(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-27
(45)【発行日】2023-08-04
(54)【発明の名称】ｉＰＳ細胞の選定方法、ｉＰＳ細胞の作製方法、及び制御装置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230728BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230728BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20230728BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20230728BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12M1/34 B
G01N21/64 F
C12Q1/02
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021503381
(86)(22)【出願日】2019-03-07
(86)【国際出願番号】 JP2019009194
(87)【国際公開番号】W WO2020179071
(87)【国際公開日】2020-09-10
【審査請求日】2021-09-01
(73)【特許権者】
【識別番号】000000376
【氏名又は名称】オリンパス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002147
【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】秋吉 竜太郎
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０２１４７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０９２３２１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｍ １／３４
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
Ｃ１２Ｑ １／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、１．７２×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の組み合わせからなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、３．５９×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定する
ｉＰＳ細胞の選定方法。
【請求項2】
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、９．７９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｏｃｔ４からなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、５．９３×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定する
ｉＰＳ細胞の選定方法。
【請求項3】
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、５．６８ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｏｃｔ４からなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、７．２５×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定する
ｉＰＳ細胞の選定方法。
【請求項4】
前記初期化因子を含む細胞を撮像した撮像画像において、前記細胞の集団を形成する外形の重心位置を含む所定の領域の輝度情報を用いて前記光子数を算出する請求項１～３のいずれか一つに記載のｉＰＳ細胞の選定方法。
【請求項5】
前記判定は、前記第１及び第２の閾値に応じて設定される、複数の、良好なｉＰＳ細胞の選定確率の高い順に分類する請求項１～３のいずれか一つに記載のｉＰＳ細胞の選定方法。
【請求項6】
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、１．７２×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の組み合わせからなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、３．５９×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定し、
選定した細胞を、予め設定されている回数まで、新たな培養容器への植え継ぎを繰り返す
ｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項7】
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、９．７９×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｏｃｔ４からなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、５．９３×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定し、
選定した細胞を、予め設定されている回数まで、新たな培養容器への植え継ぎを繰り返す
ｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項8】
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、５．６８ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｏｃｔ４からなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、７．２５×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定し、
選定した細胞を、予め設定されている回数まで、新たな培養容器への植え継ぎを繰り返す
ｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項9】
前記細胞の選定処理は、初回の培養容器への植え継ぎ前に実施される請求項６～８のいずれか一つに記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項10】
予め設定されている回数の植え継ぎ後に、前記細胞の選定処理を実施する請求項６～８のいずれか一つに記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項11】
前記細胞の選定処理は、同一の培養期間内の異なる時刻、又は、異なる植え継ぎ期間同士での各時刻で実施される請求項６～８のいずれか一つに記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項12】
初回の培養容器への植え継ぎ前の特定時刻に取得された発光量と、該特定時刻と異なる後続の時刻に取得された発光量を取得し、後続の発光量を前記初回に取得した発光量からの減衰分を補正した補正発光量を用いて選定を行う請求項１１に記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項13】
前記細胞を植え継ぐ前に当該細胞の第１の撮像画像を取得し、前記細胞を、新たな培養容器に植え継いだ後の当該細胞の第２の撮像画像を取得し、
前記第１の撮像画像に写る前記細胞と、前記第２の撮像画像に写る前記細胞とを同定する
請求項６～８のいずれか一つに記載のｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項14】
プロセッサを含む制御装置であって、前記プロセッサは、
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の単位面積当たりの光子数または単位時間当たりの光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、１．７２×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の組み合わせからなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、３．５９×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定する
制御装置。
【請求項15】
プロセッサを含む制御装置であって、
前記プロセッサは、
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、９．７９×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｏｃｔ４からなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、５．９３×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定する
制御装置。
【請求項16】
プロセッサを含む制御装置であって、
前記プロセッサは、
互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の光子数を取得し、
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の組み合わせからなる第１の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、５．６８ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第１の閾値を超えているか否かを判定し、
Ｏｃｔ４からなる第２の組について取得した発光遺伝子の単位面積当たりの前記光子数又は単位時間当たりの前記光子数が、７．２５×１０ -1 ｐｈｏｔｏｎ／μｍ 2 ／ｓｅｃに設定されている第２の閾値を超えているか否かを判定し、
各組の発光遺伝子の前記光子数が、前記第１及び第２の閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定する
制御装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｉＰＳ細胞の選定方法、及びｉＰＳ細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞は、山中因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ）に代表される初期化に必要な複数の遺伝子（初期化因子）を細胞に送り込んだ後、所定の培養期間を経て誘導される。細胞の初期化をもたらす過程はリプログラミング過程と呼ばれる。リプログラミング過程におけるｉＰＳ細胞の選定が良質なｉＰＳ細胞を選定するうえで重要である。良質なｉＰＳ細胞を効率よく選定できれば、その後の再生医療のための各種臓器等への分化も良好に進むと期待されている。
【0003】
ここで、リプログラミング過程において、山中因子と同じ発現量になる発光遺伝子（発光タンパク質）の発光量を時系列に解析し、因子ごとの発現パターンの時系列での変動パターンの違いを数値化することで、良好な形状を有するコロニーの形態の中から客観的に判断してｉＰＳ細胞を選定する技術が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【0004】
また、リプログラミング過程において、細胞へ送り込む山中因子の最適量を解析し、ｉＰＳ細胞を良好に成長させる技術が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２０１８／０９２３２１号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Stoichiometric and temporal requirements of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc expression for efficient human iPSC induction and differentiation. PNAS, 2009, Vol.106, No.31, pp12759-12764
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ところで、ｉＰＳ細胞としての性質が良好であったとしても、その後の再生医療に利用する際に、必ずしも良好な分化が進まない場合があるため、良質なｉＰＳ細胞をできるだけ多く選定できることが望ましい。
