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特許7320741Ｂ－ＲＡＦキナーゼのマレイン酸塩、結晶形、調整方法、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-27
(45)【発行日】2023-08-04
(54)【発明の名称】Ｂ－ＲＡＦキナーゼのマレイン酸塩、結晶形、調整方法、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20230728BHJP
A61K 31/4375 20060101ALI20230728BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230728BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230728BHJP
A61P 5/00 20060101ALI20230728BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230728BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20230728BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230728BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230728BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230728BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20230728BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230728BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230728BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 114A
C07D471/04 CSP
A61K31/4375
A61P1/04
A61P1/16
A61P5/00
A61P11/00
A61P13/10
A61P13/12
A61P15/00
A61P17/00
A61P19/00
A61P25/00
A61P35/00
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2017553956
(86)(22)【出願日】2016-04-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-04-26
(86)【国際出願番号】 CN2016079251
(87)【国際公開番号】W WO2016165626
(87)【国際公開日】2016-10-20
【審査請求日】2019-04-08
【審判番号】
【審判請求日】2021-01-22
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2015/076639
(32)【優先日】2015-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】514164650
【氏名又は名称】ベイジーン リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100144048
【弁理士】
【氏名又は名称】坂本 智弘
(72)【発明者】
【氏名】チャン、グオリャン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ、チャンヨウ
【合議体】
【審判長】瀬良 聡機
【審判官】齋藤 恵
【審判官】関 美祝
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５０６３５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２１－０７３２４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｃ．Ｇ．ＷＥＲＭＵＴＨ編，「最新 創薬化学 下巻」，株式会社 テクノミック，１９９９年，ｐｐ．３４７－３６５
【文献】真野高司，創薬の探索段階における薬剤学的研究の意義と実践，日本薬理学雑誌，２００９年 ３月 １日，第１３３巻，第３号，第１４９－１５３頁
【文献】平山令明，有機化合物結晶作製ハンドブック －原理とノウハウ－，２００８年 ７月２５日，ｐ．１７－２３，３７－４０，４５－５１，５７－６５
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C07D,A61K
ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩ）の構造を有する、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩の結晶であって、６．３±０．２°、８．９±０．２°、９．４±０．２°、１１．２±０．２°、１２．６±０．２°、１３．４±０．２°、１７．９±０．２°、１８．６±０．２°、１８．８±０．２°、１９．３±０．２°、２０．１±０．２°、２０．７±０．２°、２１．２±０．２°、２１．８±０．２°、２２．４±０．２°、２２．６±０．２°、２３．３±０．２°、２３．８±０．２°、２４．７±０．２°、２５．６±０．２°、２６．１±０．２°、２７．４±０．２°、２８．３±０．２°、２８．６±０．２°、２９．０±０．２°、２９．４±０．２°及び３０．４±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する、７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる、結晶形Ａ＊である結晶。
【化1】
【請求項2】
請求項１に記載の結晶の治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、脳腫瘍、肺癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、又は甲状腺腫瘍及びそれらの合併症からなる群から選択される癌を治療又は予防するための使用のための医薬組成物。
【請求項3】
前記癌が、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ及びＫＲＡＳ突然変異の脳腫瘍、肺癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、リンパ腫、又は甲状腺腫瘍及びそれらの合併症からなる群から選択される、請求項２に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｂ－ＲＡＦキナーゼ、すなわち、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オン（以下、化合物１と呼ぶ）のマレイン酸塩、特に化合物１のセスキマレイン酸、及びセスキマレイン酸の結晶形（多形体）、及び調整方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ－ＲＡＦは細胞の増殖及び生存の鍵となるＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路の一部であるキナーゼである。Ｂ－ＲＡＦの突然変異はメラノーマ（４３％）（Ｈ．Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７（２００２）、９４９－５４；Ｄ．Ｒ．Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ、１７（２００８）、１７７４－８０；Ｇ．Ｖ．Ｌｏｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．、１３（２０１２）、１０８７－９５を参照）、甲状腺癌（２７％）（Ｙ．Ｃｏｈｅｎ、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、９５（２００３）、６２５－７；Ｅ．Ｔ．Ｋｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６３（２００３）、１４５４－７を参照）、結腸直腸癌（１４％）（Ｈ．Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７（２００２）、９４９－５４；Ｄ．Ｒ．Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ、１７（２００８）、１７７４－８０；Ｓ．Ｏｇｉｎｏら、Ｇｕｔ、５８（２００９）、９０－６；Ｃ．Ｐ．Ｖａｕｇｈｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ、５０（２０１１）、３０７－１２を参照）、卵巣癌（１５％）（Ｈ．ＤＡｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４１７（２００２）、９４９－５４；Ｓ．Ｅ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２０３（２００４）、６１７－９を参照）、及び肺癌（２％）（Ｍ．Ｓ．Ｂｏｒｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６２（２００２）、６９９７－７０００を参照）を含むヒトの癌の７％以上で発見されている。メラノーマで発見されたＢ－ＲＡＦの突然変異の９０％以上が構成的な活性化をもたらす、Ｂ－ＲＡＦタンパク質鎖の６００番目のアミノ酸であるバリンのグルタミン酸への置換（Ｖ６００Ｅ）である。
【0003】
ベムラフェニブ及びダブラフェニブのようなＢ－ＲＡＦ阻害剤のメラノーマ患者への臨床経験は効能を証明し、Ｂ－ＲＡＦ及びＭＡＰＫシグナル伝達に依存して腫瘍を標的とするという概念を確認した。腫瘍にＢ－ＲＡＦのＶ６００Ｅ突然変異を抱えるメラノーマ患者への選択的阻害は優れた客観的応答率及び無憎悪生存期間の延長をもたらした。しかし、ベムラフェニブ及びダブラフェニブを含むＢ－ＲＡＦ阻害剤の第１世代は、例えば、１）変異又は活性ＲＡＳに関連するＢ－ＲＡＦ／Ｃ－ＲＡＦヘテロダイマーの誘導を通じたＭＡＰＫシグナル伝達の逆説的な増加によるケラトアカントーマ又は有棘細胞癌の成長；及び２）Ｂ－ＲＡＦのＶ６００Ｅ突然変異を有するメラノーマの外部（例えば、結腸直腸）での臨床活性の制限といった、いくつかの制限を有する。したがって、これらの領域を改善した第２世代阻害剤が非常に望ましい。
【0004】
５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オン（遊離塩基、化合物１）はセリン／スレオニンキナーゼのＲＡＦファミリーに対する強力な阻害活性を実証する第２世代Ｂ－ＲＡＦ阻害剤として開示されている。ＷＯ２０１３／０９７２２４Ａ１を参照。
【化1】
【0005】
化合物１はＢ－ＲＡＦ突然変異及びＫ－ＲＡＳ／Ｎ－ＲＡＳ突然変異を含む、ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫ分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路に異常がある癌の治療のための、単独療法又は他の癌治療法との併用としての分子標的治療薬である。しかし、化合物１の遊離塩基の比較的乏しい経口吸収は化合物１を医薬品開発において不適当なものにする。
【0006】
化合物１の遊離塩基は、元々は図１のＸＲＰＤの結果に基づいて非晶質固体として得られ、かつ、化合物１の遊離塩基は０．００１ｍｇ／ｍＬの定量下限値未満で水に実質的に不溶であり、かつ、０～８０％の相対湿度で２．２％水分貯留し、わずかに吸湿性であることもまた明らかになっている。
【0007】
加えて、化合物１の合成は非効率的であった。例えば、光学的に純粋な異性体を調製するためのキラルＨＰＬＣカラムの要件及び、過程における不純物除去を阻害するという非晶質形態の化合物１の遊離塩基の傾向といった様々な要素が化合物１の大規模な調製及び精製を困難にさせる。
【0008】
事実上、どの特定の化合物の塩が医薬品加工において安定かつ適切であるかを、自信を持って予測することは困難である。特定の化合物が様々な結晶固体状態をとるかどうか、及び、それらの結晶固体状態の物理的特性を予測することはさらに困難である。
【0009】
したがって、はるかに良い生物学的利用能を有し、かつ、この薬品の処方及び貯蔵の間化学的及び物理的安定性を有する化合物１のいくつかの形態を大いに必要としており、かつ、良い品質及び再生産性を有する化合物１の大規模な調製に適した工程を大いに必要としている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本願は前述の困難及び必要性を化合物１の安定した塩及びその結晶形を提供することで処理するための発明を開示する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
第１の観点において、本願は５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オン（“化合物１”）の塩であって、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、Ｌ－酒石酸塩、マレイン酸塩及びシュウ酸塩から選択される、化合物１の塩を提供する。１つの実施態様では、塩は薬学的に許容される。別の実施態様では、塩は固体である。１つの好ましい実施態様では、塩は結晶形である。本願の塩は固体であり、かつ、潜在的な塩候補であることを意味する、化合物１の遊離塩基とは異なる結晶形を示す。本願の結晶形の塩は医薬製剤に適した優れた物理的特性を有し、かつ、高品質及び優良な再生産性のもと大きな商業的規模で製造され得る。
【発明の効果】
【0012】
本発明の発明者は化合物１の塩酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、Ｌ－酒石酸塩、マレイン酸塩及びシュウ酸塩の中で、化合物１のマレイン酸塩、特に、セスキマレイン酸塩が結晶形となることを偶然発見した。特に、化合物１のマレイン酸塩は、本願では結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ，Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭとよぶ、複数の結晶形（多形体）で存在し得ることが思いがけず発見された。化合物１のマレイン酸塩及びその結晶形、具体的には結晶形Ａ＊及びＡは、他の塩と比較して、製剤及び臨床用途において適した候補となる、改善された溶解性及び安全性、特に、長期的な化学的／物理的安定性のような優れた特性を有する。より具体的には、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ａ＊、Ａ及び他の形の、改善された溶解性及び／又は長期的な化学的／物理的安定性は、生体内（インビボ）及び試験管内（インビトロ）で速く溶解し、及びそれによって遊離塩基と比較して生物学的利用能が増加した、これらの形を提供する。
【0013】
第２の観点において、本願は式（Ｉ）の化合物である、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩
（式中、ｎは約０．３～約１．５である）
を提供する。
【化2】
を提供する。
【0014】
１つの実施態様では、式（Ｉ）の化合物において、ｎは０．５±０．０５、１．０±０．１、及び１．５±０．２からなる群から選択される。
【0015】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物において、ｎは０．５、１．０又は１．５である。
【0016】
別の好ましい実施態様では、式（Ｉ）の化合物は結晶形である。
【0017】
別の好ましい実施態様では、ｎは１．５であり、かつ、化合物は式（ＩＩ）の５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンの結晶セスキマレイン酸塩である。
【化3】
【0018】
１つの実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は、６．３±０．２°、８．９±０．２°、９．４±０．２°、１１．２±０．２°、１２．６±０．２°、１３．４±０．２°、１７．９±０．２°、１８．６±０．２°、１８．８±０．２°、１９．３±０．２°、２０．１±０．２°、２０．７±０．２°、２１．２±０．２°、２１．８±０．２°、２２．４±０．２°、２２．６±０．２°、２３．３±０．２°、２３．８±０．２°、２４．７±０．２°、２５．６±０．２°、２６．１±０．２°、２７．４±０．２°、２８．３±０．２°、２８．６±０．２°、２９．０±０．２°、２９．４±０．２°及び３０．４±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ａ＊である。
【0019】
別の実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は結晶形Ａ＊＊の単結晶である。
【0020】
別の実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は、８．３±０．２°、１１．２±０．２°、１７．９±０．２°、１８．４±０．２°、１８．６±０．２°、１９．３±０．２°、２０．８±０．２°及び２２．５±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する３つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ａである。
【0021】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、１１．１±０．２°、１５．８±０．２°、１７．７±０．２°、１８．４±０．２°、１９．６±０．２°、２２．３±０．２°、２３．１±０．２°及び２８．８±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する３つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｂである。
【0022】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、３．１±０．２°、８．８±０．２°、１１．２±０．２°、１７．８±０．２°、１８．５±０．２°、１９．３±０．２°、２０．１±０．２°、２０．７±０．２°、２１．９±０．２°及び２２．４±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する３つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｃである。
【0023】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、８．９±０．２°、１４．９±０．２°、１６．７±０．２°、１７．８±０．２°、１９．９±０．２°、２０．４±０．２°、２０．９±０．２°及び２６．９±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する３つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｄである。
【0024】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、１２．９±０．２°、１７．０±０．２°、１８．５±０．２°、１９．４±０．２°、２０．５±０．２°、２２．５±０．２°及び２４．１±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する３つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｆである。
【0025】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、３．４±０．２°、５．６±０．２°、７．０±０．２°、１０．３±０．２°、１０．９±０．２°、１１．７±０．２°、１２．４±０．２°、１３．１±０．２°、１４．０±０．２°、１４．９±０．２°、１６．４±０．２°、１７．４±０．２°、１８．６±０．２°、１９．３±０．２°、２０．１±０．２°、２１．０±０．２°、２１．９±０．２°、２３．６±０．２°、２４．２±０．２°、２５．６±０．２°及び２６．４±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｇである。
【0026】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、６．３±０．２°、９．０±０．２°、１０．１±０．２°、１１．２±０．２°、１２．７±０．２°、１４．５±０．２°、１６．１±０．２°、１６．６±０．２°、１７．９±０．２°、１８．１±０．２°、１８．５±０．２°、１９．０±０．２°、２０．１±０．２°、２１．９±０．２°、２２．４±０．２°、２３．９±０．２°、２５．１±０．２°、２６．２±０．２°及び２８．７±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｈである。
【0027】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、３．１±０．２°、５．５±０．２°、６．８±０．２°、１０．８±０．２°、１１．５±０．２°、１３．７±０．２°、１６．１±０．２°、１６．３±０．２°、１７．８±０．２°、１９．８±０．２°、２１．５±０．２°、２３．８±０．２°、２４．４±０．２°及び２８．３±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する５つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｉである。
【0028】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、５．５±０．２°、８．２±０．２°、１０．９±０．２°、１１．３±０．２°、１３．６±０．２°、１４．８±０．２°、１５．８±０．２°、１７．４±０．２°、１８．０±０．２°、１９．１±０．２°、１９．８±０．２°、２０．０±０．２°、２０．４±０．２°、２１．１±０．２°、２１．９±０．２°、２２．６±０．２°、２３．４±０．２°、２４．１±０．２°、２５．０±０．２°、２６．１±０．２°、２６．９±０．２°、２７．３±０．２°、２８．４±０．２°、２９．１±０．２°、３３．１±０．２°及び３５．９±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｊである。
【0029】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、３．１±０．２°、８．９±０．２°、９．３±０．２°、１１．２±０．２°、１６．７±０．２°、１７．９±０．２°、１８．６±０．２°、１８．８±０．２°、１９．４±０．２°、２０．２±０．２°、２１．９±０．２°、２２．４±０．２°、２３．４±０．２°、２３．９±０．２°、２４．６±０．２°、２６．２±０．２°、２７．４±０．２°、２８．５±０．２°、２９．４±０．２°及び３０．４±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｋである。
