特許 7323816 エンドトキシン測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-01

(45)【発行日】2023-08-09

(54)【発明の名称】エンドトキシン測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/76 20060101AFI20230802BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230802BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20230802BHJP

【ＦＩ】

G01N21/76

G01N33/68

C12Q1/66

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2021102392

(22)【出願日】2021-06-21

(65)【公開番号】P2023001581

(43)【公開日】2023-01-06

【審査請求日】2022-06-10

(73)【特許権者】

【識別番号】000219451

【氏名又は名称】東亜ディーケーケー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100141139

【弁理士】

【氏名又は名称】及川 周

(74)【代理人】

【識別番号】100106057

【弁理士】

【氏名又は名称】柳井 則子

(74)【代理人】

【識別番号】100152146

【弁理士】

【氏名又は名称】伏見 俊介

(74)【代理人】

【識別番号】100153763

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 広之

(72)【発明者】

【氏名】八幡 悟史

(72)【発明者】

【氏名】野田 健一

(72)【発明者】

【氏名】下村 亜依

【審査官】伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－０１４３７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－２１１７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－１８３８６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－３３３６９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－１３２８７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１４－０８５１３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１０９１５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００ － Ｇ０１Ｎ ２１／８３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ ー Ｇ０１Ｎ ３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／００ － Ｃ１２Ｑ １／７０

Ｃ１２Ｍ １／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料液と、エンドトキシンにより活性化する試薬と、活性化した試薬により、発光基質を遊離させる発光合成基質と、遊離した発光基質を発光させる発光酵素とを含む測定液を調製し、
前記測定液の調製後第１の時間Ｔ１経過後における第１発光量Ｌ１と第２の時間Ｔ２経過後における第２発光量Ｌ２とを測定し、
前記第１発光量Ｌ１と前記第２発光量Ｌ２に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量ＬＸを求め、求めた正味発光量ＬＸに基づき、試料液中のエンドトキシン濃度を求めるエンドトキシン測定方法。
ただし、前記第１の時間Ｔ１は試料液に代えてエンドトキシンを含まないブランク液を測定したときの発光量が最大値又は最大値近くとなり、かつ、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められない時間であり、前記第２の時間Ｔ２は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間である。

【請求項2】

前記第２発光量Ｌ２から前記第１発光量Ｌ１を差し引いた発光量を、前記正味発光量ＬＸとする、請求項１に記載のエンドトキシン測定方法。

【請求項3】

前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、請求項１又は２に記載のエンドトキシン測定方法。

【請求項4】

前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が、凍結乾燥状態で収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、請求項１又は２に記載のエンドトキシン測定方法。

【請求項5】

前記エンドトキシンにより活性化する試薬がライセート試薬であり、前記発光合成基質がペプチドに発光基質が結合してなり、前記ペプチドと前記発光基質の結合は、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子、および凝固酵素の少なくともいずれか１種の作用により切断される構造である、請求項１～４のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。

【請求項6】

前記発光基質がアミノルシフェリンであり、前記発光酵素がルシフェラーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エンドトキシン測定方法に関する。さらに詳しくは、試薬によるバックグラウンド発光の影響を排除してエンドトキシン濃度を精度良く求めることが可能なエンドトキシン測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

「エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ：内毒素）」は、グラム陰性菌の外膜を構成する成分の一つであり、その活性の本体はＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：リポ多糖）である。生体内におけるエンドトキシンの存在は、グラム陰性菌の表層に外膜の一部として存在する。また、一般的にはグラム陰性菌の死後、フリーのエンドトキシンとして血液中に遊離して存在している。

【0003】

エンドトキシンが血液中に一定量以上存在する場合、当該エンドトキシンの刺激によって単球や顆粒球等で過剰の炎症性サイトカインが産生される。その結果、エンドトキシン血症と呼ばれる発熱、敗血症、敗血症性ショック、または多臓器不全等の症状が惹起される。このため、注射用医薬品等におけるエンドトキシンの検出は極めて重要である。
また、臨床診断上では、血液中のエンドトキシンを正確に測定することは、早期診断や治療効果の判定に極めて重要であると考えられる。