ところが、リプログラミング過程における発現パターンは、初期化因子ごとに多種多様に変動するため、最終的に良好であると判定されるｉＰＳ細胞と合致する発現パターンに一致するか類似度の高いｉＰＳ細胞を多数得ることは難しい。
また、コロニーの形態に基づいてｉＰＳ細胞を選定する場合、形態そのものが多様であるため、熟練者が判断した膨大な画像データを教師データとして用いる必要がある。さらに、形態的に良好と判定されるコロニー（例えば外縁の形状が丸みを帯び、かつ一定の面積を有するコロニー）であっても、必ずしも最終的に良好なｉＰＳ細胞であると判定されるとは限らない。
ところが、リプログラミング過程における発現パターンは、初期化因子ごとに多種多様に変動するため、最終的に良好であると判定されるｉＰＳ細胞と合致する発現パターンに一致するか類似度の高いｉＰＳ細胞を多数得ることは難しい。
また、コロニーの形態に基づいてｉＰＳ細胞を選定する場合、形態そのものが多様であるため、熟練者が判断した膨大な画像データを教師データとして用いる必要がある。さらに、形態的に良好と判定されるコロニー（例えば外縁の形状が丸みを帯び、かつ一定の面積を有するコロニー）であっても、必ずしも最終的に良好なｉＰＳ細胞であると判定されるとは限らない。
【0008】
本発明は、上記に鑑みて為されたものであって、高効率でかつ正確に良好であるｉＰＳ細胞を選定することができるｉＰＳ細胞の選定方法、及びｉＰＳ細胞の作製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係るｉＰＳ細胞の選定方法は、互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の発光量を取得し、取得した各発光遺伝子の発光量が、各々に対して予め設定されている閾値をそれぞれ超えているか否かを判定し、各発光遺伝子の発光量が、各々に対して予め設定されている閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定することを特徴とする。
【0010】
また、上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係るｉＰＳ細胞の作製方法は、互いに異なる発光遺伝子によって標識された複数組の初期化因子を含む細胞を培養するリプログラミング過程において、当該細胞の各発光遺伝子の発光量を取得し、取得した各発光遺伝子の発光量が、各々に対して予め設定されている閾値をそれぞれ超えているか否かを判定し、各発光遺伝子の発光量が、各々に対して予め設定されている閾値をそれぞれ超えている場合に、当該細胞を次の処理の対象細胞に選定し、選定した細胞を、予め設定されている回数まで、新たな培養容器への植え継ぎを繰り返すことを特徴とする。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、高効率でかつ正確に良好であるｉＰＳ細胞を選定することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施の形態に係るｉＰＳ細胞の選定方法、及びｉＰＳ細胞の作製方法について、図面を参照しながら説明する。なお、これら実施の形態によって本発明が限定されるものではない。また、各図面の記載において、同一部分には同一の符号を付して示している。
【0014】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係るｉＰＳ細胞の選定システムの全体構成の一例を示す図である。図２は、本発明の実施の形態１に係るｉＰＳ細胞の選定システムにおける情報通信端末の機能構成を示すブロック図である。本実施の形態１に係る選定システム１は、サンプルからの光を結像して取得した複数の画像をもとに、各種臓器へ分化するのに良好なｉＰＳ細胞を選定するシステムである。
図１は、本発明の実施の形態１に係るｉＰＳ細胞の選定システムの全体構成の一例を示す図である。図２は、本発明の実施の形態１に係るｉＰＳ細胞の選定システムにおける情報通信端末の機能構成を示すブロック図である。本実施の形態１に係る選定システム１は、サンプルからの光を結像して取得した複数の画像をもとに、各種臓器へ分化するのに良好なｉＰＳ細胞を選定するシステムである。
【0015】
図１に示すように、選定システム１は、サンプル２と、サンプル２を収納した容器３と、容器３を配置するステージ４と、撮像ユニット５と、情報通信端末１０と、を備える。
【0016】
サンプル２は、例えば、「体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子をコードする核酸」と「複数種類の初期化因子のうち少なくとも１種類と共に発現するように構成された発光レポータータンパク質（以下、発光タンパク質ともいう）をコードする核酸」とが導入された細胞である。具体的に、サンプル２は、体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－ｍｙｃ、ＬＩＮ２８などの転写因子）をコードする核酸と、互いに異なる波長帯域の光を発する複数種類の発光タンパク質をコードする核酸とが導入され、初期化因子と発光遺伝子との融合タンパク質を発現するような遺伝子群（コンストラクト）を含む体細胞である。
本明細書において、核酸は、遺伝子と同じ意味を有し、例えばＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）である。発光遺伝子によって発光レポータータンパク質が発現し、発現した発光レポータータンパク質によって発光物質を発光させる。
本明細書において、核酸は、遺伝子と同じ意味を有し、例えばＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）である。発光遺伝子によって発光レポータータンパク質が発現し、発現した発光レポータータンパク質によって発光物質を発光させる。
【0017】
また、体細胞は、例えば、ヒト末梢血単核球細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell：ＰＢＭＣ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とは、宿主の染色体に組み込まれずに持続的に発現する形態で体細胞に導入されることが好ましい。例えば、初期化因子をコードする核酸、及び、発光タンパク質をコードする核酸は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入される。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているものであってもよいし、市販のエピソーマルベクターに、発光タンパク質をコードする核酸を組み込んだ改変ベクターであってもよい。市販のエピソーマルベクターとしては、例えば、ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とは、宿主の染色体に組み込まれずに持続的に発現する形態で体細胞に導入されることが好ましい。例えば、初期化因子をコードする核酸、及び、発光タンパク質をコードする核酸は、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入される。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているものであってもよいし、市販のエピソーマルベクターに、発光タンパク質をコードする核酸を組み込んだ改変ベクターであってもよい。市販のエピソーマルベクターとしては、例えば、ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
【0018】
複数種の初期化因子をコードする核酸は、各々個別のベクターに組み込まれてもよいし、一つのベクターに組み込まれていてもよい。この核酸を一つのベクターに組み込む場合、例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列などを経てポリシストロニックに連結して挿入することが好ましい。一例として、一つのベクターに１種類、又は２Ａ配列を経て組み込まれる２種類の初期化因子をコードする核酸を組み込んでなるベクターを複数種作製し、それらを混合してｉＰＳ細胞の誘導に必要なすべての初期化因子をコードする核酸を体細胞に導入する。なお、遺伝子導入の操作は、既知の方法によって行うことができる。
初期化因子をコードする核酸、及び、発光タンパク質をコードする核酸に加えて、リプログラミング効率を高める追加の因子をコードする核酸を体細胞に導入してもよい。リプログラミング効率を高める追加の因子としては、リプログラミング効率を高めることが知られている因子、例えば、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３、ＥＢＮＡ１を用いることができる。リプログラミング効率を高める追加の因子は、例えば、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入される。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているもの、例えば、ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
初期化因子をコードする核酸、及び、発光タンパク質をコードする核酸に加えて、リプログラミング効率を高める追加の因子をコードする核酸を体細胞に導入してもよい。リプログラミング効率を高める追加の因子としては、リプログラミング効率を高めることが知られている因子、例えば、ドミナントネガティブ変異を導入したマウスｐ５３、ＥＢＮＡ１を用いることができる。リプログラミング効率を高める追加の因子は、例えば、エピソーマルベクターの形態で体細胞に導入される。この場合、エピソーマルベクターは、市販されているもの、例えば、ｐＣＥ－ｍｐ５３ＤＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。
【0019】
体細胞のリプログラミングに必要な複数種類の初期化因子としては、例えば、上述したＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－ｍｙｃ、ＬＩＮ２８からなる転写因子群から二つ以上選択される複数の転写因子を用いることができる。体細胞のリプログラミングに必要な初期化因子の数は、例えば３～６種類である。例えば、初期化因子として、Ｋｌｆ４をコードする核酸と、Ｓｏｘ２をコードする核酸とを含むベクター、Ｌ－ｍｙｃをコードする核酸と、ＬＩＮ２８をコードする核酸とを含むベクター、Ｏｃｔ３／４をコードする核酸を含むベクターから構成されるベクターセットが挙げられる。本実施の形態では、転写因子群から選択した複数組の転写因子が用いられる。
【0020】
発光タンパク質をコードする核酸は、複数組の転写因子に対してそれぞれ発現する複数種類の核酸が用いられる。例えば、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列やＩＲＥＳ配列を経てポリシストロニックに転写因子をコードする核酸に連結することが好ましい。発光タンパク質をコードする核酸の配置は、転写因子と発光タンパク質とがともに発現する位置であればよく、転写因子をコードする核酸の上流であってもよいし、下流であってもよい。本実施の形態において、発光タンパク質は、互いに発光色が異なる（発光する光の波長帯域が異なる）ルシフェラーゼが用いられる。ルシフェラーゼとしては、例えば、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ、クリックビートル、ＭＡ－Ｌｕｃｉ２、ＳｆＲＥ１等を含む甲虫ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、エクオリン、カイアシルシフェラーゼ、発光エビルシフェラーゼ等を含む海洋性ルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、渦鞭毛藻ルシフェラーゼなど、各種のルシフェラーゼが用いられ得る。具体的には、ルシフェラーゼとして、例えば、緑色の発光をもたらすＥｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光をもたらすＣＲＢルシフェラーゼ、青色の発光をもたらすウミシイタケルシフェラーゼが挙げられる。特に、ホタル由来のルシフェラーゼや、クリックビートル等の甲虫由来のルシフェラーゼは、ＡＴＰ要求性であり、生物反応が失われた死細胞では光らないため、アポトーシス等で培養期間中に失活した細胞を除いた、生きた細胞を選択的に観察できる点で好ましい。
発光タンパク質は、転写因子とともに発現するため、発光タンパク質をコードする遺伝子の発現タイミング及び発現量は、初期化因子のそれらに対応しているとみなすことができる。発光タンパク質としてルシフェラーゼを用いる場合、ルシフェリンを添加して発光させる。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリン、バクテリアルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン等を用いることができる。
