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特許7324213防御性干渉性核酸分子、ならびに該核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、ならびに防御性干渉性核酸を含有する薬学的組成物およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-01
(45)【発行日】2023-08-09
(54)【発明の名称】防御性干渉性核酸分子、ならびに該核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、ならびに防御性干渉性核酸を含有する薬学的組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/44 20060101AFI20230802BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230802BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230802BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230802BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230802BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230802BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20230802BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230802BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230802BHJP
【ＦＩ】
C12N15/44 ZNA
C12N15/86 Z
C12N5/10
C12N7/01
A61P31/16
A61K35/76
A61K39/145
A61K31/7088
A61K48/00
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2020545780
(86)(22)【出願日】2019-03-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-07-08
(86)【国際出願番号】 EP2019055359
(87)【国際公開番号】W WO2019170625
(87)【国際公開日】2019-09-12
【審査請求日】2021-12-27
(31)【優先権主張番号】18159908.5
(32)【優先日】2018-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】598165611
【氏名又は名称】マックス－プランク－ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【氏名又は名称】中西 基晴
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ライヒル，ウド
(72)【発明者】
【氏名】クプケ，サッシャ
(72)【発明者】
【氏名】フレンジング，ティモ
(72)【発明者】
【氏名】ズモラ，パベウ
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】Journal of Virology，1994年，Vol.68, No.1，p.530-534
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／４４
Ｃ１２Ｎ １５／８６
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ７／０１
Ａ６１Ｐ ３１／１６
Ａ６１Ｋ ３５／７６
Ａ６１Ｋ ３９／１４５
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｋ ４８／００
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を含有する配列番号２；ｂ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を有し、配列番号２の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）配列ａ）またはｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；または
ｄ）配列ａ）、ｂ）、またはｃ）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡ
を含む単離核酸分子。
【請求項2】
ａ）配列番号３；ｂ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１８Ｇ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ,Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｃ５３５Ｔ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を有し、配列番号３の配列と９８％より高い同一性を有する核酸配列；
ｃ）配列ａ）またはｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｄ）配列ａ）、ｂ）、またはｃ）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡ
を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項3】
少なくともＣ３ＴおよびＧ８Ａでの置換基が存在する、請求項１または２記載の単離核酸分子。
【請求項4】
ＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に請求するような単離核酸分子。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項記載の単離核酸分子を含む組成物。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクターまたはプラスミド。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子。
【請求項8】
前記ウイルス様粒子または前記ウイルスベクターが、インフルエンザウイルスに対応するか、あるいは前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルスである、請求項７記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子。
【請求項9】
前記ウイルス様粒子または前記ウイルスベクターが、インフルエンザＡウイルスに対応するか、あるいは前記ウイルス粒子が、インフルエンザＡウイルスである、請求項８記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子を含有し、そして過去の感染シーズンおよび／または現在の感染シーズンで活性であるインフルエンザウイルスのＨＡまたはＮＡを有する、請求項７～９のいずれか一項記載のウイルス様粒子またはウイルスベクター。
【請求項11】
薬剤として使用するための、またはウイルス感染の治療において使用するための、請求項７～１０のいずれか一項記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子。
【請求項12】
請求項６記載の核酸ベクターまたはプラスミド、あるいは請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子を含有する、宿主細胞。
【請求項13】
請求項７～１０のいずれか一項記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子、請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子、請求項５記載の組成物、請求項６記載のベクターまたはプラスミド、ならびに／あるいは請求項１２記載の宿主細胞を含有する、薬学的組成物。
【請求項14】
療法的または予防的ワクチンとして使用するための、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項15】
ウイルス感染の治療において使用するための、請求項１３または１４記載の薬学的組成物。
【請求項16】
前記ウイルス感染が病原性インフルエンザウイルスによって引き起こされる、ウイルス感染の治療において使用するための、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項17】
動物またはヒトである個体に投与するために適応された、請求項１３～１６のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項18】
粘膜投与のための薬学的組成物である、請求項１３～１７のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項19】
鼻内投与のための、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項20】
インフルエンザＡウイルスに対する療法的または予防的ワクチンとして使用するための；あるいはインフルエンザＡウイルス感染を治療するための、請求項１３～１８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項21】
請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子、請求項５記載の組成物、請求項６記載のベクターまたはプラスミド、ならびに／あるいは請求項７～１０のいずれか一項記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子を含有する、ウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチン。
【請求項22】
インフルエンザウイルス感染に対するワクチン接種のための、請求項２１記載のウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチン。
【請求項23】
インフルエンザＡウイルス感染に対するワクチン接種のための、請求項２２記載のワクチン。
【請求項24】
個体における免疫防御を送達する際に使用するための、請求項１３～２０のいずれか一項記載の薬学的組成物、請求項２１～２３のいずれか一項記載のワクチン、ならびに／あるいは請求項７～１０のいずれか一項記載のウイルス様粒子またはウイルスベクター。
【請求項25】
ウイルス感染に対して治療するかまたは防御する際に使用するための、請求項７～１０のいずれか一項記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子、あるいは請求項１～４のいずれか一項記載の核酸分子、請求項５記載の組成物、あるいは請求項６記載のベクターまたはプラスミド、あるいは請求項１２記載の宿主細胞、ならびに野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子を含む、組成物またはキット。
【請求項26】
前記野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子は、インフルエンザウイルスベクターまたはウイルス粒子である、請求項２５記載の組成物またはキット。
【請求項27】
前記野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子は、インフルエンザＡウイルスベクターまたはインフルエンザＡウイルス粒子である、請求項２６記載の組成物またはキット。