【0004】

エンドトキシンを高感度で検出する方法として、エンドトキシンによって活性化した試薬により発光合成基質から発光基質を遊離させ、遊離した発光基質を発光させる生物発光法が知られている（特許文献１）。
生物発光法による発光分析に使用する試薬は、生物由来の試薬を使用することも多く、ロット毎に感度が異なる傾向にある。そのため、試薬のロット毎に、測定対象成分と発光量との関係を示す検量線を求めることが行われている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】国際公開第２００９／０６３８４０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかし、試薬のロット毎に検量線を作成しても、エンドトキシン濃度を再現性良く求めることは難しかった。
本発明者らがその原因を検討したところ、同じロットでも試薬キット毎に微妙に試薬量が異なり、それに応じて、バックグラウンド発光の要因となる物質量も異なってしまうためであることが判明した。
本発明は上記事情に鑑みて、試薬キット毎に異なるバックグラウンド発光の影響を排除して、エンドトキシン濃度を再現性良く測定することが可能なエンドトキシン測定方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］試料液と、エンドトキシンにより活性化する試薬と、活性化した試薬により、発光基質を遊離させる発光合成基質と、遊離した発光基質を発光させる発光酵素とを含む測定液を調製し、
前記測定液の調製後第１の時間Ｔ１経過後における第１発光量Ｌ１と第２の時間Ｔ２経過後における第２発光量Ｌ２とを測定し、
前記第１発光量Ｌ１と前記第２発光量Ｌ２に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量ＬＸを求め、求めた正味発光量ＬＸに基づき、試料液中のエンドトキシン濃度を求めるエンドトキシン測定方法。
ただし、前記第１の時間Ｔ１は試料液に代えてエンドトキシンを含まないブランク液を測定したときの発光量が最大値又は最大値近くとなり、かつ、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められない時間であり、前記第２の時間Ｔ２は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間である。
［２］前記第２発光量Ｌ２から前記第１発光量Ｌ１を差し引いた発光量を、前記正味発光量ＬＸとする、［１］に記載のエンドトキシン測定方法。
［３］前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、［１］又は［２］に記載のエンドトキシン測定方法。
［４］前記エンドトキシンにより活性化する試薬、前記発光合成基質、及び前記発光酵素が、凍結乾燥状態で収容された測定容器に、前記試料液を注入することによって、前記測定液を調製する、［１］又は［２］に記載のエンドトキシン測定方法。
［５］前記エンドトキシンにより活性化する試薬がライセート試薬であり、前記発光合成基質がペプチドに発光基質が結合してなり、前記ペプチドと前記発光基質の結合は、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子、および凝固酵素の少なくともいずれか１種の作用により切断される構造である、［１］～［４］のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。
［６］前記発光基質がアミノルシフェリンであり、前記発光酵素がルシフェラーゼである、［１］～［５］のいずれか一項に記載のエンドトキシン測定方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明のエンドトキシン測定方法によれば、試薬キット毎に異なるバックグラウンド発光の影響を排除して、エンドトキシン濃度を再現性良く測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の一実施形態に係るエンドトキシン測定方法の手順を示す図である。

【図2】測定液における反応の一例を示す図である。

【図3】反応時間に応じた発光量の変化を示すグラフである。

【図4】本発明の測定方法を実施する測定装置の一例を示す概略構成図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

図１を参照して、本発明の一実施形態に係るエンドトキシン測定方法の手順を説明する。
図１（ａ）に示すように、まず、測定容器１の容器本体２から蓋３を取り外す。容器本体２は、少なくともエンドトキシンに基づく発光を透過可能な素材、例えば、ガラス等で構成されている。

【0011】

測定容器１の容器本体２には試薬キット６（測定液を構成する試料液以外の成分）が予め収容されている。試薬キット６は、凍結乾燥状態で容器本体２に収容されていることが好ましい。また、容器本体２の底部に付着していることが好ましい。
試薬キット６を収容した測定容器１は、使用時まで、冷蔵状態で保管されることが好ましい。