発光タンパク質は、転写因子とともに発現するため、発光タンパク質をコードする遺伝子の発現タイミング及び発現量は、初期化因子のそれらに対応しているとみなすことができる。発光タンパク質としてルシフェラーゼを用いる場合、ルシフェリンを添加して発光させる。ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリン、バクテリアルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン等を用いることができる。
【0021】
サンプル２（体細胞）は、培養期間を経て、初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とを発現することによって体細胞のリプログラミングが誘導され、ｉＰＳ細胞に変化する。この変化にあたっては、複数回の植え継ぎ期間に亘り、培養後の細胞集団の一部を植え継ぐ（所定の培養容器内で所定期間の培養を終えたコロニー（細胞集団）を新たな培養容器に移し替える）ことによって、段階的にリプログラミングが誘導される。「リプログラミング」とは、分化細胞が多能性幹細胞に変わる現象、又は、分化細胞を初期化することをいう。
遺伝子導入した単一の体細胞は、所定の期間培養するとコロニーと呼ばれる細胞集団に成長する。一般に、リプログラミング過程の全期間中に繰り返される植え継ぎは、コロニーごとの重心位置を含む所定の領域に位置する細胞集団をピペッティング等により分取することによって実施される。
遺伝子導入した単一の体細胞は、所定の期間培養するとコロニーと呼ばれる細胞集団に成長する。一般に、リプログラミング過程の全期間中に繰り返される植え継ぎは、コロニーごとの重心位置を含む所定の領域に位置する細胞集団をピペッティング等により分取することによって実施される。
【0022】
ここで、ｉＰＳ細胞作製のために必要とされる植え継ぎ回数は５～１０回であり、この所要回数に達するとリプログラミング過程が終了したと見做され、最後にｉＰＳ細胞としての機能を調べる試薬により合否判定される。合否判定は、細胞の分化に関する多能性を検査するための試験、例えばＰＣＲ法や免疫染色法（免染）を用いて実施される。この最終的な試験に合格したｉＰＳ細胞のみが、再生医療のための研究等の目的で使用される。
【0023】
具体的に、ｉＰＳ細胞の品質評価としては、例えば、リプログラミング状態の評価や、分化能の評価が挙げられる。
リプログラミング状態の評価としては、例えば、アルカリフォスファターゼ活性の解析や、核型解析、未分化マーカーの発現解析が挙げられる。
アルカリフォスファターゼは、多能性幹細胞で高発現するため、未分化状態のマーカーの一つである。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば、公知の手法に準じてアルカリフォスファターゼ染色を行うことによって解析できる。この解析は、アルカリフォスファターゼ染色によって、アルカリフォスファターゼ活性の有無を判定してもよいし、アルカリフォスファターゼ活性を定量化してもよい。アルカリフォスファターゼ染色は、例えば、ホルマリン固定後に、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルりん酸（ＢＣＩＰ）と、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との混合液からなる基質液を加えて、アルカリフォスファターゼ活性に伴う反応産物を検出する。
核型解析は、例えば、Ｇ－ｂａｎｄ解析によって染色体の数や構造の変化を解析することによって行われる。
未分化マーカーの発現解析は、未分化マーカー遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲや、未分化マーカータンパク質の免疫染色によって行う。未分化マーカーとしては、例えば、Ｎａｎｏｇや、Ｏｃｔ３／４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１を用いることができる。
分化能の評価は、例えば、三胚葉細胞への分化を誘導した後の、三胚葉文化マーカーの発現解析によって行われる。文化マーカーの発現解析は、分化マーカーのＲＴ－ｑＰＣＲや、分化マーカータンパク質の免疫染色によって行う。文化マーカーとしては、例えば、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６、ＭＡＰ２）、中胚葉マーカー（α－ＳＭＡ、Ｂｒａｎｃｈｙｕｒｙ）、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７、ＡＦＰ）を用いることができる。
リプログラミング状態の評価としては、例えば、アルカリフォスファターゼ活性の解析や、核型解析、未分化マーカーの発現解析が挙げられる。
アルカリフォスファターゼは、多能性幹細胞で高発現するため、未分化状態のマーカーの一つである。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば、公知の手法に準じてアルカリフォスファターゼ染色を行うことによって解析できる。この解析は、アルカリフォスファターゼ染色によって、アルカリフォスファターゼ活性の有無を判定してもよいし、アルカリフォスファターゼ活性を定量化してもよい。アルカリフォスファターゼ染色は、例えば、ホルマリン固定後に、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルりん酸（ＢＣＩＰ）と、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との混合液からなる基質液を加えて、アルカリフォスファターゼ活性に伴う反応産物を検出する。
核型解析は、例えば、Ｇ－ｂａｎｄ解析によって染色体の数や構造の変化を解析することによって行われる。
未分化マーカーの発現解析は、未分化マーカー遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲや、未分化マーカータンパク質の免疫染色によって行う。未分化マーカーとしては、例えば、Ｎａｎｏｇや、Ｏｃｔ３／４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１を用いることができる。
分化能の評価は、例えば、三胚葉細胞への分化を誘導した後の、三胚葉文化マーカーの発現解析によって行われる。文化マーカーの発現解析は、分化マーカーのＲＴ－ｑＰＣＲや、分化マーカータンパク質の免疫染色によって行う。文化マーカーとしては、例えば、外胚葉マーカー（ＰＡＸ６、ＭＡＰ２）、中胚葉マーカー（α－ＳＭＡ、Ｂｒａｎｃｈｙｕｒｙ）、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７、ＡＦＰ）を用いることができる。
【0024】
図３は、本発明の実施の形態１におけるｉＰＳ細胞の作製処理の流れを説明する図である。なお、本実施の形態１では、植え継ぎ処理を６回行う例を説明する。以下、植え継ぎ開始から初回の植え継ぎ処理までの期間、及び、植え継ぎ処理後から次回の植え継ぎ処理までの期間を「培養期間」ということがある。
【0025】
ステップＳ１０１において、リプログラミングに必要な複数種類の初期化因子と、少なくとも２種類の発光遺伝子との融合タンパク質を発現するような遺伝子群（コンストラクト）を体細胞に導入する。本実施の形態１では、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－ｍｙｃ、ＬＩＮ２８の初期化因子を一つ又は複数組み合わせた初期化因子が用いられる。
ステップＳ１０１において初期化因子が導入された体細胞は、例えば２０日～２５日間培養される。
ステップＳ１０１は、リプログラミングの初期段階に相当する。リプログラミングの初期段階は、細胞が群集化することによって三次元的に隆起が始まるコロニー形成段階を含む。
ステップＳ１０１において初期化因子が導入された体細胞は、例えば２０日～２５日間培養される。
ステップＳ１０１は、リプログラミングの初期段階に相当する。リプログラミングの初期段階は、細胞が群集化することによって三次元的に隆起が始まるコロニー形成段階を含む。
【0026】
ステップＳ１０１に続くステップＳ１０２において、ステップＳ１０１の培養によって発生したコロニーを、別の培養容器に移す植え継ぎ処理（第１植え継ぎ処理）を実施する。第１植え継ぎ処理では、植え継いだコロニーを７日～１０日間培養する。
【0027】
その後、ステップＳ１０２と同様にして、培養によって発生したコロニーを、新たな培養容器に植え継ぐ植え継ぎ処理を繰り返す（ステップＳ１０３～Ｓ１０７）。本実施の形態１では、６回の植え継ぎ処理が実施される。
【0028】
ステップＳ１０７に続くステップＳ１０８において、植え継がれ培養されることによって発生したコロニーに含まれる細胞の品質を評価する。品質評価は、例えば、上述したＰＣＲ法や免疫染色法（免染）が用いられる。
【0029】
ステップＳ１０８に続くステップＳ１０９において、品質評価の結果から、良好なｉＰＳ細胞になり得る細胞を選定する。このｉＰＳ細胞の作製処理によって作製されるｉＰＳ細胞が、再生医療のための研究等の目的で使用される。
【0030】
容器３は、具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレートなどが挙げられる。
【0031】
撮像ユニット５は、倒立型の顕微鏡を構成する。撮像ユニット５は、サンプル２の発光画像や蛍光画像を撮像する。撮像ユニット５は、対物レンズ５１と、ダイクロイックミラー５２と、光源５３と、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ５４と、結像レンズ５５と、シャッター５６とを有する。
対物レンズ５１は、具体的には、（開口数／倍率）2の値が０．０１以上である。
ダイクロイックミラー５２は、サンプル２からの光を透過するとともに、光源５３から照射された励起光がサンプル２へ照射されるように励起光の進行方向を変える。換言すれば、ダイクロイックミラー５２は、サンプル２の発光として検出される波長帯域の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を折り曲げる。
撮像時、ダイクロイックミラー５２は、例えば、観察する光の波長帯域に応じて、適宜、対応する透過波長（及び反射波長）のダイクロイックミラーに切り替えられる。なお、発光観察のみを行う場合は、ダイクロイックミラー５２を有しない構成としてもよい。ダイクロイックミラー５２を有しない構成の場合、ＣＣＤカメラ５４の前段に、観察する波長帯域の光を透過するフィルタを設けてもよい。
光源５３は、キセノンランプ、ハロゲン等のランプ、レーザ、又はＬＥＤ（Light Emitting Diode）を用いて構成される。
ＣＣＤカメラ５４は、対物レンズ５１、ダイクロイックミラー５２及び結像レンズ５５を経由して当該ＣＣＤカメラ５４の受光面に投影されたサンプル２の像を撮像し、蛍光画像又は明視野画像を取得する。また、ＣＣＤカメラ５４は、情報通信端末１０と有線又は無線で通信可能に接続される。ここで、サンプル２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ５４は、当該撮像範囲中に含まれる複数のサンプル２の蛍光画像及び明視野画像を撮像してもよい。
結像レンズ５５は、対物レンズ５１及びダイクロイックミラー５２を経由して当該結像レンズ５５に入射した光を集束させて、サンプル２を含む像を結像する。
シャッター５６は、光源５３から照射された光の波長帯域を切り替える。換言すると、シャッター５６は、光源５３から出射された光を透過したり遮断したりすることで、サンプル２に照射する光の波長帯域を切り替える。
対物レンズ５１は、具体的には、（開口数／倍率）2の値が０．０１以上である。
ダイクロイックミラー５２は、サンプル２からの光を透過するとともに、光源５３から照射された励起光がサンプル２へ照射されるように励起光の進行方向を変える。換言すれば、ダイクロイックミラー５２は、サンプル２の発光として検出される波長帯域の光を透過し、それ以外の波長帯域の光を折り曲げる。
撮像時、ダイクロイックミラー５２は、例えば、観察する光の波長帯域に応じて、適宜、対応する透過波長（及び反射波長）のダイクロイックミラーに切り替えられる。なお、発光観察のみを行う場合は、ダイクロイックミラー５２を有しない構成としてもよい。ダイクロイックミラー５２を有しない構成の場合、ＣＣＤカメラ５４の前段に、観察する波長帯域の光を透過するフィルタを設けてもよい。
光源５３は、キセノンランプ、ハロゲン等のランプ、レーザ、又はＬＥＤ（Light Emitting Diode）を用いて構成される。
ＣＣＤカメラ５４は、対物レンズ５１、ダイクロイックミラー５２及び結像レンズ５５を経由して当該ＣＣＤカメラ５４の受光面に投影されたサンプル２の像を撮像し、蛍光画像又は明視野画像を取得する。また、ＣＣＤカメラ５４は、情報通信端末１０と有線又は無線で通信可能に接続される。ここで、サンプル２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ５４は、当該撮像範囲中に含まれる複数のサンプル２の蛍光画像及び明視野画像を撮像してもよい。
