ホーム > 特許ランキング > 株式会社大塚製薬工場
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-07-28
(45)【発行日】2023-08-07
(54)【発明の名称】癒着防止剤及びそれを用いた癒着防止方法
(51)【国際特許分類】
A61L 31/04 20060101AFI20230731BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230731BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20230731BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20230731BHJP
【ＦＩ】
A61L31/04 120
A61K9/10
A61K47/36
A61K47/38
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022528834
(86)(22)【出願日】2021-06-01
(86)【国際出願番号】 JP2021020791
(87)【国際公開番号】W WO2021246388
(87)【国際公開日】2021-12-09
【審査請求日】2022-08-08
(31)【優先権主張番号】P 2020095280
(32)【優先日】2020-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000149435
【氏名又は名称】株式会社大塚製薬工場
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】大畑 淳
(72)【発明者】
【氏名】山下 拓道
(72)【発明者】
【氏名】藤本 栞理
【審査官】梅田 隆志
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１９／００１５５６４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００５／０００３７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／０９９０８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開平０３－１６７２０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】SULTANA, T., et al.，TEMPO oxidized nano-cellulose containing thermo-responsive injectable hydrogel for post-surgical per，Materials Science & Engineering: C，2019年，Vol.102，pp.12-21.
【文献】磯貝 明，バイオ系ナノファイバーの調製と高機能部材への応用展開，繊維学会誌，2009年，Vol.65, No.1，pp.7-8.
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ ３１／０４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料、並びに液状媒体を含み、アニオン化されたナノ材料が液状媒体中に分散してなる癒着防止剤であって、癒着防止剤中のアニオン化されたナノ材料の濃度が、０．１～１０重量％であり、アニオン化されたナノ材料に含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種であり、癒着防止剤の粘度（３７℃）が、０．５～２０００ｍＰａ・ｓである、癒着防止剤。
【請求項2】
アニオン化されたナノ材料が、アニオン化されたナノセルロースである、請求項１に記載の癒着防止剤。
【請求項3】
アニオン化されたナノセルロースが、アニオン化されたセルロースナノファイバー及びアニオン化されたセルロースナノクリスタルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２に記載の癒着防止剤。
【請求項4】
アニオン化されたナノ材料が、アニオン化されたナノキチンである、請求項１に記載の癒着防止剤。
【請求項5】
アニオン化されたナノキチンが、アニオン化されたキチンナノファイバー及びアニオン化されたキチンナノクリスタルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４に記載の癒着防止剤。
【請求項6】
液状媒体が水を含む媒体である、請求項１～５のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項7】
癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が、２５重量％以上である、請求項１～６のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項8】
腹腔内の臓器又は組織に適用するための、請求項１～７のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項9】
粘度（３７℃）が、０．５～２０００ｍＰａ・ｓである癒着防止剤を製造するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料、並びに液状媒体を含み、アニオン化されたナノ材料が液状媒体中に分散してなり、アニオン化されたナノ材料の濃度が、０．１～１０重量％であり、アニオン化されたナノ材料に含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種である液状分散体の使用。
【請求項10】
癒着防止剤の製造方法であって、有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料と、液状媒体とを混合して、アニオン化されたナノ材料の濃度が、０．１～１０重量％であり、アニオン化されたナノ材料に含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種であり、粘度（３７℃）が０．５～２０００ｍＰａ・ｓである癒着防止剤を調製する工程を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癒着防止剤及びそれを用いた癒着防止方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癒着とは、互いに分離しているべき組織の表面が線維性の組織で連結又は融合された状態のことをいう。腹部手術後には高頻度に癒着が発生し、癒着性腸閉塞、再手術の困難化及びリスク増大、妊孕性の低下、並びに慢性腹痛の原因となる。特に、癒着に起因する腸閉塞に陥った場合には生命の危険に瀕することから、臨床的にも重大な問題となっている。
【0003】
癒着を防止する手段として、シート状の癒着防止材（セプラフィルム（登録商標）、インターシード（登録商標））及びゲル状の癒着防止材（アドスプレー（登録商標））が市販されている。これらは何れも腹壁切開創下や損傷部に貼布又はスプレーし、切開創又は損傷部と隣接する臓器との間に物理的隔壁を設けることによって癒着を軽減する。
【0004】
シート状の癒着防止材は、貼付部位の癒着を軽減したというエビデンスが認められているが、一方で、癒着性腸閉塞の発生率を低下させるというエビデンスはないとの系統的レビューが報告されている（例えば、非特許文献１）。ゲル状の癒着防止材は、２液を混合し損傷部位周辺に噴霧し速やかにゲル化させて癒着防止効果を発揮するものであるが、２液の調製が煩雑であり、かつ癒着防止効果は適用部位に限局される。これら既存の癒着防止材が癒着性腸閉塞を完全に防止できない理由は、癒着発生が明確に予測される腹壁切開創下又は損傷部に対してのみ使用されるためである。
【0005】
実際には、癒着の発生する部位は不特定であり腹腔内の広範囲にわたるため、既存の癒着防止材を用いても腹腔内全体の癒着を完全には防止することはできない。さらに、癒着性腸閉塞の原因の大半は、癒着発生部位が予測困難な腸管、とりわけ小腸が関与する癒着であることから、癒着防止製品の更なる改善が望まれている。
このような臨床的な問題を解決するためには、癒着発生が明確に予測される腹壁切開創下や損傷部だけでなく、癒着発生部位が予測困難な腸管、とりわけ小腸といった腹腔内の広範囲にわたる癒着を防止する必要がある。
このような臨床的な問題を解決するためには、癒着発生が明確に予測される腹壁切開創下や損傷部だけでなく、癒着発生部位が予測困難な腸管、とりわけ小腸といった腹腔内の広範囲にわたる癒着を防止する必要がある。
【0006】
特許文献１には、パルプ由来ナノセルロース水分散液を肝臓切除面に塗布することにより、癒着防止効果が認められたことが記載されている。また、特許文献２には、微生物セルロース材料を傷害部位に適用することで、傷害部位に組織癒着を最小限にできることが記載されている。
【0007】
特許文献３及び非特許文献２には、ＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー（ＴＯＣＮ）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールからなるヒドロゲル組成物が、腹膜組織の癒着防止に用い得ることが記載されている。当該ゲル組成物は、４℃では透明液体であるが、２５℃及び３７℃でゲル化して流動性がなくなる性質を有していることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】国際公開第２０１５／０９９０８３号；実施例１９
【文献】国際公開第２０１０／０８０２６４号
【文献】米国特許出願公開第２０１９／００１５５６４号明細書
【非特許文献】
【0009】
【文献】Intra‐peritoneal prophylactic agents for preventing adhesions and adhesive intestinal obstruction after non-gynaecological abdominal surgery, Cochrane Database Syst Rev. 2009 Jan 21;(1):CD005080. doi: 10.1002/14651858.CD005080.pub2.
【文献】Materials Science and Engineering C 102(2019) 12-21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、新規な癒着防止剤、及びそれを用いた癒着防止方法を提供することを課題とする。更に、癒着発生が予測される組織又は臓器の損傷部位又は炎症部位のみならず、腹腔内の広範囲に癒着を防止ができる癒着防止剤、及びそれを用いた癒着防止方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討をした結果、アニオン化されたナノセルロース又はアニオン化されたナノキチンの水性分散液が、損傷部位又は炎症部位において効果的に癒着を防止できることを見出した。また、当該水性分散液は、体温付近で増粘することがない（粘度が高くならず流動性を維持する）ため、損傷部位又は炎症部位だけでなくその周辺の腹腔内にまで広く適用することができ、腹腔内の広範囲で癒着を防止できることをも見出した。かかる知見に基づいて更に検討を加えることにより、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、本発明は、癒着防止剤及びそれを用いた癒着防止方法を提供する。
項１．有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料を含む癒着防止剤。
項２．アニオン化されたナノ材料が、アニオン化されたナノセルロースである、項１に記載の癒着防止剤。
項３．アニオン化されたナノセルロースが、アニオン化されたセルロースナノファイバー及びセルロースナノクリスタルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項２に記載の癒着防止剤。
項４．アニオン化されたナノセルロースに含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種である、項２又は３に記載の癒着防止剤。
項５．アニオン化されたナノ材料が、アニオン化されたナノキチンである、項１に記載の癒着防止剤。
項６．アニオン化されたナノキチンが、アニオン化されたキチンナノファイバー及びアニオン化されたキチンナノクリスタルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項５に記載の癒着防止剤。
項７．アニオン化されたナノキチンに含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種である、項５又は６に記載の癒着防止剤。
項８．さらに液状媒体を含み、アニオン化されたナノ材料が液状媒体中に分散してなる、項１～７のいずれかに記載の癒着防止剤。
項９．液状媒体が水を含む媒体である、項８に記載の癒着防止剤。
項１０．癒着防止剤中のアニオン化されたナノ材料の濃度が、０．１～１０重量％である、項８又は９に記載の癒着防止剤。
項１１．癒着防止剤の粘度（３７℃）が、０．５～２０００ｍＰａ・ｓである、項８～１０のいずれかに記載の癒着防止剤。
項１２．癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が、２５重量％以上である、項８～１１のいずれかに記載の癒着防止剤。
項１３．腹腔内の臓器又は組織に適用するための、項１～１２のいずれかに記載の癒着防止剤。
項１４．腹腔内の臓器又は組織の癒着防止に使用するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料。
項１５．癒着防止剤を製造するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料の使用。
項１６．癒着防止剤として使用するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料。
項１７．項１～１３のいずれかに記載の癒着防止剤を、腹腔内の臓器又は組織に適用することを含む、癒着防止方法。
項１８．癒着防止剤の製造方法であって、有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料と、液状媒体とを混合する工程を含む、製造方法。
項１．有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料を含む癒着防止剤。
項２．アニオン化されたナノ材料が、アニオン化されたナノセルロースである、項１に記載の癒着防止剤。
項３．アニオン化されたナノセルロースが、アニオン化されたセルロースナノファイバー及びセルロースナノクリスタルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項２に記載の癒着防止剤。
項４．アニオン化されたナノセルロースに含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種である、項２又は３に記載の癒着防止剤。