【0030】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、９．７±０．２°及び１４．１±０．２°の２θ角度値を有する回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｌである。
【0031】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、５．０±０．２°、９．３±０．２°、１１．３±０．２°、１４．９±０．２°、１５．９±０．２°、１７．４±０．２°、１８．０±０．２°、１８．７±０．２°、１９．４±０．２°、２０．２±０．２°、２２．１±０．２°、２３．４±０．２°、２４．３±０．２°、２５．４±０．２°、２６．５±０．２°、２７．５±０．２°、２８．５±０．２°及び２９．３±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形Ｍである。
【0032】
いくつかの実施態様では、式（Ｉ）の化合物において、ｎは１であり、すなわち、化合物１のマレイン酸塩（１：１）である。他の実施態様では、本願は３．３０±０．２°、６．６１±０．２°、９．８８±０．２°、１１．７３±０．２°、１３．１４±０．２°、１５．２３±０．２°、１６．５６±０．２°、１７．９４±０．２°、１８．７２±０．２°、１９．３４±０．２°、１９．９３±０．２°、２０．７６±０．２°、２２．０４±０．２°、２２．９５±０．２°、２３．８６±０．２°、２５．１９±０．２°、２６．６１±０．２°、２８．３６±０．２°、３０．１３±０．２°、３１．３６±０．２°、３３．４９±０．２°及び３７．２２±０．２°からなる群から独立して選択される２θ角度値を有する７つ又はそれ以上の回折ピークを持つ粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｎを提供する。
【0033】
別の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は図２、図１６、図１７、図１８、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、図２８及び図３３からなる群から選択される粉末Ｘ線回折パターンによって実質的に特徴付けられる結晶形である。
【0034】
いくつかの実施態様では、化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｎは、図３３に示す粉末Ｘ線回折パターンによって実質的に特徴付けられる化学的に安定な結晶形である。
【0035】
別の観点では、本願は式（ＩＩ）の５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩の結晶形の調製方法であり、以下の工程のいずれかを含む、調製方法を提供する：
（ａ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンの遊離塩基又はマレイン酸塩以外の塩を溶媒又は溶媒混合物に溶解して、溶液又は懸濁液を生成し；結果として生ずる溶液又は懸濁液をマレイン酸と混合して混合物を生成し；かつ、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩を目的の結晶形として沈殿させる工程；
（ｂ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩を溶媒又は混合溶媒に溶解又は懸濁させ；かつ、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩を目的の結晶形として沈殿させる工程；
（ｃ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩を目的の結晶形を得るために長期間保存する工程；
（ｄ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩の結晶又は非晶質を加熱して昇温し、その後塩を冷却して目的の結晶形を得る工程；及び
（ｅ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩の結晶又は非晶質を溶媒の蒸気に晒して目的の結晶形を得る工程。
（ａ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンの遊離塩基又はマレイン酸塩以外の塩を溶媒又は溶媒混合物に溶解して、溶液又は懸濁液を生成し；結果として生ずる溶液又は懸濁液をマレイン酸と混合して混合物を生成し；かつ、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩を目的の結晶形として沈殿させる工程；
（ｂ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩を溶媒又は混合溶媒に溶解又は懸濁させ；かつ、５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩を目的の結晶形として沈殿させる工程；
（ｃ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩を目的の結晶形を得るために長期間保存する工程；
（ｄ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのセスキマレイン酸塩の結晶又は非晶質を加熱して昇温し、その後塩を冷却して目的の結晶形を得る工程；及び
（ｅ）５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩の結晶又は非晶質を溶媒の蒸気に晒して目的の結晶形を得る工程。
【0036】
本観点の1つの実施態様では、工程（ａ）又は（ｂ）は、加熱、不溶な不純物を除去するための濾過、溶媒の蒸留、カウンターの溶媒又は溶媒混合物の添加、種結晶の添加、沈殿誘発剤の添加、冷却、沈殿及び結晶生成物を採取するためのろ過から独立して選択される１つ又はそれ以上の工程をさらに含む。
【0037】
本観点の別の実施態様では、工程（ａ）又は（ｂ）は、溶媒又は溶媒混合物が水、低級アルキルアルコール、ケトン、エーテル、エステル、低級脂肪族カルボン酸、低級脂肪族ニトリル、任意にハロゲン化された芳香族溶媒及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0038】
本観点の別の実施態様では、工程（ａ）又は（ｂ）は、溶媒がイソプロパノール、エタノール、メタノール、アセトン、ＴＨＦ、１，４－ジオキサン、酢酸、アセトニトリル、水又はそれらの組み合わせである。
【0039】
本観点の別の実施態様では、工程（ａ）において、遊離塩基は単離され精製された遊離塩基、単離されたが精製されていない遊離塩基又は遊離塩基を含む粗反応生成物である。
【0040】
本観点の別の実施態様では、工程（ｃ）において、長期間とは少なくとも３日、少なくとも１週間又は少なくとも２週間である。
【0041】
本観点の別の実施態様では、工程（ｄ）において、昇温は少なくとも４０℃、少なくとも６０℃、少なくとも８０℃又は少なくとも１００℃であるが、セスキマレイン酸塩の分解温度よりも低い。
【0042】
本観点の別の実施態様では、工程（ｅ）において、蒸気は酢酸の蒸気である。
【0043】
本観点の別の実施態様では、方法は：
１）結晶形Ａ＊を生成するための溶媒としてイソプロパノール－水（ｖ／ｖ＞６０／４０）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
２）結晶形Ａ＊＊を生成するための溶媒としてアセトンを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
３）結晶形Ａを生成するための溶媒としてＩＰＡ－水混合物（ｖ：ｖ＝４：１）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
４）結晶形Ｂを生成するための溶媒として１，４－ジオキサンを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
５）結晶形Ｃを生成するための溶媒としてエタノールを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
６）結晶形Ｄを生成するための溶媒としてメタノールを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
７）結晶形Ｆを生成するための溶媒としてアセトニトリル－水混合物（ｖ：ｖ＝１：１）用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
８）結晶形Ｇを生成するための溶媒として酢酸－水混合物を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
９）結晶形Ｈを生成するための溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
１０）結晶形Ｉを生成するための溶媒としてＩＰＡ－水混合物（ｖ：ｖ＝３：１）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
１１）結晶形Ｋを生成するために結晶形Ｄを室温で２週間保存する工程（ｃ）；
１２）結晶形Ｍを生成するために結晶形Ｊを室温で２週間保存する工程（ｃ）；
１３）結晶形Ｌを生成するために結晶形Ｇを１４０℃に加熱し、その後室温まで冷却する工程（ｄ）；及び
１４）結晶形Ｊを生成するために結晶形Ａを酢酸蒸気と接触させる工程（ｅ）；
から選択される。
１）結晶形Ａ＊を生成するための溶媒としてイソプロパノール－水（ｖ／ｖ＞６０／４０）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
２）結晶形Ａ＊＊を生成するための溶媒としてアセトンを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
３）結晶形Ａを生成するための溶媒としてＩＰＡ－水混合物（ｖ：ｖ＝４：１）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
４）結晶形Ｂを生成するための溶媒として１，４－ジオキサンを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
５）結晶形Ｃを生成するための溶媒としてエタノールを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
６）結晶形Ｄを生成するための溶媒としてメタノールを用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
７）結晶形Ｆを生成するための溶媒としてアセトニトリル－水混合物（ｖ：ｖ＝１：１）用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
８）結晶形Ｇを生成するための溶媒として酢酸－水混合物を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
９）結晶形Ｈを生成するための溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
１０）結晶形Ｉを生成するための溶媒としてＩＰＡ－水混合物（ｖ：ｖ＝３：１）を用いる工程（ａ）又は（ｂ）；
１１）結晶形Ｋを生成するために結晶形Ｄを室温で２週間保存する工程（ｃ）；
１２）結晶形Ｍを生成するために結晶形Ｊを室温で２週間保存する工程（ｃ）；
１３）結晶形Ｌを生成するために結晶形Ｇを１４０℃に加熱し、その後室温まで冷却する工程（ｄ）；及び
１４）結晶形Ｊを生成するために結晶形Ａを酢酸蒸気と接触させる工程（ｅ）；
から選択される。
【0044】
いくつかの実施態様では、本願は、還流温度以下の温度で混合する工程、例えば、化合物１とマレイン酸を混合溶媒であるｉ－ＰｒＯＨ及び水の中で約５０℃で混合する工程、又は、還流温度以下で混合する工程、例えば、化合物１とマレイン酸の混合物、若しくは懸濁液、若しくは溶液を混合溶媒であるｉ－ＰｒＯＨ及び水の中で約５０℃で混合する工程、又は、還流温度以下で混合する工程、例えば、化合物１の混合物、若しくは懸濁液、若しくは溶液を、マレイン酸が含まれる、混合溶媒であるｉ－ＰｒＯＨ及び水の中で約５０℃で混合する工程、を含み、ｉ－ＰｒＯＨの量はｉ－ＰｒＯＨ及び水の全容積に対して４０体積％より大きく、好ましくは６０体積％より大きく、更に好ましくは９０体積％より大きい、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形の調製工程を提供する。いくつかの好ましい実施態様では、上記の混合溶媒はｉ－ＰｒＯＨに置き換えられる。他の実施態様では、工程は室温まで冷却した後に、いくらかの種結晶を結果として生ずる混合物に添加し、その後混合物を１２時間、２４時間、２、３、もしくは４日、又は１週間、２週間といった一定期間放置する工程をさらに含む。
【0045】
いくつかの実施態様では、本願は化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形とメタノールを混合する工程を含む化合物１のマレイン酸塩の調製工程を提供する。いくつかの実施態様では、上述の混合する工程は撹拌して行われる。いくつかの実施態様では、化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形は本願で開示されている結晶形Ｎである。いくつかの実施態様では、化合物１のマレイン酸塩の結晶形は、結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭからなる群から選択されるいずれかの結晶形である。いくつかの実施態様では、上述の混合する工程は約１日、又は２日、又は３日、又は４日、又は５日、又は６日、又は１週間、又は２週間である。化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）のマレイン酸塩（１：１）への当該変換は非常に単純な工程、例えば、例として結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、及びＡのいずれかである化合物１のセスキマレイン酸塩を室温又は昇温で、メタノール中で単に撹拌することによって、有効医薬品成分である化合物１を製造及び／又はさらに精製するための、費用対効果の高い工程を提供する。当該変換は、得られた結晶質（すなわち、化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形）の結晶粒径の減少を生じさせ、次に、薬品の溶解速度を速め、かつ、さらに、薬品の化学的純度を高める可能性があることも発見されている。この点について、当該変換は薬品の製造工程をさらに簡素化、例えば、微粉化及び圧縮の工程を使用せずにすむことを期待されている。
【0046】
別の観点では、本願は、本願に記載されるいずれかの実施形態による式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【0047】
１つの実施態様では、医薬生成物は経口摂取に適している。
【0048】
別の実施態様では、医薬生成物は錠剤又はカプセルの形態である。
【0049】
別の実施態様では、錠剤又はカプセルの単位投与量は５～８０ｍｇである。
【0050】
別の実施態様では、医薬組成物中の化合物の重量パーセンテージは１～９９％である。
【0051】
別の観点では、本願は、被検体に治療的に有効な量の、本願に記載されるいずれかの実施形態による式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、又は式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ヒトのような前記被検体の疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。
【0052】
１つの実施態様では、疾患又は障害は、脳腫瘍、肺癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、リンパ腫又は甲状腺腫瘍及びそれらの合併症からなる群から選択される癌である。
【0053】
別の実施態様では、疾患はＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ及びＫＲＡＳ突然変異の脳腫瘍、肺癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、リンパ腫又は甲状腺腫瘍及びそれらの合併症からなる群から選択される癌である。
【0054】
別の実施態様では、化合物の投与量は１～１００ｍｇ／日であり、かつ、投与頻度は１日あたり１～３回である。
【0055】
別の実施態様では、化合物の投与量は５～５０ｍｇ／日であり、かつ、投与頻度は１日あたり１～３回である。
【0056】
別の実施態様では、化合物の投与量は１０～４０ｍｇ／日であり、かつ、投与頻度は１日１回である。
【0057】
別の実施態様では、化合物は結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＮからなる群から選択される結晶形の５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩である。
【0058】
別の観点では、本願はＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ及びＫＲＡＳ活性に関連する疾患又は障害の治療のための、医薬品の製造において本願に記載されるいずれかの実施形態による式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物の使用を提供する。
【0059】
好ましい実施態様では、疾患は癌である。
【0060】
別の好ましい実施態様では、化合物は結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＮからなる群から選択される結晶形の５－（（（１Ｒ，１ａＳ，６ｂＲ）－１－（６－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－１ａ，６ｂ－ジヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［ｂ］ベンゾフラン－５－イル）オキシ）－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オンのマレイン酸塩である。本発明のこれら及び他の観点は、以下の図面、詳細な説明及び特許請求の範囲の観点からより高く評価されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】無定形の化合物１のＸ線回折パターンを示す。
【図2】（イソプロパノール／水からの結晶化により得られた）化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊のＸ線回折パターンを示す。
【図3】化合物１の塩酸塩（１：１）のＸ線回折パターンを示す。
【図4】化合物１のメタンスルホン酸塩（１：１）のＸ線回折パターンを示す。
【図5】化合物１の２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（１：１）のＸ線回折パターンを示す。
【図6】化合物１のＬ－酒石酸塩（１：１）のＸ線回折パターンを示す。
【図7】化合物１のシュウ酸塩（１：１）のＸ線回折パターンを示す。
【図8】リン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、トルエンスルホン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、エタンジスルホン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、スルホン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、ＡＰＩ懸濁液のコントロール及びＡＰＩのＸ線回折パターンを重ね合わせたものを示す。
【図9】Ｌ－乳酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、Ｌ－マレイン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、マロン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、ニコチンアミドを含む化合物１（１：１）より得られた固体、サッカリンを含む化合物１（１：１）より得られた固体、コハク酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、ＡＰＩ懸濁液のコントロール及びＡＰＩのＸ線回折パターンを重ね合わせたものを示す。
【図10】安息香酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、クエン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、フマル酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、ゲンチジン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、グリコール酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、ＡＰＩ懸濁液のコントロール及びＡＰＩのＸ線回折パターンを重ね合わせたものを示す。
【図11】ニコチン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、ニコチン酸の懸濁液のコントロール、ＡＰＩ懸濁液のコントロール及びＡＰＩのＸ線回折パターンを重ね合わせたものを示す。
【図12】アジピン酸を含む化合物１（１：１）より得られた固体、アジピン酸の懸濁液のコントロール、ＡＰＩ懸濁液のコントロール及びＡＰＩのＸ線回折パターンを重ね合わせたものを示す。
【図13】（アセトンからの再結晶により得られた）化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊＊の絶対構造を示す。
【図14】化合物１のセスキマレイン酸塩の単結晶形Ａ＊＊の水素結合を図解する。
【図15】化合物１のセスキマレイン酸塩の単結晶形Ａ＊＊の結晶充填を示す。
【図16】ＭＥＲＣＵＲＹソフトウェアを用いて計算した化合物１のセスキマレイン酸塩の単結晶形Ａ＊の理論上のＸＲＰＤパターンを示す。
【図17】（イソプロパノール／水からの再結晶により得られた）化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形ＡのＸ線回折パターンを示す。
【図18】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＢのＸ線回折パターンを示す。
【図19】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＣのＸ線回折パターンを示す。
【図20】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＤのＸ線回折パターンを示す。
