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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-24
(45)【発行日】2023-08-01
(54)【発明の名称】アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20230725BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230725BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230725BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230725BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230725BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
C12N7/01
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
A61K35/761
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2021528389
(86)(22)【出願日】2019-11-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 US2019062547
(87)【国際公開番号】W WO2020106924
(87)【国際公開日】2020-05-28
【審査請求日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】62/770,631
(32)【優先日】2018-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】501083115
【氏名又は名称】メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】100069556
【弁理士】
【氏名又は名称】江崎 光史
(74)【代理人】
【識別番号】100111486
【弁理士】
【氏名又は名称】鍛冶澤 實
(74)【代理人】
【識別番号】100139527
【弁理士】
【氏名又は名称】上西 克礼
(74)【代理人】
【識別番号】100164781
【弁理士】
【氏名又は名称】虎山 一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100221981
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 大成
(72)【発明者】
【氏名】バリー・マイケル・エイ
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０８３２９７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００８－５２２６３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５２７４５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００２／０１５０５５７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５２３００７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Oncolytic Virotherapy，2018年05月01日，vol.7, p.43-51
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ１２Ｎ ７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ヒトＡｄ６株からのＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）ヒトＡｄ５７株からの少なくとも２つのヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチドを含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記組換えＡｄは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌとの組み合わせをコードする核酸をさらに含む、前記組換えＡｄ。
【請求項2】
（ａ）ヒトＡｄ６株からのＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）ヒトＡｄ５７株からの少なくとも２つのヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチドを含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記組換えＡｄは、制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であり、前記ＣＲＡｄは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌとの組み合わせをコードする核酸をさらに含む、前記組換えＡｄ。
【請求項3】
ヒトＡｄ６株のキャプシドヘキソンポリペプチドが、ヒトＡｄ５７株からのキャプシドヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチド１～７を含む、請求項１または２に記載の組換えＡｄ。
【請求項4】
ヒトＡｄ６株のキャプシドヘキソンポリペプチドが、ヒトＡｄ５７株からのキャプシドヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチド２～６を含む、請求項１または２に記載の組換えＡｄ。
【請求項5】
１種または複数の異なるＡｄ株からのキャプシドポリペプチドをさらに含み、当該キャプシドポリペプチドが、ヒトＡｄ６およびヒトＡｄ５７株のファイバーポリペプチドとは異なるファイバーポリペプチドである、請求項１～４のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
【請求項6】
アミノ酸置換および／またはアミノ酸修飾をさらに含み、前記のアミノ酸置換がＨＶＲポリペプチドにおけるシステインへの置換であり、前記のアミノ酸修飾がＨＶＲポリペプチドにおけるシステインのＰＥＧ化およびＢＡＰ化から選択される、請求項１～５のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
【請求項7】
配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えＡｄ。
【請求項8】
（ａ）ヒトＡｄ６株からのヘキソンポリペプチドをコードするＡｄゲノムおよび（ｂ）ヒトＡｄ５７株からの少なくとも２つのヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記組換えＡｄは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌとの組み合わせをコードする核酸をさらに含む、前記組換えＡｄ。
【請求項9】
（ａ）ヒトＡｄ６株からのヘキソンポリペプチドをコードするＡｄゲノムおよび（ｂ）ヒトＡｄ５７株からの少なくとも２つのヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記組換えＡｄは、制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であり、前記ＣＲＡｄは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌまたは４－１ＢＢＬとＣＤ４０Ｌとの組み合わせをコードする核酸をさらに含む、前記組換えＡｄ。
【請求項10】
ヒトＡｄ６株のキャプシドヘキソンポリペプチドが、ヒトＡｄ５７株からのキャプシドヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチド１～７を含む、請求項８または９に記載の組換えＡｄ。
【請求項11】
ヒトＡｄ６株のキャプシドヘキソンポリペプチドが、ヒトＡｄ５７株からのキャプシドヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチド２～６を含む、請求項８～９のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
【請求項12】
１種または複数の異なるＡｄ株からのキャプシドポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、当該キャプシドポリペプチドが、ヒトＡｄ６およびヒトＡｄ５７株のファイバーポリペプチドとは異なるファイバーポリペプチドである、請求項８～１０のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
【請求項13】
Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中にｄｌ１１０１欠失を含むように修飾されているか、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中にｄｌ１１０７欠失を含むように修飾されているか、またはＥ１ポリペプチドをコードする核酸中にｄｌ１１０１欠失およびｄｌ１１０７欠失を含むように修飾されている、請求項９に記載の組換えＡｄ。
【請求項14】
配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、請求項１３に記載の組換えＡｄ。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス（Ａｄ）を含む、癌を有する哺乳動物を治療するための方法に使用するための医薬組成物であって、前記方法が、前記哺乳動物に前記医薬組成物を投与することを含む、前記医薬組成物。
【請求項16】
前記癌が、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫、リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記投与が全身投与を含む、請求項１５～１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項18】
全身投与が筋肉内、鼻内または静脈内投与を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記投与が局所投与を含む、請求項１５～１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記局所投与が腫瘍内注射を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項21】
請求項１～１４のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス（Ａｄ）を含む、癌の治療のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸送達、ワクチン接種、および／または癌の治療のための方法および材料に関する。例えば、本発明は、アデノウイルス（Ａｄ）、および医学的状態、例えば癌を治療するためにアデノウイルスを使用するための方法を包含する。本発明の一態様では、本明細書で提供されるアデノウイルスを腫瘍溶解剤として使用することができる。
【背景技術】
【0002】
膨大な努力にもかかわらず、２０１７年のみで１６０万を超える新規症例を有する米国では、癌は依然として主要な公衆衛生問題である（米国国立がん研究所、「Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔ Ｆａｃｔｓ： Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ Ａｎｙ Ｓｉｔｅ，」ｓｅｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｓｔａｔｆａｃｔｓ／ｈｔｍｌ／ａｌｌ．ｈｔｍｌ）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１７ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：１１０７－１１１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
従来の治療法、例えば、化学療法、放射線療法および手術は、特に癌が進行している場合には、しばしば失敗する。その理由の１つは、癌細胞がこれらの治療法によって標的化される成分を排除または修飾し、殺されることを効果的に回避できるからである。
【0005】
腫瘍溶解性ウイルス療法は、腫瘍を破壊し、適応免疫応答を活性化し、腫瘍に対する生涯にわたる免疫を確保するために選択的に複製するウイルスを利用することにより、癌治療の代替アプローチを提供することができる（非特許文献１）。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、核酸送達、ワクチン接種、および／または癌の治療のための方法および材料を提供する。例えば、本発明は、腫瘍溶解剤として１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）を投与することによって癌を治療ための方法および材料を提供する。一実施態様では、組換えＡｄは、第１のＡｄに由来することができ（例えば、第１のＡｄ、例えばＡｄ６のゲノムを含むことができ、組換えＡｄバックボーンとも呼ぶ）、そして、第２のＡｄ、例えばＡｄ５７由来のヘキソンＨＶＲを含むことができる。組換えＡｄがＡｄ６ゲノムおよびＡｄ５７ヘキソンＨＶＲを含む場合、組換えＡｄはＡｄ６５７と称されるキメラＡｄであり得る。（Ｎｇｕｙｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ ７：４３－５１， ２０１８参照）。
【0007】
一態様において、本発明は、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）を使用する、感染性疾患に対してワクチン接種するための方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍溶解剤として１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）を使用する、癌を治療ための方法を提供する。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７）は、哺乳動物における癌細胞の数を減少させるために（例えば、癌細胞に感染させ、癌細胞を殺すことによって）、使用することができる。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）は、哺乳動物における抗癌免疫応答を刺激するために使用することができる。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）は、哺乳動物における感染性疾患に対する免疫応答を刺激するために使用することができる。
【0008】
本明細書において実証されるように、Ａｄ６５７を皮下ヒトＤＵ１４５前立腺癌腫瘍を有するマウスに静脈内注射によって送達すると、Ａｄ６５７はまず肝臓に感染し、次いで遠隔の腫瘍に到達する。Ａｄ６およびＡｄ６５７は両者とも、腫瘍成長の有意な遅延および生存の延長を媒介したが、Ａｄ６はより高い有効性を媒介した。
【0009】
本発明は、核酸送達、ワクチン接種、および／または癌の治療のための方法および材料を提供する。例えば、本発明は、腫瘍溶解剤として１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）を投与することによって癌を治療ための方法および材料を提供する。一実施態様では、組換えＡｄは、第１のＡｄに由来することができ（例えば、第１のＡｄ、例えばＡｄ６のゲノムを含むことができ、組換えＡｄバックボーンとも呼ぶ）、そして、第２のＡｄ、例えばＡｄ５７由来のヘキソンＨＶＲを含むことができる。組換えＡｄがＡｄ６ゲノムおよびＡｄ５７ヘキソンＨＶＲを含む場合、組換えＡｄはＡｄ６５７と称されるキメラＡｄであり得る。一態様において、本発明は、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）を使用する、感染性疾患に対してワクチン接種するための方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍溶解剤として１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）を使用する、癌を治療ための方法を提供する。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７）は、哺乳動物における癌細胞の数を減少させるために（例えば、癌細胞に感染させ、癌細胞を殺すことによって）、使用することができる。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）は、哺乳動物における抗癌免疫応答を刺激するために使用することができる。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄ（例えば、１種または複数のＡｄ６５７およびそれらのバリアント）は、哺乳動物における感染性疾患に対する免疫応答を刺激するために使用することができる。
【0010】
本明細書において実証されるように、Ａｄ６５７を皮下ヒトＤＵ１４５前立腺癌腫瘍を有するマウスに静脈内注射によって送達すると、Ａｄ６５７はまず肝臓に感染し、次いで遠隔の腫瘍に到達する。Ａｄ６およびＡｄ６５７は両者とも、腫瘍成長の有意な遅延および生存の延長を媒介したが、Ａｄ６はより高い有効性を媒介した。
【0011】
さらに、肝壊死が、実質的にいずれの腫瘍溶解性ウイルスにとっても、それが静脈内全身療法として使用される場合、重要な問題である。ウイルスが肝細胞に感染し、それらを殺すと、低用量では肝臓の損傷をもたらし、高用量では死に至る。特に、本発明のＡｄ、すなわちＡｄ６５７キメラベクターおよびそのバリアントの投与は、Ａｄ５またはＡｄ６のいずれよりも予想外に低い肝臓損傷を媒介した。このように、Ａｄ６プラットフォームとＡｄ６５７のＨＶＲ１～７とのユニークな組合せは、天然ウイルスでは観察されない生体内分布および治療の変化を媒介した。
【0012】
また、本明細書において示されるように、鼻内（ＩＮ）および筋肉内（ＩＭ）経路によるクレードＢ ＨＩＶ－１ ｇｐ１６０のみを発現する複製シングルサイクルアデノウイルス（ＳＣ－Ａｄ６５７）ワクチンを用いたアカゲザルの免疫化を、粘膜および全身経路のワクチン接種と比較した。ＳＣ－Ａｄワクチンは単独で、単回免疫化だけの後に、Ｅｎｖに対する有意な循環抗体力価をもたらした。ＩＭ経路のみで免疫化した動物は血中の末梢Ｔ濾胞ヘルパー（ｐＴｆｈ）細胞が高かったが、リンパ節ではＴｆｈが低く、そして抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）抗体活性がより低かった。ＩＮ経路によって免疫化した動物は、リンパ節でのＴｆｈが高かったが、血中でのｐＴｆｈは低く、ＡＤＣＣ抗体がより高かった。免疫化した動物をＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３で直腸チャレンジした場合、それらは全て感染したが、粘膜で抗原刺激を受けた動物はそれらの胃腸管のウイルス量は著しく低かった。同様に、Ｃ型肝炎抗原の遺伝子を保有するＡｄ６５７は、肝炎およびサイトメガロウイルスに対して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成することができる。Ａｄ６５７は、４－１ＢＢＬ、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭＣＳＦ）およびＩＬ－２１のようなサイトカインを含む治療遺伝子を送達し、発現することができる。本明細書中に提供される結果は、組換えＡｄが核酸、ワクチン、および／または癌に関する腫瘍溶解性ウイルス療法のための局所または全身送達ビヒクルとして使用できることを実証している。
【0013】
発明の概要
概して、本発明の一態様は、（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄゲノムおよび（ｂ）第２のＡｄ株からのヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＡｄであって、前記ヘキソンポリペプチドの１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）が前記ＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲとは異なる組換えＡｄを特徴とする。第１のＡｄ株は第１のヒトＡｄ株であることができ、第２のＡｄ株は第１のヒトＡｄ株とは異なる第２のヒトＡｄ株であることができる。第１のＡｄ株と第２のＡｄ株は血清型的に異なっていてよい。第１のＡｄ株はヒトＡｄ６株であることができ、そして第２のＡｄ株はヒトＡｄ５７株であることができる。前記組換えＡｄはまた、１つまたは複数の標的化ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、酵素、アミノ酸置換、ＰＥＧ化、リガンド、タグなども含み得る。
概して、本発明の一態様は、（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄゲノムおよび（ｂ）第２のＡｄ株からのヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＡｄであって、前記ヘキソンポリペプチドの１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）が前記ＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲとは異なる組換えＡｄを特徴とする。第１のＡｄ株は第１のヒトＡｄ株であることができ、第２のＡｄ株は第１のヒトＡｄ株とは異なる第２のヒトＡｄ株であることができる。第１のＡｄ株と第２のＡｄ株は血清型的に異なっていてよい。第１のＡｄ株はヒトＡｄ６株であることができ、そして第２のＡｄ株はヒトＡｄ５７株であることができる。前記組換えＡｄはまた、１つまたは複数の標的化ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、酵素、アミノ酸置換、ＰＥＧ化、リガンド、タグなども含み得る。
【0014】
組換えＡｄは、遺伝子ベースのワクチン接種のための、遺伝子治療適用／送達のための、または腫瘍溶解性ウイルス療法のためのベクターとして使用され得る。
【0015】
さらなる実施態様において、前記組換えＡｄは、（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄゲノムおよび（ｂ）１種または複数のＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、前記の１種または複数のＡｄ株からの前記ヘキソンポリペプチドの超可変領域（ＨＶＲ）は第１のＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲとは異なる。
【0016】
さらなる実施態様において、前記組換えＡｄは、複製能を有する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）または制限増殖型Ａｄ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ Ａｄ）（例えば、ＣＲＡｄ）であってよい。
【0017】
別の態様において、本発明は、（ａ）第１のヘキソンポリペプチドをコードする核酸および（ｂ）第２のヘキソンポリペプチドを含み、第１のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列が、第２のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列と異なる、組換えおよび／またはキメラＡｄを特徴とする。第１のヘキソンポリペプチドの超可変領域（ＨＶＲ）のアミノ酸配列は、第２のヘキソンポリペプチドの超可変領域のアミノ酸配列とは異なっていてよい。前記核酸は第１のＡｄ株由来であることができ、そして第２のヘキソンポリペプチドは第２のＡｄ株由来であることができる。第１のＡｄ株は第１のヒトＡｄ株であることができ、第２のＡｄ株は第１のヒトＡｄ株とは異なる第２のヒトＡｄ株であることができる。第１のＡｄ株と第２のＡｄ株は血清型的に異なっていてよい。前記Ａｄ株はヒトＡｄ６株であることができ、そして第２のＡｄ株はヒトＡｄ５７株であることができる。前記組換えＡｄはまた、標的化ポリペプチドを含むこともできる。前記標的化ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＡＲＧＥＨＫＥＥＥＬＩ（配列番号１）を含むことができる。
【0018】
さらなる実施態様において、前記組換えＡｄは、（ａ）第１のヘキソンポリペプチドをコードする核酸および（ｂ）１種または複数のＡｄ株からの第２のヘキソンポリペプチドを含み、ここで第１のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列は、前記の１種または複数のＡｄ株からの第２のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列とは異なる。
【0019】
さらなる実施態様において、前記組換えＡｄは、複製能を有するＡｄまたは制限増殖型Ａｄ（例えば、ＣＲＡｄ）であり得る。
【0020】
別の態様において、本発明は、癌を有する哺乳動物を治療するための材料および方法を提供する。前記方法は、癌を有する哺乳動物に、（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄゲノムおよび（ｂ）１種または複数のＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドを含む組換えＡｄであって、前記ヘキソンポリペプチドの１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）が前記ＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲと異なる前記組換えＡｄを、および／または、（ａ）第１のヘキソンポリペプチドをコードする核酸および（ｂ）第２のヘキソンポリペプチドを含みＡｄであって、第１のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列が、第２のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるＡｄを、投与することを含むか、または投与することから本質的になることができる。哺乳動物はヒトであり得る。前記癌は、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫、リンパ性白血病または骨髄性白血病であり得る。投与には、全身投与または局所投与（例えば、静脈内、腫瘍内、筋肉内、器官内、リンパ節内投与）が含まれ得る。
【0021】
本明細書において、Ａｄ６５７およびそのバリアントが、治療用ポリペプチドの発現のために細胞に治療用遺伝子を送達できることが実証されている。従って、組換えＡｄ（キメラＡｄを含む）は、核酸、ワクチンおよび／または癌のための腫瘍溶解性ウイルス療法のための局所または全身送達ビヒクルとして使用することができる。
【0022】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細は、例および添付の図面ならびに以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、当該説明および図面から、並びに請求項から明らかとなろう。（ａ）第１のＡｄ株からのヘキソンポリペプチドをコードするＡｄゲノムおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲと異なる、組換えアデノウイルス（Ａｄ）。
【0023】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、第１のＡｄ株および前記の１種または複数の異なるＡｄ株が血清型的に異なる組換えＡｄに関する。
【0024】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記第１のＡｄ株がヒトＡｄ６株であり、第２のＡｄ株がヒトＡｄ５７株である組換えＡｄに関する。
【0025】
本発明のさらなる態様は、標的化ポリペプチド、抗原、酵素、受容体、リガンドまたはタグをコードする核酸をさらに含む、上記のような組換えＡｄに関する。
【0026】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、標的化ポリペプチドが配列番号１～４１および配列番号４６～４７から選択されるアミノ酸配列を含む組換えＡｄに関する。
【0027】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記組換えＡｄが複製能を有するＡｄである組換えＡｄに関する。
【0028】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記の複製能を有するＡｄが、シングルサイクルＡｄ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ Ａｄ）または制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）である組換えＡｄに関する。
【0029】
本発明のさらなる態様は、（ａ）第１のＡｄ株由来のＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株由来の少なくとも１つのヘキソンポリペプチドを含む上記のような組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドまたはキャプシドポリペプチドの超可変領域（ＨＶＲ）が、第１のＡｄ株のＨＶＲまたはキャプシドポリペプチドとは異なる組換えアデノウイルス（Ａｄ）に関する。
【0030】
本発明のさらなる態様は、（ａ）第１のヘキソンポリペプチドをコードする核酸および（ｂ）第２のヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含む上記のような組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、第１のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列が第２のヘキソンポリペプチドのアミノ酸配列と異なる組換えアデノウイルス（Ａｄ）に関する。
【0031】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、少なくとも１つのヘキソンポリペプチドをコードする核酸が前記第２のヘキソンポリペプチドの超可変領域のアミノ酸配列とは異なる前記組換えＡｄに関する。
【0032】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記核酸が第１のＡｄ株由来であり、前記第２のヘキソンポリペプチドが第２のＡｄ株由来である組換えＡｄに関する。
【0033】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記第１のＡｄ株が第１のヒトＡｄ株であり、そして前記第２のＡｄ株が前記第１のヒトＡｄ株とは異なる第２のヒトＡｄ株である組換えＡｄに関する。
