特許 7318897 ペプチド、組成物、及びグレリン分泌促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-24

(45)【発行日】2023-08-01

(54)【発明の名称】ペプチド、組成物、及びグレリン分泌促進剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20230725BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20230725BHJP

   C07K 5/113 20060101ALI20230725BHJP

   C07K 5/103 20060101ALI20230725BHJP

   C07K 5/117 20060101ALI20230725BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20230725BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20230725BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20230725BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20230725BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20230725BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230725BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

C07K7/08

C07K5/113

C07K5/103

C07K5/117

A61K38/07

A61K38/08

A61K38/10

A61P1/14

A23L33/18

C12N15/09 Z

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021516218

(86)(22)【出願日】2020-04-23

(86)【国際出願番号】 JP2020017565

(87)【国際公開番号】W WO2020218450

(87)【国際公開日】2020-10-29

【審査請求日】2021-10-21

(31)【優先権主張番号】P 2019086211

(32)【優先日】2019-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業「米を活用した次世代介護食品の社会実装のための技術基盤開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(73)【特許権者】

【識別番号】596175810

【氏名又は名称】公益財団法人かずさＤＮＡ研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】390019987

【氏名又は名称】亀田製菓株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100206335

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 和宏

(72)【発明者】

【氏名】大日向 耕作

(72)【発明者】

【氏名】徳山 雄基

(72)【発明者】

【氏名】中戸 絢也

(72)【発明者】

【氏名】岩倉 浩

(72)【発明者】

【氏名】金子 賢太朗

(72)【発明者】

【氏名】尾高 清乃

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 大

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 秀幸

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 彰

(72)【発明者】

【氏名】樋口 裕樹

(72)【発明者】

【氏名】中山 諒子

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１８９９６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／０９２８５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１５０５４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０９４０２０９５（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２２５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－０２７００１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５０７２７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】欧州特許出願公開第０１３３２７６０（ＥＰ，Ａ１）

【文献】特開２００５－０８２４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－２２７３０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／１１１５７３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、ペプチド。

【請求項2】

配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、ズブチリシン消化物である、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のペプチドを含み、食欲不振の治療、予防、又は改善に用いられる組成物。

【請求項4】

前記食欲不振が、グレリン分泌の低下によってもたらされる食欲不振である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

医薬品である請求項３又は４に記載の組成物。

【請求項6】

飲食品である請求項３又は４に記載の組成物。

【請求項7】

配列番号１から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、グレリン分泌促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチド、組成物、及びグレリン分泌促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

様々な疾患等やストレスがもたらす症状のひとつとして食欲不振が知られる。食欲不振が長期にわたって続く場合、栄養状態が悪化し、疾患等の重篤化をもたらし得る。また、高齢者では疾患を発症していなくとも食欲不振が認められ、生活の質（ＱＯＬ）の低下が惹起され得る。

【0003】

例えば、特許文献１には、食欲不振等のグレリン分泌が関与する症状の予防及び治療を目的とした、所定の化合物を含むグレリン分泌促進剤が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１３－２２７３０９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、食欲不振を治療、予防、又は改善できる機能性素材に対するさらなるニーズがある。

【0006】

本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、食欲不振を治療、予防、又は改善できる新規ペプチドを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、特定のアミノ酸配列からなるペプチドによれば上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のものを提供する。

【0008】

＜１＞ 以下の（１）から（３）のいずれかに記載のペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち４個以上９個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち４個以上１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド

【0009】

＜２＞ 配列番号３から７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、＜１＞に記載のペプチド。

【0010】

＜３＞ 配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、ズブチリシン消化物である、＜１＞に記載のペプチド。

【0011】

＜４＞ ＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチド、又は前記ペプチドをアミノ酸配列の一部として含むタンパク質を含み、食欲不振の治療、予防、又は改善に用いられる組成物。

【0012】

＜５＞ 前記食欲不振が、グレリン分泌の低下によってもたらされる食欲不振である、＜４＞に記載の組成物。

【0013】

＜６＞ 医薬品である＜４＞又は＜５＞に記載の組成物。

【0014】

＜７＞ 飲食品である＜４＞又は＜５＞に記載の組成物。

【0015】

＜８＞ ＜４＞から＜７＞のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、食欲不振を治療、予防、又は改善する方法。