項５．アニオン化されたナノ材料が、アニオン化されたナノキチンである、項１に記載の癒着防止剤。
項６．アニオン化されたナノキチンが、アニオン化されたキチンナノファイバー及びアニオン化されたキチンナノクリスタルからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項５に記載の癒着防止剤。
項７．アニオン化されたナノキチンに含まれるアニオン性基が、カルボキシル基、カルボキシメチル基、リン酸エステル基及び硫酸エステル基からなる群より選択される少なくとも１種である、項５又は６に記載の癒着防止剤。
項８．さらに液状媒体を含み、アニオン化されたナノ材料が液状媒体中に分散してなる、項１～７のいずれかに記載の癒着防止剤。
項９．液状媒体が水を含む媒体である、項８に記載の癒着防止剤。
項１０．癒着防止剤中のアニオン化されたナノ材料の濃度が、０．１～１０重量％である、項８又は９に記載の癒着防止剤。
項１１．癒着防止剤の粘度（３７℃）が、０．５～２０００ｍＰａ・ｓである、項８～１０のいずれかに記載の癒着防止剤。
項１２．癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が、２５重量％以上である、項８～１１のいずれかに記載の癒着防止剤。
項１３．腹腔内の臓器又は組織に適用するための、項１～１２のいずれかに記載の癒着防止剤。
項１４．腹腔内の臓器又は組織の癒着防止に使用するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料。
項１５．癒着防止剤を製造するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料の使用。
項１６．癒着防止剤として使用するための、アニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料。
項１７．項１～１３のいずれかに記載の癒着防止剤を、腹腔内の臓器又は組織に適用することを含む、癒着防止方法。
項１８．癒着防止剤の製造方法であって、有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料と、液状媒体とを混合する工程を含む、製造方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明の癒着防止剤は、癒着を防止しようとする部位に有効成分であるアニオン化されたナノ材料を適用することにより、効果的に癒着を防止することができる。本発明の癒着防止剤は、有効成分を含む分散液（特に、水性分散液）の剤型とすることができる。当該分散液は、体温付近でも粘度が小さく適度な流動性を有するため、癒着発生が明確に予測される腹壁切開創下や損傷部だけでなく、癒着発生が予測困難な、腸管（とりわけ小腸）等の腹腔内の広範囲にわたる組織表面全体に、有効成分を接触又は付着させることができる利点を有する。
【0014】
本発明の癒着防止剤は、このように腹壁切開創下や損傷部に限局されず、腹腔内の広範囲にわたる癒着を防止することが可能となるため、臨床的に重大な問題となっている癒着性腸閉塞の原因となる腸管（とりわけ小腸）が関与する癒着を防止することができる。
【0015】
本発明の癒着防止剤は、損傷部位の治癒に必要な期間において癒着を効果的に防止できるため、癒着による合併症を低減することができる。治癒後は体内に吸収されるため、異物反応等による新たな癒着を惹起することもない。
【0016】
本発明の癒着防止剤は、典型的には有効成分を含む分散液の剤型であるため、使用前に複雑な処理（事前調合、形状調整等）を経る必要がなく、取り扱い性に優れている。また、当該分散液は、室温から体温付近で適度な流動性を有しているため、そのまま損傷部位の表面を含む腹腔内の広範囲に適用（滴下、スプレー、塗布、ディップ(浸漬)、注入等）することができる。そのため、癒着防止剤は、開腹手術のみならず低侵襲の内視鏡手術において好適に用いられる。
【0017】
本発明の癒着防止剤は、有効成分としてアニオン化されたナノ材料を含んでいるため、上記の優れた癒着防止効果を発揮すると考えられる。これに対し、未修飾のナノ材料又はカチオン化されたナノ材料では、本発明のような癒着防止効果は発揮することはできず、むしろ癒着を増悪してしまう場合がある（図２～４及び９、比較例１及び４～７を参照）。また、サブナノオーダーの平均径を有するセルロース分子鎖（径０．４ｎｍ程度）をもつカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）では、アニオン化されていても溶液の剤型では本発明のような優れた癒着防止効果は得られない（図２及び３、比較例２及び３を参照）。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】アニオン化されたナノ材料の顕微鏡写真である。（ａ）カルボキシル化ＣＮＦ、（ｂ）カルボキシル化ＣＮＣ、（ｃ）カルボキシル化キチンＮＣ
【図2】実施例１８で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図3】実施例１９で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図4】実施例２０で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図5】実施例２１で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図6】実施例２２で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図7】実施例２３で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図8】実施例２４で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図9】実施例２５で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【図10】実施例２６で示された癒着防止試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。
１．癒着防止剤
本発明の癒着防止剤は、有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料を含むことを特徴とする。本発明の癒着防止剤は、アニオン化されたナノ材料と液状媒体とを含み、アニオン化されたナノ材料が液状媒体中に分散されてなる分散液の剤型であることが好ましい。
１．癒着防止剤
本発明の癒着防止剤は、有効成分としてアニオン化されたナノセルロース及びアニオン化されたナノキチンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアニオン化されたナノ材料を含むことを特徴とする。本発明の癒着防止剤は、アニオン化されたナノ材料と液状媒体とを含み、アニオン化されたナノ材料が液状媒体中に分散されてなる分散液の剤型であることが好ましい。
【0020】
（１）アニオン化されたナノセルロース
アニオン化されたナノ材料のうちアニオン化されたナノセルロースについて説明する。 植物の細胞壁の中では、平均繊維径が約３～４ｎｍのセルロースミクロフィブリル（エレメンタリーフィブリル）が基本骨格物質(基本エレメント)として存在する。このセルロースミクロフィブリルは、セルロース分子鎖（平均径は約０．４ｎｍ）の数十本が規則的に集合した束からなる極細の単繊維であり、このセルロースミクロフィブリルが集まって植物の骨格を形成している。本発明において、ナノセルロースとは、植物繊維を含む材料（例えば、木材パルプ等）をその繊維をナノサイズレベルまで解きほぐしたものである。尚、ここで言う繊維径とは繊維の直径を意味する。
アニオン化されたナノ材料のうちアニオン化されたナノセルロースについて説明する。 植物の細胞壁の中では、平均繊維径が約３～４ｎｍのセルロースミクロフィブリル（エレメンタリーフィブリル）が基本骨格物質(基本エレメント)として存在する。このセルロースミクロフィブリルは、セルロース分子鎖（平均径は約０．４ｎｍ）の数十本が規則的に集合した束からなる極細の単繊維であり、このセルロースミクロフィブリルが集まって植物の骨格を形成している。本発明において、ナノセルロースとは、植物繊維を含む材料（例えば、木材パルプ等）をその繊維をナノサイズレベルまで解きほぐしたものである。尚、ここで言う繊維径とは繊維の直径を意味する。
【0021】
本発明のアニオン化されたナノセルロースは、ナノセルロースの表面に存在するセルロース分子鎖上のグルコースの水酸基の一部がアニオン化、即ちアニオン性基に化学修飾されたものである。そのため、アニオン変性されたナノセルロースと表記することもある。
【0022】
ナノセルロースは、一般的にその製造方法に由来して基本構造が相違する場合があり、その相違に基づいて、例えば、ファイバー状のセルロースナノファイバー（以下「ＣＮＦ」とも表記する）、及びクリスタル状のセルロースナノクリスタル（以下「ＣＮＣ」とも表記する）に分類することができる。
【0023】
本発明のアニオン化されたＣＮＦの平均繊維径は、通常３～１００ｎｍであり、好ましくは３～５０ｎｍであり、より好ましくは３～１０ｎｍである。その平均繊維長は、通常０．３～２００μｍであり、好ましくは０．５～５０μｍ、より好ましくは０．５～１０μｍである。アスペクト比は、通常、５０以上であり、好ましくは５０～１００００であり、より好ましくは５０～１０００である。尚、ここで言う平均とは相加平均を意味する。
【0024】
本発明のアニオン化されたＣＮＣの平均繊維径は、通常３～１００ｎｍであり、好ましくは３～５０ｎｍであり、より好ましくは３～１０ｎｍである。その平均繊維長は、通常１００～４００ｎｍであり、好ましくは１００～３００ｎｍであり、より好ましくは１００～２００ｎｍである。アスペクト比は、通常、５０未満である。
【0025】
本発明のアニオン化されたナノセルロースは、このＣＮＦ及びＣＮＣのそれぞれがアニオン化されたものであり、上記ＣＮＦ及びＣＮＣそれぞれの特徴を有している。本発明のアニオン化されたナノセルロースは、アニオン化されたセルロースナノファイバー（以下「アニオン化ＣＮＦ」とも表記する）、及びアニオン化されたセルロースナノクリスタル（以下「アニオン化ＣＮＣ」とも表記する）の両方を含む概念である。
【0026】
本発明のアニオン化されたナノセルロースが有するアニオン性基としては、脱プロトン化してマイナスの電荷を帯びることができる基であり、例えば、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、硫酸エステル基（－Ｏ－ＳＯ３Ｈ）、リン酸エステル基（－Ｏ－ＰＯ３Ｈ２）、カルボキシメチル基（－ＣＨ２ＣＯＯＨ）、亜リン酸エステル基（－Ｐ(ＯＲ)３、－Ｐ(Ｏ)(ＯＲ)２、ここで、Ｒは独立して水素原子又は有機基（例えば、アルキル基等）である。）、硝酸エステル基（－Ｏ－ＮＯ２Ｈ）等が挙げられる。
【0027】
本発明のアニオン化されたナノセルロースとしては、好ましくは、カルボキシル基を有するナノセルロース（以下「カルボキシル化ナノセルロース」とも表記する）、硫酸エステル基を有するナノセルロース（以下「硫酸エステル化ナノセルロース」とも表記する）、リン酸エステル基を有するナノセルロース（以下「リン酸エステル化ナノセルロース」とも表記する）、カルボキシメチル基を有するナノセルロース（以下「カルボキシメチル化ナノセルロース」とも表記する）等を挙げることができる。
【0028】
これらは、必要に応じ、カチオン性の原子又は原子団と共に塩を形成していてもよい。当該塩としては、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）の塩、アンモニウム塩、有機アンモニウム（例えば、テトラアルキルアンモニウム等）との塩等が挙げられる。好ましくはアルカリ金属の塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。なお、本発明のアニオン化されたナノセルロースは、上記のアニオン性基を有するナノセルロース及びその塩を包含する意味に用いられる。
【0029】
カルボキシル化ナノセルロースは、セルロースを構成するグルコースの６位の水酸基、或いはグルコースの２位及び３位の水酸基がカルボキシル基に化学修飾された構造を有している。例えば、該６位の水酸基の一部が酸化されカルボキシル基に変換されたもの（例えば、ＴＥＭＰＯを用いた酸化法）、該２位及び３位の水酸基の一部が酸化されカルボキシル基に変換されたもの（例えば、次亜塩素酸ナトリウム５水和物を用いた酸化法）等が挙げられる。カルボキシル化ナノセルロースは、公知の方法、例えば、特開２００８－００１７２８号、特開２０１７－１５５０２４号、国際公開第２０１８／２３０３５４号、ACS Sustainable Chem Eng 2020, 8, 17800-17806等に従い又は準じて製造することができる。
【0030】
カルボキシル化ナノセルロースにおける、カルボキシル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、通常、カルボキシル化ナノセルロースを含む水分散液（スラリー）を、アルカリ水溶液（例えば、水酸化ナトリウム水溶液等）で中和滴定することにより求めることができる。例えば、実施例の［導入官能基含量の測定１］の記載に従い測定することができる。
【0031】
硫酸エステル化ナノセルロースは、通常、ナノセルロースの表面に存在するセルロースを構成するグルコースの２位、３位及び／又は６位の水酸基の一部が硫酸で化学修飾された構造を有している。硫酸エステル化ナノセルロースは、公知の方法、例えば、国際公開第２０１８／１３１７２１号等に従い又は準じて製造することができる。
【0032】
硫酸エステル化ナノセルロースにおける、硫酸エステル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、通常、硫酸エステル化ナノセルロースを含む水分散液（スラリー）を、アルカリ水溶液（例えば、水酸化ナトリウム水溶液等）で中和滴定することにより求めることができる。例えば、実施例の［導入官能基含量の測定２］の記載に従い又は準じて測定することができる。
【0033】
リン酸エステル化ナノセルロースは、通常、ナノセルロースの表面に存在するセルロースを構成するグルコースの２位、３位及び／又は６位の水酸基の一部がリン酸で化学修飾された構造を有している。リン酸エステル化ナノセルロースは、公知の方法、例えば、国際公開第２０１４／１８５５０５号等に従い又は準じて製造することができる。
【0034】
リン酸エステル化ナノセルロースにおける、リン酸エステル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、例えば、実施例の［導入官能基含量の測定２］の記載に従い又は準じて測定することができる。
【0035】