【0034】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記第１のＡｄ株および前記第２のＡｄ株が血清型的に異なる組換えＡｄに関する。
【0035】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記第１のＡｄ株がヒトＡｄ６株であり、前記第２のＡｄ株がヒトＡｄ５７株である組換えＡｄに関する。
【0036】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、標的化ポリペプチドをさらに含む組換えＡｄに関する。
【0037】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記の標的化ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＡＲＧＥＨＫＥＥＥＬＩ（配列番号１）を含む組換えＡｄに関する。
【0038】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記組換えＡｄが複製能を有するＡｄである組換えＡｄに関する。
【0039】
本発明のさらなる態様は、上記のような組換えＡｄであって、前記の複製能を有するＡｄが、シングルサイクルＡｄ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ Ａｄ）または制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）である組換えＡｄに関する。
【0040】
本発明のさらなる態様は、癌を有する哺乳動物を治療するための方法であって、本明細書に記載されるような組換えアデノウイルス（Ａｄ）を前記哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
【0041】
本発明のさらなる態様は、上記のような方法であって、前記癌が、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫、リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される方法に関する。
【0042】
本発明のさらなる態様は、上記のような方法であって、前記投与が全身投与を含む方法に関する。
【0043】
本発明のさらなる態様は、上記のような方法であって、全身投与が筋肉内、鼻内または静脈内投与を含む方法に関する。
【0044】
本発明のさらなる態様は、上記のような方法であって、前記投与が局所投与を含む方法に関する。
【0045】
本発明のさらなる態様は、上記のような方法であって、前記局所投与が腫瘍内注射を含む方法に関する。
【0046】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。すべての出版物、特許出願、特許、並びにここで言及されている他の参考文献が、それらの全体として参照によって組み込まれる。不一致がある場合、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法および例はあくまで例示であり、限定することを意図するものではない。
【0047】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、当該説明および図面から、並びに請求項から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】図１は、ファージからアデノウイルスへのコンテキスト特異的なペプチドの翻訳を示す。Ａ）ランダムな１２量体ペプチドライブラリーを構造的に制約するＡｄ５ファイバーＨＩ βシートを含むファージディスプレイライブラリーの図。下に示されるのは、Ａｄ５ ＨＶＲ５ヘキソンにおけるβ７およびβ８シートの間の構造的に類似した部位の描写である。Ｂ）ＨＩライブラリーにおける１２．５１および１２．５２の一次アミノ酸アライメントおよびヘキソンのＨＶＲ５中に挿入された場合のそれらの位置。Ｃ）ペプチドで修飾されたＡｄ５ ＧＦＰ－Ｌｕｃ発現ウイルスを示す。
【図2】図２は、インビトロ形質導入を示す。Ａ）１０４ｖｐ／細胞の示されたベクターを感染させたＣ２Ｃ１２細胞の、感染２日後の蛍光顕微鏡によるＧＦＰ発現。Ｂ）示されたＡｄの様々なＭＯＩでの感染２日後のＣ２Ｃ１２細胞からのルシフェラーゼ活性。
【図3】図３は、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ形質導入を示す。Ａ）静脈内（ＩＶ）または筋肉内（ＩＭ）経路による注射１日後のマウスのルシフェラーゼイメージング。ＩＭ注射されたマウスは、それぞれの四頭筋に１０９ｖｐを受けた。ＩＶ注射されたマウスは、尾静脈により１０１０ｖｐを受けた。Ｂ）注射後示された日でのイメージングによる、ルシフェラーゼ活性の定量化。＊一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５。＊＊＊一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１。
【図5】図５は、単回ＩＭ免疫化の１６週後の遺伝子をベースとする免疫応答を示す。図３からのマウスをＩＭ注射の１６週後に採血し、それらの血清をＥＬＩＳＡによって段階希釈で分析して、ＧＦＰタンパク質に対する抗体を検出した。＊一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。＊＊＊＊一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０００１。全てのＡｄ注射マウスは、１：１０，０００～１：１０００の血清希釈でＰＢＳ群と比較した場合に、有意な抗ＧＦＰ抗体を生成した。Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５１および１２．５２とＡｄ５－ＧＬとの比較を黒色のアスタリスクで示す。Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５１とＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５２との比較を灰色のアスタリスクで示す。ＯＤ０．０６における灰色の一点鎖線は、ＰＢＳ群とは異なる抗体を区別する９５％信頼区間を示す。
【図7】図７は、Ａｄ５、６および５７のアラインメントを示し、ヘキソンおよびＥ３領域における変化を示す。（Ａ）Ａｄ６およびＡｄ５７のゲノムのＰｕｓｔｅｌｌ ＤＮＡアライメント。ボックスは、２つのウイルスの間で変化が最も大きいヘキソンおよびＥ３領域を示す。（Ｂ）Ａｄ５、Ａｄ６およびＡｄ５７からのヘキソンタンパク質における超可変領域のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸アラインメント。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ上でアライメントを行った。
【図9】図９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍溶解活性を示す。ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５細胞を、示されたｖｐ／細胞を有する示されたウイルスで５日間処理した。細胞をクリスタルバイオレットで染色し、細胞生存率をＯＤ５９５により測定した。細胞生存率（％）は、サンプルのＯＤを同じ９６ウェルプレート上の未処理コントロール細胞の平均ＯＤで割り、この数に１００を掛けることによって計算した。（Ａ）ＬＮＣａＰ細胞殺傷。（Ｂ）ＤＵ１４５殺傷。略語：ｖｐ、ウイルス粒子。
【図10】図１０は、肝損傷における腫瘍溶解性Ａｄの効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝６）に１０１１ｖｐの各ウイルスを尾静脈により注射した。（Ａ）カプラン・マイヤー生存。（Ｂ）注射３日後にＡＬＴ測定用に採血した（＊＊＊＊ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。略語：ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ； ｖｐ、ウイルス粒子。
【図11】図１１は、単回ｉ．ｖ．投与後のヌードマウスにおけるＤＵ１４５腫瘍異種移植片におけるＡｄ６およびＡｄ６５７の抗癌活性を示す。確立されたＤＵ１４５腫瘍を有するヌードマウス（１群あたりｎ＝９）に、示されたウイルスの３×１０１０ｖｐの単回用量またはＰＢＳをｉ．ｖ．注射した。（Ａ）腫瘍成長に対する単回ｉ．ｖ注射の効果。腫瘍寸法をカリパスで測定し、腫瘍体積を幅２×長さ×１／２として計算した。データは平均±ＳＥとして示す。本文に記載されるようなＡＮＯＶＡによりまたはＴ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＝０．０００１。黒色矢印が上を指す黒色アスタリスクは、本文に記載された選択された日におけるＡｄ６群とＰＢＳ群との間の統計的差異を示す。灰色のアスタリスクおよび上を指す矢印は、示された日におけるＡｄ６５７群とＰＢＳ群との間の差を示す。灰色の矢印が下を指す影付きの白色アスタリスクは、示された日におけるＡｄ６群とＡｄ６５７群との間の統計的差異を示す。（Ｂ）生存に対する単回ｉ．ｖ．注射の効果。腫瘍体積が２０００μＬに達した場合、又は他の屠殺基準を満たした場合（例えば 潰瘍形成）、動物を安楽死させ、カプラン・マイヤー生存曲線をプロットした（ｌｏｇ－ｒａｎｋ解析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。略語：ｉ．ｖ、静脈内。
【図12】図１２は、ルシフェラーゼイメージングヌードマウスを示す。１２．５Ｋ、６．７Ｋ、１９Ｋ、１１．６Ｋ（ＡＤＰ）、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）および１４．７Ｋの一部の欠失、およびＥ４ ３４Ｋの部分的欠失を有する３×１０１０ｖｐのＡｄ６およびＡｄ６５７－ＧＦＰ－Ｌｕｃの単回ｉ．ｖ．注射後４日目。略語： ｉ．ｖ、静脈内； ｖｐ、ウイルス粒子。
【図14】図１４は、血漿ＨＩＶ Ｅｎｖ結合力価を示す。異なるＳＣ－Ａｄおよびｇｐ１４０タンパク質を用いた免疫化を、大きな矢印でグラフの上に示す。ＥＬＩＳＡによるミッドポイントＦ８ ｇｐ１４０結合力価を、各免疫化の前後に各動物に関して示す。破線は、このアッセイにおける抗体の最小検出限界を示す。記号は個々の測定を観察できるように、各時点ではｘ方向に散布されている。ＳＣ－Ａｄ６－ＥｂｏｖはネガティブコントロールＡｄワクチンである。この動物群は、ｇｐ１４０でブーストされなかった。ＳＣ－Ａｄ６－Ｅｂｏｖ群との比較における一元配置ＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図16】図１６は、血漿ＡＤＣＣ活性を示す。血漿サンプルを、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３を感染させたＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５．ＣＤ４＋－Ｌｕｃ，標的細胞を殺すために、ＣＤ１６－ＫＨＹＧ－１エフェクター細胞で試験した。各ドットは、各動物の平均値を表す。対ＳＣ－Ａｄ６－Ｅｂｏｖ群の一元配置ＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図17】図１７は、粘膜ＡＤＣＣ活性を示す。膣洗浄および唾液サンプルを、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３を感染させたＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５．ＣＤ４＋－Ｌｕｃ，標的細胞を殺すために、ＣＤ１６－ＫＨＹＧ－１エフェクター細胞で試験した。各ドットは、各動物の平均値を表す。対ＳＣ－Ａｄ６－Ｅｂｏｖ群の一元配置ＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５。
【図18】図１８は、ＰＢＭＣおよびリンパ節からのＩＦＮ－γ分泌細胞を示す。ＰＢＭＣおよびリンパ節細胞はＩＦＮ－γの染色によりＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。抗Ｅｎｖは、保存されたＨＩＶ Ｅｎｖペプチド、およびＳＣ－Ａｄで刺激された細胞を示す。刺激されたウェルの各々におけるスポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数を計数し、バックグラウンドとしてのコントロール培地に対して調整した。各ドットは、各動物の平均値を表す。一元配置ＡＮＯＶＡにより＊ｐ＜０．０５。
【図19】図１９は、粘膜Ｔ細胞の輸送および活性化を示す。２回目のタンパク質ブースト後に採取した直腸生検からＴ細胞を回収し、ＣＤ４、ＣＤ８、α４β７インテグリン、ＣＤ６９およびＦｏｘＰ３についてフローサイトメトリーによって分析した。各ドットは、各動物の平均値を表す。
【図20】図２０は、血液中およびリンパ節中のＴｆｈ細胞応答を示す。４０週目に回収したＰＢＭＣおよびリンパ節細胞をＨＩＶ－１ Ｅｎｖタンパク質で刺激し、その後、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＸＣＲ５＋およびＩＬ－２１の共発現について調べた。各ドットは、各動物の平均値を表す。一元配置ＡＮＯＶＡにより＊ｐ＜０．０５。
【図21】図２１は、反復的な直腸ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３チャレンジに対する保護を示す。示された群を、週１回ベースで、４．３ＴＣＩＤ５０（アカゲザルＰＢＭＣにおける）のＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３での直腸チャレンジに付した。血漿サンプルを、ＳＨＩＶウイルスＲＮＡコピーに関して分析した。１０を超えるＲＮＡコピーを有する動物を感染動物とみなし、その動物に感染させるのに必要なチャレンジの回数をカプラン・マイヤー生存分析のイベントとして用いた。
【図22】図２２は、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３獲得およびウイルス量を示す。Ａ）図８からの動物を、それらの最初のＳＣ－Ａｄプライミング経路（ＩＭまたはＩＮ）によって群分けし、８のグループを得、カプラン・マイヤー分析を行った。Ｂ）チャレンジ研究の経過中の血漿ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスＲＮＡレベル。
【図24】図２４は、例７に使用したシングルサイクルアデノウイルスワクチンを示す。Ａ）Ｆ８およびＧ４クレードＢのＨＩＶエンベロープ遺伝子を有するＳＣ－Ａｄ血清型６および６５７の図。Ｂ）ワクチン上に提示されたＡｄ６および５７ヘキソンを含むクレードＣのＡｄヘキソンのアライメント。
【図25】図２５は、唾液および膣のＨＩＶ ｅｎｖ結合滴定を示す。Ｆ８に対して試験した場合の、ＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０レベルを、示された希釈において示されたサンプルについて示す。これらの粘膜サンプルにおける抗体の低いレベルは、アッセイの飽和に達することを妨げる。この理由のために、ＥＣ５０値は、ほとんどの動物について信頼性をもって算出することができない。ＩＮ－ＩＭ－ＩＭ群におけるアカゲザルＲｈ１３－０９１は、ＥＣ５０を算出できた唯一の動物であった（ＥＣ５０＝４５８０）。ＳＦ１６２ ｇｐ１４０を用いたＥＬＩＳＡでも同様の結果が観察された。
【図26】図２６は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を生成する、Ｃ型肝炎およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＢ由来の抗原遺伝子を発現するＡｄ６５７を示す。ＣＭＶ ｇＢよりもむしろＡｄ６５７－ＨＣＶでワクチン接種したマウスにおいてＣ型肝炎ペプチド負荷標的細胞が殺されることを示す。
【図33-1】図３３は、異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入と、細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規アミノ酸、例えばシステインの、標的化化学修飾および遮蔽のためのヘキソンへの挿入とを組み合わせた図を示す。細胞および血液因子との天然の相互作用を調節するために異なるＡｄ血清型由来の異なるＨＶＲを組み合わせるキメラＨＶＲ構築物が示され、異なるＨＶＲにおける細胞結合および細胞脱標的化ペプチドの挿入と組み合わせて薬理が改善されて、細胞侵入および細胞回避を変化させる。１つのＨＶＲが１００種のＡｄから置き換えられる場合、これは、１００種の異なるヘキソンキメラを生成するであろう。７つ全てのＨＶＲがそれぞれ別のＡｄ ＨＶＲを受け取った場合、このコンビナトリアルライブラリーは、７１００バリアントに及ぶであろう。１つのペプチドを７つのＨＶＲに導入した場合、これは７Ｘ７１００バリアントに及ぶであろう。１０の異なるペプチドが７つのＨＶＲに導入された場合、これは１０Ｘ７Ｘ７１００に及ぶであろう、等々。
【図33-2】図３３は、異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入と、細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規アミノ酸、例えばシステインの、標的化化学修飾および遮蔽のためのヘキソンへの挿入とを組み合わせた図を示す。細胞および血液因子との天然の相互作用を調節するために異なるＡｄ血清型由来の異なるＨＶＲを組み合わせるキメラＨＶＲ構築物が示され、異なるＨＶＲにおける細胞結合および細胞脱標的化ペプチドの挿入と組み合わせて薬理が改善されて、細胞侵入および細胞回避を変化させる。１つのＨＶＲが１００種のＡｄから置き換えられる場合、これは、１００種の異なるヘキソンキメラを生成するであろう。７つ全てのＨＶＲがそれぞれ別のＡｄ ＨＶＲを受け取った場合、このコンビナトリアルライブラリーは、７１００バリアントに及ぶであろう。１つのペプチドを７つのＨＶＲに導入した場合、これは７Ｘ７１００バリアントに及ぶであろう。１０の異なるペプチドが７つのＨＶＲに導入された場合、これは１０Ｘ７Ｘ７１００に及ぶであろう、等々。
【図33-3】図３３は、異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入と、細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規アミノ酸、例えばシステインの、標的化化学修飾および遮蔽のためのヘキソンへの挿入とを組み合わせた図を示す。細胞および血液因子との天然の相互作用を調節するために異なるＡｄ血清型由来の異なるＨＶＲを組み合わせるキメラＨＶＲ構築物が示され、異なるＨＶＲにおける細胞結合および細胞脱標的化ペプチドの挿入と組み合わせて薬理が改善されて、細胞侵入および細胞回避を変化させる。１つのＨＶＲが１００種のＡｄから置き換えられる場合、これは、１００種の異なるヘキソンキメラを生成するであろう。７つ全てのＨＶＲがそれぞれ別のＡｄ ＨＶＲを受け取った場合、このコンビナトリアルライブラリーは、７１００バリアントに及ぶであろう。１つのペプチドを７つのＨＶＲに導入した場合、これは７Ｘ７１００バリアントに及ぶであろう。１０の異なるペプチドが７つのＨＶＲに導入された場合、これは１０Ｘ７Ｘ７１００に及ぶであろう、等々。
【図34】図３４は、代表的なコンビナトリアルヘキソンおよびペプチドの組み合わせについてのプラスミドマップを示す。Ａｄ６由来のＨＶＲ１およびＡｄ５７由来のＨＶＲ２～７を有するヘキソン、ならびに個々のＨＶＲへの細胞標的化ペプチドの挿入を示す。
【図35】図３５は、細胞および血液因子との天然の相互作用を調節するために異なるＡｄ血清型由来の異なるＨＶＲを組み合わせるキメラＨＶＲ構築物を示し、異なるＨＶＲにおける細胞結合および細胞脱標的化ペプチドの挿入と組み合わせて薬理が改善されて、細胞侵入および細胞回避を変化させる。この例では、単一のシステインアミノ酸をＡｄ６５７のＨＶＲ１およびＨＶＲ５に挿入して、薬理を調節し、ポリエチレングリコールのようなポリマーまたは発蛍光団のようなイメージング剤のような他の部分の標的化された連結を可能にする。
【図36】図３６は、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－Ｃへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の連結を示す。Ａ）ＰＥＧ化有り、ＰＥＧ化なしのＡｄタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。矢印は、ヘキソンへのＰＥＧの化学結合によるサイズ増加を示す。Ｂ）ウイルス感染におけるマレイミド－ＰＥＧおよび非標的化ＮＨＳ－ＰＥＧによる標的化ＰＥＧ化の効果。
【図37】図３７は、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－Ｃへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の連結を示す。Ａ）ＰＥＧ化有り、ＰＥＧ化なしのＡｄタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。Ｂ）Ａｄタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの近赤外イメージング（ＰＥＧ化有り、ＰＥＧ化なし、および近赤外蛍光イメージングタグＩＲ８００有り、なし）。Ｃ）ルシフェラーゼイメージングによる、マレイミド－ＰＥＧ化Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－Ｃの腹腔内注射後のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入。
【図38】図３８は、ヌードマウスのルシフェラーゼイメージングを示す。Ａ）Ａｄ６単回Ｉ．Ｖ．注射後１、４、７、１４、２８および４２日目ｖｓ遠隔ＤＵ１４５前立腺腫瘍。Ｂ）ＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を有するマウスへの増殖型Ａｄ５－ＧＦＰＬＵＣのＩ．Ｖ．注射後３、７および１９日目。
【図41】図４１は、Ａｄ治療サイクルを示す概略図である。Ａ）Ａｄによる血清型スイッチング（ｓｅｒｏｔｙｐｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）の概要図。Ｂ）Ａｄ６およびＡｄ６５７が、共有結合ポリマー連結と組み合わされた血清型スイッチングによる複数ラウンドの治療のために使用できる、例示的な治療サイクルの概略図。
【図42】図４２は、Ｅ３Ａ遺伝子（１２．５Ｋ、６．７Ｋ、１９Ｋ、１１．６Ｋ）が欠失しているがＥ３Ｂ遺伝子（１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋ）が保持され、Ｅ４ ３４Ｋが保持されたＡｄ６およびＡｄ６－Ｆ３５の単回ＩＶ注射後の、ＤＵ１４５前立腺腫瘍における血清型スイッチングおよびオンターゲットルシフェラーゼ活性を示す。腫瘍がＡｄ６５７およびＣＲＡｄ６５７（両者とも元のままのＥ３遺伝子を有する）による事前の単回ＩＶ注射に耐えたマウスに、示されたベクターを単回ＩＶ注射によって注射した。
【図43】図４３は、Ｅ１発現が天然のＥ１プロモーターによって制御されている、複製能を有するＡｄ（ＲＣ－Ａｄ）；Ｅ１発現が前立腺特異的プロバシンプロモーターによって制御されているバリアントＣＲＡｄ－プロバシン－Ｅ１Ａ（Ａｄ－ＰＢ）；ｐ３００経路との結合能が除去され、正常細胞におけるＩＦＮ経路に対して感受性である、ＣＲＡｄ－ｄｌ１１０１；ｐＲＢとの結合能が除去されることによって、ウイルスがＲＢ経路途絶を有する癌細胞を殺すことを可能にするが、ＲＢ＋正常細胞においては抑制される、ＣＲＡｄ－ｄｌ１１０７；ｐ３００経路との結合能が除去され、ＩＦＮ経路に対して感受性であり、ｐＲＢとの結合能が除去されることによって、ウイルスがＲＢ経路途絶を有する癌細胞を殺すことを可能にするが、ＲＢ＋正常細胞においては抑制される、ＣＲＡｄ－ｄｌ１１０１／０７。
【図49】図４９は、ヒト前立腺腫瘍を有するマウスにおける単回静脈内注射後のｉｎ ｖｉｖｏでの、複製能を有するＡｄ６５７および制限増殖型Ａｄ６５７－ｄｌ１１０１／０７（両方とも元のままのＥ３領域を有する）の、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果を示す。
【図57】図５７は、Ａｄ種Ｃの代表例Ａｄ６とＡｄ種Ｄの代表例Ａｄ２６における異なるＥ３免疫回避遺伝子の概略図を示す。両方のＡｄの発現サイズおよびＥ３の配列バリアント １２．５Ｋ、６．７Ｋ、１９Ｋ、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）、および１４．７Ｋ遺伝子、ならびにこれらのＥ３にコードされるタンパク質の機能の描写。
【図58】図５８は、免疫正常ハムスターにおけるＡｄ６－Ｌｕｃウイルスによる腫瘍溶解性ウイルス抗腫瘍活性に対するＰＥＧ化およびＥ３欠失の効果を示す。Ａｄ６－ＬｕｃおよびＡｄ６－Ｌｕｃ－２０Ｋ ＰＥＧは両方とも、全Ｅ３遺伝子およびＥ４ ３４Ｋを元のままで有している。Ａｄ６－ｄｅｌｔａＥ３－Ｌｕｃは、Ｅ３ １２．５ＫとＥ４ ３４Ｋの部分的欠失、およびＥ３ ６．７Ｋ、１９Ｋ、１１．６Ｋ（ＡＤＰ）、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）および１４．７Ｋ遺伝子の全欠失を有する。これらの免疫回避遺伝子が腫瘍溶解性アデノウイルスに存在しない場合、この免疫正常動物モデルでは腫瘍溶解効果が失われる。
【図59】図５９は、Ｅ３ １２．５ＫとＥ４ ３４Ｋの部分的欠失、およびＥ３ ６．７Ｋ、１９Ｋ、１１．６Ｋ（ＡＤＰ）、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）および１４．７Ｋ遺伝子の全欠失を有するＡｄ６５７のプラスミドマップである。
【図61】図６１は、Ｅ３挿入部位を有するＣＲＡｄ６５７を示す。これらは、本明細書において記載されるｄｌ１１０１／１１０７ ＣＲＡｄ修飾を伴う場合と伴わない場合、およびＥ３免疫回避修飾を伴う場合と伴わない場合である。
【図62】図６２は、ＣＲＡｄ６５７＋／－ Ａｄ３５ファイバーまたはＣｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｃ６８ファイバー＋／－Ｋ７ペプチドを示す。これらは、前のスライドにおいて記載されるｄｌ１１０１／１１０７ ＣＲＡｄ修飾を伴う場合と伴わない場合、およびＥ３免疫回避修飾を伴う場合と伴わない場合である。いくつかの場合では、Ｅ４の後かつファイバーの前にコドンのゆらぎを有するＥ４ ３４Ｋ遺伝子が含まれ、Ｅ３Ｂ遺伝子を欠失させた場合にＥ４ ３４Ｋの部分欠失を補う。
【図63】図６３は、ＣＲＡｄ６５７＋／－Ａｄ３５ファイバーまたはＣｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｃ６８ファイバー＋／－Ｋ７ペプチドを示す。これらは、前のスライドにおいて記載されるｄｌ１１０１／１１０７ ＣＲＡｄ修飾を伴う場合と伴わない場合、およびＥ３免疫回避修飾を伴う場合と伴わない場合である。
【図66】図６６は、１つのウイルスにおいて４－１ＢＢＬまたはＧＭＣＳＦまたはＩＬ２１またはＣＤ４０Ｌおよび組み合わせを発現するＣＲＡｄ６５７＋／－Ａｄ３５ファイバーまたはチンパンジーＣ６８ファイバー＋／－Ｋ７ペプチドを示す。
【図69】図６９は、Ａｄ６ ＨＶＲ１、Ａｄ５７ ＨＶＲ２～６、Ａｄ６ ＨＶＲ７＋／Ａｄ３５ファイバーまたはチンパンジーＣ６８ファイバー＋／－Ｋ７ペプチドを有し、ＧＦＰルシフェラーゼを発現するＡｄ６／５７／６を示す。
【図70】図７０は、血清型スイッチング後のルシフェラーゼイメージングを示す。側腹にＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を有するマウスを、Ａｄ６５７またはＣＲＡｄ６５７の単回ＩＶ注射により処置した。単回ＩＶ注射の５か月後に残存腫瘍を有するマウスを、バリアントファイバーおよびコドン最適化Ｅ４ ３４Ｋ遺伝子を有するおよび有しない、ＧＦＰルシフェラーゼを発現する示されたＡｄ６／５７／６バリアントの血清型スイッチングにより処置した。示したＡｄ６／５７／６バリアントは、ファイバー上に付加された７つのリジン（Ｋ７）、Ａｄ６ファイバー上にそのＫＫＴＫフレキシビリティードメイン後にグラフトされたチンパンジーＣ６８ファイバーを含む異なるファイバー修飾を有し、Ａｄ３５ファイバーを有するＡｄ６／５７／６ウイルスを含む。マウスを、７日後にルシフェラーゼ活性について画像化した。
【0049】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸送達、ワクチン接種、および／または癌の治療のための方法および材料を提供する。例えば、本発明は、タンパク質／ポリペプチドの核酸送達、ワクチン接種、および／または腫瘍溶解剤として１種または複数の組換えＡｄ（例えば、Ａｄ６５７およびそのバリアント）を使用する癌の治療のための方法および材料を提供する。
本発明は、核酸送達、ワクチン接種、および／または癌の治療のための方法および材料を提供する。例えば、本発明は、タンパク質／ポリペプチドの核酸送達、ワクチン接種、および／または腫瘍溶解剤として１種または複数の組換えＡｄ（例えば、Ａｄ６５７およびそのバリアント）を使用する癌の治療のための方法および材料を提供する。
【0050】
アデノウイルス二十面体は、そのヘキソンタンパク質７２０コピーから構成される。ウイルスはこのタンパク質を受容体に結合するためには使用しないが、繰り返しタンパク質のこのナノ格子はタンパク質、細胞および薬剤との相互作用（例えば、天然の相互作用および非天然の相互作用）のためのマトリックスを提供する。Ａｄを中和できる抗体は、Ａｄ上のヘキソンポリペプチドの超可変領域（ＨＶＲ）を標的とすることができる。
【0051】
いくつかの場合において、本発明は、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄを提供する。例えば、組換えＡｄは、第１のＡｄから誘導することができ、そして１種または複数の異なるＡｄ由来のヘキソンＨＶＲを含むことができる。ＨＶＲは、任意の種ＣのＡｄ、例えば、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６およびＡｄ５７から誘導され得る。一実施態様では、組換えＡｄは、第１のＡｄから誘導することができ、そして少なくとも１種の他のＡｄからの１つまたは複数のヘキソンＨＶＲを含むことができ、ここで、少なくとも１つのヘキソンＨＶＲは第１のＡｄのＨＶＲ（複数可）とは異なる。第１のＡｄ株はヒトＡｄ６株であることができ、そして第２のＡｄ株はヒトＡｄ５７株であることができる。ヘキソンシャトルプラスミドマップ（図３４）は、異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入と、細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規アミノ酸、例えばシステインの、標的化化学修飾および遮蔽のためのヘキソンへの挿入との組み合わせを示す。一実施態様では、前記組換えＡｄは、アミノ酸置換、例えば、ポリペプチド中へのシステインの置換、および修飾、例えばＰＥＧ化およびＢＡＰ化を含む。ここでは、Ａｄ６５７に挿入されたポリマーおよびシステインに関する他の化学修飾を標的とする能力が示される。
【0052】