【請求項28】
請求項７～１１のいずれか一項記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子であって、感染後、ｉ）産生されるウイルス粒子の総数の減少、ｉｉ）産生される感染性ウイルスの割合の大きな減少、ｉｉｉ）ｐｉＲＮＡとは異なるすべての残りのゲノムセグメントの複製が減少する中での、ｐｉＲＮＡの正常な細胞内複製、ｉｖ）他のゲノムセグメントに比較した、ｐｉＲＮＡ由来のｍＲＮＡの転写の増加、ｖ）ｐｉＲＮＡ由来のｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の数の増進、ｖｉ）該タンパク質の細胞内輸送の攪乱であって、したがってウイルス核タンパク質の細胞内輸送の攪乱につながる前記攪乱、ｖｉｉ）他のゲノムセグメントの取り込みが減少する中での、野生型ウイルスのすべてのゲノムセグメントに比較した、ウイルス粒子内へのｐｉＲＮＡの正常な取り込み、およびｖｉｉｉ）インターフェロンβ発現によって発現される生得的免疫反応のより強い誘導が観察可能であることの少なくとも１つを示す、前記ウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
第一の側面において、本発明は、単離核酸分子、特に特定の置換を含有するＲＮＡ分子に関する。さらなる側面において、本発明は、該核酸分子を含む組成物、ならびに本発明記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子に関する。該ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、ウイルス感染を治療するための抗ウイルス剤として使用するために適している。さらに、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子あるいは核酸分子を含有する、薬学的予防ワクチンとしての使用に特に適した薬学的組成物を提供する。最後に、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチン、ならびに野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子と組み合わせた、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の核酸分子を含む、組成物またはキットであって、ウイルス感染に対して治療するかまたは防御する際に使用するために適している、前記組成物またはキットを提供する。
【発明の概要】
【0002】
オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）は、脊椎動物に感染するＲＮＡウイルスの科である。とりわけ、インフルエンザウイルスは、この科のメンバーである。インフルエンザは、発熱、咳、および重度の筋肉痛によって特徴づけられる呼吸器系のウイルス感染である。インフルエンザウイルスの３つの属、すなわちインフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣが存在し、これらは、核タンパク質およびマトリックスタンパク質の抗原性相違によって区別される。ウイルス性インフルエンザＡおよびインフルエンザＢは、一本鎖マイナスセンスＲＮＡの８つのセグメントを有し、インフルエンザＣウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の７つのセグメントを含有する。
【0003】
ヒトインフルエンザの主要原因病原体はＡ型ウイルスである。ウイルスゲノムは、９つの構造タンパク質および２つの非構造タンパク質をコードする、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）セグメントからなる。とりわけ、セグメント７は２つのマトリックスタンパク質、すなわちＭ１およびＭ２をコードする。これらの２つのマトリックスタンパク質は、重複するコード配列を伴う。
【0004】
ヒトインフルエンザウイルスＡおよびＢはどちらも人の季節性疾患に関与するが、インフルエンザＡウイルスのみが世界的なパンデミックを引き起こす。ヒトウイルスにおいて、多様な別個の赤血球凝集素、すなわちＨ１、Ｈ２およびＨ３ならびにいくつかの別個のノイラミニダーゼ、すなわちＮ１およびＮ２が同定されてきている。これらは、ウイルスの分類に用いられる。タンパク質において抗原シフトと称される連続シフトがあり、したがって、ヒト免疫系から逃れることが可能になる。
【0005】
インフルエンザ感染は、それを引き起こした株に対する強い免疫反応を誘発するが、抗原シフトによる新規株が、以前感染していた個体を離れる速度が速いため、個体は新規感染に感受性になる。インフルエンザワクチンは、長年、商業的に入手可能であり、これには不活性化および生ワクチン、ならびに組換えウイルス様粒子およびウイルス粒子が含まれる。不活性化ウイルス粒子を含有するワクチンもあるが、より一般的に、精製されたＨＡおよびＮＡ構成要素が存在する。典型的には、インフルエンザワクチンの設計は、前シーズンの感染を引き起こした主要なインフルエンザウイルス株に基づく。しかし、抗原ドリフト現象のため、存在するワクチンの基礎として用いられるインフルエンザ株は、ＷＨＯによって年ごとに再評価され、そして変化させなければならない可能性もある。しかし、実際の感染性インフルエンザ株およびワクチンの構成要素の間のタイムラグが常にある。
【0006】
インフルエンザに対する他の防御線には抗ウイルス薬剤が含まれる。これらの抗ウイルス薬剤が作用する、多様な機構が知られる。例えば、アマンタジンおよびリマンタジンは、マトリックスタンパク質の作用を阻害し、こうしてウイルスＲＮＡが細胞質ゾル内に進入することを阻害する。さらに、リレンザ（登録商標）およびタミフル（登録商標）としてもまた知られるザナミビルおよびオセルタミビルが抗ウイルス薬剤として用いられる。これらの薬剤は、ノイラミニダーゼを遮断し、こうして感染細胞からの子孫ビリオンの放出および感染の蔓延を阻害する。
【0007】
しかし、これらの抗ウイルス薬剤に対して耐性であるウイルスもまた、インフルエンザ患者において、よりしばしば見出されてきている。
ＤＩウイルスとも称される欠損性干渉性ウイルスの存在は、１９４０年代から知られている。欠損性干渉性ウイルスは、非欠損性ウイルスの正常な複製および感染サイクルを破壊する。典型的には、ウイルス集団は、前記欠損性干渉性ウイルス粒子ならびに正常ウイルス粒子の混合物を含有する。欠損性ウイルス粒子は、例えば内部欠失を生じる、ＲＮＡセグメントにおける自発的突然変異のために生じる。ＤＩウイルスは非感染性ウイルスであり、そして完全なゲノムを持つウイルスに感染している細胞に、ＤＩウイルスのゲノムが存在する場合にのみ複製する。ＤＩウイルスは、細胞内で感染性ウイルスに干渉する能力を有し、したがって、該ウイルスは、感染性ウイルスの増殖を特異的に阻害することが可能である。以下において、ＤＩウイルスはまた、欠損性干渉性粒子（ＤＩＰ）とも称される。
ＤＩウイルスとも称される欠損性干渉性ウイルスの存在は、１９４０年代から知られている。欠損性干渉性ウイルスは、非欠損性ウイルスの正常な複製および感染サイクルを破壊する。典型的には、ウイルス集団は、前記欠損性干渉性ウイルス粒子ならびに正常ウイルス粒子の混合物を含有する。欠損性ウイルス粒子は、例えば内部欠失を生じる、ＲＮＡセグメントにおける自発的突然変異のために生じる。ＤＩウイルスは非感染性ウイルスであり、そして完全なゲノムを持つウイルスに感染している細胞に、ＤＩウイルスのゲノムが存在する場合にのみ複製する。ＤＩウイルスは、細胞内で感染性ウイルスに干渉する能力を有し、したがって、該ウイルスは、感染性ウイルスの増殖を特異的に阻害することが可能である。以下において、ＤＩウイルスはまた、欠損性干渉性粒子（ＤＩＰ）とも称される。
【0008】
ＤＩＰはウイルス起源であり、そして相同性標準ウイルス（ＳＴＶ）と同じ構造的特徴を共有するが、典型的には、ウイルスゲノムの欠失型を含有する（ＨｕａｎｇおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ， １９７０， Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２２６， ３２５－３２８）。ゲノム情報が失われた結果、ＤＩＰはウイルス複製不全であり、そしてしたがって、細胞に感染すると、子孫ビリオンの産生を生じることができない。しかし、完全に感染性であるＳＴＶとの同時感染によって補完されると、正常ウイルス生活環への干渉が観察可能となり、これにはＳＴＶ複製抑制および主に非感染性ＤＩＰの放出が伴う。この感染の結果、全長（ＦＬ）対応物に勝る欠損性干渉性（ＤＩ）ゲノムの増殖上の利点が生じ、これは、ゲノム複製の増進、細胞性またはウイルス性資源に関する勝利およびウイルス粒子への優先的なパッケージングによって明らかとなる（Ｍａｒｒｉｏｔｔ ａｎｄ Ｄｉｍｍｏｃｋ， ２０１０）。興味深いことに、ＤＩＰがウイルス複製を抑制する能力を考慮すると、抗ウイルス剤として使用するため、ＤＩＰの臨床適用への関心が大きくなりつつあると現在認識されうる（ＤｉｍｍｏｃｋおよびＥａｓｔｏｎ、２０１５、以下を参照されたい）。
【0009】
ＤＩＰは、一本鎖および二本鎖ゲノムを含有するウイルスを含めて、大部分のＤＮＡおよびＲＮＡウイルスに関して観察された。内部ゲノム欠失は、ゲノム複製中のウイルスポリメラーゼの誤った転位置によって生じると示唆され、これはしばしば「コピー選択」機構と称される。他のＤＩゲノムには、多重欠失型、「コピーバック」または「ヘアピン」ゲノム（ある部分が逆相補体型で反復される）および「モザイク」ゲノム（多数の非隣接部分がともに連結される）が含まれる。干渉の正確な機構はまだ完全には理解されていない。しかし、ＤＩゲノムがヘルパーウイルスをコードする遺伝子産物、特にウイルスポリメラーゼと競合すると示唆された。さらに、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）に関して、ＦＬ対応物に勝るＤＩゲノムの優先的な合成が観察された。この背景において、ＤＩゲノムの長さが減少しているため、ＤＩゲノムはより迅速な集積を示すと提唱された。さらに、ＩＡＶのＤＩゲノムは、特にそのＦＬ親ゲノムウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のパッケージングを競合的に阻害し、そしてさらに、子孫ビリオン内に優先的に取り込まれた。
【0010】
これまでに、ＤＩゲノムは主に、そのゲノム欠失に基づいて同定され、そして潜在的なヌクレオチド置換に対してはほとんど注意が払われなかった。したがって、ＤＩウイルスはまた、感染性ウイルスに対するワクチンを開発する焦点ともなる。例えば、ＥＰ２０１９６８５ Ａは、特異的ＲＮＡセグメント１配列を有する、クローニングされたヒトＤＩインフルエンザＡウイルスである、欠損性干渉性ウイルスを記載する。さらに、クローニングされた欠損性干渉性インフルエンザＲＮＡおよび呼吸器ウイルス疾患のありうる汎特異的（ｐａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）治療としての使用が、Ｄｉｍｍｏｃｋ Ｍ．Ｊ．およびＥａｓｔｏｎ Ａ．Ｊ．， Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１５， ７， ３７６８－３７８８に記載されている。該文献に記載されるインフルエンザＡ由来ＤＩゲノムは、２つの異なる機構によって防御を可能にすると主張される。第一に、インフルエンザＡ複製への分子干渉、そして第二に、非インフルエンザＡウイルスに対して作用する自然免疫の刺激による。典型的には、ＤＩウイルスは、ポリメラーゼタンパク質をコードするセグメント１、セグメント２、またはセグメント３の欠損性および干渉性インフルエンザＲＮＡを含有する。
【0011】
発明が解決しようとする課題