【0012】

試薬キット６には、エンドトキシンにより活性化する試薬と、活性化した試薬により、発光基質を遊離させる発光合成基質と、遊離した発光基質を発光させる発光酵素と、その他発光反応に必要な他の化合物が含まれる。

【0013】

エンドトキシンにより活性化する試薬としては、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子を含む試薬が好ましく、Ｃ因子に加えて、活性型Ｃ因子により活性化されるＢ因子、および活性型Ｂ因子により活性化されて凝固酵素を生成する前凝固酵素を含有する試薬がより好ましい。Ｃ因子、Ｂ因子、および前凝固酵素を含有する試薬としては、ライセート試薬（カブトガニ血球抽出成分）を好適に使用できる。

【0014】

発光合成基質としては、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質を使用できる。発光合成基質としては、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子、および凝固酵素の少なくともいずれか１種の作用（プロテアーゼ活性）により、発光基質とペプチドとの結合が切断される構造を有するものを使用できる。

【0015】

発光基質としては、アミノルシフェリンが好適に使用できる。発光基質と結合するペプチドとしては、該ペプチドのＣ末端におけるアミノルシフェリンとのアミド結合が、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素の少なくともいずれか１種のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列からなるものであればよい。
ペプチドの具体的なアミノ酸配列としては、特許文献１に記載の配列が挙げられる。

【0016】

発光酵素は、発光合成基質から遊離される発光基質の生物発光に対して触媒として機能し、光を発生させる酵素である。発光基質がアミノルシフェリンである場合の発光酵素はルシフェラーゼであり、発光反応に必要な他の化合物は、ＡＴＰおよび２価金属イオンである。２価金属イオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。
なお、試料液が塩分を含む場合、試薬キット６は、塩分濃度に起因する誤差を解消するために、さらにＮａＣｌを含んでいてもよい。

【0017】

次に図１（ｂ）に示すように、容器本体２にマイクロピペット５を用いて試料液を注入する。注入する試料液の量に特に限定はないが、発光を測定装置１００で測定しやすく、かつ試料液と試薬キット６の量を少なくする観点から、５０～５００μＬとすることが好ましく、１００～３００μＬとすることがより好ましく、例えば、２００μＬとすることができる。

【0018】

図１（ｃ）に示すように、試料液が注入されると、試薬キット６に試料液が加わることになり、測定液４が調製される。この測定液４を収容した容器本体２に対して、蓋３を閉め、図１（ｄ）に示すように撹拌して混合する。なお、図１（ｄ）には、手で振り混ぜる態様を示したが、撹拌混合の方法に限定はなく、例えば、振動ミキサー等を使用してもよい。

【0019】

測定液４は、調製したときからエンドトキシンとエンドトキシンにより活性化する試薬との反応が進行する。図２に試薬キット６が、ライセート試薬とペプチドにアミノルシフェリンが結合した発光合成基質とルシフェラーゼを含む場合の反応過程を示す。
ライセート試薬（カブトガニ血球抽出成分）中にはエンドトキシンと特異的に反応するＣ因子経路が存在する。

【0020】

「Ｃ因子経路」は、図２に示すように、まず、エンドトキシンが、Ｃ因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｃ）と強固に結合してＣ因子を活性化する。次に、エンドトキシンの結合により活性化されたＣ因子（活性型Ｃ因子）はＢ因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｂ）を活性化する。続いて、活性化されたＢ因子（活性型Ｂ因子）によって、さらに前凝固酵素（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）が活性化されて凝固酵素（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）が生成される。

【0021】

この凝固酵素は、ペプチドにアミノルシフェリンが結合した発光合成基質のペプチドとアミノルシフェリンとの結合を切断する。その結果、発光基質であるアミノルシフェリンが遊離する。このアミノルシフェリンにルシフェラーゼ（発光酵素）を作用させることにより、光が発生する。
なお、遊離したアミノルシフェリンをルシフェラーゼで発光させる反応には、ＡＴＰおよび２価金属イオン（図２では、マグネシウムイオンを例示）が関与する。