Ａｄ６５７が、ヒト前立腺癌に対する腫瘍溶解物質として実証される。Ａｄ６ ＨＶＲをＡｄ５７由来のものと置き換えて、Ａｄ６５７と呼ぶキメラ種Ｃ腫瘍溶解性ウイルスを生成した。Ａｄ６５７およびＡｄ６を、ヒト癌性腫瘍を有するヌードマウスにおいて単回ｉ．ｖ．注射による全身性腫瘍溶解療法として試験した。Ａｄ６５７は、癌に対する局所または全身腫瘍溶解性ウイルス療法として使用し得る。これらのデータは、腫瘍溶解性の種Ｃ Ａｄでの血清型スイッチング（ｓｅｒｏｔｙｐｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）の驚くべき効果も示している。
【0053】
いくつかの場合において、本発明は、癌、感染性疾患および／または遺伝的疾患を有するかもしくは有するリスクがある哺乳動物を治療するために、本明細書において提供される１種または複数の組換えＡｄを使用するための方法を提供する。例えば、１種または複数の組換えＡｄは、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある哺乳動物に、当該哺乳動物（例えば、ヒト）における癌細胞の数を減少させるために（例えば、癌細胞に感染し殺すことによって）、投与することができる。例えば、１種または複数の組換えＡｄは、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある哺乳動物に、当該哺乳動物（例えば、ヒト）における抗癌免疫応答を刺激するために投与することができる。
【0054】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）は、哺乳動物の免疫系によって破壊されない。例えば、組換えＡｄは、当該組換えＡｄが投与される哺乳動物における抗原提示細胞（ＡＰＣ）、マクロファージおよび／または他の免疫細胞によって破壊されない。
【0055】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）は、複数（例えば２以上）ラウンドの治療のために投与することができる。例えば、本明細書に記載される第１の組換えＡｄは本明細書に記載される第２の組換えＡｄを中和できる抗体を回避することができ、逆もまた同様である。癌を有する哺乳動物が本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄで治療される場合、前記哺乳動物は、第１の組換えＡｄでの第１ラウンドの治療を施され、引き続き第２の組換えＡｄでの第２ラウンドの治療を施されることができる。
【0056】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）は、複製能を有するＡｄ（ＲＣ－Ａｄ）であることができる。例えば、ＲＣ－Ａｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸を含むＲＣ－Ａｄ（例えば、Ｅ１＋ＲＣ－Ａｄ）であることができる。例えば、ＲＣ－Ａｄは、感染性のウイルス子孫の産生に関連する１種または複数のポリペプチド（例えば、ｐＩＩＩａおよびＥ３）をコードする１つまたは複数の核酸の欠失を含むシングルサイクルＡｄ（ＳＣ－Ａｄ）であることができる。例えば、ＲＣ－Ａｄは、制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であることができる。シングルサイクルＡｄの例、およびそれらの製造および使用方法は、他において提供されている（国際特許出願公開ＷＯ２００９／１１１７３８号）。
【0057】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）は、複製欠損Ａｄ（ＲＤ－Ａｄ）であることができる。例えば、ＲＤ－Ａｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸の欠失を含むＲＤ－Ａｄ（例えば、Ｅ１欠失ＲＤ－Ａｄ）であり得る。
【0058】
本明細書の例において、ＣＲＡｄ６５７およびそのバリアントが癌性細胞において制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であること、およびＣＲＡｄ６５７およびバリアントが細胞生存率および腫瘍体積を減少させることが実証されている。従って、ＣＲＡｄ６５７およびそのバリアントは、癌を有する対象における局所または全身性の腫瘍溶解性ウイルス療法として使用され得る。
【0059】
さらに、ＣＲＡｄが抗原の発現のために使用でき、ウイルスに対するワクチン接種のための、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するワクチン接種のためのワクチンとして使用できることが実証される。
【0060】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）は、（例えば、細胞へのウイルス侵入を容易にするために）細胞表面受容体に結合することができる。例えば、本明細書において記載される組換えＡｄは、コクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）および／またはＦｃ受容体（例えば、ＦｃμＲおよびＦｃγＲ）、補体受容体（例えば、ＣＲ３および／またはＣ２ｑＲ）に結合することができる。
【0061】
本発明の一態様では、ＣＲＡｄは、Ａｄに対して異種のポリペプチド、例えば抗原、細胞表面受容体、細胞標的化ポリペプチドなどをコードする核酸を含むことができる。例えば、ＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１／１１０７－ＦｏｌＲ は、元のままの（ｉｎｔａｃｔ）Ｅ３を含み、ヒトホレート受容体αを発現する組換えＡｄである。本明細書では、ＣＲＡｄを用いて、既知の癌抗原、例えばホレート受容体αに対する抗体を生成できることが実証されている。
【0062】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、（例えば、細胞へのウイルス侵入を容易にするために）スカベンジャー受容体への結合を回避することができる（例えば結合しない）。例えば、本明細書において記載される組換えＡｄは、ＳＲＥＣ受容体および／またはＳＲ－Ａ受容体への結合を回避する。
【0063】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、ファゴサイトーシスを回避することができる。
【0064】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、非病原性である（例えば、本明細書において記載されるように治療される哺乳動物に対して）。
【0065】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、分裂細胞に感染することができる（例えば分裂細胞にのみ感染することができる）。
【0066】
本明細書において記載される組換えＡｄは、組換えＤＮＡ技術および当業者に公知の方法によって生成される任意の適切な組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ）であることができる。組換えＡｄは、当該組換えＡｄが由来するＡｄ以外の任意の生物由来の物質（例えば、核酸および／またはポリペプチド）を組換えることによって生成される任意のＡｄであることができる。例えば、組換えＡｄは、そのＡｄ中に天然には存在しない（例えば、組換え前にそのＡｄ中に天然には存在しない）１種または複数の物質を含むことができる。いくつかの場合において、本明細書において提供される組換えＡｄは、キメラＡｄであることができる（例えば、２種またはそれを超える（例えば、２、３、４、５またはそれを超える）異なるＡｄゲノム由来のウイルスエレメントを含むことができる）。
【0067】
これらの実施態様は、異なるＡｄからの異なるＨＶＲを組み合わせる（すなわち、ＨＶＲをシャッフルする）Ａｄとの関連においても適用されている。例えば、Ａｄ６のＨＶＲ１とＡｄ５７のＨＶＲ２～７、またはＡｄ６のＨＶＲ１および７とＡｄ５７のＨＶＲ２～６、またはＡｄ６からのＨＶＲ１および７とＡｄ６５７からのＨＶＲ２～６。
【0068】
Ａｄ中に天然には存在しない核酸および／またはポリペプチドは、任意の適切な起源に由来し得る。いくつかの場合において、そのようなＡｄ中に天然には存在しない核酸および／またはポリペプチドは、非ウイルス性の生物由来であることができる。いくつかの場合において、そのようなＡｄ中に天然には存在しない核酸および／またはポリペプチドは、Ａｄ以外のウイルス由来であることができる。いくつかの場合において、そのようなＡｄ中に天然には存在しない核酸および／またはポリペプチドは、異なる種から得られるＡｄ由来であることができる。いくつかの場合において、そのようなＡｄ中に天然には存在しない核酸および／またはポリペプチドは、Ａｄの異なる株（例えば、血清型が異なる株）由来であることができる。いくつかの場合において、そのようなＡｄ中に天然には存在しない核酸および／またはポリペプチドは、合成核酸および／または合成ポリペプチドであることができる。
【0069】
本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、任意の適切なＡｄから誘導することができる（例えば、任意の適切なＡｄ由来のゲノムバックボーンを含むことができる）。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、低い血清抗体保有率を有するＡｄから誘導することができる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）の５０％以下（例えば、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％以下）が、本明細書において記載される組換えＡｄが由来するＡｄに曝露されていてよい。血清抗体保有率に関して、種ＣアデノウイルスであるＡｄ６およびＡｄ６５７は、原型Ａｄ５ウイルスよりも低い有病率を有する。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、副作用（例えば、ファゴサイトーシスおよび肝臓損傷）が減少または排除されたＡｄから誘導することができる。組換えＡｄは、任意の適切な動物種から単離されるＡｄから誘導することができる。例えば、Ａｄは、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル類、例えばアカゲザルのような旧世界ザル種）、魚類、カエル類およびヘビ類から単離することができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、ヒトＡｄ（ＨＡｄまたはＨＡｄＶ）から誘導することができる。組換えＡｄはＡｄの任意の種（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ）から誘導することができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、Ａｄ Ｃ種（例えば、ヒトＡｄ Ｃ種（ＨＡｄ－Ｃ））から誘導することができる。組換えＡｄは、任意の適切なＡｄ血清型（例えば、２、５、６または５７）から誘導することができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、Ａｄ血清型６（Ａｄ６；例えばヒトＡｄ６）から誘導することができる。
【0070】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）は、ポリペプチド（またはその断片）をコードする１つまたは複数の核酸および／またはＡｄゲノムの１種または複数のウイルスエレメントに対して、１つまたは複数の修飾を含むＡｄゲノムを含み得る。前記の１つまたは複数の修飾は、任意の適切な修飾であることができる。いくつかの場合において、修飾は、当該修飾を施されたポリペプチドが別のポリペプチド、例えばｐ３００および／またはｐＲＢに結合する能力を阻害するのに有効であることができる。いくつかの場合において、修飾は、１つまたは複数のインターフェロン経路を中和するために有効であることができる。ポリペプチドをコードする核酸に対してまたはウイルスエレメントに対してなされ得る修飾の例としては、置換、欠失、挿入および突然変異が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0071】
Ａｄ（例えば、Ａｄ６５７およびそのバリアント）は、修飾され、全てのＥ１Ａ遺伝子を保持してよく、あるいは、選択された領域およびそれらのコードされるタンパク質の機能を欠失するように修飾されてもよい。
【0072】
図５７は、Ａｄ種Ｃの代表例Ａｄ６とＡｄ種Ｄの代表例Ａｄ２６における異なるＥ３免疫回避遺伝子の概略図を示し、ならびにこれらのＥ３にコードされるタンパク質の機能を描写する。両方のＡｄの発現サイズおよびＥ３の配列バリアント １２．５Ｋ、６．７Ｋ、１９Ｋ、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）、および１４．７Ｋ遺伝子。１９Ｋは、感染細胞をＴ細胞およびＮＫ細胞から保護するために、細胞表面上のＭＨＣ ＩおよびＭＩＣタンパク質の提示を減少させる。ＲＩＤタンパク質は、死誘導性リガンド（ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲおよびＥＧＦＲ）から感染細胞を保護する。１４．７Ｋは、感染細胞におけるアポトーシスの内因性活性化を阻害する。種ＣのＡｄはまた、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＤＰ）として知られる１１．６Ｋも発現する。ＡＤＰの過剰発現は細胞死を加速させるが、全体的な細胞死は同等である。種Ｄのウイルスはまた、４９Ｋおよび３１Ｋと呼ばれる２つの新規バリアントも発現する。分泌型の４９Ｋは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＣＤ４６に結合し、これらの細胞のダウンレギュレーション、およびＮＫ細胞によるクラスＩ ＭＨＣ欠損細胞の効率の低い細胞殺傷をもたらす。Ａｄ６５７プラスミドは、全てのネイティブＥ３免疫回避遺伝子（１２．５Ｋ、６．７Ｋ、１９Ｋ、１１．６Ｋ（ＡＤＰ）、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）および１４．７Ｋ）およびＥ４ ３４Ｋを保持するために、または選択された領域を削除するために修飾されている。Ａｄ６５７およびそのバリアントはまた、４９Ｋおよび３１Ｋの付加によって修飾されて、これらの種Ｃウイルスプラットフォームにこれらの追加の機能も付与する。
【0073】
Ａｄ（例えば、Ａｄ６５７およびそのバリアント）は、全てのＥ３免疫回避遺伝子を保持するように、または選択された領域およびそれらのコードタンパク質の機能を欠失するように修飾されてもよい。Ｅ３突然変異に関して：１９ｋは、感染細胞上のＭＨＣＩおよびＭＩＣタンパク質をダウンレギュレートする；ＡＤＰの過剰発現は、細胞死を加速させるが、殺される細胞数は増加させない；１０ｋおよび１４ｋタンパク質（ＲＩＤαおよびＲＩＤβ）は、組み合わされてＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＴＮＦＲおよびＥＧＦＲのような外因性アポトーシスタンパク質が細胞を殺すのを妨げる；１４．７ｋタンパク質は、内因性アポトーシスシグナル伝達を阻害する。
【0074】
これらのＥ３タンパク質を保持することにより、腫瘍溶解をより長く持続させ得、それらを欠失させると免疫刺激が増加し得る。
【0075】
腫瘍溶解性効果を試験したデータからは、元のままのＥ３がより良好な有効性を媒介することが示唆される。
【0076】
ＤＥ３構築物は１２．５ｋから１４．７ｋまでの部分が欠失されており、ＤＥ３Ａ構築物はＥ３ １２．５ｋから１９ｋまでの部分が欠失されており、そしてＤＥ３ＡＤＰ構築物は、Ｅ３ １２．５ｋからＡＤＰまでの部分が欠失されている。
【0077】
驚くべきことに、全てのＥ３遺伝子を欠失させると、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍増殖抑制効果が低下する。
【0078】
一実施態様では、本発明は、シングルサイクルアデノウイルス、例えばＳＣ－Ａｄ６５７およびそのバリアントを包含する。ポリペプチドをコードする異種核酸を有する組換えＳＣ－Ａｄウイルスを、ワクチンとしての使用について評価した。ＳＣ－Ａｄ６５７ワクチンは単独で、単回免疫化だけの後に、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対する有意な循環抗体力価をもたらした。
【0079】
同様に、Ｂ型およびＣ型肝炎抗原の遺伝子を保有するＡｄ６５７は、肝炎およびサイトメガロウイルスに対して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成することができる。
【0080】
ヒト乳頭腫ウイルス由来の合成ペプチドをＨＶＲ５に挿入することにより、Ａｄ６５７を修飾した。一実施態様では、バリアントＡｄ６５７－ＨＶＲ５－ＨＰＶヘキソンのアミノ酸配列が配列番号５７に定義される。当該修飾は、ワクチン目的のためのこの抗原の提示、ならびにＨＰＶペプチドと相互作用するタンパク質への結合による再標的化を可能にする。
【0081】
さらなる実施態様において、Ａｄ６５７によるヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の発現が、本明細書において実証される。
【0082】
従って、本明細書の例から、組換えＡｄ、例えばＡｄ６５７およびそのバリアントが、異種タンパク質、例えばポリペプチド抗原および細胞標的化ポリペプチドの発現に利用され得ることが実証される。
【0083】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、１つまたは複数の置換を含むＡｄゲノムを含むことができる。例えば、ポリペプチド（またはその断片）をコードする１つまたは複数の核酸、および／またはＡｄゲノムによってコードされる１つまたは複数のウイルス要素が置換されてよい。置換は、任意の適切な置換であることができる。いくつかの場合において、第１のＡｄのゲノムのキャプシドポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を、第２のＡｄのキャプシドポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸で置換して、キメラＡｄを生成することができる。例えば、組換えＡｄが、第１のＡｄ由来のゲノムであって、当該ゲノムにおけるキャプシドポリペプチドをコードする核酸が第２のＡｄ（例えばＡｄバックボーンとは異なるＡｄ）由来のキャプシドポリペプチドをコードする核酸で置換されているゲノムを含む場合、第２のＡｄ由来のキャプシドポリペプチドをコードする前記核酸は、１種または複数のキャプシドポリペプチドを発現することができ、発現されたキャプシドポリペプチド（単数または複数）は、組換えＡｄのキャプシドに組み込まれることができる。キャプシドポリペプチドの例としては、ヘキソンポリペプチド、ファイバーポリペプチド、ペントンベース（ｐｅｎｔｏｎ ｂａｓｅ）ポリペプチド、ＩＩＩａポリペプチド、ＩＸポリペプチド、およびｐＶＩポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
【0084】
Ａｄファイバータンパク質は、初期の細胞付着ステップを媒介する３つのおそらく同一のサブユニットの複合体である。天然のＡｄ６ファイバータンパク質は、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＡＲに結合する。
【0085】
本発明の一態様では、親Ａｄまたは「バックボーン」Ａｄ由来でないファイバータンパク質を有するファイバー修飾組換えおよびキメラＡｄを生成した。
【0086】
キメラＡｄであるＡｄＦ３５ファイバーキメラは、配列番号６１のアミノ酸配列を有し、Ａｄ５およびＡｄ６ファイバータンパク質より短く、ウイルスの標的をＣＤ４６に変える。
【0087】
配列番号６２の配列を有するＫ７ファイバーを含むファイバー修飾組換えＡｄは、ウイルスの標的を、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび細胞上の負電荷に向けさせる。
【0088】
配列番号６３の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８由来のファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。当該ファイバータンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質より短く、ＣＡＲに結合する。
【0089】
配列番号６４の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８由来のファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。当該ファイバータンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質より短い。６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、標的がヘパリン硫酸および負電荷に変わる。
【0090】
配列番号６５の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８由来のファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。当該ファイバータンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質より短い。６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、標的がヘパリン硫酸および負電荷に変わる。
【0091】
いくつかの場合において、組換えＡｄは、第１のＡｄ由来のゲノムであって、当該ゲノムにおけるヘキソンポリペプチドをコードする核酸（例えば、ヘキソンポリペプチドをコードする核酸のＨＶＲ）が第２のＡｄ由来のヘキソンポリペプチドをコードする核酸（例えば、ヘキソンポリペプチドをコードする核酸のＨＶＲ）で置換されている第１のＡｄ由来のゲノムを含むことができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、第２のＡｄからの１つまたは複数のＨＶＲで置換された１つまたは複数のＨＶＲを有する第１のＡｄからのゲノムを含むことができる。例えば、組換えＡｄは、キメラ、特にＡｄ６５７であることができる（例えば、ヘキソンＨＶＲがＡｄ５７ヘキソンＨＶＲと置き換えられているＡｄ６ゲノムを含むことができる）。組換えＡｄが、第１のＡｄ由来のゲノムであって、当該ゲノムにおけるヘキソンポリペプチドをコードする核酸が第２のＡｄ由来のヘキソンポリペプチドをコードする核酸で置換されている第１のＡｄ由来のゲノムを含む場合、当該組換えＡｄは、第２のＡｄ由来のヘキソンポリペプチドを約１～約７２０含むことができる。例えば、組換えＡｄがＡｄ６５７である場合、当該Ａｄ６５７は、Ａｄ６ゲノムと、Ａｄ５７ヘキソンＨＶＲを含む７２０のヘキソンポリペプチドを含み得る。
【0092】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、１つまたは複数の核酸欠失を含むＡｄゲノムを含むことができる。核酸欠失は、任意の適切な核酸欠失であり得る。核酸欠失は、完全欠失（例えば、ポリペプチドをコードする核酸の欠失）または部分欠失（例えば、ポリペプチドをコードする核酸内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失）であり得る。核酸欠失は、欠失した核酸によってコードされるポリペプチドの転写および翻訳を減少または排除することができる。任意の適切な核酸を欠失させることができる。いくつかの場合において、感染性の子孫の産生に関連するポリペプチドをコードする核酸を欠失させることができる。本明細書において記載される組換えＡｄにおいて欠失および／または修飾できる核酸の例は、Ｅ１（例えば、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、ｐＩＩＩＡ、ファイバー、Ｅ１Ｂをコードし得、ウイルスエンハンサーおよびプロモーターを含み得る。例えば、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含むＡｄゲノムを含むことができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸における１つまたは複数の置換を含むことができる。
【0093】
特定の実施態様では、本明細書に記載される組換えＡｄは、例えば、配列番号４８の核酸を含むプロバシンプロモーターを含むように修飾され；本明細書に記載される組換えＡｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中にｄｌ１１０１欠失を含むように修飾され；本明細書に記載される組換えＡｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中にｄｌ１１０７欠失を含むように修飾され；本明細書に記載される組換えＡｄはｄｌ１１０１欠失およびｄｌ１１０７欠失を含むように修飾されている。Ｅ１Ａポリペプチド、例えば野生型Ａｄ Ｅ１Ａ、およびＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１、ＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０７およびＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１／１１０７バリアントのＮ末端アミノ酸配列に関して、本明細書の例および図５６を参照されたい。
【0094】
一実施態様では、バリアントＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１／１１０７－ＦｏｌＲは、元のままのＥ３を含み、癌細胞上に見出されるヒトホレート受容体αを発現する。
【0095】
概して、Ａｄは、本明細書に記載されるＣＲＡｄ修飾を含むように修飾されてもよい。
【0096】
いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）は、１つまたは複数の核酸挿入を含むＡｄゲノムを含むことができる。例えば、核酸挿入は、ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。核酸は、本明細書において記載される組換えＡｄのゲノム内の任意の適切な位置に挿入することができる。いくつかの場合において、ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書において記載される組換えＡｄのゲノムのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ ５ループ）に挿入することができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸が本明細書において記載される組換えＡｄのゲノムのＨＶＲに挿入される場合、ポリペプチドをコードする当該核酸は、１種または複数のポリペプチドを発現することができ、発現されたポリペプチド（単数または複数）は、組換えＡｄのキャプシド中に組み込まれ得る。ポリペプチドをコードする核酸が、本明細書に記載される組換えＡｄのゲノムのＨＶＲ中に挿入される場合、前記組換えＡｄは、その表面上に、挿入された核酸によってコードされる約１～約７２０のポリペプチドを提示することができる。核酸挿入は、任意の適切なポリペプチドをコードする核酸であることができる。いくつかの場合において、核酸挿入は、ポリペプチド抗原をコードすることができる。
【0097】
いくつかの場合において、核酸挿入は、標的化ポリペプチドをコードすることができる。本明細書において記載される組換えＡｄに含まれ得る標的化ポリペプチドの例には以下が含まれるが、限定はされない：ペプチド１２．５１（ＴＡＲＧＥＨＫＥＥＥＬＩ；配列番号１）、ペプチド１２．５２（ＬＲＱＴＧＡＡＳＡＶＷＧ；配列番号２）、１２．５３（ＡＲＲＡＤＴＱＷＲＧＬＥ；配列番号３）、ＶＳＶ（ＧＴＷＬＮＰＧＦＰＰＱＳＣＧＹＡＴＶＴ；配列番号４）、ＲＧＤ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号５）、α４インテグリン結合ペプチド（ＮＭＳＬＤＶＮＲＫＡ；配列番号６）、Ｍｅｔ３－４（ＩＳＬＳＳＨＲＡＴＷＶＶ；配列番号７）、Ｌ１０．１Ｆ（ＷＴＭＧＬＤＱＬＲＤＳＳＷＡＨＧＧＦＳＡ；配列番号８）、Ｌ１０．１ＲＧＤＦ（ＷＴＭＧＬＤＱＬＲＧＤＳＳＷＡＨＧＧＦＳ；配列番号９）、Ｌ１０．２Ｆ（ＲＳＶＳＧＴＥＷＶＰＭＮＥＱＨＲＧＡＩＷ；配列番号１０）、Ｌ１０．５Ｆ（ＴＥＬＲＴＨＴＳＫＥＬＴＩＲＴＡＡＳＳＤ；配列番号１１）、Ｓ５．１（ＤＲＡＩＧＷＱＤＫＬＹＫＬＰＬＧＳＩＨＮ；配列番号１２）、ＤＵ９Ｃ．１（ＭＧＳＷＥＫＡＡＬＷＮＲＶＳＡＳＳＧＧＡ；配列番号１３）、ＤＵ９Ｃ．２（ＭＡＭＧＧＫＰＥＲＰＡＤＳＤＮＶＱＶＲＧ；配列番号１４）、ＤＵ９Ａ．７（ＭＡＳＲＧＤＡＧＥＧＳＴＱＳＮＴＮＶＰＳ；配列番号１５）、ＸＳ．１（ＧＰＥＤＴＳＲＡＰＥＮＱＱＫＴＦＨＲＲＷ；配列番号１６）、ＲＥＤＶｍｙｃ（ＭＧＲＥＤＶＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＧＳ；配列番号１７）、ＲＧＤ－４Ｃ（ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ；配列番号１８）、ＲＥＤＶ－４Ｃ（ＡＣＤＣＲＥＤＶＣＦＣＧ；配列番号１９）、ＳＫＢＲ５Ｃ１（ＧＱＩＰＩＴＥＰＥＬＣＣＶＰＷＴＥＡＦＹ；配列番号２０）、２３１Ｒ１０．１（ＰＱＰＰＮＳＴＡＨＰＮＰＨＫＡＰＰＮＴＴ；配列番号２１）、ＨｅｐａＣＤ８（ＶＲＷＦＰＧＧＥＷＧＶＴＨＰＥＳＬＰＰＰ；配列番号２２）、Ｋ２０（ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ；配列番号２３）、ＢＡＰ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨ；配列番号２４）、ＣＡＬＭ ＢＰ（ＣＡＡＡＲＷＫＫＡＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳ；配列番号２５）、ＥＢＶ（ＥＤＰＧＦＦＮＶＥＩＰＥＦＰ；配列番号２６）、＃１－５（ＧＧＨＧＲＶＬＷＰＤＧＷＦＳＬＶＧＩＳＰ；配列番号２７）、＃＃４＊－５（ＭＡＲＴＶＴＡＮＶＰＧＭＧＥＧＭＶＶＶＰＣ；配列番号２８）、１－１（ＧＶＳＫＲＧＬＱＣＨＤＦＩＳＣＳＧＶＰＷ；配列番号２９）、１－２（ＮＱＳＩＰＫＶＡＧＤＳＫＶＦＣＷＷＣＡＬ；配列番号３０）、１－３（ＱＳＴＰＰＴＫＨＬＴＩＰＲＨＬＲＮＴＬＩ；配列番号３１）、１－４（ＤＭＳＦＱＬＶＴＰＦＬＫＡＬＰＴＧＷＲＧ；配列番号３２）、１－５（ＧＧＨＧＲＶＬＷＰＤＧＷＦＳＬＶＧＩＳＰ；配列番号３３）、１－５ｃｏｎ（ＦＳＬＶＧＩＳＰ；配列番号３４）、１－６（ＱＩＭＭＧＰＳＬＧＹＹＭＰＳＥＳＩＦＡＹ；配列番号３５）、２－１１（ＩＳＷＤＩＷＲＷＷＹＴＳＥＤＲＤＡＧＳＡ；配列番号３６）、２－１４（ＶＷＧＭＴＴＳＤＨＱＲＫＴＥＲＬＤＳＰＥ；配列番号３７）、２－２０（ＭＴＳＡＱＴＳＥＫＬＫＡＥＴＤＲＨＴＡＥ；配列番号３８）、２－９（ＭＧＳＲＳＡＶＧＤＦＥＳＡＥＧＳＲＲＰ；配列番号３９）、３ｂ－６（ＭＧＲＴＶＱＳＧＤＧＴＰＡＱＴＱＰＳＶＮ；配列番号４０）、４＊－５（ＭＡＲＴＶＴＡＮＶＰＧＭＧＥＧＭＶＶＶＰ；配列番号４１）、ＣＬＬペプチド、ＰＤ－１、ＧＬＡポリペプチド（例えば、第Ｘ因子）、抗原遺伝子、融合タンパク質、融合性糖タンパク質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、一本鎖抗体、および他のウイルス由来のキャプシドタンパク質。標的化ポリペプチドは、任意の適切なタイプの細胞を標的とすることができる。本明細書において記載される組換えＡｄに含まれる標的化ポリペプチドによって標的とされ得る細胞のタイプの例としては、筋細胞（例えば、骨格筋細胞）、腫瘍、癌細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、粘膜細胞、炭水化物および細胞膜が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0098】