カルボキシメチル化ナノセルロースにおける、カルボキシメチル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．０６～３．８２ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．３～３．６４ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．６～３．４４ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、例えば、実施例の［導入官能基含量の測定１］の記載に従い又は準じて測定することができる。
【0036】
本発明の癒着防止剤には、アニオン化されたナノセルロースを１種又は複数種含んでいてもよい。アニオン化されたナノセルロースのうち、癒着防止の効果がより向上する観点から、アニオン化ＣＮＦよりもアニオン化ＣＮＣが好ましい。
【0037】
（２）アニオン化されたナノキチン
アニオン化されたナノ材料のうちアニオン化されたナノキチンについて説明する。
キチンとは、節足動物や甲殻類の外骨格すなわち外皮、軟体動物の殻皮の表面などの多くの無脊椎動物の体表を覆うクチクラや、キノコなど菌類の細胞壁などの主成分である。キチンは、直鎖型の含窒素多糖高分子であり、ポリ－β１－４－Ｎ－アセチルグルコサミンを意味し、その構造は、セルロースと類似の構造であるが、２位炭素の水酸基がアセトアミド基になっている。即ち、Ｎ－アセチルグルコサミンの１，４－重合物である。ナノキチンとは、上記の原料から得られるキチンをナノサイズレベルまで解きほぐしたものである。
アニオン化されたナノ材料のうちアニオン化されたナノキチンについて説明する。
キチンとは、節足動物や甲殻類の外骨格すなわち外皮、軟体動物の殻皮の表面などの多くの無脊椎動物の体表を覆うクチクラや、キノコなど菌類の細胞壁などの主成分である。キチンは、直鎖型の含窒素多糖高分子であり、ポリ－β１－４－Ｎ－アセチルグルコサミンを意味し、その構造は、セルロースと類似の構造であるが、２位炭素の水酸基がアセトアミド基になっている。即ち、Ｎ－アセチルグルコサミンの１，４－重合物である。ナノキチンとは、上記の原料から得られるキチンをナノサイズレベルまで解きほぐしたものである。
【0038】
本発明のアニオン化されたナノキチンは、ナノキチンの表面に存在するＮ－アセチルグルコサミンの水酸基の一部がアニオン化、即ちアニオン性基に化学修飾されたものである。そのため、アニオン変性されたナノキチンと表記されることもある。
【0039】
ナノキチンは、一般的にその製造方法に由来して基本構造が相違する場合があり、その相違に基づいて、例えば、ファイバー状のキチンナノファイバー（以下「キチンＮＦ」とも表記する）、及びクリスタル状のキチンナノクリスタル（以下「キチンＮＣ」とも表記する）に分類することができる。
【0040】
本発明のアニオン化されたキチンＮＦの平均繊維径は、通常３～１００ｎｍであり、好ましくは３～５０ｎｍであり、より好ましくは３～１０ｎｍである。その平均繊維長は、通常０．５～２００μｍであり、好ましくは０．５～５０μｍ、特に好ましくは０．５～１０μｍである。アスペクト比は、通常、５０以上であり、好ましくは５０～１００００、より好ましくは５０～１０００である。
【0041】
本発明のアニオン化されたキチンＮＣの平均繊維径は、通常３～１００ｎｍであり、好ましくは３～５０ｎｍであり、より好ましくは３～１０ｎｍである。その平均繊維長は、通常１００～４００ｎｍであり、好ましくは１００～３００ｎｍであり、より好ましくは１００～２００ｎｍである。アスペクト比は、通常、５０未満である。
【0042】
本発明のアニオン化されたナノキチンは、このキチンＮＦ及びキチンＮＣのそれぞれがアニオン化されたものであり、上記キチンＮＦ及びキチンＮＣそれぞれの特徴を有している。本発明のアニオン化されたナノキチンは、アニオン化されたキチンナノファイバー（以下「アニオン化キチンＮＦ」とも表記する）、及びアニオン化されたキチンナノクリスタル（以下「アニオン化キチンＮＣ」とも表記する）の両方を含む概念である。
【0043】
本発明のアニオン化されたナノキチンが有するアニオン性基としては、脱プロトン化してマイナスの電荷を帯びることができる基であり、例えば、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、硫酸エステル基（－Ｏ－ＳＯ３Ｈ）、リン酸エステル基（－Ｏ－ＰＯ３Ｈ２）、カルボキシメチル基（－ＣＨ２ＣＯＯＨ）、亜リン酸エステル基（－Ｐ(ＯＲ)３、－Ｐ(Ｏ)(ＯＲ)２、ここで、Ｒは前記に同じ。）、硝酸エステル基（－Ｏ－ＮＯ２Ｈ）等が挙げられる。そのうち、カルボキシル基が好ましい。
【0044】
本発明のアニオン化されたナノキチンとしては、好ましくは、カルボキシル基を有するナノキチン（以下、「カルボキシル化ナノキチン」とも表記する）、硫酸エステル基を有するナノキチン（以下、「硫酸エステル化ナノキチン」とも表記する）、リン酸エステル基を有するナノキチン（以下、「リン酸エステル化ナノキチン」とも表記する）、カルボキシメチル基を有するナノキチン（以下「カルボキシメチル化ナノキチン」とも表記する）等を挙げることができる。
【0045】
これらは、必要に応じ、カチオン性の原子又は原子団と共に塩を形成していてもよい。当該塩としては、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）の塩、アンモニウム塩、有機アンモニウム（例えば、テトラアルキルアンモニウム等）との塩等が挙げられる。好ましくはアルカリ金属の塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。なお、本発明のアニオン化されたナノキチンは、上記のアニオン性基を有するナノキチン及びその塩を包含する意味に用いられる。
【0046】
カルボキシル化ナノキチンは、通常、ナノキチンの表面に存在するＮ－アセチルグルコサミンの６位の水酸基の一部がカルボキシル基に化学修飾された構造を有している。例えば、該６位の水酸基の一部が酸化（例えば、ＴＥＭＰＯ酸化）されカルボキシル基に変換されたもの等が挙げられる。カルボキシル化ナノキチンは、公知の方法、例えば、Biomacromolecules 2008, 9, 192-198等に従い又は準じて製造することができる。
【0047】
カルボキシル化ナノキチンにおける、カルボキシル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、例えば、実施例の［導入官能基含量の測定１］の記載に従い測定することができる。
【0048】
硫酸エステル化ナノキチンは、通常、ナノキチンの表面に存在するＮ－アセチルグルコサミンの３位及び／又は６位の水酸基の一部が硫酸で化学修飾された構造を有している。硫酸エステル化ナノキチンは、公知の方法、例えば、Carbohydrate Polymers, 2018, 197, 349-358等に従い又は準じて製造することができる。
【0049】
硫酸エステル化ナノキチンにおける、硫酸エステル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、例えば、実施例の［導入官能基含量の測定２］の記載に準じて測定することができる。
【0050】
リン酸エステル化ナノキチンにおける、リン酸エステル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．１～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、例えば、実施例の［導入官能基含量の測定２］の記載に準じて測定することができる。
【0051】
カルボキシメチル化ナノキチンにおける、カルボキシメチル基の濃度（官能基導入量）は、通常、０．０６～３．８２ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．３～３．６４ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．６～３．４４ｍｍｏｌ／ｇである。官能基導入量は、例えば、実施例の［導入官能基含量の測定１］の記載に従い又は準じて測定することができる。
【0052】
本発明の癒着防止剤には、アニオン化されたナノキチンを１種又は複数種含んでいてもよい。本発明のアニオン化されたナノキチンのうち、アニオン化キチンＮＣが好ましく、カルボキシル化されたキチンナノクリスタル（以下「カルボキシル化キチンＮＣ」とも表記する）がより好ましい。
【0053】
（３）液状媒体
本発明の癒着防止剤に含み得る液状媒体は、薬学的に許容できる水を含んでいることが好ましい。即ち、液状媒体は水性液状媒体であることが好ましい。
本発明の癒着防止剤に含み得る液状媒体は、薬学的に許容できる水を含んでいることが好ましい。即ち、液状媒体は水性液状媒体であることが好ましい。
【0054】
該水性液状媒体としては、例えば、滅菌水、精製水、蒸留水、イオン交換水、超純水等の水；生理的食塩水、塩化ナトリウム水溶液、塩化カリウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、塩化マグネシウム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液、硫酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、リンゲル液等の電解質水溶液；リン酸緩衝溶液、トリス塩酸緩衝溶液等の緩衝溶液；グリセリン、エチレングリコール、エタノール、イソプロピルアルコール等の水溶性有機物を含有する水溶液；グルコース、スクロース、マルトース等の糖分子を含有する水溶液；ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子を含む水溶液；オクチルグルコシド、ドデシルマルトシド、プルロニック（登録商標）（ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコール／ポリエチレングリコール共重合体）等の界面活性剤を含む水溶液；細胞内液、細胞外液、間質液、リンパ液、髄液、血液、胃液、血清、血漿、唾液、涙、精液、尿等の体液；又はこれらの混合液等が挙げられる。このうち、精製水、生理的食塩水、リンゲル液等が好ましい。
【0055】
本発明の癒着防止剤は、上記成分の他に、保存安定性の向上、治療効果及び癒着防止効果の促進、取扱性の向上、細菌感染の防止等の観点から、必要に応じて、さらに抗菌剤、抗生剤、抗炎症剤、血行改善剤、ステロイド剤、酵素阻害剤、増殖因子、各種ビタミン等の薬理成分；賦形剤、粘度調節剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤等の添加剤；窒素ガス、炭酸ガス等のガス担体等を含んでいてもよい。
【0056】
（４）剤型
本発明の癒着防止剤は、腹腔内の組織や臓器の表面に適用するため、アニオン化されたナノ材料が液状媒体（特に、水性液状媒体）に分散した分散液（特に、水性分散液）の剤型であることが好ましい。本発明の癒着防止剤には、アニオン化されたナノ材料を１種又は複数種含んでいてもよい。本発明の癒着防止剤が分散液の場合、当該分散液には、癒着防止効果が発揮される有効量のアニオン化されたナノ材料を含んでいる。癒着防止剤（分散液）中に含まれるアニオン化されたナノ材料の濃度は、癒着防止剤（分散液）の総量に対して、通常、０．０１～１０重量％（ｗｔ％）であり、好ましくは０．１～５重量％であり、より好ましくは０．２～３重量％であり、特に好ましくは０．３～２重量％である。
本発明の癒着防止剤は、腹腔内の組織や臓器の表面に適用するため、アニオン化されたナノ材料が液状媒体（特に、水性液状媒体）に分散した分散液（特に、水性分散液）の剤型であることが好ましい。本発明の癒着防止剤には、アニオン化されたナノ材料を１種又は複数種含んでいてもよい。本発明の癒着防止剤が分散液の場合、当該分散液には、癒着防止効果が発揮される有効量のアニオン化されたナノ材料を含んでいる。癒着防止剤（分散液）中に含まれるアニオン化されたナノ材料の濃度は、癒着防止剤（分散液）の総量に対して、通常、０．０１～１０重量％（ｗｔ％）であり、好ましくは０．１～５重量％であり、より好ましくは０．２～３重量％であり、特に好ましくは０．３～２重量％である。
【0057】
本発明の癒着防止剤は、癒着防止のための有効成分としてアニオン化されたナノ材料を含み、好ましくは有効成分としてアニオン化されたナノ材料から必須としてなり、より好ましくは有効成分としてアニオン化されたナノ材料のみからなる。癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量は、通常、２５重量％以上であり、好ましくは３０～１００重量％であり、より好ましくは３０～８０重量％であり、特に好ましくは３０～６０重量％である。総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が１００重量％未満の時、本発明の癒着防止剤は電解質、糖などの添加剤を含む。
【0058】
本発明の癒着防止剤が分散液の場合、操作性や腹腔内で広範囲に適用できるという観点から、常温から体温付近の範囲で適度な流動性を有していることが好ましい。例えば、癒着防止剤（分散液）の粘度は、その温度が０～４０℃（さらに、２５～３７℃、特に３７℃付近）の時に、通常、０．５～２０００ｍＰａ・sであり、０．５～１０００ｍＰａ・ｓであることが好ましい。特に、アニオン化されたナノクリスタルの場合、０．５～１００ｍＰａ・ｓであることがより好ましい。これにより、癒着防止剤（分散液）を、癒着発生が予測される損傷部位だけでなく、癒着発生が予想困難な部位を含む腹腔内の組織表面全体に接触又は付着させることができる。なお、粘度は、実施例に記載されるように、回転式粘度計を用いて測定することができる。
【0059】
本発明の癒着防止剤のｐＨは、生体への安全性の観点から、通常、４～８であり、好ましくは６～７．５である。
【0060】
本発明の癒着防止剤は、上記の分散液を、例えば、液剤；エアゾール剤やポンプスプレー剤などのスプレー剤；塗布剤；注射剤等の剤型とすることもできる。その使用形態に応じて、組織上に直接適用することができ、かつ操作性がよい剤型に製剤化することができる。
【0061】
本発明に係る癒着防止剤は、製薬上許容される担体をさらに含む組成物であってもよい。製薬上許容される担体は、使用する剤形に合わせて選択することができ、ガス担体又は液体担体等であってもよい。
【0062】
（５）好ましい態様
癒着防止剤の好ましい一実施形態としては、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体（特に、水性液状媒体）を含む水性分散液であり、アニオン化されたナノ材料が、カルボキシル基の濃度が０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇであるカルボキシル化されたナノセルロース（特に、カルボキシル化ＣＮＣ）であり、癒着防止剤に含まれるカルボキシル化されたナノセルロースの濃度が０．３～２重量％（ｗｔ％）であり、癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が３０～１００重量％であり、温度が２５～３７℃（特に３７℃付近）における粘度が０．５～２０００ｍＰａ・ｓ（特に、０．５～１０００ｍＰａ・ｓ）である、癒着防止剤が挙げられる。