結像レンズ５５は、対物レンズ５１及びダイクロイックミラー５２を経由して当該結像レンズ５５に入射した光を集束させて、サンプル２を含む像を結像する。
シャッター５６は、光源５３から照射された光の波長帯域を切り替える。換言すると、シャッター５６は、光源５３から出射された光を透過したり遮断したりすることで、サンプル２に照射する光の波長帯域を切り替える。
【0032】
ここで、撮像ユニット５は、ステージ４に対する配置が異なっていてもよい。また、ＣＣＤカメラは、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）カメラに代えてもよい。
【0033】
情報通信端末１０は、パーソナルコンピュータを用いて構成される。そして、情報通信端末１０は、制御部１１と、記憶部１２と、クロック発生部１３と、通信インターフェース部１４と、入出力インターフェース部１５と、入力部２１と、出力部２２とによって構成されている。情報通信端末１０は、これら各部を、バスを用いて接続している。
【0034】
記憶部１２は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いて構成される。そして、記憶部１２は、制御部１１の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。
【0035】
クロック発生部１３は、システムの時刻を計時したり、各部の動作の同期をとったりするためのクロックを発生する。
【0036】
通信インターフェース部１４は、情報通信端末１０と、ステージ４、ＣＣＤカメラ５３及びＣＣＤカメラ５４との間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１４は他の端末と有線又は無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
【0037】
入出力インターフェース部１５は、入力部２１や出力部２２に接続する。ここで、出力部２２には、モニタの他、スピーカやプリンタを用いることができる。
入力部２１は、例えばキーボードやマウス、タッチパネル、各種スイッチ等の入力デバイスによって構成され、これらの入力デバイスに対する外部からの操作に応じて発生させた入力信号を入出力インターフェース部１５に出力する。
入力部２１は、例えばキーボードやマウス、タッチパネル、各種スイッチ等の入力デバイスによって構成され、これらの入力デバイスに対する外部からの操作に応じて発生させた入力信号を入出力インターフェース部１５に出力する。
【0038】
制御部１１は、プログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１は、画像撮像指示部１１ａと、画像取得部１１ｂと、発光量取得部１１ｃと、判定部１１ｄと、選定部１１ｅとを有する。制御部１１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等の汎用プロセッサやＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等の特定の機能を実行する各種演算回路等の専用プロセッサを用いて構成される。
【0039】
画像撮像指示部１１ａは、通信インターフェース部１４を経由して、ＣＣＤカメラ５４へ発光画像及び／又は明視野画像の撮像を指示する。
画像取得部１１ｂは、ＣＣＤカメラ５４で撮像した発光画像及び／又は明視野画像を、通信インターフェース部１４を経由して取得する。
画像取得部１１ｂは、ＣＣＤカメラ５４で撮像した発光画像及び／又は明視野画像を、通信インターフェース部１４を経由して取得する。
【0040】
ここで、画像取得部１１ｂが取得した発光画像と明視野画像とは、ステージ４の位置や、対物レンズ５１を含む光学系の位置、及び対物レンズ５１を含む光学系の位置が同じ場合、それぞれの位置関係は対応付けられている。なお、互いに波長帯域が異なる複数の発光画像についても同様に、位置関係は対応付けられる。
【0041】
発光量取得部１１ｃは、発光画像に基づいて、発光タンパク質によって発光した発光物質（ここではルシフェリン）の発光量を測定する。ここで、発光タンパク質は、発光遺伝子によって発現したものであり、発光タンパク質の発現量で発光量が決まる。換言すれば、この発光量は、発光遺伝子によって発現した発光タンパク質に相当し、発光遺伝子の発光量と捉えることができる。
発光量取得部１１ｃは、発光画像において、サンプル２中の細胞集団（コロニー）ごとに、重心位置を含む所定の領域の発光量を取得する。発光量取得部１１ｃは、画素値（輝度）をもとに、コロニーの外縁の形状を求め、この形状の重心位置を算出する。コロニーの外縁の形状は、発光画像（又は明視野画像）を二値化して輪郭を抽出する。発光量取得部１１ｃは、求めた重心位置を含む所定の領域の画素値をもとに発光量を算出する。発光量は、単位面積、単位時間あたりの光子数である。発光量の単位は、例えば、ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃである。具体的に、発光量（光子数）は、検出対象の発光タンパク質の波長におけるＣＣＤカメラ５４の量子効率を用いて、以下の式によって算出される。
光子数 ＝ （出力輝度－ダーク輝度）×変換計数／（アナログゲイン×ＥＭゲイン×量子効率／１００）
ここで、例えば、変換係数は５．８、アナログゲインは１．０、ＥＭゲインは１２００、量子効率は９０に設定される。アナログゲインは、アナログの輝度信号の増幅率である。ＥＭ（電子増倍：electron multiply）ゲインは、ＣＣＤカメラ５２の光検出面における電子増倍率である。
なお、本明細書で開示される測定機の種類や撮像条件、光学フィルタ特性が異なっていても、開示した上式等に基づいて、品質の判断基準としての発光量（光子数）を算出できる。
植え継ぎの際、重心位置を含む所定の領域に位置する細胞集団をピペッティングするため、重心位置又は重心位置付近の発光量を取得することがｉＰＳ細胞を選定するために必要な測定領域といえる。ここで、重心位置は、コロニーの中心付近で且つ細胞密度が最も大きい部位を含む所定面積の領域と定義することができる。具体的には、このコロニーの重心位置付近は、明視野画像で観察した際に、コロニー内で最も細胞密度が高い画像上の部位であって、所定の単位面積（例えば半径約１ｍｍ以内の円形または矩形）の領域と定義することができる。
所定の培養のコロニーごとに発光強度を求めるには、まずコロニー全体が視野に入るような観察視野において発光画像を取得し、取得した発光画像に基づいて重心位置付近に相当する領域に含まれる画素の輝度値の総和を算出することによって行われる。細胞集団の前記２種類の発光遺伝子の発光量を取得する。
発光量取得部１１ｃは、発光画像において、サンプル２中の細胞集団（コロニー）ごとに、重心位置を含む所定の領域の発光量を取得する。発光量取得部１１ｃは、画素値（輝度）をもとに、コロニーの外縁の形状を求め、この形状の重心位置を算出する。コロニーの外縁の形状は、発光画像（又は明視野画像）を二値化して輪郭を抽出する。発光量取得部１１ｃは、求めた重心位置を含む所定の領域の画素値をもとに発光量を算出する。発光量は、単位面積、単位時間あたりの光子数である。発光量の単位は、例えば、ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃである。具体的に、発光量（光子数）は、検出対象の発光タンパク質の波長におけるＣＣＤカメラ５４の量子効率を用いて、以下の式によって算出される。
光子数 ＝ （出力輝度－ダーク輝度）×変換計数／（アナログゲイン×ＥＭゲイン×量子効率／１００）
ここで、例えば、変換係数は５．８、アナログゲインは１．０、ＥＭゲインは１２００、量子効率は９０に設定される。アナログゲインは、アナログの輝度信号の増幅率である。ＥＭ（電子増倍：electron multiply）ゲインは、ＣＣＤカメラ５２の光検出面における電子増倍率である。
なお、本明細書で開示される測定機の種類や撮像条件、光学フィルタ特性が異なっていても、開示した上式等に基づいて、品質の判断基準としての発光量（光子数）を算出できる。
植え継ぎの際、重心位置を含む所定の領域に位置する細胞集団をピペッティングするため、重心位置又は重心位置付近の発光量を取得することがｉＰＳ細胞を選定するために必要な測定領域といえる。ここで、重心位置は、コロニーの中心付近で且つ細胞密度が最も大きい部位を含む所定面積の領域と定義することができる。具体的には、このコロニーの重心位置付近は、明視野画像で観察した際に、コロニー内で最も細胞密度が高い画像上の部位であって、所定の単位面積（例えば半径約１ｍｍ以内の円形または矩形）の領域と定義することができる。
所定の培養のコロニーごとに発光強度を求めるには、まずコロニー全体が視野に入るような観察視野において発光画像を取得し、取得した発光画像に基づいて重心位置付近に相当する領域に含まれる画素の輝度値の総和を算出することによって行われる。細胞集団の前記２種類の発光遺伝子の発光量を取得する。
【0042】
ここで、コロニーの重心位置の算出について説明する。コロニーについて取得された明視野画像中の、以下の座標に設定される点であると定義される。
ここで、ｎは明視野画像を構成する画素の数を表す。
また、ＣＣＤカメラ５４の画素の配列に対応し、互いに直交するｘ軸およびｙ軸からなる直交座標において、ｘｉはｉ番目の画素におけるｘ座標を表し、ｙｉはｉ番目の画素におけるｙ座標を表す。また、Ｂｉはｉ番目の画素における輝度を二値化した値を表す。ｎ及びｉは、何れも１以上の整数である。ｎ及びｉは、ｎ≧ｉを満たす。コロニーの重心位置は、例えば、ｃｅｌｌＳｅｎｓ（セルセンス；オリンパス株式会社製）を用いて設定することが可能である。
【数1】
また、ＣＣＤカメラ５４の画素の配列に対応し、互いに直交するｘ軸およびｙ軸からなる直交座標において、ｘｉはｉ番目の画素におけるｘ座標を表し、ｙｉはｉ番目の画素におけるｙ座標を表す。また、Ｂｉはｉ番目の画素における輝度を二値化した値を表す。ｎ及びｉは、何れも１以上の整数である。ｎ及びｉは、ｎ≧ｉを満たす。コロニーの重心位置は、例えば、ｃｅｌｌＳｅｎｓ（セルセンス；オリンパス株式会社製）を用いて設定することが可能である。
【0043】
判定部１１ｄは、発光量取得部１１ｃが取得した各発光タンパク質の発光量（以下、発光遺伝子の発光量ともいう）と、予め設定されている、各発光遺伝子の発光量に係る閾値とを比較して、各発光遺伝子の発光量が閾値を超えているか否かを判定する。閾値は、各発光遺伝子の発光における光子数によって規定される。具体的に、例えば、初期化因子の組み合わせにおいて、過去の試験で良好なｉＰＳ細胞を選定できた光子数に基づいて、以下の閾値に設定される。なお、閾値は、組み合わせた発光遺伝子の相対発光量（光子数）に相当する。以下の閾値を用いれば、高効率で良好なｉＰＳ細胞を選定することができる。
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数との組み合わせ：色分離なし
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：８３％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：１．７２×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．５９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：２．３０×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．５９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数との組み合わせ：色分離あり
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：８３％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：４．１４×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．３９×１０-2ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：４．７４×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．３９×１０-2ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｏｃｔ４の光子数との組み合わせ：色分離なし