この例は、ファージライブラリー上の適合性の構造的状況において選択されたペプチドが、Ａｄヘキソンタンパク質に翻訳され得ることを実証している。例えば、１２．５１ペプチドに関しては、この挿入部位は、筋肉形質導入を増加させるが、肝臓におけるオフターゲット感染を減少させる。従って、筋肉組織を標的とするこのような組換えＡｄは、遺伝子ベースの筋肉ワクチン接種のための、または筋肉への遺伝子療法適用／送達のためのベクターとして使用され得る。
【0099】
いくつかの場合において、核酸挿入はウイルスを脱標的化することができる（例えば、所与のＨＶＲ上で生じる細胞およびタンパク質相互作用を崩壊させることによって）。いくつかの場合において、核酸挿入は、検出可能な標識をコードすることができる。検出可能な標識の例としては、発蛍光団（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＢＦＰ）、ならびに酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ＤＮＡｓｅ、プロテアーゼ、トランスポーターおよびポリメラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0100】
本明細書に記載の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７、およびそのバリアント）を含有する発現ベクターもまた、本明細書において提供される。発現ベクターは、本明細書において記載される組換えＡｄを、別の細胞（例えば、癌細胞）中に運ぶことができ、そこでそれは複製および／または発現され得る。一般に発現構築物とも呼ばれる発現ベクターは、典型的には、特定の核酸の発現を制御するエンハンサー／プロモーター領域を有するプラスミドまたはベクターである。細胞に導入される場合、発現ベクターは、細胞内でウイルスを産生するために細胞のタンパク質合成機構を使用することができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄを含む発現ベクターは、ウイルスベクターであることができる。例えば、本明細書において記載される組換えＡｄを含む発現ベクターは、レトロウイルスベクターであることができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される組換えＡｄを含む発現ベクターはまた、１種または複数の導入遺伝子の挿入（例えばマルチクローニングサイトで）を可能にするように設計することもできる。例えば、本明細書において記載される組換えＡｄを含む発現ベクターはまた、検出可能な標識をコードする核酸を含むこともできる。検出可能な標識の例としては、発蛍光団（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＢＦＰ）、ならびに酵素（例えば、ルシフェラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、および転写因子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0101】
本発明はまた、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）を使用するための方法および材料を提供する。いくつかの場合において、本明細書において提供される組換えＡｄは、癌を有するか、または癌を有するリスクがある哺乳動物を治療するために使用することができる。例えば、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある哺乳動物を治療するための方法は、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄを前記哺乳動物に投与することを含むことができる。いくつかの場合において、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある哺乳動物を治療するための方法は、本明細書において記載される組換えＡｄをコードする１種または複数の発現ベクター、または本明細書において記載される組換えＡｄをコードする核酸を、前記哺乳動物に投与することを含むことができる。いくつかの場合において、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄは、哺乳動物における癌細胞の数を減少させるために（例えば、腫瘍増殖を抑制するおよび／または遅らせる）、および／または哺乳動物の生存を増加させるために、哺乳動物に投与することができる。
【0102】
血清型スイッチング腫瘍溶解性アデノウイルスによる癌性腫瘍の標的化が実証される。側腹にＤＵ１４５またはＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を有するマウスを、Ａｄ６５７でＩＶ注射により一度処置した。これらのマウスを、２度目に、ファイバー修飾を有し、ＧＦＰルシフェラーゼを発現する別のＡｄ６またはＡｄ６／５７／６腫瘍溶解性ウイルスバリアントで処置し、ルシフェラーゼ活性をイメージングによって測定した。Ａｄ６は、Ａｄ６ヘキソンとＣＡＲを標的とするファイバーを有する。Ａｄ６－Ｆ３５は、Ａｄ６ヘキソンとＣＤ４６を標的とするＡｄ３５ファイバーを有する。Ａｄ６／５７／６は、Ａｄ６からのＨＶＲ１および７、ならびにＡｄ５７からのＨＶＲ２～６を有する。Ａｄ６／５７／６ウイルスは、Ａｄ６ファイバー、ＡｄＣ６８ファイバー、またはＡｄ３５ファイバーを有する。図９におけるこれらのデータは、肝臓のオフターゲット感染がより低い、腫瘍を標的とするウイルスによる血清型スイッチ腫瘍溶解に関する驚くべき能力を示している。
【0103】
血清型スイッチングの別の例では、側腹にＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を有するマウスを、Ａｄ６５７またはＣＲＡｄ６５７を用いる単回の静脈内（ＩＶ）注射により処置した。これらのマウスを、５月後、２度目に、ＧＦＰルシフェラーゼおよびファイバーバリアントＫ７（７個のリジンが付加）、Ｆ３５（Ａｄ３５ファイバーを有する）またはＫＫＴＫ－Ｃ６８（Ａｄ６ ＫＫＴＫフレキシビリティードメインの後に融合されたチンパンジーＣ６８ファイバー）を発現する別のＡｄ６／５７／６腫瘍溶解性ウイルスで処置した。ＫＫＴＫ－Ｃ６８ウイルスはまた、ウイルス生産性を増強するために、付加されたコドン最適化Ｅ４ ３４Ｋ遺伝子を有する。ルシフェラーゼ活性をイメージングによって測定した。全てのＡｄ６／５７／６は、Ａｄ６からのＨＶＲ１および７、ならびにＡｄ５７からのＨＶＲ２～６を有するヘキソンを有する。Ａｄ６／５７／６およびＫＫＴＫ－Ｃ６８は、ＣＡＲを標的とするファイバーを有する。Ａｄ６／５７／６－Ｆ３５は、ＣＤ４６を標的とするＡｄ３５ファイバーを有する。Ｋ７は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンの結合を含む細胞上の負電荷への結合を増加させる。図７０は、肝臓のオフターゲット感染がより低い、腫瘍を標的とするウイルスによる血清型スイッチ腫瘍溶解に関する能力を示している。
【0104】
癌、感染性疾患、および／または遺伝的疾患を有するか、またはこれらを有するリスクがある任意の適切な哺乳動物を、本明細書において記載されるように治療することができる。例えば、癌、感染性疾患および／または遺伝的疾患を有する、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル類）、ウマ類、ウシ種、ブタ種、イヌ類、ネコ類、マウス類、ラット類、およびペット（ｆｅｅｄ ａｎｉｍａｌｓ）を、本明細書に記載されるように癌について治療することができる。いくつかの場合において、癌を有するヒトを治療することができる。いくつかの場合において、本明細書において記載されるように治療される哺乳動物（例えばヒト）は、本明細書において記載される組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）を生成するために使用されるＡｄの天然宿主ではない。例えば、本明細書において記載される組換えＡｄ６５７で治療されているヒトは、Ａｄ６に対する既存の適応免疫を欠くことができる。
【0105】
任意のタイプの癌を有する哺乳動物を、本明細書において記載されるように治療することができる。いくつかの場合において、癌は、１種または複数の固形腫瘍を含むことができる。いくつかの場合において、癌は、血液癌であることができる。本明細書に記載されるように治療することができる癌の例には、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫および白血病（例えば、リンパ性白血病および骨髄性白血病）が含まれるが、これらに限定はされない。
【0106】
いくつかの場合において、本明細書において記載される方法はまた、哺乳動物を癌を有すると同定することを含むことができる。癌を有するとして哺乳動物を同定するための方法の例としては、身体的検査、実験室試験（例えば、血液および／または尿）、生検、イメージング試験（例えば、Ｘ線、ＰＥＴ／ＣＴ、ＭＲＩ、および／または超音波）、核医学スキャン（例えば、骨スキャン）、内視鏡検査、および／または遺伝子診断が挙げられるが、これらに限定はされない。癌、感染性疾患および／または遺伝性疾患を有するとして一旦同定されると、哺乳動物は、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７）または本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７）をコードする核酸（例えば、発現ベクター）を、投与されることができ、または自己投与するように指示され得る。
【0107】
本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７ｓ）は、任意の適切な経路によって投与することができる。いくつかの場合において、投与は局所投与であることができる。いくつかの場合において、投与は全身投与であることができる。投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻内、吸入、経皮、非経口、腫瘍内、後尿管（ｒｅｔｒｏ－ｕｒｅｔｅｒ）、被膜下、膣および直腸投与が挙げられるが、これらに限定はされない。複数ラウンドの治療が実施される場合、第１ラウンドの治療は、第１経路（例えば、静脈内）によって哺乳動物（例えば、ヒト）に本明細書に記載される１種または複数の組換えＡｄを投与することを含むことができ、第２ラウンドの治療は、第２経路（例えば、筋肉内）によって哺乳動物（例えば、ヒト）に本明細書に記載される１種または複数の組換えＡｄを投与することを含むことができる。
【0108】
本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、当該組成物を治療的用途のために特に好適にする、本発明の１種または複数の組換えおよび／またはキメラＡｄとキャリア（不活性または活性）との組み合わせを表す。本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７）は、哺乳動物（例えば、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある哺乳動物）への投与のための組成物（例えば、医薬組成物）に処方することができる。例えば、１種または複数の組換えＡｄは、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある哺乳動物への投与のために、薬学的に受容可能な組成物に処方することができる。いくつかの場合において、１種または複数の組換えＡｄは、１種または複数の薬学的に許容可能なキャリア（添加剤）および／または希釈剤と一緒に処方することができる。医薬組成物は、無菌溶液、懸濁剤、徐放性製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、ウエファーおよび顆粒剤を含むがこれらに限定されない固体または液体形態で投与するために製剤化することができる。本明細書において記載される医薬組成物において使用され得る薬学的に許容可能なキャリア、増量剤およびビヒクルには、限定はされないが、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、バッファー物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれる。適切な医薬キャリアは、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版に記載されている。適切な賦形剤の選択および使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）に教示されている。
【0109】
本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば、組換えＡｄ６５７）を含む組成物（例えば、医薬組成物）は、ワクチンとして哺乳動物（例えば、癌を有するか、または癌を有するリスクがある哺乳動物）に投与することができる。ワクチンは、予防的または治療的であり得る。
【0110】
いくつかの場合において、本明細書において記載される方法はまた、哺乳動物（例えば、癌を有する哺乳動物）に、癌を治療するために使用される１つまたは複数の追加的な剤を投与することを含むこともできる。癌を治療するために使用される１種または複数の追加的な剤は、任意の適切な癌治療を含み得る。いくつかの場合において、癌治療は手術を含み得る。いくつかの場合において、癌治療は放射線治療を含み得る。いくつかの場合において、癌治療は、薬物療法、例えば化学療法、ホルモン療法、標的化療法および／または細胞傷害性療法の実施を含むことができる。例えば、癌を有する哺乳動物に、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７およびそのバリアント）を投与し、および癌を治療するために使用される１種または複数の追加的な剤を投与することができる。癌を有する哺乳動物が本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄで治療され、および癌、感染性疾患および／または遺伝性疾患を治療するために使用される１種または複数の追加的な剤で治療される場合、癌、感染性疾患および／または遺伝性疾患を治療するために使用される追加的な剤は、同時にまたは独立して投与することができる。例えば、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄおよび癌、感染性疾患および／または遺伝的疾患を治療するために使用される１種または複数の追加的な剤を一緒に処方して、単一の組成物を形成することができる。いくつかの場合においては、本明細書において記載される１種または複数の組換えＡｄを最初に投与し、癌、感染性疾患および／または遺伝的疾患を治療するために使用される１種または複数の追加的な剤を次に投与することができ、またはその逆も同様である。
【実施例】
【0111】
例
例１．アデノウイルス。
例１．アデノウイルス。
【0112】
５０年間にわたって、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、およびＡｄ６を含む４つの種Ｃのヒト種Ａｄのみが知られていた（例えば、Ｗｅａｖｅｒら、２０１１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．４１２：１９－２７を参照のこと）。２００１年に、第５の種Ｃアデノウイルスが、野生分離株＃１６７００として同定され、Ａｄ１、２、５および６に対する抗血清を用いたウイルス中和試験により、各抗血清がその同族ウイルスに対して使用された場合の高レベルの中和（５００～１６，０００の相互力価（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｔｉｔｅｒｓ）が実証された（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、２００８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８９：３８０～３８８）。対照的に、抗Ａｄ１、２および５抗体は、＃１６７００に対して弱い交差反応性を有する（３２～６４の相互力価）。抗Ａｄ６血清は＃１６７００に対してより高い交差反応性を示したが、中和は、Ａｄ６自体と比較した場合、＃１６７００を中和するために１０倍高い濃度の血清を必要とした。その後の配列比較によって、＃１６７００は新規の種Ｃアデノウイルスとして確認され、Ａｄ５７と改名された（例えば、Ｗａｌｓｈら、２０１１ Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：３４８２－３４９０を参照のこと）。
【0113】
１５のヒトＡｄについて、乳房、卵巣、肝臓、前立腺、腎臓およびＢ細胞性悪性腫瘍に対する腫瘍溶解活性を評価した。ＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍に対する試験において、種Ｃ Ａｄ６は、腫瘍内または静脈内（ｉ．ｖ．）単回注射後において、種Ｃ Ａｄ５または種ＢウイルスＡｄ１１およびＡｄ３５よりも強力であった。Ａｄ６はまた、免疫正常シリアンハムスターにおいてＡｄ５およびＡｄ１１よりも有効であった。
【0114】
組換えアデノウイルスの構築。
【0115】
組換えアデノウイルスを、当業者に公知の方法を利用する組換えＤＮＡ技術によって構築した。組換えＡｄは、第１のＡｄから誘導され（例えば、第１のＡｄ、例えばＡｄ６のゲノムを含むことができ）、そして、第２のＡｄ、例えばＡｄ５７からのヘキソンＨＶＲを含むことができる。組換えＡｄがＡｄ６ゲノムおよびＡｄ５７ヘキソンＨＶＲを含む場合、組換えＡｄはＡｄ６５７と称されるキメラＡｄであり得る。
【0116】
Ａｄ６５７を得るために、Ａｄ５７ＨＶＲ配列を合成し、ｐＶＩとヘキソンとの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを種々のｐＡｄ６プラスミド中に組換えて、Ａｄ６５７およびその変異体を生成した。Ａｄ６５７ヘキソンのアミノ酸配列を配列番号４９に示す。Ａｄ６５７バリアントのプラスミドマップについては、図３４および５９～６５を参照のこと。
【0117】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ５７ ＨＶＲ配列を、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能にするための制限部位で修飾されたＨＶＲ１を用いて合成した。これを、ｐＶＩとヘキソンとの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを種々のｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中にシステインを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－ＸＸＡと呼ぶ当該バリアントは、配列番号５０のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0118】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ５７ ＨＶＲ配列を、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能にするための制限部位で修飾されたＨＶＲ５を用いて合成した。これを、ｐＶＩとヘキソンとの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを種々のｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ５中にシステインを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＸＸＡと呼ぶ当該バリアントは、配列番号５１のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0119】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ５７ ＨＶＲ配列を、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能にするための制限部位で修飾されたＨＶＲ１を用いて合成した。これを、ｐＶＩとヘキソンとの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを種々のｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中にシステインを有しないが、ＨＶＲ１中へのペプチド挿入を可能にする制限部位を有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－ＸＡと呼ぶ当該バリアントは、配列番号５２のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0120】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ５７ ＨＶＲ配列を、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能にするための制限部位で修飾されたＨＶＲ５を用いて合成した。これを、ｐＶＩとヘキソンとの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを種々のｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ５中にシステインを有しないが、ＨＶＲ５中へのペプチド挿入を可能にする制限部位を有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＸＡと呼ぶ当該バリアントは、配列番号５３のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0121】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ６５７ ＨＶＲ１－ＸＡ配列は、ＨＶＲ１へのビオチンアクセプターペプチドの挿入によって修飾された。これを種々のｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中にＢＡＰを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－ＰＳＴＣＤと呼ぶ当該バリアントは、配列番号５４のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0122】
ビオチンアクセプターペプチドの挿入は、ウイルスバリアントを肝臓から脱標的化し（ｄｅｔａｒｇｅｔ）、当該ウイルスをアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン化リガンドで再標的化（ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ）させることを可能にし、そして当該ウイルスを単量体アビジンまたはストレプトアビジンカラムで精製することを可能にする。
【0123】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ６５７ ＨＶＲ１－ＸＡ配列を、ＨＶＲ１へのビオチンアクセプターペプチドの挿入によって修飾した。これを種々のｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中にＢＡＰを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＰＳＴＣＤと呼ぶ当該バリアントは、配列番号５５のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0124】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ６５７ ＨＶＲ５－ＸＡ配列をＨＩＶエンベロープ由来の合成Ｖ１／Ｖ２ループのＨＶＲ５中への挿入によって修飾した。Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－Ｖ１／Ｖ２と呼ぶ当該バリアントは配列番号５６のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0125】
ＨＩＶエンベロープ由来の合成Ｖ１／Ｖ２ループの挿入により、この抗原の提示がワクチンとしての役割を果たすとともに、ＨＩＶエンベロープと相互作用するタンパク質と結合することによって再標的化が可能になる。
【0126】
Ａｄ６５７のバリアントに関して、Ａｄ６５７ ＨＶＲ５－ＸＡ配列をヒト乳頭腫ウイルス由来の合成ペプチドのＨＶＲ５中への挿入によって修飾した。Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＨＰＶと呼ぶ当該バリアントは配列番号５７のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0127】
ヒト乳頭腫ウイルス由来の合成ペプチドの挿入は、ワクチン目的のため、ならびにＨＰＶペプチドと相互作用するタンパク質への結合による再標的化のための抗原としてのＨＰＶペプチドの提示を可能にする。
【0128】
本発明の別の態様において、Ａｄ６ ＨＶＲ１およびＡｄ５７ ＨＶＲ２～７を有するキメラＡｄを生成した。Ａｄ６／５７ＨＶＲキメラと呼ぶ当該キメラは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0129】
本発明のさらに別の態様において、Ａｄ６ ＨＶＲ１および７ならびにＡｄ５７ ＨＶＲ２～６を有するキメラＡｄを生成した。Ａｄ６／５７／６ＨＶＲキメラと呼ぶ当該キメラは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
【0130】
例２．遺伝子送達のための再標的化および脱標的化組換えアデノウイルス。
【0131】
アデノウイルスは、遺伝子送達および遺伝子ベースの免疫化のための確固たるベクターである。これらの適用の大部分では、原型アデノウイルスは、ヒト種Ｃアデノウイルス血清型５（ＨＡｄＶ－Ｃ５またはＡｄ５）が使用されてきた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、Ａｄ５はそのファイバーおよびペントンベースタンパク質と細胞表面受容体との組み合わされた相互作用を介して細胞に結合し、侵入する。三量体のファイバーは、コクサッキー・アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に結合し、ＣＡＲを欠く細胞は、ペントンベース上のＲＧＤモチーフによって結合され得るαｖインテグリンも発現しない限り、感染に対して比較的耐性である。
【0132】
Ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらの相互作用が依然として利用されるが、それらの重要性は注射経路によって異なる。固形組織または腫瘍に直接注射した場合、ＣＡＲおよびインテグリン相互作用が優勢である。静脈内注射（ＩＶ）した場合、これらの相互作用は、Ａｄ５のビタミン－Ｋ依存性血液凝固因子への結合の影響のため、二の次になる。血液第Ｘ因子（ＦＸ）は、Ａｄ５のヘキソンにナノモル以下の親和性で結合し、その結果、Ａｄ５がＩＶ注射後に肝細胞に効率的に形質導入することを可能にする。ＦＸの非存在下では、肝臓の形質導入は大幅に減少する。
【0133】
アデノウイルスベクターは、わずか４．５ｋｂのＤＮＡ配列しかもたないアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような他のベクターと比較すると、３６キロ塩基対（ｋｂｐ）までの非常に大きなｃＤＮＡ配列を運ぶ能力という点において、いくぶんユニークである。このペイロード容量は、１４ｋｂｐのジストロフィンｃＤＮＡのような非常に大きな導入遺伝子を送達する場合、筋肉遺伝子治療のためのＡｄベクターの早期探索を正当化した。新生マウスでのＩＶ投与は、筋肉の遺伝子送達を媒介できるが、この能力は成体マウスでは失われる。加齢に伴うトランスフェクションの減少は、部分的にはＡｄビリオンの非常に大きなサイズ（すなわち、１００ｎｍ）、ならびに加齢に伴う筋肉細胞上のＣＡＲ受容体の喪失に起因する。骨格筋細胞にＣＡＲが存在しないという事実にもかかわらず、筋肉内（ＩＭ）経路は、Ａｄ５および他の血清型を用いる場合、遺伝子ベースのワクチンのための圧倒的に最も一般的な経路である。
【0134】
従って、筋肉のＡｄ５および他の血清型形質導入は、遺伝子治療または遺伝子ベースのワクチン接種に適切であり得る。しかしながら、筋肉中にウイルスの一次受容体が存在しないと、ウイルスの有効性が低下し、所望の効果を達成するためにはより多くのベクターが送達されることが必要となる。
【0135】
アデノウイルスにおけるペプチド修飾ヘキソンの構築。
【0136】
Ｃ２Ｃ１２マウス筋肉細胞上の１２アミノ酸（１２ｍｅｒ）のペプチドを、Ａｄ５のノブ領域からのＨおよびＩβシートの間に提示されたランダムペプチドライブラリーから選択した（図１Ａ）。ペプチド１２．５１（ＴＡＲＧＥＨＫＥＥＥＬＩ；配列番号１）および１２．５２（ＬＲＱＴＧＡＡＳＡＶＷＧ； 配列番号２）を、非標的細胞に対して前清澄化（ｐｒｅ－ｃｌｅａｒｉｎｇ）した筋芽細胞に対して選択して、筋肉細胞への結合に関して特異的であるペプチドを得た。ほとんどの場合、小さいペプチドは比較的低い親和性を有する。従って、Ａｄ５ヘキソンの７２０コピー上にこれらの筋肉選択ペプチドを提示することは、より良好な筋肉遺伝子送達を可能にし得ると推論した。この挿入部位はまた、ＩＭ注射後にベクターが血液中に漏出した場合に、ヘキソンに結合するＦＸを不活性化してベクターを肝臓から「脱標的化」するという利点を有するかもしれない。
【0137】
これらの筋肉選択ペプチドを、ウイルス上の超可変ループも拘束する２つの他のβシートの間に挿入し、トロピズムを調節する修飾Ａｄの能力を評価した。ペプチド１２．５１および１２．５２を、Ａｄ５ヘキソン中のβ７およびβ８シートによって拘束された超可変領域（ＨＶＲ）５ループ中に導入した。マウスおよびハムスターにおける静脈内および筋肉内注射の後のこれらのウイルスの組織形質導入能（ｉｎ ｖｉｖｏ）を評価した。
【0138】
アデノウイルス
Ｅ１－欠失Ａｄ５－ＧＬ（ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ）は、他に記載されるように、緑色蛍光タンパク質－ルシフェラーゼ（ＧＦＰ－ルシフェラーゼ、ＧＬ）融合タンパク質を発現する（例えば、Ｃｒｏｓｂｙら、２００２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７６：６８９３－６８９９；Ｋｈａｒｅら、２０１１ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９：１２５４－１２６２；およびＫｈａｒｅら、２０１２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，８６：２２９３－２３０１を参照のこと）。当業者に公知の方法に従って、筋肉選択ペプチド１２．５１および１２．５２を、Ａｄ５ヘキソン上のＨＶＲ５の代わりに、Ａｄ５のノブ領域からのＨおよびＩβシートと構造的に類似するそのβ７およびβ８シートの間に挿入した（図１Ａ）。フレキシビリティーリーダー（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｌｅａｄｅｒ）を有するペプチドで、Ａｄ５におけるＨＶＲ５ループ全体を置き換えた（図１Ｂ）。これらの修飾されたヘキソン配列を、細菌におけるｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎによって、緑色蛍光タンパク質－ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現する複製欠損Ａｄ５（ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ）に導入した（例えば、Ｃａｍｐｏｓら、２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５：１１２５－１１３０を参照のこと）。ペプチド修飾Ａｄを、ペプチド１２．５１および１２．５２（図１Ｂ）をコードするアニーリングされたオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＨＶＲ５ディスプレイ（図１Ａ下）に挿入することによって構築して、組換えＡｄであるＡｄ５－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＨＶＲ５－１２．５２を得た。