【0016】

＜９＞ 以下の（１）から（３）のいずれかに記載のペプチドを含むグレリン分泌促進剤。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち４個以上９個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち４個以上１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、食欲不振を治療、予防、又は改善できる新規ペプチドが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】米胚乳タンパク質の酵素消化物がグレリン分泌活性に及ぼす影響を示す図である。

【図2】本発明のペプチドがグレリン分泌活性に及ぼす影響を示す図である。

【図3】本発明のペプチドがグレリン分泌活性及びグレリン合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。

【図4】本発明のペプチドが細胞内ｃＡＭＰ濃度に及ぼす影響を示す図である。

【図5】本発明のペプチドがマウスの摂食行動、及び、血清中グレリン濃度に及ぼす影響を示す図である。

【図6】本発明のペプチドがマウスの摂食行動に及ぼす影響を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。

【0020】

＜本発明のペプチド＞
本発明のペプチドは、以下の（１）から（３）のいずれかに記載のペプチドである。なお、以下、アミノ酸配列は、Ｎ末端を左端に置き、Ｎ末端からＣ末端にかけて記載する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＱＡＦＥＰＩＲＳＶ）のうち４個以上９個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＴＮＰＷＨＳＰＲＱＧＳＦ）のうち４個以上１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチド
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド

【0021】

本発明において、「配列番号１（又は２）に記載のアミノ酸配列のうちｎ個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド」とは、配列番号１（又は２）に記載のアミノ酸配列から、該配列における順序を維持して選択されるｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドを意味する。
例えば、「配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち４個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド」としては、「ＱＡＦＥ」からなるペプチド、「ＡＦＥＰ」からなるペプチド、「ＦＥＰＩ」からなるペプチド等が挙げられる。

【0022】

本発明者らは、各種ペプチド混合物の一斉分析情報や、食欲不振に影響を及ぼす既知のペプチドの構造－活性相関情報に基づき検討した結果、食欲不振の治療等に対して効果を示す新規ペプチド、すなわち、上記ペプチドを発見した。
なお、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列は、いずれも、「ズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）」（サブチリシン、サチライシンとも呼ばれる。）による、米胚乳タンパク質の酵素消化物である。

【0023】

本発明のペプチドは、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、その部分ペプチドであってもよい。

【0024】

本発明のペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの部分ペプチドである場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、好ましくは４個以上８個以下、より好ましくは４個以上５個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。

【0025】

本発明のペプチドが配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの部分ペプチドである場合、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、好ましくは４個以上１０個以下、より好ましくは４個以上８個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。

【0026】

本発明のペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの部分ペプチドである場合、好ましい配列として以下が挙げられる。
配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＱＡＦＥ）からなるペプチド
配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＰＩＲＳＶ）からなるペプチド

【0027】

本発明のペプチドが配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの部分ペプチドである場合、好ましい配列として以下が挙げられる。
配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＴＮＰＷ）からなるペプチド
配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＨＳＰＲ）からなるペプチド
配列番号７で表されるアミノ酸配列（ＱＧＳＦ）からなるペプチド

【0028】

本発明のペプチドは、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、ズブチリシン消化物であってもよい。

【0029】

本発明者らによるさらなる検討の結果、本発明のペプチドは、グレリン分泌を促進することで食欲向上効果をもたらし、食欲不振の治療や予防の効果を奏し得ることが見出された。

【0030】

本発明のペプチドは、化学合成や、天然のタンパク質（米胚乳タンパク質）又はポリペプチドの加水分解によって得られる。

【0031】

化学合成の方法としては、公知のペプチド合成法が挙げられる。具体的には、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法又は固相法が挙げられる。さらに具体的には、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等が挙げられる。合成されたペプチドは、精製してもよい。精製方法としては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いた方法が挙げられる。

【0032】

加水分解の方法としては、加水分解酵素を用いた方法、強酸又は強塩基を用いた方法等が挙げられる。

【0033】

加水分解酵素を用いた方法においては、動物、植物又は微生物由来の加水分解酵素（ズブチリシン等）を使用できる。加水分解酵素としては、食品として用いることができる微生物（例えば、パン酵母、ビール酵母等の食用酵母）等を用いてもよい。

【0034】

加水分解酵素を用いた加水分解の条件としては、特に限定されないが、用いる酵素に応じてｐＨを適切な値に調整し、３０～４０℃程度の温度下にて、３０分～４８時間反応させてもよい。得られた反応液から本発明のペプチドを精製して用いてもよい。加水分解した対象が食品素材である場合は、そのまま、又は、他の食品素材に添加して食品として供することもできる。