癒着防止剤の好ましい一実施形態としては、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体（特に、水性液状媒体）を含む水性分散液であり、アニオン化されたナノ材料が、カルボキシル基の濃度が０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇであるカルボキシル化されたナノセルロース（特に、カルボキシル化ＣＮＣ）であり、癒着防止剤に含まれるカルボキシル化されたナノセルロースの濃度が０．３～２重量％（ｗｔ％）であり、癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が３０～１００重量％であり、温度が２５～３７℃（特に３７℃付近）における粘度が０．５～２０００ｍＰａ・ｓ（特に、０．５～１０００ｍＰａ・ｓ）である、癒着防止剤が挙げられる。
【0063】
癒着防止剤の好ましい他の実施形態としては、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体（特に、水性液状媒体）を含む水性分散液であり、アニオン化されたナノ材料が、硫酸エステル基の濃度が０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇである硫酸エステル化されたナノセルロース（特に、硫酸エステル化ＣＮＣ）であり、癒着防止剤に含まれる硫酸エステル化されたナノセルロースの濃度が０．３～２重量％（ｗｔ％）であり、癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が３０～１００重量％であり、温度が２５～３７℃（特に３７℃付近）における粘度が０．５～２０００ｍＰａ・ｓ（特に、０．５～１０００ｍＰａ・ｓ）である、癒着防止剤が挙げられる。
【0064】
癒着防止剤の好ましい他の実施形態としては、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体（特に、水性液状媒体）を含む水性分散液であり、アニオン化されたナノ材料が、リン酸エステル基の濃度が０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇであるリン酸エステル化されたナノセルロース（特に、リン酸エステル化ＣＮＣ）であり、癒着防止剤に含まれるリン酸エステル化されたナノセルロースの濃度が０．３～２重量％（ｗｔ％）であり、癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が３０～１００重量％であり、温度が２５～３７℃（特に３７℃付近）における粘度が０．５～２０００ｍＰａ・ｓ（特に、０．５～１０００ｍＰａ・ｓ）である、癒着防止剤が挙げられる。
【0065】
癒着防止剤の好ましい他の実施形態としては、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体（特に、水性液状媒体）を含む水性分散液であり、アニオン化されたナノ材料が、カルボキシメチル基の濃度が０．０６～３．８２ｍｍｏｌ／ｇであるカルボキシメチル化されたナノセルロース（特に、カルボキシメチル化ＣＮＣ）であり、癒着防止剤に含まれるカルボキシメチル化されたナノセルロースの濃度が０．３～２重量％（ｗｔ％）であり、癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が３０～１００重量％であり、温度が２５～３７℃（特に３７℃付近）における粘度が０．５～２０００ｍＰａ・ｓ（特に、０．５～１０００ｍＰａ・ｓ）である、癒着防止剤が挙げられる。
【0066】
癒着防止剤の好ましい他の実施形態としては、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体（特に、水性液状媒体）を含む水性分散液であり、アニオン化されたナノ材料が、カルボキシル基の濃度が０．１～２．５ｍｍｏｌ／ｇであるカルボキシル化されたナノキチン（特に、カルボキシル化キチンＮＣ）であり、癒着防止剤に含まれるカルボキシル化されたナノキチンの濃度が０．３～２重量％（ｗｔ％）であり、癒着防止剤に含まれる総固形分中のアニオン化されたナノ材料の含有量が３０～１００重量％であり、温度が２５～３７℃（特に３７℃付近）における粘度が０．５～２０００ｍＰａ・ｓ（特に、０．５～１０００ｍＰａ・ｓ）である、癒着防止剤が挙げられる。
【0067】
２．癒着防止剤の調製
本発明に係る癒着防止剤は、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体を含むことが好ましく、本発明の癒着防止効果を発揮できる範囲で、必要に応じ、更に他の成分を添加してもよい。癒着防止剤は、通常、アニオン化されたナノ材料と液状媒体とを混合して調製することができる。具体的には、液状媒体中にアニオン化されたナノ材料を均一に分散させることにより調製することができる。分散方法としては、超音波分散法、撹拌法(例えば、ホモミキサー等)等を用いて均一に分散させることにより調製することができる。
本発明に係る癒着防止剤は、アニオン化されたナノ材料及び液状媒体を含むことが好ましく、本発明の癒着防止効果を発揮できる範囲で、必要に応じ、更に他の成分を添加してもよい。癒着防止剤は、通常、アニオン化されたナノ材料と液状媒体とを混合して調製することができる。具体的には、液状媒体中にアニオン化されたナノ材料を均一に分散させることにより調製することができる。分散方法としては、超音波分散法、撹拌法(例えば、ホモミキサー等)等を用いて均一に分散させることにより調製することができる。
【0068】
本発明の癒着防止剤は、腹腔内の臓器、組織等に適用されることから、滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理は、高圧蒸気滅菌、ろ過滅菌、電子線滅菌等の公知の方法が採用できる。
【0069】
３．癒着防止剤の使用方法
本発明の癒着防止剤は、癒着を防止する部位に使用（適用）することで効果的に癒着を防止できる。
本発明の癒着防止剤は、癒着を防止する部位に使用（適用）することで効果的に癒着を防止できる。
【0070】
癒着を防止する部位としては、例えば、人又は動物の臓器、組織等における炎症部位又は損傷部位が挙げられる。特に、手術の切開部位、手術中の処置により人為的に生じた損傷部位、体内の内因性又は外因性の炎症部位等が挙げられる。臓器としては、例えば、胃、小腸、大腸、十二指腸、腸間膜、腹膜、盲腸、肝臓、心臓、心膜、肺、脳、卵巣、子宮、脾臓、大網、眼球等が挙げられ、組織としては、例えば、骨、脊椎、神経、軟骨、靱帯、腱、皮膚、管（血管、卵管等）、脂肪等が挙げられる。
【0071】
本発明の癒着防止剤は、粘度が小さく適度な流動性を有する液状分散体（例えば、水性分散液）の剤型とすることにより、癒着発生が明確に予測される上記の腹壁切開創下や損傷部だけでなく、癒着発生部位が予測困難な腸管、とりわけ小腸といった腹腔内の広範囲にわたる組織表面全体に有効成分を接触又は付着させて癒着を防止することができる。
【0072】
本発明の癒着防止剤は、液状分散体（例えば、水性分散液）の剤型とすることができ、通常、液剤、スプレー剤（エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、塗布剤、注射剤等に製剤化することができる。この製剤を、癒着を防止する部位の表面に、滴下、曝露、スプレー、塗布等して投与することができる。
【0073】
癒着防止剤の使用量は、その癒着防止効果が発揮できる量であれば特に限定はない。癒着防止剤（液状分散体）は、癒着を防止する部位が癒着防止剤で被覆されるように適用することができる。
【0074】
本発明の癒着防止剤は、２液剤型の癒着防止剤に必要な使用前の調合、シート状の癒着防止材に必要な形状又はサイズの調整等のような複雑な前処理を経ることなくそのまま癒着を防止する部位に適用できるため、取扱い性に優れている。そのため、特に、低侵襲の内視鏡手術において好適に用いられる。
【0075】
本明細書において用いられる用語「を含む」、「を含有する」又は「を有する」には、「から必須としてなる」及び「のみからなる」の概念も包含するものとして解釈される。
【実施例】
【0076】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0077】
実施例及び比較例に用いた材料について説明する。なお、以下の実施例及び比較例で用いる略記号の意味は、次のとおりである。
ＣＮＦ：セルロースナノファイバー
ＣＮＣ：セルロースナノクリスタル
ＣＭＣ：カルボキシメチルセルロース
キチンＮＣ：キチンナノクリスタル
キチンＮＦ：キチンナノファイバー
キトサンＮＦ：キトサンナノファイバー
ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチルピペリジン１－オキシル
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＣＮＦ：セルロースナノファイバー
ＣＮＣ：セルロースナノクリスタル
ＣＭＣ：カルボキシメチルセルロース
キチンＮＣ：キチンナノクリスタル
キチンＮＦ：キチンナノファイバー
キトサンＮＦ：キトサンナノファイバー
ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチルピペリジン１－オキシル
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【0078】
実施例及び比較例で得られた分散液の性質は、以下のように測定した。
【0079】
［固形分濃度の測定］
固形分濃度は、水分計（ＭＯＣ６３ｕ、株式会社島津製作所製）を用いて測定した。標準乾燥自動停止モード（乾燥温度：１０５℃、終了条件：３０秒間の水分変化率が０．０５％以下）で分散液の固形分濃度を測定した。
固形分濃度は、水分計（ＭＯＣ６３ｕ、株式会社島津製作所製）を用いて測定した。標準乾燥自動停止モード（乾燥温度：１０５℃、終了条件：３０秒間の水分変化率が０．０５％以下）で分散液の固形分濃度を測定した。
【0080】
［形状（繊維長、繊維径）の測定］
走査型プローブ顕微鏡を用いて繊維形状を測定した。超純水で０．００５重量％（ｗｔ％）に希釈した分散液１０μＬをマイカ基板に滴下し、室温で乾燥させ、観察用試料とした。試料を走査型プローブ顕微鏡（環境制御型ユニットＥ－ｓｗｅｅｐ、株式会社日立ハイテクサイエンス製）にセットし、マイクロカンチレバーＳＩ－ＤＦ４０（株式会社日立ハイテクサイエンス製）を用いて、ＤＦＭモードで繊維画像を取得した（図１（ａ）、図１（ｂ）及び図１（ｃ））。
画像からランダムに５０個の繊維を選択し、画像解析ソフト（Ｇｗｙｄｄｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｇｗｙｄｄｉｏｎ．ｎｅｔ／）を用いて１本１本の繊維長及び繊維径を測定し、それぞれ最小及び最大の数値範囲で表した。また、繊維長及び繊維径の平均を相加平均にて求めた。なお、ファイバーの繊維長の最大値については、正確な測定が困難であるため、おおよその値として示した。
走査型プローブ顕微鏡を用いて繊維形状を測定した。超純水で０．００５重量％（ｗｔ％）に希釈した分散液１０μＬをマイカ基板に滴下し、室温で乾燥させ、観察用試料とした。試料を走査型プローブ顕微鏡（環境制御型ユニットＥ－ｓｗｅｅｐ、株式会社日立ハイテクサイエンス製）にセットし、マイクロカンチレバーＳＩ－ＤＦ４０（株式会社日立ハイテクサイエンス製）を用いて、ＤＦＭモードで繊維画像を取得した（図１（ａ）、図１（ｂ）及び図１（ｃ））。
画像からランダムに５０個の繊維を選択し、画像解析ソフト（Ｇｗｙｄｄｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｇｗｙｄｄｉｏｎ．ｎｅｔ／）を用いて１本１本の繊維長及び繊維径を測定し、それぞれ最小及び最大の数値範囲で表した。また、繊維長及び繊維径の平均を相加平均にて求めた。なお、ファイバーの繊維長の最大値については、正確な測定が困難であるため、おおよその値として示した。
【0081】
［導入官能基含量の測定１］（カルボキシル基の濃度）
伝導度滴定法によりカルボキシル基濃度を測定した。具体的には、ナノセルロース分散液又はナノキチン分散液を０．３ｗｔ％に調整後、０．１Ｎ塩酸水溶液によってｐＨを約２．０に調整した。電位差自動滴定装置（ＡＴ－５１０、京都電子工業株式会社製）を用い、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定した。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下式に従い、カルボキシル基濃度を求めた。
カルボキシル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．０５／ナノセルロース重量（ｇ）
カルボキシル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．０５／ナノキチン重量（ｇ）
伝導度滴定法によりカルボキシル基濃度を測定した。具体的には、ナノセルロース分散液又はナノキチン分散液を０．３ｗｔ％に調整後、０．１Ｎ塩酸水溶液によってｐＨを約２．０に調整した。電位差自動滴定装置（ＡＴ－５１０、京都電子工業株式会社製）を用い、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定した。電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下式に従い、カルボキシル基濃度を求めた。
カルボキシル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．０５／ナノセルロース重量（ｇ）
カルボキシル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．０５／ナノキチン重量（ｇ）
【0082】
［導入官能基含量の測定２］（リン酸エステル基又は硫酸エステル基の濃度）
先行文献（特開２０１７－２５４６８号）を参考に、リン酸エステル基又は硫酸エステル基濃度を測定した。具体的には、リン酸エステル化ＣＮＦ分散液又は硫酸エステル化ＣＮＦ分散液を０．２ｗｔ％に調整し、強酸性イオン交換樹脂による処理を行った後に、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、電気伝導度を測定した。強酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下式に従い、リン酸エステル基又は硫酸エステル基濃度を求めた。
リン酸エステル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．1／ナノセルロース重量（ｇ）
硫酸エステル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．1／ナノセルロース重量（ｇ）
先行文献（特開２０１７－２５４６８号）を参考に、リン酸エステル基又は硫酸エステル基濃度を測定した。具体的には、リン酸エステル化ＣＮＦ分散液又は硫酸エステル化ＣＮＦ分散液を０．２ｗｔ％に調整し、強酸性イオン交換樹脂による処理を行った後に、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、電気伝導度を測定した。強酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下式に従い、リン酸エステル基又は硫酸エステル基濃度を求めた。
