特許 7322317 ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ、検査キット及び応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-28

(45)【発行日】2023-08-07

(54)【発明の名称】ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ、検査キット及び応用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20230731BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20230731BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230731BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z ZNA

C12Q1/6851 Z

C12N15/11 Z

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2023094502

(22)【出願日】2023-06-08

【審査請求日】2023-06-08

(31)【優先権主張番号】202310005882.X

(32)【優先日】2023-01-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】523218359

【氏名又は名称】唐山市人民医院

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(72)【発明者】

【氏名】李玉鳳

(72)【発明者】

【氏名】李景武

(72)【発明者】

【氏名】王磊

(72)【発明者】

【氏名】李丹

(72)【発明者】

【氏名】王卓

(72)【発明者】

【氏名】李青科

(72)【発明者】

【氏名】李玉輝

(72)【発明者】

【氏名】劉洪梅

(72)【発明者】

【氏名】鄭▲セン▼

(72)【発明者】

【氏名】陳晶晶

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００６／１３２０２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００６／０８６８４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００１／０５３８３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Nucleic Acids Research，2013年，Vol.41，e186，doi:10.1093/nar/gkt766

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブであって、前記ＩＣＯＮプローブの塩基配列がａａＴｃｇｇｇｔｃａｃＴｃｃｃａｃｃｃｇａａｔａｔｔｇｃＧｃｔｔｔｔｃａｇａｃｃｇｇｃＴｔａａｇａａであり、Ｇはｇにビピリジンが修飾されていることを示し、Ｔはｔにアミノ基が修飾されていることを示し、前記アミノ基はビオチンで標識されていることを特徴とするヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ。

【請求項2】

請求項１に記載のＩＣＯＮプローブ、ハイブリダイゼーション緩衝液及びオスミウム酸溶液を含むことを特徴とするヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用検出キット。

【請求項3】

前記ハイブリダイゼーション緩衝液が、４×ＳＳＣ緩衝液、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、質量パーセント１０％の硫酸デキストランおよび体積パーセント２５％のホルムアミドの成分を含むことを特徴とする請求項２に記載の検出キット。

【請求項4】

前記オスミウム酸溶液の最終濃度が５ｍＭであり；前記オスミウム酸溶液中の溶媒がｐＨ７．７の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ＭのＮａＣｌを含む水溶液であることを特徴とする請求項２に記載の検出キット。

【請求項5】

前記検出キットがチラミドシグナル増幅検出試薬をさらに含むことを特徴とする請求項２～４のいずれか１項に記載の検出キット。

【請求項6】

請求項２～４のいずれか１項に記載の検出キットのヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化の検出における使用。

【請求項7】

請求項１に記載のＩＣＯＮプローブのヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化を検出するための試薬キットの調製における使用。

【請求項8】

請求項１に記載のＩＣＯＮプローブを細胞標的ＤＮＡにハイブリダイズさせ、チラミドシグナル増幅検出試薬で蛍光シグナルを増幅し、蛍光シグナルを観察し、記録した後、ハイブリダイゼーション系をオスミウム酸溶液で処理し、変性させ、蛍光シグナルを再度観察して記録し、蛍光シグナルの強度に応じて、細胞内の標的ＤＮＡのメチル化状態を判断するステップを含むことを特徴とするヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化を検出する方法。

