特許 7323456 抗ＢＭＰ１０抗体及び該抗体を有効成分とする、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-07-31

(45)【発行日】2023-08-08

(54)【発明の名称】抗ＢＭＰ１０抗体及び該抗体を有効成分とする、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230801BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20230801BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230801BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230801BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230801BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230801BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230801BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230801BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20230801BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230801BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/22

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P9/12

A61K39/395 N

A61K39/395 M

A61K39/395 D

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2019559178

(86)(22)【出願日】2018-12-12

(86)【国際出願番号】 JP2018045739

(87)【国際公開番号】W WO2019117208

(87)【国際公開日】2019-06-20

【審査請求日】2021-12-03

(31)【優先権主張番号】P 2017238106

(32)【優先日】2017-12-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001029

【氏名又は名称】協和キリン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所

(72)【発明者】

【氏名】有山 博之

(72)【発明者】

【氏名】小川 進也

(72)【発明者】

【氏名】北山 哲也

(72)【発明者】

【氏名】山田 武直

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５２６０８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２９０４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／１２６１６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／００７１９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Proc. Natl. Acad. Sci.，2015年，Vol.112, No.25，E3207-3215

【文献】J. Biol. Chem.，2016年，Vol.291, No.6，pp.2954-2966

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）～（ｗ）から選ばれる、モノクローナル抗体または該抗体断片であって、
前記モノクローナル抗体はヒトＢＭＰ１０に結合するモノクローナル抗体であり、
前記抗体断片はヒトＢＭＰ１０に結合する抗体断片である、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ａ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｂ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｃ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｄ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｅ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｆ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｇ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｈ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｊ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｋ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｌ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｎ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｏ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｐ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｑ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｒ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｓ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｔ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｕ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｖ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｗ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。

【請求項2】

ＢＭＰ１０の中和活性を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。

【請求項3】

ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の中和活性を有する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。

【請求項4】

遺伝子組換え抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。

【請求項5】

Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）及びジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）から選ばれる抗体断片である請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体断片。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。

【請求項7】

請求項６に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。

【請求項8】

請求項７に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。

【請求項9】

請求項８に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。

【請求項10】

ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対するアンタゴニストを含む、高血圧及び／又は高血圧性疾患の治療剤であり、該ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対するアンタゴニストがＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性を有する抗ＢＭＰ１０抗体である、治療剤。

【請求項11】

ＢＭＰ９アンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、高血圧及び／又は高血圧性疾患の治療剤であり、ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストが抗ＢＭＰ１０抗体であり、該ＢＭＰ９アンタゴニストが抗ＢＭＰ９抗体である、治療剤。

【請求項12】

ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、ＢＭＰ９アンタゴニストを含む、高血圧及び／又は高血圧性疾患の治療剤であり、ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストが抗ＢＭＰ１０抗体であり、該ＢＭＰ９アンタゴニストが抗ＢＭＰ９抗体である、治療剤。

【請求項13】

請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を含む、ヒトＢＭＰ１０が関与する疾患の診断薬。

【請求項14】

請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いる、ヒトＢＭＰ１０の免疫学的検出方法又は測定方法。

【請求項15】

請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片と薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項16】

高血圧および高血圧性疾患の治療用医薬組成物の製造のための、ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対するアンタゴニストの使用であり、該ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対するアンタゴニストがＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性を有する抗ＢＭＰ１０抗体である、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＢＭＰ１０（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１０）に結合する、抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株、および該形質転換株を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法に関する。

【0002】

また本発明は、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、高血圧および高血圧性疾患の治療剤、ヒトＢＭＰ１０が関与する疾患の診断薬又は医薬組成物、該アンタゴニストを用いるヒトＢＭＰ１０の免疫学的検出方法又は測定方法、並びに高血圧および高血圧性疾患の治療用医薬組成物の製造のための該アンタゴニストの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

ＢＭＰ１０は、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １０の略である。ＢＭＰ１０は約２０種類からなるＢＭＰ（骨形成タンパク質）ファミリー分子に属し、ヒトＢＭＰ１０は４２４アミノ酸からなる分泌タンパク質である（非特許文献１、２）。ＢＭＰ１０はタイプＩ及びタイプＩＩの２つの受容体に結合することにより、受容体が活性化され、Ｓｍａｄ１／５／８がリン酸化され、さらにリン酸化により活性化されたＳｍａｄ１／５／８が、Ｓｍａｄ４と複合体を形成後、核内に移行し、転写因子として機能する。

【0004】

ＢＭＰ１０は、心臓で主に発現し（非特許文献２、３、４）、ヒトＢＭＰ１０は血液中に約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する血中循環因子であることが知られている（非特許文献５）。

【0005】

生体内におけるＢＭＰ１０の役割について、これまでＢＭＰ１０欠損マウスの解析から、胎児期における心臓の発生、血管新生に重要な因子であることが報告されている（非特許文献６、７）。しかしながら、ＢＭＰ１０欠損マウスが胎生致死であることから、成体期におけるＢＭＰ１０の作用の報告はなく、また成体期において動物への抗ＢＭＰ１０抗体投与に基づく報告はない。

【0006】

また、高血圧を伴う拡張型心筋症であるＨＴ－ＤＣＭの患者においてＢＭＰ１０の遺伝子変異があり、該遺伝子変異によりＢＭＰ１０が過剰分泌されることが報告されている（非特許文献１２）。非特許文献１２には、高血圧ラットに高食塩を与えて心肥大を起こすと、ＢＭＰ１０ ｍＲＮＡの発現が上昇することが示されている。しかしながら、非特許文献１２にはＢＭＰ１０の中和および欠損についての記載はなく、ＢＭＰ１０の中和による降圧作用の予測は非常に困難である。

【0007】

従って、抗ＢＭＰ１０抗体が生体内において降圧作用、腎保護作用、心保護作用を有することを予想することは極めて困難であった。

【0008】

ＢＭＰ１０を特異的に中和する抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体として、Ｒ＆Ｄシステムズ社市販されているＭＡＢ２９２６（クローンＮｏ．４６２７３２）及び論文上で報告されている抗体１種（クローンＮｏ．１３Ｃ１１）が知られている。またＭＡＢ２９２６の方が１３Ｃ１１より強力なＢＭＰ１０中和活性を持つことが示されている（非特許文献８）。その他のＢＭＰ１０に対する特異的な中和抗体は知られていなかった。

【0009】

高血圧は、最も患者数の多い生活習慣病である。Ｃａ拮抗薬、利尿薬、ＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢなど数多くの薬剤が存在するが、米国ではわずか３５％しか適切に血圧をコントロールできていないことが報告されている（非特許文献９）。高血圧をコントロールできない原因の一つとして、長期間の服用期間によるアドヒアランスの低下が挙げられる。従って、持続的かつ安定的に血圧をコントロールできる新規の降圧薬が望まれている。

【0010】

既存降圧薬によるコントロールの困難な高血圧の一つとして食塩感受性高血圧が挙げられる。健常人は食塩の摂取量に応じて腎臓からナトリウムが排泄されて恒常性が保たれているが、食塩感受性高血圧患者では腎臓におけるナトリウム排泄機構に異常が生じている。食塩感受性亢進が生じている病態では、健常人と同量のナトリウムを排泄するためにより高い血圧を必要とし、従って食塩摂取量に応じて高血圧を呈する。対症方法として減塩療法が行われているが、減塩食によるＱＯＬの低下などから減塩療法によって降圧を達成できる患者は多くない（非特許文献１０）。従って、食塩感受性高血圧を治療できる新規分子を標的とした新しい機序の降圧薬が求められている。

【0011】

コントロール不良な高血圧は、脳卒中、心臓発作、心不全、腎疾患などの循環器疾患の発症リスクと関連する。腎不全が進行することにより、血中ナトリウムの貯留、体液貯留、血圧調節因子の活性化、尿毒症物質の蓄積などを来し、さらに血圧を上昇させる。また体液貯留による心不全は心拍出量の低下の結果、交感神経や体液調節因子の異常を引き起こし、血圧制御を困難にさせる。このように腎不全、心不全は高血圧などの血行動態不全を増悪させ、血行動態不全が腎不全、心不全病態を悪化させる心腎症候群という悪循環が生じる（非特許文献１１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】米国特許第８２８７８６８号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１３７５０３号明細書

【非特許文献】

【0013】

【文献】FEBS Letters 586 1846-1859(2012)

【文献】J Biol Chem. 2011 Jul 1;286(26):22785-94

【文献】Mech Dev. 1999 Feb;80(2):181-4.

【文献】Dev Genes Evol. 2004 Feb;214(2):96-8.

【文献】Blood. 2012 Jun 21; 119(25): 6162-6171.

【文献】Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jul 16;110(29):11887-92

【文献】Development. 2004 May; 131(9): 2219-2231.

【文献】Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 23; 112(25):E3207-15

【文献】Expert Opin Biol Ther. 2010 Jul;10(7):1077-87

【文献】実験医学 33(7): 1078-1084, 2015.

【文献】Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014 Oct;18(19):2918-26.

【文献】Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007 Dec;293(6):H3396-403.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

従って、新しい高血圧治療薬として、腎臓保護作用、心臓保護作用の両方を達成できる治療剤が望まれている。また、上述のように、新しい高血圧治療薬では、持続的かつ安定的な血圧のコントロール、新規の標的を介した降圧作用、また腎臓及び心臓に対する保護作用という三つの特徴が求められている。

【0015】

本発明は、抗ＢＭＰ１０抗体及び該抗体を有効成分とする、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、抗ＢＭＰ１０抗体の生体内における作用を明らかにする目的で、ラットを用いて抗ＢＭＰ１０抗体の取得を試みたところ、既存の抗体に比べて、ＢＭＰ１０に対する中和活性および結合活性が著しく向上した抗ＢＭＰ１０抗体の取得に成功した。加えて、ＡＬＫ１高発現細胞に対して既存の抗体は中和活性を持たないのに対し、取得した抗ＢＭＰ１０抗体は強力な中和活性をもつことを明らかにした。

【0017】

さらに、既存の抗体はＡＬＫ１と競合するのに対し、取得した抗ＢＭＰ１０抗体はＢＭＰＲＩＩ、Ｅｎｄｏｇｌｉｎと拮抗する新規の阻害様式をもつことを見出した。加えて取得した抗ＢＭＰ１０抗体を用いることによって、血中にはＢＭＰ９とＢＭＰ１０から構成されるヘテロ２量体が存在することを明らかにした。さらに取得した抗ＢＭＰ１０抗体は、ＡＬＫ１高発現細胞においてＢＭＰ９とＢＭＰ１０から構成されるヘテロ２量体に対して強力な中和活性を持つことを明らかにした。

【0018】

更に、取得した抗体を用いて、抗ＢＭＰ１０抗体の生体内における作用について検討した。その結果、本発明の抗ＢＭＰ１０抗体には、持続的な降圧作用があること、更に食塩感受性病態における高血圧およびナトリウム排泄障害を顕著に改善させること、高血圧に伴う糸球体障害、尿細管障害、心臓拡張機能障害に対する治療効果を持つことを見出した。

【0019】

本発明者らはこれらの知見に基づき、抗ＢＭＰ１０抗体を有効成分とする、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤を提供できると考え、本発明を完成させるに至った。

【0020】

すなわち、本発明は以下の（１）～（１８）に関する。
（１）それぞれ配列番号２９および３１で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１および３、ならびに配列番号３０で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３０で表されるアミノ酸配列の１６番目のセリンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含む重鎖；ならびにそれぞれ配列番号３２～３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体または該抗体断片。
（２）配列番号７１～８７から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（以下ＶＬと略記する）ならびに／または配列番号７０および８８～９８から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（以下ＶＨと略記する）を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（３）以下の（ａ）～（ｗ）から選ばれる、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（ａ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｂ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｃ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｄ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｅ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｆ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｇ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｈ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｊ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｋ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｌ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｎ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｏ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｐ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｑ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｒ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｓ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｔ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｕ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｖ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（ｗ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、モノクローナル抗体または該抗体断片。
（４）ＢＭＰ１０の中和活性を有する、（１）～（３）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（５）ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の中和活性を有する、（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（６）遺伝子組換え抗体である、（１）～（５）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（７）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドか
ら選ばれる抗体断片である（１）～（６）のいずれか１に記載の抗体断片。
（８）（１）～（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（９）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１１）（１０）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１２）ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、高血圧及び／又は高血圧性疾患の治療剤。
（１３）ＢＭＰ９アンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、（１２）に記載の治療剤。
（１４）ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストと同時または逐次に投与することを特徴とする、ＢＭＰ９アンタゴニストを含む、高血圧及び／又は高血圧性疾患の治療剤。
（１５）ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを含む、ヒトＢＭＰ１０が関与する疾患の診断薬。
（１６）ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストを用いる、ヒトＢＭＰ１０の免疫学的検出方法又は測定方法。
（１７）ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストと薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（１８）高血圧および高血圧性疾患の治療用医薬組成物の製造のための、ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方に対するアンタゴニストの使用。

【発明の効果】

【0021】

本発明の抗体は、既存抗体に比して、ＢＭＰ１０に対する中和活性および結合活性の少なくとも一方が著しく向上した抗ＢＭＰ１０抗体である。また、本発明の抗体は、ＡＬＫ１高発現細胞でＢＭＰ１０に対する中和活性を持つ。また、本発明の抗体は、ヒトＢＭＰ１０とヒトＢＭＰＲＩＩおよびヒトＥｎｄｏｇｌｉｎとの結合を阻害する。

【0022】

また、本発明の抗体により、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰ１０とから構成されるヘテロ２量体がヒト血中に存在することが示された。さらに、本発明の抗体は、ＡＬＫ１高発現細胞において、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰ１０とから構成されるヘテロ２量体に対する中和活性を持つ。

【0023】

また、本発明の抗体は、高血圧病態において持続的に血圧を降下させる作用を持つ。更に、本発明の抗体は、食塩感受性高血圧における高血圧およびナトリウム排泄障害を顕著に改善させる。加えて、本発明の抗体は、高血圧を伴う腎臓尿細管間質障害、腎臓糸球体障害、心臓拡張機能障害に対する改善作用を有する。

【0024】

本発明の抗体は上述の一つ以上または全ての特徴を有する抗体である。このような特徴を有する該抗体をコードするＤΝΑ、該ＤΝΑを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換株、該形質転換株を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とすることにより、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、取得した抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体のＢＭＰ１０中和活性を既知抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（μｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。黒丸はコントロール抗体、黒四角はＭＡＢ２９２６、白丸は１８Ｃ１抗体、白四角は１２Ｈ３抗体、白三角は１１Ｈ１０抗体を示す。

【図2】図２は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、取得した抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体のＢＭＰ１０中和活性を既知抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（μｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。黒丸はコントロール抗体、黒四角はＭＡＢ２９２６、白丸は１８Ｃ１抗体、白四角は１２Ｈ３抗体、白三角は１１Ｈ１０抗体を示す。

【図3】図３は、取得した１８Ｃ１抗体の各種ＢＭＰ分子に対する中和活性を評価した図である。縦軸は中和活性（％）を示す。白棒グラフは１８Ｃ１抗体、黒棒グラフはコントロール抗体を示す。

【図4】図４Ａ～図４Ｃは、取得した抗ＢＭＰ１０抗体の単回投与による、正常ラット全身血圧に対する作用を示す図である。図４Ａのグラフは１８Ｃ１抗体の単回投与による収縮期血圧の変化を示す。図４Ｂのグラフは１２Ｈ３抗体の単回投与による収縮期血圧の変化を示す。図４Ｃのグラフは１１Ｈ１０抗体の単回投与による収縮期血圧の変化を示す。グラフの横軸は抗体を投与した時間を０時間とした時の経過時間を、縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示す。

【図5】図５は、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の単回投与による、自然発症型高血圧ラットの血圧に対する作用を示す図である。図５のグラフは収縮期血圧の変化を示す。グラフの横軸は抗体を投与した時間を０時間とした時の経過時間を、縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示す。

【図6】図６は、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットの収縮期血圧に対する作用を示す図である。図６のグラフは収縮期血圧の変化を示す。グラフの横軸はラットの週齢（ｗ）を、縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示す。黒丸は正常食群（ｎ＝６）、黒四角は高食塩群（ｎ＝１２）、白丸は高食塩食＋１８Ｃ１抗体群（ｎ＝１２）を示す。図中のエラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。