リン酸エステル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．1／ナノセルロース重量（ｇ）
硫酸エステル基濃度（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｖ（ｍＬ）×０．1／ナノセルロース重量（ｇ）
【0083】
［粘度の測定］
回転式粘度計（ＨＡＡＫＥ ＲＳ－６０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて粘度を測定する。実際には、Ｒｏｔモード（回転粘度測定）にて、各分散液を下部プレート（Ｌｏｗｅｒ Ｐｌａｔｅ ＴＭＰ６０）にのせ、センサー（Ｃｏｎｅ Ｃ６０／１° Ｔｉ Ｌ）を用いて測定し（Ｒｏｔ時間依存性測定；モード：ＣＲ、せん断速度：１００ １／ｓ、ギャップ０．０５２ｍｍ、温度：２５℃及び３７℃）、測定開始５分後までの粘度平均値を計測した。なお、純水の粘度は、２５℃で０．８３ｍＰａ・ｓ、３７℃で０．７０ｍＰａ・ｓであった。
回転式粘度計（ＨＡＡＫＥ ＲＳ－６０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて粘度を測定する。実際には、Ｒｏｔモード（回転粘度測定）にて、各分散液を下部プレート（Ｌｏｗｅｒ Ｐｌａｔｅ ＴＭＰ６０）にのせ、センサー（Ｃｏｎｅ Ｃ６０／１° Ｔｉ Ｌ）を用いて測定し（Ｒｏｔ時間依存性測定；モード：ＣＲ、せん断速度：１００ １／ｓ、ギャップ０．０５２ｍｍ、温度：２５℃及び３７℃）、測定開始５分後までの粘度平均値を計測した。なお、純水の粘度は、２５℃で０．８３ｍＰａ・ｓ、３７℃で０．７０ｍＰａ・ｓであった。
【0084】
［カルボキシル基を導入したＣＮＦの製造例］
先行文献（特開２０１３－２４９４４８号、セルロース繊維Ｂ６の製造）を参考に、カルボキシル基を導入したＣＮＦを製造した。
具体的には、針葉樹パルプ２ｇに、水１５０ｍＬ、臭化ナトリウム０．２５ｇ、ＴＥＭＰＯ試薬０．０２５ｇを加え、１３ｗｔ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（共酸化剤）を２４．０ｍｍｏｌ／ｇとなるように加え、反応を開始した。反応中は、０．５Ｎ水酸化ナトリウムを滴下しながら分散液のｐＨを１０～１１に保持し、ｐＨの変化が見られなくなるまで反応させた（反応時間は１２０分）。
反応終了後、０．１Ｎ塩酸を添加して中和し、ろ過と水洗を繰り返して精製した後、ミクロフィブリルの表面が酸化されたセルロース繊維を得た。遠心分離機で固液分離した後、純水を加えて固形分濃度４ｗｔ％に調整した。
２４％水酸化ナトリウム水溶液にてスラリーのｐＨを１０に調整し、スラリーの温度を３０℃として水素化ホウ素ナトリウムをセルロースの繊維に対して０．２ｍｍｏｌ／ｇ加え、２時間反応させることで還元処理した。反応後、０．１Ｎ塩酸を添加して中和し、ろ過と水洗を繰り返して精製した後、セルロース繊維を得た。
これに純水を加え１ｗｔ％に希釈し、高圧ホモジナイザー（三和エンジニアリング社製、Ｈ１１）を用いて圧力１００ＭＰａで１回処理し、カルボキシル基を導入したＣＮＦを製造した。
先行文献（特開２０１３－２４９４４８号、セルロース繊維Ｂ６の製造）を参考に、カルボキシル基を導入したＣＮＦを製造した。
具体的には、針葉樹パルプ２ｇに、水１５０ｍＬ、臭化ナトリウム０．２５ｇ、ＴＥＭＰＯ試薬０．０２５ｇを加え、１３ｗｔ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（共酸化剤）を２４．０ｍｍｏｌ／ｇとなるように加え、反応を開始した。反応中は、０．５Ｎ水酸化ナトリウムを滴下しながら分散液のｐＨを１０～１１に保持し、ｐＨの変化が見られなくなるまで反応させた（反応時間は１２０分）。
反応終了後、０．１Ｎ塩酸を添加して中和し、ろ過と水洗を繰り返して精製した後、ミクロフィブリルの表面が酸化されたセルロース繊維を得た。遠心分離機で固液分離した後、純水を加えて固形分濃度４ｗｔ％に調整した。
２４％水酸化ナトリウム水溶液にてスラリーのｐＨを１０に調整し、スラリーの温度を３０℃として水素化ホウ素ナトリウムをセルロースの繊維に対して０．２ｍｍｏｌ／ｇ加え、２時間反応させることで還元処理した。反応後、０．１Ｎ塩酸を添加して中和し、ろ過と水洗を繰り返して精製した後、セルロース繊維を得た。
これに純水を加え１ｗｔ％に希釈し、高圧ホモジナイザー（三和エンジニアリング社製、Ｈ１１）を用いて圧力１００ＭＰａで１回処理し、カルボキシル基を導入したＣＮＦを製造した。
【0085】
［実施例１～４］（カルボキシル化ＣＮＦ分散液の調製）
上記のカルボキシル基を導入したＣＮＦに、固形分濃度が０．２ｗｔ％（実施例１），０．４ｗｔ％（実施例２），０．８ｗｔ％（実施例３）及び１．２ｗｔ％（実施例４）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）を加えた後、高速回転ミキサー（ポリトロンホモジナイザー、株式会社セントラル科学貿易製）処理を行うことで均一なカルボキシル化ＣＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
上記のカルボキシル基を導入したＣＮＦに、固形分濃度が０．２ｗｔ％（実施例１），０．４ｗｔ％（実施例２），０．８ｗｔ％（実施例３）及び１．２ｗｔ％（実施例４）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）を加えた後、高速回転ミキサー（ポリトロンホモジナイザー、株式会社セントラル科学貿易製）処理を行うことで均一なカルボキシル化ＣＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0086】
［リン酸エステル基を導入したＣＮＦの製造例］
先行文献（特開２０１７－２５４６８号、比較例２）を参考に、リン酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
具体的には、尿素３０．０ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物１６．６ｇ、リン酸水素二ナトリウム１２．４ｇを純水３２．８ｇに溶解させて、リン酸化試薬を調製した。針葉樹晒クラフトパルプのシートを、カッターミル及びピンミルで処理し、綿状の繊維にした後、この繊維を絶乾重量で３０ｇ取り、リン酸化試薬を均一に吹きかけ、薬液含浸パルプを得た。
次に、薬液含浸パルプを１４０℃に加熱したダンパー付きの送風乾燥機にて１２０分間加熱処理し、リン酸エステル化パルプを得た。これをパルプ質量で３ｇ分取し、イオン交換水３００ｍＬを加え、攪拌して均一に分散させた後、ろ過脱水して脱水シートを得る工程を２回繰り返した。次いで、得られた脱水シートをイオン交換水３００ｍＬで希釈し、攪拌しながら１Ｎ水酸化ナトリウムを滴下しイオン交換水３００ｍＬを加え、ｐＨ１２～１３のパルプスラリーを得た。このパルプスラリーを脱水し、脱水シートを得た後、イオン交換水３００ｍＬを加え、攪拌して均一に分散させた後、ろ過脱水して脱水シートを得る工程を２回繰り返した。
洗浄脱水後に得られたリン酸エステル化パルプの脱水シートにイオン交換水を加え、攪拌し、０．５ｗｔ％のスラリーにした。このスラリーを解繊処理装置（エムテクニック社製、クレアミックス－２．２Ｓ）を用いて、２１５００回転／分で３０分間処理し、リン酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
先行文献（特開２０１７－２５４６８号、比較例２）を参考に、リン酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
具体的には、尿素３０．０ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物１６．６ｇ、リン酸水素二ナトリウム１２．４ｇを純水３２．８ｇに溶解させて、リン酸化試薬を調製した。針葉樹晒クラフトパルプのシートを、カッターミル及びピンミルで処理し、綿状の繊維にした後、この繊維を絶乾重量で３０ｇ取り、リン酸化試薬を均一に吹きかけ、薬液含浸パルプを得た。
次に、薬液含浸パルプを１４０℃に加熱したダンパー付きの送風乾燥機にて１２０分間加熱処理し、リン酸エステル化パルプを得た。これをパルプ質量で３ｇ分取し、イオン交換水３００ｍＬを加え、攪拌して均一に分散させた後、ろ過脱水して脱水シートを得る工程を２回繰り返した。次いで、得られた脱水シートをイオン交換水３００ｍＬで希釈し、攪拌しながら１Ｎ水酸化ナトリウムを滴下しイオン交換水３００ｍＬを加え、ｐＨ１２～１３のパルプスラリーを得た。このパルプスラリーを脱水し、脱水シートを得た後、イオン交換水３００ｍＬを加え、攪拌して均一に分散させた後、ろ過脱水して脱水シートを得る工程を２回繰り返した。
洗浄脱水後に得られたリン酸エステル化パルプの脱水シートにイオン交換水を加え、攪拌し、０．５ｗｔ％のスラリーにした。このスラリーを解繊処理装置（エムテクニック社製、クレアミックス－２．２Ｓ）を用いて、２１５００回転／分で３０分間処理し、リン酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
【0087】
［実施例５～６］（リン酸エステル化ＣＮＦ分散液の調製）
上記のリン酸エステル基を導入したＣＮＦに、固形分濃度が０．８ｗｔ％（実施例５）及び１．２ｗｔ％（実施例６）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一なリン酸エステル化ＣＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
上記のリン酸エステル基を導入したＣＮＦに、固形分濃度が０．８ｗｔ％（実施例５）及び１．２ｗｔ％（実施例６）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一なリン酸エステル化ＣＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0088】
［硫酸エステル基を導入したＣＮＦの製造例］
先行文献（国際公開第２０１８／１３１７２１号、実施例１４）を参考に、硫酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
具体的には、ＤＭＳＯ１８ｇ、無水酢酸２ｇ（解繊溶液における濃度は９．８ｗｔ％）と硫酸０．５ｇ（解繊溶液における濃度は２．４ｗｔ％）を５０ｍＬのサンプル瓶に入れ、十分に攪拌後、解繊溶液を調製した。この解繊溶液にセルロースパルプ０．６ｇを加え、室温（２３℃）で８０分攪拌した。次に、０．７５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液４００ｍＬを加え、室温（２３℃）で１０分間混ぜた後、遠心分離により上澄みを除いた。残った沈殿物（セルロース繊維）に純水４００ｍＬを加えて均一分散するまで攪拌し、遠心分離により上澄みを除き、同様の操作を４回繰り返した。
遠心分離によって得られた沈殿物に純水を加え、全体の重量が１５０ｇになるまで希釈した。これを、高速回転ミキサー（ポリトロンホモジナイザー、株式会社セントラル科学貿易製）を用いて３分間攪拌することによって硫酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
先行文献（国際公開第２０１８／１３１７２１号、実施例１４）を参考に、硫酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
具体的には、ＤＭＳＯ１８ｇ、無水酢酸２ｇ（解繊溶液における濃度は９．８ｗｔ％）と硫酸０．５ｇ（解繊溶液における濃度は２．４ｗｔ％）を５０ｍＬのサンプル瓶に入れ、十分に攪拌後、解繊溶液を調製した。この解繊溶液にセルロースパルプ０．６ｇを加え、室温（２３℃）で８０分攪拌した。次に、０．７５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液４００ｍＬを加え、室温（２３℃）で１０分間混ぜた後、遠心分離により上澄みを除いた。残った沈殿物（セルロース繊維）に純水４００ｍＬを加えて均一分散するまで攪拌し、遠心分離により上澄みを除き、同様の操作を４回繰り返した。
遠心分離によって得られた沈殿物に純水を加え、全体の重量が１５０ｇになるまで希釈した。これを、高速回転ミキサー（ポリトロンホモジナイザー、株式会社セントラル科学貿易製）を用いて３分間攪拌することによって硫酸エステル基を導入したＣＮＦを製造した。
【0089】
［実施例７］（硫酸エステル化ＣＮＦ分散液の調製）
上記の硫酸エステル基を導入したＣＮＦに、固形分濃度が０．８ｗｔ％（実施例７）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な硫酸エステル化ＣＮＦ分散液を得た。
上記の硫酸エステル基を導入したＣＮＦに、固形分濃度が０．８ｗｔ％（実施例７）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な硫酸エステル化ＣＮＦ分散液を得た。
【0090】
［比較例１］（未修飾ＣＮＦ分散液の調製）
セルロースミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していない未修飾ＣＮＦとして、市販のＢｉＮＦｉ－ｓ（登録商標）、ＷＭａ－１０００２（株式会社スギノマシン製、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が０．８ｗｔ％（比較例１）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで未修飾ＣＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
セルロースミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していない未修飾ＣＮＦとして、市販のＢｉＮＦｉ－ｓ（登録商標）、ＷＭａ－１０００２（株式会社スギノマシン製、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が０．８ｗｔ％（比較例１）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで未修飾ＣＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0091】
［比較例２～３］（ＣＭＣ溶液の調製）
ミクロフィブリルを有しないセルロースとして、市販のカルボキシメチルセルロースナトリウム（セロゲンＡＧガムＭキョクホウ、エーテル化度０．８２、第一工業製薬株式会社製）を使用した。固形分濃度が０．８ｗｔ％（比較例２）及び１．５ｗｔ％（比較例３）になるように蒸留水に溶解させた後、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
ミクロフィブリルを有しないセルロースとして、市販のカルボキシメチルセルロースナトリウム（セロゲンＡＧガムＭキョクホウ、エーテル化度０．８２、第一工業製薬株式会社製）を使用した。固形分濃度が０．８ｗｔ％（比較例２）及び１．５ｗｔ％（比較例３）になるように蒸留水に溶解させた後、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0092】