【図21】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＦのＸ線回折パターンを示す。
【図22】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＧのＸ線回折パターンを示す。
【図23】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＨのＸ線回折パターンを示す。
【図24】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＩのＸ線回折パターンを示す。
【図25】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＪのＸ線回折パターンを示す。
【図26】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＫのＸ線回折パターンを示す。
【図27】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＬのＸ線回折パターンを示す。
【図28】化合物１のマレイン酸塩の結晶形ＭのＸ線回折パターンを示す。
【図29】化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図30】化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図31】ＤＶＳによる化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の吸湿性を示す。
【図32】化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｎの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図33】化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形ＮのＸ線回折パターンを示す。
【図34】化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図35】化合物１のマレイン酸塩（１：１．２）の結晶形Ｂの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図36】化合物１のマレイン酸塩（１：１．３）の結晶形Ｃの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図37】化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｄの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図38】化合物１のマレイン酸塩（１：０．５）の結晶形Ｆの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図39】化合物１のマレイン酸塩（１：０．５）の結晶形Ｇの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図40】化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図41】化合物１のマレイン酸塩（１：０．５）の結晶形Ｉの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図42】化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｊの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図43】化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｋの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図44】化合物１のマレイン酸塩（１：０．３）の結晶形Ｌの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【図45】化合物１のマレイン酸塩（１：１．３）の結晶形Ｍの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0062】
本発明の塩を調製する過程で、製薬業界で一般的に使用される多くの塩形成剤が研究された。特に、本発明で検討される塩形成剤は、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グリコール酸、Ｌ－乳酸、フマル酸、Ｌ－酒石酸、クエン酸、Ｌ－マレイン酸、コハク酸、馬尿酸、マレイン酸、アジピン酸、安息香酸、ゲンチジン酸、マロン酸、エタンジスルホン酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、ニコチン酸、ニコチンアミド及びサッカリンからなる群から選択される２５の酸又は塩形成剤を含む。
【0063】
しかし、化合物１と６つの塩のみが反応により塩の形成を示した。特に、塩酸（図３）、メタンスルホン酸（図４）、２－ヒドロキシエタンスルホン酸（図５）、Ｌ－酒石酸（図６）、マレイン酸（図２、図１７等）及びシュウ酸（図７）を含む６つの酸との化合物１の塩の固体形は、遊離塩基、ＡＰＩコントロール及び固体酸コントロールとは異なる結晶形を示した。本出願の上記６種の結晶性塩とは対照的に、他の塩は結晶化することができなかった。
【0064】
一の観点では、本願で提供されるものは、本願に開示された方法によって大量に調製される、化合物１のセスキマレイン酸塩である。図２に示すように、化合物１のセスキマレイン酸塩は結晶形（本図では結晶形Ａ＊とよぶ）であり、そのＸ線粉末回折スペクトルは典型的には以下のピーク回折角を有する（「間隔」は図２では「ｄ値」として示される）。
【0065】
【表1】
【0066】
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊は、非常に安定した結晶形である。微粉化後、平均粒径（Ｄ９０）が約１～１０ミクロンの良好に分布した微粒子になるため、臨床用途のために容易に製剤化され得る。
【0067】
別の実施態様において、本願では化合物１のセスキマレイン酸塩の単結晶形Ａ＊＊が提供される。化合物１の結晶形Ａ＊＊の構造は、アセトン中でゆっくり冷却することによって成長させた単結晶から収集した一連の回折データを用いて決定した。 結晶データ及び構造精密化を表２に示す。
【0068】
【表2】
【0069】
図１３に示す化合物１のマレイン酸塩の単結晶構造は、遊離塩基分子のイミダゾール窒素原子がプロトン化されたセスキマレイン酸塩を確認する。Ｃ１（Ｓ）、Ｃ２（Ｒ）及びＣ３（Ｒ）の絶対配置は、０．１（５）の絶対構造パラメータによって示されるように高い確率で決定された。水素結合相互作用を図１４に示す。この構造は、ｂｃ面内の二次元構造を示す。化合物１及びマレイン酸アニオンの遊離塩基分子は、ｂ軸に沿って分子間相互作用（Ｎ３・・・Ｎ３ ２．７９７Å）及び水素結合（Ｎ２－Ｈ２・・・Ｏ４ ２．７６０Å）によって連結される。テープ構造は、ｃ軸に沿った分子間相互作用（Ｎ３・・・Ｏ７ ３．００８Å及びＮ４・・・Ｏ７ ２．７１５Å）及び水素結合（Ｎ１－Ｈ１・・・Ｏ８ ２．６５９Å）を介してマレイン酸アニオンによって連結され、二次元構造を形成する。 化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶充填を図１５に示す。化合物１の単結晶形Ａ＊＊のＭＥＲＣＵＲＹソフトウェアを用いて計算した理論上のＰＸＲＤパターンを図１６に示す。
【0070】
別の実施態様において、本願では化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａが提供される。 図１７に示すように、結晶形ＡのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図１７では「ｄ値」として示される）。
【0071】
【表3】
【0072】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｂが提供される。 図１８に示すように、結晶形ＢのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図１８では「ｄ値」として示される）。
【0073】
【表4】
【0074】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｃが提供される。 図１９に示すように、結晶形ＣのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図１９では「ｄ値」として示される）。
【0075】
【表5】
【0076】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｄが提供される。 図２０に示すように、結晶形ＤのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２０では「ｄ値」として示される）。
【0077】
【表6】
【0078】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｆが提供される。 図２１に示すように、結晶形ＦのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２１では「ｄ値」として示される）。
【0079】
【表7】
【0080】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｇが提供される。 図２２に示すように、結晶形ＧのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２２では「ｄ値」として示される）。
【0081】
【表8】
【0082】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｈが提供される。 図２３に示すように、結晶形ＨのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２３では「ｄ値」として示される）。
【0083】
【表9】
【0084】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｉが提供される。 図２４に示すように、結晶形ＩのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２４では「ｄ値」として示される）。
【0085】
【表10】
【0086】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｊが提供される。 図２５に示すように、結晶形ＪのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２５では「ｄ値」として示される）。
【0087】
【表11】
【0088】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｋが提供される。 図２６に示すように、結晶形ＫのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２６では「ｄ値」として示される）。
【0089】
【表12】
【0090】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｌが提供される。 図２７に示すように、結晶形ＬのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２７では「ｄ値」として示される）。
【0091】
【表13】
【0092】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｍが提供される。 図２８に示すように、結晶形ＭのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図２８では「ｄ値」として示される）。
【0093】
【表14】
【0094】
別の実施態様において、本願では化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｎが提供される。 図３３に示すように、結晶形ＮのＸ線粉末回折スペクトルは、典型的には、以下のピーク回折角を有する（「間隔」が図３３では「ｄ値」として示される）。
【0095】
【表15】
【0096】
上記の結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＮについては、主なピーク（すなわち、最も特徴的であり、重要であり、固有であり、かつ／又は再現可能であるピーク）のみが要約される；追加のピークは従来の方法で回折スペクトルから得ることができる可能性がある。上記の主なピークは誤差の範囲内（最後に与えられた小数点以下の桁＋若しくは－２、又は指定された値で＋若しくは－０．２）で再現され得る。
【0097】
別の観点では、本願では式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の化合物を調製する方法が提供される。
【0098】
１つの実施態様では、本願ではスキーム１に示される手順に従って調製又は精製された化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊が提供される。本願に開示される新規の合成方法及び結晶化／再結晶化の工程は、９９％以上の光学純度を有する重要なキラル中間体の調製など、以前に報告された工程に関連する多くの問題を克服し、かつ、従来の工程よりも多くの利点を提供する。 特に、本願に開示された方法は、高品質かつ良好な収率である、化合物１のセスキマレイン酸塩の再現性のある商業規模の製造に特に適している。
【化4】
【0099】
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形は、以下の一般的な方法によって調製され得る。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を溶媒で完全に溶解するまで加熱する。濾過、冷却、結晶化、濾過及び乾燥の後、対応する異なる結晶形が得られる。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａを調製するための結晶化工程の例は、実施例３（下記）に記載されている。上記の結晶化は、単一の溶媒、有機溶媒の混合物、又は水と有機溶媒との混合物中で実行され得る。 結晶化に適した有機溶媒は、低級アルキルアルコール、ケトン、エーテル、エステル、ハロゲン化炭化水素、アルカン、ハロゲン化ベンゼン、脂肪族ニトリル、及び他の芳香族溶媒から選択することができるが、これらに限定されない。 好ましい溶媒には、例えば、イソプロパノール、酢酸エチル、水、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、及びそれらの混合物が含まれる。
【0100】
化合物１の遊離塩基はもともと、わずかに吸湿性であり、０～８０％のＲＨから２．２％の水分増加を伴った無定形固体として得られた。 動的蒸気収着（ＤＶＳ）後には形態変化は観察されなかった。偏光顕微鏡から不規則な形状の複屈折現象が観察された。
【0101】
本願では、驚くべきことに、マレイン酸塩、特にセスキマレイン酸塩が薬物候補の所望の特性を有することが判明した、化合物１の塩酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、Ｌ－酒石酸塩、マレイン酸塩及びシュウ酸塩が開示されている。例えば、化合物１は結晶性酒石酸塩を形成しないと思われ、かつ、シュウ酸塩は結晶性が悪い。２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、メシラート、及びＨＣｌ塩は水への溶解性が比較的良好であったが、ＨＣｌ塩は化学的に不安定であり、６０℃及び４０℃／７５％ＲＨで１週間後に著しく劣化し、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩及びメシラート塩は両方吸湿性であり、０～８０％ＲＨから約４％の重量が増加する。２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩及びメシラート塩も、６０℃及び４０℃／７５％ＲＨで１週間後に分解を示し、したがって、所望の長期の化学的安定性を欠くと予想される。他方で、セスキマレイン酸塩（１：１．５遊離塩基／マレイン酸）は、本願に開示されたＸＲＰＤパターンによって示されるように良好な結晶化度を有し、水にわずかに可溶性であり、かつ、６０℃及び４０℃／７５％ＲＨで１週間後に分解を示さず、長期で安定する可能性を示している；したがって、セスキマレイン酸塩は、さらなる開発のために選択された。
【0102】
所望又は必要であれば、化合物１のセスキマレイン酸塩の純度は、セスキマレイン酸塩をメタノール－懸濁液工程によりマレイン酸塩（遊離塩基/酸の比率１：１）に変換することによりさらに改善することができる。１：１マレイン酸塩の結晶形の形成は、不純物の効率的な駆除を生じた。遊離塩基の非晶質形はまた、１：１マレイン酸塩を塩基で処理し、次いで溶媒で抽出することによって高純度で製造され得た。遊離塩基をマレイン酸で処理することにより、はるかに高純度のセスキマレエート結晶塩を調製した（スキーム２）。
【化5】
【0103】
本願における「低級アルキルアルコール」という用語は、直鎖又は分枝鎖であるＣ１～Ｃ８、好ましくはＣ１～Ｃ６、より好ましくはＣ１～Ｃ４のアルキルアルコールを含む。特定の例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、及びブタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
本願で使用される「約」という用語は、他に示されない限り、数（例えば、温度、ｐＨ、容積など）が±１０％以内、好ましくは±５％以内で変化し得ることを意味する。
【0105】
本発明の結晶形の結晶化は、少なくとも１つの溶媒を含む適切な溶媒系中で、溶媒系中で過飽和を達成するための溶媒の蒸留、冷却及び／又は（化合物１のセスキマレイン酸塩を可溶化しにくい溶媒であり、本願に記載のものを含むがこれらに限定されない）貧溶媒の添加によって同様に実行され得る。
【0106】
結晶化は、本発明中に記載されている種結晶の有無にかかわらず行われる可能性がある。
【0107】
本発明によって提供される個々の結晶形は、結晶化工程の特定の熱力学的特性及び平衡特性に依存する特定の条件下で発生する。したがって、当業者は、形成された結晶が結晶化工程の動力学的及び熱力学的な特性の結果であることを知るだろう。特定の条件（例えば、溶媒、温度、圧力及び化合物の濃度）の下では、特定の結晶形は、他の結晶形よりも安定である可能性がある（又は実際に他の結晶形よりも安定である）。しかし、特定の結晶の比較的低い熱力学的安定性は、有利な動力学的安定性を有する可能性がある。動力学以外の時間、不純物分布、攪拌及び種結晶の有無等の付加的な要因も、結晶形に影響を与える可能性がある。
【0108】
別の観点では、本願では化合物１のマレイン酸塩の、上記の結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＮのいずれかの結晶形、特に化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の有効量及び薬学的に許容される担体をそれぞれ含有する医薬組成物が提供される。活性化合物は、組成物の１～９９重量％、好ましくは１～７０重量％、又はより好ましくは１～５０重量％、又は最も好ましくは５～４０重量％である。
【0109】
医薬組成物は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、滅菌溶液、懸濁液又はエマルジョンのような形態の徐放性注射剤などの形態で経口により；ペースト、クリーム、又は軟膏のような形態で局所治療を介して；又は坐剤などの形態で直腸を介して投与され得る。医薬組成物は、正確な投与用途に適した単位投与量である可能性がある。加えて、医薬組成物は、他の活性成分を含む可能性がある。
【0110】
好適な医薬担体は、水、種々の有機溶媒及び種々の不活性希釈剤又は充填剤を含む。必要であれば、医薬組成物は、香料、接着剤及び賦形剤のような種々の添加物を含む可能性がある。経口投与のために、錠剤及びカプセル剤は、クエン酸、澱粉、アルギン酸及びいくつかのケイ酸塩などの種々の崩壊剤、並びにスクロース、ゼラチン及びアラビアゴムなどの種々の接着剤などの様々な賦形剤を含み得る。加えて、ステアリン酸マグネシウム及びタルク充填剤を含む潤滑剤が、錠剤の製造に一般的に使用される。同種の固体成分はまた、軟質及び硬質のゼラチンカプセルを製剤するためも使用され得る。水性懸濁液が経口投与のために必要とされる場合、活性化合物は、種々の甘味料又は着香剤、顔料又は染料の組み合わせと混合され得る。必要に応じて、種々の乳化剤を使用され得るものであり、また懸濁液が生成され得る；水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、又はそれらの組み合わせなどの希釈剤が利用され得る。
【0111】
上記の医薬組成物は、経口投与することが好ましい。
【0112】
上記の医薬組成物は、カプセル又は錠剤の形態であることが好ましい。
【0113】
別の観点では、本願で提供されるのは、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ、ＥＰＨＢ等のＢＲＡＦキナーゼ又は他のキナーゼの阻害に応答する癌の治療に有用な医薬の製造における、本発明の化合物（すなわち、化合物１のマレイン酸塩並びに上記の結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、I、J、K、L、M及びＮのいずれか）の使用に関する。
【0114】
１つの実施態様では、本願で提供されるのは、哺乳動物の膵炎、腎臓疾患、癌、血管新生、又は血管新生関連疾患の治療又は予防に有用な医薬の製造における、本発明の化合物（すなわち、化合物１のマレイン酸塩並びに上記の結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、I、J、K、L、M及びＮのいずれか）の使用に関する。
【0115】
化合物１のマレイン酸塩並びに上記の結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、I、J、K、L、M及びＮのいずれか、又は本願における化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｎは、腫瘍血管新生、リウマチ性関節炎などの慢性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬及び強皮症などの皮膚疾患、糖尿病誘発皮膚疾患、糖尿病性網膜症、早期網膜症、加齢に関連する変性染色、血管腫、神経膠腫、カポジ体内腫瘍、卵巣癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺、結腸及び皮膚腫瘍、並びにそれらの合併症からなる群から選択されるが、これらに限られない疾患を治療又は予防するために使用され得る。本願中に記載されている哺乳動物の中では、ヒトが好ましい。
【0116】