【請求項9】

前記変性方法は、ハイブリダイゼーション系を体積７０％のホルムアミドを含む２×ＳＳＣ溶液中に入れて、６０～６５℃で２．５～３．５分間インキュベートして、架橋していないＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを除去し、褪色防止用封入剤で封入することを特徴とする請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は遺伝子検出技術分野に属し、詳しくは、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ、検出キット並び応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡメチル化は重要な修飾経路であり、メチルトランスフェラーゼの触媒作用の下で、ＤＮＡのＣＧの２つのヌクレオチドのシトシンにメチル基が選択的に付加されて、５－メチルシトシンが形成され（図１を参照）、これは、遺伝子の５’－ＣＧ－３’配列によく見られる。メチル化は主にＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの５炭素原子で起こり、生成物は５－メチルシトシン（５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ、５ｍＣ）である。ＤＮＡメチル化は主にＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤｎｍｔ３ａとＤｎｍｔ３ｂ、および補因子Ｄｎｍｔ３Ｌによって確立され；その維持は主にＤｎｍｔ１によって達成される。約９０％の５ｍＣは、タンデムリピートにあり、縦列反復配列（ｍｏｕｓｅ：ｍａｊｏｒ ａｎｄ ｍｉｎｏｒ ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ；ｈｕｍａｎ：ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ２、３及ａｌｐｈａ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）、長い散在性反復配列（ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＬＩＮＥ）、および短い散在性反復配列（ｍｏｕｓｅ：Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＳＩＮＥ；ｈｕｍａｎ：Ａｌｕ）などを含む反復配列上にある。ゲノム内のＣｐＧジヌクレオチドの分布は均一ではなく、一部の領域では、ＣｐＧ配列の密度が非常に高くなり、ＣｐＧアイランドが形成される。哺乳類のＣｐＧアイランドには約３００～３０００の塩基が含まれ、通常は遺伝子のプロモーター領域または一番目のエキソン領域に位置している。

【0003】

ＤＮＡメチル化状態は、以下のゲノムに特定の分布パターンを示し、健康なヒトゲノムでは、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位は通常非メチル化状態を示し、ＣｐＧアイランドの外側のＣｐＧサイトは通常メチル化状態を示し；このメチル化の形態は、細胞分裂過程中に安定して保持され、ＤＮＡ配列を変更することなく、遺伝子発現、クロマチンのリモデリング、ゲノムのインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、およびゲノムの安定性において重要な調節的役割を果たしている。

【0004】

ＤＮＡメチル化異常の重要な原因として、慢性炎症、肝炎ウイルス、化学物質、栄養失調によるメチル供与体の不足などが知られている。ＤＮＡメチル化レベルの異常は、癌を含むさまざまなヒト疾患の発生および発症と密接に関連している。例えば、腫瘍細胞では、ＤＮＡメチル化異常は主に次のように現れる。１）腫瘍抑制遺伝子とＤＮＡ修復遺伝子のプロモーター領域にあるＣｐＧアイランドは、高度にメチル化状態を示して沈黙されている；２）癌遺伝子のプロモーター領域は、低メチル化状態を示して活性化されている；３）ゲノム全体のメチル化レベルが低下して、トランスポゾン、レトロポゾン、および反復配列が活性化されて、染色体の安定性が低下する。

【0005】

研究によると、遺伝子プロモーター領域の局所的な高度のメチル化は、細胞の悪性増殖よりも早く、全ゲノムの低メチル化も腫瘍発生に伴って起こり、腫瘍の悪性度の増加に伴い顕著であることを示している。ＤＮＡメチル化の異常は、腫瘍細胞の死滅回避、新生血管生成の誘導、持続的な増殖シグナル、エネルギー代謝の変化及び免疫系破壊の回避などのプロセスに密接に関連しており、腫瘍の発生、発達及び転移や進行の重要な原因となっている。

【0006】

ＤＮＡメチル化解析技術を用いて組織細胞内の特定の遺伝子のメチル化のレベルの変化と、ＤＮＡの全体的なメチル化レベル（即ち、メチル化プロファイル）を検出することは、腫瘍の早期診断、疾患経過のモニタリング、および治療効果の評価のための潜在的な手段である。現在、メチル化検出方法には、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化特異的リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ法及び重亜硫酸塩シーケンス法がある。上記の方法のいずれも、細胞内の特定の配列のＤＮＡメチル化状態をｉｎ ｓｉｔｕで観察することはできない。現在、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンのＤＮＡメチル化の検出にはバイサルファイトシーケンス法が主に使用されているが、サンプルの準備には時間がかかり、高価なシーケンサーが必要であり、通常の研究室では容易に実現できない。また、細胞のｉｎ ｓｉｔｕで特定の配列のＤＮＡメチル化状態を観察することはできない。マウスおよびヒトサテライトシーケンス用のＩＣＯＮプローブが前記に既に設計されており、また、サテライトＩＣＯＮプローブ用のＭｅＦＩＳＨ検出法が開発されている（図２）（Ｙｕｆｅｎｇ Ｌｉ、ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｔ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３．４１（１９）：ｅ１８６）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