【0035】

強酸を用いた方法においては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等を用いることができる。強塩基を用いた方法においては、例えば、アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）、アルカリ金属炭酸塩（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、アルカリ金属炭酸水素塩（炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）を用いることができる。

【0036】

強酸又は強塩基を用いた加水分解の条件としては、特に限定されないが、強酸又は強塩基の存在下で、水中で、１～１００℃の温度下にて、３０分～４８時間反応させてもよい。加水分解の反応生成物は、ｐＨを調製した後、そのまま使用してもよく、精製により本発明のペプチドを単離して使用してもよい。

【0037】

各種方法によって得られたペプチドのアミノ酸配列は、エドマン分解法でＣ－末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＧＣ－ＭＳ等で分析できる。

【0038】

＜本発明の組成物＞
本発明の組成物は、少なくとも本発明のペプチドを含む。本発明の組成物は、本発明のペプチドからなるものであってもよく、その他の成分を含んでいてもよい。本発明の組成物に含まれるペプチドは、本発明のペプチドをアミノ酸配列の一部として含むタンパク質であってもよい。

【0039】

本発明のペプチドを摂取することにより、食欲不振を治療、予防、又は改善できる。したがって、本発明の組成物は、食欲不振の治療、予防、又は改善のために好ましく使用できる。

【0040】

本発明において、「食欲不振」とは、食欲の減少や摂食量の減少を意味する。本発明によれば、グレリン分泌の低下によってもたらされる食欲不振を特に良好に治療、予防、又は改善できる。

【0041】

本発明において、「治療」とは、例えば、食欲不振の治癒等を意味する。「予防」とは、例えば、食欲不振の抑制又は遅延等を意味する。「改善」とは、例えば、食欲不振の緩和、軽減等を意味する。

【0042】

本発明の組成物は、任意の形態に調製でき、医薬品や飲食品として調製してもよい。

【0043】

本発明の組成物を医薬品として調製する場合、経口投与剤又は非経口投与剤として調製できる。本発明の組成物は、例えば、本発明のペプチド単独で、又は、担体、希釈剤若しくは賦形剤とともに、以下の製剤として調製できる；タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠等）、カプセル、トローチ、粉末、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、クリーム、注射剤（アミノ酸輸液、電解質輸液等の輸液に配合する場合を含む）、腸溶性の錠剤、カプセル剤、徐放性製剤等。

【0044】

担体、希釈剤又は賦形剤としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。例えば、以下のものが挙げられる；乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等。

【0045】

本発明の組成物を飲食品として調製する場合、任意の形態に調製でき、例えば、以下のものが挙げられる；飲料類（コーヒー、ココア、ジュース、清涼飲料、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料等）、ガム、グミ、ゼリー、キャンディ、クッキー、クラッカー、ビスケット、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷等）、レトルト食品、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、ゼリー状飲料等）等。

【0046】

本発明の飲食品は、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、機能性表示食品、病者用食品・病者用組合せ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）又は高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）として調製してもよい。

【0047】

本発明の組成物における、本発明のペプチドの量は、得ようとする効果等に応じて適宜設定できる。例えば、組成物に対して、本発明のペプチドを、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは１．００質量％以上配合してもよい。また、組成物に対して、本発明のペプチドを、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは９０質量％以下配合してもよい。なお、上記の値は、本発明の組成物に本発明のペプチド以外のペプチドが含まれる場合、本発明のペプチドの量に換算したものである。

【0048】

本発明の組成物における、本発明のペプチド以外の成分の量は、該成分の種類、組成物の形態、得ようとする効果等に応じて適宜設定できる。

【0049】

本発明の組成物の投与方法は特に限定されず、経口投与、又は非経口投与（注射等）のいずれであってもよい。本発明の効果が奏されやすいという観点から、本発明の組成物は経口投与されることが好ましい。

【0050】

本発明の組成物の投与量は、投与方法、投与対象の状態や年齢等により異なるが、例えば、本発明のペプチドの量に換算して、成人１日あたり、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇである。上記範囲内において、投与量が多いほど、本発明の効果がより奏されやすい傾向にある。