［実施例８～１３］（カルボキシル化ＣＮＣ分散液の調製）
セルロースミクロフィブリル表面のグルコースの６位にカルボキシル基を導入したＣＮＣとして、市販のカルボキシル化ＣＮＣ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製、ＴＥＭＰＯ酸化品、官能基濃度１．２又は２．０ｍｍｏｌ／ｇ、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が０．１ｗｔ％（実施例８），０．５ｗｔ％（実施例９），１．０ｗｔ％（実施例１０），１．５ｗｔ％（実施例１１）及び２．０ｗｔ％（実施例１２）、１．２ｗｔ％（実施例１３）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一なカルボキシル化ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
セルロースミクロフィブリル表面のグルコースの６位にカルボキシル基を導入したＣＮＣとして、市販のカルボキシル化ＣＮＣ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製、ＴＥＭＰＯ酸化品、官能基濃度１．２又は２．０ｍｍｏｌ／ｇ、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が０．１ｗｔ％（実施例８），０．５ｗｔ％（実施例９），１．０ｗｔ％（実施例１０），１．５ｗｔ％（実施例１１）及び２．０ｗｔ％（実施例１２）、１．２ｗｔ％（実施例１３）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一なカルボキシル化ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0093】
［カルボキシル基を導入したＣＮＣの製造例］
先行文献（国際公開第２０１８／２３０３５４号、ACS Sustainable Chem Eng 2020, 8, 17800-17806）を参考に、セルロースミクロフィブリル表面のグルコースの２位及び３位にカルボキシル基を導入したＣＮＣを製造した。
具体的には、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（富士フイルム和光純薬株式会社製）４２．８ｇに、水、６Ｍ塩酸、未修飾ＣＮＣ（固形分量１ｇ）を加えて攪拌し、濃度２２％、ｐＨ１１．０の水溶液とした。前記水溶液を３０℃に保温しながら、ｐＨ１１．０を維持するために５Ｍ水酸化ナトリウムを添加して、２時間スターラーで攪拌した。得られた液に酸化還元電位が－１００ｍＶ以下となるまで亜硫酸ナトリウムを加え、残存する次亜塩素酸ナトリウムを還元して反応を終了した。透析チューブ（材質：再生セルロース、分画分子量：３，５００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に入れ、１週間の透析を行った。超音波ホモジナイザー（ＬＵＨ３００、ヤマト科学株式会社製）を用いて、定振幅制御モード（出力振幅設定値：５５％）で３分間のインターバル運転（１分間ＯＮ→１分間ＯＦＦ）を行い、懸濁液を超音波破砕した。破砕処理後の懸濁液を遠心分離し、上清を回収し、カルボキシル基を導入したＣＮＣを製造した。
先行文献（国際公開第２０１８／２３０３５４号、ACS Sustainable Chem Eng 2020, 8, 17800-17806）を参考に、セルロースミクロフィブリル表面のグルコースの２位及び３位にカルボキシル基を導入したＣＮＣを製造した。
具体的には、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（富士フイルム和光純薬株式会社製）４２．８ｇに、水、６Ｍ塩酸、未修飾ＣＮＣ（固形分量１ｇ）を加えて攪拌し、濃度２２％、ｐＨ１１．０の水溶液とした。前記水溶液を３０℃に保温しながら、ｐＨ１１．０を維持するために５Ｍ水酸化ナトリウムを添加して、２時間スターラーで攪拌した。得られた液に酸化還元電位が－１００ｍＶ以下となるまで亜硫酸ナトリウムを加え、残存する次亜塩素酸ナトリウムを還元して反応を終了した。透析チューブ（材質：再生セルロース、分画分子量：３，５００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に入れ、１週間の透析を行った。超音波ホモジナイザー（ＬＵＨ３００、ヤマト科学株式会社製）を用いて、定振幅制御モード（出力振幅設定値：５５％）で３分間のインターバル運転（１分間ＯＮ→１分間ＯＦＦ）を行い、懸濁液を超音波破砕した。破砕処理後の懸濁液を遠心分離し、上清を回収し、カルボキシル基を導入したＣＮＣを製造した。
【0094】
［実施例１４］（カルボキシル化ＣＮＣ分散液の調製）
上記のカルボキシル基を導入したＣＮＣに、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１４）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）を加え、カルボキシル化ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
上記のカルボキシル基を導入したＣＮＣに、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１４）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）を加え、カルボキシル化ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0095】
［硫酸エステル基を導入したＣＮＣの製造例］
先行文献（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，２３，１９３－１９９）を参考に、硫酸エステル基を導入したＣＮＣを製造した。
具体的には、木材由来微結晶セルロース（ナカライテスク株式会社）１０ｇを６５％硫酸１００ｍＬに懸濁し、４５℃で６０分間撹拌した。蒸留水２００ｍＬを加え、反応を停止させた。反応液を遠心分離し、上澄みをデカントで捨て、沈殿物に蒸留水を適量加え、激しく振盪することで完全に懸濁した後、再度遠心分離した。遠心分離後の上澄みが透明の間、この洗浄工程を繰り返した。遠心分離後、上澄みが濁った状態になったら、上澄みを回収した。上澄みが濁っている間は回収工程を継続し、濁りが無くなった時点で回収を終了した。回収したＣＮＣ懸濁液を透析膜（ＭＷＣＯ１４０００）に入れ、透析外液が中性になるまで透析した。ＣＮＣ懸濁液を透析膜に入れたまま１０％濃度のポリエチレングリコール（分子量２００００）溶液に浸漬し、固形分濃度が２％程度になるまで濃縮した。
先行文献（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，２３，１９３－１９９）を参考に、硫酸エステル基を導入したＣＮＣを製造した。
具体的には、木材由来微結晶セルロース（ナカライテスク株式会社）１０ｇを６５％硫酸１００ｍＬに懸濁し、４５℃で６０分間撹拌した。蒸留水２００ｍＬを加え、反応を停止させた。反応液を遠心分離し、上澄みをデカントで捨て、沈殿物に蒸留水を適量加え、激しく振盪することで完全に懸濁した後、再度遠心分離した。遠心分離後の上澄みが透明の間、この洗浄工程を繰り返した。遠心分離後、上澄みが濁った状態になったら、上澄みを回収した。上澄みが濁っている間は回収工程を継続し、濁りが無くなった時点で回収を終了した。回収したＣＮＣ懸濁液を透析膜（ＭＷＣＯ１４０００）に入れ、透析外液が中性になるまで透析した。ＣＮＣ懸濁液を透析膜に入れたまま１０％濃度のポリエチレングリコール（分子量２００００）溶液に浸漬し、固形分濃度が２％程度になるまで濃縮した。
【0096】
［実施例１５］（硫酸エステル化ＣＮＣ分散液の調製）
上記の硫酸エステル基を導入したＣＮＣに、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１５）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）を加え、硫酸エステル化ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
上記の硫酸エステル基を導入したＣＮＣに、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１５）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）を加え、硫酸エステル化ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0097】
［カルボキシメチル基を導入したＣＮＣの製造例］
先行文献（ＬＷＴ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，８６，３１８－３２６）を参考に、カルボキシメチル基を導入したＣＮＣを製造した。
具体的には、ＣＮＣ粉末（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製）１ｇをイソプロパノール１００ｍＬに懸濁し、撹拌した。１２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを滴下し、撹拌を続けた。クロロ酢酸１．４２ｇをイソプロパノール１５ｍＬに溶解させ、溶液として滴下し、５０℃で５０分間撹拌した。１２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを滴下し、６０℃でさらに１時間撹拌した。９０％酢酸水溶液０．５ｍＬを滴下し、中性にした。反応液が室温に下がるまで静置した。桐山ロートでろ過し、残渣を８０％メタノール７５ｍＬで２回洗浄した後、メタノール５０ｍＬで１回洗浄した。４５℃で２４時間乾燥させ、粉末状のカルボキシメチル基を導入したＣＮＣを得た。
先行文献（ＬＷＴ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，８６，３１８－３２６）を参考に、カルボキシメチル基を導入したＣＮＣを製造した。
具体的には、ＣＮＣ粉末（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製）１ｇをイソプロパノール１００ｍＬに懸濁し、撹拌した。１２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを滴下し、撹拌を続けた。クロロ酢酸１．４２ｇをイソプロパノール１５ｍＬに溶解させ、溶液として滴下し、５０℃で５０分間撹拌した。１２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを滴下し、６０℃でさらに１時間撹拌した。９０％酢酸水溶液０．５ｍＬを滴下し、中性にした。反応液が室温に下がるまで静置した。桐山ロートでろ過し、残渣を８０％メタノール７５ｍＬで２回洗浄した後、メタノール５０ｍＬで１回洗浄した。４５℃で２４時間乾燥させ、粉末状のカルボキシメチル基を導入したＣＮＣを得た。
【0098】
［実施例１６］（カルボキシメチル化ＣＮＣ分散液の調製）
上記のカルボキシメチル基を導入したＣＮＣを、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１６）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）に溶解させた後、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
上記のカルボキシメチル基を導入したＣＮＣを、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１６）になるように蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）に溶解させた後、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0099】
［比較例４］（未修飾ＣＮＣ分散液の調製）
セルロースミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していない未修飾ＣＮＣとして、市販のＣＮＣ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製、脱硫酸品、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が１．５ｗｔ％（比較例４）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な未修飾ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
セルロースミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していない未修飾ＣＮＣとして、市販のＣＮＣ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製、脱硫酸品、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が１．５ｗｔ％（比較例４）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な未修飾ＣＮＣ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0100】
［比較例５］（４級アンモニウム化ＣＮＣ分散液の調製）
セルロースミクロフィブリル表面に４級アンモニウム基を導入したＣＮＣとして、市販の４級アンモニウム化ＣＮＣ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製、固形分濃度１．５ｗｔ％）（比較例５）を使用した。高速回転ミキサー処理後、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
セルロースミクロフィブリル表面に４級アンモニウム基を導入したＣＮＣとして、市販の４級アンモニウム化ＣＮＣ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｌａｂ社製、固形分濃度１．５ｗｔ％）（比較例５）を使用した。高速回転ミキサー処理後、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0101】
［カルボキシル基を導入したキチンＮＣの製造例］
Ｆａｎらの方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，９，１９２－１９８）を参考に、カルボキシル化キチンＮＣを製造した。
具体的には、キチン粉末（富士フイルム和光純薬株式会社製）３ｇに、水３００ｍＬ、臭化ナトリウム０．３ｇ、ＴＥＭＰＯ試薬０．０４８ｇを加え、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（有効塩素３９％以上）１０．１ｇを添加し、室温で反応を開始させた。反応中は、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下しながら分散液のｐＨを１０に保持し、４５分間反応させた後、エタノール（９９．５）を１０ｍＬ添加し、酸化反応を停止させた。０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で反応液のｐＨを７．０付近に調整した後、遠心分離により上澄みを除いた。残った沈殿物に超純水を加えて均一分散するまで攪拌し、遠心分離により上澄みを除き、同様の操作を３回繰り返した。