Ｅ１－欠失Ａｄ５－ＧＬ（ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ）は、他に記載されるように、緑色蛍光タンパク質－ルシフェラーゼ（ＧＦＰ－ルシフェラーゼ、ＧＬ）融合タンパク質を発現する（例えば、Ｃｒｏｓｂｙら、２００２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７６：６８９３－６８９９；Ｋｈａｒｅら、２０１１ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９：１２５４－１２６２；およびＫｈａｒｅら、２０１２ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，８６：２２９３－２３０１を参照のこと）。当業者に公知の方法に従って、筋肉選択ペプチド１２．５１および１２．５２を、Ａｄ５ヘキソン上のＨＶＲ５の代わりに、Ａｄ５のノブ領域からのＨおよびＩβシートと構造的に類似するそのβ７およびβ８シートの間に挿入した（図１Ａ）。フレキシビリティーリーダー（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｌｅａｄｅｒ）を有するペプチドで、Ａｄ５におけるＨＶＲ５ループ全体を置き換えた（図１Ｂ）。これらの修飾されたヘキソン配列を、細菌におけるｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎによって、緑色蛍光タンパク質－ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現する複製欠損Ａｄ５（ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ）に導入した（例えば、Ｃａｍｐｏｓら、２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５：１１２５－１１３０を参照のこと）。ペプチド修飾Ａｄを、ペプチド１２．５１および１２．５２（図１Ｂ）をコードするアニーリングされたオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＨＶＲ５ディスプレイ（図１Ａ下）に挿入することによって構築して、組換えＡｄであるＡｄ５－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＨＶＲ５－１２．５２を得た。
【0139】
得られたプラスミドを消化し、ｐＡｄ５－ＧＬへのｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎに使用した。これらのベクターを２９３細胞中でレスキューし、２つの連続するＣｓＣｌ勾配で精製し、Ｅｃｏｎｏｐａｃ １０－ＤＧクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で０．５Ｍスクロースを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８中に脱塩し、－８０℃で保存した。
【0140】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス試験
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。２９３細胞は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含むＤＭＥＭ中で維持した。
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。２９３細胞は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含むＤＭＥＭ中で維持した。
【0141】
Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞を、感染の前日に６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。ウイルスを用いて、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて細胞を感染させた。細胞を２日間インキュベートした後、緑色蛍光下で観察した。
【0142】
動物実験は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ、ＰＨＳ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｐｏｌｉｃｙの規定およびＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの指針に基づいて行った。雌ＣＤ－１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に麻酔をかけ、示された時間に、１０１０ｖｐの示されたウイルスを筋肉内（ＩＭ）または静脈内（ＩＶ）に注射した。動物を麻酔し、３ｍｇのｄ－ルシフェリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングシステムでイメージングした。その後、動物を麻酔し、ＥＬＩＳＡ用の血清分離器で血液を回収した。
【0143】
ＥＬＩＳＡを以下のように行った。Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）を、１ウェルあたり１００ｎｇの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＧＦＰタンパク質と共に４℃で一晩インキュベートし、洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）を含むＴＲＩＳ緩衝生理食塩水中の５％ミルクを用いて室温で２時間ブロッキングを行った。各血清サンプルの１：１００，０００～１：１，１０００希釈物をブロッキングバッファー中に調製した。ウェルを洗浄し、各１００μＬをＧＦＰでコーティングしたプレートにｎ＝３で添加し、室温で３時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の１／１０，０００希釈物を各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄し、５０μＬの１ Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、続いて５０μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＴＸ ８８０を用いて決定した。
【0144】
統計解析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて行った。統計学的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤにより算出した。
【0145】
マウスＣ２Ｃ１２筋肉細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入
ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ、ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＲＤ－Ａｄ５－ＨＶＲ５－１２．５２を使用して、ウイルス粒子（ｖｐ）／細胞に関して様々な感染多重度（ＭＯＩ）でマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞に感染させた。ＧＦＰ融合タンパク質からの緑色蛍光が蛍光顕微鏡によって観察された場合、ペプチド修飾ベクターの両方が、ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬよりも有意に良好な形質導入を媒介した（図２Ａ）。ルシフェラーゼ活性を測定したところ、ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ－１２．５１および１２．５２感染細胞において有意な増加が観察された（図２Ｂ）。ペプチドの１つ１２．５１をＡｄ５のノブ領域に挿入し戻すと、当該ペプチドはＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を１４倍増加させた。
ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ、ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＲＤ－Ａｄ５－ＨＶＲ５－１２．５２を使用して、ウイルス粒子（ｖｐ）／細胞に関して様々な感染多重度（ＭＯＩ）でマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞に感染させた。ＧＦＰ融合タンパク質からの緑色蛍光が蛍光顕微鏡によって観察された場合、ペプチド修飾ベクターの両方が、ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬよりも有意に良好な形質導入を媒介した（図２Ａ）。ルシフェラーゼ活性を測定したところ、ＲＤ－Ａｄ５－ＧＬ－１２．５１および１２．５２感染細胞において有意な増加が観察された（図２Ｂ）。ペプチドの１つ１２．５１をＡｄ５のノブ領域に挿入し戻すと、当該ペプチドはＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を１４倍増加させた。
【0146】
マウスでの筋肉内注射後のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入
１０９ｖｐのＡｄ５－ＧＬ、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２を、マウスの両四頭筋内にＩＭ経路によって注射し、ルシフェラーゼイメージングを様々な時間で行った（図３Ａの上）。Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１は、すべての時間点でＡｄ５－ＧＬよりも２～３倍高いルシフェラーゼ活性をもたらした（一元配置ＡＮＯＶＡにより１日目でｐ＜０．０５）（図３Ｂ左）。筋肉におけるＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのそのより強い活性とは対照的に、Ａｄ５－ＧＬとＨＶＲ５－１２．５１の両方よりも低かった。
１０９ｖｐのＡｄ５－ＧＬ、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２を、マウスの両四頭筋内にＩＭ経路によって注射し、ルシフェラーゼイメージングを様々な時間で行った（図３Ａの上）。Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１は、すべての時間点でＡｄ５－ＧＬよりも２～３倍高いルシフェラーゼ活性をもたらした（一元配置ＡＮＯＶＡにより１日目でｐ＜０．０５）（図３Ｂ左）。筋肉におけるＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのそのより強い活性とは対照的に、Ａｄ５－ＧＬとＨＶＲ５－１２．５１の両方よりも低かった。
【0147】
マウスでの静脈内注射後のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入
３×１０１０ｖｐのＡｄ５－ＧＬ、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２を、マウスにＩＶ経路によって注射し、ルシフェラーゼイメージングを行った（図３Ａの下）。筋肉での結果とは対照的に、非修飾Ａｄ５－ＧＬのみが強い肝臓形質導入を媒介した。Ａｄ５－ＧＬによる肝臓形質導入は、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２の両方よりも６０倍高かった（一元配置ＡＮＯＶＡにより１日目にｐ＜０．００１）（図３Ｂ右）ことから、組換えＡｄが肝臓におけるオフターゲット感染を減少させながら、筋肉組織を標的とすることが実証された。
３×１０１０ｖｐのＡｄ５－ＧＬ、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２を、マウスにＩＶ経路によって注射し、ルシフェラーゼイメージングを行った（図３Ａの下）。筋肉での結果とは対照的に、非修飾Ａｄ５－ＧＬのみが強い肝臓形質導入を媒介した。Ａｄ５－ＧＬによる肝臓形質導入は、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１およびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５２の両方よりも６０倍高かった（一元配置ＡＮＯＶＡにより１日目にｐ＜０．００１）（図３Ｂ右）ことから、組換えＡｄが肝臓におけるオフターゲット感染を減少させながら、筋肉組織を標的とすることが実証された。
【0148】
ハムスターでの筋肉内注射後のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入
１２．５１修飾ベクターがマウス以外の種で機能するかどうかを試験するために、１０１０ｖｐのＡｄ５－ＧＬおよびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１を、より大きなシリアンハムスターの両四頭筋中にＩＭ注射し、２４時間後にルシフェラーゼイメージングを行った（図４）。この場合、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１は、Ａｄ５－ＧＬよりも７倍高いルシフェラーゼ活性を媒介した（一元配置ＡＮＯＶＡにより１日目でｐ＜０．０１）。
１２．５１修飾ベクターがマウス以外の種で機能するかどうかを試験するために、１０１０ｖｐのＡｄ５－ＧＬおよびＡｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１を、より大きなシリアンハムスターの両四頭筋中にＩＭ注射し、２４時間後にルシフェラーゼイメージングを行った（図４）。この場合、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ５－１２．５１は、Ａｄ５－ＧＬよりも７倍高いルシフェラーゼ活性を媒介した（一元配置ＡＮＯＶＡにより１日目でｐ＜０．０１）。
【0149】
マウスにおける筋肉内注射後の遺伝子をベースとする免疫化
ＩＭ注射の１６週間後、血清を、上記のようにおよび図３に示されるように処置されたマウスから収集し、そして導入遺伝子コードＧＦＰに対する抗体についてＥＬＩＳＡによって段階希釈で分析した（図５）。全てのＡｄ注射マウスは、１：１０，０００～１：１０００の血清希釈でＰＢＳ群と比較した場合に、有意な抗ＧＦＰ抗体を生成した（一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０００１）。しかしながら、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５１は、Ａｄ５またはＡｄ５－ＨＶＲ５－１２．５２よりも高い抗体を産生した。血清の１：１０００～１：１０，０００希釈において、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５１はＡｄ５－ＧＬよりも有意に高かった（一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０１～０．０００１）。血清の１：１０００希釈では、１２．５１が１２．５２よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。Ａｄ５－ＧＬ－１２．５２は、血清の１：１０００および１：１０，０００希釈においてＡｄ５－ＧＬよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５～０．００１）。
ＩＭ注射の１６週間後、血清を、上記のようにおよび図３に示されるように処置されたマウスから収集し、そして導入遺伝子コードＧＦＰに対する抗体についてＥＬＩＳＡによって段階希釈で分析した（図５）。全てのＡｄ注射マウスは、１：１０，０００～１：１０００の血清希釈でＰＢＳ群と比較した場合に、有意な抗ＧＦＰ抗体を生成した（一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０００１）。しかしながら、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５１は、Ａｄ５またはＡｄ５－ＨＶＲ５－１２．５２よりも高い抗体を産生した。血清の１：１０００～１：１０，０００希釈において、Ａｄ５－ＧＬ－ＨＶＲ－１２．５１はＡｄ５－ＧＬよりも有意に高かった（一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０１～０．０００１）。血清の１：１０００希釈では、１２．５１が１２．５２よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。Ａｄ５－ＧＬ－１２．５２は、血清の１：１０００および１：１０，０００希釈においてＡｄ５－ＧＬよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５～０．００１）。
【0150】
この例は、ファージライブラリー上の適合性の構造的状況において選択されたペプチドが、Ａｄヘキソンタンパク質に翻訳され得ることを実証している。例えば、１２．５１ペプチドに関しては、この挿入部位は、筋肉形質導入を増加させるが、肝臓におけるオフターゲット感染を減少させる。従って、筋肉組織を標的とするこのような組換えＡｄは、遺伝子ベースの筋肉ワクチン接種のための、または筋肉への遺伝子治療適用／送達のためのベクターとして使用され得る。
【0151】
本発明のさらなる態様は、Ａｄ６５７ＨＶＲに、ならびにＡｄ６およびＣ６８ ＨＩループに挿入された他の細胞標的化ペプチドを含む組換えおよび／またはキメラＡｄに関する（表１に記載）。
【0152】
【表1】
【0153】
示されたペプチドをコードするＤＮＡおよびその相補ＤＮＡを、Ａｄプラスミド（例えば、ＸＡヘキソンプラスミドまたはｐＡｄ６－ＮｄｅＰｆｌファイバーシャトルプラスミド）へのライゲーションのために付着末端に隣接して合成した。これらのアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ＨＶＲまたはＡｄのＨＩループにライゲートした。これらのプラスミドを使用して、種々のＡｄバックボーンプラスミド中に組換えた。
【0154】
一部のペプチドは、細胞上の新しい受容体を標的とするために利用できる。細菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡを発現する細胞中でウイルスを増殖させる場合、ｓｍａｌｌ ＢＡＰのような他のものをアビジン標的化および精製のために使用することができる。カルモジュリンペプチドは、再標的化のためまたはウイルス精製のために、ウイルスがカルモジュリンまたはカルモジュリン融合タンパク質に結合することを可能にする。
【0155】
従って、特定の組織／細胞受容体を標的とするこのような組換えＡｄは、遺伝子ベースのワクチン接種のための、または標的化細胞および／または組織における遺伝子治療適用のためのベクターとして使用され得る。
【0156】
例３．細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規アミノ酸の挿入による異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入。
【0157】
ヘキソンシャトルプラスミドマップ（図３４）は、異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入と、細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規アミノ酸、例えばシステインの、標的化化学修飾および遮蔽のためのヘキソンへの挿入との組み合わせを示す。
【0158】
特定の実施態様では、細胞結合ペプチド１２．５１、ＶＳＶ、ＲＧＤ（表１を参照）がＨＶＲ１またはＨＶＲ５に挿入され、当該実施態様は、これらのおよび他のペプチドをＡｄのＨＶＲのいずれかに挿入する例として役立つ（図３４）。別の例は、これらのＨＶＲへのビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ：ｂｉｏｔｉｎ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）の挿入を示し、これは、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン化リガンド、あるいはアビジン－またはストレプトアビジン融合タンパク質を用いたベクター再標的化を可能にする。ＢＡＰ挿入はまた、ウイルスを、ベクター産生のために単量体アビジンまたはストレプトアビジンカラム上で精製することを可能にする。同様に、Ａｄ５７－ＨＶＲ１－ＸＸＡおよびＸＡは、マレイミドまたは他のシステイン反応性剤での標的化化学修飾を可能にするために、この部位にシステインを挿入する例を示す（図３４）。
【0159】
これらの実施態様は、異なるＡｄからの異なるＨＶＲを組み合わせる（すなわち、ＨＶＲをシャッフルする）Ａｄとの関連においても適用されている。例えば、Ａｄ６のＨＶＲ１とＡｄ５７のＨＶＲ２～７、またはＡｄ６のＨＶＲ１および７とＡｄ５７のＨＶＲ２～６。さらなる実施態様において、６／５６／６ウイルスは、Ａｄ６由来のＨＶＲ１および７、ならびにＡｄ６５７由来のＨＶＲ２～６を有する。
【0160】
例４．システイン修飾ヘキソン修飾Ａｄ６５７－ＨＶＲ５Ｃの標的化化学的連結。
【0161】
図３５は、異なるＡｄ血清型由来の個々のＨＶＲの挿入と、新規アミノ酸、例えばシステインの、標的化化学修飾および遮蔽のためのヘキソンへの挿入との組み合わせを示すＡｄバリアントを示す。
【0162】
システイン修飾ヘキソン修飾Ａｄ６５７－ＨＶＲ１Ｃの遮蔽および機能に対する、非標的化化学的連結の効果と標的化化学的連結の効果との比較（図３６）。この例は、Ａｄヘキソンに挿入されたシステインに対するポリマーおよび他の化学修飾を標的とする能力を示す。非標的化ＰＥＧは、ウイルス感染を不活性化するが、システイン標的化ＰＥＧ化はウイルス機能を保持する。
【0163】
本発明の一態様では、抗体、タンパク質、細胞を脱標的化、再標的化およびそれらから遮蔽するための、ポリマーまたは挿入されたペプチド／タンパク質の使用が企図される。図５４は、例えば、ＰＥＧ化または「ＢＡＰ化（ＢＡＰｙｌａｔｉｏｎ）」によって修飾され得るＡｄ ＨＶＲの部位を示す。
【0164】
一実施態様では、異なるＡｄ血清型および／またはバリアントは、Ａｄ６およびＡｄ６５７バリアントの複数投与（ｍｕｌｔｉ ｄｏｓｉｎｇ）を可能にするポリマー遮蔽を含む。Ａｄ６およびＡｄ６５７が、共有結合ポリマー連結と組み合わされた血清型スイッチングによる複数ラウンドの治療のために使用できる、例示的な治療サイクルを示す（図４１Ｂ）。
【0165】
ＧＦＰルシフェラーゼを発現するＡｄ６５７－ＨＶＲ１Ｃを細胞から産生し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。ウイルスを５ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で共有結合により修飾した。ウイルスを、ウイルスタンパク質上のアミン／リジンとランダムに反応するＮＨＳ－ＰＥＧで、またはＸＸＡシャトルプラスミドを使用してＨＶＲ１に挿入されたシステインと特異的に反応するマレイミドＰＥＧのいずれかで処理した。引き続き、これらの非修飾または修飾ウイルスを最終的なＣｓＣｌスピンによって精製し、続いて脱塩した。示したウイルスをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙで染色し、イメージングによって可視化した（図３６Ａ）。これは、タンパク質の見掛け質量の増加によって示されるように（矢印によって示される）、ＮＨＳ－ＰＥＧ化が多くのウイルスタンパク質をランダムに修飾することを示す。対照的に、ＨＶＲ１におけるシステインとの標的化マレイミドＰＥＧ反応はヘキソンのみを修飾し、他のウイルスカプソメアタンパク質に損傷を与えない。ウイルス機能に対するＰＥＧ化の影響を評価した。
【0166】
示したウイルスをＡ５４９細胞と共にインキュベートし、細胞に感染するためのそれらの能力をルシフェラーゼアッセイによって測定した。これは、ランダムなＮＨＳ－ＰＥＧ化がウイルス活性を９０％を超えて低下させるが、マレイミド－ＰＥＧは低下させないことを示す（図３６Ｂ）。
【0167】
免疫正常シリアンハムスターに皮下ＨａＫ腎臓癌腫瘍を移植した。これらが２００μｌの体積に達したとき、それらに、Ｅ３（ＤＥ３）有りでまたは無しで、およびランダムＮＨＳ－ＰＥＧ化有りでまたは無しで構築された示したＡｄ６ウイルスを静脈内経路によって１回注射した。腫瘍サイズを経時的に測定した。データから、腫瘍溶解性ウイルスＡｄ６－ｄｅｌｔａＥ３－Ｌｕｃにおいて全てのＥ３遺伝子を欠失させると、当該ウイルスは、腫瘍溶解性の親ウイルスＡｄ６－Ｌｕｃよりも腫瘍体積を減少させる効果が低下することが示される。当該データはまた、Ａｄ６はＰＥＧ化されて、有効性を保持できることを示す（Ａｄ６－Ｌｕｃ対Ａｄ６－Ｌｕｃ－２０ｋＤａ ＰＥＧを参照のこと）（図５８）。
【0168】
システイン修飾ヘキソン修飾Ａｄ、例えばＡｄ６５７－ＨＶＲ５Ｃの標的化化学的連結。ＧＦＰルシフェラーゼを発現するＡｄ６５７－ＨＶＲ５Ｃを細胞から産生し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。当該ウイルスを、マレイミド－ＩＲ８００近赤外発蛍光団、マレイミド－ビオチン、またはＨＶＲ５中にそのＸＸＡシャトルプラスミドを用いて挿入されたシステインと特異的に反応する５ｋＤａマレイミド－ＰＥＧで、共有結合により修飾した。示したＡｄおよび修飾ＡｄをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙで染色し、イメージングによって可視化した（図３７Ａ）。ウイルスタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、それに続く近赤外イメージングは、ＨＶＲ－Ｃがイメージング剤でタグ化できることを示す（図３７Ｂ）。ＰＥＧ化Ａｄウイルスを腹腔内注射することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ Ａｄウイルス機能に対するＰＥＧ化の影響が示された。腫瘍を有するマウスにおける細胞に感染する能力は、イメージングにより検出可能なルシフェラーゼ活性によって実証される。図３７Ｃは、Ａｄ６５７ヘキソン領域に挿入されたシステインに対するポリマーおよび他の化学修飾を標的化する能力を示す。さらに、ＰＥＧ化が、ｉｎ ｖｉｖｏでアデノウイルスを肝臓に関して脱標的化することが示される（図５０）。
【0169】
例５．Ａｄ６５７によるヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の発現。
【0170】
ヒトＧＭＣＳＦのｃＤＮＡを有するＡｄ６５７を使用してＡ５４９細胞に感染させ、様々な量の上清をＧＭＣＳＦ増殖依存性ＴＦ－１細胞に添加した。増加した細胞数は、機能的なヒトサイトカインの発現を示す（図２７）。当該データは、組換えＡｄを異種タンパク質の発現のために利用できることを実証している。
【0171】
例６．癌細胞に対する全身性ウイルス療法のための腫瘍溶解性アデノウイルスＡｄ６５７。
【0172】
選択した全Ａｄゲノムのアラインメントにより、Ａｄ５７と、Ａｄ６とほぼ相同の他の種Ｃウイルスとをクラスター化する系統樹が得られ、図６に示す。
【0173】
Ａｄ５７はＡｄ６とほぼ同一であると考えられ、ヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）およびＥ３免疫回避遺伝子において配列の相違を有する（図７）。ファイバー、ペントンベース、ＩＩＩａおよびＩＸを含む他の曝露されるウイルスキャプシドタンパク質は、Ａｄ６とＡｄ５７の間で実質的に同一である。中和データは、ほとんどのアデノウイルス中和抗体がＡｄ上のＨＶＲを標的とするという事実と一致する。Ａｄ６抗血清とＡｄ５７との間の低い交差反応性は、それらの共通のファイバータンパク質を標的とし得る抗体に起因すると考えられる（Ｌｕｋａｓｈｅｖら、２００８ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８９：３８０－３８８）。
【0174】
この例では、ヒト前立腺癌に対する腫瘍溶解物質としてのＡｄ６５７の有用性が実証される。Ａｄ６ ＨＶＲをＡｄ５７由来のものと置き換えて、Ａｄ６５７と呼ぶキメラ種Ｃ腫瘍溶解性ウイルスを生成した。Ａｄ６５７およびＡｄ６を、ヒト前立腺癌腫瘍を有するヌードマウスにおいて単回ｉ．ｖ．注射による全身性腫瘍溶解療法として試験した。このウイルスの肝臓及び腫瘍トロピズムを、前立腺癌のマウスモデルで以下のように評価した。
【0175】
ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入し、そしてＲＡＤＩＬによるＩＭＰＡＣＴ試験によって特異的病原体フリーであることを確認した。２９３細胞は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａから入手した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で維持した。
【0176】
Ａｄ６、Ｔｏｎｓｉｌ ９９株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１０８３）のゲノムを、他に記載されるようにクローニングした（例えば、Ｗｅａｖｅｒら、２０１３ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８：ｅ７３３１３を参照のこと）。天然のＡｐａＩ部位とＳａｃＩ部位との間のＡｄ５７ヘキソンに対応するカセットをＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。このフラグメントを、他に記載されるように、Ａｄ６ ｐＶＩおよびヘキソン遺伝子と細菌における相同組換えのためのそれらの間のＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子－ＦＲＴカセットとを含むシャトルプラスミドｐＵＣ５７－Ａｄ６ Ｈｅｘｏｎ－ＦＺＦにクローニングした（例えば、Ｃａｍｐｏｓら、２００４ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：１１２５－１１３０；およびＫｈａｒｅら、２０１２ Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８６：２２９３－２３０１を参照のこと）。Ａｄ６ ＡｐａＩ－ＳａｃＩフラグメントを、プラスミドｐＵＣ５７－Ａｄ６／５７ヘキソン－ＦＺＦを生成するＡｄ５７フラグメントで置き換えた。これをｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎによりＡｄ６ゲノム中に組み換えた（Ｃａｍｐｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １５：１１２５－１１３０）。図５９は、Ｅ３欠失を有するＡｄ６５７のプラスミドマップを示す。ウイルスを、２９３細胞へのトランスフェクションによってレスキューし、１０ ｐｌａｔｅ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）から産生させた。緑色蛍光タンパク質－ルシフェラーゼ（ＧＦＰ－Ｌｕｃ）融合タンパク質を発現するウイルスは、ＡｄファイバーとＥ４との間に挿入されたＣＭＶ－ＧＦＰ－Ｌｕｃ発現カセットと、この挿入のためのスペースを作るためのＥ３欠失とを有する。ウイルスを２つのＣｓＣｌ勾配で精製し、ウイルス粒子（ｖｐ）数をＯＤ２６０によって計算した。