抗ウイルス薬剤での治療は、感染後まもなく治療を開始する必要があるため、限定される。さらに、抗ウイルス薬剤に対する耐性は迅速に生じる。さらに、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたは単一構成要素、特にＨＡおよびＮＡ構成要素を含むワクチンは、典型的にはＷＨＯからの毎年の予測に基づく（来たるインフルエンザシーズン中に人々の間に蔓延し、そして疾病を引き起こす可能性が最も高い株）。当該技術分野に記載されるＤＩ（ＤＩＰ）ウイルスは、インフルエンザワクチン接種において成功を示してきていない。したがって、ウイルス感染、特にインフルエンザＡと闘う新規手段が喫緊に必要である。
抗ウイルス薬剤での治療は、感染後まもなく治療を開始する必要があるため、限定される。さらに、抗ウイルス薬剤に対する耐性は迅速に生じる。さらに、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたは単一構成要素、特にＨＡおよびＮＡ構成要素を含むワクチンは、典型的にはＷＨＯからの毎年の予測に基づく（来たるインフルエンザシーズン中に人々の間に蔓延し、そして疾病を引き起こす可能性が最も高い株）。当該技術分野に記載されるＤＩ（ＤＩＰ）ウイルスは、インフルエンザワクチン接種において成功を示してきていない。したがって、ウイルス感染、特にインフルエンザＡと闘う新規手段が喫緊に必要である。
【課題を解決するための手段】
【0012】
第一の側面において、本発明は、
ａ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を含有する配列番号２；
ｂ）配列番号２の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
を含む単離核酸分子を提供する。
ａ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を含有する配列番号２；
ｂ）配列番号２の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
を含む単離核酸分子を提供する。
【0013】
１つの態様において、単離核酸配列は、配列番号２または配列番号３、あるいはその機能的断片を有する配列である。
さらなる側面において、本発明記載の単離核酸分子を含む組成物を提供する。さらに、本発明記載の核酸分子を含むベクターまたはプラスミドを開示する。
さらなる側面において、本発明記載の単離核酸分子を含む組成物を提供する。さらに、本発明記載の核酸分子を含むベクターまたはプラスミドを開示する。
【0014】
別の側面において、本発明記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子であって、特に、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスに由来するウイルス様粒子またはウイルスベクター、またはインフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡウイルス由来のウイルス粒子である、前記ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子を開示する。
【0015】
このウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、例えばウイルス感染の治療における薬剤として有用である。
さらに、本発明記載の核酸ベクターまたはプラスミド、あるいは本発明記載の核酸分子を含有する宿主細胞を記載する。
さらに、本発明記載の核酸ベクターまたはプラスミド、あるいは本発明記載の核酸分子を含有する宿主細胞を記載する。
【0016】
さらに、療法的または予防的ワクチンとして特に有用である薬学的組成物を同定する。
さらなる側面において、ウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチンを開示する。最後に、例えばウイルス感染に対して治療するかまたは防御する際に使用するための、野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子、特にインフルエンザウイルスベクターまたはインフルエンザウイルス粒子、例えばインフルエンザＡウイルスベクターまたはインフルエンザＡウイルス粒子と組み合わせた、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、あるいは本発明記載のベクターまたはプラスミド、あるいは本発明記載の宿主細胞を含む、組成物またはキットを開示する。
さらなる側面において、ウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチンを開示する。最後に、例えばウイルス感染に対して治療するかまたは防御する際に使用するための、野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子、特にインフルエンザウイルスベクターまたはインフルエンザウイルス粒子、例えばインフルエンザＡウイルスベクターまたはインフルエンザＡウイルス粒子と組み合わせた、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、あるいは本発明記載のベクターまたはプラスミド、あるいは本発明記載の宿主細胞を含む、組成物またはキットを開示する。
【0017】
本発明は、以下に記載するような野生型ウイルスの表現型とは異なる表現型で特徴づけられる、いわゆる防御性干渉性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）の同定に基づく。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】Ｓ７－ＯＰ７ ｖＲＮＡの機能性領域における改変。ヌクレオチドおよびａａ位を、それぞれ黒い数字で示す。３５の限定されたｎｔ突然変異を示す。
【図2】ＯＰ７シードウイルスでのＩＡＶ感染細胞の同時感染。１０のＭＯＩで野生型（ＷＴ）ウイルスに感染した細胞を、示すＭＯＩでＯＰ７シードウイルスに同時感染させた。１２ｈｐｉ（感染後の時間）で、ＴＣＩＤ５０アッセイによって、感染性ウイルス力価を定量化し、そしてリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって、細胞内およびビリオン由来の精製ｖＲＮＡを定量化した。データを用い、ＨＡ力価から得られるウイルス粒子濃度を用いて、感染性ウイルスの割合およびビリオンあたりのｖＲＮＡの数を計算した。ビリオンあたりのｖＲＮＡの標準化は、（参照としての）ＰＲ８－ＲＫＩウイルスに基づいた。各々、１つのＯＰ７シードウイルスを用いて、独立の実験を行った。（Ａ）ＭＤＣＫ細胞におけるＩＡＶ複製への異なるＯＰ７シードウイルスの干渉。（ＢおよびＣ）ＯＰ７シードウイルスでの、ＰＲ８－ＲＫＩ感染ヒトＨＥＫ２９３（Ｂ）およびＡ５４９（Ｃ）細胞株の同時感染。（ＤおよびＥ）ＭＤＣＫ細胞におけるＨ１Ｎ１－ｐｄｍ０９（Ｄ）およびＨ３Ｎ２（Ｅ）ウイルス複製へのＯＰ７ウイルスの干渉。（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）に関して、１つの代表的な実験の結果を示す。
【図3】Ｓ７－ＯＰ７ ｖＲＮＡの機能性領域における改変。ヌクレオチドおよびａａ位を、それぞれ黒い数字で示す。すべての３７ｎｔ突然変異（参照配列、すなわち配列番号１に関して）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
第一の側面において、本発明は、
ａ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を含有する配列番号２；
ｂ）配列番号２の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
を含む単離核酸分子を提供する。
ａ）配列番号１の野生型配列に比較して、以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換を含有する配列番号２；
ｂ）配列番号２の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
を含む単離核酸分子を提供する。
【0020】
本発明の１つの側面において、請求項１記載の核酸分子は、
ａ）配列番号３；あるいは
ｂ）配列番号３の配列と９８％より高い同一性を有する核酸配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
を含む。
ａ）配列番号３；あるいは
ｂ）配列番号３の配列と９８％より高い同一性を有する核酸配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
を含む。
【0021】
すなわち、本発明記載の単離核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子での感染は、ｉ）産生されるウイルス粒子の総数の減少が決定可能であり、ｉｉ）産生される感染性ウイルスの割合（パーセンテージ）の大きな減少、ｉｉｉ）ｐｉＲＮＡとは異なるすべての残りのゲノムセグメントの複製が減少する一方で、ｐｉＲＮＡの正常な細胞内複製、ｉｖ）他のゲノムセグメントに比較した、ｐｉＲＮＡ由来のｍＲＮＡの転写の増加、その結果のｖ）ｐｉＲＮＡ由来のｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の数の増進、ｖｉ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の細胞内輸送の妨害を導く、ｐｉＲＮＡから翻訳されたタンパク質の細胞内輸送の攪乱、ｖｉｉ）他のゲノムセグメントの取り込みが減少する一方で、野生型ウイルスのすべてのゲノムセグメントに比較した、ウイルス粒子へのｐｉＲＮＡの正常な取り込みが起こり、そして最後に、ｖｉｉｉ）インターフェロンβ発現によって発現される自然免疫反応のより強い誘導が観察可能である、野生型ウイルスに比較した異常な表現型を示す。したがって、本発明記載の単離核酸分子、特にｐｉＲＮＡの形の該分子は、それ自体の複製および蔓延を支持しながら、インフルエンザＡウイルス複製に対する強い阻害効果を示して、ウイルス構成要素の産生を減少させる。
【0022】
本発明の１つの態様において、配列番号１の野生型配列に比較して、本明細書に記載する３５または３７の突然変異に加えて、配列番号２または配列番号３の配列に９８％同一性、例えば９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．８％同一性を有する、核酸分子を提供する。
【0023】
本発明の１つの態様において、本発明記載の単離核酸配列は、配列番号２または３を有する単離核酸配列あるいはその機能性断片である。本発明の１つの態様において、本発明記載の単離核酸配列は、配列番号２の３５の置換、ならびにさらに置換Ａ１８ＧおよびＣ５３５Ｔを含有する、配列番号３を有する単離核酸配列である。
【0024】
本明細書に示すように、配列番号２ならびに配列番号３記載の核酸配列は、上記の異常な表現型を有する。
１つの態様において、本発明記載の核酸分子は、例えば配列番号３に示すように、置換Ａ１８ＧおよびＣ５３５Ｔをさらに含有する。
１つの態様において、本発明記載の核酸分子は、例えば配列番号３に示すように、置換Ａ１８ＧおよびＣ５３５Ｔをさらに含有する。
【0025】
さらに、本明細書において、
ａ）以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換の少なくとも２０の置換を含有する配列番号１；
ｂ）ａ）に定義するような置換基の少なくとも１つを含有しない配列番号１の残りの配列内で、９０％より高い、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
あるいは、該核酸分子を含有するウイルス粒子の複製に関して同じ機能を有する、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の断片であって、
それによって少なくともＣ３ＴおよびＧ８Ａでの置換が存在する
前記配列
を含む核酸分子を記載する。
ａ）以下のＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換の少なくとも２０の置換を含有する配列番号１；