【0022】

この発生する光を、図１（ｅ）に示すように、測定装置１００で測定する。具体的には、撹拌混合された測定液４を収容した測定容器１を測定装置１００の測定室１０に格納して測定室１０の扉１２を閉める。
測定装置１００は、測定液４を収容した測定容器１が測定装置１００の測定室１０に格納され、測定室１０の扉１２が閉められると測定を開始し、エンドトキシン濃度を求める。

【0023】

なお、容器本体２に試料液を注入してから、測定容器１を測定室１０に格納して扉１２を閉めるまでの時間（以下「準備時間」という。）は、できるだけ一定にすることが好ましい。
準備時間は、例えば１～６０秒の範囲、好ましくは５～１０秒の範囲とすることができる。準備時間のばらつきは、３０秒以内とすることが好ましく、５秒以内とすることがより好ましい。

【0024】

測定装置１００は、測定液４の調製後第１の時間Ｔ１経過後における第１発光量Ｌ１と第２の時間Ｔ２経過後における第２発光量Ｌ２とを測定し、第１発光量Ｌ１と前記第２発光量Ｌ２に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量ＬＸを求める。そして、求めた正味発光量ＬＸを、予め記憶した検量線と照らし合わせることにより、試料液中のエンドトキシン濃度を求める。

【0025】

以下、図３を参照しつつ、測定装置１００がエンドトキシン濃度を求める方法について詳述する。図３には、反応時間に応じた発光量の変化の一例を示した。
具体的には、試薬キット６が、ライセート試薬とペプチドにアミノルシフェリンが結合した発光合成基質とルシフェラーゼを含む場合の、エンドトキシン濃度が「０ＥＵ／ｍＬ」のブランク液のデータ（２つ）と、エンドトキシン濃度が「０．００５ＥＵ／ｍＬ」の試料液のデータの例を示している。

【0026】

図３において、横軸の「反応時間」の数値は、測定液４を収容した測定容器１を測定装置１００の測定室１０に格納して扉１２を閉めてからの時間であり、測定液４の調製後からの経過時間（以下「全反応時間」という。）よりやや小さい数値となっている。本データを取得した際の準備時間は約５秒であったので、反応時間２００秒の時の全反応時間は約２０５秒となる。
図３の縦軸は発光量である。

【0027】

第１の時間Ｔ１は試料液に代えてエンドトキシンを含まないブランク液を測定したときの発光量が最大値又は最大値近くとなり、かつ、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められない時間である。
第２の時間Ｔ２は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間である。

【0028】

ブランク液を測定したときの発光は、エンドトキシンによらない試薬キット自体によるバックグラウンド発光である。試薬キット自体のバックグラウンド発光は、例えば、発光合成基質に含まれる遊離の発光基質が発光酵素により発光することにより生じる。
本発明者らが確認したところ、バックグラウンド発光は、比較的短い反応時間で開始して急速に立ち上がり、最大値となった後は、緩やかに下降する傾向にあった。

【0029】

一方、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量は、ブランク液を測定したときの発光量が最大値となる時間前後までは、ブランク液を測定したときの発光量とほぼ同等に上昇し、その後、ブランク液を測定したときの発光量よりも大きくなり、その差は時間の経過と共に大きくなる傾向にあった。

【0030】

これは、エンドトキシンに基づく発光は、ライセート反応系が活性化してからでないと生じないため時間を要するためである。ブランク液を測定したときの発光量が最大値となる時間前後までは、実質的にエンドトキシンに基づく発光は生じておらず、バックグラウンド発光のみが観察されたものと考えられた。
そして、ライセート反応系の活性化とその後の反応が進み、エンドトキシンに基づく発光が生じてくると、バックグラウンド発光とエンドトキシンに基づく発光を合わせた発光が観察されたものと考えられた。

【0031】

なお、ブランク液を測定したときの発光量との差が時間の経過と共に大きくなるのは、ライセート反応系のエンドトキシンに基づく活性化が次々と進むため、発光基質を遊離可能な発光合成基質が充分な量存在していれば、ライセート反応系の活性化の進行に伴い、遊離のルシフェリンが増して行くためであると考えられる。