遠心分離によって得られた沈殿物に超純水５０ｍＬを加え、懸濁後、透析チューブ（材質：再生セルロース、分画分子量：３，５００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に入れ、５日間の透析を行った。超音波ホモジナイザー（ＬＵＨ３００、ヤマト科学株式会社製）を用いて、定振幅制御モード（出力振幅設定値：５５％）で６０分間のインターバル運転（１分間ＯＮ→１分間ＯＦＦ）を行い、懸濁液を超音波破砕した。破砕処理後の懸濁液を遠心分離し、上清を回収し、カルボキシル基を導入したキチンＮＣを製造した。
Ｆａｎらの方法（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００８，９，１９２－１９８）を参考に、カルボキシル化キチンＮＣを製造した。
具体的には、キチン粉末（富士フイルム和光純薬株式会社製）３ｇに、水３００ｍＬ、臭化ナトリウム０．３ｇ、ＴＥＭＰＯ試薬０．０４８ｇを加え、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（有効塩素３９％以上）１０．１ｇを添加し、室温で反応を開始させた。反応中は、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下しながら分散液のｐＨを１０に保持し、４５分間反応させた後、エタノール（９９．５）を１０ｍＬ添加し、酸化反応を停止させた。０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で反応液のｐＨを７．０付近に調整した後、遠心分離により上澄みを除いた。残った沈殿物に超純水を加えて均一分散するまで攪拌し、遠心分離により上澄みを除き、同様の操作を３回繰り返した。
遠心分離によって得られた沈殿物に超純水５０ｍＬを加え、懸濁後、透析チューブ（材質：再生セルロース、分画分子量：３，５００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に入れ、５日間の透析を行った。超音波ホモジナイザー（ＬＵＨ３００、ヤマト科学株式会社製）を用いて、定振幅制御モード（出力振幅設定値：５５％）で６０分間のインターバル運転（１分間ＯＮ→１分間ＯＦＦ）を行い、懸濁液を超音波破砕した。破砕処理後の懸濁液を遠心分離し、上清を回収し、カルボキシル基を導入したキチンＮＣを製造した。
【0102】
［実施例１７］（カルボキシル化キチンＮＣの調製）
上記のカルボキシル基を導入したキチンＮＣに、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１７）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一なカルボキシル化キチンＮＣ分散液を得た。
上記のカルボキシル基を導入したキチンＮＣに、固形分濃度が１．０ｗｔ％（実施例１７）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一なカルボキシル化キチンＮＣ分散液を得た。
【0103】
［比較例６］（未修飾キチンＮＦ分散液の調製）
キチンミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していない未修飾キチンＮＦとして、市販のキチンＮＦ（ＢｉＮＦｉ－ｓ（登録商標）、ＳＦｏ－２０００２、株式会社スギノマシン製、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が１．０ｗｔ％（比較例６）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な未修飾キチンＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
キチンミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していない未修飾キチンＮＦとして、市販のキチンＮＦ（ＢｉＮＦｉ－ｓ（登録商標）、ＳＦｏ－２０００２、株式会社スギノマシン製、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が１．０ｗｔ％（比較例６）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な未修飾キチンＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0104】
［比較例７］（キトサンＮＦ分散液の調製）
キトサンミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していないキトサンＮＦとして、市販のキトサンＮＦ（ＢｉＮＦｉ－ｓ（登録商標）、ＥＦｏ－２０００２、株式会社スギノマシン製、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が１．０ｗｔ％（比較例７）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な未修飾キトサンＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
キトサンミクロフィブリルの表面に化学修飾を施していないキトサンＮＦとして、市販のキトサンＮＦ（ＢｉＮＦｉ－ｓ（登録商標）、ＥＦｏ－２０００２、株式会社スギノマシン製、固形分濃度２．０ｗｔ％）を使用した。固形分濃度が１．０ｗｔ％（比較例７）になるように蒸留水を加えた後、高速回転ミキサー処理を行うことで均一な未修飾キトサンＮＦ分散液を得た。得られた分散液は、１２１℃、２０分間の高圧蒸気滅菌処理を行った。
【0105】
実施例１～１７及び比較例１～７の分散液の性質（形状、官能基、分散液の粘度）の測定結果を表１に示す。
【表1】
【0106】
［実施例１８］（マウス癒着モデルを用いたカルボキシル化ＣＮＦ分散液の癒着防止効果－未修飾ＣＮＦ分散液及びＣＭＣ溶液との比較）
（試験方法）
６～７週齢のＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ系雄性マウス（日本クレア株式会社製）を用い、ケタミン・キシラジン混合麻酔下にて開腹後、盲腸を露出した。盲腸の腸間膜反対側の１ヵ所を、バイポーラコアギュレーションフォーセプス（Ｅ４０５２－ＣＴ、コヴィディエンジャパン株式会社製）を用いて５Ｗの出力（ＳｕｒｇｉＳｔａｔ、コヴィディエンジャパン株式会社製）で１秒間焼灼した。その後、カルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例３）、未修飾ＣＮＦ分散液（比較例１）、又はＣＭＣ溶液（比較例２）を０．２５ｍＬ／ｂｏｄｙで腹腔内に滴下投与し、閉腹した。対照群は、同量の生理食塩液とした。なお、本試験方法は、Ｋｏｓａｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００８， Ｖｏｌ．１４， Ｎｏ．４， ４３７－４４１）を参考にした。術後７日目に試験群を秘匿した状態で、盲腸焼灼部と他の臓器の癒着を下記の６段階のスコアで評価した。群ごとに、癒着スコアの平均値±標準誤差を算出した。
スコア０：癒着なし
スコア１：１ヵ所の薄い膜状の癒着
スコア２：２ヵ所以上の薄い膜状の癒着
スコア３：局所的に厚い癒着
スコア４：播種状に付着した厚い癒着又は２ヵ所以上の局所的に厚い癒着
スコア５：極めて厚く血管新生も認められる癒着又は２ヵ所以上の播種状に付着した厚い癒着
（試験結果）
癒着評価の結果を図２に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液は、対照群と比較して明らかに癒着スコアを低減した。一方、未修飾ＣＮＦ分散液及びＣＭＣ溶液は癒着スコアを低減しなかった。
これらの結果から、分散液中のセルロースがミクロフィブリル構造（セルロース分子鎖の集合体）を有するファイバー状であること、且つ、その表面がカルボキシル基に修飾されていることによって癒着防止作用が得られることが分かった。
（試験方法）
６～７週齢のＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ系雄性マウス（日本クレア株式会社製）を用い、ケタミン・キシラジン混合麻酔下にて開腹後、盲腸を露出した。盲腸の腸間膜反対側の１ヵ所を、バイポーラコアギュレーションフォーセプス（Ｅ４０５２－ＣＴ、コヴィディエンジャパン株式会社製）を用いて５Ｗの出力（ＳｕｒｇｉＳｔａｔ、コヴィディエンジャパン株式会社製）で１秒間焼灼した。その後、カルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例３）、未修飾ＣＮＦ分散液（比較例１）、又はＣＭＣ溶液（比較例２）を０．２５ｍＬ／ｂｏｄｙで腹腔内に滴下投与し、閉腹した。対照群は、同量の生理食塩液とした。なお、本試験方法は、Ｋｏｓａｋａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００８， Ｖｏｌ．１４， Ｎｏ．４， ４３７－４４１）を参考にした。術後７日目に試験群を秘匿した状態で、盲腸焼灼部と他の臓器の癒着を下記の６段階のスコアで評価した。群ごとに、癒着スコアの平均値±標準誤差を算出した。
スコア０：癒着なし
スコア１：１ヵ所の薄い膜状の癒着
スコア２：２ヵ所以上の薄い膜状の癒着
スコア３：局所的に厚い癒着
スコア４：播種状に付着した厚い癒着又は２ヵ所以上の局所的に厚い癒着
スコア５：極めて厚く血管新生も認められる癒着又は２ヵ所以上の播種状に付着した厚い癒着
（試験結果）
癒着評価の結果を図２に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液は、対照群と比較して明らかに癒着スコアを低減した。一方、未修飾ＣＮＦ分散液及びＣＭＣ溶液は癒着スコアを低減しなかった。
これらの結果から、分散液中のセルロースがミクロフィブリル構造（セルロース分子鎖の集合体）を有するファイバー状であること、且つ、その表面がカルボキシル基に修飾されていることによって癒着防止作用が得られることが分かった。
【0107】
［実施例１９］（マウス癒着モデルを用いたカルボキシル化ＣＮＣ分散液の癒着防止効果－未修飾ＣＮＣ分散液、４級アンモニウム化ＣＮＣ分散液、及びＣＭＣ溶液との比較）
（試験方法）
実施例１８と同様の方法及び条件で試験を行った。カルボキシル化ＣＮＣ分散液（実施例１１）、未修飾ＣＮＣ分散液（比較例４）、４級アンモニウム化ＣＮＣ分散液（比較例５）又はＣＭＣ溶液（比較例３）を０．２５ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図３に示した。カルボキシル化ＣＮＣ分散液は、対照群と比較して明らかに癒着スコアを低減した。一方、未修飾ＣＮＣ分散液、４級アンモニウム化ＣＮＣ分散液及びＣＭＣ溶液は癒着スコアを低減しなかった。
これらの結果から、分散液中のセルロースがミクロフィブリル構造を有するクリスタル状であること、且つ、その表面がカルボキシル基に修飾されていることによって癒着防止作用が得られることが分かった。一方、４級アンモニウム化したＣＮＣ分散液では癒着防止効果が見られなかったことから、ミクロフィブリル表面の修飾官能基を、カチオン性ではなくアニオン性とすることが重要である推察された。
（試験方法）
実施例１８と同様の方法及び条件で試験を行った。カルボキシル化ＣＮＣ分散液（実施例１１）、未修飾ＣＮＣ分散液（比較例４）、４級アンモニウム化ＣＮＣ分散液（比較例５）又はＣＭＣ溶液（比較例３）を０．２５ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図３に示した。カルボキシル化ＣＮＣ分散液は、対照群と比較して明らかに癒着スコアを低減した。一方、未修飾ＣＮＣ分散液、４級アンモニウム化ＣＮＣ分散液及びＣＭＣ溶液は癒着スコアを低減しなかった。
これらの結果から、分散液中のセルロースがミクロフィブリル構造を有するクリスタル状であること、且つ、その表面がカルボキシル基に修飾されていることによって癒着防止作用が得られることが分かった。一方、４級アンモニウム化したＣＮＣ分散液では癒着防止効果が見られなかったことから、ミクロフィブリル表面の修飾官能基を、カチオン性ではなくアニオン性とすることが重要である推察された。
【0108】
［実施例２０］（ラット小腸癒着モデルを用いたアニオン化ＣＮＦ分散液の癒着防止効果－未修飾ＣＮＦ分散液との比較）
（試験方法）
７～８週齢のＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社）を用い、ケタミン・キシラジン混合麻酔下にて開腹し、精巣上体周囲脂肪を切除した。回盲部を体外に露出させ、盲腸から１０ｃｍの範囲の小腸を指に巻きつけた乾燥ガーゼで溢血が認められる程度擦過した。臓器を腹腔内に戻し、生理食塩液１０ｍＬを用いて腹腔内を洗浄した。洗浄後の残液は可能な限り吸引除去した。その後、カルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例３）、リン酸エステル化ＣＮＦ分散液（実施例５）、硫酸エステル化ＣＮＦ分散液（実施例７）、又は未修飾ＣＮＦ分散液（比較例１）を２ｍＬ／ｂｏｄｙで腹腔内に滴下投与し、閉腹した。対照群は、同量の生理食塩液とした。なお、本試験方法は、山内らの方法（特開平７－１０１８６６号）を参考にした。術後７日目に試験群を秘匿した状態で、腸管を含む腹腔内の広範囲に形成される癒着の長さを測定した。群ごとに、癒着の長さ（ｍｍ）の平均値±標準誤差を算出した。
（試験結果）
癒着評価の結果を図４に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液、リン酸エステル化ＣＮＦ分散液及び硫酸エステル化ＣＮＦ分散液は、対照群と比較していずれも明らかに癒着の長さを低減した。一方、未修飾ＣＮＦ分散液は癒着の長さを低減しなかった。
これらの結果から、セルロースナノファイバーのミクロフィブリル表面の化学修飾は、カルボキシル基に限らず、リン酸エステル基や硫酸エステル基といったアニオン性官能基に置換することによって癒着防止作用が得られることが分かった。
（試験方法）
７～８週齢のＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社）を用い、ケタミン・キシラジン混合麻酔下にて開腹し、精巣上体周囲脂肪を切除した。回盲部を体外に露出させ、盲腸から１０ｃｍの範囲の小腸を指に巻きつけた乾燥ガーゼで溢血が認められる程度擦過した。臓器を腹腔内に戻し、生理食塩液１０ｍＬを用いて腹腔内を洗浄した。洗浄後の残液は可能な限り吸引除去した。その後、カルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例３）、リン酸エステル化ＣＮＦ分散液（実施例５）、硫酸エステル化ＣＮＦ分散液（実施例７）、又は未修飾ＣＮＦ分散液（比較例１）を２ｍＬ／ｂｏｄｙで腹腔内に滴下投与し、閉腹した。対照群は、同量の生理食塩液とした。なお、本試験方法は、山内らの方法（特開平７－１０１８６６号）を参考にした。術後７日目に試験群を秘匿した状態で、腸管を含む腹腔内の広範囲に形成される癒着の長さを測定した。群ごとに、癒着の長さ（ｍｍ）の平均値±標準誤差を算出した。