そこで、本発明は、細胞内のＤＮＡメチル化をｉｎ ｓｉｔｕで可視的に検出することができるヒトＬＩＮＥトランスポゾンのＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ（ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブ）、および検出キットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブを提供し、前記ＩＣＯＮプローブの塩基配列はａａＴｃｇｇｇｔｃａｃＴｃｃｃａｃｃｃｇａａｔａｔｔｇｃＧｃｔｔｔｔｃａｇａｃｃｇｇｃＴｔａａｇａａであり、Ｇはｇにビピリジン（Ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）が修飾されていることを示し、Ｔはｔにアミノ基が修飾されていることを示し、前記アミノ基はビオチンで標識されている。

【0009】

本発明は、前記ＩＣＯＮプローブ、ハイブリダイゼーション緩衝液及びオスミウム酸溶液を含むヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用検出キットを提供する。

【0010】

好ましくは、ハイブリダイゼーション緩衝液が、４×ＳＳＣ緩衝液、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、質量パーセント１０％の硫酸デキストランおよび体積パーセント２５％のホルムアミドの成分を含む。

【0011】

好ましくは、前記オスミウム酸（Ｋ_２ＯｓＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）溶液の最終濃度は５ｍＭであり；前記オスミウム酸溶液中の溶媒がｐＨ７．７の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ＭのＮａＣｌを含む水溶液である。

【0012】

好ましくは、前記検出キットはチラミドシグナル増幅検出試薬をさらに含む。

【0013】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化の検出における前記検出キットの応用を提供する。

【0014】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化を検出するための試薬キットの調製における、前記ＩＣＯＮプローブの応用を提供する。

【0015】

本発明は、前記ＩＣＯＮプローブを細胞標的ＤＮＡにハイブリダイズさせ、チラミドシグナル増幅検出試薬で蛍光シグナルを増幅し、蛍光シグナルを観察し、記録した後、ハイブリダイゼーション系をオスミウム酸溶液で処理し、変性させ、蛍光シグナルを再度観察して記録し、蛍光シグナルの強度に応じて、細胞内の標的ＤＮＡのメチル化状態を判断するステップを含むヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化を検出する方法を提供する。

【0016】

好ましくは、前記変性方法は、ハイブリダイゼーション系を体積パーセント７０％のホルムアミドを含む２×ＳＳＣ溶液中に入れて、６０～６５℃で２．５～３．５分間インキュベートして、架橋していないＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを除去し、洗浄し、水分を除去し、褪色防止用封入剤で封入する。

【発明の効果】

【0017】

本発明はヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮ（Ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ Ｏｓｍｉｓｕｍ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）プローブを提供し、前記ＩＣＯＮプローブの塩基配列はａａＴｃｇｇｇｔｃａｃＴｃｃｃａｃｃｃｇａａｔａｔｔｇｃＧｃｔｔｔｔｃａｇａｃｃｇｇｃＴｔａａｇａａであり、Ｇはｇにビピリジンが修飾されていることを示し、Ｔはｔにアミノ基が修飾されていることを示し、前記アミノ基はビオチンで標識されている。本発明により提供されるＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブは、ヒトＬＩＮＥトランスポゾン遺伝子に特異的に結合することができ、ｃｇモチーフのｇはビピリジンで修飾されて、検出中、オスミ酸の媒介下で、ビピリジンはゲノム標的配列のメチル化Ｃのメチル基と安定した架橋を形成し、熱に対して安定するので、変性処理後、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブは容易に溶出されない。同時に、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブのビオチンはチラミドシグナル増幅検出試薬中のストレプトアビジンに結合し、蛍光シグナルを増幅することにより、細胞のｉｎ ｓｉｔｕレベルでの迅速かつ可視的な検出の目的を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】シトシンのＤＮＡメチル化反応の模式図；