上記治療方法の標的疾患は、Ｂ－ＲＡＦ又はＮＲＡＳ又はＫ－ＲＡＳ突然変異の、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、胸部癌、頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、皮膚癌、副腎癌、子宮頸癌、リンパ腫又は甲状腺腫瘍、及びそれらの合併症などのＢ－ＲＡＦ、ＮＲＡＳ及びＫ－ＲＡＳ突然変異の腫瘍から選択されることが好ましい。
【0117】
上記の方法は、任意の化学療法（例えば、ＭＥＫ阻害剤）、生物学的療法、又は放射線治療と組み合わせて適用され得る。
【0118】
投与される場合の活性成分又は化合物の投与量は、治療される患者の個々の必要性、投与経路、疾患又は病気の重症度、投与計画、並びに指定された医師の評価及び判断によって決定されるであろう。しかし、活性化合物に基づき、有効投与量の好ましい範囲は、体重１キログラムあたり毎日約０．０１～１２０ｍｇであり得る；又は、より好ましくは１日当たり０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ある場合には、上記投与量範囲の下限を適用することがより適切であり、他の場合には、有害な副作用を引き起こさずにより高い投与量で使用される可能性がある。
【0119】
本願の別の観点は、臨床応用のために化合物１のセスキマレイン酸塩を提供することである。特に、本発明は、癌患者のための以下の治療の選択肢を有する化合物１のマレイン酸塩による臨床的処置に関する：化合物１のマレイン酸塩及び／又は結晶形Ａ＊、Ａ＊＊、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、G、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ及びＮの投与量は、１日に１～３回の投与頻度で１～１００ｍｇ／日であり；好ましい投与量は１日に１～３回の投与頻度で５～５０ｍｇ／日であり；より好ましい投与量は１日に１回の投与頻度で５～６０ｍｇ／日であり；さらにより好ましい投与量は１日に１回の投与頻度で１０～５０ｍｇ／日である。
【0120】
以下の合成方法、具体例及び有効性試験は、本発明の特定の観点をさらに説明する。それらは、決して本発明の範囲を限定又は制限してはならない。
【実施例】
【0121】
以下の例は例示的なものであり、使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を保証するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に断りのない限り、温度は摂氏である。試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、又はＴＣＩのような市販の供給元から購入し、かつ、特に断りのない限り、さらなる精製を行わずに使用した。
【0122】
特に断りのない限り、以下に述べる反応は、正圧の窒素又はアルゴン下、又は乾燥管を用いた無水溶媒中で実施した；反応フラスコに、シリンジを介して基質及び試薬を導入するためのゴム隔壁を取り付けた；かつ、ガラス器具をオーブン乾燥及び／又は加熱乾燥した。
【0123】
特に断りのない限り、カラムクロマトグラフィー精製は、シリカゲルカラムを備えるＢｉｏｔａｇｅシステム（製造元：Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又はシリカＳｅｐＴａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）で行ったか、又は予め充填したシリカゲルカートリッジを用いてＴｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ精製システムで行った。
【0124】
１Ｈ ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ ＮＭＲを、溶媒としてＤＭＳＯ－ｄ６を用いて、４００ＭＨｚで動作するＶａｒｉａｎ装置で記録した。
【0125】
無色の板状結晶からのＸ線強度データを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＰＥＸ－ＩＩ ＣＣＤ回折計（ＣｕＫα線、λ＝１．５４１７８Å）を用いて１７３（２）Ｋで測定した。偏光顕微鏡の写真を室温で捕捉した。
【0126】
以下の実施例において、以下の略語を使用することができる：
ＡｒＯＨ 酢酸
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡＰＩ 以下に化合物１と称することがある活性医薬成分
Ａｑ 水性
Ｂｒｉｎｅ 飽和塩化ナトリウム水溶液
Ｂｎ ベンジル
ＢｎＢｒ 臭化ベンジル
ＣＨ２Ｃｌ２ ジクロロメタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｄｐｐｆ １，１”－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン
ＤＢＵ １，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＩＥＡ又はＤＩＥＰＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
Ｅｔ２Ｏ又はエーテル ジエチルエーテル
ｇ グラム
ｈ又はｈｒ 時間
ＨＡＴＵ Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）―Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＣｌ 塩酸
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ ２－プロパノール
ｉ－ＰｒＯＨ イソプロピルアルコール
Ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ｍｍｏｌ ミリモル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ｍｉｎ 分
ｍｓ又はＭＳ 質量スペクトル
Ｎａ２ＳＯ４ 硫酸ナトリウム
ＰＥ 石油エーテル
ＰＰＡ ポリリン酸
Ｒｔ 保持時間
Ｒｔ又はｒｔ 室温
ＴＢＡＦ フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＳＣｌ 塩化ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＣｌ 塩化トリメチルシリル
μＬ マイクロリットル
ＡｒＯＨ 酢酸
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡＰＩ 以下に化合物１と称することがある活性医薬成分
Ａｑ 水性
Ｂｒｉｎｅ 飽和塩化ナトリウム水溶液
Ｂｎ ベンジル
ＢｎＢｒ 臭化ベンジル
ＣＨ２Ｃｌ２ ジクロロメタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｄｐｐｆ １，１”－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン
ＤＢＵ １，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＩＥＡ又はＤＩＥＰＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
Ｅｔ２Ｏ又はエーテル ジエチルエーテル
ｇ グラム
ｈ又はｈｒ 時間
ＨＡＴＵ Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）―Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＣｌ 塩酸
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ ２－プロパノール
ｉ－ＰｒＯＨ イソプロピルアルコール
Ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ｍｍｏｌ ミリモル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ｍｉｎ 分
ｍｓ又はＭＳ 質量スペクトル
Ｎａ２ＳＯ４ 硫酸ナトリウム
ＰＥ 石油エーテル
ＰＰＡ ポリリン酸
Ｒｔ 保持時間
Ｒｔ又はｒｔ 室温
ＴＢＡＦ フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＳＣｌ 塩化ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＣｌ 塩化トリメチルシリル
μＬ マイクロリットル
【0127】
実施例１：様々な塩形成剤による化合物１の塩の形成
実施例１Ａ：化合物１の遊離塩基及び化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶Ａ＊の調製
工程１：中間体１の合成
窒素保護下で３５℃以下の温度で、ＤＭＦ（９８９ｋｇ）中のＥｔＯＮａ（１５４ｋｇ）の攪拌溶液にＥｔＳＨ（６８．６ｋｇ）を添加した。混合物を内温３５℃以下で６０～９０分間撹拌した。ＤＭＦ（５５．０ｋｇ）中の５－メトキシベンゾフラン（５８．７５ｋｇ）を添加した。混合物を１１０～１３０℃に加熱し、４５時間撹拌し、次いで９０℃未満の真空下で濃縮した。混合物を１０～２０℃に冷却した後、２Ｎ ＨＣｌ（１３２６ｋｇ）を滴下し、ＥｔＯＡｃ（５３１ｋｇ）及びＨ２Ｏ２（１２９ｋｇ）を内温３５℃以下で添加した。混合物を３０～６０分間攪拌した。有機層を分離した後、水相をＥｔＯＡｃで抽出した。一体化した有機相を飽和食塩水で２回洗浄し、次いで溶媒を蒸発乾固させた。ＭｅＯＨ及び水（１８５ｋｇ）中のＮａＯＨ（４４．５ｋｇ）の溶液を４０℃未満の残留物に滴下した。混合物を３０～４０℃で５～７時間攪拌した。水（７７ｋｇ）で濡らした活性炭（７４ｋｇ）を添加した。混合物を３０～４０℃で４～６時間撹拌し、濾過した後、濾過ケーキをＭｅＯＨ及び水で洗浄した。ＤＣＭを濾液に充填し、４０℃未満で、ＨＣｌ（３５％ａｑ）でｐＨを１に調整した。水相をＤＣＭで抽出し、有機相を２５％ＮａＣｌで洗浄し、４０℃未満で濃縮した。残渣を次の工程で直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ９．１４（ｓ、１Ｈ）、７．８６（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９４（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．７９（ｄｄ、Ｊ＝２．０、０．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．７４（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．４Ｈｚ、１Ｈ）ｐｐｍ。ＭＳ：Ｍ／ｅ １３５（Ｍ＋１）＋。
実施例１Ａ：化合物１の遊離塩基及び化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶Ａ＊の調製
工程１：中間体１の合成
【化6】
【0128】
工程２：中間体２の合成
－５～０℃で、ＤＣＭ（１５５ｋｇ）中のベンゾフラン－５－オール（中間体１、３３．１ｋｇ）及びＥｔ３Ｎ（５０．８ｋｇ）の撹拌溶液に、ＤＣＭ（５０ｋｇ）中のＴＭＳＣｌ（３０．４ｋｇ）の溶液を滴下した。混合物を０～１０℃に加温し、その温度で２時間撹拌した（工程内管理（ＩＰＣ）でＩＮＴ－１／ＩＮＴ－２＝３７．４％であると確認した）。混合物を－５～０℃に冷却し、ＴＭＳＣｌ（１０．６ｋｇ）のＤＣＭ（８ｋｇ）溶液を滴下し、次いで混合物を０～１０℃に加温し、その温度で１時間撹拌した。混合物を４０℃未満で濃縮し、混合物にｎ－ヘプタンを加えた。混合物を２０～３０分間撹拌し、濾過し、ケーキをｎ－ヘプタンで洗浄した。濾液から溶媒を蒸留して除き、粗中間体２（ＩＮＴ－２％：６２．７％、ＫＦ：０．０１％）を得た。上記の粗中間体２とＤＣＭ（１４９ｋｇ）中のＥｔ３Ｎ（８．６ｋｇ）の撹拌溶液に、ＤＣＭ（１０ｋｇ）中のＴＭＳＣｌ（９．０ｋｇ）の溶液を－５～０℃で滴下した。混合物を０～１０℃に温め、その温度で１時間撹拌した（ＴＬＣは反応が終了したことを示した）。反応混合物４０℃未満で濃縮し、混合物にｎ－ヘプタンを加えた。混合物を２０～３０分間撹拌し、次いで濾過し、ケーキをｎ－ヘプタンで洗浄した。濾液から溶媒を蒸留して除き、中間体２（４１．５ｋｇ、ＩＮＴ－２％：９８．１％）を無色油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ７．６９（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．６１（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．５６（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、０．００（ｓ、９Ｈ）ｐｐｍ。
【化7】
【0129】
工程３：中間体３の合成
銅（Ｉ）トリフラート（トルエンとの２：１錯体、０．４１ｋｇ）及び（Ｓ，Ｓ）-エバンス配位子（０．５５２ｋｇ）を室温のＮ２雰囲気下でＤＣＭ（１６０ｋｇ）中で１～２時間撹拌した。中間体２（３７．０ｋｇ）を添加し、続いて２０～３０℃でＤＣＭ（４５０ｋｇ）中のジアゾエタン酸エチル（５８ｋｇ）をゆっくりと添加した。反応物を２０～３０℃で０．５～１時間撹拌した（ＩＰＣ：ＩＮＴ－２／ＩＮＴ－３≦０．２％、残留Ｎ２ＣＨＣＯ２Ｅｔ：０．０５％≦１．０％）。ＥＤＴＡ二ナトリウム溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、１５０ｋｇ）を２０～３０℃で３～４回、４０～５０分間反応混合物に添加した。有機相を２５％水性ＮａＣｌで２０～３０℃で２回洗浄し、３０℃未満で濃縮した。残渣を減圧蒸留し、粗中間体３（３６．２６ｋｇ、８４．５％）を１２０～１４４℃で回収した。粗製化合物は、次の工程で除去することができるエンドエナンチオマーを含んでいた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ６．７９（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．５９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．４２（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９５（ｄｄ、Ｊ＝５．４、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．０８（ｄｄ、Ｊ＝５．４、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．０２（ｄｄ、Ｊ＝３．１、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、０．００（ｓ、９Ｈ）ｐｐｍ。
【化8】
【0130】
工程４及び５：中間体５及び中間体６の合成
ＭｅＯＨ（１０８ｋｇ）中の中間体４（３６．３ｋｇ）の溶液に２０～３０℃でＨＣｌ／ＭｅＯＨ（５Ｍ、０．１１ｋｇ）の溶液を加え、混合物を２～３時間撹拌した（ＩＰＣ：Ｌ／Ｍ：０．５％、光学純度９０．０％）。混合物を濃縮し、残渣をｎ－ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（４：１）で希釈し、次いで濃縮した。温度を１０～２０℃に調整し、１０～２０℃で２～４時間撹拌した後、濾過して湿潤生成物を得た（中間体５：９４．０％、光学純度９０．５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ９．０５（ｓ、１Ｈ）、６．８９（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．７２（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．５５（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄｄ、Ｊ＝５．４、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．２７（ｄｄ、Ｊ＝５．４、３．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．１９－１．１７（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ。粗生成物をｎ－ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（２０：１）で３回スラリー化して淡黄色固体を得て、これを４０～５０℃で１２～１６時間乾燥して１６．５５ｋｇの生成物を得た（中間体６：９８．６％；光学純度：９９．３％）。
【化9】
【0131】
工程６及び７：中間体７及び中間体８の合成
ＤＭＦ（６６ｋｇ）中の中間体６（１４ｋｇ）及び５－フルオロ－３，４－ジヒドロ－１，８－ナフチリジン－２（１Ｈ）－オン（ＳＭ２、１１．２ｋｇ）の溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（２６ｋｇ）を ４０～６０℃で添加し、混合物を１１０～１２０℃に加温し、１１０～１２０℃で３時間攪拌した。反応ｐＨは２５～３５℃で、酢酸（１２．０ｋｇ）で６に調整した。水（５２０ｋｇ）を加え、混合物を１～２時間撹拌した。濾過後、固体をＥＡ（７８ｋｇ）でスラリー化して湿潤生成物（純度：(中間体７＋中間体８)％：９８％）を得た。ＴＨＦ（２４０ｋｇ）中の湿潤生成物の撹拌溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１２５ｋｇ、２Ｍ）を加え、２０～３０℃で２～３時間攪拌した（ＩＰＣ：ＩＮＴ－７／ＩＮＴ－８：０．９％）。混合物を２０～３０℃で、４Ｎ ＨＣｌ（３７ｋｇ）でｐＨ４～５に調整し、０．５～１時間攪拌した。混合物を５０℃未満で濃縮し、固体を溶液から沈殿させた。濾過後、湿った生成物を３５～４５℃で、ＴＨＦ中で１～２時間再スラリー化し、次いで濾過した。得られた湿潤生成物を４５～６５℃で４０時間乾燥させて、表題の化合物である中間体８（１８．９５ｋｇ：化学純度９９％、光学純度１００％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．５９（ｓ、１Ｈ）、１０．４３（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．２９（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．９７（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９３（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．２１（ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ｄｄ、Ｊ＝５．４、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．２７－３．２５（ｍ、１Ｈ）、２．８９（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．５１（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．１９（ｄｄ、Ｊ＝３．０、１．０Ｈｚ、１Ｈ）ｐｐｍ。ＭＳ：Ｍ／ｅ ３３９（Ｍ＋１）＋。
【化10】
【0132】
工程８：中間体９の合成
ＤＭＦ（１６７ｋｇ）中の中間体８（１３．３ｋｇ）、ＤＩＥＰＡ（１６ｋｇ）及びＨＡＴＵ（１８．１ｋｇ）の溶液を、０～１５℃で、ＤＭＦ（７４ｋｇ）中の４－（トリフルオロメチル）ベンゼン－１，２－ジアミン（ＳＭ３、７．６ｋｇ）の混合物に滴下した。混合物を２０～２５℃で４～６時間撹拌した（ＩＰＣ：ＩＮＴ－９／ＩＮＴ－９：検出されなかった）。反応混合物にＤＭＦ（７．５ｋｇ）中の活性炭（５．３ｋｇ）を添加し、４０～４５℃で２～４時間撹拌した後、濾過した。濾液に水（８４６ｋｇ）を１５～３０℃で滴下し、１～２時間撹拌すると固体が沈殿した。沈殿物を処理し、ＥｔＯＨ中で２０～３０℃で２～４時間スラリー化した。濾過後、湿潤生成物を４５～６０℃で３７時間乾燥させて、表題の化合物である中間体９（１７．６０ｋｇ：９５．５％）を得た。
【化11】
【0133】
工程９：化合物１の遊離塩基の合成
ＡｃＯＨ（３６０ｋｇ）中の中間体９（１７ｋｇ）及び水（１．５ｋｇ）の溶液を６５～７０℃で２０時間撹拌した（ＩＰＣ：Ｒ／Ｓ≦１．０％）。混合物を５５℃以下で濃縮乾固し、ＭｅＯＨ（３２ｋｇ）中の活性炭（１７ｋｇ）を残渣に加えた。混合物を約５０℃で１時間撹拌した。ろ過後、ろ過を濃縮して溶媒を４５℃未満で除去した。残渣にＥＡ（１６０ｋｇ）と水（３３０ｋｇ）を加え、２０～３０℃でｐＨが８～９になるまでＮａＯＨ水溶液（２ｍｏｌ／Ｌ）を加えた。有機層を分離し、ＥＡで水相を抽出した。一体化した有機相を水で２回洗浄し、濃縮乾固して、遊離塩基の形態の化合物１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．８４（ｓ、１Ｈ）、１０．４７（ｓ、１Ｈ）、７．９８（ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６（ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｍ、１Ｈ）、７．４８（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８（ｄ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．０２（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．２９（ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４３（ｄｄ、Ｊ＝５．４、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．５５（ｄｄ、Ｊ＝５．３、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．９５（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．５５（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、１．９７（ｄ、Ｊ＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）ｐｐｍ。
【化12】
【0134】
工程１０：化合物１のセスキマレイン酸塩の合成
ＩＰＡ（８３ｋｇ）を工程９の残渣に添加した。水（２９ｋｇ）中のマレイン酸（５ｋｇ）を混合物に加え、約５０℃で４時間撹拌し、次いで３５℃に冷却し、その温度で１２時間撹拌した。得られた固体を濾過し、４０～６０℃で乾燥させ、微粉化機で微粉化して、Ｄ９０＝４．１μｍ、Ｄ１０＝１．５μｍ、Ｄ５０＝２．４μｍの白色粉末（化合物１のセスキマレイン酸塩、８．３６ｋｇ）を得た。結晶形Ａ＊の構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた（図２参照）。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図２９に示す。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを図３０に示す。