【図7】図７Ａおよび図７Ｂは、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおけるナトリウム排泄に対する作用を示す図である。図７Ａは血中ナトリウム濃度の変化を示す。グラフの横軸はラットの週齢（ｗ）を、縦軸は血清ナトリウム濃度（ｍＥｑ）を示す。図７Ｂは１日当たりの尿中ナトリウム排泄量の変化を示す。グラフの横軸はラットの週齢（ｗ）を、縦軸は１日当たりの尿中ナトリウム排泄量（ｍＥｑ／day）を示す。黒丸は正常食群（ｎ＝６）、黒四角は高食塩群（ｎ＝１２）、白丸は高食塩食＋１８Ｃ１抗体群（ｎ＝１２）を示す。図中のエラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。

【図8】図８は、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける１日当たりの尿量の変化を示す。グラフの横軸はラットの週齢（ｗ）を、縦軸は１日当たりの体重当たり尿量（ｍＬ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。黒丸は正常食群（ｎ＝６）、黒四角は高食塩群（ｎ＝１２）、白丸は高食塩食＋１８Ｃ１抗体群（ｎ＝１２）を示す。図中のエラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。

【図9】図９は、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける腎機能に対する作用を示す図である。図９は１日当たりの尿中タンパク質排泄量の変化を示す。グラフの横軸はラットの週齢（ｗ）を、縦軸は１日当たりの尿中タンパク質排泄量（ｍｇ／ｄａｙ）を示す。黒丸は正常食群（ｎ＝６）、黒四角は高食塩群（ｎ＝１２）、白丸は高食塩食＋１８Ｃ１抗体群（ｎ＝１２）を示す。図中のエラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｆは、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける腎機能に対する作用を示す図である。図１０ＡはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける通常食群の腎臓糸球体病理を示す図である。図１０ＢはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットに高食塩食群の腎臓糸球体病理を示す図である。図１０ＣはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットに高食塩食を与えて１８Ｃ１抗体を投与した群（高食塩食＋１８Ｃ１）の腎臓糸球体病理を示す図である。図１０ＤはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける通常食群の腎臓尿細管間質病理の写真である。図１０ＥはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットに高食塩食群の腎臓尿細管間質病理の写真である。図１０ＦはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットに高食塩食を与えて１８Ｃ１抗体を投与した群（高食塩食＋１８Ｃ１）の腎臓尿細管間質病理の写真である。

【図11】図１１Ａおよび図１１Ｂは、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける腎機能に対する作用を示す図である。図１１ＡはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットの糸球体病理スコアを示したグラフである。縦軸は病理スコアを示す。図１１ＢはＤａｈｌ食塩感受性高血圧ラットの尿細管間質病理スコアを示したグラフである。縦軸は病理スコアを示す。

【図12】図１２Ａおよび図１２Ｂは、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける心機能に対する作用を示す図である。図１２Ａは１６週齢時点の心臓エコーで測定した左室後壁厚を示す。グラフの横軸は餌の種類と投与した薬剤を、縦軸は左室後壁厚を示す。図１２Ｂは１６週齢時点の心臓エコーで測定した僧帽弁輪速度ｅ’を示す。グラフの横軸は餌の種類と投与した薬剤を、縦軸はｅ’を示す。正常食群（ｎ＝６）、高食塩群（ｎ＝１２）、高食塩食＋１８Ｃ１抗体群（ｎ＝１２）である。図中のエラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。

【図13】図１３は、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体の、Ｄａｈｌ食塩感受性高血圧ラットにおける心機能に対する作用を示す図である。図１３は１６週齢時点で解剖して採取した肺の重量を体重で補正した値を示す。グラフの縦軸は肺重量体重比率（ｍｇ．肺重量／ｇ．体重）を示す。正常食群（ｎ＝６）、高食塩群（ｎ＝１２）、高食塩食＋１８Ｃ１抗体群（ｎ＝１２）である。図中のエラーバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。

【図14】図１４は、ヒト血中にＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体が存在し、取得した抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体がＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性を持つことを示した図である。図１４はＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞における、抗ＢＭＰ９抗体と抗ＢＭＰ１０抗体の血中ＢＭＰに対する中和活性を示す。横軸は抗体の添加濃度（μｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白丸はコントロール抗体、黒丸は１８Ｃ１抗体、黒四角は１２Ｈ３抗体、黒三角は１１Ｈ１０抗体、黒ひし形は抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体、白四角は１２Ｈ３抗体と１０Ｄ５抗体を混合したもの、白三角は１１Ｈ１０抗体と１０Ｄ５抗体を混合したものを示す。白四角と白三角は破線で示す。

【図15】図１５は、血中にＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体が存在することを示す図である。図１５は抗ＢＭＰ１０抗体または抗ＢＭＰ９抗体を固相化し、ヒト血清を反応させ、抗ＢＭＰ１０抗体１２Ｈ３抗体をビオチン化した抗体で検出したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。縦軸はＥＬＩＳＡでの吸光度（ＯＤ４５０／５７０）、横軸はヒト血清の終濃度（％）を示す。黒丸は抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体、白四角は１１Ｈ１０抗体、黒三角はコントロール抗体を固相化したものである。

【図16】図１６は、１８Ｃ１抗体を改変して設計されるヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号７０のアミノ酸配列からの改変により設計したアミノ酸配列を示す。配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。

【図17】図１７は、１８Ｃ１抗体を改変して設計されるヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図であり、配列番号２３のアミノ酸配列からの改変により設計したアミノ酸配列を示す。配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。

【図18】図１８Ａおよび図１８Ｂは、１８Ｃ１抗体を改変して設計されるヒト化抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。各配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。図１８Ａは、配列番号７１のアミノ酸配列からの改変により設計したアミノ酸配列を示す。図１８Ｂは、配列番号２６のアミノ酸配列からの改変により設計したアミノ酸配列を示す。

【図19】図１９は、１８Ｃ１抗体を改変して設計されるヒト化抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図であり、配列番号７０のアミノ酸配列からの改変により設計したアミノ酸配列を示す。配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。

【図20】図２０は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白四角はＶＬｒｅｓ０２ＨＶｍｕｔ０７、白三角はＶＬｒｅｓ０２ＨＶｍｕｔ０８、黒三角はＶＬｒｅｓ０４ＨＶｍｕｔ０４抗体、黒丸はＶＬｒｅｓ０４ＶＨｒｅｓ１６抗体、白丸はｃｈ１８Ｃ１抗体を示す。黒丸と黒三角は破線で示す。

【図21】図２１は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白四角はＶＬｒｅｓ０６ＨＶｍｕｔ０２、白三角はＶＬｒｅｓ０６ＨＶｍｕｔ１０、黒三角はＶＬｒｅｓ０７ＨＶｍｕｔ１０抗体、黒丸はＶＬｒｅｓ０７ＶＨｒｅｓ１６抗体、白丸はｃｈ１８Ｃ１抗体を示す。黒丸と黒三角は破線で示す。

【図22】図２２は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白四角はＶＬｒｅｓ０８ＨＶｍｕｔ０４、白三角はＶＬｒｅｓ０８ＨＶｍｕｔ０８、黒三角はＶＬｒｅｓ０８ＶＨｒｅｓ１６抗体、黒丸はＶＬｒｅｓ１０ＨＶｍｕｔ０２抗体、白丸はｃｈ１８Ｃ１抗体を示す。黒丸と黒三角は破線で示す。

【図23】図２３は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白四角はＶＬｒｅｓ１０ＨＶｍｕｔ０４、白三角はＶＬｒｅｓ１０ＨＶｍｕｔ０８、黒三角はＶＬｒｅｓ１０ＨＶｍｕｔ１０抗体、黒丸はＶＬｒｅｓ１０ＶＨｒｅｓ１６抗体、白丸はｃｈ１８Ｃ１抗体を示す。黒丸と黒三角は破線で示す。

【図24】図２４は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白四角はＶＬｒｅｓ１４ＨＶｍｕｔ０７、白三角はＶＬｒｅｓ１４ＨＶｍｕｔ０８、黒三角はＶＬｒｅｓ１４ＨＶｍｕｔ１０抗体、黒丸はＶＬｒｅｓ１４ＶＨｒｅｓ１６抗体、白丸はｃｈ１８Ｃ１抗体を示す。黒丸と黒三角は破線で示す。

【図25】図２５は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。横軸は抗体の添加濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸は中和活性（％）を示す。白四角はＶＬｒｅｓ１６ＨＶｍｕｔ０７、白三角はＶＬｒｅｓ１６ＨＶｍｕｔ１０、黒三角はＶＬｒｅｓ１６ＶＨｒｅｓ１６、黒丸はｃｈ１８Ｃ１抗体を示す。黒丸と黒三角は破線で示す。

【図26】図２６は、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のヒト血中ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性を１８Ｃ１キメラ抗体と比較したグラフである。縦軸はＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を示す。

【図27】図２７Ａおよび図２７Ｂは、抗ＢＭＰ９抗体、あるいは抗ＢＭＰ９抗体と抗ＢＭＰ１０抗体混合液の単回投与による、正常ラット全身血圧に対する作用を示す図である。図２７Ａは１０Ｄ５抗体の単回投与による収縮期血圧の変化を示す。図２７Ｂは、１０Ｄ５抗体と１１Ｈ１０抗体の混合液の単回投与による収縮期血圧の変化を示す。白丸は媒体（ＰＢＳ）投与した当日の変化、白三角は抗体を投与した当日の変化、黒四角は抗体を投与した１日後の変化、黒三角は抗体を投与した２日後の変化を示す。黒四角と黒三角は破線で示す。グラフの横軸は薬液を投与した時間を０時間とした時の経過時間を、縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示す。

【図28】図２８は、ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質の単回投与による、正常ラット全身血圧に対する作用を示す図である。白丸は媒体（ＰＢＳ）を投与した当日の変化、白三角はヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質を投与した当日の変化、グラフの横軸は薬液を投与した時間を０時間とした時の経過時間を、縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、ヒトＢＭＰ１０に結合するモノクローナル抗体に関する。また、本発明は、ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に結合するモノクローナル抗体に関する。

【0027】

本発明において、本発明のモノクローナル抗体と競合してヒトＢＭＰ１０に結合する抗体とは、所望のバインディングアッセイ系において、本発明のモノクローナル抗体とヒトＢＭＰ１０との結合を阻害する抗体をいう。

【0028】

本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。

【0029】

ヒトＢＭＰ１０は、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を持つ、一本鎖の前駆体タンパク質（Ｐｒｅ－Ｐｒｏ体）として合成される。この一本鎖のＰｒｅ－Ｐｒｏ体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、１から２１番目までのシグナルペプチド領域が切断されて全長体となった後、３８８番目に存在するシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体（Ｐｒｏ２量体、または全長体２量体）を形成する。

【0030】

その後、ｆｕｒｉｎ様プロテアーゼにより、配列番号４７で表されるアミノ酸配列の３１６番目と３１７番目のアミノ酸残基間で切断がおこり、Ｎ末側断片のプロペプチド領域（配列番号４７で表されるアミノ酸配列のうち、２２番目のアミノ酸から３１６番目のアミノ酸までを含むペプチド。Ｎ末プロペプチド体ともいう）と配列番号４８で表されるアミノ酸配列からなるＣ末側断片（ｍａｔｕｒｅ領域またはｍａｔｕｒｅ体ともいう）に分割される。

【0031】

前記ｍａｔｕｒｅ領域は、プロペプチド領域の切断後も、配列番号４８で表されるアミノ酸配列の７２番目に残るシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体を形成する（以下、ｍａｔｕｒｅ２量体と表記する）。切断されたＮ末側のプロペプチド領域の２分子は、このｍａｔｕｒｅ２量体１分子と非共有結合を介し複合体を形成し、その複合体の形で細胞から分泌される。ｍａｔｕｒｅ２量体及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体のいずれも、ＢＭＰ１０の機能を有している。

【0032】

従って、本発明におけるヒトＢＭＰ１０としては、配列番号４７又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７で示されるアミノ酸配列のうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３１７番目から４２４番目までのアミノ酸配列（配列番号４８）を含み、かつヒトＢＭＰ１０の機能を有するポリペプチドをいう。

【0033】

また、本発明におけるヒトＢＭＰ１０としては、配列番号４８で示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ１０の機能を有するポリペプチドをいう。さらに、本発明におけるヒトＢＭＰ１０としては、配列番号４８で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ１０の機能を有するポリペプチドをいう。さらに、本発明におけるヒトＢＭＰ１０としては、上述のｍａｔｕｒｅ２量体、及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体も包含される。

【0034】

ヒトＢＭＰ９は、配列番号６６で表されるアミノ酸配列を持つ、一本鎖の前駆体タンパク質（Ｐｒｅ－Ｐｒｏ体）として合成される。この一本鎖のＰｒｅ－Ｐｒｏ体は、配列番号６６で表されるアミノ酸配列のうち、１から２２番目までのシグナルペプチド領域が切断された後、３９２番目に存在するシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体（Ｐｒｏ２量体）を形成する。

【0035】

その後、ｆｕｒｉｎ様プロテアーゼにより、配列番号６６で表されるアミノ酸配列の３１９番目と３２０番目のアミノ酸残基間で切断が起こり、Ｎ末側断片のプロペプチド領域（配列番号６６で表されるアミノ酸配列のうち、２３番目のアミノ酸から３１９番目のアミノ酸までを含むペプチド）と配列番号６５で表されるアミノ酸配列からなるＣ末側断片（ｍａｔｕｒｅ領域）に分割される。

【0036】

前記ｍａｔｕｒｅ領域は、プロペプチド領域の切断後も、配列番号６５で表されるアミノ酸配列の７３番目に残るシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体を形成する（以下、ｍａｔｕｒｅ２量体と表記する）。切断されたＮ末側のプロペプチド領域の２分子は、このｍａｔｕｒｅ２量体１分子と非共有結合を介し複合体を形成し、その複合体の形で細胞から分泌される［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２６，２５１１１（２００５）］。ｍａｔｕｒｅ２量体及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体のいずれも、ＢＭＰ９の機能を有している。

【0037】

従って、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列のうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号６５）を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをいう。

【0038】

また、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、配列番号６５で示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをいう。

【0039】

更に、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、配列番号６５で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをいう。更に、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、上述のｍａｔｕｒｅ２量体、及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体も包含される。

【0040】

前述のＢＭＰは同一のタンパク質の２量体（以下、ホモ２量体と表記する）だけでなく、ＢＭＰファミリーに属する別のタンパク質と２量体を形成する（以下、ヘテロ２量体と表記する）。本発明におけるＢＭＰ９とＢＭＰ１０とから構成されるヘテロ２量体（ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体とも表記する）とは、配列番号４８で示されるＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ領域に相当するアミノ酸配列と、配列番号６５で示されるＢＭＰ９ ｍａｔｕｒｅ領域に相当するアミノ酸配列の両方を含む。

【0041】

また、本発明におけるＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体には、配列番号４８で示されるアミノ酸配列および配列番号６５で示されるアミノ酸配列の少なくとも一方において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の機能を有するポリペプチドも包含される。更に、本発明におけるＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体には、配列番号４８で示されるアミノ酸配列および配列番号６５で示されるアミノ酸配列の少なくとも一方と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の機能を有するポリペプチドも包含される。更に、本発明におけるＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体には、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体も包含される。

【0042】

前述のＢＭＰ１０の機能としては、ＢＭＰ１０の細胞内のシグナル伝達への関与をいう。細胞内のシグナル伝達では、ＢＭＰ１０がＴＧＦβスーパーファミリーに属するタイプＩ及びタイプＩＩの２つの受容体に結合することにより、当該受容体が活性化され、Ｓｍａｄ１／５／８がリン酸化され、さらにリン酸化により活性化されたＳｍａｄ１／５／８が、Ｓｍａｄ４と複合体を形成後、核内に移行し、転写因子として機能する。

【0043】

前述のＢＭＰ９の機能としては、ＢＭＰ９の細胞内のシグナル伝達への関与をいう。細胞内のシグナル伝達では、ＢＭＰ９がＴＧＦβスーパーファミリーに属するタイプＩ及びタイプＩＩの２つの受容体に結合することにより、当該受容体が活性化され、Ｓｍａｄ１／５／８がリン酸化され、さらにリン酸化により活性化されたＳｍａｄ１／５／８が、Ｓｍａｄ４と複合体を形成後、核内に移行し、転写因子として機能する。