【図2】ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＩＣＯＮプローブに対するＭｅＦＩＳＨ検出方法の概略図；

【図3】細胞におけるＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブのＦＩＳＨおよびＭｅＦＩＳＨの結果；

【図4】ヒト正常乳腺上皮細胞ＨＢＬ－１００における非ＴＳＡ増幅ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブのＭｅＦＩＳＨ結果。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブを提供し、前記ＩＣＯＮプローブの塩基配列はａａＴｃｇｇｇｔｃａｃＴｃｃｃａｃｃｃｇａａｔａｔｔｇｃＧｃｔｔｔｔｃａｇａｃｃｇｇｃＴｔａａｇａａであり、Ｇはｇにビピリジンが修飾されていることを示し、Ｔはｔにアミノ基が修飾されていることを示し、前記アミノ基はビオチンで標識されている。

【0020】

本発明において、前記ビピリジンの機能は、オスミ酸の作用下で標的配列中のＣ上のメチル基と安定した架橋を形成することである。ビピリジンによって修飾されたｇは、好ましくは、前記ＩＣＯＮプローブのヌクレオチド配列の中部に位置し、標的配列への安定した結合に一層的に有利である。前記ビオチン修飾の作用は、検出中にチラミドシグナル増幅検出試薬中のストレプトアビジンと結合して、カスケードシグナル増幅効果を生成することである。

【0021】

本発明において、前記ＩＣＯＮプローブの調製方法は、好ましくは、特許公開番号ＷＯ／２００６／１３２０２２に開示されたプローブ合成方法を参照することによって完成される。本発明の実施例において、前記ＩＣＯＮプローブは、日本味の素バイオファーマサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｐａｒｋ１５１６．ｓａｋｕｒａ．ｎｅ．ｊｐ／ｉｃｏｎ-ｐｒｏｂｅ／）に委託して合成できる。ビオチン－Ｘ－Ｘ－ＮＨＳ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｎ／ＣＮ／ｚｈ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｂ３２９５）を使用して、プローブをビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）で標識および精製した。

【0022】

本発明は、ＩＣＯＮプローブ、ハイブリダイゼーション緩衝液及びオスミウム酸溶液を含むヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用検出キットを提供した。

【0023】

本発明では、ハイブリダイゼーション緩衝液は好ましくは、４×ＳＳＣ緩衝液、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、質量パーセント１０％の硫酸デキストランおよび体積パーセント２５％のホルムアミドの成分を含む。

【0024】

本発明では、好ましくは、前記オスミウム酸溶液の濃度は５ｍＭであり；前記オスミウム酸溶液中の溶媒がｐＨ７．７の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび１ＭのＮａＣｌを含む水溶液である。

【0025】

本発明では、前記検出キットはチラミドシグナル増幅検出試薬をさらに含むことが好ましい。本発明において、チラミドシグナル増幅検出試薬の供給源は特に限定されず、当技術分野で周知のチラミドシグナル増幅検出試薬を使用すればよい。本発明の実施例において、前記チラミドシグナル増幅検出試薬は、米国のＰＥ社から購入した（品番：ＮＥＬ７００Ａ００ＫＴ、マニュアルへのリンクｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ／ｌａｂ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ＿ＴＳＡＢｉｏｔｉｎＳｙｓｔｅｍ．ｐｄｆ？＿ｇａ＝２．６８８１９７３２．４６７９０７５９７．１６６７９９６３１９－１４３４９３８８３０．１６６７９９６３１９）。

【0026】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化の検出における前記検出キットの応用を提供した。本発明において、前記検出キットは、非疾患診断目的のヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化の検出に使用できる。

【0027】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化を検出するための試薬キットの調製における、前記ＩＣＯＮプローブの応用を提供した。