【0051】

本発明の組成物の製造方法としては、得ようとする形態に応じて、公知の方法を採用できる。

【0052】

＜食欲不振を治療、予防、又は改善する方法＞
本発明の組成物を対象に投与することで、食欲不振を治療、予防、又は改善することができる。

【0053】

投与方法は、組成物の形態に応じて適宜選択することができる。

【0054】

投与回数、投与間隔、投与量は、投与対象の状態（症状、年齢、体重等）に応じて適宜選択することができる。

【0055】

投与対象としては特に限定されず、ヒト、ヒト以外の哺乳類（イヌ、ネコ、家畜（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）等）等が挙げられる。

【0056】

＜グレリン分泌促進剤＞
上記のとおり、本発明のペプチドはグレリン分泌促進効果を有する。したがって、本発明のペプチドは、グレリン分泌促進剤として有効である。

【0057】

本発明のグレリン分泌促進剤は、少なくとも本発明のペプチドを含み、本発明のペプチドからなるものであってもよく、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分を含む場合、本発明のペプチドの作用を阻害しなければ任意の成分を配合することができ、例えば、上記＜本発明の組成物＞の項で挙げた成分を配合してもよい。

【実施例】

【0058】

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0059】

＜試験１＞
（ペプチドの作製－１）
精製した米胚乳タンパク質、及び各種消化酵素を水に溶解させ、質量比が米胚乳タンパク質：酵素＝１００：１、かつ、米胚乳タンパク質の終濃度が２０ｍｇ／ｍｌとなるように混合し、酵素反応を行い、ペプチドを各種酵素消化物として得た。

【0060】

使用した消化酵素、及び反応条件は以下のとおりである。下記反応時間の経過後、各試料をボイル（１００℃、１０分間）し、酵素反応を停止した。
（１）ズブチリシン（商品名「Ｔ１４２６」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）：反応温度３７℃、反応時間５時間、反応ｐＨ７．５
（２）スミチーム（商品名「スミチームＦＰ」、新日本化学社製）：反応温度：５０℃、反応時間：５時間、反応ｐＨ７．５
（３）サーモリシン（商品名「Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ」、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社製）：反応温度３７℃、反応時間５時間、反応ｐＨ７．０～７．５

【0061】

（グレリン分泌活性の評価－１）
上記（ペプチドの作製－１）で得られたペプチドを、以下の試験に供し、各ペプチドがグレリン分泌に与える影響を評価した。ペプチド投与によってグレリン分泌が促進されるほど、該ペプチドが高い食欲促進効果を有することを意味する。

【0062】

グレリン分泌細胞（ＭＧＮ３－１）を９６ウェルプレートへ１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、オクタン酸ナトリウム／ＤＭＥＭ培地中で、３７℃で２４時間培養した。培養後、細胞をＤＰＢＳで洗浄した。バッファー溶液として調製した各ペプチド１００μＬ（ペプチド濃度１又は１０ｍｇ／ｍＬ）を細胞へ添加し、さらに３７℃で４時間培養した。なお、バッファーとしては、ＤＭＥＭ中５０μＭ オクタン酸ナトリウムを用いた。

【0063】

また、以下の全ての試験において、特段の記載がない限り、ペプチドの代わりにバッファーのみを添加した点以外は上記同様に培養したものを対照として用意した。

【0064】

培養後、培地試料を回収し遠心分離処理により上清を得た。上清に１Ｎ ＨＣｌを１０μＬ添加し、下記グレリン濃度測定の実施をするまで－８０℃で保存した。

【0065】

各培地試料中のグレリン濃度をＥＬＩＳＡキット（商品名「Ｇｈｒｅｌｉｎ （Ａｃｙｌａｔｅｄ） ＥＩＡＫｉｔ Ａ０５１１７」、Ｂｅｒｔｉｎ Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて測定した。その結果を図１に示す。なお、図１の結果は、対照の測定値に対する相対値として示した。

【0066】

図１に示されるとおり、ズブチリシン消化物、スミチーム消化物、及びサーモリシン消化物は、それぞれグレリン分進効果を有することがわかった。
特に、ズブチリシン消化物及びスミチーム消化物は、濃度依存的に顕著なグレリン分泌促進効果を有することがわかった。

【0067】

＜試験２＞
（ペプチドの作製－２）
上記（グレリン分泌の評価－１）の結果を踏まえ、グレリン分泌促進効果与するズブチリシン消化物中のペプチドをスクリーニングし、以下の２種のペプチドを候補として特定した。そこで、これらのペプチドを、Ｆｍｏｃ法による合成、次いで、逆相ＨＰＬＣによる精製によって作製した。なお、以下、「配列番号ｎで表されるアミノ酸配列からなるペプチド」を、単に「配列番号ｎのペプチド」ともいう。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＱＡＦＥＰＩＲＳＶ）からなるペプチド
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＴＮＰＷＨＳＰＲＱＧＳＦ）からなるペプチド