【化13】
【0135】
可溶性試験は、化合物１の遊離塩基（０．００１ｍｇ／ｍＬの定量下限値未満）よりも化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の方がはるかに良好な水溶性（０．００２ｍｇ／ｍＬ）が得られたことを示した。
【0136】
図３１に示すように、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊は非吸湿性であり、
９５％ＲＨに曝された水吸収量は０．１８０１％であった。
９５％ＲＨに曝された水吸収量は０．１８０１％であった。
【0137】
実施例１Ｂ：他の塩形成剤との化合物１の塩の調製
約１５０ｍｇの化合物１の遊離塩基を、４０ｍＬのガラス瓶中で２ｍＬのＩＰＡに個別に溶解した。表１６に記載されたモル比である、ＩＰＡ中の適切な塩形成剤の溶液（溶解できなかった塩形成剤は、塩形成剤をＩＰＡに予め溶解し、懸濁液を加熱して溶解させた）を、マグネチックスターラー上でそれぞれ遊離塩基溶液にゆっくりと滴定し、次いで室温で２４時間攪拌して固体を沈殿させた。固体が得られなかった場合、貧溶媒（例えば、ヘプタン）を溶液にゆっくりと加えて沈殿物を得た。新しい結晶形が得られたかどうかを決定するためにＸＲＰＤによって遠心固体を決定し、次いでさらなる特徴付けのために４０℃で一晩真空乾燥した。ＩＰＡ中に懸濁したＡＰＩ及び純粋な固体酸をＡＰＩコントロール及び純粋な固体の塩形成剤コントロールとして使用し、塩／共結晶形成とＡＰＩ又は固体塩形成剤の多形を区別した。
約１５０ｍｇの化合物１の遊離塩基を、４０ｍＬのガラス瓶中で２ｍＬのＩＰＡに個別に溶解した。表１６に記載されたモル比である、ＩＰＡ中の適切な塩形成剤の溶液（溶解できなかった塩形成剤は、塩形成剤をＩＰＡに予め溶解し、懸濁液を加熱して溶解させた）を、マグネチックスターラー上でそれぞれ遊離塩基溶液にゆっくりと滴定し、次いで室温で２４時間攪拌して固体を沈殿させた。固体が得られなかった場合、貧溶媒（例えば、ヘプタン）を溶液にゆっくりと加えて沈殿物を得た。新しい結晶形が得られたかどうかを決定するためにＸＲＰＤによって遠心固体を決定し、次いでさらなる特徴付けのために４０℃で一晩真空乾燥した。ＩＰＡ中に懸濁したＡＰＩ及び純粋な固体酸をＡＰＩコントロール及び純粋な固体の塩形成剤コントロールとして使用し、塩／共結晶形成とＡＰＩ又は固体塩形成剤の多形を区別した。
【0138】
マレイン酸との結晶塩の形成に加えて、塩酸（図３）、メタンスルホン酸（図４）、２－ヒドロキシエタンスルホン酸（図５）、Ｌ－酒石酸（図６、酒石酸塩について化学シフトが検出されなかったので、真の酒石酸塩は形成されず、遊離塩基の多形である可能性がある）及びシュウ酸（図７）を含む５つの酸からも、遊離塩基、ＡＰＩコントロール及び固体酸コントロールと異なる結晶形を示す結晶形の固体が発見された。形成された結晶塩の中で、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩及びマレイン酸塩は、他の４種（塩酸、メタンスルホン酸、Ｌ－酒石酸及びシュウ酸）より良好な結晶化度を有する。
【0139】
他の塩生成剤から得られた固体は、すべて非晶質形態（図８、図９、図１０）又は純粋な固体塩形成剤と同じ形態（図１１及び図１２）であり、遊離形、又は無定形塩、又は遊離形と塩形成剤の混合物が得られたことを示唆した。
【表16】
【0140】
実施例２：化合物１のセスキマレイン酸塩の単結晶形Ａ＊＊の調製
溶媒、温度及び再結晶法を変化させることにより、９４個の異なる条件下で単結晶成長スクリーニングを行い、そこから、アセトン中でゆっくりと冷却することによって構造決定に適した単結晶が得られた。
溶媒、温度及び再結晶法を変化させることにより、９４個の異なる条件下で単結晶成長スクリーニングを行い、そこから、アセトン中でゆっくりと冷却することによって構造決定に適した単結晶が得られた。
【0141】
実施例３：化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの調製
化合物１の遊離塩基（１４５ｇ）を１７５０ｍＬのｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（Ｖ：Ｖ＝４：１）中の６３．５ｇのマレイン酸（１．８当量）と合わせた。すべての固体が溶解するまで、混合物を還流した。透明な溶液を室温まで冷却し、いくつかの種結晶を添加し、次いで混合物を２４時間放置した。白色固体を沈殿させ、濾過した。濾過ケーキを約５００ｍＬのｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（Ｖ：Ｖ＝４：１）で洗浄し、５０℃で４８時間高真空下で乾燥させて、表題の生成物（１１２ｇ）を結晶として得た。結晶形Ａの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図１７を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで０．３重量％であることを示した。ＤＳＣの結果は、１９４．２℃（開始温度）に融解吸熱を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、遊離塩基／マレイン酸の１／１．５の化学量論比を示した（図３４参照）。
化合物１の遊離塩基（１４５ｇ）を１７５０ｍＬのｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（Ｖ：Ｖ＝４：１）中の６３．５ｇのマレイン酸（１．８当量）と合わせた。すべての固体が溶解するまで、混合物を還流した。透明な溶液を室温まで冷却し、いくつかの種結晶を添加し、次いで混合物を２４時間放置した。白色固体を沈殿させ、濾過した。濾過ケーキを約５００ｍＬのｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（Ｖ：Ｖ＝４：１）で洗浄し、５０℃で４８時間高真空下で乾燥させて、表題の生成物（１１２ｇ）を結晶として得た。結晶形Ａの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図１７を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで０．３重量％であることを示した。ＤＳＣの結果は、１９４．２℃（開始温度）に融解吸熱を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、遊離塩基／マレイン酸の１／１．５の化学量論比を示した（図３４参照）。
【0142】
実施例１Ａは、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形の大量生産（すなわち、形Ａ＊と呼ぶ）を対象とし、実施例３は、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形の実験室調製（すなわち、形Ａと呼ぶ）を対象とする。粉末Ｘ線回折パターン、１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び他の技術は、結晶形Ａ＊及び結晶形Ａの２つの結晶形の間の一貫性を示す。
【0143】
実施例４：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｂの調製
セスキマレイン酸塩の結晶形Ａの１，４－ジオキサン溶液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却して結晶化させることにより、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｂを調製した。手順：２０．０ｍｇのＡ形固体を３ｍＬのガラス瓶に量り、１ｍＬの１，４－ジオキサンを瓶に加える；混合物を５０℃で、磁気によって８００ＲＰＭの速度で撹拌する；０．４５μｍのナイロン膜を用いて６０℃で２時間平衡化した後に、サンプルを濾過する；濾液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却する。試料は、分離前に５℃で保存した。結晶形Ｂの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた；図１８を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１５０℃までで１５．１重量％であることを示した（結晶の１，４－ジオキサン溶媒和物／水和物の分子が含まれる）。ＤＳＣの結果は、分解前に多重重複吸熱（１８１．４及び１８９．６℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、遊離塩基／マレイン酸の約１／１．２の化学量論比を示した（図３５参照）。
セスキマレイン酸塩の結晶形Ａの１，４－ジオキサン溶液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却して結晶化させることにより、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｂを調製した。手順：２０．０ｍｇのＡ形固体を３ｍＬのガラス瓶に量り、１ｍＬの１，４－ジオキサンを瓶に加える；混合物を５０℃で、磁気によって８００ＲＰＭの速度で撹拌する；０．４５μｍのナイロン膜を用いて６０℃で２時間平衡化した後に、サンプルを濾過する；濾液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却する。試料は、分離前に５℃で保存した。結晶形Ｂの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた；図１８を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１５０℃までで１５．１重量％であることを示した（結晶の１，４－ジオキサン溶媒和物／水和物の分子が含まれる）。ＤＳＣの結果は、分解前に多重重複吸熱（１８１．４及び１８９．６℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、遊離塩基／マレイン酸の約１／１．２の化学量論比を示した（図３５参照）。
【0144】
実施例５：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｃの調製
結晶化のために、化合物１のエタノール溶液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却することによって、化合物１の結晶形態Ｃを調製した。手順：２１．３ｍｇのＡ形固体を３ｍＬのガラス瓶に量り、１ｍＬのエタノールを瓶に加える；混合物を５０℃で磁気によって８００ＲＰＭの速度で撹拌する；０．４５μｍのナイロン膜を用いて６０℃で２時間平衡化した後に、サンプルを濾過する。濾液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却する。試料は、分離前に５℃で保存した。結晶形Ｃの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた；図１９を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１８０℃までで７．０重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の４つの吸熱（１０７．５、１６２．７、１７９．３及び１９６．０℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは遊離塩基／マレイン酸の約１／１．３の化学量論比を示した（図３６参照）。
結晶化のために、化合物１のエタノール溶液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却することによって、化合物１の結晶形態Ｃを調製した。手順：２１．３ｍｇのＡ形固体を３ｍＬのガラス瓶に量り、１ｍＬのエタノールを瓶に加える；混合物を５０℃で磁気によって８００ＲＰＭの速度で撹拌する；０．４５μｍのナイロン膜を用いて６０℃で２時間平衡化した後に、サンプルを濾過する。濾液を６０℃から５℃まで０．１℃／分の速度で冷却する。試料は、分離前に５℃で保存した。結晶形Ｃの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた；図１９を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１８０℃までで７．０重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の４つの吸熱（１０７．５、１６２．７、１７９．３及び１９６．０℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは遊離塩基／マレイン酸の約１／１．３の化学量論比を示した（図３６参照）。
【0145】
実施例６：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｄの調製
化合物１の結晶形Ａのセスキマレイン酸塩のＭｅＯＨ溶液を、室温でＣＦ３ＣＯＯ－イオン性液体の存在下でゆっくりと蒸発させることにより、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｄを調製した。手順：１５０．２ｍｇのＡ形固体を２０ｍＬガラス瓶に量り、１０．２ｍＬのＭｅＯＨを瓶に加える；混合物を濾過して、０．４５μｍのナイロン膜を用いて飽和ストーク溶液を得る；２．８ｍｇのＣＦ３ＣＯＯ－イオン性液体を１ｍＬのＭｅＯＨストック溶液に添加する。室温で撹拌して沈殿を誘導する。結晶形Ｄの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２０を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで６．３重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の２つの吸熱（７５．８及び１６１．４℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは遊離塩基／マレイン酸の約１／１の化学量論比を示した（図３７参照）。
化合物１の結晶形Ａのセスキマレイン酸塩のＭｅＯＨ溶液を、室温でＣＦ３ＣＯＯ－イオン性液体の存在下でゆっくりと蒸発させることにより、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｄを調製した。手順：１５０．２ｍｇのＡ形固体を２０ｍＬガラス瓶に量り、１０．２ｍＬのＭｅＯＨを瓶に加える；混合物を濾過して、０．４５μｍのナイロン膜を用いて飽和ストーク溶液を得る；２．８ｍｇのＣＦ３ＣＯＯ－イオン性液体を１ｍＬのＭｅＯＨストック溶液に添加する。室温で撹拌して沈殿を誘導する。結晶形Ｄの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２０を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで６．３重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の２つの吸熱（７５．８及び１６１．４℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは遊離塩基／マレイン酸の約１／１の化学量論比を示した（図３７参照）。
【0146】
実施例７：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｆの調製
ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ/ｖ）溶液からの化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの結晶化により、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｆを調製した。手順：１８．９ｍｇのＡ形固体を３ｍＬガラス瓶に量り、１．５ｍＬのＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）を加える；２ｍｇのポリマー混合物（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡＣ）、ヒプロメロース（ＨＰＭＣ）及びメチルセルロース（ＭＣ）を１：１：１：１：１：１の質量比）を懸濁液に添加し、室温で撹拌して沈殿を誘導する。
ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ/ｖ）溶液からの化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの結晶化により、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｆを調製した。手順：１８．９ｍｇのＡ形固体を３ｍＬガラス瓶に量り、１．５ｍＬのＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）を加える；２ｍｇのポリマー混合物（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡＣ）、ヒプロメロース（ＨＰＭＣ）及びメチルセルロース（ＭＣ）を１：１：１：１：１：１の質量比）を懸濁液に添加し、室温で撹拌して沈殿を誘導する。
【0147】
結晶形Ｆの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２１を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１３０℃までで３．２重量％（ＡＣＮ溶媒和物/水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の３つの吸熱（６２．４、１５６．９及び１６９．３℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、約１／０．５の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図３８参照）。
【0148】
実施例８：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｇの調製
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの酢酸溶液に水を添加することによって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｇを調製した。手順：２０．２ｍｇの形Ａの固体を２０ｍＬガラス瓶に量り入れる；１．０ｍＬの酢酸を瓶に加え、室温で撹拌して透明な溶液を得る；溶液に５ｍＬの水を段階的に加えて沈殿を誘導する。
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの酢酸溶液に水を添加することによって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｇを調製した。手順：２０．２ｍｇの形Ａの固体を２０ｍＬガラス瓶に量り入れる；１．０ｍＬの酢酸を瓶に加え、室温で撹拌して透明な溶液を得る；溶液に５ｍＬの水を段階的に加えて沈殿を誘導する。
【0149】
結晶形Ｇの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２２を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで１１．０重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の４つの吸熱（８４．３、１２６．９、１３９．４及び１８７．３℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／０．５の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図３９参照）。
【0150】
実施例９：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｈの調製
ＴＨＦ中の化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａを室温でスラリー化することによって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｈを調製した。手順：１７．７ｍｇのＡ形固体を１．５ｍＬ瓶に量り、０．３ｍＬのＴＨＦを瓶に加えて懸濁液を得る；混合物を室温で、磁気によって８００ＲＰＭで３日間撹拌する。結晶形Ｈの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２３を参照のこと。ＴＧＡの結果は、二段階の重量減少が１５０℃までで１３．０重量％（結晶ＴＨＦ溶媒和物/水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の２つの吸熱（１２４．５及び１７８．０℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／１の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４０参照）。
ＴＨＦ中の化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａを室温でスラリー化することによって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｈを調製した。手順：１７．７ｍｇのＡ形固体を１．５ｍＬ瓶に量り、０．３ｍＬのＴＨＦを瓶に加えて懸濁液を得る；混合物を室温で、磁気によって８００ＲＰＭで３日間撹拌する。結晶形Ｈの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２３を参照のこと。ＴＧＡの結果は、二段階の重量減少が１５０℃までで１３．０重量％（結晶ＴＨＦ溶媒和物/水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の２つの吸熱（１２４．５及び１７８．０℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／１の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４０参照）。
【0151】
実施例１０：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｉの調製
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（３：１、ｖ／ｖ）溶液の室温でのゆっくりとした蒸発によって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｉを調製した。手順：１３．８ｍｇのＡ形固体を３ｍＬガラス瓶に量り、１．５ｍＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（３：１、ｖ／ｖ）を瓶に加えて透明な溶液を得る；室温で溶液から溶媒を蒸発させて沈殿を誘導する。結晶形Ｉの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２４を参照のこと。ＴＧＡの結果は、二段階の重量減少が１８０℃までで２０．７重量％（結晶ＩＰＡ溶媒和物/水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の４つの重複した吸熱（８５．８、１１５．１及び１３８．２℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／０．５の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４１参照）。