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：７５％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：９．７９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：５．９３×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：５．６８ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：７．２５×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｏｃｔ４の光子数との組み合わせ：色分離あり
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：７１％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：２．９３ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：１．９２×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：２．９３ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：３．２８×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
ここで、「色分離あり」では、得られた信号値に対して、ダイクロイックミラー５２等の光フィルタの透過率をもとにクロストークを除去する補正が行われる。これに対し、「色分離なし」では、上述したクロストークを除去する補正が行われない。
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数との組み合わせ：色分離なし
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：８３％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：１．７２×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．５９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：２．３０×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．５９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数との組み合わせ：色分離あり
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：８３％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：４．１４×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．３９×１０-2ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：４．７４×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の光子数に対する閾値：３．３９×１０-2ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｏｃｔ４の光子数との組み合わせ：色分離なし
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：７５％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：９．７９×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：５．９３×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：５．６８ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：７．２５×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
・Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数と、Ｏｃｔ４の光子数との組み合わせ：色分離あり
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：７１％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：２．９３ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：１．９２×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
（良好なｉＰＳ細胞の選定確率：１００％）
Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の光子数に対する閾値：２．９３ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
Ｏｃｔ４の光子数に対する閾値：３．２８×１０-1ｐｈｏｔｏｎ／μｍ2／ｓｅｃ
ここで、「色分離あり」では、得られた信号値に対して、ダイクロイックミラー５２等の光フィルタの透過率をもとにクロストークを除去する補正が行われる。これに対し、「色分離なし」では、上述したクロストークを除去する補正が行われない。
【0044】
選定部１１ｅは、判定部１１ｄの判定結果をもとに、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含むコロニーを選定する。具体的に、選定部１１ｅは、各発光遺伝子の発光量が、それぞれの閾値を超えている場合、その細胞は、判定部１１ｄの判定結果をもとに、良好なｉＰＳ細胞の選定確率が高い順に、選定した細胞を分類し、その分類結果を出力部２２に表示させる。これにより、品質の高い順にできるだけ多くの良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を選定できるようになる。
【0045】
図４は、本発明の実施の形態１におけるｉＰＳ細胞として良好な細胞を選定する選定処理について説明する図である。図４では、Ｌ－ｍｙｃとＬＩＮ２８とを組み合わせた相対発光量と、Ｓｏｘ２とＫｌｆ４とを組み合わせた相対発光量とを取得して、これらの発光量を各初期化因子の発現量とみなして細胞の選定を行った場合を示す。例えば、Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８の発光量に対する閾値がＴ1、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の発光量に対する閾値がＴ2に設定されている場合、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞として選定される細胞は、各発光量が、それぞれ閾値Ｔ1及びＴ2以上となる領域Ｒ1に分布される。一方、各発光量が、閾値Ｔ1及びＴ2の少なくとも一方を下回っている領域Ｒ2～Ｒ4に分布される場合、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞としては選定されない。
【0046】
また、制御部１１は、同一の時刻に撮像された明視野画像、及び、一つ又は複数の発光画像のうちの少なくとも二つの画像を重ね合わせた画像を生成し、出力部２２に表示させる。
【0047】
入力部２１は、例えばキーボードやマウス、タッチパネル、各種スイッチ等の入力デバイスによって構成され、これらの入力デバイスに対する外部からの操作に応じて発生させた入力信号を制御部１１に出力する。
【0048】
出力部２２は、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）又はＥＬ（ElectroLuminescence）ディスプレイ等の表示装置や、プリンタによって構成され、制御部１１の制御のもとで動作する。
【0049】
【0050】
ステップＳ２０１において、画像撮像指示部１１ａは、ＣＣＤカメラ５３へ明視野画像を撮像するよう指示する。画像取得部１１ｂは、ＣＤカメラ５３が撮像した明視野画像を取得する。
【0051】
ステップＳ２０１に続くステップＳ２０２において、画像撮像指示部１１ａは、ＣＣＤカメラ５３へ発光画像を撮像するよう指示する。画像取得部１１ｂは、ＣＤカメラ５３が撮像した発光画像を取得する。この際、サンプル２に導入されている発光遺伝子を励起して発光させる波長帯域の光（励起光）をそれぞれ出射する。
制御部１１は、ステップＳ２０１、Ｓ２０２において取得した明視野画像や、各発光遺伝子の発光画像を記憶部１２に記憶させる。この際に記憶される画像は、制御上、同じ時刻に撮像したものとして処理する。例えば、画像の取得時刻を、明視野画像の取得を開始した時間に設定したり、明視野画像の取得開始時刻と、発光画像の取得終了時刻との中間の時刻に設定したりする。
制御部１１は、ステップＳ２０１、Ｓ２０２において取得した明視野画像や、各発光遺伝子の発光画像を記憶部１２に記憶させる。この際に記憶される画像は、制御上、同じ時刻に撮像したものとして処理する。例えば、画像の取得時刻を、明視野画像の取得を開始した時間に設定したり、明視野画像の取得開始時刻と、発光画像の取得終了時刻との中間の時刻に設定したりする。
【0052】
撮像処理における露光時間は、撮像系（例えば撮像素子）の感度、結像光学系の光学特性、生体試料の種類、発光遺伝子の種類、蛍光試薬の種類、培養条件（温度、培養液の成分、培養期間等）などによって適宜変更される。
通常、発光画像を取得する際の撮像素子における露光時間は、明視野画像及び蛍光画像に比べると顕著に長時間を要する（生体試料の成長段階や生体試料の大きさによっても変更され得るが、例えば５～６０分間）。
また、発光画像に関する露光期間を複数に分割することで、発光画像の撮像を間欠的に行うようにしてもよい。
発光画像の取得に必要な露光時間内に細胞が動いてしまう場合であっても、精度の高い細胞評価を維持できるように撮像タイミング等が制御されることが好ましい。
通常、発光画像を取得する際の撮像素子における露光時間は、明視野画像及び蛍光画像に比べると顕著に長時間を要する（生体試料の成長段階や生体試料の大きさによっても変更され得るが、例えば５～６０分間）。
また、発光画像に関する露光期間を複数に分割することで、発光画像の撮像を間欠的に行うようにしてもよい。
発光画像の取得に必要な露光時間内に細胞が動いてしまう場合であっても、精度の高い細胞評価を維持できるように撮像タイミング等が制御されることが好ましい。
【0053】
ステップＳ２０３において、発光量取得部１１ｃは、撮像された発光画像において、サンプル２中のコロニーの重心位置を求め、該重心位置を含む所定の領域を、発光量取得領域に設定する。
【0054】
ステップＳ２０３に続くステップＳ２０４において、発光量取得部１１ｃは、設定した領域の画素値から、コロニーにおける各発光遺伝子の発光量を取得する。
【0055】
ステップＳ２０４に続くステップＳ２０５において、判定部１１ｄは、各発光タンパク質の発光量が閾値を超えているか否かを判定する。判定部１１ｄは、ステップＳ２０４において取得された発光量と、予め設定されている閾値とを、発光遺伝子ごとに比較して、大小関係をそれぞれ判定する。
【0056】
その後、選定部１１ｅが、判定部１１ｄの判定結果をもとに、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含むコロニーを選定する（ステップＳ２０６）。具体的に、選定部１１ｅは、各発光遺伝子の発光量が、それぞれの閾値を超えている場合（例えば、図３に示す領域Ｒ1に分布される場合）、その細胞は、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含んだコロニーとして選定する。
【0057】
以上説明した選定処理は、初回の植え継ぎ処理前や、初回の植え継ぎ期間の後半時期に実施される。培養の初期段階で細胞の選定を行うことで、良好なｉＰＳ細胞になり得る細胞のみが受け継がれる。その結果、良好なｉＰＳ細胞とはなり得ない細胞を植え継いで無駄に培養することが抑制される。
【0058】
以上説明した実施の形態１では、各発光遺伝子の発光量と閾値との比較結果を組み合わせて選定することによって、高い確率で高品質なｉＰＳ細胞になる細胞集団（コロニー）と、高い確率で低品質あるいはｉＰＳ細胞にならないと評価される細胞集団を発現量だけで選定できる。実施の形態１では、全ての細胞集団から高品質な細胞を選別し、低品質な細胞を客観的な判定で除外できる。本実施の形態１によれば、高効率でかつ正確に良好であるｉＰＳ細胞を選定することができる。
【0059】
また、実施の形態１によれば、細胞集団の重心位置付近の細胞について選定を行うことで、細胞集団の輪郭や位置ごとの細胞密度のばらつきに影響されず、選定に十分な発現量を取得できる。
【0060】
また、実施の形態１によれば、初期化因子ごとに所定の閾値を設けることで、良質な細胞集団（コロニー）を容易に分別できる。
【0061】