【0028】

本発明では、前記ヒトＬＩＮＥトランスポゾンの細胞源は、好ましくは、癌細胞および／または正常な体細胞を含む。前記癌細胞は、好ましくは乳癌細胞を含む。前記正常な体細胞は、好ましくは正常な乳腺細胞を含む。

【0029】

本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化を検出する方法を提供し、検出のメカニズムは、オスミウム酸の存在下で、ＬＩＮＥ１のメチル化シトシンとＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブの相補塩基上のピリジンとの間に共有結合による架橋が形成され、変性しても分離しないため、オスミウム酸処理および変性後に観察される蛍光シグナルはＬＩＮＥ１のメチル化状態を反映できるので、非疾患診断の目的に使用できる。具体的には以下のステップを含む：
前記ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを細胞標的ＤＮＡにハイブリダイズさせ、チラミドシグナル増幅検出試薬で蛍光シグナルを増幅し、蛍光シグナルを観察し、記録した後、ハイブリダイゼーション系をオスミウム酸溶液で処理し、変性させ、蛍光シグナルを再度観察して記録し、蛍光シグナルの強度に応じて、細胞内の標的ＤＮＡのメチル化状況を判断する。

【0030】

本発明において、ハイブリダイゼーションの方法は、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝溶液を固定化細胞上に滴下し、カバーガラスおよびゴムでシールしてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことである。前記固定化細胞の調製方法は、好ましくは、細胞を低張液中に入れて８分間静置し、同量の固定液をゆっくりと滴下して固定処理し、軽く吹きつけて叩き、遠心分離した後、再度固定液を３ｍｌ加えて、軽く叩いてから遠心分離し、前のステップを繰り返し、最後に、１ｍｌの固定液で細胞を再懸濁して固定化細胞を得ることである。前記低張液は、好ましくは７５ｍＭＫＣｌ水溶液である。前記固定液は、好ましくは、体積比が１：３である酢酸とメタノールの混合液である。前記固定回数は、好ましくは２～３回である。前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの条件は、好ましくは８０℃で３分間保持することである。前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの後、未結合のプローブを除去するために洗浄をさらに含むことが好ましい。前記洗浄に用いる溶媒は、好ましくは２×ＳＳＣおよびＰＢＳである。まず２×ＳＳＣ溶液に浸してカバースリップを取り除き、２×ＳＳＣ溶液で５分間洗浄し、ＰＢＳ溶液で５分間洗浄し、再組み立てを３回繰り返す。ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中のＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブの最終濃度は、好ましくは１．２５ｎｇ／μｌである。

【0031】

本発明において、チラミドシグナル増幅検出試薬を用いて蛍光シグナルを増幅する方法は、好ましくは、ハイブリダイゼーション系にＴＮＢバッファーを添加し、室温で３０分間インキュベートした後、次にＨＲＰ試薬（１：５００）を加えて室温で３０分間インキュベートして、ＴＮＴバッファーで５分間の洗浄を３回実行し；チラミド作業溶液（１：５０）を滴下して加え、室温で１０分間インキュベートし、ＴＮＴバッファーで５分間の洗浄を３回実行し；ＳＡ－ＦＩＴＣ溶液（１：２５０）を滴下し、３７℃で４０分間インキュベートし；ＴＮＴバッファーで５分間の洗浄を３回実行し；褪色防止用封入剤（ＤＡＰＩ）で封入する。オスミウム処理前の蛍光シグナルを観察した目的は、異なる細胞間でＦＩＳＨの蛍光シグナル強度に違いがないことを説明するためであり、これはＦＩＳＨのシグナルはメチル化の有無とは無関係であり、同時に、またオスミ酸処理後の低シグナルはＦＩＳＨによるものではないことを示すためでもある。

【0032】

本発明において、前記変性方法は、好ましくは、ハイブリダイゼーション系を７０体積％のホルムアミドを含む２×ＳＳＣ溶液に入れ、６０～６５℃で２．５～３．５分間インキュベートして、未架橋のＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを除去し、洗浄し、水を除去し、褪色防止用封入剤（ＤＡＰＩ）で封入する。前記変性時のインキュベーション温度は好ましくは６３℃である。前記インキュベーション時間は、好ましくは３分間である。