（試験結果）
癒着評価の結果を図４に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液、リン酸エステル化ＣＮＦ分散液及び硫酸エステル化ＣＮＦ分散液は、対照群と比較していずれも明らかに癒着の長さを低減した。一方、未修飾ＣＮＦ分散液は癒着の長さを低減しなかった。
これらの結果から、セルロースナノファイバーのミクロフィブリル表面の化学修飾は、カルボキシル基に限らず、リン酸エステル基や硫酸エステル基といったアニオン性官能基に置換することによって癒着防止作用が得られることが分かった。
【0109】
［実施例２１］（ラット小腸癒着モデルを用いた各種アニオン化ＣＮＣ分散液の癒着防止効果－生理食塩液との比較）
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。カルボキシル化ＣＮＣ分散液（実施例１４、グルコースの２位及び３位の水酸基をカルボキシル基に修飾）、硫酸エステル化ＣＮＣ分散液（実施例１５）、又はカルボキシメチル化ＣＮＣ分散液（実施例１６）を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、それぞれ同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図５に示した。カルボキシル化ＣＮＣ分散液、硫酸エステル化ＣＮＣ分散液及びカルボキシメチル化ＣＮＣ分散液は、対照群と比較していずれも癒着の長さを低減した。
これらの結果から、セルロースナノクリスタルのミクロフィブリル表面の化学修飾は、カルボキシル基に限らず、硫酸エステル基やカルボキシメチル基といったアニオン性官能基に置換することによって癒着防止作用が得られることが分かった。さらに、グルコースの２位及び３位の水酸基をカルボキシル基に修飾したＣＮＣ（実施例１４）及び後に実施例２３に示すようにグルコースの６位の水酸基をカルボキシル基に修飾したＣＮＣ（実施例１０）はいずれも癒着の長さを低減していることから、癒着防止作用においてカルボキシル基の修飾位置に選択性はないことが分かった。
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。カルボキシル化ＣＮＣ分散液（実施例１４、グルコースの２位及び３位の水酸基をカルボキシル基に修飾）、硫酸エステル化ＣＮＣ分散液（実施例１５）、又はカルボキシメチル化ＣＮＣ分散液（実施例１６）を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、それぞれ同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図５に示した。カルボキシル化ＣＮＣ分散液、硫酸エステル化ＣＮＣ分散液及びカルボキシメチル化ＣＮＣ分散液は、対照群と比較していずれも癒着の長さを低減した。
これらの結果から、セルロースナノクリスタルのミクロフィブリル表面の化学修飾は、カルボキシル基に限らず、硫酸エステル基やカルボキシメチル基といったアニオン性官能基に置換することによって癒着防止作用が得られることが分かった。さらに、グルコースの２位及び３位の水酸基をカルボキシル基に修飾したＣＮＣ（実施例１４）及び後に実施例２３に示すようにグルコースの６位の水酸基をカルボキシル基に修飾したＣＮＣ（実施例１０）はいずれも癒着の長さを低減していることから、癒着防止作用においてカルボキシル基の修飾位置に選択性はないことが分かった。
【0110】
［実施例２２］（ラット小腸癒着モデルを用いたカルボキシル化ＣＮＦ分散液の癒着防止効果－濃度依存性）
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。０．２ｗｔ％（実施例１），０．４ｗｔ％（実施例２）及び０．８ｗｔ％（実施例３）のカルボキシル化ＣＮＦ分散液を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図６に示した。対照群と比較して０．２ｗｔ％、０．４ｗｔ％及び０．８ｗｔ％の濃度において癒着の長さを低減した。更に、０．４ｗｔ％及び０．８ｗｔ％の濃度においては有意に癒着の長さを低減した。
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。０．２ｗｔ％（実施例１），０．４ｗｔ％（実施例２）及び０．８ｗｔ％（実施例３）のカルボキシル化ＣＮＦ分散液を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図６に示した。対照群と比較して０．２ｗｔ％、０．４ｗｔ％及び０．８ｗｔ％の濃度において癒着の長さを低減した。更に、０．４ｗｔ％及び０．８ｗｔ％の濃度においては有意に癒着の長さを低減した。
【0111】
［実施例２３］（ラット小腸癒着モデルを用いたカルボキシル化ＣＮＣ分散液の癒着防止効果－濃度依存性）
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。０．１ｗｔ％（実施例８），０．５ｗｔ％（実施例９），１．０ｗｔ％（実施例１０），１．５ｗｔ％（実施例１１）及び２．０ｗｔ％（実施例１２）のカルボキシル化ＣＮＣ分散液を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図７に示した。対照群と比較して０．１～２．０ｗｔ％のすべての濃度で癒着の長さを低減した。更に１．５及び２．０ｗｔ％では有意に癒着の長さを低減した。
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。０．１ｗｔ％（実施例８），０．５ｗｔ％（実施例９），１．０ｗｔ％（実施例１０），１．５ｗｔ％（実施例１１）及び２．０ｗｔ％（実施例１２）のカルボキシル化ＣＮＣ分散液を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図７に示した。対照群と比較して０．１～２．０ｗｔ％のすべての濃度で癒着の長さを低減した。更に１．５及び２．０ｗｔ％では有意に癒着の長さを低減した。
【0112】
［実施例２４］（ラット小腸癒着モデルを用いたカルボキシル化ＣＮＦ分散液とカルボキシル化ＣＮＣ分散液の癒着防止効果の比較）
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。１．２ｗｔ％のカルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例４）と１．２ｗｔ％のカルボキシル化ＣＮＣ（実施例１３）分散液を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図８に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液及びカルボキシル化ＣＮＣ分散液は、対照群と比較していずれも癒着の長さを低減し、カルボキシル化ＣＮＣ分散液は、カルボキシル化ＣＮＦ分散液に対して有意に癒着の長さを低減した。
これらの結果から、癒着防止の効果がより向上する観点から、カルボキシル化ＣＮＦよりもカルボキシル化ＣＮＣがより好ましいことが分かった。
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。１．２ｗｔ％のカルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例４）と１．２ｗｔ％のカルボキシル化ＣＮＣ（実施例１３）分散液を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図８に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液及びカルボキシル化ＣＮＣ分散液は、対照群と比較していずれも癒着の長さを低減し、カルボキシル化ＣＮＣ分散液は、カルボキシル化ＣＮＦ分散液に対して有意に癒着の長さを低減した。
これらの結果から、癒着防止の効果がより向上する観点から、カルボキシル化ＣＮＦよりもカルボキシル化ＣＮＣがより好ましいことが分かった。
【0113】
［実施例２５］（ラット小腸癒着モデルを用いたカルボキシル化キチンＮＣ分散液の癒着防止効果－未修飾キチンＮＦ分散液、キトサンＮＦ分散液との比較）
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。カルボキシル化キチンＮＣ分散液（実施例１７）、未修飾キチンＮＦ分散液（比較例６）、又はキトサンＮＦ分散液（比較例７）を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図９に示した。カルボキシル化キチンＮＣ分散液は、対照群と比較して明らかに癒着の長さを低減した。一方、未修飾キチンＮＦ分散液は癒着の長さを低減しなかった。カチオン性のキトサンＮＦ分散液では、明らかな癒着の増悪がみられた（１０例中６例で多数の臓器が絡んだ塊状の癒着を形成していたため癒着の長さを正確に測定できなかった。従って、癒着の長さの平均を求めることは不可であった）。
これらの結果から、セルロースと同様に、キチンのミクロフィブリル表面がカルボキシル基に修飾されていることによって癒着防止作用が得られることが分かった。
（試験方法）
実施例２０と同様の方法及び条件で試験を行った。カルボキシル化キチンＮＣ分散液（実施例１７）、未修飾キチンＮＦ分散液（比較例６）、又はキトサンＮＦ分散液（比較例７）を２ｍＬ／ｂｏｄｙで投与した。対照群は、同量の生理食塩液とした。
（試験結果）
癒着評価の結果を図９に示した。カルボキシル化キチンＮＣ分散液は、対照群と比較して明らかに癒着の長さを低減した。一方、未修飾キチンＮＦ分散液は癒着の長さを低減しなかった。カチオン性のキトサンＮＦ分散液では、明らかな癒着の増悪がみられた（１０例中６例で多数の臓器が絡んだ塊状の癒着を形成していたため癒着の長さを正確に測定できなかった。従って、癒着の長さの平均を求めることは不可であった）。
これらの結果から、セルロースと同様に、キチンのミクロフィブリル表面がカルボキシル基に修飾されていることによって癒着防止作用が得られることが分かった。
【0114】
［実施例２６］（ウサギアキレス腱癒着モデルを用いたアニオン化ＣＮＦ分散液の癒着防止効果）
（試験方法）
１１週齢のＫｂｌ：ＪＷ系雄性ウサギ（北山ラベス株式会社製）を用い、ケタミン・キシラジン混合麻酔下でアキレス腱（ヒラメ筋腱）周囲の皮膚を剃毛した後、専用装具とギプス（スリーエムジャパン株式会社製）を用いて膝関節を９０°、足首関節を１８０°に固定した。動物を腹臥位に固定し、足首周囲の皮膚をポビドンヨード（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）及び消毒用エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）で交互に清拭し十分に消毒した。処置部の皮膚を２．５ｃｍ切開し、２ｃｍの周囲組織を切除し、ヒラメ筋腱を単離した。腱をメスで切断後、５－０縫合糸を用いて単結紮およびＭｏｄｉｆｉｅｄ－Ｋｅｓｓｌｅｒ法で縫合した。出血がないことを確認した後、術部を生理食塩液で洗浄した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例４）又はリン酸エステル化ＣＮＦ分散液（実施例６）を０．３０ｍＬ／ｂｏｄｙで術部に滴下投与し閉創した。対照群は、同量の生理食塩液とした。皮膚を３－０ナイロン糸で縫合した。閉創部に医療脱脂綿（キュアレット、川本産業株式会社製）を置き、さらにギプス用包帯（オルテックス、村中医療器株式会社製）で覆った。大腿部から指先までをギプスで固定し、さらに伸縮包帯（エラストポア、ニチバン株式会社製）でギプスを保護した。術後１４日目に試験群を秘匿した状態で、ヒラメ筋腱の処置範囲２ｃｍを５つのエリアに分け、それぞれのエリアの癒着を下記の５段階のスコアで評価した。５つのエリアの合計を個体代表値とし、群ごとに、癒着スコアの平均値±標準誤差を算出した。
スコア０：癒着なし
スコア１：容易に鈍的に剥離可能
スコア２：鈍的に剥離可能
スコア３：一部に鋭的剥離を要する
スコア４：全てに鋭的剥離を要する
（試験結果）
癒着評価の結果を図１０に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液及びリン酸エステル化ＣＮＦ分散液は、対照群と比較して癒着スコアを低減した。
これらの結果から、アニオン化ＣＮＦは、腹部臓器の癒着防止に限らない、手足の腱においても癒着防止作用を発揮することが分かった。
（試験方法）
１１週齢のＫｂｌ：ＪＷ系雄性ウサギ（北山ラベス株式会社製）を用い、ケタミン・キシラジン混合麻酔下でアキレス腱（ヒラメ筋腱）周囲の皮膚を剃毛した後、専用装具とギプス（スリーエムジャパン株式会社製）を用いて膝関節を９０°、足首関節を１８０°に固定した。動物を腹臥位に固定し、足首周囲の皮膚をポビドンヨード（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）及び消毒用エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）で交互に清拭し十分に消毒した。処置部の皮膚を２．５ｃｍ切開し、２ｃｍの周囲組織を切除し、ヒラメ筋腱を単離した。腱をメスで切断後、５－０縫合糸を用いて単結紮およびＭｏｄｉｆｉｅｄ－Ｋｅｓｓｌｅｒ法で縫合した。出血がないことを確認した後、術部を生理食塩液で洗浄した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液（実施例４）又はリン酸エステル化ＣＮＦ分散液（実施例６）を０．３０ｍＬ／ｂｏｄｙで術部に滴下投与し閉創した。対照群は、同量の生理食塩液とした。皮膚を３－０ナイロン糸で縫合した。閉創部に医療脱脂綿（キュアレット、川本産業株式会社製）を置き、さらにギプス用包帯（オルテックス、村中医療器株式会社製）で覆った。大腿部から指先までをギプスで固定し、さらに伸縮包帯（エラストポア、ニチバン株式会社製）でギプスを保護した。術後１４日目に試験群を秘匿した状態で、ヒラメ筋腱の処置範囲２ｃｍを５つのエリアに分け、それぞれのエリアの癒着を下記の５段階のスコアで評価した。５つのエリアの合計を個体代表値とし、群ごとに、癒着スコアの平均値±標準誤差を算出した。
スコア０：癒着なし
スコア１：容易に鈍的に剥離可能
スコア２：鈍的に剥離可能
スコア３：一部に鋭的剥離を要する
スコア４：全てに鋭的剥離を要する
（試験結果）
癒着評価の結果を図１０に示した。カルボキシル化ＣＮＦ分散液及びリン酸エステル化ＣＮＦ分散液は、対照群と比較して癒着スコアを低減した。
これらの結果から、アニオン化ＣＮＦは、腹部臓器の癒着防止に限らない、手足の腱においても癒着防止作用を発揮することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0115】
本発明の癒着防止剤は、癒着を防止する部位に適用することにより、効果的に癒着を防止できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】