【0044】

タイプＩ受容体としては、ＡＬＫ１及びＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６が挙げられる。また、タイプＩＩ受容体としては、ＢＭＰタイプＩＩ受容体（ＢＭＰＲＩＩ）、ａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩａ受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）、及びａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩｂ）が挙げられる。またタイプＩ及びタイプＩＩ以外の受容体としては、Ｅｎｄｏｇｌｉｎが挙げられる。

【0045】

配列番号４８で示されるアミノ酸配列および配列番号６５で示されるアミノ酸配列の少なくとも一方において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９、（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号４８または配列番号６５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。

【0046】

欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。

【0047】

ヒトＢＭＰ１０をコードする遺伝子としては、配列番号４９又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４４８２で示される塩基配列が挙げられる。そのうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する配列番号５０で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ１０の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明のヒトＢＭＰ１０をコードする遺伝子に含まれる。また、配列番号５０で示される塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ１０の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明のヒトＢＭＰ１０をコードする遺伝子に含まれる。さらに、配列番号５０で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＢＭＰ１０の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のヒトＢＭＰ１０をコードする遺伝子に包含される。

【0048】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号５０で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。

【0049】

具体的には、ハイブリダイズしたコロニーもしくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物又はオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃にてハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、（１９９５）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。

【0050】

前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号５０で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。

【0051】

真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＢＭＰ１０をコードする遺伝子に包含される。

【0052】

本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。

【0053】

デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。

【0054】

配列番号４７又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号４７で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換株を培養することにより作製することができる。

【0055】

また、上記の方法で作製されるポリペプチド又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号４７又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。

【0056】

さらに、配列番号４７又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号４７又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。

【0057】

ＢＭＰ９についても、上述の方法、または特開２０１７－２５０１１号公報に記載の方法など公知の方法により、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを作製することができる。

【0058】

本発明のアンタゴニストとは、リガンドとその受容体タンパク質の結合を阻害することにより受容体の活性化を阻害するものをいう。
本発明のＢＭＰ１０アンタゴニストとは、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方とそれらの受容体タンパク質の結合を阻害することにより、受容体の活性化を阻害するものをいう。また本発明のＢＭＰ１０アンタゴニストとは、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方の中和活性を持つものをいう。本発明のＢＭＰ１０アンタゴニストとは、本発明の抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体または該抗体断片を含む。
本発明のＢＭＰ９アンタゴニストとはＢＭＰ９とその受容体タンパク質の結合を阻害することにより、受容体の活性化を阻害するものをいう。また本発明のＢＭＰ９アンタゴニストとは、ＢＭＰ９の中和活性を持つものをいう。本発明のＢＭＰ９アンタゴニストとして、例えば抗ＢＭＰ９抗体が挙げられる。

【0059】

本発明の抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体（以下、本発明の抗体または本発明のモノクローナル抗体ともいう）またはその抗体断片の一態様は、ヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列、又はその立体構造を認識し、かつ結合する抗体又はその抗体断片である。本発明の抗体またはその抗体断片の一態様は、ヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合し、ＢＭＰ１０とＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害し、ＢＭＰ１０とＥｎｄｏｇｌｉｎの結合を阻害し、ＢＭＰ１０とＡＬＫ１との結合を阻害しない抗体又はその抗体断片である。また、本発明の抗体またはその抗体断片の一態様は、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体のアミノ酸配列、又はその立体構造を認識し、かつ結合する抗体又はその抗体断片である。本発明の抗体またはその抗体断片の一態様は、ＢＭＰ１０の中和活性を有する抗体又はその抗体断片である。本発明の抗体またはその抗体断片の一態様は、ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の中和活性を有する抗体又はその抗体断片である。

【0060】

本発明の抗体またはその抗体断片としては、上記いずれかの特徴を１つまたは複数持てばいかなるものでもよいが、ＢＭＰ１０に結合し、ＢＭＰ１０とＢＭＰＲＩＩとの結合およびＢＭＰ１０とＥｎｄｏｇｌｉｎとの結合を阻害し、ＢＭＰ１０とＡＬＫ１の結合を阻害せず、ＢＭＰ１０の中和活性を有し、ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に結合し、ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の中和活性を有するという全ての特徴を有しているものが最も好ましい。

【0061】

また、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の一態様としては、本発明のモノクローナル抗体と競合してヒトＢＭＰ１０に結合する抗体またはその抗体断片も含まれる。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片と競合してヒトＢＭＰ１０に結合する抗体またはその抗体断片であって、ＢＭＰ１０及びＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方の中和活性を有する抗体又はその抗体断片も含まれる。

【0062】

さらに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の一態様としては、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体またはその抗体断片も含まれる。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体またはその抗体断片であって、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の少なくとも一方の中和活性を有する抗体又はその抗体断片も含まれる。

【0063】

本発明におけるヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号４８で表されるヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列を２つ含み、７２番目のシステイン残基間がジスルフィド結合を形成しているものが挙げられる。

【0064】

本発明におけるヒトＢＭＰ１０の立体構造としては、配列番号４７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７又は配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含むヒトＢＭＰ１０が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＢＭＰ１０が天然状態でとりうる立体構造とは、ヒトＢＭＰ１０の天然型の立体構造のことをいう。

【0065】

本発明におけるヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６５で表されるヒトＢＭＰ９ ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列を２つ含み、７３番目のシステイン残基間がジスルフィド結合を形成しているものが挙げられる。

【0066】

本発明におけるヒトＢＭＰ９の立体構造としては、配列番号６６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８又は配列番号６５で示されるアミノ酸配列を含むヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる立体構造とは、ヒトＢＭＰ９の天然型の立体構造のことをいう。

【0067】

本発明におけるヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号４８で表されるヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列および配列番号６５で表されるヒトＢＭＰ９ ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列を１つずつ含み、システイン残基間がジスルフィド結合を形成しているものが挙げられる。

【0068】

本発明におけるヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の立体構造としては、配列番号４７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５２９７又は配列番号４８で示されるアミノ酸配列及び配列番号６６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８又は配列番号６５で示されるアミノ酸配列の２つを含むヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体が天然状態でとりうる立体構造とは、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の天然型の立体構造のことをいう。

【0069】

本発明におけるＢＭＰＲＩＩとしては、配列番号５１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１９５で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２７番目から１５０番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。

【0070】

本発明におけるＡＬＫ１としては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００１１で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２２番目から１１８番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。

【0071】

本発明におけるＥｎｄｏｇｌｉｎとしては、配列番号６９又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０８２２５で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２７番目から５８６番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。

【0072】

本発明におけるＡＬＫ１高発現細胞とは、通常よりＡＬＫ１を多く発現している細胞をいう。ＡＬＫ１高発現細胞には、後述する実施例３の３－１）に記載のヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞およびＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞も含む。

【0073】

本発明における抗体として、具体的には、以下の（Ａ）または（Ｂ）で表されるモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（Ａ）それぞれ配列番号２９～３１で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１～３を含む重鎖；ならびにそれぞれ配列番号３２～３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片。
（Ｂ）それぞれ配列番号２９および３１で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１および３、ならびに配列番号３０で表されるアミノ酸配列の１６番目のセリンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列（配列番号９９）を含むＣＤＲ２を含む重鎖；ならびにそれぞれ配列番号３２～３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片。

【0074】

また、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片としては、前記モノクローナル抗体またはその抗体断片と競合してヒトＢＭＰ１０に結合する抗体及びその抗体断片を挙げることができる。

【0075】

さらに、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片としては、前記モノクローナル抗体またはその抗体断片が結合するヒトＢＭＰ１０に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片を挙げることができる。

【0076】

結合活性とは、例えば本発明の抗体又はその抗体断片が、ヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列、又はその立体構造に対して結合する活性を有することをいう。

【0077】

本発明の抗体の結合活性は、例えば、固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など、ヒトＢＭＰ１０またはヒトＢＭＰ１０を発現した組織に対する公知の免疫学的検出法、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法などにより確認することができる。他にも、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）などを用いた表面プラズモン共鳴、ＩＴＣ（ＤＫＳＨ社製）などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。

【0078】

抗原に対する抗体の結合解離定数（Ｋｄ値）は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、等温滴定カロリメトリー、いずれの方法からも、スキャッチャード・プロット、または各装置の添付文書に従った解析を行うことで、求めることができる。具体的には、Ｋｄ値はＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定したセンサーグラムから、シングルサイクルカイネティクス算出法（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により解析することで、算出することができる。

【0079】

本発明のＢＭＰ１０に対する中和活性とは、例えば、ヒトＢＭＰ１０に結合した抗体又は該抗体断片が、ヒトＢＭＰ１０の受容体への結合を阻害し、受容体が活性化をすることを阻害することである。中和活性は、例えば、ヒトＢＭＰ１０受容体発現細胞を用いた方法、ヒトＢＭＰ１０と受容体タンパク質の結合に対する抗体の阻害を調べることができる方法などにより測定することができる。

【0080】

本発明のヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性とは、例えば、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に結合した抗体又は該抗体断片が、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の受容体への結合を阻害し、受容体が活性化することを阻害することである。

【0081】

ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体を中和する方法として、例えば、ヒトＢＭＰ９に結合する抗体又は該抗体断片とヒトＢＭＰ１０に結合する抗体又は該抗体断片を混合し、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の受容体への結合を阻害し、受容体が活性化することを阻害する方法が挙げられる。また、ヒトＢＭＰ１０に結合する抗体であって、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の受容体への結合を阻害する抗体を用いて、受容体が活性化することを阻害する方法も挙げられる。

【0082】

中和活性の測定方法としては、例えば、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の受容体発現細胞を用いた方法、ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体と受容体タンパク質の結合に対する抗体の阻害を調べることができる方法などにより確認することができる。

【0083】

ヒトＢＭＰ１０受容体発現細胞またはヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体受容体発現細胞を用いた中和活性の測定方法としては、例えば、転写因子の活性化をルシフェラーゼなどの酵素で検出するレポーターアッセイなどの方法が挙げられる。

【0084】

ヒトＢＭＰ１０と受容体タンパク質、またはヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体と受容体タンパク質の結合に対する抗体の阻害を調べる方法としては、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）などを用いた表面プラズモン共鳴、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの方法が挙げられる。

【0085】

本発明の抗体又はその抗体断片が、ヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することは、固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など、ヒトＢＭＰ１０またはヒトＢＭＰ１０を発現した組織に対する公知の免疫学的検出法、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法などにより確認することができる。

【0086】

また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。

【0087】

ヒトＢＭＰ１０を発現した組織としては、該ＢＭＰ１０を発現していればいずれの組織でもよく、例えば血液、心臓、肝臓などが挙げられる。

【0088】

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換株により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。

【0089】

モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。

【0090】

エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。

【0091】

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列に結合する。

【0092】

本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、配列番号４７で示されるヒトＢＭＰ１０のアミノ酸配列に含まれ、より好ましくは配列番号４８で示されるアミノ酸配列に含まれる。

【0093】

本発明において、バイスぺシフィック抗体とは、特異性が異なる２種類の抗原結合ドメインを有する抗体をいう。バイスぺシフィック抗体のそれぞれの抗原結合ドメインは、単一の抗原の異なるエピトープに結合してもよいし、異なる抗原に結合してもよい。

【0094】

一分子のバイスペシフィック抗体は、単一の抗原の異なるエピトープ、または異なる抗原それぞれに一つ以上の抗原結合ドメインが結合する、すなわちそれぞれ一価以上で結合する。例えば、本発明において、一分子のバイスペシフィック抗体が、ＢＭＰ１０に結合する抗原結合ドメインおよびＢＭＰ９に結合する抗原結合ドメインを一つずつ有する場合、かかるバイスペシフィック抗体は、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９に、それぞれ一価で結合する。

【0095】

本発明の抗体には、ＢＭＰ９とＢＭＰ１０に結合するバイスペシフィック抗体も含む。

【0096】

ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＢＭＰ１０を抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体を取得することができる。

【0097】

抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。

【0098】

本発明における遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。

【0099】

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（ＶＨとも記す）及び軽鎖可変領域（ＶＬとも記す）とヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨとも記す）及び軽鎖定常領域（ＣＬとも記す）からなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、前記のハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0100】

ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４又はこれらの改変体といったサブクラスのいずれも用いることができる。前記改変体としては、例えばｈＩｇＧ４の重鎖定常領域の、ＥＵ－ｉｎｄｅｘにおける２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＧｌｕに、および４０９番目のＡｒｇ残基をＬｙｓにそれぞれ置換したＩｇＧ４変異体（以下、ＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋと記載する）の重鎖定常領域を用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。

【0101】

本発明のヒト型キメラ抗体として具体的には、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。また、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。また、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。

【0102】

ヒト化抗体としては、ヒト型ＣＤＲ移植抗体または表面再構成法によるヒト化抗体が挙げられる。また、これらのヒト化抗体を作製する方法を組み合わせた方法により作製された抗体も、本発明のヒト化抗体に含まれる。さらに、これらの方法で設計されるヒト化抗体のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつヒトＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロダイマーを特異的に認識する抗体も、本発明のヒト化抗体に含まれる。

【0103】

ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、以下のようにして製造することができる。すなわち、ヒトＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロダイマーを特異的に認識し、かつヒトＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロダイマーのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築する。次いで、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させる。

【0104】

表面再構成法によるヒト化抗体とは、表面再構成方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９４，９１（３）：９６９－７３およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６， １０， ８９５－９０）により、ヒト以外の動物の抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗体の結合活性に影響を与えないと考えられるＦＲのアミノ酸残基を、抗原性を低下させると考えられるアミノ酸残基へ置換した抗ｓ体をいう。本発明の表面再構成法によるヒト化抗体は、以下のようにして製造することができる。すなわち、ヒトＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロダイマーを特異的に認識し、
かつヒトＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロダイマーのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合する、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのうち、任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築する。次いで、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入して表面再構成法によるヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させる。

【0105】

ヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラス又はこれらの改変体のいずれも用いることができる。前記改変体としては、例えばＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９ＫのＣＨを用いることができる。また、ヒト化抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。

【0106】

本発明のヒト化抗体として具体的には、それぞれ配列番号２９および３１で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；以下ＣＤＲと略記する）１および３、ならびに配列番号３０で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３０で表されるアミノ酸配列の１６番目のセリンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含む重鎖；ならびにそれぞれ配列番号３２～３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含む軽鎖を含むヒト化抗体が挙げられる。

【0107】

本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）ＶＨ及び（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号７０で表されるアミノ酸配列、又は配列番号７０で表されるアミノ酸配列の１４番目のＰｒｏ、２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、２９番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＩｌｅ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｎ、７８番目のＰｈｅ、８２番目のＬｅｕ、８５番目のＶａｌ、９２番目のＶａｌ、９４番目のＴｙｒ、及び１０９番目のＴｈｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）配列番号７１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の７番目のＰｒｏ、１０番目のＶａｌ、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、１６番目のＬｙｓ、１９番目のＴｈｒ、２０番目のＩｌｅ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、８１番目のＬｅｕ、８２番目のＬｙｓ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ

【0108】

本発明のヒト化抗体としては、ＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を以下の（Ａ）に示すように置換したものも含む。
（Ａ）ＶＨのＣＤＲ１が配列番号２９で表されるアミノ酸配列または、配列番号２９で表されるアミノ酸配列中の４番目のＶａｌをＡｌａに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２が配列番号３０で表されるアミノ酸配列または、配列番号３０で表されるアミノ酸配列中の１６番目のＳｅｒをＡｓｐに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３が配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲのアミノ酸配列。

【0109】

更に、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）～（１４）が好ましい。
（１）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の１４番目のＰｒｏ、２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、２９番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＩｌｅ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｎ、７８番目のＰｈｅ、８２番目のＬｅｕ、８５番目のＶａｌ、９２番目のＶａｌ、９４番目のＴｙｒ、及び１０９番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、２９番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＩｌｅ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、７８番目のＰｈｅ、８２番目のＬｅｕ、８５番目のＶａｌ、９４番目のＴｙｒ、及び１０９番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、７８番目のＰｈｅ、８２番目のＬｅｕ、９２番目のＶａｌ、及び９４番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（４）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、２９番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、９２番目のＶａｌ、及び９４番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（５）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、４８番目のＩｌｅ、７１番目のＶａｌ、７８番目のＰｈｅ、８２番目のＬｅｕ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（６）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（７）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、７８番目のＰｈｅ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（８）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、７１番目のＶａｌ、７８番目のＰｈｅ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（９）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（１０）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、７１番目のＶａｌ、９２番目のＶａｌ、及び９４番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（１１）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の２７番目のＧｌｙ、７１番目のＶａｌ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（１２）配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の７１番目のＶａｌ、及び９２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（１３）配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ
（１４）上記（１）～（１３）で示されるＶＨに対し、そのＣＤＲのアミノ酸配列を前記（Ａ）に記載のＣＤＲのアミノ酸配列に置き換えたアミノ酸配列を含むＶＨ