【0068】

（グレリン分泌活性の評価－２）
上記２種のペプチドを用いて、上記（グレリン分泌活性の評価－１）と同様の方法で、各ペプチドがグレリン分泌に与える影響を評価した。その結果を図２に示す（ｎ＝４）。なお、本例においては、ペプチド濃度が０．０１、０．１又は１ｍＭであるペプチド溶液を使用した。

【0069】

図２に示されるとおり、配列番号１又は２のペプチドは、いずれもグレリン分泌促進効果を有することがわかった。特に、ペプチド濃度が１ｍＭ以上であるとその効果が顕著だった。

【0070】

＜試験３＞
上記（ペプチドの作製－２）で作製した、配列番号１のペプチドを用いて、グレリン分泌促進効果の作用を検証した。具体的には、配列番号１のペプチドの投与が、細胞内外のグレリン濃度に及ぼす影響、及び、グレリン合成関連遺伝子発現に及ぼす影響を検証した。

【0071】

（グレリン分泌活性の評価－３）
配列番号１のペプチドを用いて、上記（グレリン分泌活性の評価－１）と同様の方法で、ペプチドがグレリン分泌（細胞内のグレリン濃度）に与える影響を評価した。その結果を図３Ａに示す（ｎ＝４～５）。

【0072】

（グレリン合成関連遺伝子発現の評価）
上記（グレリン分泌活性の評価－１）における培養完了後の細胞中の、グレリン合成に関連する３種の遺伝子（Ｐｒｅｐｒｏｇｈｒｅｌｉｎ、ＧＯＡＴ、及びＰＣ３）の発現量を、以下の方法で測定した。まず、「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（ＱＩＡ－ＧＥＮ社製）、及び「Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（タカラバイオ社製）を用いて細胞からｍＲＮＡを抽出した。次いで、「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）、及び「ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ」（東洋紡社製）を用いて、ｃＤＮＡを増幅させ、ｍＲＮＡ発現量を測定した。その結果を図３Ｂ（Ｐｒｅｐｒｏｇｈｒｅｌｉｎ）、図３Ｃ（ＧＯＡＴ）、図３Ｄ（ＰＣ３）に示す（それぞれ、ｎ＝４～５）。

【0073】

図３Ａに示されるとおり、配列番号１のペプチドの投与により、細胞内のグレリン濃度は減少する傾向にあった。なお、配列番号１のペプチドの投与により、細胞外のグレリン濃度が増加した（データは示していない。）。

【0074】

図３Ｂ～Ｄに示されるとおり、グレリン合成関連遺伝子の発現量は、いずれも配列番号１のペプチドの投与による変化が認められなかった。

【0075】

以上の結果から、配列番号１のペプチドは、グレリン合成を促進するのではなく、細胞外へのグレリン分泌を促進することで、グレリン分泌促進効果をもたらすことがわかった。

【0076】

＜試験４＞
上記＜試験３＞の結果を踏まえ、配列番号１のペプチドによるグレリン分泌促進効果の作用を検証した。具体的には、配列番号１のペプチドの投与が、細胞内ｃＡＭＰ濃度及び細胞内カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）濃度に与える影響を検証した。

【0077】

なお、ノルアドレナリンは、細胞内のｃＡＭＰ濃度及び細胞内カルシウムイオン濃度の増加を介して、グレリンの分泌を促進することが知られる。そこで、以下の試験では、陽性対照としてノルアドレナリンを用いたものも用意した。

【0078】

（細胞内ｃＡＭＰ濃度の評価）
グレリン分泌細胞（ＭＧＮ３－１）を０．５ｍＭ ＩＢＭＸを含むＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ－ＨＥＰＥＳバッファーに溶解させ、３７℃、３０分インキュベートした後に、細胞内のｃＡＭＰを「ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ ｃＡＭＰ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ社製）を用いて定量した。その結果を図４に示す。

【0079】

（細胞内カルシウムイオン濃度の評価）
「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｋｉｔ ＩＩ－Ｆｌｕｏ ４」（同仁化学研究所）を使用し、マルチプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＧｍｂＨ社製、λｅｘ＝４８５ｎｍ，λｅｍ＝５２０ｎｍ）を用いて測定した。