また、実施の形態１によれば、発光タンパク質を用いて観察、選定を行うため、細胞に対して低侵襲で処理を実施でき、かつ高定量性に優れている。ここで、蛍光タンパク質を用いて蛍光観察する場合、励起光の照射が必要になる。励起光は、細胞に対して光毒性をもたらすことが知られている、例えば、励起光は、活性酸素種の生成に関与するため、活性酸素種によって酸化的なＤＮＡへの損傷要因となる。また、ＧＦＰに代表される蛍光タンパク質の励起波長では、ｍｅｍｂｒｅｎｅ ｂｌｅｄｓ（膜の水泡）や、細胞分裂異常が発生する。さらに、蛍光タンパク質の発現自体が細胞誘導の原因となる。これに対し、励起光を使用しない発光を観察する場合、例え長期間観察しても、細胞への損傷を抑制することができる。また、発光タンパク質の発現は、細胞に対して無害である。
また、蛍光タンパク質によって定量する場合、蛍光タンパク質検出時に、多くの場合に自家蛍光に観察される。一方で、発光タンパク質によって定量する場合、自家蛍光に起因するバックグラウンドが観察されないため、定量性に優れる。
また、蛍光タンパク質によって定量する場合、蛍光タンパク質検出時に、多くの場合に自家蛍光に観察される。一方で、発光タンパク質によって定量する場合、自家蛍光に起因するバックグラウンドが観察されないため、定量性に優れる。
【0062】
また、実施の形態１によれば、発光タンパク質を用いて観察、選定を行うため、初期段階の観察、選定に優れている。ここで、蛍光タンパク質の成熟には、最短でも３時間、最長では２０時間程要する。特に、赤色蛍光は、成熟過程で緑色蛍光を経て成熟するため、成熟過程で緑色蛍光との区別が困難である。これに対し、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質は、発現が誘導され次第即座に成熟する。このため、発光タンパク質は、リプログラミング初期段階の観察に適している。
【0063】
また、実施の形態１によれば、初期段階で良質なｉＰＳ細胞を選定できるので、作製の手間が大幅に軽減する。また、実施の形態１は、初期段階より後では選定を行わないので、ｉＰＳ細胞の作製コストを低減することができる。
【0064】
なお、上述した実施の形態１において、絞りや位相板を配置して、位相差観察画像を取得できる構成としてもよい。
【0065】
ここで、本実施の形態１において判断基準とする初期化因子の組合せは任意である。実際、発明者らが、実施の形態１で挙げた以外の初期化因子の組合せも網羅的に実験したところ、同様に所定の閾値を算出することは可能であった。一方で、実験の結果から、上述した実施の形態１に記載されるような、Ｌ－ｍｙｃとＬＩＮ２８との組合せ、及び、Ｓｏｘ２とＫｌｆ４との組合せで評価する方が、他の組合せで評価する場合よりも良質なｉＰＳ細胞を得るうえでばらつきが少なく、効率よくｉＰＳ細胞のコロニーを選別できるという点で好ましい。
【0066】
また、本実施の形態１では、培養期間の初回（初回の植え継ぎ前）の時期（培養を開始してから間もない同一の時点）で発光量を測定する例を説明した。一方で、本実施の形態１で利用される生物発光は、継続的に定量的な光を発している。このため、同一の培養期間であれば、互いに異なる時点（例えば、特定時刻、及び、該特定時刻とは異なる後続の時刻）で発光量を測定した場合であっても、本実施の形態１の方法によって見出された閾値を超える場合には、良質なｉＰＳ細胞であると判定できることが見出された。
また、エピソーマルベクターの作用によって、細胞の発光は、培養が進行するほど実測値としての発光量が全体的に減少した後、比較的低い発光量で安定して、その後徐々に消失する傾向がある。ここで、発光量の減衰率は転写因子の種類によらず同一であり、減衰前後の同じ時刻に発光量についても、同じ時刻の各転写因子どうしの発光量の比率が、エピソーマルベクターの作用による減衰の前後で変わらないことが確認された。よって、培養の進行によって減衰した発光量の減衰率の逆数を乗算することで、経時的な減衰に起因する発光量の減少分を補正した光子数（補正発光量）が得られ、この補正発光量と、本実施の形態１で挙げた閾値とをそのまま適用して比較することが可能である。かかる補正処理を行えば、初回に限らず、植え継ぎ処理以降であっても、発光が検出できる限り良質なｉＰＳ細胞であるか否かを監視し続けて回収率を高めてもよい。
すなわち、本実施の形態１に係る選定処理は、同一の培養期間内の異なる時刻、又は、異なる培養期間における各時刻で取得された画像に基づく発光量を用いて実施することができる。この際、初回の培養容器への植え継ぎ前の特定時刻に取得された発光量と、該特定時刻と異なる後続の時刻に取得された発光量と、を取得して、後続の時刻に取得された発光量を用いて選定処理を実施する場合は、後続の発光量を、初回に取得した発光量からの減衰分を補正した補正後の発光量（補正発光量）を用いて選定を行う。
また、エピソーマルベクターの作用によって、細胞の発光は、培養が進行するほど実測値としての発光量が全体的に減少した後、比較的低い発光量で安定して、その後徐々に消失する傾向がある。ここで、発光量の減衰率は転写因子の種類によらず同一であり、減衰前後の同じ時刻に発光量についても、同じ時刻の各転写因子どうしの発光量の比率が、エピソーマルベクターの作用による減衰の前後で変わらないことが確認された。よって、培養の進行によって減衰した発光量の減衰率の逆数を乗算することで、経時的な減衰に起因する発光量の減少分を補正した光子数（補正発光量）が得られ、この補正発光量と、本実施の形態１で挙げた閾値とをそのまま適用して比較することが可能である。かかる補正処理を行えば、初回に限らず、植え継ぎ処理以降であっても、発光が検出できる限り良質なｉＰＳ細胞であるか否かを監視し続けて回収率を高めてもよい。
すなわち、本実施の形態１に係る選定処理は、同一の培養期間内の異なる時刻、又は、異なる培養期間における各時刻で取得された画像に基づく発光量を用いて実施することができる。この際、初回の培養容器への植え継ぎ前の特定時刻に取得された発光量と、該特定時刻と異なる後続の時刻に取得された発光量と、を取得して、後続の時刻に取得された発光量を用いて選定処理を実施する場合は、後続の発光量を、初回に取得した発光量からの減衰分を補正した補正後の発光量（補正発光量）を用いて選定を行う。
【0067】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。図６は、本発明の実施の形態２に係るｉＰＳ細胞の選定システムにおける情報通信端末の機能構成を示すブロック図である。本実施の形態２に係る選定システムは、上述したサンプル２、サンプル２を収納した容器３、容器３を配置するステージ４、及び撮像ユニット５と、情報通信端末１０Ａと、を備える。本実施の形態２に係る選定システムは、上述した選定システム１の情報通信端末１０を情報通信端末１０Ａに変えた以外は、同じ構成である。以下、実施の形態１とは構成が異なる情報通信端末１０Ａについて説明する。
次に、本発明の実施の形態２について説明する。図６は、本発明の実施の形態２に係るｉＰＳ細胞の選定システムにおける情報通信端末の機能構成を示すブロック図である。本実施の形態２に係る選定システムは、上述したサンプル２、サンプル２を収納した容器３、容器３を配置するステージ４、及び撮像ユニット５と、情報通信端末１０Ａと、を備える。本実施の形態２に係る選定システムは、上述した選定システム１の情報通信端末１０を情報通信端末１０Ａに変えた以外は、同じ構成である。以下、実施の形態１とは構成が異なる情報通信端末１０Ａについて説明する。
【0068】
情報通信端末１０Ａは、パーソナルコンピュータを用いて構成される。そして、情報通信端末１０Ａは、制御部１１Ａと、記憶部１２と、クロック発生部１３と、通信インターフェース部１４と、入出力インターフェース部１５と、入力部２１と、出力部２２とによって構成されている。情報通信端末１０Ａは、これら各部を、バスを用いて接続している。
【0069】
制御部１１Ａは、プログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１Ａは、画像撮像指示部１１ａと、画像取得部１１ｂと、発光量取得部１１ｃと、判定部１１ｄと、選定部１１ｅと、同定部１１ｆとを有する。制御部１１Ａは、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等の汎用プロセッサやＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等の特定の機能を実行する各種演算回路等の専用プロセッサを用いて構成される。画像撮像指示部１１ａ、画像取得部１１ｂ、発光量取得部１１ｃ、判定部１１ｄ、及び選定部１１ｅは、実施の形態１と同様の構成、機能を有する。以下、同定部１１ｆの構成及び処理について説明する。
【0070】
同定部１１ｆは、撮像時間が異なる画像同士を比較して、各画像に写る細胞（又はコロニー）を画像間で同定し、両者を対応付ける。同定部１１ｆは、まず、各画像の発光プロファイルから、細胞が存在し得る注目すべき領域（以下、注目領域ともいう）をそれぞれ特定する。この際に取得される発光プロファイルは、例えば、発光強度、発光強度分布、又はこれらの組み合わせを用いて作成される。
同定部１１ｆは、特定された注目領域と、発光プロファイルとを用いて、各画像の注目領域の特徴量を算出する。同定部１１ｆは、画像間で特徴量を比較して、注目領域に含まれる細胞（又はコロニー）を対応付ける。特徴量は、例えば、注目領域における発光強度の強度比である。なお、同定部１１ｆは、選定部１１ｅが用いたコロニーの発光量を用いて同定処理を実施してもよい。
本実施の形態２では、取得時間が異なる画像間の注目領域を対応付けることによって、継時的に細胞を追跡する。
同定部１１ｆは、特定された注目領域と、発光プロファイルとを用いて、各画像の注目領域の特徴量を算出する。同定部１１ｆは、画像間で特徴量を比較して、注目領域に含まれる細胞（又はコロニー）を対応付ける。特徴量は、例えば、注目領域における発光強度の強度比である。なお、同定部１１ｆは、選定部１１ｅが用いたコロニーの発光量を用いて同定処理を実施してもよい。
本実施の形態２では、取得時間が異なる画像間の注目領域を対応付けることによって、継時的に細胞を追跡する。
【0071】
【0072】
ステップＳ３０１において、画像撮像指示部１１ａは、上述したステップＳ２０１と同様にして、ＣＣＤカメラ５３へ明視野画像を撮像するよう指示する。画像取得部１１ｂは、ＣＤカメラ５３が撮像した明視野画像を取得する。
【0073】
ステップＳ３０１に続くステップＳ３０２において、画像撮像指示部１１ａは、上述したステップＳ２０２と同様にして、ＣＣＤカメラ５３へ発光画像を撮像するよう指示する。画像取得部１１ｂは、ＣＤカメラ５３が撮像した発光画像を取得する。
制御部１１は、ステップＳ３０１、Ｓ３０２において取得した明視野画像や、各発光遺伝子の発光画像を記憶部１２に記憶させる。この際に記憶される画像は、制御上、同じ時刻とする。
制御部１１は、ステップＳ３０１、Ｓ３０２において取得した明視野画像や、各発光遺伝子の発光画像を記憶部１２に記憶させる。この際に記憶される画像は、制御上、同じ時刻とする。
【0074】
ステップＳ３０３において、発光量取得部１１ｃは、撮像された発光画像において、サンプル２中のコロニーの重心位置を求め、該重心位置を含む所定の領域を、発光量取得領域に設定する。
【0075】
ステップＳ３０３に続くステップＳ３０４において、発光量取得部１１ｃは、設定した領域の画素値から、コロニーにおける各発光遺伝子の発光量を取得する。
【0076】
ステップＳ３０４に続くステップＳ３０５において、判定部１１ｄは、各発光タンパク質の発光量が閾値を超えているか否かを判定する。判定部１１ｄは、ステップＳ３０４において取得された発光量と、予め設定されている閾値とを、発光遺伝子ごとに比較して、大小関係をそれぞれ判定する。
【0077】
その後、選定部１１ｅが、判定部１１ｄの判定結果をもとに、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含むコロニーを選定する（ステップＳ３０６）。選定部１１ｅは、判定部１１ｄの判定結果をもとに、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含むコロニーを選定する。具体的に、選定部１１ｅは、各発光遺伝子の発光量が、それぞれの閾値を超えている場合（例えば、図３に示す領域Ｒ1に分布される場合）、その細胞は、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含んだコロニーとして選定する。
【0078】
ステップＳ３０６の後、初回の植え継ぎ処理が実施される。植え継ぎ処理は、例えば、ステップＳ３０６において選定されたコロニーに対して実施される。このため、植え継ぎ処理では、良好なｉＰＳ細胞になり得ると選定されたコロニーのみが植え継がれる。植え継ぎ処理を実施後、制御部１１は、植え継ぎ処理の回数を確認する（ステップＳ３０７）。制御部１１は、例えば、入力部２１が受け付けた入力信号に基づいて、植え継ぎ処理の回数を確認する。制御部１１は、植え継ぎ処理の回数が、予め設定されている回数以上であるか否かを判断する。ここで、制御部１１は、植え継ぎ処理の回数が、予め設定されている回数未満であれば（ステップＳ３０７：Ｎｏ）、植え継ぎ処理の回数の判断処理を繰り返す。一方、制御部１１は、植え継ぎ処理の回数が、予め設定されている回数以上であると判断した場合（ステップＳ３０７：Ｙｅｓ）、ステップＳ３０８に移行する。