【0110】

前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７０で表されるアミノ酸配列中の１４番目のＰｒｏをＬｅｕに、２０番目のＬｅｕをＩｌｅに、２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、２９番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３４番目のＶａｌをＡｌａに、３７番目のＩｌｅをＶａｌに、４８番目のＩｌｅをＭｅｔに、６５番目のＳｅｒをＡｓｐに、６７番目のＶａｌをＬｅｕに、７１番目のＶａｌをＡｒｇに、７６番目のＡｓｎをＳｅｒに、７８番目のＰｈｅをＶａｌに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８５番目のＶａｌをＬｅｕに、９２番目のＶａｌをＬｙｓに、９４番目のＴｙｒをＰｈｅに、又は１０９番目のＴｈｒをＩｌｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0111】

また、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、以下の（１）～（１５）が好ましい。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の７番目のＰｒｏ、１０番目のＶａｌ、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、１６番目のＬｙｓ、１９番目のＴｈｒ、２０番目のＩｌｅ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、８１番目のＬｅｕ、８２番目のＬｙｓ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の７番目のＰｒｏ、１０番目のＶａｌ、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、１９番目のＴｈｒ、２０番目のＩｌｅ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の７番目のＰｒｏ、１２番目のＧｌｕ、１９番目のＴｈｒ、２０番目のＩｌｅ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、８１番目のＬｅｕ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の７番目のＰｒｏ、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、１６番目のＬｙｓ、１９番目のＴｈｒ、４１番目のＰｒｏ、７５番目のＳｅｒ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の１２番目のＧｌｕ、２０番目のＩｌｅ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１２番目のＧｌｕ、１６番目のＬｙｓ、１９番目のＴｈｒ、４１番目のＰｒｏ、８２番目のＬｙｓ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１６番目のＬｙｓ、２０番目のＩｌｅ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１４番目のＰｒｏ、２０番目のＩｌｅ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、８１番目のＬｅｕ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、２０番目のＩｌｅ、４８番目のＶａｌ、８２番目のＬｙｓ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１９番目のＴｈｒ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（１１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、４１番目のＰｒｏ、７５番目のＳｅｒ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（１２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、４１番目のＰｒｏ、７５番目のＳｅｒ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（１３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、１９番目のＴｈｒ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（１４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の、２０番目のＩｌｅ、４８番目のＶａｌ、及び８８番目のＡｓｐが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（１５）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬ

【0112】

前記ＶＬのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の７番目のＰｒｏをＳｅｒに、１０番目のＶａｌをＭｅｔに、１２番目のＧｌｕをＴｈｒに、１４番目のＰｒｏをＬｅｕに、１６番目のＬｙｓをＳｅｒに、１９番目のＴｈｒをＬｙｓに、２０番目のＩｌｅをＬｅｕに、４１番目のＰｒｏをＧｌｕまたはＡｒｇに、４８番目のＶａｌをＭｅｔに、７５番目のＳｅｒをＰｈｅに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、８２番目のＬｙｓをＧｌｎに、８８番目のＡｓｐをＩｌｅに、又は９０番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0113】

また、本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）もしくは（ｃ）で示されるＶＨ及び／または（ｂ）で示されるＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列の１１番目のＬｅｕ、１４番目のＬｅｕ、１９番目のＳｅｒ、２７番目のＰｈｅ、６８番目のＳｅｒ、７１番目のＡｒｇ、７７番目のＧｌｎ、７９番目のＰｈｅ、８３番目のＡｓｎ、８５番目のＬｅｕ、及び１０７番目のＨｉｓから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列中の３番目のＶａｌ、８番目のＡｓｎ、１４番目のＬｅｕ、１９番目のＬｙｓ、７５番目のＰｈｅ、８０番目のＡｓｎ、８３番目のＩｌｅ、及び８８番目のＩｌｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（ｃ）配列番号７０で表わされるアミノ酸配列の１０番目のＧｌｙ、１３番目のＬｙｓ、１９番目のＳｅｒ、２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、２９番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＩｌｅ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、６８番目のＴｈｒ、７１番目のＶａｌ、７７番目のＧｌｎ、７８番目のＰｈｅ、７９番目のＳｅｒ、８２番目のＬｅｕ、８３番目のＳｅｒ、８５番目のＶａｌ、８６番目のＴｈｒ、８７番目のＡｌａ、８８番目のＡｌａ、９２番目のＶａｌ、９４番目のＴｙｒ、及び１０９番目のＴｈｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ

【0114】

前述のヒト化抗体としては、ＶＨのＣＤＲのアミノ酸を次のように置換したものも含む。
ＶＨのＣＤＲ１が配列番号２９で表されるアミノ酸配列または、配列番号２９で表されるアミノ酸配列中の４番目のＶａｌをＡｌａに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２が配列番号３０で表されるアミノ酸配列または、配列番号３０で表されるアミノ酸配列中の１６番目のＳｅｒをＡｓｐに置換する改変が導入されたアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３が配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ。

【0115】

前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＡｌａに、１４番目のＬｅｕをＰｒｏに、１９番目のＳｅｒをＡｓｐに、２７番目のＰｈｅをＡｌａに、３４番目のＶａｌをＡｌａに、６５番目のＳｅｒをＡｓｐに、６８番目のＳｅｒをＡｌａに、７１番目のＡｒｇをＬｙｓに、７７番目のＧｌｎをＧｌｕに、７９番目のＰｈｅをＡｌａに、８３番目のＡｓｎをＡｓｐに、８５番目のＬｅｕをＡｓｐに、又は１０７番目のＨｉｓをＧｌｎに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。更には、配列番号７０で表わされるアミノ酸配列の１０番目のＧｌｙをＡｓｐに、１３番目のＬｙｓをＧｌｎに、１９番目のＳｅｒをＡｓｐに、２０番目のＬｅｕをＩｌｅに、２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、２９番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＩｌｅをＶａｌに、４８番目のＩｌｅをＭｅｔに、６５番目のＳｅｒをＡｓｐに、６７番目のＶａｌをＬｅｕに、６８番目のＴｈｒをＡｌａに、７１番目のＶａｌをＡｒｇに、７６番目のＡｓｎをＳｅｒに、７７番目のＧｌｎをＧｌｕに、７８番目のＰｈｅをＶａｌに、７９番目のＳｅｒをＰｈｅに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８３番目のＳｅｒをＡｓｐに、８５番目のＶａｌをＬｅｕに、８６番目のＴｈｒをＧｌｎに、８７番目のＡｌａをＴｈｒに、８８番目のＡｌａをＡｓｐに、９２番目のＶａｌをＬｙｓに、９４番目のＴｙｒをＰｈｅに、１０９番目のＴｈｒをＩｌｅ、又は１１０番目のＬｅｕをＭｅｔに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0116】

前記ＶＬのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２６で表されるアミノ酸配列中の３番目のＶａｌをＡｌａに、８番目のＡｓｎをＡｓｐに、１４番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＬｙｓをＴｈｒに、７５番目のＰｈｅをＳｅｒに、８０番目のＡｓｎをＡｓｐに、８３番目のＩｌｅをＶａｌに、又は８８番目のＩｌｅをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0117】

本発明のヒト化抗体の具体例としては、図１６、図１７、または図１９で示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ、および図１８Ａまたは図１８Ｂで示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬの、少なくとも一方を含むヒト化抗体が挙げられる。
また、本発明のヒト化抗体の具体例として、配列番号７１～８７から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬならびに／または配列番号７０および８８～９８から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨを含むヒト化抗体が挙げられる。
さらに、本発明のヒト化抗体の具体例として、以下の（ａ）～（ｗ）のヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｂ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｃ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｄ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨをおよび配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｅ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｆ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｇ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｈ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｉ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｊ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｋ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｌ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｍ）配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｎ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｏ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｐ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｑ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｒ）配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｓ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｔ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｕ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｖ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。
（ｗ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒト化抗体。

【0118】

ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。

【0119】

ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。

【0120】

ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。

【0121】

ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。

【0122】

上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又はその抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。

【0123】

欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１～数十個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個である。

【0124】

上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入又は付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。

【0125】

天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、又はＬ－システインなどが挙げられる。

【0126】

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４－ジアミノブタン酸、２、３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン

【0127】

本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。

【0128】

Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0129】

本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。

【0130】

Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧのヒンジ領域のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。

【0131】

本発明のＦ（ａｂ’）_２は、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させ、作製することもできる。

【0132】

Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。

【0133】

ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0134】

本発明のｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0135】

ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。

【0136】

本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0137】

ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。

【0138】

本発明のｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0139】

ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。

【0140】

本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。

【0141】

本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的又は遺伝子工学的に結合させた抗体またはその抗体断片の誘導体を包含する。抗体またはその抗体断片の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、又は定量用試薬として使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に結合する薬剤として、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体が挙げられる。

【0142】

本発明における、抗体またはその抗体断片の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又はその抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらにはモノクローナル抗体又はその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。

【0143】

また、本発明における、抗体またはその抗体断片の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。

【0144】

放射性同位元素としては、例えば、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^６４Ｃｕ、^９９Ｔｃ、^７７Ｌｕ、又は^２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。

【0145】

低分子の薬剤としては、例えば、アクリジニウムエステルもしくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。

【0146】

低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。

【0147】

高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的又は生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのｅ－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。

【0148】

蛋白質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼなどの酵素が挙げられる。

【0149】

本発明は、ＢＭＰ１０アンタゴニストを含む、高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤に関する。また、ＢＭＰ９アンタゴニストを同時または逐次に投与することを特徴とする、ＢＭＰ１０アンタゴニストを含む高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤も本発明に含まれる。さらに、ＢＭＰ１０アンタゴニストを同時または逐次に投与することを特徴とする、ＢＭＰ９アンタゴニストを含む高血圧および高血圧性疾患に対する治療剤も本発明に含まれる。
本発明のＢＭＰ１０アンタゴニストには、前述のように、本発明の抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体およびその抗体断片を含む。

【0150】

高血圧としては、血圧が正常範囲を超過した場合であればすべて含まれるが、特に食塩感受性高血圧などがある。なお正常範囲とは収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ未満、拡張期血圧９０ｍｍＨｇ未満を指す。

【0151】

高血圧性疾患としては、高血圧そのものと高血圧が継続することによる合併症がある。高血圧としては、原因の特定できない本態性高血圧および特定の原因による二次性高血圧に分けられる。本態性高血圧の原因として考えられているものとして、特に食塩感受性高血圧がある。

【0152】

二次性高血圧としては、例えば、腎血管性高血圧、腎実質性高血圧、原発性アルドステロン症、睡眠時無呼吸性症候群、褐色細胞腫、クッシング症候群、薬物誘発性高血圧、妊娠高血圧、大動脈縮窄症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、脳幹部血管圧迫などが挙げられる。また、高血圧性疾患としては、例えば、ナトリウム排泄障害、高血圧を伴う腎臓尿細管間質障害、腎臓糸球体障害、心臓拡張機能障害なども挙げられる。

【0153】

高血圧が継続することによる合併症としては、例えば、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、うっ血性心不全（例えば、収縮不全型心不全、拡張不全型心不全など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症など）、右心不全、慢性腎臓病（例えば、糖尿病性腎症、腎硬化症、多発性嚢胞腎、慢性糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎など）、急性腎障害（例えば、急速進行性糸球体腎炎、急性尿細管壊死など）、大動脈解離、大動脈瘤、網膜出血などがある。

【0154】

本発明の治療剤としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。

【0155】

本発明の医薬組成物としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。

【0156】

本発明の医薬組成物としては、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアとしては、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液及び緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。

【0157】

投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。投与形態としては、種々の形態で投与することができ、それらの形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。

【0158】

乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、例えば、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。

【0159】

カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。 注射剤は、水、ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。

【0160】

非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤および噴霧剤などが挙げられる。注射剤の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。これらの剤形は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。

【0161】

注射手法としては、例えば、点滴静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射および皮内注射等が挙げられる。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。

【0162】

座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は本発明の抗体又は抗体の機能的断片そのものを用いて調製することもでき、あるいは受容者（患者）の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ前記抗体又は抗体の機能的断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせるための担体などを用いて調製される。

【0163】

担体として、具体的には例えば、乳糖およびグリセリンなどが挙げられる。前記抗体又は抗体の機能的断片の性質や用いる担体の性質に応じて、エアロゾルまたはドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

【0164】

その投与量は、症状、年齢または体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ～１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ～１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。

【0165】

本発明の抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。

【0166】

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与もしくは皮下投与を挙げられる。

【0167】

投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。

【0168】

さらに、本発明は、ＢＭＰ１０のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有する、ＢＭＰ１０の免疫学的検出又は測定方法に関する。

【0169】

本発明においてＢＭＰ１０の量を検出又は測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出又は測定方法などが挙げられる。

【0170】

免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫学的検出又は測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などが挙げられる。

【0171】

以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。

【0172】

１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＢＭＰ１０又はＢＭＰ１０を発現した組織は、ＢＭＰ１０全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＢＭＰ１０を多量に発現しているヒト組織からＢＭＰ１０を精製し、得ることが出来る。また、該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＢＭＰ１０の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。

【0173】

本発明で用いられるＢＭＰ１０は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、該ＢＭＰ１０をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。

【0174】

まず、ＢＭＰ１０をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換株を得ることができる。

【0175】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。

【0176】

宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。

【0177】

大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＢＭＰ１０をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。

【0178】

該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。

【0179】

また、該ＢＭＰ１０をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＢＭＰ１０の生産率を向上させることができる。

【0180】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。

【0181】

プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。

【0182】

宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ－１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。

【0183】

宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］が挙げられる。

【0184】

動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号）、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。

【0185】

プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターもしくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。

【0186】

宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３－９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）、などが挙げられる。

【0187】

宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。

【0188】

以上のようにして得られるＢＭＰ１０をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換株を培地に培養し、培養物中に該ＢＭＰ１０を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＢＭＰ１０を製造することができる。該形質転換株を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

【0189】

真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたＢＭＰ１０を得ることができる。

【0190】

誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。

【0191】

動物細胞を宿主として得られた形質転換株を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ_２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

【0192】

ＢＭＰ１０をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。

【0193】

ＢＭＰ１０の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるＢＭＰ１０の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。

【0194】

ＢＭＰ１０が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＢＭＰ１０を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。

【0195】

また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＢＭＰ１０の生産量を上昇させることもできる。

【0196】

得られたＢＭＰ１０は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
ＢＭＰ１０が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。

【0197】

前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

【0198】

ＢＭＰ１０が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＢＭＰ１０の不溶体を回収する。回収した該ＢＭＰ１０の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＢＭＰ１０を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。

【0199】

ＢＭＰ１０又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＢＭＰ１０又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

【0200】

また、本発明において用いられるＢＭＰ１０は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。

【0201】

（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３～２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＢＭＰ９ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。

【0202】

免疫は、動物の皮下、皮内、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。

【0203】

抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに２～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。

【0204】

抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。

【0205】

（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ－１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などが用いられる。

【0206】

該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０^７個以上の細胞数を確保する。

【0207】

（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。

【0208】

沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃にて、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。

【0209】

培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＢＭＰ１０を含む抗原に反応し、ＢＭＰ１０を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。

【0210】

（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。

【0211】

また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラム又はプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。

【0212】

抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。

【0213】

（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。

【0214】

（６－ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＢＭＰ１０をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いても良い。

【0215】

抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又は０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以降、ＰＢＳＴともいう）などで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳＴでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。

【0216】

また、本発明のモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＢＭＰ１０のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。

【0217】

さらに、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。

【0218】

（６－ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。

【0219】

得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。又は、ヒトＢＭＰ１０をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。

【0220】

２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。

【0221】

（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。

【0222】

ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。

【0223】

動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。またＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ抗体を発現させる場合には、例えばＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号）などを用いることができる。

【0224】

動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。

【0225】

遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いることができる。また抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］、またはＮ５ＫＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号）などを用いる。

【0226】

（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。

【0227】

非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。

【0228】

前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。

【0229】

非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。

【0230】

ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ ｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。