【0032】

以上のことから、試料液を測定したときの第２の時間Ｔ２における第２発光量Ｌ２に含まれるバックグラウンド発光の発光量を、その試料液を測定したときの第１の時間Ｔ１における第１発光量Ｌ１に基づき推定できることがわかった。
すなわち、第１発光量Ｌ１と第２発光量Ｌ２に基づき、エンドトキシンに基づく正味発光量ＬＸを求められることがわかった。

【0033】

正味発光量ＬＸは、以下の式（１）により、簡易に求めることができる。
ＬＸ＝Ｌ２－Ｌ１ ・・・（１）
また、ブランク液を測定したときの発光量が、第１の時間Ｔ１から第２の時間Ｔ２までの間に多少変化することを考慮すると、例えば、以下の式（２）により求めれば、より高い精度で正味発光量ＬＸを求めることができる。
ＬＸ＝Ｌ２－Ｌ１×ｋ ・・・（２）
ここで、ｋは定数であり、第２の時間Ｔ２におけるブランク液の発光量を、第１の時間Ｔ１におけるブランク液の発光量で除することにより求められる。

【0034】

第１の時間Ｔ１を決めるにあたり、ブランク液を測定したときの発光量が最大値となる時間は、図３に示すように、繰り返し測定により多少のばらつきが生じるが、図３の例では、概ね２００秒付近である。
第１の時間Ｔ１は、ブランク液を測定したときの発光量が最大値近くとなる時間であれば、最大値となる時間からずれていてもよい。

【0035】

ここで、最大値近くの発光量として、許容される発光量は、必要とされる測定精度等に応じて適宜設定できるが、最大値の５０％以上の発光量であることが好ましく、最大値の７５％以上の発光量であることがより好ましく、最大値の９０％以上の発光量であることがさらに好ましい。
図３の例では、反応時間１００～３００秒の間であれば、概ね最大値の９５％以上の発光量となっている。

【0036】

また、第１の時間Ｔ１は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められない時間とする必要がある。すなわち、試料液を測定する際に、エンドトキシンに基づく発光が実質的に生じない、又は無視できる程度である時間とする必要がある。

【0037】

図３の例では、エンドトキシン濃度が「０ＥＵ／ｍＬ」のブランク液のデータ（２つ）と、エンドトキシン濃度が「０．００５ＥＵ／ｍＬ」の試料液のデータとを比較した場合、反応時間３００秒のあたりから、発光量の差が生じ始めている。すなわち、反応時間３００秒のあたりから、ブランク液の発光量と、エンドトキシンを含む試料液のデータとの間に有意の差が認められ、エンドトキシンに基づく発光が実質的に生じ始めていると言える。

【0038】

ブランク液の発光量と、エンドトキシンを含む試料液のデータとの差がどの程度小さければ有意の差が認められないと言えるのかを決める閾値は、必要とされる測定精度等に応じて適宜設定できる。
測定装置１００のフルスケールに相当するエンドトキシンを含む試料液とブランク液のデータとを対比した際、上記閾値は、ブランク液を測定したときの最大値の０～５０％であることが好ましく、最大値の０～３０％である量であることがより好ましく、最大値の０～１０％であることがさらに好ましい。
第１の時間Ｔ１を決めるにあたって、上記閾値が好ましい範囲の下限値以上であれば、第１の時間Ｔ１選択の自由度が高まり、好ましい範囲の上限値以下であれば、試料液を測定した際のバックグラウンドの発光量の推定精度が高まる。

【0039】

第２の時間Ｔ２は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に有意の差が認められる時間とする必要がある。すなわち、試料液を測定する際に、エンドトキシンに基づく発光を確認できる時間とする必要がある。第２の時間Ｔ２は、エンドトキシンを含む試料液を測定したときの発光量と前記ブランク液を測定したときの発光量との間に充分な差が認められる時間とすることが好ましい。