ｂ）ａ）に定義するような置換基の少なくとも１つを含有しない配列番号１の残りの配列内で、９０％より高い、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ストリンジェントな条件下で、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）配列ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；あるいは
ｅ）配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれか１つに由来するｍＲＮＡ
あるいは、該核酸分子を含有するウイルス粒子の複製に関して同じ機能を有する、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の断片であって、
それによって少なくともＣ３ＴおよびＧ８Ａでの置換が存在する
前記配列
を含む核酸分子を記載する。
【0026】
用語「あるいは、該核酸分子を含有するウイルス粒子の複製に関して同じ機能を有する、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の断片」は、配列番号２または配列番号３の核酸に関して記載するのと同じ効果を有する断片を指す。
【0027】
さらに、用語「またはその機能性断片」は、配列番号２または配列番号３の核酸分子に関して記載するのと同じ効果を有する核酸分子を指す。
本発明者らは、本発明記載の単離核酸分子、特に、配列番号１がＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換の少なくとも２５、少なくとも３０またはすべての置換を含有する本発明記載の単離核酸分子が、インフルエンザ感染に対する防御を示し、それによって少なくともＣ３ＴおよびＧ８Ａでの置換が存在することを認識した。
本発明者らは、本発明記載の単離核酸分子、特に、配列番号１がＣ３Ｔ、Ｇ４Ａ、Ｇ８Ａ、Ａ１００Ｇ、Ｇ１１３Ａ、Ｇ１３０Ａ、Ｇ２４０Ａ、Ａ２４１Ｇ、Ｃ３３４Ｔ、Ｃ３５３Ｔ、Ｃ３６１Ｔ、Ｃ３７０Ａ、Ｔ３７１Ｇ、Ｔ３８５Ｃ、Ａ４０１Ｔ、Ｇ４３４Ａ、Ｃ４４２Ｔ、Ａ４４３Ｇ、Ｃ４５３Ｔ、Ａ４５４Ｇ、Ａ５２４Ｇ、Ｔ６４３Ｇ、Ｇ６４５Ｔ、Ａ６４８Ｇ、Ａ６６７Ｇ、Ｇ６７０Ａ、Ａ７１６Ｇ、Ｃ７９３Ｔ、Ｇ８０１Ｔ、Ａ８０５Ｇ、Ｇ８７４Ｔ、Ａ８８７Ｔ、Ｃ８８８Ｔ、Ｇ８９４Ａ、Ｇ９４３Ａの置換の少なくとも２５、少なくとも３０またはすべての置換を含有する本発明記載の単離核酸分子が、インフルエンザ感染に対する防御を示し、それによって少なくともＣ３ＴおよびＧ８Ａでの置換が存在することを認識した。
【0028】
本発明の１つの態様において、核酸分子はＲＮＡの形であり、特に本発明記載の単離核酸分子は、インフルエンザＡのゲノムセグメント７に由来する防御性干渉性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）に相当する。上述のような配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２０１６．１の配列を指す。
【0029】
ヌクレオチド配列は、配列番号２の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列であってもよく、例えば核酸分子は、配列番号３の配列内で９８％より高い同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、配列番号２と、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％より高い同一性を有してもよい。さらに、ヌクレオチド配列は、配列番号３と、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％より高い同一性を有してもよい。
【0030】
本発明記載の単離核酸配列を、細胞培養を含む生物学的系から得てもよいし、あるいは化学的に合成してもよい。
さらなる側面において、本発明は、本発明のいずれか１つ記載の単離核酸分子を含む組成物に関し、該組成物は、送達構成要素と組み合わせた、例えばリポソーム、エキソソーム、または他のナノ粒子の形の単離核酸分子を含有してもよい。当業者は、適切な形の、例えば被験体内に送達するための、本発明記載の単離核酸分子を含有する適切な組成物の提供をよく知っている。
さらなる側面において、本発明は、本発明のいずれか１つ記載の単離核酸分子を含む組成物に関し、該組成物は、送達構成要素と組み合わせた、例えばリポソーム、エキソソーム、または他のナノ粒子の形の単離核酸分子を含有してもよい。当業者は、適切な形の、例えば被験体内に送達するための、本発明記載の単離核酸分子を含有する適切な組成物の提供をよく知っている。
【0031】
前記組成物は、ｐｉＲＮＡの分解に対する防御を可能にする、いわゆるｖＲＮＰ複合体（ウイルスリボ核タンパク質複合体）の他の構成要素、すなわちＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡおよびＮＰのようなさらなるウイルスタンパク質をさらに含有してもよい。
【0032】
さらなる側面において、本発明記載の核酸分子を含むベクターまたはプラスミドを提供する。ベクターまたはプラスミドは、宿主内への本発明記載の核酸分子の導入を可能にするために、または単離核酸分子の増殖のために適した、任意のタイプのベクターまたはプラスミドであってもよい。
【0033】
適切なベクターまたはプラスミドには、ウイルスタンパク質のための発現プラスミド、例えばｐＣＡＧＧＳ、ｐｃＤＮＡ、レトロウイルスベクター、例えばｐＱＸＣＩＰ、および二重プロモーターベクター（組換えウイルスのため）、例えばｐＨＷ２０００、ｐＤＺが含まれてもよい。
【0034】
さらなる側面において、本発明は、本発明記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子に関する。
用語「ウイルスベクター」は、組換え感染性ウイルス粒子を指す。
用語「ウイルスベクター」は、組換え感染性ウイルス粒子を指す。
【0035】
用語「ウイルス粒子」は、弱毒化されるかまたは不活性化されることなく、感染性であるウイルス全体を指す。
本明細書において、用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、エンベロープおよびカプシドのタンパク質を含む粒子を指し、そしてさらに、さらなる遺伝物質を含有してもよい。すなわち、少なくとも１つの核酸分子、すなわち少なくとも本発明記載の核酸分子を含有してもよい。ＶＬＰは非感染性粒子である。ＶＬＰには、上述のようなＤＩＰが含まれ、これはＤＩウイルスとも称される。
本明細書において、用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、エンベロープおよびカプシドのタンパク質を含む粒子を指し、そしてさらに、さらなる遺伝物質を含有してもよい。すなわち、少なくとも１つの核酸分子、すなわち少なくとも本発明記載の核酸分子を含有してもよい。ＶＬＰは非感染性粒子である。ＶＬＰには、上述のようなＤＩＰが含まれ、これはＤＩウイルスとも称される。
【0036】
もちろん、ウイルス様粒子は、他の核酸分子を含有してもよい。例えば、インフルエンザウイルスの場合、ウイルス様粒子またはウイルスベクターは、ＲＮＡの形の、例えば上述のｖＲＮＰ複合体の形の、遺伝物質の異なるセグメントを含有する一方、ウイルスカプシドまたはウイルスエンベロープは、インフルエンザＡ、またはインフルエンザＢおよびインフルエンザＣを含む他のウイルスに由来するタンパク質で構成される。
【0037】
また、非構造ウイルスタンパク質は、本発明記載のウイルス様粒子またはウイルスベクター中に存在してもまたは存在しなくてもよい。
本発明の１つの態様において、ウイルス様粒子またはウイルスベクターは、インフルエンザウイルス、特にインフルエンザＡウイルスに由来する。さらに、ウイルス粒子は、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスである。すなわち、本発明の１つの態様において、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、本発明記載の核酸配列、特に、セグメント７として配列番号２または３のＲＮＡ分子である核酸配列を、随意にインフルエンザＡウイルスの他のセグメント１～６および８とともに含有する、インフルエンザＡウイルスである。
本発明の１つの態様において、ウイルス様粒子またはウイルスベクターは、インフルエンザウイルス、特にインフルエンザＡウイルスに由来する。さらに、ウイルス粒子は、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスである。すなわち、本発明の１つの態様において、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、本発明記載の核酸配列、特に、セグメント７として配列番号２または３のＲＮＡ分子である核酸配列を、随意にインフルエンザＡウイルスの他のセグメント１～６および８とともに含有する、インフルエンザＡウイルスである。
【0038】
ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、薬剤として特に有用である。すなわち、さらなる側面において、本発明は、薬剤としてのウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子の使用に関する。本明細書において、交換可能に用いられる、この薬剤または薬学的組成物は、予防的または療法的治療を可能にするワクチンの形であってもよく、例えば個体のワクチン接種の形であってもよい。
【0039】
本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、ウイルス感染の治療に特に有用である。特に、感染性ウイルスのエンベロープタンパク質の少なくとも部分、例えばＨＡまたはＮＡを有するウイルスでのウイルス感染の治療に有用であり、そしてさらに、ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、本発明記載の核酸分子を含有する。
【0040】
ウイルス感染の治療において該ウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子を用いると、産生されるウイルス粒子の総数を減少させることが可能であり、そしてさらに、産生される感染性ウイルス粒子の割合が顕著に減少することが可能である。
【0041】
したがって、本発明記載のウイルスベクター、ウイルス様粒子またはウイルス粒子を用いて、ウイルス粒子の産生を減少させることによって、感染性ウイルス粒子の複製を阻害することが可能である。
【0042】
さらなる態様において、本発明は、本発明記載の核酸分子を含有する本発明記載の核酸ベクターまたはプラスミドを含有する宿主細胞を指す。これらの宿主細胞は、本発明記載の核酸分子を産生することを可能にする。例えば細胞培養または卵における、宿主細胞の産生および培養、ならびに適切な宿主細胞は、当業者に知られる。
【0043】
さらなる側面において、本発明は、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子、本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、本発明記載のベクターまたはプラスミド、ならびに／あるいは本発明記載の宿主細胞を含有する、薬学的組成物に関する。
【0044】
薬学的組成物は、療法的ワクチンまたは特に予防ワクチンとして、特に有用である。特に、本発明記載の薬学的組成物は、特にウイルス感染が病原性インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスによって引き起こされる際の、ウイルス感染の使用および治療のためのものである。すなわち、本発明記載の核酸分子、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子、本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、本発明記載のベクターまたはプラスミド、ならびに／あるいは本発明記載の宿主細胞は、適切な抗ウイルス剤に相当する。