ここで設定される植え継ぎ処理の回数は、ｉＰＳ細胞を作製するうえで実施される植え継ぎ回数よりも少ない回数、かつ培養した細胞を追跡するのに適切な回数が設定される。
なお、発光画像の取得可能期間は、初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とが体細胞内に維持される期間に限定される。例えば、初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とをエピソーマルベクターの形態で体細胞に導入した場合、その発光の撮像は、リプログラミング誘導開始直後、すなわちエピソーマルベクターを体細胞に導入してから、エピソーマルベクターが体細胞外へ放出されるまでの間で可能である。
ここで設定される植え継ぎ処理の回数は、ｉＰＳ細胞を作製するうえで実施される植え継ぎ回数よりも少ない回数、かつ培養した細胞を追跡するのに適切な回数が設定される。
なお、発光画像の取得可能期間は、初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とが体細胞内に維持される期間に限定される。例えば、初期化因子をコードする核酸と、発光タンパク質をコードする核酸とをエピソーマルベクターの形態で体細胞に導入した場合、その発光の撮像は、リプログラミング誘導開始直後、すなわちエピソーマルベクターを体細胞に導入してから、エピソーマルベクターが体細胞外へ放出されるまでの間で可能である。
【0079】
ステップＳ３０８において、画像撮像指示部１１ａは、上述したステップＳ３０１と同様にして、ＣＣＤカメラ５３へ明視野画像を撮像するよう指示する。画像取得部１１ｂは、ＣＤカメラ５３が撮像した明視野画像を取得する。
【0080】
ステップＳ３０８に続くステップＳ３０９において、画像撮像指示部１１ａは、上述したステップＳ３０２と同様にして、ＣＣＤカメラ５３へ発光画像を撮像するよう指示する。画像取得部１１ｂは、ＣＤカメラ５３が撮像した発光画像を取得する。
制御部１１は、ステップＳ３０８、Ｓ３０９において取得した明視野画像や、各発光遺伝子の発光画像を記憶部１２に記憶させる。
制御部１１は、ステップＳ３０８、Ｓ３０９において取得した明視野画像や、各発光遺伝子の発光画像を記憶部１２に記憶させる。
【0081】
ステップＳ３１０において、発光量取得部１１ｃは、撮像された発光画像において、サンプル２中のコロニーの重心位置を求め、該重心位置を含む所定の領域を、発光量取得領域に設定する。
【0082】
ステップＳ３１０に続くステップＳ３１１において、発光量取得部１１ｃは、設定した領域の画素値から、コロニーにおける各発光遺伝子の発光量を取得する。
【0083】
ステップＳ３１１に続くステップＳ３１２において、同定部１１ｆは、ステップＳ３０１と、ステップＳ３０８で取得された明視野画像同士を比較して、各画像に写る細胞（又はコロニー）を画像間で同定し、両者を対応付ける。
【0084】
ステップＳ３１２に続くステップＳ３１３において、判定部１１ｄは、各発光タンパク質の発光量が閾値を超えているか否かを判定する。判定部１１ｄは、ステップＳ３０４において取得された発光量と、予め設定されている閾値とを、発光遺伝子ごとに比較して、大小関係をそれぞれ判定する。
【0085】
その後、選定部１１ｅが、判定部１１ｄの判定結果をもとに、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞を含むコロニーを選定する（ステップＳ３１４）。
ステップＳ３１４では、ステップＳ３０６において選定された細胞のみに対して選定を行うため、基本的にはすべての細胞が、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞として選定される。この際、外的な要因等によって、良好なｉＰＳ細胞とはなり得ない細胞として判断される場合があり、ステップＳ３１４では、植え継ぎ過程において、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞から脱落した細胞を選定するともいえる。
ステップＳ３１４では、ステップＳ３０６において選定された細胞のみに対して選定を行うため、基本的にはすべての細胞が、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞として選定される。この際、外的な要因等によって、良好なｉＰＳ細胞とはなり得ない細胞として判断される場合があり、ステップＳ３１４では、植え継ぎ過程において、良好なｉＰＳ細胞となり得る細胞から脱落した細胞を選定するともいえる。
【0086】
以上説明した実施の形態２では、各発光遺伝子の発光量と閾値との比較結果を組み合わせるだけの簡易な手法で選定することによって、高い確率で高品質なｉＰＳ細胞になる細胞集団（コロニー）と、高い確率で低品質あるいはｉＰＳ細胞にならないと評価される細胞集団を発現量だけで選定できる。実施の形態２では、全ての細胞集団から高品質な細胞を選別し、低品質な細胞を客観的な判定で除外できる。本実施の形態２によれば、高効率でかつ正確に良好であるｉＰＳ細胞を選定することができる。
【0087】
また、実施の形態２では、上記の選定処理を、予め設定された植え継ぎ後に再度実施することによって、植え継ぎ過程で選外に変わった細胞を植え継ぎ対象から外す。本実施の形態２によれば、一層高精度に、良好であるｉＰＳ細胞を選定することができる。また、細胞の取り違いを防ぎ、作製するｉＰＳ細胞の品質を向上できる。
【0088】
ここまで、本発明を実施するための形態を説明してきたが、本発明は上述した実施の形態によってのみ限定されるべきものではない。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含み得るものである。
【実施例】
【0089】
以下、実施例によって、さらに本発明の詳細を説明する。しかし、本実施例により本発明が限定して解釈されるわけではない。本実施例では、リプログラミングの誘導因子として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－ｍｙｃ、及びＬＩＮ２８を使用した。これらの誘導因子のうち、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のそれぞれに、発光レポータータンパク質として、ルシフェラーゼを連結し、各誘導因子の発現状態を発光画像から評価した。
【0090】
＜１－１．ベクターの作製＞
リプログラミングの誘導のために、以下の５種類のエピソーマルベクターを準備した。
（１）Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８を発現するベクター（ｐＣＥ－ｈＵＬ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１）
（２）Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１）
（３）Ｏｃｔ３／４及びＳｆＲＥ１ルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ＳｆＲＥ１）
リプログラミングの誘導のために、以下の５種類のエピソーマルベクターを準備した。
（１）Ｌ－ｍｙｃ及びＬＩＮ２８を発現するベクター（ｐＣＥ－ｈＵＬ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１）
（２）Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１）
（３）Ｏｃｔ３／４及びＳｆＲＥ１ルシフェラーゼを発現するベクター（ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ＳｆＲＥ１）
【0091】
これら３種類のベクターを「改変型ベクターセット」という。転写因子については、Okita K, et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5):409-412. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.をもとに選択した。
【0092】
以下に、（１）～（３）のベクターの詳細を示す。図８は、実施例におけるｐＣＥ－ｈＵＬベクターの構成を示す図である。図９は、実施例におけるｐＣＥ－ｈＳＫベクターの構成を示す図である。図１０は、実施例におけるｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ＳｆＲＥ１ベクターの構成を示す図である。
（１）ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ
ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬは、ａｄｄｇｅｎｅから入手した（図８参照）。
（２）ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１
ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１は、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４とともに、発光レポータータンパク質としてＯｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼが発現するものに調製した。
具体的には、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＳｐｎ I及びＢｇｌ IIで消化し、Ｋｆｌ４の下流に、２Ａ配列を経てＯｋｉ＿ｍｕｔ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１）を組み込むことによって発現ベクターを調製した（図９参照）。なお、図９に示すＫｐｎ Iのサイトに関しては、Ｋｌｆ４の内部からＫｐｎ Iのサイトを含むストップコドンを削除した配列を人工合成して挿入した。
（１）ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ
ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬは、ａｄｄｇｅｎｅから入手した（図８参照）。
（２）ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１
ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ－Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１は、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４とともに、発光レポータータンパク質としてＯｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼが発現するものに調製した。
具体的には、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＳｐｎ I及びＢｇｌ IIで消化し、Ｋｆｌ４の下流に、２Ａ配列を経てＯｋｉ＿ｍｕｔ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１）を組み込むことによって発現ベクターを調製した（図９参照）。なお、図９に示すＫｐｎ Iのサイトに関しては、Ｋｌｆ４の内部からＫｐｎ Iのサイトを含むストップコドンを削除した配列を人工合成して挿入した。
【0093】
（３）ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３－ＳｆＲＥ１
ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３－ＳｆＲＥ１は、Ｏｃｔ３／４とともに、発光レポータータンパク質としてｐＣＸＬＥ１ルシフェラーゼが発現するものに調製した。
具体的には、ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＫｐｎ I及びＢｇｌ IIで消化し、ｈＯｃｔ３／４の下流に、２Ａ配列を経てＳｆＲＥ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号２）を組み込むことによって発現ベクターを調製した（図１０参照）。
ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３－ＳｆＲＥ１は、Ｏｃｔ３／４とともに、発光レポータータンパク質としてｐＣＸＬＥ１ルシフェラーゼが発現するものに調製した。
具体的には、ｐＣＸＬＥ－ｈＯｃｔ３／４－ｓｈｐ５３（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＫｐｎ I及びＢｇｌ IIで消化し、ｈＯｃｔ３／４の下流に、２Ａ配列を経てＳｆＲＥ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号２）を組み込むことによって発現ベクターを調製した（図１０参照）。