【0040】

ブランク液の発光量と、エンドトキシンを含む試料液のデータとがどの程度差があれば、有意の差、好ましくは充分な差があると言えるのかを決める閾値は、必要とされる測定精度と測定効率等に応じて適宜設定できる。
測定装置１００のフルスケールに相当するエンドトキシンを含む試料液とブランク液のデータとを対比した際、上記閾値は、ブランク液を測定したときの最大値の５～１００％であることが好ましく、最大値の１０～１００％である量であることがより好ましく、最大値の２０～１００％であることがさらに好ましい。
第２の時間Ｔ２を決めるにあたって、上記閾値が好ましい範囲の下限値以上であれば、正味発光量ＬＸが充分に大きい値となり、測定精度が高まる。好ましい範囲の上限値以下であれば、エンドトキシン濃度を求めるまでの時間を短くすることができる。

【0041】

検量線は、試料液に代えて、既知濃度のエンドトキシンを含む校正液を用い、上記のようにして決定した第１の時間Ｔ１と第２の時間Ｔ２において第１発光量Ｌ１と第２発光量Ｌ２を測定し、上記式（１）、式（２）等により、正味発光量ＬＸを求める。そして、求めた正味発光量ＬＸと、その校正液のエンドトキシン濃度とを紐付けることにより、検量線が作成される。
検量線は、エンドトキシン濃度が異なる複数の校正液を用いて作成することが好ましい。検量線は、試薬のロット毎にメーカー等が作成し、測定者に提供してもよい。

【0042】

試料液を測定する際は、検量線を作成した際と同じ第１の時間Ｔ１と第２の時間Ｔ２において第１発光量Ｌ１と第２発光量Ｌ２を測定し、検量線を作成した際と同じ式（上記式（１）、式（２）等）により、正味発光量ＬＸを求める。そして、求めた正味発光量ＬＸを、予め記憶した検量線と照らし合わせることにより、試料液中のエンドトキシン濃度を求める。

【0043】

従来バックグラウンド発光の影響を排除するためには、試料液を測定した際の発光量から、ブランク液を試料液と同じ条件で測定した際の発光量を、差し引くことが行われていた。
しかし、本発明者らは、ブランク液を測定した際の試薬キット６の量が、試料液を測定した際の試薬キット６の量と異なると、ブランク液を試料液と同じ条件で測定した際の発光量が、試料液を測定した際のバックグラウンドの発光量と異なってしまうことに気がついた。

【0044】

すなわち、微量の試薬キット６を、総ての測定容器１に完全に同じ量で収容することは困難である。例えば、ブランク液を測定した際の試薬キット６の量が、試料液を測定した際の試薬キット６の量の１１０質量％であったとすると、バックグラウンドの発光量を１０％程度過大に評価してしまうことになることに気がついた。

【0045】

ブランク液を測定する際の試薬キット６の量と試料液を測定する際の試薬キット６の量の差の絶対値が同じでも、試薬キット６の量を少なくするほど、バックグラウンドの発光量に与える影響は無視できないものとなる。すなわち、試薬キット６の量を少なくする場合には、試料液を測定した際の発光量から、ブランク液を試料液と同じ条件で測定した際の発光量を差し引く従来方法では正確な測定ができないことがわかった。

【0046】

本発明によれば、測定容器１に収容された試薬キット６に試料液を入れて測定液４を調製し、まず、第１の時間Ｔ１でバックグラウンドの発光量を推定するためのデータを得、その後同じ測定液４について第２の時間Ｔ２でバックグラウンド発光とエンドトキシンに基づく発光を含む発光量のデータを得る。そのため、測定容器１に収容されている試薬キット６の量が多少変動しても、バックグラウンドの発光量を過大評価したり過小評価したりしてしまうことを回避できる。
したがって、精度良く、試料液のエンドトキシン濃度を測定することができる。

【0047】

なお、上記実施形態では、測定容器１に試薬キット６が予め収容されている例を示したが、試薬キット６が収容されていない測定容器１に測定者自身が各試薬を入れるようにしてもよい。その場合は、測定者による試薬の秤量誤差なども生じかねないが、本発明によれば、多少の秤量誤差があってもバックグラウンド発光の影響を正確に排除できる。

【0048】

以下に、本発明の測定方法を実施する際に使用する測定装置１００の一例について図４を用いて説明する。
図４の発光分析装置は、測定容器１を格納可能な測定室１０と測定室１０に収容された測定容器１内からの光を検出する光検出器２０と光検出器２０で検出した発光量が入力される演算装置３０とを備えている。