【0033】

本発明の実施例では、正常乳腺細胞（ＨＢＬ-１００）および乳癌細胞（ＭＣＦ-７およびＭＤＡ-ＭＢ-２３１）を検出対象として使用し、本発明によって提供される検出方法を使用して、標的遺伝子のメチル化を検出した結果、正常乳腺細胞株ＨＢＬ－１００では強い蛍光シグナルが依然と検出されたが、２つの乳癌細胞では蛍光シグナルが検出されず、以前に報告されたシーケンス結果と一致する。

【0034】

本発明において、本発明によって提供されるＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブは、ＴＳＡキットを使用して蛍光シグナルを増幅した後、通常の蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ７１）を使用することにより、蛍光シグナルを検出できて、従来のプローブ法では、通常の蛍光顕微鏡では検出できず、共焦点顕微鏡に頼らざるを得ないという問題を回避できる。

【0035】

本発明によって提供されるヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ、検査キットは、実施例を参照して以下に詳細に説明されるが、これらは本発明の保護範囲を限定するものとして解釈されるものではない。

【0036】

実施例１
ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブの設計及び合成
ヒトＬＩＮＥトランスポゾンを標的遺伝子とし、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用して、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化のＩＣＯＮプローブを設計して取得し：ａａＴｃｇｇｇｔｃａｃＴｃｃｃａｃｃｃｇａａｔａｔｔｇｃＧｃｔｔｔｔｃａｇａｃｃｇｇｃＴｔａａｇａａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｇはｇにビピリジンが修飾されていることを示し、Ｔはｔにアミノ基（ａｍｉｎｏ－ＮＨ_２）が修飾されていることを示し、５０ｎｔ、日本味の素バイオファーマサービス社に合成を委託した。ビオチン－Ｘ－Ｘ－ＮＨＳ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｎ／ＣＮ／ｚｈ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｂ３２９５）を使用してプローブをビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）標識および精製した。具体的な方法は次のとおりである。

【0037】

一、試薬準備
１、３部位のアミノ標識ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブ（３０μｇを２０μｌＨ_２Ｏに溶解）
２、１５μｌのＤＭＳＯを０．５ｍｇのビオチン－Ｘ－Ｘ－ＮＨＳバイアルに加え、溶解するまでよく混ぜる。注意：ビオチン－ＸＸ－ＮＨＳは溶解後すぐに使用すべきである。
３、９９．９％ＤＭＳＯ（４℃で保存し、使用前は室温で保存）
４、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－３０ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃａｔ．Ｎｏ．４２４２２）
５、２５ｍｇ／ｍｌ ＮａＨＣＯ_３ Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．５（－２０℃で６ヶ月保存可能であり、毎回使用前にｐＨ値を測定する）

【0038】

二、室温で以下の試薬の混合
１５μｌＢｉｏｔｉｎ－Ｘ－Ｘ－ＮＨＳ ｉｎ ＤＭＳＯ（０．５ｍｇ）
５μｌＮａＨＣＯ_３Ｂｕｆｆｅｒ
３μｌＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＷａｔｅｒ
７μｌＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ－ｏｌｉｇｏ
合計３０μｌ

【0039】

３、よく混合した後、室温で１時間インキュベートし、光を避けて時々均一に混合した。

【0040】

三、精製
１、まず２００μｌのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅｗａｔｅｒを使用してＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ－３０Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｆｉｌｔｅｒを予備洗浄し、説明書に従って遠心分離した。

【0041】

２、上記のプローブ混合液に４００μｌのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加え、均一に混ぜてフィルターに加え、フィルターの下に１．５ｍｌのＥＰチューブを配置して、廃棄物を集めた。

【0042】

３、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－３０の説明書に従って遠心分離し、ＥＰチューブ内の廃液を捨てた。

【0043】

４、４００μｌのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒをフィルターに再度添加し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－３０の説明書に従って遠心分離し、ＥＰチューブ内の廃液を捨てた。