【0045】
本発明記載の薬学的組成物は、動物またはヒトである個体への投与のために適応している。１つの態様において、動物は、ブタ、ウマ、イヌ、ネコまたは鳥類より選択される。別の態様において、個体はヒトである。
【0046】
例えば、薬学的組成物は、粘膜経路による投与、例えば鼻内投与、経口投与のために適応している。あるいは、静脈内投与、筋内投与または皮下投与によって投与を行ってもよい。
【0047】
薬学的組成物は、さらに、適切な希釈剤、キャリアーまたは流出液を含有してもよい。当業者は適切な希釈剤、流出液またはキャリアーを適宜、熟知している。
さらに、本発明は、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチンに関する。ワクチンは、本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、本発明記載のベクターまたはプラスミドならびに／あるいは本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子を含有する。
さらに、本発明は、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染に対するワクチン接種のためのワクチンに関する。ワクチンは、本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、本発明記載のベクターまたはプラスミドならびに／あるいは本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子を含有する。
【0048】
１つの態様において、核酸分子はＲＮＡ分子である。別の態様において、インフルエンザウイルス感染は、インフルエンザＡウイルス感染である。ワクチン接種は、典型的には、予防的ワクチン接種であってもよいが、また、療法的ワクチン接種も可能である。
【0049】
本発明記載の薬学的組成物、例えば本発明記載のワクチン、ならびに本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、個体における免疫防御の送達を可能にすると認識されてきている。
【0050】
すなわち、本発明記載の防御性干渉性核酸分子、特に本明細書に記載するような本発明記載の防御性干渉性ＲＮＡ分子の驚くべき特性のため、感染性ウイルス粒子の割合が減少することが可能であり、そしてさらに、感染性ウイルスの蔓延が減少するかまたは阻害されることが可能である一方で、本発明記載の核酸分子を含有するウイルス様粒子、ウイルスベクター、またはウイルス粒子の蔓延は個体において増加する。
【0051】
したがって、ウイルス感染を適宜制御し、そして減少させることも可能である。
したがって、本発明のさらなる側面において、本発明はウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染、例えばインフルエンザＡウイルス感染の予防的または療法的治療の方法に関する。前記方法には、本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の薬学的組成物の、ウイルス感染に罹患しているかまたはウイルス感染に罹患していると推測される個体への、あるいは予防的ワクチン接種のための、投与が含まれる。これらの投与は、罹患している場合、一度でもまたは数回でもよい。
したがって、本発明のさらなる側面において、本発明はウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染、例えばインフルエンザＡウイルス感染の予防的または療法的治療の方法に関する。前記方法には、本発明記載の核酸分子、本発明記載の組成物、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の薬学的組成物の、ウイルス感染に罹患しているかまたはウイルス感染に罹患していると推測される個体への、あるいは予防的ワクチン接種のための、投与が含まれる。これらの投与は、罹患している場合、一度でもまたは数回でもよい。
【0052】
投与法は上述の通りであってもよい。
最後に、本発明は、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の核酸分子、あるいは本発明記載の組成物、あるいは本発明記載のベクタープラスミド、あるいは本発明記載の宿主細胞、ならびにさらに野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子を含む、組成物またはキットに関する。本発明記載の組成物またはキットは、ワクチン接種、およびウイルス感染の療法的または予防的治療のために有用である。
最後に、本発明は、本発明記載のウイルス様粒子、ウイルスベクターまたはウイルス粒子、あるいは本発明記載の核酸分子、あるいは本発明記載の組成物、あるいは本発明記載のベクタープラスミド、あるいは本発明記載の宿主細胞、ならびにさらに野生型ウイルスベクターまたは野生型ウイルス粒子を含む、組成物またはキットに関する。本発明記載の組成物またはキットは、ワクチン接種、およびウイルス感染の療法的または予防的治療のために有用である。
【0053】
１つの態様において、野生型ウイルスベクターは、インフルエンザウイルスベクター、例えばインフルエンザＡウイルスベクターであってもよい。野生型ウイルス粒子は、インフルエンザウイルス粒子、例えばインフルエンザＡウイルス粒子であってもよい。
【0054】
本発明記載の組成物またはキットは、ウイルス感染に対して治療するかまたは防御する際に有用な、薬学的組成物の形であってもよい。
本発明は、本発明を限定することなく、例としてさらに記載されるであろう。
本発明は、本発明を限定することなく、例としてさらに記載されるであろう。
【実施例】
【0055】
本研究において、本発明者らは、単細胞感染実験を行った。驚くべきことに、感染した単細胞のある割合は、ウイルス子孫の低い感染力価および他のゲノムセグメントに関して過剰な比率の細胞内Ｓ７ ｖＲＮＡ量によって特徴づけられる異常な表現型を示し、これは、以下で過剰比率Ｓ７（Ｏｖｅｒ－Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ Ｓ７）（ＯＰ７）ウイルスと称されるウイルスの下位集団の同時感染によって引き起こされた。その後のその濃縮で、本発明者らは、野生型（ＷＴ）配列に関して、それぞれ図１に示すような３５の突然変異および図３に示すような３７の突然変異を示し、プロモーター、コードされるマトリックスタンパク質１（Ｍ１）および２（Ｍ２）ならびにゲノムパッケージングシグナルに影響を及ぼす、ＯＰ７ビリオン由来のＳ７（Ｓ７－ＯＰ７）のゲノムｖＲＮＡの配列を決定した。さらに、ＯＰ７シードウイルスを用いた、細胞集団に基づく感染実験によって、（ｉ）改変されたウイルスＲＮＡ合成の原因が、Ｓ７－ＯＰ７上で同定される「スーパープロモーター」である可能性もあり（Ｂｅｌｉｃｈａ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら， ２０１２， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＢ１ ａｎｄ ＰＡ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６， ５９２６－５９３０）、（ｉｉ）放出されるＯＰ７ビリオンは、主に取り込まれるＳ７を除いて、ｖＲＮＡ内容物が不完全であるため、ウイルス複製不全であり、そして（ｉｉｉ）突然変異Ｍ１タンパク質の増進された核集積は、すべてのゲノムセグメントの部分的核保持を引き起こしうることが示されている。最後に、同時感染実験によって、適切な同種および異種ＩＡＶ株の複製へのＯＰ７ウイルスの強い干渉、ならびにヒト細胞株における干渉が示され、このため、ＯＰ７ウイルスは抗ウイルス剤としての利用に有望である可能性もある。さらに、本発明者らの結果は、ＯＰ７ビリオンが、欠失されないが突然変異されたゲノムＲＮＡセグメントを含む、ＩＡＶ由来のＤＩＰのなお認識されていない型であることを明らかにする。
【0056】
細胞およびウイルス
ＭＤＣＫ細胞（ＥＣＡＣＣ、＃８４１２１９０３）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペプトンを含むグラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）中で培養した。ＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞株を、１０％ＦＢＳを含有するダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。すべての培養および感染を、５％ＣＯ２大気中、３７℃で行った。ブタ・トリプシンを、対応する血清不含培地に、最終濃度５ ＢＡＥＥ Ｕ／ｍＬまで添加することによって、感染培地を調製した。ＲＫＩ（＃３１８８）およびＮＩＢＳＣ（＃９９／７１６）よりインフルエンザウイルス株ＰＲ８が提供された。ＮＩＢＳＣより株Ｈ３Ｎ２（＃１５／１９２）およびＨ１Ｎ１－ｐｄｍ０９（＃１０／１２２）が供給された。ＭＤＣＫ細胞を用いた標準ＴＣＩＤ５０アッセイ（ＧｅｎｚｅｌおよびＲｅｉｃｈｌ， ２００７， Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ － ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中， Ｒ． Ｐоｅｒｔｎｅｒ監修（Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）， ｐｐ． ４５７－４７３）によってシードウイルス力価を決定し、そしてＭＯＩはこの力価に基づいた。
ＭＤＣＫ細胞（ＥＣＡＣＣ、＃８４１２１９０３）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペプトンを含むグラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）中で培養した。ＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞株を、１０％ＦＢＳを含有するダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。すべての培養および感染を、５％ＣＯ２大気中、３７℃で行った。ブタ・トリプシンを、対応する血清不含培地に、最終濃度５ ＢＡＥＥ Ｕ／ｍＬまで添加することによって、感染培地を調製した。ＲＫＩ（＃３１８８）およびＮＩＢＳＣ（＃９９／７１６）よりインフルエンザウイルス株ＰＲ８が提供された。ＮＩＢＳＣより株Ｈ３Ｎ２（＃１５／１９２）およびＨ１Ｎ１－ｐｄｍ０９（＃１０／１２２）が供給された。ＭＤＣＫ細胞を用いた標準ＴＣＩＤ５０アッセイ（ＧｅｎｚｅｌおよびＲｅｉｃｈｌ， ２００７， Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ － ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｎｅｅｄｓ ｉｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中， Ｒ． Ｐоｅｒｔｎｅｒ監修（Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）， ｐｐ． ４５７－４７３）によってシードウイルス力価を決定し、そしてＭＯＩはこの力価に基づいた。
【0057】
感染単細胞の単離