【0049】

測定室１０は、上端が開口部１１ａとされた有底筒状の測定室本体１１と、開口部１１ａを開閉可能に覆う扉１２とで構成されている。
測定室本体１１は、側面に設けられた光透過性の検出窓１１ｂの部分以外は遮光性とされている。また扉１２も遮光性とされている。

【0050】

扉１２を開状態（図１において、破線で示した扉１２の状態）とした際には、開口部１１ａから測定室本体１１内に測定容器１を出し入れできるようになっている。また、扉１２を閉状態（図１において、実線で示した扉１２の状態）とした際、測定室１０は、測定室１０内部への外光の侵入を遮断できるようになっている。

【0051】

光検出器２０としては、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタ、アバランシェフォトダイオードなどを適宜用いることができる。
本実施形態では、光検出器２０は、扉１２が閉状態のときのみ、光を検出するようになっている。例えば光検出器２０が光電子増倍管の場合、扉１２が閉状態のときのみ光検出器２０に電圧がかかるようになっている。

【0052】

扉１２が閉状態のときのみ光検出器２０が光を検出するようにする方法に特に限定はないが、例えば、扉１２自体をスイッチとし、測定室本体１１の開口部１１ａ周縁に扉１２の先端が接触することにより、光検出器２０に電圧を印加する回路を閉じるようにする方法が挙げられる。また、測定室本体１１の開口部１１ａ周縁に扉１２の先端が接触したことを感知する接触センサ等を用いてもよい。

【0053】

演算装置３０は、測定容器１が測定室１０に格納されたと判断した場合に、上記試料液中のエンドトキシン濃度を求める作業を行うことが好ましい。
これにより、測定容器１を測定室１０に格納するだけで自動的に演算装置３０に試料液中のエンドトキシン濃度を求める作業を開始させることができる。

【0054】

演算装置３０は、例えば、扉１２が開状態となり、次いで閉状態となった際に、光検出器２０が試薬キット６自体のバックグラウンド発光を検出できるか否かにより測定容器１が測定室１０に格納されたか否かを判断することができる。
このバックグラウンド発光を検出できたか否かの判断は、具体的には、光検出器２０が検出した発光量が、所定のしきい値以上であるか否かにより行う。
しきい値は、試薬キット６自体のバックグラウンド発光が生じていると明確に判断できる発光量とする。

【0055】

なお、測定容器１自体からもごく僅かな自然発光が生じうるが、そのような自然発光の発光量、またはその発光量に近い発光量をしきい値とすることは行わない。測定容器１自体から発せられる自然発光のように、極僅かな発光量をしきい値とすると、極めて高い感度の光検出器２０を用意せざるを得ず、かつ、バックグラウンド発光の有無の判断を精度良く行うことが困難となるからである。

【0056】

試薬キット６自体のバックグラウンド発光の発光量は、ブランク液として、測定対象成分を含まない試料液を用い、このブランク液と試薬キット６を含む測定液４の発光量を測定することにより確認することができる。
しきい値は、試薬キット６自体のバックグラウンド発光の発光量の１０～１００％とすることが好ましく、３０～７０％とすることがより好ましく、例えば５０％程度とすることができる。

【0057】

光検出器２０の感度を確認する場合は、測定液４における試料液として測定対象成分を含まないブランク液を用いる。そして、操作者は、そのブランク液を含む測定液４を収容した測定容器１を測定室１０に格納して、感度確認を指示する入力動作を行う。
すると、演算装置３０は、光検出器２０で検出した発光量を、予め記憶した検量線の測定対象成分濃度ゼロにおける発光量と対比して、光検出器２０の感度変化を確認する。

【0058】

ここで、予め記憶した検量線の測定対象成分濃度ゼロにおける発光量（以下「ゼロ基準発光量」という場合がある。）は、試薬キット６自体のバックグラウンド発光に相当する。試薬キット６自体のバックグラウンド発光は、例えば、発光合成基質に含まれる遊離の発光基質が発光酵素により発光することにより生じる。