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａの、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（３：１、ｖ／ｖ）溶液の室温でのゆっくりとした蒸発によって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｉを調製した。手順：１３．８ｍｇのＡ形固体を３ｍＬガラス瓶に量り、１．５ｍＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（３：１、ｖ／ｖ）を瓶に加えて透明な溶液を得る；室温で溶液から溶媒を蒸発させて沈殿を誘導する。結晶形Ｉの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２４を参照のこと。ＴＧＡの結果は、二段階の重量減少が１８０℃までで２０．７重量％（結晶ＩＰＡ溶媒和物/水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の４つの重複した吸熱（８５．８、１１５．１及び１３８．２℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／０．５の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４１参照）。
【0152】
実施例１１：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｊの調製
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ａの固体と酢酸蒸気との相互作用によって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｊを調製した。手順：１４．２ｍｇの形Ａの固体を３ｍＬのガラス瓶に量り、３ｍＬ瓶を２ｍＬの酢酸を含む２０ｍＬガラス瓶に密封する；系を室温に８日間保ち、蒸気と固体を相互作用させる。結晶形Ｊの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２５を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１３０℃までで１９．３重量％（結晶酢酸溶媒和物／水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の３つの吸熱（１０２．９、１５５．７及び１８７．７℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／１の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４２参照）。
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ａの固体と酢酸蒸気との相互作用によって、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｊを調製した。手順：１４．２ｍｇの形Ａの固体を３ｍＬのガラス瓶に量り、３ｍＬ瓶を２ｍＬの酢酸を含む２０ｍＬガラス瓶に密封する；系を室温に８日間保ち、蒸気と固体を相互作用させる。結晶形Ｊの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２５を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１３０℃までで１９．３重量％（結晶酢酸溶媒和物／水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、分解前の３つの吸熱（１０２．９、１５５．７及び１８７．７℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／１の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４２参照）。
【0153】
実施例１２：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｋの調製
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｄを周囲条件下で２週間保存後に、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｋを得た。結晶形Ｋの構造を特徴付けるために、粉末X線回折パターン法を用いた。図２６を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１５０℃までで４．２重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、１８６．６℃（ピーク温度）で溶融する前の２つの吸熱（５９．６及び１６３．５℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、約１／１の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４３参照）。
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｄを周囲条件下で２週間保存後に、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｋを得た。結晶形Ｋの構造を特徴付けるために、粉末X線回折パターン法を用いた。図２６を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１５０℃までで４．２重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、１８６．６℃（ピーク温度）で溶融する前の２つの吸熱（５９．６及び１６３．５℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、約１／１の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４３参照）。
【0154】
実施例１３：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｌの調製
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｇを１４０℃に加熱し、室温に冷却することにより、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｌを得た。結晶形Ｌの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２７を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで３．９重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、１８３．９℃（ピーク温度）で溶融する前の１つの吸熱（１４１．１℃、開始温度）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／０．３の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４４参照）。
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｇを１４０℃に加熱し、室温に冷却することにより、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｌを得た。結晶形Ｌの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２７を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１２０℃までで３．９重量％（結晶水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、１８３．９℃（ピーク温度）で溶融する前の１つの吸熱（１４１．１℃、開始温度）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／０．３の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４４参照）。
【0155】
実施例１４：化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｍの調製
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｊを周囲条件下で２週間保存後に、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｍを得た。結晶形Ｍの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２８を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１４０℃までで１．４重量％（結晶酢酸水和物／水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、複数の吸熱（１２３．０、１５６．５、１７１．９、１７６．１及び１９５．３℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／１．３の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４５参照）。
化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｊを周囲条件下で２週間保存後に、化合物１のマレイン酸塩の結晶形Ｍを得た。結晶形Ｍの構造を特徴付けるために、粉末Ｘ線回折パターン法を用いた。図２８を参照のこと。ＴＧＡの結果は、重量減少が１４０℃までで１．４重量％（結晶酢酸水和物／水和物の分子を含む）であることを示した。ＤＳＣの結果は、複数の吸熱（１２３．０、１５６．５、１７１．９、１７６．１及び１９５．３℃）を示した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは約１／１．３の遊離塩基／マレイン酸の化学量論比を示した（図４５参照）。
【0156】
実施例１５：化合物１のマレイン酸塩及びセスキマレイン酸塩の形成のための条件のスクリーニング
【化14】
【0157】
条件１：ＥｔＯＡｃ中でマレイン酸と反応させた化合物１
ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）中の化合物１（４７．８ｍｇ）の撹拌溶液に、マレイン酸のＥｔＯＡｃ溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ、ｖｍＬ）を室温で加えた。混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過し、高真空下で乾燥させて、表題の塩を得た。驚くべきことに、０．５、０．９、１．８又は３．０当量のマレイン酸を使用した場合、全ての条件下で化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）の結晶が得られた。
ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）中の化合物１（４７．８ｍｇ）の撹拌溶液に、マレイン酸のＥｔＯＡｃ溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ、ｖｍＬ）を室温で加えた。混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過し、高真空下で乾燥させて、表題の塩を得た。驚くべきことに、０．５、０．９、１．８又は３．０当量のマレイン酸を使用した場合、全ての条件下で化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）の結晶が得られた。
【0158】
条件２：ＥｔＯＨ中でマレイン酸と反応させた化合物１
手順：ＥｔＯＨ中の化合物１及びマレイン酸の混合物を、すべての固体が溶解するまで２０分間還流した。溶液を周囲温度に冷却し、３時間放置した。析出した白色固体を濾過し、高真空下で乾燥させて、表題の化合物を得た。驚くべきことに、１当量のマレイン酸を使用した場合、化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶が得られたが、マレイン酸の量を１．３、１．５又は３．５当量に増加させた場合、すべての条件で化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）の結晶が生成物として得られた。
手順：ＥｔＯＨ中の化合物１及びマレイン酸の混合物を、すべての固体が溶解するまで２０分間還流した。溶液を周囲温度に冷却し、３時間放置した。析出した白色固体を濾過し、高真空下で乾燥させて、表題の化合物を得た。驚くべきことに、１当量のマレイン酸を使用した場合、化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶が得られたが、マレイン酸の量を１．３、１．５又は３．５当量に増加させた場合、すべての条件で化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）の結晶が生成物として得られた。
【0159】
条件３：ＭｅＯＨ中でマレイン酸と反応させた化合物１
手順：ＭｅＯＨ中の化合物１及びマレイン酸の混合物を、すべての固体が溶解するまで２０分間還流した。溶液を周囲温度に冷却し、３時間放置した。析出した白色固体を濾過し、高真空下で乾燥させて化合物１のマレイン酸塩（１：１）を得た。驚くべきことに、溶媒としてＭｅＯＨを使用し、１．０、１．５又は３．５当量のマレイン酸を使用した場合、生成物は一貫して粉末状の化合物１のマレイン酸塩（１：１）であった。
手順：ＭｅＯＨ中の化合物１及びマレイン酸の混合物を、すべての固体が溶解するまで２０分間還流した。溶液を周囲温度に冷却し、３時間放置した。析出した白色固体を濾過し、高真空下で乾燥させて化合物１のマレイン酸塩（１：１）を得た。驚くべきことに、溶媒としてＭｅＯＨを使用し、１．０、１．５又は３．５当量のマレイン酸を使用した場合、生成物は一貫して粉末状の化合物１のマレイン酸塩（１：１）であった。
【0160】
条件４：ｉ－ＰｒＯＨ／水中でマレイン酸と反応させた化合物１
手順：混合溶媒（ｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ＝４：１、容積１．７Ｌ）中の化合物１（１４５ｇ、０．３ｍｏｌ）及びマレイン酸（６３ｇ、０．５４ｍｏｌ）の混合物を、すべての固体が溶解するまで還流した。混合物を室温まで冷却し、種結晶を溶液に加え、混合物を２４時間放置した。析出した白色結晶を濾過した。濾過ケーキを５００ｍＬの混合溶媒で洗浄し、５０℃で４８時間高真空下で乾燥して化合物１のセスキマレイン酸塩（１１２ｇ、５６．７％）を結晶針として得た。興味深いことに、溶媒として４０体積％のｉ－ＰｒＯＨを使用した場合、化合物１のヘミマレイン酸塩（１：０．５）が得られた。６０体積％のｉ－ＰｒＯＨ、９０体積％のｉ－ＰｒＯＨ又は１００％のｉ－ＰｒＯＨを溶媒として使用した場合、全ての条件で化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）の結晶が得られた。
手順：混合溶媒（ｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ＝４：１、容積１．７Ｌ）中の化合物１（１４５ｇ、０．３ｍｏｌ）及びマレイン酸（６３ｇ、０．５４ｍｏｌ）の混合物を、すべての固体が溶解するまで還流した。混合物を室温まで冷却し、種結晶を溶液に加え、混合物を２４時間放置した。析出した白色結晶を濾過した。濾過ケーキを５００ｍＬの混合溶媒で洗浄し、５０℃で４８時間高真空下で乾燥して化合物１のセスキマレイン酸塩（１１２ｇ、５６．７％）を結晶針として得た。興味深いことに、溶媒として４０体積％のｉ－ＰｒＯＨを使用した場合、化合物１のヘミマレイン酸塩（１：０．５）が得られた。６０体積％のｉ－ＰｒＯＨ、９０体積％のｉ－ＰｒＯＨ又は１００％のｉ－ＰｒＯＨを溶媒として使用した場合、全ての条件で化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）の結晶が得られた。
【0161】
条件５：他の溶媒中でマレイン酸と反応させた化合物１
上記の同様の手順に従って、他の溶媒（ＴＨＦ、アセトン、ＤＭＥ、１，４－ジオキサン）を使用した場合、得られた生成物は一貫して化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）であった。
上記の同様の手順に従って、他の溶媒（ＴＨＦ、アセトン、ＤＭＥ、１，４－ジオキサン）を使用した場合、得られた生成物は一貫して化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）であった。
【0162】
条件６：化合物１のセスキマレイン酸塩（１：１．５）のマレイン酸塩（１：１）への変換
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶（１．０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に懸濁し、混合物を室温で１日間撹拌した。白色固体を濾過した。濾過ケーキをＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で洗浄し、赤外線ランプ下、５０℃で１６時間乾燥させて化合物１のマレイン酸塩（１：１）（８２０ｍｇ、９０％）を白色結晶固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄｍｓｏ）δ １０．５０（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６（ｓ、１Ｈ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．４７（ｄｄ、Ｊ＝８．４、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．０１（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、６．３１－６．２４（ｍ、３Ｈ）、５．４３（ｄｄ、Ｊ＝５．２、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．５５（ｄｄ、Ｊ＝５．２、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．９４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．５４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．９７（ｄｄ、Ｊ＝３．２、１．２Ｈｚ、１Ｈ）（詳細なスペクトルは図３２を参照）。
【化15】
【0163】
粉末Ｘ線回折パターンの調査は、条件６で得られた白色結晶固体の構造を決定するために用いられ、化合物１のマレイン酸塩（１：１）の結晶形Ｎ（図３３）と命名された。
【0164】
条件７：化合物１のマレイン酸塩（１：１）のセスキマレイン酸塩への変換
ｉ－ＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ（４：１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）の混合物中の、化合物１のマレイン酸塩（１：１）（４．３ｇ）及びマレイン酸（０．６７ｇ、０．８当量のマレイン酸）の混合物を１時間還流した。少量の固体が残った。別の５ｍＬの混合溶媒を加え、得られた混合物を３０分間還流し、すべての固体を溶解した。混合物を室温まで冷却し、次いで１６時間放置した。析出した白色結晶を濾過した。濾過ケーキを２０ｍＬの混合溶媒で洗浄し、赤外線ランプ下で２４時間乾燥させて、化合物１のセスキマレイン酸塩（３．２ｇ、６８％）を結晶針として得た。
【化16】
【0165】
実施例１６
化合物１のＡＰＩの不純物排出：第１の結晶化セスキマレイン酸塩（化学純度＝９８．８２％）２８．５ｋｇをメタノールと共に４５～５０℃で４～５時間撹拌した。スラリー混合物を２０～３０℃で３～４時間冷却し、濾過して湿潤ケーキを得た（３０．３ｋｇ；化学純度＝９９．７６％）。湿潤ケーキを酢酸エチル及び水と混合し、炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ＝７～８に処理し、次いで水で洗浄した。酢酸エチル中の化合物１の遊離塩基（１６．２ｋｇ、化学純度＝９９．８１％）を得た。蒸留により酢酸エチルをｉ－プロパノールに置き換えた。ｉ－ＰｒＯＨ中の遊離塩基を、マレイン酸の水溶液及びセスキマレイン酸の種結晶と共に撹拌した。混合物を４０～５０℃で数時間、２０～３０℃で数時間撹拌した。得られた固体を濾過して、第２の結晶化セスキマレイン酸塩（１９．６ｋｇ；化学純度＝９９．８２％；光学純度＝１００％）を得た。
化合物１のＡＰＩの不純物排出：第１の結晶化セスキマレイン酸塩（化学純度＝９８．８２％）２８．５ｋｇをメタノールと共に４５～５０℃で４～５時間撹拌した。スラリー混合物を２０～３０℃で３～４時間冷却し、濾過して湿潤ケーキを得た（３０．３ｋｇ；化学純度＝９９．７６％）。湿潤ケーキを酢酸エチル及び水と混合し、炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ＝７～８に処理し、次いで水で洗浄した。酢酸エチル中の化合物１の遊離塩基（１６．２ｋｇ、化学純度＝９９．８１％）を得た。蒸留により酢酸エチルをｉ－プロパノールに置き換えた。ｉ－ＰｒＯＨ中の遊離塩基を、マレイン酸の水溶液及びセスキマレイン酸の種結晶と共に撹拌した。混合物を４０～５０℃で数時間、２０～３０℃で数時間撹拌した。得られた固体を濾過して、第２の結晶化セスキマレイン酸塩（１９．６ｋｇ；化学純度＝９９．８２％；光学純度＝１００％）を得た。
【0166】
実施例１７：化合物１の塩又は結晶形の安定性試験
実施例１７Ａ：短期安定性試験
塩酸塩、メシル酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩及びマレイン酸塩を評価するために短期安定性試験を行った。
実施例１７Ａ：短期安定性試験
塩酸塩、メシル酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩及びマレイン酸塩を評価するために短期安定性試験を行った。
【0167】
上記塩をそれぞれ約２ｍｇ（ＸＲＰＤについては１０ｍｇ）４０ｍＬのガラス瓶中で別々に秤量した。遊離塩基形態をコントロールとして使用した。閉鎖したサンプルをキャップしてパラフィルムで封止し、開封したサンプルをピンホール付きアルミニウムホイルで覆った。すべてのサンプルを、対応する条件（６０℃及び４０℃／７５％RH）で１週間、安定性チャンバー又は乾燥オーブンに保存した。
【0168】