以前記載されるように単離を行った（Ｈｅｌｄｔら， ２０１５， Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｕｎｖｅｉｌ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６， ８９３８）。簡潔には、９．６ｃｍ２プレート中の集密ＭＤＣＫ細胞を、２５０μＬの感染培地中、示すＭＯＩで感染させた。インキュベーションの最初の１時間は、プレートを揺動させた。次いで、培地体積を２ｍＬに増加させ、そして細胞をさらに１．５時間インキュベーションした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄（２回）した後、細胞を１０～１５分間トリプシン処理した。細胞維持培地（１０％ＦＢＳを含有する）を用いてトリプシン処理を停止した。ホモジナイズした細胞懸濁物を、あらかじめ温めた（３７℃）感染培地中で連続希釈した。続いて、５０μＬの希釈細胞懸濁物（濃度：５０μＬあたり１細胞）を、電子マルチチャネル／マルチステップピペットを用いて、あらかじめ温めた３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃７８１９０１）の各ウェルに迅速に添加した。プレートを１２ｈｐｉまでインキュベーションした。１５０ｘｇで短時間遠心分離した後、本発明者らは、位相差顕微鏡によって、単細胞を含有する個々のウェルを同定した。上清を直ちにプラークアッセイに供して、ウイルス収量を定量化した。残った単細胞をＰＢＳで洗浄し、そして５μＬの希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｂ１４）を１ｍｇ／ｍＬの濃度でウェルに添加した。３８４ウェルプレートを密封し、そしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲまで、直ちに－８０℃で保存した。
以前記載されるように単離を行った（Ｈｅｌｄｔら， ２０１５， Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｕｎｖｅｉｌ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６， ８９３８）。簡潔には、９．６ｃｍ２プレート中の集密ＭＤＣＫ細胞を、２５０μＬの感染培地中、示すＭＯＩで感染させた。インキュベーションの最初の１時間は、プレートを揺動させた。次いで、培地体積を２ｍＬに増加させ、そして細胞をさらに１．５時間インキュベーションした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄（２回）した後、細胞を１０～１５分間トリプシン処理した。細胞維持培地（１０％ＦＢＳを含有する）を用いてトリプシン処理を停止した。ホモジナイズした細胞懸濁物を、あらかじめ温めた（３７℃）感染培地中で連続希釈した。続いて、５０μＬの希釈細胞懸濁物（濃度：５０μＬあたり１細胞）を、電子マルチチャネル／マルチステップピペットを用いて、あらかじめ温めた３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、＃７８１９０１）の各ウェルに迅速に添加した。プレートを１２ｈｐｉまでインキュベーションした。１５０ｘｇで短時間遠心分離した後、本発明者らは、位相差顕微鏡によって、単細胞を含有する個々のウェルを同定した。上清を直ちにプラークアッセイに供して、ウイルス収量を定量化した。残った単細胞をＰＢＳで洗浄し、そして５μＬの希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｂ１４）を１ｍｇ／ｍＬの濃度でウェルに添加した。３８４ウェルプレートを密封し、そしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲまで、直ちに－８０℃で保存した。
【0058】
プラークアッセイ
感染単細胞の全上清を、２つの希釈（総試料の９０％または１０％いずれか）を用いて、ウイルス力価（ＰＦＵ／細胞）に関して調べた。２５０μＬの各希釈を、６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞上で１時間インキュベーションした。インキュベーション中、プレートを揺動した。上清を除去した後、細胞に１％寒天（感染培地中）を上層し、そして４日間インキュベーションした。次いで、メタノールで細胞を固定し、そして０．２％クリスタルバイオレット溶液を用いて染色した。光学顕微鏡を用いて、プラークカウントを決定した。
感染単細胞の全上清を、２つの希釈（総試料の９０％または１０％いずれか）を用いて、ウイルス力価（ＰＦＵ／細胞）に関して調べた。２５０μＬの各希釈を、６ウェルプレート中のＭＤＣＫ細胞上で１時間インキュベーションした。インキュベーション中、プレートを揺動した。上清を除去した後、細胞に１％寒天（感染培地中）を上層し、そして４日間インキュベーションした。次いで、メタノールで細胞を固定し、そして０．２％クリスタルバイオレット溶液を用いて染色した。光学顕微鏡を用いて、プラークカウントを決定した。
【0059】
細胞集団に基づく感染および試料採取
９．６ｃｍ２プレート中の集密細胞を、２５０μＬの感染培地中、示すＭＯＩで感染させた。１時間のインキュベーション中、プレートを揺動した。接種物を取り除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして２ｍＬの感染培地を添加した。感染後の調べた時点各々に関して、１つのプレートを試料採取した。
９．６ｃｍ２プレート中の集密細胞を、２５０μＬの感染培地中、示すＭＯＩで感染させた。１時間のインキュベーション中、プレートを揺動した。接種物を取り除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして２ｍＬの感染培地を添加した。感染後の調べた時点各々に関して、１つのプレートを試料採取した。
【0060】
製造者の指示にしたがって、「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡウイルス」キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いた、ウイルス力価決定または放出されたビリオン中のｖＲＮＡの精製を行うまで、上清アリコットを－８０℃で保存した。次いで、残りの細胞をＰＢＳで２回洗浄した。「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ」キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて、細胞の溶解および細胞内ＲＮＡ抽出を行った。ウイルス粒子由来の精製ｖＲＮＡ、ならびに細胞内ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化した。感染時点での細胞カウントに基づいて、細胞あたりのウイルスＲＮＡレベルを計算した。
【0061】
ウイルス定量化
細胞集団に基づく感染のウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞を用いた標準ＴＣＩＤ５０アッセイ（ＧｅｎｚｅｉおよびＲｅｉｃｈｌ、２００７、上記を参照されたい）およびＨＡアッセイ（Ｋａｌｂｆｕｓｓら， ２００８， Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ： ｐｒｅｃｉｓｅ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６， １４５－１６１）に基づいて決定した。ＨＡ力価を、試験体積あたりのｌоｇ１０ＨＡ単位として表した（ｌоｇ１０ ＨＡＵ／１００μＬ）。ビリオンの数が赤血球の数と等しい希釈まで凝集が起こると仮定して、ウイルス粒子濃度ｃウイルス（ビリオン／ｍＬ）を計算した（Ｂｕｒｌｅｓｏｎら， １９９２， Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）中， ｐｐ． ８６－９２）。したがって、計算は、ＨＡ力価および赤血球懸濁物の細胞濃度（２ｘ１０７細胞／ｍＬ）に基づいた。
細胞集団に基づく感染のウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞を用いた標準ＴＣＩＤ５０アッセイ（ＧｅｎｚｅｉおよびＲｅｉｃｈｌ、２００７、上記を参照されたい）およびＨＡアッセイ（Ｋａｌｂｆｕｓｓら， ２００８， Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ： ｐｒｅｃｉｓｅ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３６， １４５－１６１）に基づいて決定した。ＨＡ力価を、試験体積あたりのｌоｇ１０ＨＡ単位として表した（ｌоｇ１０ ＨＡＵ／１００μＬ）。ビリオンの数が赤血球の数と等しい希釈まで凝集が起こると仮定して、ウイルス粒子濃度ｃウイルス（ビリオン／ｍＬ）を計算した（Ｂｕｒｌｅｓｏｎら， １９９２， Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）中， ｐｐ． ８６－９２）。したがって、計算は、ＨＡ力価および赤血球懸濁物の細胞濃度（２ｘ１０７細胞／ｍＬ）に基づいた。
【0062】
【化1】
【0063】
リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲ
（ｉ）単細胞試料の細胞内ｖＲＮＡ、（ｉｉ）細胞集団に由来する試料の細胞内ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）ウイルス粒子から精製されたｖＲＮＡの絶対定量化に、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを利用した。このため、本発明者らは、以前公表された方法（Ｋａｗａｋａｍｉら， ２０１１， Ｓｔｒａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖＲＮＡ， ｃＲＮＡ， ａｎｄ ｍＲＮＡ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７３， １－６）から、個々のＩＡＶ ＲＮＡの極性および遺伝子特異的増幅を可能にする、プライマーの組み合わせを得た。逆転写（ＲＴ）のため、タグ付けプライマー（表１）を用い、ｑＰＣＲプライマーを表２に列挙する。絶対定量化を容易にするため、本発明者らは、ＲＮＡ参照標準を生成し、そして検量線に基づいてウイルスＲＮＡの数を計算した。
（ｉ）単細胞試料の細胞内ｖＲＮＡ、（ｉｉ）細胞集団に由来する試料の細胞内ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）ウイルス粒子から精製されたｖＲＮＡの絶対定量化に、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを利用した。このため、本発明者らは、以前公表された方法（Ｋａｗａｋａｍｉら， ２０１１， Ｓｔｒａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖＲＮＡ， ｃＲＮＡ， ａｎｄ ｍＲＮＡ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７３， １－６）から、個々のＩＡＶ ＲＮＡの極性および遺伝子特異的増幅を可能にする、プライマーの組み合わせを得た。逆転写（ＲＴ）のため、タグ付けプライマー（表１）を用い、ｑＰＣＲプライマーを表２に列挙する。絶対定量化を容易にするため、本発明者らは、ＲＮＡ参照標準を生成し、そして検量線に基づいてウイルスＲＮＡの数を計算した。
【0064】
【表1】
【0065】
【表2】
【0066】
参照標準のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のため、本発明者らは、製造者の指示にしたがって、「Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた慣用的なＰＣＲにおいて、（対応するセグメントの）ｖＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡ完全配列を所持するプラスミドを用いた。それによって、プライマー（表Ｓ３）は、ＰＣＲ産物内に（望ましい配向で）Ｔ７プロモーター配列を導入した。精製後（「ＩｎｎｕＰｒｅｐ ＰＣＲｐｕｒｅキット」（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ））、本発明者らはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（「ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７高収率転写キット」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））のためにＰＣＲ産物を用いた。「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ」（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてＲＮＡ参照標準の最終精製を行い；標準を使用まで－８０℃で保存した。