【0059】

演算装置３０は、光検出器２０で検出した発光量とゼロ基準発光量とを対比する。対比は、例えば、ゼロ基準発光量に対する光検出器２０で検出した発光量の比を求めたり、両者の差を求めたりすることにより行う。

【0060】

演算装置３０は、ゼロ基準発光量に対する光検出器２０で検出した発光量の比を求める場合、求めた比が予め定めた所定範囲の比に満たない場合又は超えた場合、光検出器２０の感度が所定の許容範囲を超えて変動したと判断する。
また、両者の差を求める場合は、求めた差が予め定めた所定範囲の差を超えた場合、光検出器２０の感度が所定の許容範囲を超えて変動したと判断する。
所定の範囲は求められる測定精度等に応じて適宜設定して演算装置３０に記憶させればよい。

【0061】

演算装置３０が、光検出器２０の感度が所定の許容範囲を超えて変動したことを確認した場合は、警報の出力等により、操作者に、光検出器２０の感度調整や交換等の対処を行わせることができる。
光検出器２０の感度調整は、光検出器２０が光電子増倍管である場合、光検出器２０に印加する電圧を変更することにより調整できる。

【0062】

演算装置３０が、測定容器１が測定室１０に格納されたか否かを判断するために、又は光検出器２０の感度を確認するために、試薬キット６に、発光物質を含ませておくことも好ましい。
発光物質は、測定対象成分が存在しない状況下において、試薬キット６に含まれる発光酵素により発光する物質、又はそれ自体が発光する物質であり、複数の試薬で構成された試薬群であってもよい。

【0063】

発光物質が発する光の波長領域は、エンドトキシンが試薬キット６に含まれる他の成分に作用して発する光の波長領域と同等であることが好ましく、同じであることがより好ましい。これにより、試料液としてブランク液を用いた場合に光検出器２０で検出する発光量を増すことができる。

【0064】

測定対象成分が存在しない状況下において、試薬キット６に含まれる発光酵素により発光する物質としては、試薬キット６中に含まれる発光酵素により発光する発光基質、例えば、発光酵素がホタルルシフェラーゼの場合はルシフェリン等が挙げられる。
それ自体が発光する物質としては、試薬キット６中に含まれる発光酵素とは別の発光酵素とその別の発光酵素により発光する発光基質との組み合わせ、例えば、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせ、ウミシイタケルシフェラーゼとセレンテラジンとの組み合わせ等が挙げられる。

【0065】

発光物質が試薬キット６中に含まれる発光酵素によって発光する発光基質である場合、試薬キット６に含まれる発光合成基質から遊離される発光基質と同等の波長領域の光を発する発光基質が好ましく、試薬キット６に含まれる発光合成基質から遊離される発光基質と同じ発光基質であることが特に好ましい。
例えば、試薬キット６がアミノルシフェリンを遊離する発光合成基質を含み、発光酵素としてルシフェラーゼを含む場合の発光物質としては、アミノルシフェリンを使用することが好ましい。

【0066】

発光物質が試薬キット６中に含まれる発光酵素とは別の発光酵素とその別の発光酵素により発光する発光基質との組み合わせである場合、この組み合わせによって、試薬キット６に含まれる発光合成基質から遊離される発光基質と同等の波長領域の光を発することが好ましい。
例えば、試薬キット６がアミノルシフェリンを遊離する発光合成基質を含み、発光酵素としてルシフェラーゼを使用する場合の発光物質としては、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせとすることが好ましい。

【0067】

試薬キット６が発光物質を含む場合のバックグラウンド発光は、発光物質を含まない場合のバックグラウンド発光と比較して、発光量が大きくなる。そのため、測定容器１が測定室１０に格納されたか否かの判断と光検出器２０の感度確認を、より行いやすくなる。

【符号の説明】

【0068】

１ 測定容器
２ 容器本体
３ 蓋
４ 測定液
５ マイクロピペット
６ 試薬キット
１０ 測定室
１２ 扉
１００ 測定装置
Ｔ１ 第１の時間
Ｔ２ 第２の時間
Ｌ１ 第１発光量
Ｌ２ 第２発光量
ＬＸ 正味発光量

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】