塩酸塩は、１週間後の両方の条件で淡黄色粉末であるように見え、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、メシル酸塩及びマレイン酸塩の外観は目視観察で変化しなかった。ＸＲＰＤの結果は、すべての塩試料について結晶形の変換が検出されなかったことを示した。
【0169】
化学的安定性の結果を表１７に要約した。分解の変化が透過ラマン分光法（ＴＲＳ）の増加として検出された（塩酸塩＞２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩＞メシル酸塩＞マレイン酸塩＞遊離塩基）。対照的に、塩試料のＴＲＳが６０℃でより増加したので、温度ストレス条件は、化合物１の塩形成の湿度ストレス条件よりも大きな影響を有する可能性がある。
【表17】
【0170】
実施例１７Ｂ：長期安定性試験
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の長期安定性試験は、２５℃／６０％ＲＨで最大１８ヶ月保存した場合（ｗ／ｗ分析：Ｔ０＝９９．１％及びＴ１８＝９８．８％）及び４０℃／７５％ＲＨ条件下で最大６ヶ月保存した場合（ｗ／ｗ分析：Ｔ０＝９９．１％及びＴ６＝９８．９％）、有意な化学的純度の変化はなかったことを示した。結果は、２５℃／７５％ＲＨでの最大２４ヶ月の安定性試験の後でも、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊が純度を９８．５％に維持したことを示した。さらに、２５℃／６０％ＲＨで最大１８ヶ月保存した場合及び４０℃／７５％ＲＨの条件下で最大６ヶ月間保存した場合、結晶形及び光学純度の変化は観察されなかった。
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の長期安定性試験は、２５℃／６０％ＲＨで最大１８ヶ月保存した場合（ｗ／ｗ分析：Ｔ０＝９９．１％及びＴ１８＝９８．８％）及び４０℃／７５％ＲＨ条件下で最大６ヶ月保存した場合（ｗ／ｗ分析：Ｔ０＝９９．１％及びＴ６＝９８．９％）、有意な化学的純度の変化はなかったことを示した。結果は、２５℃／７５％ＲＨでの最大２４ヶ月の安定性試験の後でも、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊が純度を９８．５％に維持したことを示した。さらに、２５℃／６０％ＲＨで最大１８ヶ月保存した場合及び４０℃／７５％ＲＨの条件下で最大６ヶ月間保存した場合、結晶形及び光学純度の変化は観察されなかった。
【0171】
有効性テスト
試験１：化合物１のセスキマレイン酸塩によるキナーゼの阻害及び選択性（試験した結晶形Ａ＊）
方法：
Ｒａｆキナーゼ酵素アッセイ：
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの組換えＢ－Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）（ＰＶ３８４９）、Ｃ－Ｒａｆ（Ｙ３４０Ｄ／Ｙ３４１Ｄ）（ＰＶ３８０５）及び野生型Ｂｒａｆ（ＰＶ３８４８）に対して、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）法（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づくキナーゼ活性アッセイで試験した。アッセイは、ＲＡＦキナーゼ、ｋＭ濃度のＡＴＰ、ＧＳＴ標識ＭＥＫ１（Ｋ９７Ｒ）並びに、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＮａ３ＶＯ４、５ｍＭのβ－グリセロリン酸塩、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２．５ｍＭのＤＴＴ及び０．１％のＢＳＡを含むバッファ中の化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊又はＤＭＳＯを含む混合物中で実行した。キナーゼを化合物１のセスキマレイン酸の結晶形Ａ＊と共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、反応をＡＴＰ及びＧＳＴ－ＭＥＫ１（Ｋ９７Ｒ突然変異を有する完全長タンパク質であり、細菌発現系から精製した組換えタンパク質）の添加によって開始した。室温で１時間反応させた後、停止／検出溶液を製造者の指示（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に従って添加した。停止／検出溶液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、４００ｍＭのＫＦ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中に、Ｅｕ３＋クリプテート結合抗ホスホＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）ウサギポリクローナル抗体、及びｄ２結合抗ＧＳＴマウスモノクローナル抗体を含有した。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（３３７ｎｍ波長での励起における６６５ｎｍでの蛍光発光と６２０ｎｍでの発光との比）を１．５時間のインキュベーション後にＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定した。ＭＥＫ１のリン酸化は、抗ＧＳＴ抗体上のアクセプターｄ２のすぐ近くに蛍光ドナー（Ｅｕ３＋クリプテート）を配置する、ＧＳＴ－ＭＥＫ１タンパク質への抗ホスホ－ＭＥＫ１／２抗体の結合をもたらし、その結果、ドナーフルオロフォア（６２０ｎｍ）からアクセプターフルオロフォア（６６５ｎｍ）への高度の蛍光共鳴エネルギー移動をもたらした。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊のＩＣ５０は、グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアによって用量応答％阻害データを４パラメータロジスティックモデルに適合させることにより得られた。
試験１：化合物１のセスキマレイン酸塩によるキナーゼの阻害及び選択性（試験した結晶形Ａ＊）
方法：
Ｒａｆキナーゼ酵素アッセイ：
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの組換えＢ－Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）（ＰＶ３８４９）、Ｃ－Ｒａｆ（Ｙ３４０Ｄ／Ｙ３４１Ｄ）（ＰＶ３８０５）及び野生型Ｂｒａｆ（ＰＶ３８４８）に対して、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）法（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に基づくキナーゼ活性アッセイで試験した。アッセイは、ＲＡＦキナーゼ、ｋＭ濃度のＡＴＰ、ＧＳＴ標識ＭＥＫ１（Ｋ９７Ｒ）並びに、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭの塩化マグネシウム、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＮａ３ＶＯ４、５ｍＭのβ－グリセロリン酸塩、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２．５ｍＭのＤＴＴ及び０．１％のＢＳＡを含むバッファ中の化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊又はＤＭＳＯを含む混合物中で実行した。キナーゼを化合物１のセスキマレイン酸の結晶形Ａ＊と共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、反応をＡＴＰ及びＧＳＴ－ＭＥＫ１（Ｋ９７Ｒ突然変異を有する完全長タンパク質であり、細菌発現系から精製した組換えタンパク質）の添加によって開始した。室温で１時間反応させた後、停止／検出溶液を製造者の指示（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）に従って添加した。停止／検出溶液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、４００ｍＭのＫＦ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡ及び０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中に、Ｅｕ３＋クリプテート結合抗ホスホＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）ウサギポリクローナル抗体、及びｄ２結合抗ＧＳＴマウスモノクローナル抗体を含有した。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（３３７ｎｍ波長での励起における６６５ｎｍでの蛍光発光と６２０ｎｍでの発光との比）を１．５時間のインキュベーション後にＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定した。ＭＥＫ１のリン酸化は、抗ＧＳＴ抗体上のアクセプターｄ２のすぐ近くに蛍光ドナー（Ｅｕ３＋クリプテート）を配置する、ＧＳＴ－ＭＥＫ１タンパク質への抗ホスホ－ＭＥＫ１／２抗体の結合をもたらし、その結果、ドナーフルオロフォア（６２０ｎｍ）からアクセプターフルオロフォア（６６５ｎｍ）への高度の蛍光共鳴エネルギー移動をもたらした。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊のＩＣ５０は、グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアによって用量応答％阻害データを４パラメータロジスティックモデルに適合させることにより得られた。
【0172】
ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＰＤＧＦＲ－β、ＴＸＫ、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ２、ＲＥＴ、ＢＴＫ、ＩＴＫ、ＴＥＣ及びＳＲＣのキナーゼアッセイ
組換えＥＧＦＲ／ＥＰＨＡ２／ＢＴＫ（Ｃａｒｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、ＩＴＫ／ＴＥＣ／ＳＲＣ／ＰＤＧＦＲ－β／ＴＸＫ／ＦＬＴ３／ＶＥＧＦＲ２／ＲＥＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）及びＨＥＲ２（ａａ６７６－１２５５、昆虫発現系から精製された組換えタンパク質）に対して化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を、製造者の指示に従ってＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ製のＨＴＲＦ ＫｉｎＥＡＳＥ－ＴＫアッセイで分析した。キナーゼ、ｋＭ濃度のＡＴＰ、ビオチン化ペプチド基質（６１ＴＫ０ＢＬＣ、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）及び化合物１のセスキマレイン酸の結晶形Ａ＊を含む反応混合物中でアッセイを行った。このキナーゼを化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊と室温で１時間又は２時間（ＥＧＦＲについて）インキュベートし、反応をＡＴＰ及び基質の添加によって開始した。反応後、停止／検出溶液を製造者の指示に従って添加した。停止／検出溶液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、４００ｍＭのＫＦ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＢＳＡ及び０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中に、Ｅｕ３＋クリプテート結合抗ホスホチロシン抗体（６１Ｔ６６ｋＬＢ、ＣｉｓＢｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）及びストレプトアビジン－ＸＬ６６５（６１０ＳＡＸＬＢ、ＣｉｓＢｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を含有した。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（３３７ｎｍ波長での励起における６６５ｎｍでの蛍光発光と６２０ｎｍでの発光との比）は、１時間のインキュベーション後にＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で記録した。ビオチン化ペプチド基質のリン酸化により、Ｅｕ＋クリプテート結合抗ホスホチロシン抗体とストレプトアビジン－ＸＬ６６５の両方がビオチン化ペプチドに結合した。ドナー（Ｅｕ＋クリプテート）及びアクセプター（ＸＬ６６５）のフルオロフォアの近接は、ドナーフルオロフォア（６２０ｎｍ）からアクセプターフルオロフォア（６６５ｎｍ）への高度の蛍光共鳴エネルギー移動をもたらした。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊のＩＣ５０は、グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアによって用量応答％阻害データを４パラメータロジスティックモデルに適合させることにより得られた。
組換えＥＧＦＲ／ＥＰＨＡ２／ＢＴＫ（Ｃａｒｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、ＩＴＫ／ＴＥＣ／ＳＲＣ／ＰＤＧＦＲ－β／ＴＸＫ／ＦＬＴ３／ＶＥＧＦＲ２／ＲＥＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）及びＨＥＲ２（ａａ６７６－１２５５、昆虫発現系から精製された組換えタンパク質）に対して化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を、製造者の指示に従ってＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ製のＨＴＲＦ ＫｉｎＥＡＳＥ－ＴＫアッセイで分析した。キナーゼ、ｋＭ濃度のＡＴＰ、ビオチン化ペプチド基質（６１ＴＫ０ＢＬＣ、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）及び化合物１のセスキマレイン酸の結晶形Ａ＊を含む反応混合物中でアッセイを行った。このキナーゼを化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊と室温で１時間又は２時間（ＥＧＦＲについて）インキュベートし、反応をＡＴＰ及び基質の添加によって開始した。反応後、停止／検出溶液を製造者の指示に従って添加した。停止／検出溶液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、４００ｍＭのＫＦ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＢＳＡ及び０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中に、Ｅｕ３＋クリプテート結合抗ホスホチロシン抗体（６１Ｔ６６ｋＬＢ、ＣｉｓＢｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）及びストレプトアビジン－ＸＬ６６５（６１０ＳＡＸＬＢ、ＣｉｓＢｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を含有した。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（３３７ｎｍ波長での励起における６６５ｎｍでの蛍光発光と６２０ｎｍでの発光との比）は、１時間のインキュベーション後にＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で記録した。ビオチン化ペプチド基質のリン酸化により、Ｅｕ＋クリプテート結合抗ホスホチロシン抗体とストレプトアビジン－ＸＬ６６５の両方がビオチン化ペプチドに結合した。ドナー（Ｅｕ＋クリプテート）及びアクセプター（ＸＬ６６５）のフルオロフォアの近接は、ドナーフルオロフォア（６２０ｎｍ）からアクセプターフルオロフォア（６６５ｎｍ）への高度の蛍光共鳴エネルギー移動をもたらした。化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊のＩＣ５０は、グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアによって用量応答％阻害データを４パラメータロジスティックモデルに適合させることにより得られた。
【0173】
結果：
化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、Ｖ６００Ｅ突然変異体Ｂ－ＲＡＦ、野生型Ｂ－ＲＡＦ及びＣ－ＲＡＦ酵素の強力で可逆的な阻害剤である。さらに、これまでに試験された以下のキナーゼのうち、化合物１のセスキマレイン酸塩は、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＰＤＧＦＲ－β、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ２及びＲＥＴを強力に阻害し、ＨＥＲ２、ＳＲＣ及びＴＸＫに対する弱い阻害を有し、ＢＴＫ、ＩＴＫ及びＴＥＣに対する阻害を有さない。化合物１のセスキマレイン酸塩が阻害するこれらのキナーゼの多くは、抗癌療法の潜在的標的として同定されており、広範囲の腫瘍に対する化合物１セスキマレイン酸塩の潜在的な効力及び潜在的な適用性を高める可能性がある。
化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、Ｖ６００Ｅ突然変異体Ｂ－ＲＡＦ、野生型Ｂ－ＲＡＦ及びＣ－ＲＡＦ酵素の強力で可逆的な阻害剤である。さらに、これまでに試験された以下のキナーゼのうち、化合物１のセスキマレイン酸塩は、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＰＤＧＦＲ－β、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ２及びＲＥＴを強力に阻害し、ＨＥＲ２、ＳＲＣ及びＴＸＫに対する弱い阻害を有し、ＢＴＫ、ＩＴＫ及びＴＥＣに対する阻害を有さない。化合物１のセスキマレイン酸塩が阻害するこれらのキナーゼの多くは、抗癌療法の潜在的標的として同定されており、広範囲の腫瘍に対する化合物１セスキマレイン酸塩の潜在的な効力及び潜在的な適用性を高める可能性がある。
【表18】
【0174】
試験２：化合物１のセスキマレイン酸塩（試験した結晶形Ａ＊）によるヒト腫瘍細胞株のインビトロ増殖阻害
方法：
Ａ３７５、Ｓｋ－Ｍｅｌ－２８、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５、Ａ４３１及びＨＣＣ８２７細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。細胞アッセイで用いたすべての細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ユニット／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で補充された指定培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿された３７℃の環境下で培養した。購入した元の細胞から３継代以内の凍結保存されたストックから細胞株を回収し、３０回以上は継代しなかった。
方法：
Ａ３７５、Ｓｋ－Ｍｅｌ－２８、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ２０５、Ａ４３１及びＨＣＣ８２７細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。細胞アッセイで用いたすべての細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ユニット／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で補充された指定培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿された３７℃の環境下で培養した。購入した元の細胞から３継代以内の凍結保存されたストックから細胞株を回収し、３０回以上は継代しなかった。
【0175】
ＴＲ－ＦＲＥＴに基づく方法を用いて、細胞のホスホ－ＥＲＫ及びホスホ－ＥＧＦＲを測定した。９６ウェルプレートのウェルあたり３×１０４個の細胞を播種し、１６時間放置して付着させた。増殖培地を、血清を含まない培地１００μＬと交換した。細胞を化合物の１０点滴定で処理した。１時間の化合物処理の後、５０μＬの溶解緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）を各ウェルに添加した。プレートを３０分間振とうしながら室温でインキュベートした。９６ウェルプレートの各ウェルからの合計１６μＬの細胞溶解物を、３８４ウェルの小容量の白色プレートに移した。各ウェルからの溶解産物を、２μＬのＥｕ３＋又はＴｂ３＋クリプテート（ドナー）標識された抗ＥＲＫ又は抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び２μＬのＤ２（アクセプター）標識された抗ホスホＥＲＫ又は抗ホスホＥＧＦＲ抗体（Ｃｉｓｂｉｏ）と共に室温で２時間インキュベートした。ＦＲＥＴシグナルは、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いてＥＲＫ又はＥＧＦＲリン酸化のＩＣ５０値を決した。
【0176】
メラノーマ、結腸癌、乳癌及び肺癌の細胞のパネルにおける化合物の増殖阻害活性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。３日間の処理期間にわたる対数増殖を確実にするために、９６ウェルプレートの１ウェルあたり播種した細胞の数を各細胞株について最適化した。細胞を１６時間付着させたままにし、次いで１０点希釈を二重の系列で処理した。化合物への３日間の暴露後、各ウェルに存在する細胞培養培地の容量に等しい量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を添加した。混合物をオービタルシェーカー上に２分間置いて細胞を溶解させ、続いて室温で１０分間インキュベートして発光シグナルの発生及び安定化を可能にした。発光シグナルは、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて測定した。グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いて、細胞生存度のＥＣ５０値を決定した。
【0177】
結果：