【0231】

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。

【0232】

ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］、又はＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、又はＺＡＰ－ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。

【0233】

ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などを用いる。

【0234】

ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ－１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などを用いる。

【0235】

ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。

【0236】

また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。

【0237】

選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。

【0238】

決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。

【0239】

分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。

【0240】

また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ又はＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。

【0241】

（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。

【0242】

非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。

【0243】

作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。

【0244】

また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。

【0245】

（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。

【0246】

非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。

【0247】

例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。

【0248】

次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。

【0249】

設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。

【0250】

また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。

【0251】

又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。

【0252】

ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。

【0253】

（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。

【0254】

ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。

【0255】

抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。

【0256】

ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）表面再構成法によるヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
表面再構成法によるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列のうち、抗原結合活性に影響が低いと考えられるアミノ酸残基をそれぞれ選択し、該アミノ酸残基をより抗原性が低いと考えられるアミノ酸残基に置換する。
こうして設計したＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列を、抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、表面再構成法によるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターに容易に表面再構成法によるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。

【0257】

（７）ヒト化抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。

【0258】

例えば、（４）、（５）または（６）で得られるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。

【0259】

（８）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）及び（７）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。

【0260】

発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。

【0261】

ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。

【0262】

発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。

【0263】

（９）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）及び（７）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。

【0264】

宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。

【0265】

遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。

【0266】

例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。

【0267】

発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。

【0268】

動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。

【0269】

得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。

【0270】

遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。

【0271】

精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。

【0272】

３．精製モノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。

【0273】

ＢＭＰ１０及びＢＭＰ１０発現組織に対する結合活性は、前述の１－（６－ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６－ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。

【0274】

バイスペシフィック抗体の製造は、例えば国際公開第２００９／１３１２３９号に記載の方法など、公知の方法で行うことができる。

【0275】

４．本発明の抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体又は該抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、高血圧および高血圧性疾患の治療に用いることができる。

【0276】

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。

【0277】

投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。

【0278】

経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などが挙げられる。

【0279】

乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールもしくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコールもしくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油もしくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバーもしくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。

【0280】

カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖もしくはマンニトールなどの賦形剤、デンプンもしくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースもしくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。

【0281】

非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤又は噴霧剤などが挙げられる。

【0282】

注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。

【0283】

坐剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。

【0284】

噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。

【0285】

さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

【0286】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。使用する試薬類は、特に記載がない限り、添付文書に従い使用するものとする。

【実施例】

【0287】

［実施例１］抗ヒトＢＭＰ１０モノクローナル抗体の作製
１－１）免疫原の調製
免疫原としてヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質、またはヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）を用いた。ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質は、国際公開第２０１４／００７１９８号の実施例２０に記載された方法に従い調製した。この方法により調製されたヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質はｍａｔｕｒｅ体、Ｎ末プロペプチド体および全長体を含む。

【0288】

１－２）動物への免疫と抗体産生細胞の調製
アジュバントに、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（シグマアルドリッチ社製）、又はＡｌｕｍ＋百日咳ワクチンアジュバント（ナカライテスク社製）を用いて、実施例１の１－１）で調製したヒトＢＭＰ１０を抗原とする抗原懸濁液を添付文書に従い調製した後、ＷＫＹ／ＮｃｒｌＣｒｌｊラットまたはＳＤラットに腹腔及び皮下または筋肉内経路で免疫した。免疫した抗原量は、ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質は２０μｇ／ｈｅａｄ、ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体は１０μｇ／ｈｅａｄで行った。免疫は、最終ブーストを含めて計２回又は４回行った。脾臓は、最終投与の３～４日後に摘出した。

【0289】

摘出した脾臓をＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ（ナカライテスク社製）（以下ＭＥＭ培地という）中で細断した後、脾細胞を遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）により回収した。得られた脾細胞画分は、赤血球を含むことから、ＲＥＤ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（シグマアルドリッチ社製）を添加し、氷上で処理することにより、赤血球を除去した。または腸骨リンパ節を採取し、ＭＥＭ培地中で細胞をほぐしてリンパ球を得た。得られた脾細胞またはリンパ球は、ＭＥＭ培地で２回洗浄した後、細胞融合に供した。

【0290】

１－３）マウス骨髄腫細胞の調製
８－アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株ｐ３－Ｕ１［Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５９７、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］をエス・クロン（Ｓ－Ｃｌｏｎｅ） クローニングメデューム ＣＭ－Ｂ（三光純薬社製）にゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を添加した培地（以下、無血清培地と表記する）で馴化培養し、細胞融合時に必要な細胞数（４×１０^７個以上）を確保し、細胞融合に供した。

【0291】

１－４）ハイブリドーマの作製
実施例１の１－２）で得られたマウス脾細胞またはリンパ球と実施例１の１－３）で得られた骨髄腫細胞を８：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分（細胞群）に対して、ポリエチレングリコール－１０００（純正化学社製、Ｃａｔ＃６９２５７－１２１０）、ＭＥＭ培地、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ＃Ｄ２６５０）の混液５００μＬを、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。次に、該細胞液にＭＥＭ培地５ｍＬを穏やかに揺らしながら加え、更にＭＥＭ培地を４５ｍＬ添加した。次に、上記の該細胞液を含むチューブを遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した。

【0292】

得られた沈殿画分（細胞群）を、ＨＡＴを含む無血清培地を用いて９６ウェルプレートにＡ列を除いて２００μＬずつ播種した。このとき、脾細胞またはリンパ球数がプレート１枚当たり１．５×１０^７個／１８ｍＬになるように調整し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。培地交換は、ウェル内の細胞がスクリーニングに適した細胞数になるまで、ＨＡＴを含む無血清培地を用いて適宜行った。

【0293】

１－５）固相抗原ＥＬＩＳＡによる抗ＢＭＰ１０抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
抗ＢＭＰ１０抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、ＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトＢＭＰ１０を固相化させた固相抗原ＥＬＩＳＡ系を用いた。具体的には、実施例１の１－１）で調製したヒトＢＭＰ１０組み換え体、又はヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）を、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）にて０．５μｇ／ｍＬに調製したものを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ－ＩＭＭＮＯ ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃にて一晩静置して吸着させた。

【0294】

固相化液を取り除いた後、ＰＢＳで３～５回洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃０９９９６８－３５）を２００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置してブロッキングした。

【0295】

次に、ハイブリドーマ上清を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。このプレートをＰＢＳＴで３～５回洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１０００倍希釈したＧｏａｔ Ｆ（ａｂ’）_２ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ－Ｆｃ（ＨＲＰ），ｐｒｅ－ａｄｓｏｒｂｅｄ（アブカム社製、Ｃａｔ＃ａｂ６２５７）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。

【0296】

このプレートをＰＢＳＴで３～５回洗浄し、ＡＢＴＳ（２，２’－Ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ、Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃０１６－０８５２１）基質液またはＴＭＢ基質液を５０μＬ／ウェルで添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、５％ＳＤＳ溶液または１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を５０μＬ／ウェルで添加し、サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度（４１５ｎｍ－４９０ｎｍ）またはサンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ－５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。

【0297】

１－６）ＢＭＰシグナルを検出可能にした細胞の作製
抗ＢＭＰ１０抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングとして、各種ＢＭＰ蛋白質のシグナルを検出可能にした細胞（以下、ＢＭＰシグナル検出細胞）を用いた。ＢＭＰシグナル検出細胞は、特開２０１７－２５０１１号公報の実施例５に記載されたＩｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いた。

【0298】

１－７）Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯを用いた抗ＢＭＰ１０中和抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体を終濃度で３ｎｇ／ｍＬになるように添加した。次いで、ハイブリドーマ培養上清を終濃度で５０％になるように添加した。その後、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地［Ｅｘｃｅｌｌ ３２５ ＰＦ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社製、Ｃａｔ＃１４３４０Ｃ－１０００ｍＬ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１×Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９３６７－３４）、０．５μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ］にて懸濁したＩｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞液を５×１０^４個／ウェルになるように添加した。

【0299】

なお、すべてのサンプルはＥｘｃｅｌｌ ３２５培地で希釈し、すべてのサンプルを添加すると１００μＬ／ウェルとなるようにした。その後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を４０μＬ／ウェル加え撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。

【0300】

ハイブリドーマ培養上清中の抗体の中和活性（％）は、ハイブリドーマ培養上清を添加せず、ＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。

【0301】

１－８）抗ＢＭＰ１０中和抗体産生ハイブリドーマの単離
上記のスクリーニングにて５０％以上の中和活性を示したものを陽性と判断した。陽性と判断されたハイブリドーマは、無血清培地にて限界希釈し、９６ウェルプレートに播種し単クローン化を行った。単クローン化は、１回目に陽性と判断したウェル由来のハイブリドーマに対して計１～２回行った。以上の操作により、１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体を産生するハイブリドーマを単離した。

【0302】

１－９）ハイブリドーマからの抗体の大量取得
実施例１の１－８）で単離したハイブリドーマを、大フラスコボトル２本に播種した。培地には無血清培地を用いた。３７℃にて６－８日間培養した後、細胞を含む培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を０．２２μｍフィルターによりろ過した。

【0303】

フィルターでろ過した培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）またはＡｂ－Ｃａｐｃｈｕｒｅ Ｅｘｔｒａ（プロテノバ社製）を充填したオープンカラムを用いて、抗ヒトＢＭＰ１０抗体を精製した。

【0304】

［実施例２］Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いた取得した抗体と既知抗体のＢＭＰ１０中和活性比較
取得した抗ＢＭＰ１０抗体と既知抗体に関して、ＢＭＰ１０の中和活性の比較を実施例１の１－６）で作製したＩｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて行った。９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒトＢＭＰ１０ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）を終濃度で３ｎｇ／ｍＬになるように添加し、次いで既知抗体ＭＡＢ２９２６（既知抗体とはＭＡＢ２９２６のことをいう）および実施例１の１－９）で精製した抗ＢＭＰ１０抗体１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体、またはコントロール抗体（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｔ ＩｇＧ１ λ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ社製、Ｃａｔ＃５５３９９３）を終濃度で３０００ｎｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に６濃度に調製し、添加した。

【0305】

その後、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地［Ｅｘｃｅｌｌ ３２５ ＰＦ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社製、Ｃａｔ＃１４３４０Ｃ－１０００ｍＬ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１×Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９３６７－３４）、０．５ｍｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ］にて懸濁したＩｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞液を５×１０^４個／ウェルになるように添加した。すべてのサンプル添加後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。

【0306】

２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を４０μＬ／ウェル加え撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。抗体の中和活性（％）は、抗体を添加せず、ＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。結果を図１に示す。

【0307】

図１に示すように、コントロール抗体以外、いずれの抗体もＢＭＰ１０に対する中和活性を示した。既知抗体ＭＡＢ２９２６は３μｇ／ｍｌでｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０ ３ｎｇ／ｍｌを完全には中和できないことが分かった。それに対して、取得抗体１１Ｈ１０抗体、１２Ｈ３抗体、１８Ｃ１抗体は、３μｇ／ｍｌでｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０ ３ｎｇ／ｍｌを完全に中和することができた。また１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体はＭＡＢ２９２６より低濃度でＢＭＰ１０中和活性を示した。

【0308】

以上の結果より、３つの取得抗体は全て、既知抗体よりもＢＭＰ１０中和活性が著しく向上した抗体であることが明らかになった。

【0309】

［実施例３］
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞を用いた取得抗体と既知抗体のＢＭＰ１０の中和活性比較
取得した抗ＢＭＰ１０抗体と既知抗体のＢＭＰ１０に対する中和活性について、ヒトＡＬＫ１を高発現させたヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞を用いて比較した。既知抗体には、ＭＡＢ２９２６（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いた。

【0310】

３－１）ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞の作製
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞は、特開２０１７－２５０１１号公報の実施例６に記載されたＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いた。

【0311】

３－２）新規取得抗体と既知抗体のＢＭＰ１０中和活性比較
９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）を終濃度で０．３ｎｇ／ｍＬになるように添加した。次いで、抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体、ＭＡＢ２９２６、またはコントロール抗体（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｔ ＩｇＧ１ λ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ社製、Ｃａｔ＃５５３９９３）を終濃度で３０００ｎｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に６濃度に調製し、添加した。

【0312】

その後、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地にて調製したＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞懸濁液を５×１０^４個／ウェルになるように添加した。すべてのサンプルはＥｘｃｅｌｌ ３２５培地で希釈し、ヒトＢＭＰ１０、抗体希釈液、細胞懸濁液を合わせて１００μＬ／ウェルとなるようにした。その後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。

【0313】

２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液を４０μＬ／ウェル加え、撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。抗体の中和活性（％）は、抗体を添加せず、ＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。結果を図２に示す。

【0314】

図２に示すように、コントロール抗体及び既知抗体ＭＡＢ２９２６はＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞において、中和活性を示さなかった。一方、取得抗体１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体はＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞においても明確なＢＭＰ１０中和活性を示した。また、中和活性の強さは１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体の順であった。

【0315】

以上の結果より、取得抗体はＡＬＫ１高発現細胞において中和活性を示す新規の抗体であることが明らかとなった。

【0316】

［実施例４］取得抗体の各種ＢＭＰファミリー分子に対する阻害作用
１８Ｃ１抗体がＢＭＰ１０を特異的に中和することを確認するため、実施例１の１－６）で作製したＩｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞を用いて、１８Ｃ１抗体の各種ＢＭＰシグナルに対する阻害作用を検討した。

【0317】

９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒト各種ＢＭＰ ｍａｔｕｒｅ２量体を終濃度で３ｎｇ／ｍＬになるように添加し、次いで１８Ｃ１抗体の希釈液を終濃度で１．０μｇ／ｍＬになるように添加した。ヒト各種ＢＭＰ ｍａｔｕｒｅ２量体には、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ４、ヒトＢＭＰ６、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ１５、ヒトＧＤＦ５、ヒトＧＤＦ７（いずれもＲ＆Ｄシステムズ社製）を用いた。その後、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地［Ｅｘｃｅｌｌ ３２５ ＰＦ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社製、Ｃａｔ＃１４３４０Ｃ－１０００ｍＬ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１×Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９３６７－３４）、０．５μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ］にて懸濁したＩｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞液を５×１０^４個／ウェルになるように添加した。

【0318】

すべてのサンプルはＥｘｃｅｌｌ ３２５培地で希釈し、最終的に１００μＬ／ウェルとなるようにした。その後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。

【0319】

２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を４０μＬ／ウェル加え撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。

【0320】

抗体の中和活性（％）は、抗体を添加せず、ＢＭＰ ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。結果を図３に示す。

【0321】

図３に示すように、１８Ｃ１抗体は、ヒトＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ４、ヒトＢＭＰ６、ヒトＢＭＰ７、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１５、ヒトＧＤＦ５、ヒトＧＤＦ７によるシグナルはいずれも一切阻害せず、ヒトＢＭＰ１０によるシグナルのみ特異的に阻害する抗体であることが明らかになった。

【0322】

［実施例５］抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子配列の単離
５－１）抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総ＲＮＡの調製
実施例１に記載の１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体及び１１Ｈ１０抗体を産生するハイブリドーマ １×１０^６個より、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（プロメガ社製＃ＡＳ１２８０）を用いて、それぞれのハイブリドーマの総ＲＮＡを調製した。

【0323】

５－２）抗ＢＭＰ１０モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬの遺伝子クローニング
実施例５－１で取得した各ハイブリドーマの総ＲＮＡ １μｇから、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃６３４９２４）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡ ｍｉｘ（フォワードプライマーを含有する）と、ラットのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ重鎖定常領域をコードするリバースプライマーを組み合わせることで、ＶＨのｃＤＮＡ配列決定を行った。

【0324】

具体的には、ラットＩｇＧ１に特異的なプライマー（配列番号１）、ラットＩｇＧ２ａに特異的なプライマー（配列番号２）を用いて、それぞれユニバーサルプライマーＡと組み合わせることでＰＣＲ反応を行い、各抗体のＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。

【0325】

また、ラットＩｇ（κ）特異的なプライマー（配列番号３）又は、ラットＩｇ（λ）特異的なプライマー（配列番号４）を同様に用いてそれぞれユニバーサルプライマーＡと組み合わせることでＰＣＲを行い、各抗体のＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。

【0326】

ＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、７２℃にて３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃にて３０秒間、７０℃にて３０秒間、７２℃にて３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃にて３０秒間、６８℃にて３０秒間、７２℃にて３分間からなる反応サイクルを２５回行った。