【0067】
ＲＴのため、本発明者らは、１μＬのＲＮＡ試料を０．５μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および０．５μＬのＲＴプライマー（ｍＲＮＡプライマーに関しては１０μＭ、またはｖＲＮＡおよびｃＲＮＡプライマーに関しては１μＭ）と混合し、そしてヌクレアーゼ不含水で６．５μＬまで満たした。６５℃で５分間、そして次いで、異なる温度：ｍＲＮＡに関しては４２℃、またはｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ測定に関しては５５℃で５分間インキュベーションを行った。後者の工程中、本発明者らは、２μＬ「５ｘＲＴ緩衝液」、０．２５μＬ（５０Ｕ）「Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素」および１．２５μＬヌクレアーゼ不含水（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなる、あらかじめ温めた混合物（ｍＲＮＡに関しては４２℃、またはｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ測定に関しては５５℃）を添加した。ＲＴを６０℃で３０分間行い、その後、８５℃５分間で終結させた。さらに、本発明者らは、１０倍希釈工程：１～１ｘ１０－７ｎｇで、ＲＮＡ参照標準を逆転写した。この反応各々は、（随意に）細胞総ＲＮＡ（細胞内ＲＮＡ試料と一致させるため）を：（ｉ）単細胞に関しては３５０ｆｇ、（ｉｉ）集団に基づく測定に関しては３５０ｎｇ、および（ｉｉｉ）精製ビリオン由来のｖＲＮＡの測定に関しては総ＲＮＡなしで含有した。次いで、ｃＤＮＡ反応産物をヌクレアーゼ不含水中で２０μＬに希釈し、そして－２０℃で保存するか、または直ちにｑＰＣＲ分析に供した。
【0068】
ｑＰＣＲのため、本発明者らは「Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣサイクラー」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ｑＰＣＲミックス（１０μＬ）は、１ｘ「Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット」（Ｑｉａｇｅｎ）、５００μＭの各プライマーおよび３μＬの希釈ｃＤＮＡを含有した。最初の変性を９５℃で５分間行い、その後４０回のＰＣＲサイクル（２工程プロトコル）：９５℃で１０秒間、および６２℃で２０秒間を行った。その後、６５～９０℃で融解曲線分析を行った。
【0069】
ウイルスＲＮＡの絶対定量化
ウイルスＲＮＡの絶対量を計算するため、本発明者らは、ｌоｇ１０ＲＮＡ分子数ｎ分子（横軸）に対して、連続１０倍希釈したＲＮＡ参照標準のｃＴ値（ｑＰＣＲ由来）（縦軸）をプロットして、検量線を生成した（線形回帰）。標準量ｍＳＴＤ（ｎｇ）、断片の長さＮ塩基（ｂｐ）、１つの塩基の平均質量（ｋ＝３４０（Ｄａ／ｂｐ））、およびアボガドロ定数ＮＡ（ｍоｌ－１）に基づいて、ｎ分子を計算した。
ウイルスＲＮＡの絶対量を計算するため、本発明者らは、ｌоｇ１０ＲＮＡ分子数ｎ分子（横軸）に対して、連続１０倍希釈したＲＮＡ参照標準のｃＴ値（ｑＰＣＲ由来）（縦軸）をプロットして、検量線を生成した（線形回帰）。標準量ｍＳＴＤ（ｎｇ）、断片の長さＮ塩基（ｂｐ）、１つの塩基の平均質量（ｋ＝３４０（Ｄａ／ｂｐ））、およびアボガドロ定数ＮＡ（ｍоｌ－１）に基づいて、ｎ分子を計算した。
【0070】
【化2】
【0071】
試料のｃＴ値を用いて、検量線の傾き（ｍ）およびｙ切片（ｂ）、ＲＴ反応希釈の係数ＦＲＴ、およびＲＮＡ試料の総体積Ｖ試料（μＬ）を考慮することによって、ウイルスＲＮＡ分子数Ｑ試料を計算した。
【0072】
【化3】
【0073】
セグメント特異的ＰＣＲ
ビリオンから精製したｖＲＮＡを、２つの異なる目的のため、ＲＴ－ＰＣＲに供した：（ｉ）サブゲノムＲＮＡの存在の研究、および（ｉｉ）ｖＲＮＡ配列の決定（以下により詳細に記載する）。ＲＴのため、本発明者らは、すべての８つのゲノムセグメントの保存された３’端にハイブリダイズして、１つの反応ですべてのｃＤＮＡを合成する、普遍的「Ｕｎｉ１２」プライマーを用いた（Ｈｏｆｆｍａｎｎら， ２００１， Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４６， ２２７５－２２８９）。続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、本発明者らは、各セグメントのための個々の反応を用いた。プライマー配列（表３）は、セグメント特異的部分と組み合わせて、保存された３’または５’末端ｖＲＮＡ端を含み、全ゲノムセグメントの特異的増幅を可能にする。Ｓ７－ＯＰ７ ｖＲＮＡの配列決定のため、本発明者らが適応されたプライマー（表３）を用いたことに注目されたい。
ビリオンから精製したｖＲＮＡを、２つの異なる目的のため、ＲＴ－ＰＣＲに供した：（ｉ）サブゲノムＲＮＡの存在の研究、および（ｉｉ）ｖＲＮＡ配列の決定（以下により詳細に記載する）。ＲＴのため、本発明者らは、すべての８つのゲノムセグメントの保存された３’端にハイブリダイズして、１つの反応ですべてのｃＤＮＡを合成する、普遍的「Ｕｎｉ１２」プライマーを用いた（Ｈｏｆｆｍａｎｎら， ２００１， Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４６， ２２７５－２２８９）。続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、本発明者らは、各セグメントのための個々の反応を用いた。プライマー配列（表３）は、セグメント特異的部分と組み合わせて、保存された３’または５’末端ｖＲＮＡ端を含み、全ゲノムセグメントの特異的増幅を可能にする。Ｓ７－ＯＰ７ ｖＲＮＡの配列決定のため、本発明者らが適応されたプライマー（表３）を用いたことに注目されたい。
【0074】
【表3】
【0075】
ＲＴのため、１０μＬのＲＮＡを１μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および１μＬのプライマー（１０ｍＭ）と混合し、そしてヌクレアーゼ不含水で１４．５μＬまで満たした。６５℃で５分間および４℃で５分間、インキュベーションを行った。次いで、本発明者らは、４μＬの「５ｘ反応緩衝液」、５０Ｕ（０．５μＬ）の「ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素」、２０Ｕ（０．５μＬ）の「ＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮアーゼ阻害剤」および０．５μＬのヌクレアーゼ不含水（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、そして４２℃で６０分間インキュベーションした。ＲＴを７０℃１０分間で終結させた。ｃＤＮＡを－２０℃で保存するかまたは直ちにＰＣＲに供した。
【0076】
ＰＣＲのため、２μＬ ｃＤＮＡを４μＬの「５ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液」、２μＬ ＭｇＣＬ２（１０ｍＭ）、１μＬ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬの各プライマー（１０μＭ）、０．２μＬ（０．４Ｕ）の「Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ」および８．８μＬのヌクレアーゼ不含水（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と組み合わせた。最初の変性を９８℃で３分間行い、その後、２５回のＰＣＲサイクル：９８℃２５秒間、５４℃４５秒間、および７２℃で異なる時間：Ｓ１～Ｓ３に関しては２分間、Ｓ４～Ｓ６に関しては１．５分間、ならびにＳ７およびＳ８に関しては１分間行った。７２℃１０分間で最終伸長を行った。次いで、アガロースゲル電気泳動を用いて、ＰＣＲ産物を視覚化した。
【0077】
ｖＲＮＡ配列の決定
本発明者らは、ビリオンから精製したｖＲＮＡの配列を決定した。コード領域の配列決定のため、本発明者らは全セグメントを増幅するため、セグメント特異的ＰＣＲ（上記の通り）を用いた。精製後、同じＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ産物を配列決定した。サンガー配列決定を利用して、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ドイツ・エーバースベルグ）によってすべての配列決定反応を行った。
本発明者らは、ビリオンから精製したｖＲＮＡの配列を決定した。コード領域の配列決定のため、本発明者らは全セグメントを増幅するため、セグメント特異的ＰＣＲ（上記の通り）を用いた。精製後、同じＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ産物を配列決定した。サンガー配列決定を利用して、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ドイツ・エーバースベルグ）によってすべての配列決定反応を行った。
【0078】
末端ｖＲＮＡ端の配列決定のため、本発明者らはＲＮＡリガーゼを用いたｖＲＮＡの環状化に基づく、以前公表された方法（ｄｅ Ｗｉｔら， ２００７， Ｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９， ８５－８９）由来の修飾法を得た。連結領域（ｖＲＮＡ端を含有する）の続く増幅をＲＴ－ＰＣＲによって行った。ＲＴのため、ランダム六量体プライマーを用いた。続くＰＣＲ（プライマーを表Ｓ５に列挙する）において、本発明者らは、３’および５’ｖＲＮＡ端の連結部に渡って設計された第二のプライマーと組み合わせて、セグメント特異的プライマーを用いた。各３’および５’端の配列決定のため、本発明者らは１つのプライマー対を用いた。各ｖＲＮＡ端の末端２ｂｐの配列は決定されなかった（プライマー設計のため）ことに注目されたい。
【0079】
１１．５μＬのＲＮＡ試料を４μＬ（４０Ｕ）の「Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１」、２μＬの「１０ｘＴ４ ＲＮＡリガーゼ反応緩衝液」、２μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ溶液（すべての試薬はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）および０．５μＬ（２０Ｕ）の「ＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮアーゼ阻害剤」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合することによって、環状化を行った。混合物を３７℃で１時間インキュベーションした後、６５℃で１５分間熱不活性化した。本発明者らは環状化ＲＮＡを直ちに逆転写した。
【0080】