【0177】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍溶解活性を試験するために、細胞を、５％ＦＢＳおよび抗生物質－抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ， ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で、ｖｐ／細胞に関して示された感染多重度（ＭＯＩ）で処理した。５日後、培地を除去し、細胞をクリスタルバイオレット（リン酸緩衝生理食塩水において０．０５％クリスタルバイオレット、３．７％ホルムアルデヒド； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で１０分間処理した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムにおいて３７℃で一晩インキュベートして、クリスタルバイオレットを可溶化した。クリスタルバイオレットの吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＴＸ ８８０プレートリーダーでＯＤ５９５で測定した。細胞生存率（％）は、サンプルのＯＤを同じ９６ウェルプレート上の未処理コントロール細胞の平均ＯＤで割り、この数に１００を掛けることによって計算した。
【0178】
動物は、実験動物管理ガイドラインの評価および認定のための協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）の下、メイヨークリニック動物施設（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に収容した。これらの研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ、ＰＨＳ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｐｏｌｉｃｙの規定に基づき、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。皮下腫瘍を、１００μＬのＤＭＥＭ／５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の１×１０７個のＤＵ１４５細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、４週齢のヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）において開始させた。腫瘍体積は、幅２×長さ×１／２の等式を用いて計算した。腫瘍が体積で約２００μＬに達したとき、マウスを異なる群に割り当て、単回ｉ．ｖ．注射（尾静脈）によって処置した。腫瘍体積が２０００μＬに達した場合、または動物が瀕死、苦痛状態の場合、または皮膚が腫瘍上で破裂した場合、動物は安楽死させた。
【0179】
血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）測定のために、６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、尾静脈により１０１１ｖｐのＡｄ５、Ａｄ６またはＡｄ６５７をｉ．ｖ．注射し、ＡＬＴ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いたＡＬＴ測定のために３日後に血液を採取した。
【0180】
統計解析は、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて、反復測定ＡＮＯＶＡまたは一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定によって行った。カプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、ログランク検定により比較した。
【0181】
Ａｄ５７のカプソメア遺伝子は、それらのヘキソンＨＶＲを除いてＡｄ６とほぼ同一である（図６および７）。Ａｄ５７およびＡｄ６のキメラウイルスを作製するために、Ａｄ５７ヘキソンＨＶＲに対応するカセットを野生型Ａｄ６ゲノム中に組換えた（図８）。このウイルスをレスキューし、２９３細胞中で産生し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。ベースのウイルスゲノムがＡｄ６であることを考え、これらのヘキソンキメラウイルスをＡｄ６５７と呼ぶ（図５９）。
【0182】
ＬＮＣａｐおよびＤＵ１４５細胞に１０、１００または１０００ｖｐ／細胞で感染させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍溶解活性を評価した。Ａｄ５、Ａｄ６およびＡｄ６５７による肝臓損傷を比較するために、１０１１ｖｐという高用量の各ウイルスを、尾静脈によって免疫正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス中に注射した。Ａｄ５注射動物は２日以内に瀕死となり、安楽死させざるを得なかった（図１０Ａ）。Ａｄ５およびＡｄ６の生存率はＰＢＳと比較した場合、有意に低かった（ログランク分析により、それぞれ、ｐ＝０．０００１および０．０００９）。Ａｄ６５７に関する生存率も、ＰＢＳと比較した場合に減少した（ｐ＝０．０５７８）。Ａｄ６またはＡｄ６５７への曝露後の生存率は、Ａｄ５処理マウスにおけるよりも有意に良好であった（それぞれ、ｐ＝０．０００１および０．０００１）。Ａｄ６とＡｄ６５７生存率は統計学的に差がなかった（ｐ＝０．２４８）。
【0183】
生存しているＡｄ６およびＡｄ６５７動物において、注射後３日目の血液中のＡＬＴを測定した。Ａｄ５処置動物に関しては、ほとんどの群が屠殺される必要があったため、試験しなかった。このアッセイにより、Ａｄ６によって引き起こされる肝臓損傷レベルが、血中の肝ＡＬＴ酵素放出に関して、比較的低いことが示された（図１０Ｂ）。Ａｄ６群およびＡｄ６５７群は両者とも、ＰＢＳ処理マウスと比較した場合に、低いが有意なＡＬＴ値を有していた（両ウイルスに関して、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定との一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。Ａｄ６５７はＡｄ６よりもＡＬＴレベルが低かった（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。これは、ルシフェラーゼ発現ウイルスのｉ．ｖ．注射後のＡｄ６５７よりも肝臓におけるＡｄ６感染のより高いレベルと一致する（図１２）。１匹のＡｄ６５７動物は、３日目の出血後に失われた。６日目までに、Ａｄ６動物のほとんどが瀕死となった（図１０Ａ）。対照的に、Ａｄ６５７動物の５０％は、処置の２週間を超えて生存した。
【0184】
ヒトＤＵ１４５前立腺腫瘍に対するＡｄ６およびＡｄ６５７の腫瘍溶解活性を比較するために、ヌードマウスにＤＵ１４５細胞をｓ．ｃ．で移植した。動物を、平均２００μＬの類似の腫瘍サイズを有する群に割り当て、そして９匹のマウスの群を、３×１０１０ｖｐの用量のＡｄ６またはＡｄ６５７で、ｉ．ｖ．経路によって単回処置した（図１１）。
【0185】
Ａｄ６およびＡｄ６５７のこの単回ｉ．ｖ．注射は、ＰＢＳ注射されたコントロール動物と比較した場合に、腫瘍サイズを減少させた。腫瘍は、ＰＢＳ群と比較した場合、７日以内のＡｄ６群において有意に小さかった（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定と二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５）。Ａｄ６５７群における腫瘍は、１４日目までにＰＢＳ群における腫瘍と有意に異なっていた（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０１）。Ａｄ６およびＡｄ６５７は両方とも、３８日目までＰＢＳとの有意差を維持した（二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０００１）。ＰＢＳ群において最初の動物を犠牲にしなければならなかった３８日目にこの比較は終了したが、なぜなら、以降の比較は動物数の変化のために歪められるであろうからである。Ａｄ６群とＡｄ６５７群における腫瘍サイズは、Ａｄ６５７が二元ＡＮＯＶＡにより有意により高い腫瘍体積を有していた（ｐ＜０．０５）３８日目までは有意差がなかった（図１１Ａ）。Ａｄ６とＡｄ６５７腫瘍サイズ間のこの差は、５２日目まで持続し（Ｔ検定によりｐ＝０．０４）、その後、この時以後は、腫瘍は有意に相違しなかった。
【0186】
原因を問わない生存率を評価すると、Ａｄ６およびＡｄ６５７は両方とも、ＰＢＳ処置動物と比較した場合に生存が有意に延長された（図１１Ｂ、ログランク分析により、それぞれｐ＜０．０１および０．０５）。原因を問わないＡｄ６生存率は、Ａｄ６５７より有意に良好であった（ｐ＜０．０５）。しかしながらこれは、全てに起因する生存率のアーティファクトであった。なぜなら、Ａｄ６５７動物のうち３匹は、過剰な腫瘍サイズによるためではなく、腫瘍上の皮膚に潰瘍が形成されたために、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って屠殺しなければならなかったからである。一部の場合には、潰瘍形成が実際には有効な腫瘍制御と関連している。Ａｄ６のように、ＧＦＰ－ルシフェラーゼを発現するＡｄ６５７は、単回ｉ．ｖ．注射後に遠隔ＤＵ１４５皮下腫瘍において有意なルシフェラーゼ活性を生じた（図１２および図１３）。このことから、Ａｄ６およびＡｄ６５７は両方とも、単回の全身治療後に前立腺腫瘍において腫瘍溶解効果を媒介できることが示唆される。
【0187】
この例は、Ａｄ６５７が前立腺癌に対する局所または全身腫瘍溶解性ウイルス療法として使用し得ることを実証している。これらのデータは、腫瘍溶解性の種Ｃ Ａｄでの血清型スイッチングの驚くべき効果も示している。
【0188】
Ａｄの腫瘍溶解活性を、腫瘍細胞および／または癌性腫瘍において評価した。Ａｄ６単回ＩＶ注射ｖｓＡ５４９肺腫瘍細胞を評価し（図２８）；Ａｄ６単回ＩＶまたは腫瘍内（ＩＴ）注射ｖｓＰａｎｃ１膵臓腫瘍を評価し（図２９）、免疫正常ハムスターにおけるＡｄ６単回ＩＶ注射ｖｓ腎臓癌を評価した（図３０）。
【0189】
図３８は、ヌードマウスのルシフェラーゼイメージングを示す。Ａ）Ａｄ６単回Ｉ．Ｖ．注射後１、４、７、１４、２８および４２日目ｖｓ遠隔ＤＵ１４５前立腺腫瘍。Ｂ）ＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を有するマウスへの増殖型Ａｄ５－ＧＦＰＬＵＣのＩ．Ｖ．注射後３、７および１９日目。
【0190】
Ａｄ６はＩＶ注射後に遠隔の標的細胞に到達すると結論付けることができる。
【0191】
別の実施態様では、ヘキソンのＨＶＲ５に挿入されたペプチドライブラリー生成ペプチド１２．５１および１２．５２を伴うおよび伴わないルシフェラーゼを発現するＡｄを、示された細胞株、すなわちＢ１６メラノーマおよびＡ５４９肺癌細胞上で、示された数のウイルス粒子（ｖｐ）でインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を測定した。ペプチド修飾ヘキソンを有するＡｄによる癌細胞の感染の改善が示される（図３１）。
【0192】
ペプチド修飾ヘキソンを有するＡｄによる癌細胞の改善された感染。
【0193】
ヘキソンのＨＶＲ５に挿入されたペプチドライブラリー生成ペプチド１２．５１および１２．５２を伴うおよび伴わないルシフェラーゼを発現するＡｄを、示された肝細胞癌細胞株で、１０４ｖｐの各ウイルスでインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を測定した。ペプチド修飾ヘキソンを有するＡｄによる癌細胞の感染の改善が示される（図３２）。
【0194】
例７．アカゲザルにおける複製シングルサイクルアデノウイルスを用いた全身および粘膜免疫化によって生成される異なるＨＩＶ－１指向性の免疫応答（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ＨＩＶ－１ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）。
【0195】
ほとんどの遺伝子ベースのアデノウイルスワクチンは、複製欠損Ａｄ（ＲＤ－Ａｄ）ベクターであり、それらが複製してＡｄ感染を引き起こすのを妨げるために、それらのＥ１遺伝子を欠失させている。ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤ－Ａｄ）は、全てのＡｄ遺伝子を欠失しており、そしてまた複製欠損性である。Ｅ１欠失Ａｄワクチンは、細胞に感染し、その１コピーの抗原遺伝子を送達し、そしてこの抗原の単一コピー（例えば、「１Ｘ」）を発現することができる。これらは安全であるが、導入遺伝子またはそれらの発現を複製しない。
【0196】
対照的に、Ｅ１＋複製能を有するＡｄ（ＲＣ－Ａｄ）ワクチンは、同じ細胞に感染し、抗原遺伝子ＤＮＡを１０，０００倍に複製し、実質的により多くの抗原を産生し、そしてＥ１欠失ベクターよりも強い免疫応答を誘発することができる。ＲＣ－ＡｄはＲＤ－Ａｄよりも強力であるが、複製能を有するＡｄは、ヒトにおいて明らかなアデノウイルス感染を引き起こす現実的なリスクを有し得る。
【0197】
導入遺伝子ＤＮＡ複製を活用するが、アデノウイルス感染のリスクを回避するために、重要なウイルス後期タンパク質であるｐＩＩＩａに関する遺伝子の欠失を有するシングルサイクルＡｄ（ＳＣ－Ａｄ）ベクターが開発された（Ｃｒｏｓｂｙら、２０１４． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４６２－４６３：１５８－１６５； Ｃｒｏｓｂｙら、２０１５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：６６９－６７５； Ａｎｇｕｉａｎｏ－Ｚａｒａｔｅら、２０１８ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ ２１８：１８８３－１８８９；およびＣｒｏｓｂｙら、２０１７ Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８：Ｅ７９）。ＳＣ－Ａｄは、それらのＥ１遺伝子を保持して、そのゲノムを複製できるが、ｐＩＩＩａの非存在によって感染性の子孫ウイルスの産生が阻止される。ＳＣ－Ａｄはそれらのゲノムおよび導入遺伝子を、ＲＣ－Ａｄと同様に複製する（１０，０００倍まで；Ｃｒｏｓｂｙら、２０１４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４６２－４６３：１５８－１６５）。ＲＣ－およびＳＣ－Ａｄは、ＲＤ－Ａｄベクターより多く導入遺伝子タンパク質を産生する（Ｃｒｏｓｂｙら、２０１４． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４６２－４６３：１５８－１６５）。ＳＣ－Ａｄは、ＲＤ－ＡｄまたはＲＣ－Ａｄのいずれよりも、より強固でより持続的な免疫応答を生成する（Ｃｒｏｓｂｙら、２０１５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：６６９－６７５）。ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄの比較において、ＳＣ－Ａｄは、インフルエンザウイルスに対して有意に高い抗体および良好な保護をもたらす（Ｃｒｏｓｂｙら、２０１７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１：ｅ００７２０－１６）。
【0198】
この研究では、アカゲザルを、クレードＢエンベロープ配列（それらの抗体応答が中和範囲の拡大を受けた前後にＨＩＶ－１患者から得られた）を発現するＳＣ－Ａｄで免疫化した。アカゲザルを、単回全身性ＩＭ免疫化または単回粘膜鼻内（ＩＮ）免疫化により免疫化した。次いで、動物を、ＳＣ－６ Ａｄを用いた同じ経路または代替経路によってブーストし、続いてタンパク質ブーストを行った。この例は、これらの種々のＳＣ－Ａｄ免疫化ストラテジーが、ＨＩＶ結合、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および中和抗体の生成ならびに血液およびリンパ節中のＴ濾胞ヘルパー（ｐＴｆｈ）細胞を含む細胞性免疫応答に対するそれらの効果にどのように影響したかを記載する。
【0199】
ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質ｇｐ１４０を発現するシングルサイクルアデノウイルス。
【0200】
ＨＩＶ患者ＶＣ１００１４（Ｍａｌｈｅｒｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７）からの抗体中和範囲の拡大におけるピークの前（Ｇ４）および直前（Ｆ８）に生じたクレードＢ ｇｐ１６０エンベロープ配列を免疫原として使用した。モチーフ最適化Ｇ４およびＦ８ ｇｐ１６０配列を、ヒトＡｄ血清型６および５７をベースとしてＳＣ－Ａｄ中に組換えた（例えば、Ｃｒｏｓｂｙら、２０１４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４６２－４６３：１５８－１６５；Ｃｒｏｓｂｙら、２０１５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：６６９－６７５；Ａｎｇｕｉａｎｏ－Ｚａｒａｔｅら、２０１８ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ ２１８：１８８３－１８８９；およびＮｇｕｙｅｎら、２０１８ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ ７：４３－５１を参照のこと）。Ｅｂｏｌａ糖タンパク質を発現するコントロールＳＣ－Ａｄも使用した。ウイルスをレスキューし、他に記載されるように精製した（例えば、Ｃｒｏｓｂｙら、２０１４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４６２－４６３：１５８－１６５； Ｃｒｏｓｂｙら、２０１５ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：６６９－６７５；およびＡｎｇｕｉａｎｏ－Ｚａｒａｔｅら、２０１８ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ ２１８：１８８３－１８８９を参照のこと）。
【0201】
ＳＣ－Ａｄベクターにおいて使用されるＨＩＶクレードＢ感染対象からクローニングされたエンベロープ遺伝子Ｆ８をモチーフ最適化し、部位特異的突然変異誘発により改変して、未切断の三量体ｇｐ１４０を発現させた。発現、精製、および抗原性の特徴付けの詳細は他に記載されている（例えば、Ｍａｌｈｅｒｂｅら、２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７を参照のこと）。
【0202】
インド起源の雌の成体アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を、特定の病原体を含まない繁殖コロニーにおいてテキサス大学ＭＤアンダーソン癌センター（Ｂａｓｔｒｏｐ ＴＸ）のＭｉｃｈａｅｌ Ｋｅｅｌｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈで維持した。全ての動物の取り扱いは、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃおよびテキサス大学ＭＤアンダーソン癌センターの方針および手順、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ、ＰＨＳ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｐｏｌｉｃｙの規定、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの指針に従って行った。
【0203】
アカゲザルをケタミンで麻酔し、２×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の示したＳＣ－Ａｄワクチンで鼻内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）経路によって免疫化した。動物を、Ａｄｊｕｐｌｅｘ（商標）アジュバントと組み合わせた５０μｇの精製された三量体組換えＦ８ ｇｐ１４０で、他に記載されるようにＩＭ経路によってブーストした（例えば、Ｍａｌｈｅｒｂｅら、２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７；およびＨｅｓｓｅｌｌら、２０１６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３０６４－３０７８を参照のこと）。
【0204】
末梢静脈血液サンプルをＥＤＴＡ中に採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する前に、血漿を分離し、直ちに－８０℃で保存した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配で血液から調製した。唾液および膣スワブを、プロテアーゼ阻害剤を含有する１ｍｌのＰＢＳにＷｅｋ－Ｃｅｌ Ｓｐｅａｒを用いて採取し、ボルテックスし、上清を、他に記載されるように２，０００ｒ．ｐ．ｍ．での遠心分離後に回収した （例えば、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら、１９９７ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：１３８７－１３９４を参照のこと）。サンプルは、さらなる使用まで－８０℃で凍結して保持した。
【0205】
抗原特異的ＩＦＮ－γ産生細胞を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
フレッシュに単離されたＰＢＭＣを、Ｆ８ ｇｐ１４０タンパク質（１μｇ／ｍＬ）または熱不活性化Ａｄ６（７．０Ｘ１０８ｖｐ／ウェル）のいずれかで刺激して、他で記載されている方法論（例えば、Ｎｅｈｅｔｅら、２０１７ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ６７：６７－７８；Ｎｅｈｅｔｅら、２０１３ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７９８３６；およびＮｅｈｅｔｅら、２０１７ Ｊ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ５６：５０９－５１９を参照のこと）を用いた酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによってＩＦＮ－γ産生細胞の数を決定した。簡単に述べると、ＰＢＭＣのアリコート（１０５／ウェル）を、一次ＩＦＮ－γ抗体で予めコーティングした９６ウェルプレート（ポリビニリデンジフルオリドで裏打ちされたプレート、ＭＡＩＰ Ｓ ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のウェルにｎ＝２で播種し、リンパ球をＣｏｎ Ａ、Ｆ８ ｇｐ１４０タンパク質または熱不活性化Ａｄ６のいずれかで刺激した。３７℃で３０～３６時間インキュベートした後、細胞を除去し、ウェルをＰＢＳで十分に洗浄し、製造業者によって提供されるプロトコールに従って現像した。結果を、培地のみ（ネガティブコントロール）のウェル（ｎ＝２）を差し引いた後の１０５個のＰＢＭＣあたりのＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表し、バックグランドの２倍を超え、５ＳＦＣ／１０５ＰＢＭＣを超える場合にポジティブとみなす。
フレッシュに単離されたＰＢＭＣを、Ｆ８ ｇｐ１４０タンパク質（１μｇ／ｍＬ）または熱不活性化Ａｄ６（７．０Ｘ１０８ｖｐ／ウェル）のいずれかで刺激して、他で記載されている方法論（例えば、Ｎｅｈｅｔｅら、２０１７ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ６７：６７－７８；Ｎｅｈｅｔｅら、２０１３ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ７９８３６；およびＮｅｈｅｔｅら、２０１７ Ｊ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ５６：５０９－５１９を参照のこと）を用いた酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによってＩＦＮ－γ産生細胞の数を決定した。簡単に述べると、ＰＢＭＣのアリコート（１０５／ウェル）を、一次ＩＦＮ－γ抗体で予めコーティングした９６ウェルプレート（ポリビニリデンジフルオリドで裏打ちされたプレート、ＭＡＩＰ Ｓ ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のウェルにｎ＝２で播種し、リンパ球をＣｏｎ Ａ、Ｆ８ ｇｐ１４０タンパク質または熱不活性化Ａｄ６のいずれかで刺激した。３７℃で３０～３６時間インキュベートした後、細胞を除去し、ウェルをＰＢＳで十分に洗浄し、製造業者によって提供されるプロトコールに従って現像した。結果を、培地のみ（ネガティブコントロール）のウェル（ｎ＝２）を差し引いた後の１０５個のＰＢＭＣあたりのＩＦＮ－γスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表し、バックグランドの２倍を超え、５ＳＦＣ／１０５ＰＢＭＣを超える場合にポジティブとみなす。
【0206】
抗体ＥＬＩＳＡ法
ＨＩＶ－１エンベロープ結合抗体力価を、他に記載されるように、Ｆ８ ｇｐ１４０またはＳＦ１６２ ｇｐ１４０に対して規則的な間隔で採取された血漿サンプルにおいて測定した（Ｍａｌｈｅｒｂｅら、２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７；およびＨｅｓｓｅｌｌら、２０１６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３０６４－３０７８）。
ＨＩＶ－１エンベロープ結合抗体力価を、他に記載されるように、Ｆ８ ｇｐ１４０またはＳＦ１６２ ｇｐ１４０に対して規則的な間隔で採取された血漿サンプルにおいて測定した（Ｍａｌｈｅｒｂｅら、２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７；およびＨｅｓｓｅｌｌら、２０１６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３０６４－３０７８）。
【0207】
中和アッセイ
ＨＩＶ中和は、他に記載されるように、ＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイを用いて行った（Ｍａｌｈｅｒｂｅら、２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７；およびＨｅｓｓｅｌｌら、２０１６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３０６４－３０７８）。全ての値は、ウイルスのみのウェルと比較して計算した。
ＨＩＶ中和は、他に記載されるように、ＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイを用いて行った（Ｍａｌｈｅｒｂｅら、２０１４ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１２９４９－１２９６７；およびＨｅｓｓｅｌｌら、２０１６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：３０６４－３０７８）。全ての値は、ウイルスのみのウェルと比較して計算した。
【0208】
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５．ＣＤ４＋－Ｌｕｃ，標的細胞を、５０ｎｇのＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３で感染させ、そして他に記載されるように４日間培養した（例えば、Ａｌｐｅｒｔら、２０１２ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８：ｅ１００２８９０を参照のこと）。各サンプルの２倍段階希釈液を、感染した標的に室温で２０分間添加した。ＣＤ１６－ＫＨＹＧ－１エフェクター細胞を、１０：１のエフェクター対標的比で添加し、これらをさらに８時間インキュベートした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をＢｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーで測定した。
ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５．ＣＤ４＋－Ｌｕｃ，標的細胞を、５０ｎｇのＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３で感染させ、そして他に記載されるように４日間培養した（例えば、Ａｌｐｅｒｔら、２０１２ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８：ｅ１００２８９０を参照のこと）。各サンプルの２倍段階希釈液を、感染した標的に室温で２０分間添加した。ＣＤ１６－ＫＨＹＧ－１エフェクター細胞を、１０：１のエフェクター対標的比で添加し、これらをさらに８時間インキュベートした。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をＢｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーで測定した。
【0209】
フローサイトメトリー