【0044】

５、ステップ４を繰り返した（２回）。

【0045】

６、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－３０の説明書に従って、新しいＥＰチューブを使用して標識されたプローブを収集し、－２０度で保管して準備した。

【0046】

実施例２
ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化検出キット
１．実施例１で調整したヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブ
２．チラミドシグナル増幅（Ｔｙｒａｍｉｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＴＳＡ）キット（ＦＩＴＣ蛍光、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｚｈｅｎｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）；
３．ハイブリダイゼーション緩衝液
ハイブリダイゼーション緩衝液は、以下の成分を含む：４×ＳＳＣ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、質量パーセント１０％の硫酸デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）および体積パーセント２５％のホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）。

【0047】

実施例３
ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化の検出法
１．検出材料
乳癌細胞：乳癌ＭＣＦ－７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞
正常乳腺上皮細胞：ＨＢＬ－１００。

【0048】

２．検出方法
１）細胞の準備；
従来の方法により蘇生された正常な乳腺上皮細胞ＨＢＬ－１００、乳癌細胞ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、培養フラスコ内の細胞被覆率が８０％～９０％に達したら継代し、３世代で細胞を採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、沈殿物を遠心分離した。細胞を低張液（７５ｍＭ ＫＣｌ）で軽く再懸濁し、室温で８分間静置した後、等量のメタノール－酢酸（１：３、ｖ／ｖ）固定液をゆっくりと滴下して固定処理し、軽く吹きつけて叩き、遠心分離した後、酢酸／メタノール１：３混合液３ｍｌを再度加え、軽く吹きつけて叩いてから遠心分離し、前のステップを繰り返し、最後に、１ｍｌの酢酸／メタノール１：３混合液で細胞を再懸濁して、－２０℃で保管して準備した。

【0049】

２）ＩＣＯＮプローブと細胞の標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション、洗浄；
標識プローブを含むハイブリダイゼーション混合物（最終濃度：４ｘＳＳＣ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、２５％ＦＡ、１．２５ｎｇ／μｌ ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮ プローブ）４μｌを、前処理した細胞および組織のガラススライドの上に滴下し、カバースリップとゴムでシールし；ガラススライドを８０℃のインキュベーターに３分間入れてゲノムＤＮＡを変性させ、インキュベートした後、ウェットボックスに室温で２時間入れ；ハイブリダイゼーション後、３７℃の温度で２×ＳＳＣに浸漬してカバースリップを取り除き、２×ＳＳＣで５分間洗浄、２回、ＰＢＳで５分間洗浄し、３回繰り返した。

【0050】

３）ＴＳＡチラミドシグナル増幅キットで蛍光シグナルを増幅し、洗浄し、蛍光顕微鏡で一回目の蛍光シグナルを観察及び記録し；具体的なステップは以下の通りである：
キット中のＴＮＢ バッファーをウェットボックスに滴下して、室温で３０分間インキュベートし；ＨＲＰ試薬（１：５００）をウェットボックスに滴下して、４℃で一晩；ＴＮＴバッファーで５分間、３回洗浄し；チラミド作業溶液（１：５０）を滴下し、室温で１０分間インキュベートし；ＴＮＴバッファーで５分間、３回洗浄し；ＳＡ－ＦＩＴＣ溶液（１：２５０）を滴下し、３７℃で４０分間インキュベートし；ＴＮＴバッファーで５分間、３回洗浄し；ＤＡＰＩで封入した。蛍光顕微鏡下でＦＩＳＨシグナルの１回目の観察を実行した。

【0051】

４）オスミ酸溶液処理；
スライドに１０μｌのオスミ酸溶液を滴下し、３７℃のウェットボックスで３０分間インキュベートした。ここで、オスミ酸（（Ｋ_２ＯｓＯ_４）溶液は、最終濃度２５ｍＭのＫ_２ＯｓＯ_４溶液では、溶媒は５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）、および１ＭＮａＣｌを含む水溶液である。