【0327】

アガロースゲル電気泳動を行った結果、１８Ｃ１抗体ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、ＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする特異的プライマーを用いたときにＰＣＲ増幅産物が得られた。１２Ｈ３抗体産生及び１１Ｈ１０抗体ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、ＩｇＧ２ａ重鎖定常領域をコードする特異的プライマーを用いたときにＰＣＲ増幅産物が得られた。

【0328】

また、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体産生ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、ラットＩｇ（κ）特異的プライマーを用いたときにもＰＣＲ増幅産物が得られた。１８Ｃ１抗体産生ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、ラットＩｇ（λ）特異的プライマーを用いたときにもＰＣＲ増幅産物が得られた。それぞれのＰＣＲ増幅産物をＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＥＸ ＩＩ、ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃２００２１）を用いて精製した。

【0329】

得られた遺伝子断片を、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製、Ｃａｔ＃Ｋ２８７５４０ＳＰ）を用い、ｐＣＲ４ベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。

【0330】

得られたプラスミドを、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られた形質転換株より自動プラスミド抽出機（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長のＶＨ ｃＤＮＡ、及びＶＬ ｃＤＮＡが取得されたことを確認した。

【0331】

５－３）抗ヒトＢＭＰ１０モノクローナル抗体Ｖ領域の遺伝子配列の解析
実施例５－２で得られた１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体のＶＨの全塩基配列を配列番号５、６、７に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＨの全アミノ酸配列を配列番号８、９、１０に、ＶＬの全塩基配列を配列番号１１、１２、１３に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＬの全アミノ酸配列を配列番号１４、１５、１６にそれぞれ示す。

【0332】

また、配列番号５、６、７からシグナル配列を除いた塩基配列を配列番号１７、１８、１９に、配列番号１１、１２、１３からシグナル配列を除いた塩基配列を配列番号２０、２１、２２に、配列番号８、９、１０からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号２３、２４、２５に、配列番号１４、１５、１６からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号２６、２７、２８にそれぞれ示す。

【0333】

既知のラット抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体をコードする完全長ｃＤＮＡであることが確認できた。

【0334】

１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。１８Ｃ１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２９、３０及び３１に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３２、３３及び３４にそれぞれ示す。１２Ｈ３抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３５、３６及び３７に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３８、３９及び４０にそれぞれ示す。１１Ｈ１０抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４１、４２及び４３に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４４、４５及び４６にそれぞれ示す。

【0335】

５－４）抗ＢＭＰ１０キメラ抗体の作製
１８Ｃ１キメラ抗体の組換え発現には、ヒトλ型軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ４改変型重鎖定常領域を有するＮ５ＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターを、１２Ｈ３および１１Ｈ１０キメラ抗体の組換え発現には、ヒトκ型軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ４改変型重鎖定常領域を有するＮ５ＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターを使用した。国際特許広報第ＷＯ２００６０３３３８６で使用されているＮ５ＫＧ４ＰＥベクター骨格において、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の、ＥＵ－ｉｎｄｅｘにおける４０９番目のＡｒｇをＬｙｓに置換する改変を導入したものを作製し、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターと命名した。またこのベクターにおいて、ヒトκ鎖定常領域部分をヒトλ定常領域に置換したものを、Ｎ５ＬＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターと命名した。ＶＨ、ＶＬをコードするｃＤＮＡを、上記の抗体発現ベクターに挿入した。ＶＨはＳａｌＩ、ＮｈｅＩサイト間に、ＶＬはＢｇＩＩＩ、ＢｌｐＩ（λ型）またはＢｇＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ（κ型）サイト間にそれぞれ挿入した。

【0336】

１８Ｃ１抗体が挿入されたＶＨの塩基配列及びＶＬの塩基配列を配列番号５、１１に、これによって発現するＶＨのアミノ酸配列及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号８、１４にそれぞれ示す。１２Ｈ３抗体の挿入したＶＨの塩基配列及びＶＬの塩基配列を配列番号６、１２に、これによって発現するＶＨのアミノ酸配列及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号９、１５にそれぞれ示す。１１Ｈ１０抗体の挿入したＶＨの塩基配列及びＶＬの塩基配列を配列番号７、１３に、これによって発現するＶＨのアミノ酸配列及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１０、１６にそれぞれ示す。

【0337】

１８Ｃ１抗体のＶＬ、ＶＨの塩基配列の増幅には、それぞれ配列番号５３～５６で示される塩基配列からなるプライマーを、１２Ｈ３抗体のＶＬ、ＶＨの塩基配列の増幅には、それぞれ５７～６０で示される塩基配列からなるプライマーを、１１Ｈ１０抗体のＶＬ、ＶＨの塩基配列の増幅には、それぞれ６１～６４で示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行った。

【0338】

作製した発現ベクター及びＥｘｐｉ２９３Ｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて組換キメラ抗体を発現させた。培養上清から、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて抗体を精製した。ＮＡＰ－２５カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いてバッファーをＤ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製、Ｃａｔ＃１４２４９－２４）に置換した後、２８０ｎｍの吸光度を測定して抗体の濃度を決定した。分子吸光係数として、１．５０ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。

【0339】

５－５）ビアコアによる抗ＢＭＰ１０キメラ抗体のヒトＢＭＰ１０タンパク質への結合活性評価
実施例５－４で得られた抗ＢＭＰ１０キメラ抗体と、既知抗体であるＭＡＢ２９２６（Ｒ＆Ｄシステムズ社）のヒトＢＭＰ１０に対する結合活性を比較することを目的とし、ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）によるＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。

【0340】

キメラ抗体の結合活性は以下のように測定した。Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００８－３９）を用いて、添付のプロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＢＲ１００５３０）に固定化した。Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、５μｇ／ｍＬに調製した１８Ｃ１キメラ抗体（以降、ｃｈ１８Ｃ１抗体という）又は１２Ｈ３キメラ抗体（以降、ｃｈ１２Ｈ３抗体という）、１１Ｈ１０キメラ抗体（以降、ｃｈ１１Ｈ１０抗体という）を１０μＬ／分の流速で１０秒間添加した。

【0341】

また次いで、３００ｎｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に５濃度に調製したヒトｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０を３０μＬ／分の流速で、結合反応を１分間、解離反応を３０分間モニターした。取得したセンサーグラムは、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。

【0342】

ＭＡＢ２９２６の結合活性は以下のように測定した。Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００８－３８）を用いて、添付のプロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＢＲ１００５３０）に固定化した。Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、５μｇ／ｍＬに調製したＭＡＢ２９２６を１０μＬ／分の流速で１０秒間添加した。

【0343】

また次いで、３００ｎｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に５濃度に調製したヒトｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０蛋白質を３０μＬ／分の流速で、結合反応を１分間、解離反応を３０分間モニターした。取得したセンサーグラムは、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析し、ＭＡＢ２９２６の速度論定数を算出した。算出された各抗体の結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および解離定数［ｋｄ／ｋａ＝Ｋ_Ｄ］を表１に示す。

【0344】

【表1】

【0345】

表１に示すように、取得したｃｈ１８Ｃ１抗体、ｃｈ１２Ｈ３抗体、ｃｈ１１Ｈ１０抗体は既知抗体ＭＡＢ２９２６より結合が強いことが明らかとなった。

【0346】

［実施例６］
取得した抗体が競合する受容体の解析
６－１）ＡＬＫ１－Ｆｃの調製
ＡＬＫ１－Ｆｃは、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１に記載された方法に従い調製した。

【0347】

６－２）ビアコアによる競合する受容体の解析
ＢＭＰ１０はタイプＩとタイプＩＩの２つの受容体に結合することでシグナルを伝達する。取得した抗ＢＭＰ１０抗体がどの受容体に競合するか解析するために、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）によるＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。

【0348】

Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００８－３９）を用いて、添付のプロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＢＲ１００５３０）に固定化した。

【0349】

Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、１０μｇ／ｍＬに調製したＡＬＫ１－Ｆｃ、ＢＭＰＲ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃８１１－ＢＲ－１００）、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃６５７８－ＥＮ－０２５）のいずれかを１０μＬ／分の流速で１０秒間添加した。

【0350】

また次いで、１００ ｎｇ／ｍｌに調製したヒトｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０ （Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）と抗ＢＭＰ１０抗体 １μｇ／ｍｌを混合したものを１０μＬ／分の流速で３０秒間添加した。

【0351】

結果を表２に示す。表２において、抗体とｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０の混合物が、キャプチャーされているＡＬＫ１－Ｆｃ、ＢＭＰＲ２－Ｆｃ、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ－Ｆｃに結合する場合を＋、結合しない場合を－と記載する。

【0352】

【表2】

【0353】

表２に示すように、Ｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０と抗体の混合物が、キャプチャーされている受容体に結合しない場合は、抗体と受容体が競合するといえる。結果、ＭＡＢ２９２６はＢＭＰ１０とＡＬＫ１－Ｆｃの結合を阻害することが分かった。

【0354】

一方、ＭＡＢ２９２６はＢＭＰ１０とＢＭＰＲ２－Ｆｃ及びＥｎｄｏｇｌｉｎ－Ｆｃとの結合は阻害しなかった。１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体はいずれもＢＭＰ１０とＡＬＫ１－Ｆｃの結合を阻害しなかった。一方、１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体はいずれもＢＭＰ１０とＢＭＰＲ２－Ｆｃ及びＥｎｄｏｇｌｉｎ－Ｆｃとの結合を阻害した。

【0355】

以上の結果より、１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体は、既知抗体とは阻害する受容体が異なる新規の阻害様式の抗体であることが明らかとなった。

【0356】

［実施例７］
正常動物の血圧に対する取得抗体の作用の評価
ＳＤラットを用いて１８Ｃ１抗体の血圧に対する作用を評価した。６週齢の雄性ＳＤラット（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ－２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、７週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。

【0357】

具体的には、ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社製）５０ｍｇ／ｋｇをラットの腹腔内に投与し麻酔を施した。テレメトリー送信機（ＴＡ１１ＰＡ－Ｃ４０、Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の血圧センサーを腹部大動脈内に挿入し、本体を腹腔内に埋め込んだ。一般状態観察および血行動態モニターによって、手術の影響から順調に回復したことを確認した。テレメトリー送信を埋め込んだ動物を、収縮期血圧の平均値を指標に、群分けした。１２週齢時に抗体の投与を行った。

【0358】

具体的には、１８Ｃ１抗体をＰＢＳにて１ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを、１ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。また１２Ｈ３抗体、または１１Ｈ１０抗体について、ＰＢＳにて５ｍｇ／ｍｌになるように調製したものを、１ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。投与は皮下経路で行った。送信機から発信される血圧波形の信号をケージ下に設置した受信ボード（ＲＰＣ－１，Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で受信した。信号はＤａｔａ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｍａｔｒｉｘ （Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を介して、データ取得／分析システム（ＤＡＴＡＱＵＥＳＴ ＡＲＴ Ｇｏｌｄ ｖｅｒ２．３０，Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に取り込み、５分毎に１０秒間の収縮期血圧の測定データを取得した。結果を図４Ａ～図４Ｃに示す。

【0359】

図４Ａおよび図４Ｂに示すように、１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体の投与によって、収縮期血圧の降下が認められた。また１８Ｃ１抗体の方が、１２Ｈ３抗体より降圧作用が強かった。一方で、図４Ｃに示すように１１Ｈ１０抗体の投与では、収縮期血圧への影響は認められなかった。以上から、抗ＢＭＰ１０抗体は降圧作用を持つことが新規に見出された。

【0360】

さらに、降圧作用は抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＢＭＰ１０中和活性と相関し、相対的に弱い中和活性を有する１１Ｈ１０抗体では降圧作用は認められないことが分かった。このことより、強力なＢＭＰ１０中和活性を持つ抗体のみ降圧作用を持つことが、新規に見出された。

【0361】

［実施例８］
自然発症高血圧ラットの血圧に対する１８Ｃ１抗体の作用の評価
高血圧動物に対する取得抗体の降圧作用を調べるために、雄性自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ／Ｉｚｍ、日本エスエルシー社）を用いて１８Ｃ１抗体の血圧に対する作用を評価した。

【0362】

１４週齢の雄性ＳＨＲ／Ｉｚｍラット（日本エスエルシー）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ－２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、１６週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。テレメトリー送信機の埋め込み手術方法および血圧波形の取得は、実施例７に従って行った。２１週齢で、１８Ｃ１抗体をＰＢＳにて５ｍｇ／ｍｌになるように調製したものを、１ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。投与は皮下経路で行った。結果を図５に示す。

【0363】

図５に示すように、１８Ｃ１抗体５ｍｇ／ｋｇの投与によって、約１ヶ月間、持続的に収縮期血圧が下がることが観察された。以上より、ＢＭＰ１０の中和は、高血圧病態において治療効果を持つことが示された。

【0364】

［実施例９］
Ｄａｈｌ食塩感受性ラットに対する１８Ｃ１抗体の作用の評価
Ｄａｈｌ食塩感受性ラット（以下Ｄａｈｌ－Ｓラット）に高食塩を与えて誘発される高血圧および心臓や腎臓の障害に対するＢＭＰ１０抗体の作用を評価した。５週齢の雄性Ｄａｈｌ食塩感受性ラット（ＤＩＳ／Ｅｉｓ：Ｓｌｃ）（日本エスエルシー社製）を購入し、実験に供した。

【0365】

６週齢までＦＲ－２飼料（フナバシファーム社製）を与え、以降は高食塩飼料（８％ＮａＣｌ含有ＦＲ－２飼料、オリエンタル酵母社製）を与えた。正常対照群としては、６週齢以降も正常食（ＦＲ－２飼料）を与えたＤａｈｌ―Ｓラットを用いた。飲水は、動物用飲水を自由に摂取させた。

【0366】

８週齢時点で血圧及び心拍数の測定を行った。血圧及び心拍数の測定は、マウス・ラット非観血式血圧計（ＢＰ－９８Ｅ、ソフトロン社製）を用いて、２回の測定馴化後に実施した。８週齢時点で体重、血圧及び心拍数を指標に、高食塩飼料群を各群１２匹で２群に分け、媒体（ＰＢＳ １ｍＬ／ｋｇ）または１８Ｃ１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量となるように週１回の頻度で皮下投与した。

【0367】

１６週齢時点で血圧測定、心エコー検査、尿パラメータ測定を実施した。さらにイソフルラン吸入麻酔下で腹部大動脈から採血し、放血致死後に剖検した。心臓、肺及び両側腎臓を摘出し、組織重量を計測した。

【0368】

心エコー検査は、イソフルラン吸入麻酔下でラットの前胸部を剃毛し、小動物用超音波高解像度イメージングシステム（Ｖｅｖｏ２１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社製）及び高周波・高フレームレートプローブ（ＭＳ－２００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社製）を使用し、中心周波数１５．０ ＭＨｚの超音波で行った。Ｍモード法により乳頭筋レベルで左室後壁厚（ＬＶＰＷ；ｓ、ＬＶＰＷ；ｄ）を計測した。僧帽弁輪にサンプルボリュームを置いた組織ドップラ法により、僧帽弁輪速度（ｅ’）を測定した。

【0369】

採尿は、自由摂餌及び自由飲水下で、代謝ケージ（Ｔ－４８０、トキワ科学器械社製）にて２４時間行った。尿サンプルは、尿量測定後１８７０×ｇ、４°Ｃ、１５分間遠心分離し、その上清を測定に用いた。尿中パラメータは、自動分析装置日立７１７０Ｓ（日立製作所社製）または又は全自動電解質分析装置［ＰＶＡ－ＥＸＩＩ、エイアンドティー社製］を用いて測定した。

【0370】

採取した心臓、大動脈及び腎臓は、病理組織学的解析に供した。具体的には採取した心臓、大動脈及び腎臓を１０ｖｏｌ％中性緩衝ホルマリン液で固定した。常法に従ってパラフィン包埋ブロックから切片を作製し、Ｍａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ）染色またはＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色を施した。

【0371】

腎臓糸球体障害病理スコアは、ＨＥ染色標本を光学顕微鏡下で観察し、個体毎に糸球体１００個以上を対象として、糸球体１個あたりにおける病変（ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ、ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ａｎｄ／ｏｒ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｏｌｌａｐｓｅ）領域割合を、下記の５段階（０：ｎｏｒｍａｌ、１：１－２５％、２：２６－５０％、３：５１－７５％、４：７６－１００％）にグレード化した。その後、個体毎の糸球体病変スコア（“各グレードの点数”דグレード毎の糸球体の割合”の総和）を算出した。統計解析は、スコア１以上の糸球体数で比較した。