直腸およびリンパ節生検から採取した細胞を、０．２μｇのｇｐ１４０または培地単独と一晩、最後の４時間はＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下で、インキュベートした。培養後、細胞を回収し、アカゲザルサンプルと交差反応するヒト抗体のパネルと共に氷上で４５分間インキュベートした。パネルには以下の蛍光色素標識抗体が含まれていた：ＣＤ８（Ｑｄｏｔ６５５）、α４β７（ＰＥ）およびＣＸＣＲ５（ＰＥ）（全てＮｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手）；ＣＤ６９（ＢＶ７３７，クローンＦＮ５０）およびＦｏｘＰ３（ＰＥＣｙ５，クローン：ＰＣＨ１０１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手）、ＩＬ－２１（ＢＶ４２１，クローン：３Ａ３－Ｎ２．１）、ＣＤ４５（ＢＶ７８６，Ｄ０５８－１２８３）およびＣＤ３（クローンＳＰ３４－２，ＰＥ－Ｃｙ７標識）（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手）；ＣＤ４（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ，クローンＯＫＴ４）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から）。抗体の希釈は、製造業者の推奨に従って決定した。死細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手したｌｉｖｅ－ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｉｎ ｋｉｔを使用することによって排除した。続いて、細胞を２％ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで固定化し、ＦｏｘＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で透過処理した。細胞内マーカーＦｏｘＰ３およびＩＬ－２１を透過化バッファー中で染色した。コンペンセーションコントロール（ＯｎｅＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）およびｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールの両方を利用した。全てのサンプルをＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０アナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて分析した。約２ｘ１０５～１ｘ１０６イベントをサンプルごとに収集した。
直腸およびリンパ節生検から採取した細胞を、０．２μｇのｇｐ１４０または培地単独と一晩、最後の４時間はＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下で、インキュベートした。培養後、細胞を回収し、アカゲザルサンプルと交差反応するヒト抗体のパネルと共に氷上で４５分間インキュベートした。パネルには以下の蛍光色素標識抗体が含まれていた：ＣＤ８（Ｑｄｏｔ６５５）、α４β７（ＰＥ）およびＣＸＣＲ５（ＰＥ）（全てＮｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手）；ＣＤ６９（ＢＶ７３７，クローンＦＮ５０）およびＦｏｘＰ３（ＰＥＣｙ５，クローン：ＰＣＨ１０１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手）、ＩＬ－２１（ＢＶ４２１，クローン：３Ａ３－Ｎ２．１）、ＣＤ４５（ＢＶ７８６，Ｄ０５８－１２８３）およびＣＤ３（クローンＳＰ３４－２，ＰＥ－Ｃｙ７標識）（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手）；ＣＤ４（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ，クローンＯＫＴ４）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から）。抗体の希釈は、製造業者の推奨に従って決定した。死細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手したｌｉｖｅ－ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｉｎ ｋｉｔを使用することによって排除した。続いて、細胞を２％ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで固定化し、ＦｏｘＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で透過処理した。細胞内マーカーＦｏｘＰ３およびＩＬ－２１を透過化バッファー中で染色した。コンペンセーションコントロール（ＯｎｅＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）およびｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールの両方を利用した。全てのサンプルをＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０アナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて分析した。約２ｘ１０５～１ｘ１０６イベントをサンプルごとに収集した。
【0210】
ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３直腸チャレンジ
ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスは、Ｒ１５７ ｈａｒｖｅｓｔ ３（３．１６．１２）から誘導された。このストックは、６６ｎｇ／ｍｌのＰ２７含有量、Ｌｏｇ約９．３５のＲＮＡ含有量、インド起源のアカゲザルＰＢＭＣにおけるＴＣＩＤ５０：１２８８／ｍｌ、およびＴＺＭ－ｂｌ細胞におけるＴＣＩＤ５０：４．１×１０４／ｍｌを有していた。ストックの１：３００希釈１ｍｌを使用した。これは、アカゲザルＰＢＭＣにおける４．３ＴＣＩＤ５０と、およびＴＺＭ－ｂｌ細胞における１３７ＴＣＩＤ５０と同等であった。この用量を週１回の直腸内（ＩＲ）チャレンジのために使用した。血漿サンプルを、Ｌｅｉｄｏｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって、ＳＨＩＶウイルスＲＮＡコピー数に関して分析した。１０を超えるＲＮＡコピーを有する動物を感染動物とみなし、その動物に感染させるのに必要なチャレンジの回数をカプラン・マイヤー生存分析のイベントとして用いた。いったん感染させた後は、当該動物はもうチャレンジされなかった。血漿中ウイルス量を、試験終了まで同じ方法で定期的にモニタリングした。
ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスは、Ｒ１５７ ｈａｒｖｅｓｔ ３（３．１６．１２）から誘導された。このストックは、６６ｎｇ／ｍｌのＰ２７含有量、Ｌｏｇ約９．３５のＲＮＡ含有量、インド起源のアカゲザルＰＢＭＣにおけるＴＣＩＤ５０：１２８８／ｍｌ、およびＴＺＭ－ｂｌ細胞におけるＴＣＩＤ５０：４．１×１０４／ｍｌを有していた。ストックの１：３００希釈１ｍｌを使用した。これは、アカゲザルＰＢＭＣにおける４．３ＴＣＩＤ５０と、およびＴＺＭ－ｂｌ細胞における１３７ＴＣＩＤ５０と同等であった。この用量を週１回の直腸内（ＩＲ）チャレンジのために使用した。血漿サンプルを、Ｌｅｉｄｏｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって、ＳＨＩＶウイルスＲＮＡコピー数に関して分析した。１０を超えるＲＮＡコピーを有する動物を感染動物とみなし、その動物に感染させるのに必要なチャレンジの回数をカプラン・マイヤー生存分析のイベントとして用いた。いったん感染させた後は、当該動物はもうチャレンジされなかった。血漿中ウイルス量を、試験終了まで同じ方法で定期的にモニタリングした。
【0211】
組織におけるＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３のウイルス量
試験終了時に、ＰＢＭＣおよび死後組織を採取した。ＰＢＭＣおよび腸サンプルを、ｑＰＣＲによってＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスＲＮＡについて分析した。Ｐｒｉｓｍ ７ Ｇｒａｐｈｉｃａｌソフトウェアを全ての統計解析に使用した。
試験終了時に、ＰＢＭＣおよび死後組織を採取した。ＰＢＭＣおよび腸サンプルを、ｑＰＣＲによってＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスＲＮＡについて分析した。Ｐｒｉｓｍ ７ Ｇｒａｐｈｉｃａｌソフトウェアを全ての統計解析に使用した。
【0212】
ＨＩＶ－１ ｇｐ１６０を発現するＳＣ－Ａｄ
クレードＢエンベロープタンパク質配列（Ｇ４ ｇｐ１６０）を、ＨＩＶ患者ＶＣ１００１４からの抗体中和範囲の拡大におけるピークの前および直前（Ｆ８ ｇｐ１６０）に同定した。これらのｇｐ１６０配列を、強力なサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でＳＣ－Ａｄ６およびＳＣ－Ａｄ６５７に挿入した（図２４Ａ）。Ａｄ５７は、そのヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）およびそのＥ３免疫回避遺伝子においてバリエーションを有するＡｄ６とほぼ同一である種ＣヒトＡｄである（図２４Ｂ）。大部分のＡｄ中和抗体はＡｄのヘキソンＨＶＲを標的とする（Ｐｉｃｈｌａ－Ｇｏｌｌｏｎら、２００７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：１６８０－１６８９；およびＳｕｍｉｄａら、２００５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：７１７９－７１８５）。これを考慮して、Ａｄ６のＨＶＲをＡｄ５７由来のものと置き換えて、Ａｄ６５７と呼ぶキメラ種Ｃベクターを生成した。ＳＣ－Ａｄ６およびＳＣ－Ａｄ６５７は両方とも、Ｅ１を含む全てのＡｄ遺伝子を保持し、機能的なｐＩＩＩＡおよびＥ３遺伝子を欠いている（図２４Ａ）。従って、両ＳＣ－Ａｄは、それらのゲノムを複製してｇｐ１６０の発現を増幅することができるが、子孫のＡｄウイルスは生成しない。両ウイルスをレスキューし、２９３－ＩＩＩＡ細胞中で産生し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。Ａ５４９細胞に感染させるために使用した場合、両ベクターは、ウェスタンブロッティングによって決定されるように、ｇｐ１６０を産生した。
クレードＢエンベロープタンパク質配列（Ｇ４ ｇｐ１６０）を、ＨＩＶ患者ＶＣ１００１４からの抗体中和範囲の拡大におけるピークの前および直前（Ｆ８ ｇｐ１６０）に同定した。これらのｇｐ１６０配列を、強力なサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でＳＣ－Ａｄ６およびＳＣ－Ａｄ６５７に挿入した（図２４Ａ）。Ａｄ５７は、そのヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）およびそのＥ３免疫回避遺伝子においてバリエーションを有するＡｄ６とほぼ同一である種ＣヒトＡｄである（図２４Ｂ）。大部分のＡｄ中和抗体はＡｄのヘキソンＨＶＲを標的とする（Ｐｉｃｈｌａ－Ｇｏｌｌｏｎら、２００７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：１６８０－１６８９；およびＳｕｍｉｄａら、２００５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：７１７９－７１８５）。これを考慮して、Ａｄ６のＨＶＲをＡｄ５７由来のものと置き換えて、Ａｄ６５７と呼ぶキメラ種Ｃベクターを生成した。ＳＣ－Ａｄ６およびＳＣ－Ａｄ６５７は両方とも、Ｅ１を含む全てのＡｄ遺伝子を保持し、機能的なｐＩＩＩＡおよびＥ３遺伝子を欠いている（図２４Ａ）。従って、両ＳＣ－Ａｄは、それらのゲノムを複製してｇｐ１６０の発現を増幅することができるが、子孫のＡｄウイルスは生成しない。両ウイルスをレスキューし、２９３－ＩＩＩＡ細胞中で産生し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。Ａ５４９細胞に感染させるために使用した場合、両ベクターは、ウェスタンブロッティングによって決定されるように、ｇｐ１６０を産生した。
【0213】
種々のＡｄベクターが、全身性筋肉内（ＩＭ）経路によって、ならびに強制経口投与、経口腸溶性コーティングカプセル、鼻内（ＩＮ）および膣内（ＩＶＡＧ）を含む種々の粘膜経路によって、アカゲザルにおいて前もって試験された。小動物におけるＩＭ、ＩＮおよびＩＶＡＧ経路によるＳＣ－Ａｄ－Ｇ４の試験により、ＩＶＡＧ経路によるプライミングが無視できる程度の抗体応答を生成することが明らかとなった。対照的に、マウスおよびハムスターの両方においてＩＮ免疫化は、強い抗体反応を生成した。これらのデータと、ヒトにおけるＩＶＡＧ免疫化を実施することが困難である可能性を考慮し、その後のマカクを用いた試験では、粘膜免疫化経路としてＩＮ経路を選択した。
【0214】
アカゲザルにおける単回粘膜および全身性免疫化
２ｘ１０１０ｖｐのＳＣ－Ａｄ６－Ｇ４ Ｅｎｖを使用して、８匹の雌アカゲザルの群に、単回のＩＭまたはＩＮ免疫化によってワクチン接種した（図１４）。この用量は比較的低く、ＩＮとＩＭの混合免疫化によって送達されるＲＣ－Ａｄ ＨＩＶエンベロープワクチンの最近の使用よりも約７．５倍低い。ネガティブコントロールベクター群を、エボラ糖タンパク質（ｇｐ）を発現するＳＣ－Ａｄ６でＩＮ免疫化した。４週後、血漿サンプルを、Ｆ８ ｇｐ１４０に対するＥｎｖ結合抗体についてアッセイした（図１４）。これは、単回免疫化後のＩＭ免疫化経路群において、有意に高いミッドポイント結合力価を示した（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０１）。ＳＦ１６２中和抗体（ＮＡｂ）力価もこの時点で上昇したが、個々の経路群に関して、ＡＮＯＶＡによる有意には至らなかった。
２ｘ１０１０ｖｐのＳＣ－Ａｄ６－Ｇ４ Ｅｎｖを使用して、８匹の雌アカゲザルの群に、単回のＩＭまたはＩＮ免疫化によってワクチン接種した（図１４）。この用量は比較的低く、ＩＮとＩＭの混合免疫化によって送達されるＲＣ－Ａｄ ＨＩＶエンベロープワクチンの最近の使用よりも約７．５倍低い。ネガティブコントロールベクター群を、エボラ糖タンパク質（ｇｐ）を発現するＳＣ－Ａｄ６でＩＮ免疫化した。４週後、血漿サンプルを、Ｆ８ ｇｐ１４０に対するＥｎｖ結合抗体についてアッセイした（図１４）。これは、単回免疫化後のＩＭ免疫化経路群において、有意に高いミッドポイント結合力価を示した（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０１）。ＳＦ１６２中和抗体（ＮＡｂ）力価もこの時点で上昇したが、個々の経路群に関して、ＡＮＯＶＡによる有意には至らなかった。
【0215】
４週目におけるＳＣ－Ａｄ６を用いたＩＭ ｖｓ ＩＮブースト
１回のＡｄ ＩＭ免疫化によって産生される抗アデノウイルス中和抗体は、異なる経路によるブースティングによって回避され得ることが報告された（Ｘｉａｎｇら、２００３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１０７８０－１０７８９）。この経路コンセプトを検証して、マカクにおける同じＡｄ血清型の再使用を可能にするために、各々のＳＣ－Ａｄ６で抗原刺激を受けた群を４匹の２群に分けた。これらを、それぞれ、ＩＭまたはＩＮ経路のいずれかによって、４週目に、代替Ｆ８ Ｅｎｖを発現するＳＣ－Ａｄ６でブーストした。このブーストの３週後に採取した血漿サンプルは、ＩＭ－ＩＭ群、ＩＭ－ＩＮ群およびＩＮ－ＩＭ群によってプライム－ブーストされた動物において、ミッドポイント結合力価の上昇を示した。検出可能な抗体は、ＩＮ－ＩＮ群では観察されなかった（図１４）。
１回のＡｄ ＩＭ免疫化によって産生される抗アデノウイルス中和抗体は、異なる経路によるブースティングによって回避され得ることが報告された（Ｘｉａｎｇら、２００３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１０７８０－１０７８９）。この経路コンセプトを検証して、マカクにおける同じＡｄ血清型の再使用を可能にするために、各々のＳＣ－Ａｄ６で抗原刺激を受けた群を４匹の２群に分けた。これらを、それぞれ、ＩＭまたはＩＮ経路のいずれかによって、４週目に、代替Ｆ８ Ｅｎｖを発現するＳＣ－Ａｄ６でブーストした。このブーストの３週後に採取した血漿サンプルは、ＩＭ－ＩＭ群、ＩＭ－ＩＮ群およびＩＮ－ＩＭ群によってプライム－ブーストされた動物において、ミッドポイント結合力価の上昇を示した。検出可能な抗体は、ＩＮ－ＩＮ群では観察されなかった（図１４）。
【0216】
１３週目でのＳＣ－Ａｄ６５７ブースト
その後、前記動物を１３週目に、Ｇ４ Ｅｎｖを発現するＳＣ－Ａｄ６５７での血清型スイッチングによってブーストした。以前のブーストにおけるのと同じ経路を使用した。１５週目の力価により、ＩＭで抗原刺激を受けた動物が３５０近い上昇したＥｎｖ結合力価を有するが、これらのレベルはコントロール群と有意差がないことが示された（図１４）。対照的に、ＩＮ－ＩＭ－ＩＭ群における抗体は、ベクターコントロールおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群の両方より有意に高かった（ｐ＜０．０１）。ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群は再び、３回の免疫化の後でさえＥｎｖ抗体を示さなかった。
その後、前記動物を１３週目に、Ｇ４ Ｅｎｖを発現するＳＣ－Ａｄ６５７での血清型スイッチングによってブーストした。以前のブーストにおけるのと同じ経路を使用した。１５週目の力価により、ＩＭで抗原刺激を受けた動物が３５０近い上昇したＥｎｖ結合力価を有するが、これらのレベルはコントロール群と有意差がないことが示された（図１４）。対照的に、ＩＮ－ＩＭ－ＩＭ群における抗体は、ベクターコントロールおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群の両方より有意に高かった（ｐ＜０．０１）。ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群は再び、３回の免疫化の後でさえＥｎｖ抗体を示さなかった。
【0217】
２４週目における組換え三量体Ｅｎｖタンパク質ブースト
ほとんどのＨＩＶワクチン研究は、タンパク質ブーストでＡｄ免疫化を増強して、抗体反応を増幅する。例えば、最近の研究では、ＲＤ－Ａｄ２６ベクターが２回使用され、そしてアジュバント化ｇｐ１４０タンパク質で３回ブーストされた（Ｂａｒｏｕｃｈら、２０１５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９（６２４５）：３２０－４）。このストラテジーがＳＣ－Ａｄワクチンを増強するかどうかを決定するために、ＳＣ－Ａｄ－Ｅｎｖ群の全てを、ＡＤＪＵＰＬＥＸ（商標）アジュバントと混合した組換えＦ８三量体ｇｐ１４０タンパク質５０μｇでＩＭ経路によりブーストした。Ｆ８三量体タンパク質は、全ての群において２桁の大きさでミッドポイント結合力価を増大させた（図１４）。初期のＳＣ－Ａｄ免疫化後にＥｎｖ結合抗体が検出されなかったにもかかわらず、このタンパク質免疫化はまた、他の群に匹敵するレベルまでＩＮ－ＩＮ－ＩＮを増大させた。
ほとんどのＨＩＶワクチン研究は、タンパク質ブーストでＡｄ免疫化を増強して、抗体反応を増幅する。例えば、最近の研究では、ＲＤ－Ａｄ２６ベクターが２回使用され、そしてアジュバント化ｇｐ１４０タンパク質で３回ブーストされた（Ｂａｒｏｕｃｈら、２０１５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９（６２４５）：３２０－４）。このストラテジーがＳＣ－Ａｄワクチンを増強するかどうかを決定するために、ＳＣ－Ａｄ－Ｅｎｖ群の全てを、ＡＤＪＵＰＬＥＸ（商標）アジュバントと混合した組換えＦ８三量体ｇｐ１４０タンパク質５０μｇでＩＭ経路によりブーストした。Ｆ８三量体タンパク質は、全ての群において２桁の大きさでミッドポイント結合力価を増大させた（図１４）。初期のＳＣ－Ａｄ免疫化後にＥｎｖ結合抗体が検出されなかったにもかかわらず、このタンパク質免疫化はまた、他の群に匹敵するレベルまでＩＮ－ＩＮ－ＩＮを増大させた。
【0218】
２回目のタンパク質ブースト後の血漿における結合および中和抗体
動物を３８週目に２回目にタンパク質でブーストした。これは、４０週目までにＦ８結合血漿抗体力価をほぼ１０５にまで増加させ、全ての群がコントロールと有意に異なるようになった（図１４）。Ｔｉｅｒ１Ａ ＳＦ１６２ウイルスに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価は、４０週目に１００～１０，０００に上昇した（図１５）。Ｔｉｅｒ１ＢウイルスＳＳ１１９６およびＴｉｅｒ２ ＪＲＣＳＦウイルスに対するＮＡｂは、力価がバックグラウンドレベルであったＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群の２匹の動物を除き、ほとんどの動物において１００に増加した（図１５）。
動物を３８週目に２回目にタンパク質でブーストした。これは、４０週目までにＦ８結合血漿抗体力価をほぼ１０５にまで増加させ、全ての群がコントロールと有意に異なるようになった（図１４）。Ｔｉｅｒ１Ａ ＳＦ１６２ウイルスに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価は、４０週目に１００～１０，０００に上昇した（図１５）。Ｔｉｅｒ１ＢウイルスＳＳ１１９６およびＴｉｅｒ２ ＪＲＣＳＦウイルスに対するＮＡｂは、力価がバックグラウンドレベルであったＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群の２匹の動物を除き、ほとんどの動物において１００に増加した（図１５）。
【0219】
２回目のタンパク質ブースト後のＡＤＣＣ活性
４０週目の血漿中の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３感染細胞に対して試験した。ＡＤＣＣ活性は一般に、少なくとも１回のＩＮ粘膜ＳＣ－Ａｄ免疫化を行った動物においてより高かった（図１６）。粘膜免疫化を受けた全ての動物は、ＳＣ－Ａｄ－Ｅｂｏｌａコントロール動物よりも有意に高い最大％ＡＤＣＣを有していた（ＩＭ－ＩＮ－ＩＮ、ＩＮ－ＩＭ－ＩＭおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮに関してそれぞれｐ＜０．０５、０．０００１、０．０００１）。５０％のＡＤＣＣ力価によって比較した場合、ＩＮ ＳＣ－Ａｄで抗原刺激を受けた群のみが、コントロールよりも有意に高いＡＤＣＣ活性を有していた（ＩＮ－ＩＭ－ＩＭおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群に関してＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５および０．００１）。
４０週目の血漿中の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３感染細胞に対して試験した。ＡＤＣＣ活性は一般に、少なくとも１回のＩＮ粘膜ＳＣ－Ａｄ免疫化を行った動物においてより高かった（図１６）。粘膜免疫化を受けた全ての動物は、ＳＣ－Ａｄ－Ｅｂｏｌａコントロール動物よりも有意に高い最大％ＡＤＣＣを有していた（ＩＭ－ＩＮ－ＩＮ、ＩＮ－ＩＭ－ＩＭおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮに関してそれぞれｐ＜０．０５、０．０００１、０．０００１）。５０％のＡＤＣＣ力価によって比較した場合、ＩＮ ＳＣ－Ａｄで抗原刺激を受けた群のみが、コントロールよりも有意に高いＡＤＣＣ活性を有していた（ＩＮ－ＩＭ－ＩＭおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群に関してＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５および０．００１）。
【0220】
２回目のタンパク質ブースト後の、唾液および膣洗浄液における抗体反応
上記のデータにより、血漿中の全身性抗体応答をモニターした。唾液および膣洗浄サンプルを、４０週にも採取し、これらの粘膜部位における抗体に関して測定した。唾液および膣洗浄液を、ＥＬＩＳＡによってＦ８およびＳＦ１６２ ｅｎｖ結合についてアッセイした場合、ＳＣ－Ａｄ－Ｅｂｏｌａ対照群を除いてほとんどの群でこれらの応答が観察された（図２５）。
上記のデータにより、血漿中の全身性抗体応答をモニターした。唾液および膣洗浄サンプルを、４０週にも採取し、これらの粘膜部位における抗体に関して測定した。唾液および膣洗浄液を、ＥＬＩＳＡによってＦ８およびＳＦ１６２ ｅｎｖ結合についてアッセイした場合、ＳＣ－Ａｄ－Ｅｂｏｌａ対照群を除いてほとんどの群でこれらの応答が観察された（図２５）。
【0221】
これらの粘膜抗体に対する局所的効果があると考えられる。ほとんどＩＮ経路（ＩＭ－ＩＮ－ＩＮおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮ）によりＳＣ－Ａｄで免疫化した動物において、結合抗体は免疫化のこの部位に近い唾液でより高かったが、より離れた膣部位ではより低かった（図２５）。ＡＤＣＣ活性をこれらの粘膜サンプルで測定した場合、これらの応答は非常に変動しやすかった（図１７）。これにもかかわらず、コントロール動物と比較した場合、ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群においてより高いＡＤＣＣ活性が観察された（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５）。
【0222】
１回のタンパク質ブースト後の全身性細胞性免疫応答
２回目のＦ８ Ｅｎｖタンパク質ブーストの直前に採取したサンプルにおいて、３８週目のＰＢＭＣをＥＬＩＳＰＯＴにより、Ｅｎｖに対するおよびアデノウイルスに対するＴ細胞に関してアッセイした。すべてのＥｎｖ免疫化動物は、それらのＰＢＭＣにおいてＥｎｖ特異的ＩＦＮ－γ分泌細胞を有していた（図１８Ａ）。Ｅｎｖ特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＣのレベルは、少なくとも１回の粘膜免疫化を受けた動物において概して増加した。しかし、ＩＦＮ－γ ＳＦＣは、それらをＳＣ－Ａｄ Ｅｂｏｌａで免疫化したコントロール動物と比較した場合、ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ ＳＣ－Ａｄ群でのみ有意に高いだけであった（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５）。抗Ａｄ ＳＦＣは、この時点で抗Ｅｎｖ ＳＦＣと比較した場合、全ての群において比較的低かった。
２回目のＦ８ Ｅｎｖタンパク質ブーストの直前に採取したサンプルにおいて、３８週目のＰＢＭＣをＥＬＩＳＰＯＴにより、Ｅｎｖに対するおよびアデノウイルスに対するＴ細胞に関してアッセイした。すべてのＥｎｖ免疫化動物は、それらのＰＢＭＣにおいてＥｎｖ特異的ＩＦＮ－γ分泌細胞を有していた（図１８Ａ）。Ｅｎｖ特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＣのレベルは、少なくとも１回の粘膜免疫化を受けた動物において概して増加した。しかし、ＩＦＮ－γ ＳＦＣは、それらをＳＣ－Ａｄ Ｅｂｏｌａで免疫化したコントロール動物と比較した場合、ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ ＳＣ－Ａｄ群でのみ有意に高いだけであった（ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５）。抗Ａｄ ＳＦＣは、この時点で抗Ｅｎｖ ＳＦＣと比較した場合、全ての群において比較的低かった。
【0223】
２回目のタンパク質ブースト後の全身性細胞性免疫応答
４０週目に、ＰＢＭＣおよび鼠径リンパ節細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによりＥｎｖ特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＣについてアッセイした（図１８Ｂ）。このタンパク質ブーストにより、ＰＢＭＣおよびリンパ節において、Ｅｎｖ特異的ＳＦＣが、Ｅｎｖで免疫化した全ての動物において類似したレベルに増加した。
４０週目に、ＰＢＭＣおよび鼠径リンパ節細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによりＥｎｖ特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＣについてアッセイした（図１８Ｂ）。このタンパク質ブーストにより、ＰＢＭＣおよびリンパ節において、Ｅｎｖ特異的ＳＦＣが、Ｅｎｖで免疫化した全ての動物において類似したレベルに増加した。
【0224】
粘膜細胞輸送
４０週目の直腸生検サンプルに関するフローサイトメトリーでは、直腸部位におけるα４β７ ＣＤ４およびＣＤ８細胞について類似の数を示した（図１９Ａ）。ＩＮで抗原刺激を受けた群の数が増加する傾向があったが、これらは有意には達しなかった。直腸組織における活性化ＣＤ６９＋ＣＤ４＋細胞数は、群間で類似していた（図１９Ｂ）。同様に、この粘膜部位のＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋細胞に関しても、明らかな差は認められなかった（図１９Ｂ）。
４０週目の直腸生検サンプルに関するフローサイトメトリーでは、直腸部位におけるα４β７ ＣＤ４およびＣＤ８細胞について類似の数を示した（図１９Ａ）。ＩＮで抗原刺激を受けた群の数が増加する傾向があったが、これらは有意には達しなかった。直腸組織における活性化ＣＤ６９＋ＣＤ４＋細胞数は、群間で類似していた（図１９Ｂ）。同様に、この粘膜部位のＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋細胞に関しても、明らかな差は認められなかった（図１９Ｂ）。
【0225】
抗原特異的Ｔｆｈ細胞分布
ＣＸＣＲ５＋ＩＬ－２１＋ＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（ｐＴｆｈ）細胞を、４０週目に、ＰＢＭＣおよびリンパ節サンプルで測定した（図２０）。ＩＭ経路のみによってＡｄおよびタンパク質により免疫化した動物は、他の群よりも、有意に高いＰＢＭＣにおける末梢Ｔｆｈ（ｐＴｆｈ）細胞を有していた（図２０）。リンパ節では、Ｔｆｈ細胞はコントロール群およびＩＭのみの群において最も低かった。対照的に、少なくとも１回のＩＮ粘膜免疫化を受けた動物の約半数は、最後のタンパク質ブースト後にそれらのリンパ節において検出可能なＴｆｈを有している（図２０）。
ＣＸＣＲ５＋ＩＬ－２１＋ＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（ｐＴｆｈ）細胞を、４０週目に、ＰＢＭＣおよびリンパ節サンプルで測定した（図２０）。ＩＭ経路のみによってＡｄおよびタンパク質により免疫化した動物は、他の群よりも、有意に高いＰＢＭＣにおける末梢Ｔｆｈ（ｐＴｆｈ）細胞を有していた（図２０）。リンパ節では、Ｔｆｈ細胞はコントロール群およびＩＭのみの群において最も低かった。対照的に、少なくとも１回のＩＮ粘膜免疫化を受けた動物の約半数は、最後のタンパク質ブースト後にそれらのリンパ節において検出可能なＴｆｈを有している（図２０）。
【0226】
ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３を用いた直腸チャレンジ