【0094】
以下に、Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ及びＳｆＲＥ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの塩基配列を記載する。
【表1】
【表2】
【0095】
＜１－２．遺伝子導入及び細胞の培養＞
人ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社製）を解凍し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－ＬｉｇａｎｄおよびＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素株式会社製）で培養した。細胞の培養には、２４ｗｅｌｌ培養プレートを使用した。細胞を密度２．５×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行わずに、３７℃、５％ＣＯ2の環境下において７日間培養した。
人ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社製）を解凍し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－ＬｉｇａｎｄおよびＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素株式会社製）で培養した。細胞の培養には、２４ｗｅｌｌ培養プレートを使用した。細胞を密度２．５×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行わずに、３７℃、５％ＣＯ2の環境下において７日間培養した。
【0096】
７日間の培養後、ＰＢＭＣに「改変ベクターセット」を、Ａｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いたエレクトロポレーションによって導入した。
【0097】
その後、事前にコーティング剤（ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）でコートした６ｗｅｌｌ培養プレートに、ベクターを導入したＰＢＭＣを播種し、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－ＬｉｇａｎｄおよびＣＳＦを添加した培地（ＡＫ０２、味の素株式会社製）で、３７℃、５％ＣＯ2の環境下において一晩培養した。なお、播種密度は２．０×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとした。
【0098】
翌日以降、すなわち、ベクター導入後の翌々日以降については、１．５ｍＬの培地（ＡＫ０２、味の素株式会社製）を一日毎に加えて培養を継続した。ベクター導入後８日目に、ｉＰＳ細胞様コロニーが形成され、１２日目に発光観察を行った。
【0099】
＜１－３．画像の取得＞
培養１２日経過時点での二つのコロニーについて、明視野画像及び発光画像を取得した。ルシフェラーゼの触媒作用に起因する発光については、培地中にルシフェリンを終濃度１ｍＭで添加して観察した。
発光画像の取得については、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いた。ＣＣＤカメラは、ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を用いた。撮像条件としては、露出時間を５分、ビニングを１×１とし、ＥＭ－ｇａｉｎを１２００とした。対物レンズは、４倍又は２０倍の対物レンズを使用した。
ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光については、５１５ｎｍ～５６０ｎｍの光を透過するフィルタ（５１５－５６０ＨＱ）を用いて分光した。また、Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光については、６１０ｎｍの光を透過するフィルタ（６１０ＡＬＰ）を用いて分光した。
培養１２日経過時点での二つのコロニーについて、明視野画像及び発光画像を取得した。ルシフェラーゼの触媒作用に起因する発光については、培地中にルシフェリンを終濃度１ｍＭで添加して観察した。
発光画像の取得については、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を用いた。ＣＣＤカメラは、ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を用いた。撮像条件としては、露出時間を５分、ビニングを１×１とし、ＥＭ－ｇａｉｎを１２００とした。対物レンズは、４倍又は２０倍の対物レンズを使用した。
ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光については、５１５ｎｍ～５６０ｎｍの光を透過するフィルタ（５１５－５６０ＨＱ）を用いて分光した。また、Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼの発現に起因する発光については、６１０ｎｍの光を透過するフィルタ（６１０ＡＬＰ）を用いて分光した。
【0100】
図１１は、実施例１の明視野画像を示す図である。図１２は、実施例１の第１発光タンパク質（ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ）の発光画像を示す図である。図１３は、実施例１の第２発光タンパク質（Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼ）の発光画像を示す図である。
明視野画像（図１１）では、画像の右下辺りに、複数の細胞同士が集まってコロニーを形成していることが分かる。また、発光画像では、明視野画像におけるコロニー形成位置において、ルシフェラーゼが発光していることが分かる。
明視野画像（図１１）では、画像の右下辺りに、複数の細胞同士が集まってコロニーを形成していることが分かる。また、発光画像では、明視野画像におけるコロニー形成位置において、ルシフェラーゼが発光していることが分かる。
【0101】
図１４は、実施例２の明視野画像を示す図である。図１５は、実施例２の第１発光タンパク質（ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ）の発光画像を示す図である。図１６は、実施例２の第２発光タンパク質（Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼ）の発光画像を示す図である。
明視野画像（図１１）では、画像の右下辺りに、複数の細胞同士が集まってコロニーを形成していることが分かる。また、発光画像では、明視野画像におけるコロニー形成位置において、ルシフェラーゼが発光していることが分かる。
明視野画像（図１１）では、画像の右下辺りに、複数の細胞同士が集まってコロニーを形成していることが分かる。また、発光画像では、明視野画像におけるコロニー形成位置において、ルシフェラーゼが発光していることが分かる。
【0102】
その後の発光量（ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ及びＯｋｉ＿ｍｕｔ１ルシフェラーゼの各発光量）に基づく選定処理では、実施例１のコロニーが、良好なｉＰＳ細胞になり得る細胞として選定された。一方で、実施例２のコロニーは、３回目の植え継ぎ時の良否判定時において、良好なｉＰＳ細胞になり得る細胞には選定されず、選定処理から脱落した。
【0103】
ここで、実施例１のコロニー（図１１参照）は、領域Ｑ1が、コロニーの外形として認識される。また、実施例２のコロニー（図１４参照）は、領域Ｑ2が、コロニーの外形として認識される。領域Ｑ1と領域Ｑ2とを比較すると、領域Ｑ2の方が大きく、従来のコロニーの外形からｉＰＳ細胞の良悪を判定する方法では、実施例２が優先的に選定される。しかしながら、本実施例では、実施例１のコロニーが、良好なｉＰＳ細胞になり得る細胞として選定された。この結果から分かるように、互いに異なる初期化因子とともに発光する複数種の発光タンパク質の発光量に基づいて、良好なｉＰＳ細胞になり得る細胞を選定することによって、コロニーの大きさ等から選定するよりも高精度に良好なｉＰＳ細胞を選定できることが分かる。
【0104】
＜１－４．エピソーマルベクターの残存確認＞
上述した処理によって選定されたｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行い、エピソーマルベクターの残存を確認した。
・プライマー
第１プライマー（ｐＥＰ４－ＳＦ１）：TTC CAC GAG GGT AGT GAA CC
第２プライマー（ｐＥＰ４－ＳＲ１）：TCG GGG GTG TTA GAG ACA AC
・ＰＣＲ条件
９４℃、２分間の熱変性処理させた後、９４℃、２０秒間の熱変性処理、６４℃、２０秒間のアニーリング処理および７２℃、４０秒間の伸長反応処理を３０サイクル実施し、その後７２℃、３分間の伸長反応処理を実施した（参考：Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801 (2009)）。
ＰＣＲ反応後、アガロースゲルを用いた電気泳動によってエピソーマルベクター由来のバンドの有無を確認したところ、当該バンドは確認されなかった。この結果、選定されたｉＰＳ細胞において、エピソーマルベクターが消去され、導入遺伝子の残存がないといえる。
上述した処理によって選定されたｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行い、エピソーマルベクターの残存を確認した。
・プライマー
第１プライマー（ｐＥＰ４－ＳＦ１）：TTC CAC GAG GGT AGT GAA CC
第２プライマー（ｐＥＰ４－ＳＲ１）：TCG GGG GTG TTA GAG ACA AC
・ＰＣＲ条件
９４℃、２分間の熱変性処理させた後、９４℃、２０秒間の熱変性処理、６４℃、２０秒間のアニーリング処理および７２℃、４０秒間の伸長反応処理を３０サイクル実施し、その後７２℃、３分間の伸長反応処理を実施した（参考：Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801 (2009)）。
ＰＣＲ反応後、アガロースゲルを用いた電気泳動によってエピソーマルベクター由来のバンドの有無を確認したところ、当該バンドは確認されなかった。この結果、選定されたｉＰＳ細胞において、エピソーマルベクターが消去され、導入遺伝子の残存がないといえる。
【0105】
以上説明したｉＰＳ細胞の選定方法、及びｉＰＳ細胞の作製方法は、ｉＰＳ細胞のような再生医療用の生物材料に適用できることは勿論のこと、利用可能な各種細胞の選定に貢献することができる。
【産業上の利用可能性】
【0106】
本発明にかかるｉＰＳ細胞の選定方法、及びｉＰＳ細胞の作製方法は、高効率でかつ正確に良好であるｉＰＳ細胞を選定するのに有用である。
【符号の説明】
【0107】
１ 選定システム
２ サンプル
３ 容器
４ ステージ
５ 画像撮像ユニット
１０、１０Ａ 情報通信端末
１１ 制御部
１１ａ 画像撮像指示部
１１ｂ 画像取得部
１１ｃ 発光量取得部
１１ｄ 判定部
１１ｅ 選定部
１１ｆ 同定部
１２ 記憶部
１３ クロック発生部
１４ 通信インターフェース部
１５ 入出力インターフェース部
２１ 入力部
２２ 出力部
５１ 対物レンズ
５２ ダイクロイックミラー
５３ 光源
５４ ＣＣＤカメラ
５５ 結像レンズ
５６ シャッター
２ サンプル
３ 容器
４ ステージ
５ 画像撮像ユニット
１０、１０Ａ 情報通信端末
１１ 制御部
１１ａ 画像撮像指示部
１１ｂ 画像取得部
１１ｃ 発光量取得部
１１ｄ 判定部
１１ｅ 選定部
１１ｆ 同定部
１２ 記憶部
１３ クロック発生部
１４ 通信インターフェース部
１５ 入出力インターフェース部
２１ 入力部
２２ 出力部
５１ 対物レンズ
５２ ダイクロイックミラー
５３ 光源
５４ ＣＣＤカメラ
５５ 結像レンズ
５６ シャッター
【配列表フリーテキスト】
【0108】
配列番号 １ Ｏｋｉ＿ｍｕｔ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
配列番号 ２ ＳｆＲＥ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
配列番号 ３ 第１プライマー（ｐＥＰ４－ＳＦ１）
配列番号 ４ 第２プライマー（ｐＥＰ４－ＳＲ１）
配列番号 ２ ＳｆＲＥ１ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
配列番号 ３ 第１プライマー（ｐＥＰ４－ＳＦ１）
配列番号 ４ 第２プライマー（ｐＥＰ４－ＳＲ１）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】