【0052】

５）変性および洗浄；
７０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ溶液の中で、６３℃で３分間インキュベートして、架橋されていないプローブ分子を除去した。続いて、ＰＢＳで洗浄し、水分を吸取り、褪色防止用封入剤（ＤＡＰＩを含む）で封入した。

【0053】

６）蛍光顕微鏡で再度観察し、蛍光シグナルを記録した
結果を図３に示す。ここで、左側は、正常乳腺細胞ＨＢＬ－１００および乳癌細胞（ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１）におけるＬＩＮＥ１プローブのＦＩＳＨ画像である。３種類の細胞間でＦＩＳＨシグナルの強度に差異はなかった。右側は、オスミ酸で処理し、熱で変性させた３種類の細胞のＬＩＮＥ１のＭｅＦＩＳＨ画像である。正常乳房細胞株ＨＢＬ－１００では強い蛍光シグナルが検出されたが、２種類の乳癌細胞ではいずれも蛍光シグナルは検出されなかった。ＦＩＳＨ後、処理溶液にオスミ酸を含まないＭＣＦ－７細胞の中もＭｅＦＩＳＨ蛍光シグナルは検出されず、オスミ酸が不足しているため、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブがターゲットシーケンスと安定した架橋を形成しなかったことを示唆している。

【0054】

上記の結果は、ＨＢＬ－１００の蛍光シグナルがメチル化されたＬＩＮＥ１シグナルであることを示唆しており、これは報告された（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４年６月２７日；９（６）：ｅ１００４２９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１００４２９．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ２０１４．）配列決定結果と一致しており、即ち、ＬＩＮＥ１は正常細胞では高メチル化を示しているが、乳癌細胞では低メチル化を示している。

【0055】

比較例１
実施例１で作製したＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブを標的細胞（種類は実施例３に記載のものと同じ）にハイブリダイズさせ、ストレプトアビジン－ＦＩＴＣと反応させ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＡ１００１， ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｎ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ＳＡ１００１？ＳＩＤ＝ｓｒｃｈ－ｓｒｐ－ＳＡ１００１）、ＦＩＳＨ蛍光シグナルを検出し、その後、実施例３の方法に従い、オスミ酸処理、変性、及びＭｅＦＩＳＨ蛍光シグナル検出を順次に行った。

【0056】

ヒト正常乳腺上皮細胞ＨＢＬ-１００における前記ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブのＭｅＦＩＳＨ結果を図４に示す。変性後は、正常な乳腺上皮細胞でも、オリンパスＩＸ７１蛍光顕微鏡下でＭｅＦＩＳＨ蛍光シグナルを検出できなかった。これは、前記ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブにより検出する場合、ＴＳＡ チラミドシグナル増幅キットによって蛍光シグナルを増幅するステップが省略すると、検出結果の正確な特性評価に不利であることを示している。

【0057】

以上の記載は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとっては、本発明の原理から逸脱することなく、多くの改良および装飾が可能であり、これらの改良および装飾も本発明の保護範囲内とみなされることに留意されたい。

【要約】

【課題】
本発明は、ヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブ、検出キット並びに応用を提供するものである。
【解決手段】
本発明により提供されるヒトＬＩＮＥトランスポゾンＤＮＡメチル化用ＩＣＯＮプローブの塩基配列は配列番号１であり、Ｇはｇにビピリジンが修飾されていることを示し、Ｔはｔにアミノ基が修飾されていることを示す。Ｂｉｏｔｉｎ－Ｘ－Ｘ－ＮＨＳを使用して、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブの３つのアミノ基をビオチン標識した。ビピリジンは、オスミウム酸を介して、ゲノムＬＩＮＥ１のメチル化Ｃ上のメチル基と安定な架橋を形成し、変性処理後、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブは溶出しないと同時に、ＬＩＮＥ１ ＩＣＯＮプローブのビオチンはチラミドシグナル増幅検出試薬中のストレプトアビジンに結合し、蛍光シグナルを増幅することにより、ｉｎ ｓｉｔｕレベルでの細胞の迅速かつ可視的な検出の目的を実現できる。
【選択図】 図２

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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