【0372】

腎臓尿細管間質障害病理スコアは、ＨＥ染色標本を光学顕微鏡下で観察し、個体毎に、各切片の尿細管及び間質病変（ｂａｓｏｐｈｉｌｉｃ ｔｕｂｕｌｅ，ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｓｔ，ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｔｕｂｕｌａｒ ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ）が各切片面積に占める割合を５段階（０：ｎｏｒｍａｌ、１：１－２５％、２：２６－５０％、３：５１－７５％、４：７６－１００％）にグレード化した。

【0373】

結果を図６～１３に示す。

【0374】

図６に示すように、高食塩食によってＤａｈｌ－Ｓラットの血圧は著しく上昇した。１８Ｃ１抗体の投与によって、高食塩食で誘発されたＤａｈｌ－Ｓラットの高血圧は、正常食群と同程度にまで抑制された。

【0375】

また図７Ａ、図７Ｂに示すように、高食塩食によってＤａｈｌ－Ｓラットの血中ナトリウム量、尿中ナトリウム排泄量はいずれも増加した。１８Ｃ１抗体の投与によって、さらに尿中ナトリウム排泄量は増加した。さらに１８Ｃ１抗体の投与により、血中ナトリウム量は正常食群と同程度まで正常化された。以上の結果から、抗ＢＭＰ１０抗体はＤａｈｌ―Ｓラットにおける高食塩食によるナトリウム貯留及び高血圧に対して著効を示すことが明らかとなった。

【0376】

一方で、図８に示すように、高食塩食によってＤａｈｌ－Ｓラットの尿量は増加し、抗ＢＭＰ１０抗体によって低下した。すなわち抗ＢＭＰ１０抗体は食塩感受性病態における腎臓ナトリウム排泄障害を正常化する作用を持つことが示され、尿量を増加させる利尿薬とは異なる作用機序を持つことが示唆された。

【0377】

図９に示すように、高食塩食群では正常食群に比べて尿中タンパク質排泄量の増加が認められた。また図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１１Ｂに示すように、高食塩食群では腎臓において硝子円柱、好塩基性尿細管、尿細管拡張が認められ、腎臓尿細管間質が著しく障害されていることが確認された。さらに図１０Ｄ、図１０Ｅおよび図１１Ａに示すように、高食塩食群では糸球体硝子化が認められ、腎臓糸球体が著しく障害されていることが確認された。一方で、図９、図１０Ｃおよび図１０Ｆに示すように、高食塩食＋１８Ｃ１抗体投与群では、尿タンパク質排泄量の増加、腎臓糸球体障害および腎臓尿細管間質障害が劇的に抑制されていた。

【0378】

以上の結果から、抗ＢＭＰ１０抗体は高血圧で惹起される糸球体障害、尿細管間質障害に対する治療効果を持つことが示唆された。

【0379】

図１２Ａに示すように、高食塩食群では正常食群に比べて、左室後壁厚の肥厚が認められた。さらに図１２Ｂに示すように、高食塩食群では正常食群に比べて、左室拡張機能の指標ｅ’の減少が認められ、心臓拡張機能障害が起こっていることが示された。

【0380】

図１３に示すように、高食塩食群では肺重量の増加が認められ、左室拡張機能障害による肺うっ血が起こっていることが示唆された。一方で、図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１３に示すように、高食塩食＋１８Ｃ１抗体投与群では、左室後壁厚、ｅ’および肺重量が正常食群と同程度に維持されていた。

【0381】

以上の結果から、抗ＢＭＰ１０抗体は高血圧で惹起される拡張不全型心不全に対して治療効果を持つことが示唆された。

【0382】

［実施例１０］
ヒト血清に対する抗ＢＭＰ１０抗体の中和活性の評価
ＡＬＫ１のリガンドとして、ＢＭＰ１０以外にもＢＭＰ９が知られている。血中のＢＭＰ９，ＢＭＰ１０に対する中和活性を評価する目的で、ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞に対してヒト血清で刺激した際の中和活性を比較した。

【0383】

１０－１）抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体の取得
抗ＢＭＰ９抗体１０Ｄ５は、国際公開第２０１４／００７１９８号の実施例７に記載された方法に従い調製した。

【0384】

１０－２）取得抗体と既知抗体のＢＭＰ１０中和活性比較
９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｔｒｕｅ Ａ ｓｅｒｕｍ，ｐｏｏｌ ｏｆ ｄｏｎｏｒｓ、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、Ｃａｔ＃ＳＥＲ０１９）を終濃度で５％になるように添加した。

【0385】

次いで、抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体、１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体、抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体、またはコントロール抗体（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｔ ＩｇＧ１ λ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ社製、Ｃａｔ＃５５３９９３）、または抗ＢＭＰ９抗体と抗ＢＭＰ１０抗体を混合したものを添加した。抗ＢＭＰ９抗体と抗ＢＭＰ１０抗体を混合したものとしては、１２Ｈ３抗体と１０Ｄ５抗体、または１１Ｈ１０抗体と１０Ｄ５抗体を混合したものを用いた。

【0386】

抗体は、混合するかどうかにかかわらず各抗体が終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬから３倍希釈で５段階の濃度となるように調製し、添加した。その後、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞懸濁液を５×１０^４個／ウェルとなるように添加した。すべてのサンプルはＥｘｃｅｌｌ ３２５培地で希釈し、ヒト血清、抗体希釈液、細胞懸濁液を合わせて最終的に１００μＬ／ウェルとなるようにした。ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。

【0387】

２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液を４０μＬ／ウェル加え、撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。抗体の中和活性（％）は、抗体を添加せず、血清のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。

【0388】

結果、図１４に示すように、コントロール抗体、抗ＢＭＰ１０抗体である１２Ｈ３抗体、１１Ｈ１０抗体、抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体はいずれもヒト血清に対して中和活性を示さなかった。一方で、１２Ｈ３抗体と１０Ｄ５抗体を混合したもの、および１１Ｈ１０抗体と１０Ｄ５抗体を混合したものは、ヒト血清に対して明らかな中和活性を示した。

【0389】

以上の結果から、ヒト血清中にヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体が存在することが示唆された。また、抗ＢＭＰ１０抗体である１８Ｃ１抗体は、単独でヒト血清に対して中和活性を示した。このことから、１８Ｃ１抗体はヒト血清中に存在するヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対して強力な中和活性を持つ新規の抗体であることが示唆された。

【0390】

［実施例１１］
ヒト血中のＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の検出
実施例１０で示唆されたＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体を検出するため、抗ＢＭＰ９抗体と抗ＢＭＰ１０抗体でサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。

【0391】

１１－１）１２Ｈ３抗体のビオチン化
サンドイッチＥＬＩＳＡの検出抗体として用いるため、抗ＢＭＰ１０抗体である１２Ｈ３抗体のビオチン化を行った。ビオチン化は同仁化学研究所社製のＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２キット（Ｃａｔ＃ＬＫ０３）を用いて行った。方法は、製品記載の添付文書に則り行った。

【0392】

１１－２）抗ＢＭＰ９抗体、抗ＢＭＰ１０抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ
抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体、抗ＢＭＰ１０抗体である１１Ｈ１０抗体、またはコントロール抗体（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ κ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ社製、Ｃａｔ＃５５４１２１）を、炭酸―重炭酸バッファー（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社 Ｃａｔ＃Ｃ３０４１）にて３μｇ／ｍｌに希釈したものを固相化液として９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に１００μＬ／ウェル加え、４℃にて一晩静置して吸着させた。

【0393】

抗体液を取り除いた後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを３００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｔｒｕｅ Ａ ｓｅｒｕｍ，ｐｏｏｌ ｏｆ ｄｏｎｏｒｓ、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、Ｃａｔ＃ＳＥＲ０１９）を終濃度で１％、２％、４％、８％、１６％になるように０．１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで希釈した溶液を１００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置して反応させた後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。

【0394】

次に、実施例１１の１１－１）で作製したビオチン化１２Ｈ３抗体を０．１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴにて５０ｎｇ／ｍＬに調製した溶液を１００μＬ／ウェルで分注し、室温にて１時間静置した。このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰｏｌｙＨＲＰ８０，Ｐｒｅ－ｄｉｌｕｔｅｄ ｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（１／２０）（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェル加え、室温にて１時間静置した。

【0395】

プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２－０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて４５０、５７０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１５に示す。

【0396】

図１５に示すようにコントロール抗体および抗ＢＭＰ１０抗体である１１Ｈ１０抗体を固相化した際は、血清に対して反応は認められなかった。一方で抗ＢＭＰ９抗体である１０Ｄ５抗体を固相化した場合は、血清濃度依存的に明確な反応が認められた。以上の結果より、ヒト血清中には抗ＢＭＰ９抗体、抗ＢＭＰ１０抗体により同時に認識されるＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体が存在することが示唆された。

【0397】

［実施例１２］
１８Ｃ１抗体のヒト化抗体の作製
（１）１８Ｃ１ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
以下に記載する方法で、１８Ｃ１ヒト化抗体の各種ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計した。以降の記述では様々なＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を有する１８Ｃ１ヒト化抗体の総称として、ｈｚ１８Ｃ１抗体と記載する。１８Ｃ１抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植に適した既知のヒト抗体のフレームワーク（以下、ＦＲと記載する）のアミノ酸配列として、Ｋａｂａｔら［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］で報告されているヒトＦＲコンセンサス配列およびヒト抗体ジャームライン配列の中からｈＳＧＨＩＩおよびＶ１－２２を選択し、これらのＦＲにＣＤＲを移植することとした。

【0398】

ｈＳＧＨＩＩのＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、それぞれ配列番号２９、３０、３１で示される１８Ｃ１ ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植し、ｈｚ１８Ｃ１ ＨＶ０（配列番号７０）を設計した。また、Ｖ１－２２のＦＲ（ＦＲ４としては１８Ｃ１キメラ抗体のものをそのまま使用）のアミノ酸配列の適切な位置に、それぞれ配列番号３２、３３、３４で示される１８Ｃ１ ＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植し、ｈｚ１８Ｃ１ ＬＶ０（配列番号７１）を設計した。

【0399】

上記のとおり設計したｈｚ１８Ｃ１ ＨＶ０およびｈｚ１８Ｃ１ ＬＶ０のコンピュータモデリングにより、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定した。その結果、ｈｚ１８Ｃ１ ＬＶ０ＨＶ０抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸残基の中で、抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＶＨでは、配列番号７０で表わされるアミノ酸配列の１４番目のＰｒｏ、２０番目のＬｅｕ、２７番目のＧｌｙ、２９番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＩｌｅ、４８番目のＩｌｅ、６７番目のＶａｌ、７１番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｎ、７８番目のＰｈｅ、８２番目のＬｅｕ、８５番目のＶａｌ、９２番目のＶａｌ、９４番目のＴｙｒ、及び１０９番目のＴｈｒを、ＶＬでは、配列番号７１で表わされるアミノ酸配列の７番目のＰｒｏ、１０番目のＶａｌ、１２番目のＧｌｕ、１４番目のＰｒｏ、１６番目のＬｙｓ、１９番目のＴｈｒ、２０番目のＩｌｅ、４１番目のＰｒｏ、４８番目のＶａｌ、７５番目のＳｅｒ、８１番目のＬｅｕ、８２番目のＬｙｓ、８８番目のＡｓｐ、及び９０番目のＴｙｒを、それぞれ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸残基を、１８Ｃ１抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ置換し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。

【0400】

上記のような標準的なＣＤＲ移植の設計に加えて、一部のＶＨまたはＶＬには、ＶＨ ＣＤＲの改変を併せて行った。該ＶＨ ＣＤＲの改変を行ったｈｚ１８Ｃ１抗体のＶＨでは、配列番号２９で表されるＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列中の４番目のＶａｌをＡｌａに置換する改変、配列番号３０で表されるＶＨのＣＤＲ２中の１６番目のＳｅｒをＡｓｐに置換する改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。

【0401】

以上の過程により設計したアミノ酸配列として具体的なものを、ＶＨについては図１６に、ＶＬについては図１８Ａにそれぞれ示す。

【0402】

また、上記したＣＤＲ移植方法の他に、表面再構成方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９４，９１（３）：９６９－７３およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６， １０， ８９５－９０）により、上記で構築した１８Ｃ１抗体の可変領域のモデル構造から、抗体の結合活性に影響を与えないと考えられるＦＲ内のアミノ酸残基を、抗原性を低下させると考えられるアミノ酸残基へ置換し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＬおよびＶＨを設計した。一部のＶＬまたはＶＨには、ＣＤＲ移植法の場合において言及した、ＶＨ ＣＤＲの改変を併せて行った。

【0403】

具体的には、配列番号２６で表されるアミノ酸配列中の３番目のＶａｌをＡｌａに、８番目のＡｓｎをＡｓｐに、１４番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＬｙｓをＴｈｒに、７５番目のＰｈｅをＳｅｒに、８０番目のＡｓｎをＡｓｐに、８３番目のＩｌｅをＶａｌに、又は８８番目のＩｌｅをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。これにより、ｈｚ１８Ｃ１抗体のＶＬとして、それぞれ配列番号７２～８７で示されるアミノ酸配列からなるｈｚ１８Ｃ１ ＶＬｒｅｓ０１～１６を設計し、図１８Ｂに示す。

【0404】

また、ＶＨについては、配列番号２３で表されるアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＡｌａに、１４番目のＬｅｕをＰｒｏに、１９番目のＳｅｒをＡｓｐに、２７番目のＰｈｅをＡｌａに、３４番目のＶａｌをＡｌａに、６５番目のＳｅｒをＡｓｐに、６８番目のＳｅｒをＡｌａに、７１番目のＡｒｇをＬｙｓに、７７番目のＧｌｎをＧｌｕに、７９番目のＰｈｅをＡｌａに、８３番目のＡｓｎをＡｓｐに、８５番目のＬｅｕをＡｓｐに、又は１０７番目のＨｉｓをＧｌｎに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。このようにして設計されたｈｚ１８Ｃ１抗体のＶＨとして、ｈｚ１８Ｃ１ ＶＨｒｅｓ０１～３２を図１７に示す。ｈｚ１８Ｃ１ ＶＨｒｅｓ１６に関しては、そのアミノ酸配列を配列番号９８に示す。

【0405】

更に、ヒト化抗体のＶＨアミノ酸配列として、ＣＤＲ移植方法と表面再構成方法を組み合わせてＶＨアミノ酸配列を設計した。具体的には、配列番号７０で表わされるアミノ酸配列の１０番目のＧｌｙをＡｓｐに、１３番目のＬｙｓをＧｌｎに、１９番目のＳｅｒをＡｓｐに、２０番目のＬｅｕをＩｌｅに、２７番目のＧｌｙをＰｈｅに、２９番目のＶａｌをＬｅｕに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＩｌｅをＶａｌに、４８番目のＩｌｅをＭｅｔに、６５番目のＳｅｒをＡｓｐに、６７番目のＶａｌをＬｅｕに、６８番目のＴｈｒをＡｌａに、７１番目のＶａｌをＡｒｇに、７６番目のＡｓｎをＳｅｒに、７７番目のＧｌｎをＧｌｕに、７８番目のＰｈｅをＶａｌに、７９番目のＳｅｒをＰｈｅに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８３番目のＳｅｒをＡｓｐに、８５番目のＶａｌをＬｅｕに、８６番目のＴｈｒをＧｌｎに、８７番目のＡｌａをＴｈｒに、８８番目のＡｌａをＡｓｐに、９２番目のＶａｌをＬｙｓに、９４番目のＴｙｒをＰｈｅに、１０９番目のＴｈｒをＩｌｅ、および１１０番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。これにより、ｈｚ１８Ｃ１抗体のＶＨとして、ｈｚ１８Ｃ１ ＨＶｍｕｔ０１～１０（配列番号８８～９７）を設計し、それぞれのアミノ酸配列を図１９に示す。このうち、ｈｚ１８Ｃ１ ＨＶｍｕｔ０１～０４のＣＤＲ１～３はいずれも、１８Ｃ１抗体と同じアミノ酸配列（それぞれ配列番号２９～３１で表されるアミノ酸配列）を含む。一方、ｈｚ１８Ｃ１ ＨＶｍｕｔ０５～１０はＣＤＲ２に変異を含んでいる。すなわち、ｈｚ１８Ｃ１ ＨＶｍｕｔ０５～１０のＣＤＲ１および３は、それぞれ配列番号２９および３１で表されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の１６番目のＳｅｒがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列（配列番号９９）を含む。