【0080】

図４に示されるとおり、配列番号１のペプチドは、細胞内ｃＡＭＰ濃度に影響を及ぼさなかった。また、配列番号１のペプチドは、細胞内カルシウムイオン濃度にも影響を及ぼさなかった（データは示していない。）。このことは、配列番号１のペプチドがノルアドレナリンとは異なる経路を介してグレリンの分泌を促進することを示唆する。

【0081】

＜試験５＞
配列番号１のペプチドをマウスに投与し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効果を検証した。具体的には、配列番号１のペプチドの投与がマウスの摂食行動、及び血清中グレリン濃度に及ぼす影響を検証した。

【0082】

（マウスの摂食行動の評価－１）
マウス（ｄｄＹマウス、１１週齢の雄）に、生理食塩水に溶解させた配列番号１のペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）を単回経口投与した。次いで、あらかじめ秤量した飼料（商品名「ＣＥ－２」、日本クレア社製）を摂食させ、摂食４時間後に残った飼料重量を測定した。
また、配列番号１のペプチドの代わりに生理食塩水を単回経口投与した点以外は上記同様の試験を対照試験として行った。
マウスに給餌した飼料重量と、摂食４時間後に残った飼料重量との差を摂食量（ｇ／４時間）として特定した。その結果を図５Ａ（ｎ＝１０～１１）に示す。

【0083】

（マウスの血清中グレリン濃度の評価）
マウス（ｄｄＹマウス、１１週齢の雄）に、生理食塩水に溶解させた配列番号１のペプチド（０．３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。次いで、投与１時間後にマウスの眼窩静脈から採血し、１１２０×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、上清を１Ｎ ＨＣｌで酸性化した後、アシル化グレリン酵素免疫測定キットを用いて血清中グレリン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を測定した。その結果を図５Ｂ（ｎ＝５～７）に示す。

【0084】

図５Ａに示されるとおり、配列番号１のペプチドは、マウスの摂食量を増加させ、食欲促進効果を示した。また、図５Ｂに示されるとおり、配列番号１のペプチドを投与することにより、血清中グレリン濃度を増加させた。

【0085】

＜試験６＞
上記（ペプチドの作製－２）で作製した配列番号１及び２のペプチド、並びにこれらの部分ペプチド（配列番号３～７のペプチド）を、Ｆｍｏｃ法による合成、次いで、逆相ＨＰＬＣによる精製によって作製した。次いで、これらの各ペプチドをマウスに投与し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効果を検証した。具体的には、各ペプチドの投与がマウスの摂食行動に及ぼす影響を検証した。

【0086】

本例で用いたペプチドは以下の７種である。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＱＡＦＥＰＩＲＳＶ）からなるペプチド
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＴＮＰＷＨＳＰＲＱＧＳＦ）からなるペプチド
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＱＡＦＥ）からなるペプチド
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＰＩＲＳＶ）からなるペプチド
（５）配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＴＮＰＷ）からなるペプチド
（６）配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＨＳＰＲ）からなるペプチド
（７）配列番号７で表されるアミノ酸配列（ＱＧＳＦ）からなるペプチド

【0087】

（マウスの摂食行動の評価－２）
マウス（ｄｄＹマウス、７週齢の雄を購入し１週間以上順化して使用）に、生理食塩水に溶解させた各ペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）を単回経口投与した。次いで、あらかじめ秤量した飼料（商品名「ＣＥ－２」、日本クレア社製）を摂食させ、摂食２時間後に残った飼料重量を測定した。
また、各ペプチドの代わりに生理食塩水を単回経口投与した点以外は上記同様の試験を対照試験として行った。
マウスに給餌した飼料重量と、摂食２時間後に残った飼料重量との差を摂食量（ｇ／２時間）として特定した。この結果に基づき、各群における摂取量を、対照の摂取量を「１００」とした場合の相対値として算出した。その結果を図６（ｎ＝７～１８、＊ 対照に対してＰ＜０．０５）に示す。

【0088】

図６に示されるとおり、いずれのペプチドもマウスの摂食量を増加させ、食欲促進効果を示した。このような効果は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドだけではなく、その部分ペプチドにおいても認められた。
特に、配列番号３、５、６又は７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、対照と比較して、飼料摂取量が有意に増加した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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