細胞アッセイは、化合物１のセスキマレイン酸塩がＲＡＦの下流の多数の直接的なシグナル伝達中間体を阻害することを確認した。例えば、化合物１のセスキマレイン酸塩は、Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異誘発メラノーマＡ３７５及びＳｋ－Ｍｅｌ－２８細胞において、３２及び７７ｎＭのＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害した。それはまた、Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異誘発ＨＴ２９及びＣｏｌｏ２０５結腸直腸癌細胞において、１０３及び５３ｎＭのＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害する。さらに、化合物１のセスキマレイン酸塩は、ＥＧＦＲ過剰発現Ａ４３１及びＥＧＦＲ突然変異ＨＣＣ８２７肺癌細胞株において、３８５及び１６１ｎＭのＩＣ５０でＥＧＦＲリン酸化を阻害する。化合物１のセスキマレイン酸塩は、癌細胞株のパネルにおいてその抗増殖活性について評価されている。それはＢ－ＲＡＦ突然変異を有する多数の細胞系に対して抗増殖活性を示した（表１９）。
細胞アッセイは、化合物１のセスキマレイン酸塩がＲＡＦの下流の多数の直接的なシグナル伝達中間体を阻害することを確認した。例えば、化合物１のセスキマレイン酸塩は、Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異誘発メラノーマＡ３７５及びＳｋ－Ｍｅｌ－２８細胞において、３２及び７７ｎＭのＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害した。それはまた、Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異誘発ＨＴ２９及びＣｏｌｏ２０５結腸直腸癌細胞において、１０３及び５３ｎＭのＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害する。さらに、化合物１のセスキマレイン酸塩は、ＥＧＦＲ過剰発現Ａ４３１及びＥＧＦＲ突然変異ＨＣＣ８２７肺癌細胞株において、３８５及び１６１ｎＭのＩＣ５０でＥＧＦＲリン酸化を阻害する。化合物１のセスキマレイン酸塩は、癌細胞株のパネルにおいてその抗増殖活性について評価されている。それはＢ－ＲＡＦ突然変異を有する多数の細胞系に対して抗増殖活性を示した（表１９）。
【表19】
【0178】
試験３：化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の生体内薬理学
腫瘍移植方法：
ヒト癌細胞をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの右腋窩部に皮下接種して腫瘍異種移植片を作製した。移植の日に、細胞培養培地を新しい培地と交換した。３時間後、培地を除去し、細胞を回収し、接種前に冷却した（４℃）ＰＢＳで再懸濁した。各マウスの右腋窩領域を細胞接種の前に７０％エタノールで洗浄した。各動物には、２６ゲージの針を介して右前腹部に２００μｌの細胞懸濁液中の所望の細胞を皮下注射した。移植後、キャリパーを用いて、腫瘍体積を二次元で週に２回測定した。腫瘍体積は、式：Ｖ＝０．５×（ａ×ｂ２）を用いて計算した。ここで、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。
腫瘍移植方法：
ヒト癌細胞をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの右腋窩部に皮下接種して腫瘍異種移植片を作製した。移植の日に、細胞培養培地を新しい培地と交換した。３時間後、培地を除去し、細胞を回収し、接種前に冷却した（４℃）ＰＢＳで再懸濁した。各マウスの右腋窩領域を細胞接種の前に７０％エタノールで洗浄した。各動物には、２６ゲージの針を介して右前腹部に２００μｌの細胞懸濁液中の所望の細胞を皮下注射した。移植後、キャリパーを用いて、腫瘍体積を二次元で週に２回測定した。腫瘍体積は、式：Ｖ＝０．５×（ａ×ｂ２）を用いて計算した。ここで、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。
【0179】
インビボでの有効性試験のために、平均腫瘍サイズが１００～２００ｍｍ３に達したとき、層別無作為化手順を用いて、グループ当たり６～１０匹のマウスで所望の数のグループに動物を割り当てた。これらのグループは、コントロールグループ（薬物治療なし）及び異なる用量レベル（１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲）の化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の治療のグループからなっていた。全ての用量は遊離塩基重量に基づいた。薬物は、１日１回（ｑｄ）又は２回（ｂｉｄ）経口胃管投与によって毎日投与した。投薬頻度は、腫瘍増殖の個々の症例に依存した。処置は、１０ｍＬ／ｋｇ体重の容量で経口胃管投与（ｐ．ｏ．）によって投与した。体重を投与直前に評価し、投与量をそれに応じて調整した。個体の体重及び腫瘍体積を毎週２回測定し、研究期間中の毒性の臨床徴候についてマウスを毎日モニターした。マウスの腫瘍体積が２０００ｍｍ３以上に達したとき、腫瘍が潰瘍化したとき、又は体重減少が２０％を超えたときに、二酸化炭素を用いてマウスを安楽死させた。すべてのグループデータを、ｔ検定を用いて分析した。ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意であると考えられた。
【0180】
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を、以下の式を用いて計算した：
ｔｒｅａｔｅｄ ｔ＝時間ｔで処置した腫瘍の体積
ｔｒｅａｔｅｄ ｔ０＝時間０で治療された腫瘍の体積
ｐｌａｃｅｂｏ ｔ＝時間ｔにおけるプラセボの腫瘍の体積
ｐｌａｃｅｂｏ ｔ０＝時間０におけるプラセボの腫瘍の体積
【数1】
ｔｒｅａｔｅｄ ｔ０＝時間０で治療された腫瘍の体積
ｐｌａｃｅｂｏ ｔ＝時間ｔにおけるプラセボの腫瘍の体積
ｐｌａｃｅｂｏ ｔ０＝時間０におけるプラセボの腫瘍の体積
【0181】
ＰＤ試験の場合、平均腫瘍サイズが１４０～９００ｍｍ３に達したとき、層別無作為化手順を用いて、グループあたり４匹のマウスで所望の数のグループに動物を割り当てた。これらのグループは、コントロールグループ（薬物治療なし）及び異なる用量レベル（１～２０ｍｇ／ｋｇの範囲）の化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の治療のグループからなっていた。全ての用量は遊離塩基重量に基づいた。薬物は、１日１回（ｑｄ）又は２回（ｂｉｄ）で毎日経口胃管投与した。全ての処置は、１０ｍＬ／ｋｇ体重の容量で経口胃管投与（ｐ．ｏ．）によって投与した。体重を投与直前に評価し、投与量をそれに応じて調整した。マウスは、投与後の所望の時点で二酸化炭素を用いて安楽死させた。腫瘍組織を安楽死させた直後に切開し、液体窒素を用いてＭＰビーズで予め満たしたチューブにスナップ凍結し、ｐ－ＥＲＫアッセイの前に－８０℃で保存した。５００μＬの完全溶解緩衝液を、ＭＰビーズを用いて凍結した腫瘍に添加した。腫瘍組織の均質化をＭＰホモジナイゼーション装置で行い、溶解物を４℃で１３，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンして不溶性物質を除去した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ｐ－ＥＲＫ１／２アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によりリン酸化されたＥＲＫ１／２レベルを測定するために、２μｇのタンパク質溶解物を使用した。
【0182】
結果：
化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅに対する強力なキナーゼ阻害活性、細胞ベースのアッセイにおける抗増殖活性及び異種移植モデルにおける抗腫瘍活性を有する。化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、ヌードマウスのヒトＡ３７５メラノーマ（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＬＯＸメラノーマ（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、Ｃｏｌｏ２０５結腸直腸癌（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＨＴ２９結腸直腸癌（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＷｉＤｒ結腸直腸癌（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＨＣＣ８２７肺癌（ＥＧＦＲ突然変異）及びＡ４３１類表皮癌（ＥＧＦＲ過剰発現）の異種移植片に対する顕著な抗腫瘍活性を有する。さらに、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、ドセタキセル又はＭＥＫ阻害剤、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）と組み合わせた場合、ヒトＣａｌｕ－６肺腺癌（Ｋ－ＲＡＳ突然変異）腫瘍において顕著な抗腫瘍活性を示した。
化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅに対する強力なキナーゼ阻害活性、細胞ベースのアッセイにおける抗増殖活性及び異種移植モデルにおける抗腫瘍活性を有する。化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、ヌードマウスのヒトＡ３７５メラノーマ（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＬＯＸメラノーマ（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、Ｃｏｌｏ２０５結腸直腸癌（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＨＴ２９結腸直腸癌（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＷｉＤｒ結腸直腸癌（Ｂ－ＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異）、ＨＣＣ８２７肺癌（ＥＧＦＲ突然変異）及びＡ４３１類表皮癌（ＥＧＦＲ過剰発現）の異種移植片に対する顕著な抗腫瘍活性を有する。さらに、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、ドセタキセル又はＭＥＫ阻害剤、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）と組み合わせた場合、ヒトＣａｌｕ－６肺腺癌（Ｋ－ＲＡＳ突然変異）腫瘍において顕著な抗腫瘍活性を示した。
【0183】
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の経口投与は、マウスのＡ３７５異種移植片におけるＥＲＫ１／２リン酸化の時間依存性及び用量依存性の阻害をもたらした。腫瘍組織におけるｐ－ＥＲＫレベルの阻害は、化合物１の血漿及び腫瘍薬物の濃度とよく相関する。さらに、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）及びＭＥＫ阻害剤ＡＺＤ６２４４は、Ｃａｌｕ－６ Ｋ－ＲＡＳ変異型非小細胞肺腺癌の異種移植モデルにおけるｐ－ＥＲＫの阻害に対して強い相乗効果を示した。
【0184】
試験５：化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）の毒性学
化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）の前臨床安全性の評価のために、ラット及びイヌにおける２８日間のＧＬＰ試験並びにいくつかの治験研究を含む包括的な非臨床毒性試験プログラムを実施した。これらの研究は、抗癌剤の前臨床開発のための利用可能な規制ガイダンスを考慮した。これらの研究において、化合物１のセスキマレイン酸塩は、好ましい毒性学及び安全性薬理学のプロフィールを示した。安全性の薬理試験結果は、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、呼吸、血圧及び循環機能に影響を与えず、自律神経系活動又は中枢神経系に影響を及ぼさないことを示した。追加の毒性試験の結果は、催奇性、突然変異誘発性及び生殖毒性を示さなかった。
化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）の前臨床安全性の評価のために、ラット及びイヌにおける２８日間のＧＬＰ試験並びにいくつかの治験研究を含む包括的な非臨床毒性試験プログラムを実施した。これらの研究は、抗癌剤の前臨床開発のための利用可能な規制ガイダンスを考慮した。これらの研究において、化合物１のセスキマレイン酸塩は、好ましい毒性学及び安全性薬理学のプロフィールを示した。安全性の薬理試験結果は、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）は、呼吸、血圧及び循環機能に影響を与えず、自律神経系活動又は中枢神経系に影響を及ぼさないことを示した。追加の毒性試験の結果は、催奇性、突然変異誘発性及び生殖毒性を示さなかった。
【0185】
試験６：化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）の薬物動態学
完全に検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法は、以下の単回投与及び複数回投与後のＳＤラット並びにビーグル犬の、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の薬物動態学（Ｋ）試験によく用いられた。
完全に検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法は、以下の単回投与及び複数回投与後のＳＤラット並びにビーグル犬の、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊の薬物動態学（Ｋ）試験によく用いられた。
【0186】
化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊は、ラット（５１％～１０２％）及びイヌ（４１％～８２％）の両方において高い経口生物学的利用能を有する。その排泄半減期は、経口投与後にラットで４．４～９．４時間、犬で３．３～４．９時間の範囲であった。
【0187】
動態は、ラットで０．５～１５ｍｇ／ｋｇ、イヌで１．５～１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって線形であった。複数回投与した後、ラットでわずかな蓄積（約２倍）が観察された。このわずかな蓄積は、雌ラットでは統計的に有意であったが、雄ラットでは有意ではなかった。犬で複数回投与しても蓄積は認められなかった。
【0188】
試験７：化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）のＡＤＭＥ
化合物１は様々な組織に広く分布していたが、脳組織は低かった。これは、薬物が血液脳関門を容易に横切らないことを示している。ＣＹＰ２Ｃ８（ＩＣ５０＝１．０３μＭ）及びＣＹＰ２Ｃ１９（ＩＣ５０＝１．９６μＭ）の弱い阻害を除いて、ラット肝臓におけるＰ４５０酵素に対する顕著な誘発効果は見出されず、化合物１のセスキマレイン酸酸について薬物代謝酵素に対する阻害活性は見出されなかった。ＣＹＰ３Ａは、化合物１の代謝に関与する主要なＣＹＰアイソフォームであったが、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９及びＣＹＰ２Ｄ６は、化合物１の代謝にあまり寄与しなかった。
化合物１は様々な組織に広く分布していたが、脳組織は低かった。これは、薬物が血液脳関門を容易に横切らないことを示している。ＣＹＰ２Ｃ８（ＩＣ５０＝１．０３μＭ）及びＣＹＰ２Ｃ１９（ＩＣ５０＝１．９６μＭ）の弱い阻害を除いて、ラット肝臓におけるＰ４５０酵素に対する顕著な誘発効果は見出されず、化合物１のセスキマレイン酸酸について薬物代謝酵素に対する阻害活性は見出されなかった。ＣＹＰ３Ａは、化合物１の代謝に関与する主要なＣＹＰアイソフォームであったが、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９及びＣＹＰ２Ｄ６は、化合物１の代謝にあまり寄与しなかった。
【0189】
試験８：化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊と遊離塩基の薬物動態比較
薬物及び試薬：Ｄ９０＝４．１μｍ、Ｄ１０＝１．５μｍ、Ｄ５０＝２．４μｍの粒径を有する化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊。原料含量（純度）は９８．０％以上であった。
薬物及び試薬：Ｄ９０＝４．１μｍ、Ｄ１０＝１．５μｍ、Ｄ５０＝２．４μｍの粒径を有する化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊。原料含量（純度）は９８．０％以上であった。
【0190】
実験動物：雄及び雌のビーグル犬。
【0191】
製薬製剤：各物質の適切な量を量り、（化合物１の遊離塩基については）０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム、又は（化合物１のセスキマレイン酸塩については）０．５％メチルセルロース溶液に分散する。化合物１の所望の濃度で懸濁液を調製する。この試験では、化合物１のすべての用量及び濃度を遊離塩基で計算した。
【0192】
投与及び試料採取：投与溶液は、投与前に新たに調製される。実際の体重及び注入された実際の容積はそれに応じて記録される。イヌを一晩絶食させ、投薬の４時間後に食物を摂取させた。各懸濁液を０．５～１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でイヌに経口投与した。血液サンプル（約１．０ｍＬ）を、投与前及び投与後３６時間までの様々な時間に、頭部静脈叢を介して収集する。全血は遠心分離によって処理され、血漿試料は収集され、分析前に冷凍庫に保存される。血漿サンプルをタンパク質沈殿によって処理した。血漿サンプル中の化合物１の濃度を、有効な液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法を用いて決定した。血漿濃度－時間データを、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを使用した非コンパートメントモデルを用いて分析した。
【表20】
【0193】
上記実験は、化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊のＣｍａｘ（ｎｇ／ｍＬ）及びＡＵＣ０－ｉｎｆ（ｎｇ・ｈ／ｍＬ）が遊離塩基形の約２～３倍であることを示した。したがって、化合物１の結晶形態Ａ＊は、化合物１（非晶質形）の遊離塩基よりも有意に優れた相対的な生物学的利用能を有する。
【0194】
試験９：臨床試験
カプセルを調製するために化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を用いて、５、１０、２０、３０、４０及び５０ｍｇの単回用量を投与された２５人の被験者について、第Ｉ相臨床安全性試験を完了した。その結果、５～５０ｍｇの単回投与は安全で耐容性が高いことが示された。化合物１の処置は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅメラノーマ患者における部分的応答、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ＰＴＣ患者における部分的応答及びＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ＣＲＣ患者におけるいくつかの抗腫瘍活性をもたらした。１６人のＫＲＡＳ癌患者も募集され、治療され、３人のＰＲと少なくとも１２人の患者が２．２ヶ月以上生き延びた（治療を受けていないＫＲＡＳ癌患者について報告された平均ＰＦＳは、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、５、１９、２０１４参照）。これらの予備的データは、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）がＢｒａｆ及びＫ－ｒａｓ突然変異癌の治療に有効であることを実証した。
カプセルを調製するために化合物１のセスキマレイン酸塩の結晶形Ａ＊を用いて、５、１０、２０、３０、４０及び５０ｍｇの単回用量を投与された２５人の被験者について、第Ｉ相臨床安全性試験を完了した。その結果、５～５０ｍｇの単回投与は安全で耐容性が高いことが示された。化合物１の処置は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅメラノーマ患者における部分的応答、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ＰＴＣ患者における部分的応答及びＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ＣＲＣ患者におけるいくつかの抗腫瘍活性をもたらした。１６人のＫＲＡＳ癌患者も募集され、治療され、３人のＰＲと少なくとも１２人の患者が２．２ヶ月以上生き延びた（治療を受けていないＫＲＡＳ癌患者について報告された平均ＰＦＳは、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、５、１９、２０１４参照）。これらの予備的データは、化合物１のセスキマレイン酸塩（結晶形Ａ＊）がＢｒａｆ及びＫ－ｒａｓ突然変異癌の治療に有効であることを実証した。
【0195】
特定の実施形態の前述の実施例及び説明は、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するのではなく、例示として取られるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく、上述した特徴の多くの変形及び組み合わせを利用することができる。このような全ての変形は、本発明の範囲内に含まれるものとする。引用された全ての参考文献は、その全体が引用により本願に組み込まれる。
【0196】
いずれかの先行技術文献が本願で言及されている場合、そのような参考文献は、その刊行物がいずれかの国の当業界における一般的な知識の一部をなすことを認めるものではないことを理解されたい。
【0197】
以下の特許請求の範囲及び本発明の前述の説明において、文脈が明示的な言語又は必要な意味のために必要とする場合を除いて、「含む」という言葉、又は「備える」もしくは「包含する」などの変形は、包括的な意味で使用される。すなわち、記載された特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除するものではない。
【0198】
本願において識別引用によって引用される全ての刊行物、特許、特許出願及び公開特許出願の開示は、その全体が引用により本願に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】