【0406】

（２）ヒト化抗体の可変領域遺伝子の設計
表３に示すヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、動物細胞で高頻度に使用されるコドンを用いて設計した。

【0407】

【表3】

【0408】

（３）ヒト化抗体の作製
（２）で設計した塩基配列に対応する遺伝子断片を、シームレスクローニング法を用いて発現ベクターに導入して必要なプラスミドを作製した。但し、ＶＬ発現ベクターとしてはシグナル配列およびヒトλ鎖定常領域配列を有したｐＣＩ－ＯｔＣＭＶ＿ｈＬベクターを、ＶＨ発現ベクターとしてはシグナル配列およびヒトγ鎖定常領域配列を有したｐＣＩ－ＯｔＣＡＧ＿ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターを用いた。ｐＣＩ－ＯｔＣＡＧ＿ｈＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）ベクターが有する定常領域配列は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域のＥＵ－ｉｎｄｅｘにおける２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＧｌｕに、および４０９番目のＡｒｇ残基をＬｙｓにそれぞれ置換したＩｇＧ４変異体（以下、ＩｇＧ４ＰＥ Ｒ４０９Ｋ（ＷＯ２００６／０３３３８６） と記載する）の重鎖定常領域である。なおこれらのベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａ社 ｐＣＩ ベクターを共通主骨格としてヒト抗体遺伝子を発現させるために必要な制限酵素サイトを導入し、全合成によって作製されたベクターである。完成したプラスミドは、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦキット(タカラバイオ社）を用いて大量調製した。次に、目的のヒト化抗体を、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して一過性に発現させた。プラスミドの導入の方法は添付書類に従った。

【0409】

軽鎖の発現ベクターと重鎖の発現ベクターは、１：２の比率で混合して導入した。プラスミド導入後の細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２、１２５ｒｐｍの条件下で、３日間培養した。その後、細胞培養懸濁液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を通して培養上清を回収した。培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティー精製により、精製抗体を取得した。

【0410】

具体的には、カラムに充填したレジンをＰＢＳで平衡化した後、当該カラムに培養上清を添加し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｗａｓｈバッファー１（ＰＢＳ ｗｉｔｈ １Ｍ ＮａＣｌ）、Ｗａｓｈバッファー２（２０ｍＭ クエン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ５．０）で各１回洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭ クエン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ３．４）を用いて抗体を溶出した。得られた抗体溶液に中和バッファー（１Ｍ リン酸－ＮａＯＨ，ｐＨ ７．０）を１／１０量加えて中和し、ＮＡＰ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて抗体溶液の溶媒をＰＢＳに置換した。バッファー置換後の抗体溶液について、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（ミリポア社）を用いて限外濾過による濃縮を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して吸光度Ａ_２８０を測定し、抗体溶液の濃度の測定と調整を行った。吸光係数は、Ｃ．Ｎ．Ｐａｃｅらの方法に従って（１９９５，Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ．４：２４１１－２４２３）それぞれのヒト化抗体のアミノ酸配列から算出した。精製した抗体は、分析用ゲル濾過クロマトグラフィー（島津製作所社製の装置、東ソー社製カラムＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００を使用）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる品質確認を行った。

【0411】

［実施例１３］
抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体の結合活性評価
実施例５－３で得られたｃｈ１８Ｃ１抗体と、実施例１２で得られた抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のヒトＢＭＰ１０に対する結合活性を比較することを目的とし、ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）に対する結合活性をＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）により測定した。

【0412】

抗ＢＭＰ１０抗体の結合活性は以下のように測定した。Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００８－３９）を用いて、添付のプロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＢＲ１００５３０）に固定化した。Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、５μｇ／ｍＬに調製した抗体を１０μＬ／分の流速で１０秒間添加した。

【0413】

次に、１００ｎｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に５濃度に調製したヒトｍａｔｕｒｅ ＢＭＰ１０を３０μＬ／分の流速で、結合反応を１分間、解離反応を１０分間モニターした。取得したセンサーグラムは、Ｂｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。算出された各抗体の結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および解離定数［ｋｄ／ｋａ＝Ｋ_Ｄ］を表４に示す。

【0414】

［表４］

【0415】

以上の結果より、作製した抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体は、ｃｈ１８Ｃ１抗体と同等の結合活性を持つことが明らかとなった。

【0416】

［実施例１４］
抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体とｃｈ１８Ｃ１抗体の中和活性比較
１４－１）抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のＢＭＰ１０ホモ２量体に対する中和活性評価
取得した抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体とｃｈ１８Ｃ１抗体に関して、ＢＭＰ１０に対する中和活性を実施例３の３－１）で作製したヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞を用いて比較した。

【0417】

９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒトＢＭＰ１０ｍａｔｕｒｅ２量体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６－ＢＰ）を終濃度で０．３ｎｇ／ｍＬになるように添加し、次いで実施例１２で取得した抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体、またはｃｈ１８Ｃ１抗体を終濃度で３０００ｎｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に７濃度に調製し、添加した。

【0418】

その後、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地［Ｅｘｃｅｌｌ ３２５ ＰＦ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社製、Ｃａｔ＃１４３４０Ｃ－１０００ｍＬ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１×Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ナカライ社製、Ｃａｔ＃０９３６７－３４）、０．５ｍｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ］にて懸濁したＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞液を５×１０^４個／ウェルになるように添加した。すべてのサンプル添加後、ウェル内の液をプレートミキサーで均一にし、３７℃にて２０時間培養した。

【0419】

２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を４０μＬ／ウェル加え撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。抗体の中和活性（％）は、抗体を添加せず、ＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ２量体のみを添加したウェルの値を０％、抗体を添加せず、Ｅｘｃｅｌｌ ３２５培地のみを添加したウェルの値を１００％として算出した。結果を図２０～２５に示す。

【0420】

図２０～２５に示すように、作製した抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体はいずれもｃｈ１８Ｃ１抗体と同等の中和活性を示した。

【0421】

１４－２）抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体のヒト血中ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性評価
取得した抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体とｃｈ１８Ｃ１抗体に関して、ヒト血中ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対する中和活性を、ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞を用いて比較した。ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞は実施例３の３－１）で作製した細胞を用いて行った。

【0422】

９６ウェル蛍光・発光用プレート（コーニング社製、Ｃａｔ＃３９１６）に、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｔｒｕｅ Ａ ｓｅｒｕｍ，ｐｏｏｌ ｏｆ ｄｏｎｏｒｓ、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、Ｃａｔ＃ＳＥＲ０１９）を終濃度で１０％になるように添加した。

【0423】

次に、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体、またはｃｈ１８Ｃ１抗体を１０００ng/mlの終濃度で添加した。その後、ＡＬＫ１／Ｉｄ１－Ｌｕｃ／ＣＨＯ細胞懸濁液を５×１０^４個／ウェルとなるように添加した。すべてのウェルについて、液量が１００μＬ／ウェルとなるようにＥｘｃｅｌｌ ３２５培地を加えた。ウェル内の液をプレートミキサーで均一にした後、３７℃にて２０時間培養した。

【0424】

２０時間後、添付文書に従い調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ測定液を４０μＬ／ウェル加え、撹拌した後、Ｇｌｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。

【0425】

図２６に示すように、抗ＢＭＰ１０ヒト化抗体はいずれも、ヒト血中ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体に対し、ｃｈ１８Ｃ１抗体と同等の中和活性を示した。

【0426】

［実施例１５］
正常動物の血圧に対するＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体中和作用の評価
ＳＤラットを用いてＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体を中和した際の血圧に対する作用を評価した。６週齢の雄性ＳＤラット（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ－２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、７週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。テレメトリー送信機の埋め込み手術方法および血圧波形の取得は、実施例７に従って行った。

【0427】

ＢＭＰ９抗体投与群には、ＢＭＰ９抗体１０Ｄ５をＰＢＳにて１０ｍｇ／ｍｌになるように調製したものを、１ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体中和群には、ＢＭＰ９抗体１０Ｄ５およびＢＭＰ１０抗体１１Ｈ１０をＰＢＳにて、それぞれ最終濃度として１０ ｍｇ/ｍｌ、５ ｍｇ／ｍｌとなるように混合調製したものを、１ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。投与は皮下経路で行った。

【0428】

図２７Ａに示すように、媒体投与時に比べて、１０Ｄ５抗体の投与によって、収縮期血圧の変化は認められなかった。一方で図２７Ｂに示すように、媒体投与時に比べて、１０Ｄ５抗体と１１Ｈ１０抗体を混合投与したＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体中和群においては、収縮期血圧の低下が認められた。

【0429】

１０Ｄ５抗体および１１Ｈ１０抗体はいずれも単独では収縮期血圧の変化を惹起しない。しかし１０Ｄ５抗体および１１Ｈ１０抗体を併用すれば、ＢＭＰ９／ＢＭＰ１０ヘテロ２量体の中和により、降圧作用を示すことが新規に見出された。

【0430】

［実施例１６］
正常動物の血圧に対するヒトＢＭＰ１０ホモ２量体の作用の評価
１６－１）ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質の調製
ヒトＢＭＰ１０ホモ２量体の血圧に対する作用を評価するために、ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質を調製した。ヒトＢＭＰ１０発現ベクターは国際公開第２０１４／００７１９８号の実施例２０に記載された方法に従い調製した。またヒトＦｕｒｉｎ発現プラスミドは、ヒトＦｕｒｉｎ全長ｃＤＮＡを、ｐＥＡＫ８ベクター（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて組み込むことにより作製した。

【0431】

ＥＸＰＩ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ヒトＢＭＰ１０とヒトＦｕｒｉｎについて一過性発現を行い、ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質を発現させた。培養上清を、遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いた濾過により培養液から取得した。

【0432】

続いて、Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて各タンパク質を精製した。Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ ４０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用い、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いた。

【0433】

ＮＡＰ－２５カラム（ＧＥヘルスケア社製、１７－０８５２－０２）を用いて、バッファーをＰＢＳに置換した。２８０ｎｍの吸光度を測定して各タンパク質溶液の濃度を決定した。分子吸光係数として０．９６ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。このようにして得られたＢＭＰ１０組換えタンパク質は、全長体を含まず、ｍａｔｕｒｅ体およびＮ末プロペプチド体のみを含むが、実施例１－１の方法で作製される全長体を含むＢＭＰ１０組換えタンパク質と同様にホモ２量体を形成し、ＢＭＰ１０としての機能を有する。

【0434】

１６－２）ＢＭＰ１０組換えタンパク質の血圧に対する作用の評価
ＳＤラットを用いてヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質を投与した際の血圧に対する作用を評価した。６週齢の雄性ＳＤラット（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ－２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。馴化飼育の後、７週齢でテレメトリー送信機の埋め込み手術を施した。

【0435】

テレメトリー送信機の埋め込み手術方法および血圧波形の取得は、実施例７に従って行った。実施例１６－１で得られたヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質を、ＰＢＳにて０．５ ｍｇ／ｍｌになるように調製したものを、１ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。投与は静脈内経路で行った。

【0436】

図２８に示すように、媒体投与時と比較して、ヒトＢＭＰ１０組換えタンパク質を投与することにより、収縮期血圧の上昇が認められた。

【0437】

以上の結果より、ヒトＢＭＰ１０ホモ２量体に昇圧作用があることが、新規に見出された。

【0438】

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１７年１２月１２日付けで出願された日本特許出願（特願２０１７－２３８１０６号）に基づいており、その全体が引用により援用される。

【配列表フリーテキスト】

【0439】

配列番号１：ラットＩｇＧ１に特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２：ラットＩｇＧ２ａに特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号３：ラットＩｇ（κ）特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号４：ラットＩｇ（λ）特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号５：１８Ｃ１抗体のＶＨ全塩基配列
配列番号６：１２Ｈ３抗体のＶＨ全塩基配列
配列番号７：１１Ｈ１０抗体のＶＨ全塩基配列
配列番号８：１８Ｃ１抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号９：１２Ｈ３抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１０：１１Ｈ１０抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１１：１８Ｃ１抗体のＶＬ全塩基配列
配列番号１２：１２Ｈ３抗体のＶＬ全塩基配列
配列番号１３：１１Ｈ１０抗体のＶＬ全塩基配列
配列番号１４：１８Ｃ１抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１５：１２Ｈ３抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１６：１１Ｈ１０抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１７：１８Ｃ１抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１８：１２Ｈ３抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１９：１１Ｈ１０抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号２０：１８Ｃ１抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号２１：１２Ｈ３抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号２２：１１Ｈ１０抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号２３：１８Ｃ１抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２４：１２Ｈ３抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２５：１１Ｈ１０抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２６：１８Ｃ１抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２７：１２Ｈ３抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２８：１１Ｈ１０抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号２９：１８Ｃ１抗体ＶＨのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号３０：１８Ｃ１抗体ＶＨのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号３１：１８Ｃ１抗体ＶＨのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号３２：１８Ｃ１抗体ＶＬのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号３３：１８Ｃ１抗体ＶＬのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号３４：１８Ｃ１抗体ＶＬのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号３５：１２Ｈ３抗体ＶＨのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号３６：１２Ｈ３抗体ＶＨのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号３７：１２Ｈ３抗体ＶＨのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号３８：１２Ｈ３抗体ＶＬのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号３９：１２Ｈ３抗体ＶＬのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号４０：１２Ｈ３抗体ＶＬのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号４１：１１Ｈ１０抗体ＶＨのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号４２：１１Ｈ１０抗体ＶＨのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号４３：１１Ｈ１０抗体ＶＨのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号４４：１１Ｈ１０抗体ＶＬのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号４５：１１Ｈ１０抗体ＶＬのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号４６：１１Ｈ１０抗体ＶＬのＣＤＲ３アミノ酸配列）
配列番号４７：ヒトＢＭＰ１０蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４８：ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号４９：ヒトＢＭＰ１０蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号５０：ヒトＢＭＰ１０ ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号５１：ヒトＢＭＰＲＩＩのアミノ酸配列
配列番号５２：ヒトＡＬＫ１のアミノ酸配列
配列番号５３：１８Ｃ１抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号５４：１８Ｃ１抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号５５：１８Ｃ１抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号５６：１８Ｃ１抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号５７：１２Ｈ３抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号５８：１２Ｈ３抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号５９：１２Ｈ３抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号６０：１２Ｈ３抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号６１：１１Ｈ１０抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号６２：１１Ｈ１０抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号６３：１１Ｈ１０抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号６４：１１Ｈ１０抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号６５：ヒトＢＭＰ９ ｍａｔｕｒｅ 領域のアミノ酸配列
配列番号６６：ヒトＢＭＰ９蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号６７：ヒトＢＭＰ９蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号６８：ヒトＢＭＰ９ ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号６９：ヒトＥｎｄｏｇｌｉｎのアミノ酸配列
配列番号７０：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶ０のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒト化１８Ｃ１抗体ＬＶ０のアミノ酸配列
配列番号７２：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０１のアミノ酸配列
配列番号７３：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０２のアミノ酸配列
配列番号７４：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０３のアミノ酸配列
配列番号７５：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０４のアミノ酸配列
配列番号７６：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０５のアミノ酸配列
配列番号７７：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０６のアミノ酸配列
配列番号７８：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０７のアミノ酸配列
配列番号７９：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０８のアミノ酸配列
配列番号８０：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ０９のアミノ酸配列
配列番号８１：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１０のアミノ酸配列
配列番号８２：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１１のアミノ酸配列
配列番号８３：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１２のアミノ酸配列
配列番号８４：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１３のアミノ酸配列
配列番号８５：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１４のアミノ酸配列
配列番号８６：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１５のアミノ酸配列
配列番号８７：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＬｒｅｓ１６のアミノ酸配列
配列番号８８：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０１のアミノ酸配列
配列番号８９：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０２のアミノ酸配列
配列番号９０：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０３のアミノ酸配列
配列番号９１：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０４のアミノ酸配列
配列番号９２：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０５のアミノ酸配列
配列番号９３：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０６のアミノ酸配列
配列番号９４：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０７のアミノ酸配列
配列番号９５：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０８のアミノ酸配列
配列番号９６：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０９のアミノ酸配列
配列番号９７：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ１０のアミノ酸配列
配列番号９８：ヒト化１８Ｃ１抗体ＶＨｒｅｓ１６のアミノ酸配列
配列番号９９：ヒト化１８Ｃ１抗体ＨＶｍｕｔ０５～１０のＣＤＲ２のアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

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