免疫化されたマカクを、ＨＩＶ分離株ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３で直腸チャレンジした。４匹の免疫化されていないコントロール動物を研究に加え、それぞれの群を、ＮＩＨによって提供されたＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３チャレンジストックの１：３００希釈物１ｍＬを直腸接種することによって毎週チャレンジした。このチャレンジは、アカゲザルＰＢＭＣにおける４．３ＴＣＩＤ５０と、およびＴＺＭ－ｂｌ細胞における１３７ＴＣＩＤ５０と同等であった。初回チャレンジ後、非免疫化コントロール群における２匹とＩＭ－ＩＭ－ＩＭ群の２匹が感染した（図２１）。各々の混合経路群（ＩＭ－ＩＮ－ＩＮおよびＩＮ－ＩＭ－ＩＭ）における１匹は、１回のチャレンジ後に感染した。ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群では、初回チャレンジ後に感染した動物はいなかった。血漿中のウイルス量から、エボラ群動物を除く全動物が、３回のチャレンジ後に高ウイルス量に達したことが示された（図２２Ｂ）。ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群における動物では、これらの高ウイルス量への到達が遅れた。
免疫化されたマカクを、ＨＩＶ分離株ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３で直腸チャレンジした。４匹の免疫化されていないコントロール動物を研究に加え、それぞれの群を、ＮＩＨによって提供されたＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３チャレンジストックの１：３００希釈物１ｍＬを直腸接種することによって毎週チャレンジした。このチャレンジは、アカゲザルＰＢＭＣにおける４．３ＴＣＩＤ５０と、およびＴＺＭ－ｂｌ細胞における１３７ＴＣＩＤ５０と同等であった。初回チャレンジ後、非免疫化コントロール群における２匹とＩＭ－ＩＭ－ＩＭ群の２匹が感染した（図２１）。各々の混合経路群（ＩＭ－ＩＮ－ＩＮおよびＩＮ－ＩＭ－ＩＭ）における１匹は、１回のチャレンジ後に感染した。ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群では、初回チャレンジ後に感染した動物はいなかった。血漿中のウイルス量から、エボラ群動物を除く全動物が、３回のチャレンジ後に高ウイルス量に達したことが示された（図２２Ｂ）。ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群における動物では、これらの高ウイルス量への到達が遅れた。
【0227】
チャレンジを継続するにつれて、７回のチャレンジ後に未感染のままであったエボラ群の１匹を除いて、全群における動物が感染した。Ｔｒｉｍ５αおよびＭＨＣ対立遺伝子をレトロスペクティブに調べた（表２）。この解析では、耐性Ｅｂｏｌａ群動物において明白な保護遺伝子は明らかにならなかった。ほとんどの動物は、それらを適度に保護している可能性のある対立遺伝子によって分類することはできなかったが、ほとんどの群は、これらの対立遺伝子のおかげで保護の可能性がより高い動物を少なくとも１匹有していた。ＩＭ－ＩＭ－ＩＭおよびＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群における２／４匹の動物が、ＳＩＶｓｍｍおよびおそらくＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３に対する先天的保護のより高い可能性を予測し得るＴｒｉｍ５ａおよびＭＨＣ対立遺伝子を有していたことに注目すべきである（表２）。
【0228】
【表2】
【0229】
動物を、それらをＳＣ－Ａｄを用いるＩＭ経路またはＩＮ経路のいずれで抗原刺激を受けたかどうかに基づいて群分けし、カプラン・マイヤー生存率を分析したところ、ＩＭで抗原刺激を受けた８匹の動物の感染はコントロール動物の感染と類似していた（図２２Ａ）。対照的に、粘膜ＩＮ経路によりＳＣ－Ａｄ－Ｅｎｖで抗原刺激を受けた８匹の動物では、感染がいくぶん遅れた。
【0230】
組織における死後のウイルス量
チャレンジ試験は、最初のチャレンジから９週後に終了した。ＰＢＭＣおよび腸組織を単離し、ＲＮＡを精製し、ＳＨＩＶウイルスゲノムについて評価した（図２２Ｂ）。死後ＰＢＭＣは、種々のレベルのＳＨＩＶウイルスＲＮＡを有しており、ＩＭ－ＩＭ－ＩＭ群におけるよりもＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群における方が若干低いレベルであった。結腸における平均ウイルスＲＮＡは、ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群においてＩＭ－ＩＭ－ＩＭ群よりも１５倍低かった（図２３）。この差はＡＮＯＶＡでは有意に達しなかったが、両側Ｔ検定ではｐ値が０．００７９であった。
チャレンジ試験は、最初のチャレンジから９週後に終了した。ＰＢＭＣおよび腸組織を単離し、ＲＮＡを精製し、ＳＨＩＶウイルスゲノムについて評価した（図２２Ｂ）。死後ＰＢＭＣは、種々のレベルのＳＨＩＶウイルスＲＮＡを有しており、ＩＭ－ＩＭ－ＩＭ群におけるよりもＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群における方が若干低いレベルであった。結腸における平均ウイルスＲＮＡは、ＩＮ－ＩＮ－ＩＮ群においてＩＭ－ＩＭ－ＩＭ群よりも１５倍低かった（図２３）。この差はＡＮＯＶＡでは有意に達しなかったが、両側Ｔ検定ではｐ値が０．００７９であった。
【0231】
この例は、複製性ＳＣ－Ａｄベクターが、ＨＩＶ－１および他の感染性疾患に対するワクチン接種のための強固たるかつ安全なプラットフォームとして使用できることを実証している。ＳＣ－Ａｄは、感染したヒト細胞において１０，０００倍まで抗原およびサイトカイン遺伝子を増幅することができる。ヒトにおけるＨＩＶ－１ワクチンとして現在試験されているＲＤ－Ａｄベクターによって媒介されるものよりもはるかに免疫応答が増幅される。ＨＩＶワクチンを、ＳＣ－Ａｄベクター、例えば低い血清抗体保有率を有する組換えＡｄをベースとするＳＣ－Ａｄベクターを利用することによって、ＨＩＶ抗原遺伝子を増幅するワクチンプラットフォームに移行させることができる。
【0232】
例８．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原に対する免疫応答に関するＩｎ Ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ。
【0233】
ＣＭＶサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ｃＤＮＡまたはＨＣＶ抗原２．４を発現するＡｄ６５７でマウスを免疫化した。同系細胞をＨＣＶペプチドでパルスし、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した後、免疫化マウスに注射した。同種ＣＴＬ活性（ｃｏｇｎａｔｅ ＣＴＬ ａｃｔｉｖｉｔｙ）がＨＣＶ中の標識細胞の消失によりＨＣＶに対して観察されるが、ＣＭＶ免疫化動物では観察されない（図２６）。
【0234】
例９．制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）。
【0235】
Ａｄ６、Ａｄ６５７およびそれらのバリアントにおける、当該ウイルスを制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）に変換するＥ１タンパク質における突然変異を含む、突然変異の概要を図３９および図４３に示す。これらは、それぞれｐ３００およびｐＲＢへの結合を遮断するｄｌ１１０７および／またはｄｌ１１０７を含む。
【0236】
図５６は、野生型ＡｄにおけるＥ１Ａ、ならびにＡｄバリアントであるＥ１Ａ ｄｌ１１０１、Ｅ１Ａ ｄｌ１１０７およびＥ１Ａ ｄｌ１１０１／１１０７のＮ末端アミノ酸配列を示す。
【0237】
また、ＣＲＡｄ、Ａｄ－ＰＢを生成するための、配列番号４４の前立腺特異的プロモーターであるプロバシン－Ｅ１ ＤＮＡ配列による、Ａｄ Ｅ１プロモーターの置換を示す（図５５）。プロバシンプロモーターは、アンドロゲン依存性であるため、ＬＮＣａＰのようなアンドロゲン感受性腫瘍では作動するが、ＤＵ１４５のようなアンドロゲン抵抗性腫瘍では作動しない。
【0238】
Ａ５４９細胞を、示されたウイルス（ｖｐ／細胞）濃度で、示されたＡｄ６またはＡｄ６５７バリアントに感染させ、５日後にクリスタルバイオレット染色によって細胞生存率を測定した（図４０）。
【0239】
複製欠損Ａｄ（ＲＤ－Ａｄ）、Ａｄ６、ＣＲＡｄ６－ｄｌ１１０１／ｄｌ１１０７またはＣＲＡｄ６－ＰＢによる非癌性細胞の殺傷。制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であるためのＡｄ６およびＡｄ６５７の修飾（図４４）。
【0240】
複製能を有するＡｄ５、Ａｄ６、Ａｄ６５７、および示されたＣＲＡｄにより癌性細胞が殺されることが、図４５において示される。制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であるためのＡｄ６およびＡｄ６５７の修飾が示されている（図４４）。
【0241】
図４６に示される結果は、乳癌細胞における制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であるためのＡｄ６およびＡｄ６５７の修飾を示している。
【0242】
図４７に示される結果は、前立腺癌および肺癌細胞における制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であるためのＡｄ６およびＡｄ６５７の修飾を示している。
【0243】
マウスにおけるＤＵ１４５腫瘍の成長に対する、複製能を有するＡｄ６または示されたＣＲＡｄのｉｎ ｖｉｖｏ効果。図４８は、ヒト前立腺腫瘍を有するマウスにおける単回静脈内注射後にｉｎ ｖｉｖｏで制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であるためのＡｄ６およびＡｄ６５７の修飾を示す。
【0244】
ＤＵ１４５腫瘍を有するマウスの生存に対する、複製能を有するＡｄ６または示されたＣＲＡｄのｉｎ ｖｉｖｏ効果。図４９は、ヒト前立腺腫瘍を有するマウスにおける単回静脈内注射後にｉｎ ｖｉｖｏで制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）であるためのＡｄ６およびＡｄ６５７の修飾を示す。
【0245】
図５１は、チンパンジーＡｄＣ６８由来のより短いファイバーでのＡｄ６５７の修飾が有効性を低下させることを実証している。
【0246】
一実施態様において、Ａｄ６／５６／６ウイルスは、Ａｄ６由来のＨＶＲ１および７、ならびにＡｄ６５７由来のＨＶＲ２～６を有する。図５２は、ＣＲＡｄ修飾の有無にかかわらず、Ａｄ６／５６／６ウイルスがヒト肺癌細胞を殺すことを示す。
【0247】
Ｅ３タンパク質に突然変異を含むＡｄバリアントによる腫瘍細胞の殺傷。免疫正常シリアンハムスターに皮下ＨａＫ腎臓癌腫瘍を移植した。これらが２００μｌの体積に達したとき、それらに、Ｅ３有りまたは無し（ＤＥ３）で、およびランダムＮＨＳ－ＰＥＧ化有りでまたは無しで構築された示したＡｄ６ウイルスを静脈内経路によって１回注射した。腫瘍サイズを経時的に測定した。データにより、全てのＥ３遺伝子を欠失させると、腫瘍溶解性ウイルスの効果が低下することが示される（Ａｄ６－ｄｅｌｔａＥ３－Ｌｕｃ対Ａｄ６－Ｌｕｃ）（図５８）。
【0248】
Ａｄファイバータンパク質は、初期の付着ステップを媒介する３つの一見同一のサブユニットの複合体である。天然のＡｄ６ファイバータンパク質は、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＡＲに結合する。
【0249】
本発明のさらなる態様において、親Ａｄ由来でない異なるファイバータンパク質を有するファイバー修飾組換えＡｄを生成した。異なるＡｄ株由来のキャプシドタンパク質を含むＣＲＡｄを含む組換えＡｄ、例えば、異種Ａｄ３５ファイバーポリペプチドまたはチンパンジーＣ６８ファイバーポリペプチド、＋／－Ｋ７ペプチドを含む組換えＡｄを作製した（図６２～６９）。
【0250】
キメラＡｄであるＡｄＦ３５ファイバーキメラは、配列番号６１のアミノ酸配列を有し、Ａｄ５およびＡｄ６ファイバータンパク質より短く、ウイルスの標的をＣＤ４６に変える。
【0251】
配列番号６２の配列を有するＫ７ファイバーを含むファイバー修飾組換えＡｄは、ウイルスの標的を、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび細胞上の負電荷にする。
【0252】
配列番号６３の配列を含む組換えキメラＡｄ、すなわち６／ＦＣ６８ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８由来のファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。当該ファイバータンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質より短く、ＣＡＲに結合する。
【0253】
配列番号６４の配列を含む組換えキメラＡｄ、すなわち６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８由来のファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。当該ファイバータンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質より短い。６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、標的がヘパリン硫酸および負電荷に変えられる。
【0254】
配列番号６５の配列を含む組換えキメラＡｄ、すなわち６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８由来のファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。当該ファイバータンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質より短い。６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、標的がヘパリン硫酸および負電荷に変えられる。
【0255】
例１０．アデノウイルスの血清型スイッチング。
【0256】
【0257】
腫瘍溶解性アデノウイルスの血清型スイッチング後の前立腺腫瘍標的化。
【0258】
側腹にＤＵ１４５前立腺腫瘍を有するマウスを、Ａｄ６５７またはＣＲＡｄ６５７の単回静脈内（ＩＶ）注射により処置した。これらのマウスを、２度目に、ＧＦＰルシフェラーゼを発現する別のＡｄ６腫瘍溶解性ウイルスまたはＡｄ６－Ｆ３５で処置し、ルシフェラーゼ活性をイメージングによって測定した。Ａｄ６は、Ａｄ６ヘキソンとＣＡＲを標的とするファイバーを有する。Ａｄ６－Ｆ３５は、Ａｄ６ヘキソンとＣＤ４６を標的とするＡｄ３５ファイバーを有する。図４２は、肝臓のオフターゲット感染がより低い、腫瘍を標的とするウイルスによる血清型スイッチ腫瘍溶解に関する能力を示している。
【0259】
血清型スイッチングの別の例では、側腹にＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を有するマウスを、Ａｄ６５７またはＣＲＡｄ６５７の３ｅ１０のウイルス粒子（ｖｐ）を用いる単回の静脈内（ＩＶ）注射により処置した。これらのマウスを、５月後、２度目に、ＧＦＰルシフェラーゼおよびファイバーバリアントＫ７（７個のリジンを付加）、Ｆ３５（Ａｄ３５ファイバーを有する）またはＫＫＴＫ－Ｃ６８（Ａｄ６ ＫＫＴＫフレキシビリティードメインの後に融合されたチンパンジーＣ６８ファイバー）を発現する別のＡｄ６／５７／６腫瘍溶解性ウイルス３ｅ１０ｖｐで処置した。ＫＫＴＫ－Ｃ６８ウイルスはまた、ウイルス生産性を増強するために、付加されたコドン最適化Ｅ４ ３４Ｋ遺伝子を有する。ルシフェラーゼ活性を７日後にイメージングによって測定した。全てのＡｄ６／５７／６は、Ａｄ６からのＨＶＲ１および７、ならびにＡｄ５７からのＨＶＲ２～６を有するヘキソンを有する。Ａｄ６／５７／６およびＫＫＴＫ－Ｃ６８は、ＣＡＲを標的とするファイバーを有する。Ａｄ６／５７／６－Ｆ３５は、ＣＤ４６を標的とするＡｄ３５ファイバーを有する。Ｋ７は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンの結合を含む細胞上の負電荷への結合を増加させる。図７０は、肝臓のオフターゲット感染がより低い、腫瘍を標的化するウイルスによる血清型スイッチ腫瘍溶解に関する能力を示している。
【0260】
非ヒト霊長類のワクチン接種中の血清型スイッチング。
【0261】
図１４から２５において、アカゲザルを、ＨＩＶエンベロープを発現する複製性シングルサイクルＡｄ６で免疫化し、その後、ＨＩＶエンベロープを発現するシングルサイクルＡｄ６５７での血清型スイッチングによってブーストした。これらの免疫化の後、各動物をエンベロープタンパク質でブーストした。それぞれの図は、適応抗体または細胞性免疫応答の生成、および動物がどのようにしてＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスによる直腸チャレンジを撃退したかを示す。図１４は、Ａｄ６５７への変化が抗体応答の顕著な増加を生じさせた血清型スイッチの値を示す。
【0262】
例１１．腫瘍溶解性癌ワクチン。
【0263】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、元のままのＥ３を有し、ヒトホレート受容体αを発現するＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１／１１０７－ＦｏｌＲの１０１０個のウイルス粒子で、またはＰＢＳで、筋肉内経路により免疫化した。１回の免疫から２週間後に血清を採取し、検出のために抗ＩｇＭ抗体を用いるＥＬＩＳＡ法により抗ホレート受容体α抗体に関して分析を行った（全ての抗体は、このタイプの免疫後の早期時点でＩｇＭである）。データは、このＣＲＡｄによる既知の癌抗原ホレート受容体αに対する抗体の生成を示す。Ｔ検定によりｐ－０．０７（図５３）。
【0264】
例１２．腫瘍溶解活性に対するＥ３免疫回避遺伝子の影響。
【0265】
図５７は、Ａｄにおける異なるＥ３免疫回避遺伝子の概略図を示す。Ｅ３ １９Ｋは感染細胞をＴ細胞およびＮＫ細胞から保護する。ＲＩＤタンパク質は、死誘導性リガンド（ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦＲおよびＥＧＦＲ）から感染細胞を保護する。１４．７Ｋは、感染細胞におけるアポトーシスの内因性活性化を阻害する。種ＣのＡｄはまた、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＤＰ）として知られる１１．６Ｋも発現する。ＡＤＰの過剰発現は細胞死を加速させるが、全体的な細胞死は同等である。種４９Ｋは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＣＤ４６に結合し、これらの細胞のダウンレギュレーション、およびＮＫ細胞によるクラスＩ ＭＨＣ欠損細胞の効率の低い細胞殺傷をもたらす。
【0266】
図５８は、Ｅ３ １２．５Ｋの部分的欠失、およびＥ３ ６．７Ｋ、１９Ｋ、１１．６Ｋ（ＡＤＰ）、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）および１４．７Ｋ遺伝子の全欠失が、これらの免疫回避遺伝子が腫瘍溶解性アデノウイルスに存在しない場合、腎臓癌の免疫正常ハムスターモデルにおいて、腫瘍溶解性の有効性を低下させることを示している。
【0267】
他の実施態様
本発明をその詳細な説明と組み合わせて説明してきたが、前記の説明は例示を意図し、添付の請求項の範囲によって定義される発明の範囲を限定しないことを意図することは理解されるべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の請求項の範囲内にある。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドを含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＨＶＲとは異なる、前記組換えアデノウイルス（Ａｄ）。
２．前記の第１のＡｄ株および前記の１種または複数の異なるＡｄ株が血清型的に異なる、上記１に記載の組換えＡｄ。
３．前記の第１のＡｄ株がヒトＡｄ６株であり、１つの第２のＡｄ株がヒトＡｄ５７株である、上記１または２に記載の組換えＡｄ。
４．１種または複数の異なるＡｄ株からのキャプシドポリペプチドをさらに含み、当該キャプシドポリペプチドが、第１のＡｄ株のキャプシドポリペプチドとは異なる、上記１～３のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
５．１つまたは複数の標的化ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、酵素、受容体またはリガンドをさらに含む、上記１～４のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
６．前記標的化ポリペプチドが、配列番号１～４１および配列番号４６～４７から選択されるアミノ酸配列を含む、上記５に記載の組換えＡｄ。
７．アミノ酸置換および／またはアミノ酸修飾をさらに含み、前記のアミノ酸置換がシステインへの置換であり、前記のアミノ酸修飾がＰＥＧ化およびＢＡＰ化から選択される、上記１～６のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
８．制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）である、上記１～７のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
９．配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む、上記８に記載の組換えＡｄ。
１０．（ａ）第１のＡｄ株からのヘキソンポリペプチドをコードするＡｄゲノムおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲとは異なる、前記組換えアデノウイルス（Ａｄ）。
１１．前記の第１のＡｄ株および前記の１種または複数の異なるＡｄ株が血清型的に異なる、上記１０に記載の組換えＡｄ。
１２．前記の第１のＡｄ株がヒトＡｄ６株であり、１つの第２のＡｄ株がヒトＡｄ５７株である、上記１０～１１のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１３．１種または複数の異なるＡｄ株からのキャプシドポリペプチドをさらに含み、当該キャプシドポリペプチドが、第１のＡｄ株のキャプシドポリペプチドとは異なる、上記１０～１２のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１４．標的化ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、酵素、受容体またはリガンドをコードする１種または複数の核酸をさらに含む、上記１０～１３のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１５．前記核酸が、配列番号１～４１および配列番号４６～４７から選択されるアミノ酸配列を有する標的化ポリペプチドをコードする、上記１４に記載の組換えＡｄ。
１６．アミノ酸置換および／またはアミノ酸修飾をさらに含み、前記のアミノ酸置換がシステインへの置換であり、前記のアミノ酸修飾がＰＥＧ化およびＢＡＰ化から選択される、上記１０～１５のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１７．さらに別の修飾を含む上記１０～１６のいずれか１つに記載の組換えＡｄであって、制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）である、前記組換えＡｄ。
１８．配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、上記１７に記載の組換えＡｄ。
１９．癌を有する哺乳動物を治療するための方法であって、前記哺乳動物に、上記１～１８のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス（Ａｄ）を投与することを含む、前記方法。
２０．前記癌が、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫、リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される、上記１９に記載の方法。
２１．前記投与が全身投与を含む、上記１９～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．全身投与が筋肉内、鼻内または静脈内投与を含む、上記２１に記載の方法。
２３．前記投与が局所投与を含む、上記１９～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記局所投与が腫瘍内注射を含む、上記２４に記載の方法。
２５．癌の治療のための、上記１～１８のいずれか１つに記載の組換えＡｄの使用。
２６．（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドを含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＨＶＲとは異なる前記組換えアデノウイルス（Ａｄ）の、癌の治療のための医薬としての使用。
本発明をその詳細な説明と組み合わせて説明してきたが、前記の説明は例示を意図し、添付の請求項の範囲によって定義される発明の範囲を限定しないことを意図することは理解されるべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の請求項の範囲内にある。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドを含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＨＶＲとは異なる、前記組換えアデノウイルス（Ａｄ）。
２．前記の第１のＡｄ株および前記の１種または複数の異なるＡｄ株が血清型的に異なる、上記１に記載の組換えＡｄ。
３．前記の第１のＡｄ株がヒトＡｄ６株であり、１つの第２のＡｄ株がヒトＡｄ５７株である、上記１または２に記載の組換えＡｄ。
４．１種または複数の異なるＡｄ株からのキャプシドポリペプチドをさらに含み、当該キャプシドポリペプチドが、第１のＡｄ株のキャプシドポリペプチドとは異なる、上記１～３のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
５．１つまたは複数の標的化ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、酵素、受容体またはリガンドをさらに含む、上記１～４のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
６．前記標的化ポリペプチドが、配列番号１～４１および配列番号４６～４７から選択されるアミノ酸配列を含む、上記５に記載の組換えＡｄ。
７．アミノ酸置換および／またはアミノ酸修飾をさらに含み、前記のアミノ酸置換がシステインへの置換であり、前記のアミノ酸修飾がＰＥＧ化およびＢＡＰ化から選択される、上記１～６のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
８．制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）である、上記１～７のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
９．配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列を含む、上記８に記載の組換えＡｄ。
１０．（ａ）第１のＡｄ株からのヘキソンポリペプチドをコードするＡｄゲノムおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＡｄゲノムによってコードされるＨＶＲとは異なる、前記組換えアデノウイルス（Ａｄ）。
１１．前記の第１のＡｄ株および前記の１種または複数の異なるＡｄ株が血清型的に異なる、上記１０に記載の組換えＡｄ。
１２．前記の第１のＡｄ株がヒトＡｄ６株であり、１つの第２のＡｄ株がヒトＡｄ５７株である、上記１０～１１のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１３．１種または複数の異なるＡｄ株からのキャプシドポリペプチドをさらに含み、当該キャプシドポリペプチドが、第１のＡｄ株のキャプシドポリペプチドとは異なる、上記１０～１２のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１４．標的化ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、酵素、受容体またはリガンドをコードする１種または複数の核酸をさらに含む、上記１０～１３のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１５．前記核酸が、配列番号１～４１および配列番号４６～４７から選択されるアミノ酸配列を有する標的化ポリペプチドをコードする、上記１４に記載の組換えＡｄ。
１６．アミノ酸置換および／またはアミノ酸修飾をさらに含み、前記のアミノ酸置換がシステインへの置換であり、前記のアミノ酸修飾がＰＥＧ化およびＢＡＰ化から選択される、上記１０～１５のいずれか１つに記載の組換えＡｄ。
１７．さらに別の修飾を含む上記１０～１６のいずれか１つに記載の組換えＡｄであって、制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）である、前記組換えＡｄ。
１８．配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、上記１７に記載の組換えＡｄ。
１９．癌を有する哺乳動物を治療するための方法であって、前記哺乳動物に、上記１～１８のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルス（Ａｄ）を投与することを含む、前記方法。
２０．前記癌が、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、メラノーマ、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫、リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される、上記１９に記載の方法。
２１．前記投与が全身投与を含む、上記１９～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．全身投与が筋肉内、鼻内または静脈内投与を含む、上記２１に記載の方法。
２３．前記投与が局所投与を含む、上記１９～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記局所投与が腫瘍内注射を含む、上記２４に記載の方法。
２５．癌の治療のための、上記１～１８のいずれか１つに記載の組換えＡｄの使用。
２６．（ａ）第１のＡｄ株からのＡｄキャプシドポリペプチドおよび（ｂ）１種または複数の異なるＡｄ株からの少なくとも１つのヘキソンポリペプチドを含む組換えアデノウイルス（Ａｄ）であって、前記ヘキソンポリペプチドの少なくとも１つの超可変領域（ＨＶＲ）が第１のＡｄ株のＨＶＲとは異なる前記組換えアデノウイルス（Ａｄ）の、癌の治療のための医薬としての使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33-1】
【図33-2】
【図33-3】
【図34-1】
【図34-2】
【図34-3】
【図34-4】
【図34-5】
【図34-6】
【図34-7】
【図34-8】
【図34-9】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
【図71】
【配列表】