ＲＴのため、４μＬの連結されたＲＮＡ、１μＬ（０．２μｇ）の「ランダム六量体プライマー」、１μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）および８．５μＬのヌクレアーゼ不含水を含有する反応混合物を、６５℃で５分間インキュベーションし（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、そして直ちに氷上に移した。次いで、本発明者らは、４μＬの「５ｘＲＴ緩衝液」、０．５μＬ（１００Ｕ）の「Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素」、０．５μＬ（２０Ｕ）の「ＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮアーゼ阻害剤」および０．５μＬのヌクレアーゼ不含水（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。２５℃で１０分間、そして次いで５０℃で３０分間、インキュベーションを行った。８５℃５分間で終結を行った。ｃＤＮＡを－２０℃で保存するか、または直ちにＰＣＲに供した。
【0081】
ＰＣＲ反応混合物は、４．５μＬのＲＴ産物、６μＬの「５ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液」、３μＬ ＭｇＣＬ２（１０ｍＭ）、１．５μＬ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．５μＬの各プライマー（１０μＭ）、０．３μＬ（０．６Ｕ）「Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ」および１１．７μＬのヌクレアーゼ不含水（すべての試薬はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなった。サイクリング条件は、９８℃１０５秒間の最初の変性、そして次いで、４０回のＰＣＲサイクル：９８℃１０秒間、６０℃３０秒間および７２℃４０秒間を含んだ。最終伸長を７２℃で１０分間行った。すべてのＰＣＲ産物を、ゲルから切り出し（アガロースゲル電気泳動後）、そして次いで、製造者の指示にしたがって、「ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【0082】
自然免疫反応の分析
感染した細胞集団のＩＦＮ－ベータおよびＭｘ１の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを用いて評価した。このため、製造者の指示にしたがって、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよび「Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素」（どちらもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、５００ｎｇの精製細胞内ＲＮＡを逆転写した。続いて、本発明者らは、「Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣＲサイクラー」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲミックス（１０μＬ）は、１ｘ「Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット」（Ｑｉａｇｅｎ）、５００ｎＭの各プライマーおよび３μＬの希釈ｃＤＮＡを含有した。最初の変性を９５℃で５分間行い、その後、４０回のＰＣＲサイクル（２工程プロトコル）：９５℃１０秒間、および６２℃２０秒間を行った。遺伝子発現を、倍誘導（偽感染細胞上）で示し、そして参照遺伝子としての１８ｓ ｒＲＮＡとともに、デルタ－デルタｃＴ法を用いて計算した。
感染した細胞集団のＩＦＮ－ベータおよびＭｘ１の発現を、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲを用いて評価した。このため、製造者の指示にしたがって、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよび「Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素」（どちらもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、５００ｎｇの精製細胞内ＲＮＡを逆転写した。続いて、本発明者らは、「Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣＲサイクラー」（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲミックス（１０μＬ）は、１ｘ「Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット」（Ｑｉａｇｅｎ）、５００ｎＭの各プライマーおよび３μＬの希釈ｃＤＮＡを含有した。最初の変性を９５℃で５分間行い、その後、４０回のＰＣＲサイクル（２工程プロトコル）：９５℃１０秒間、および６２℃２０秒間を行った。遺伝子発現を、倍誘導（偽感染細胞上）で示し、そして参照遺伝子としての１８ｓ ｒＲＮＡとともに、デルタ－デルタｃＴ法を用いて計算した。
【0083】
細胞内ウイルスタンパク質の分析
すべての示す時点で、感染ＭＤＣＫ細胞集団をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、本発明者らは、１５０μＬのラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液を添加した。細胞スクレーパーを用いて細胞を採取し、そして０．２μｍシリンジを用いてホモジナイズした。遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分間および４℃）後、上清アリコットをウェスタンブロット（ＷＢ）分析まで－８０℃で保存した。ＷＢのため、本発明者らはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用いた。マウス抗ＮＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１２８１９３）を１：２，０００希釈で用い、ウサギ抗ＰＡポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（ＧｅｎｅＴｅｘ、＃ＧＴＸ１２５９３２）を１：１０，０００に希釈し、マウス抗Ｍ１ ｍＡｂ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃｈ、＃ＭＣＡ４０１）を１：１，０００の希釈で用い、そしてＭｅｒｃｋのマウス抗グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＡｂ（＃ＣＢ１００１）を１：５，０００に希釈した。どちらも１：１０，０００希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化したロバ抗マウスｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５－０３６－１５１）およびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１１１－０３５－００３）を用いて、二次抗体染色を行った。「ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ基質」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ブロット上のタンパク質を視覚化した。
すべての示す時点で、感染ＭＤＣＫ細胞集団をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、本発明者らは、１５０μＬのラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液を添加した。細胞スクレーパーを用いて細胞を採取し、そして０．２μｍシリンジを用いてホモジナイズした。遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分間および４℃）後、上清アリコットをウェスタンブロット（ＷＢ）分析まで－８０℃で保存した。ＷＢのため、本発明者らはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用いた。マウス抗ＮＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１２８１９３）を１：２，０００希釈で用い、ウサギ抗ＰＡポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（ＧｅｎｅＴｅｘ、＃ＧＴＸ１２５９３２）を１：１０，０００に希釈し、マウス抗Ｍ１ ｍＡｂ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃｈ、＃ＭＣＡ４０１）を１：１，０００の希釈で用い、そしてＭｅｒｃｋのマウス抗グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＡｂ（＃ＣＢ１００１）を１：５，０００に希釈した。どちらも１：１０，０００希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化したロバ抗マウスｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５－０３６－１５１）およびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギｐＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１１１－０３５－００３）を用いて、二次抗体染色を行った。「ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ基質」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ブロット上のタンパク質を視覚化した。
【0084】
電子顕微鏡
細胞集団由来感染において放出されたウイルス粒子を、β－プロピオラクトンを用いて不活性化し、そして次いで、ｎｓ－ＴＥＭを利用して視覚化した。グロー放電炭素フォイルで覆ったグリッドに試料を結合させ、そして１％酢酸ウラニルを用いて染色した。「ＣＭ－１２０ ＢｉｏＴｗｉｎ」透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて、グリッドを室温で画像化した。「ＴｅｍＣａｍ－Ｆ４１６ ＣＭＯＳ」カメラ（ＴＶＩＰＳ）を用いて画像を得た。
細胞集団由来感染において放出されたウイルス粒子を、β－プロピオラクトンを用いて不活性化し、そして次いで、ｎｓ－ＴＥＭを利用して視覚化した。グロー放電炭素フォイルで覆ったグリッドに試料を結合させ、そして１％酢酸ウラニルを用いて染色した。「ＣＭ－１２０ ＢｉｏＴｗｉｎ」透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて、グリッドを室温で画像化した。「ＴｅｍＣａｍ－Ｆ４１６ ＣＭＯＳ」カメラ（ＴＶＩＰＳ）を用いて画像を得た。
【0085】
画像化フローサイトメトリー分析
感染後、示す時点で、本発明者らは、感染ＭＤＣＫ細胞集団を揺動して、剥離細胞を感染培地内に放出させた。上清を採取し、そして剥離細胞を遠心分離（３００ｘｇ、１０分間および４℃）によって上清から分離した。残った接着細胞をトリプシン処理し、そしてその後、以前の工程由来の剥離細胞と合わせた。次いで、細胞を１％の最終濃度で、パラホルムアルデヒドで固定し（３０分間および４℃）、そしてＰＢＳで洗浄した。画像化フローサイトメトリー分析まで、アリコットを－２０℃で７０％エタノール中に保存した。
感染後、示す時点で、本発明者らは、感染ＭＤＣＫ細胞集団を揺動して、剥離細胞を感染培地内に放出させた。上清を採取し、そして剥離細胞を遠心分離（３００ｘｇ、１０分間および４℃）によって上清から分離した。残った接着細胞をトリプシン処理し、そしてその後、以前の工程由来の剥離細胞と合わせた。次いで、細胞を１％の最終濃度で、パラホルムアルデヒドで固定し（３０分間および４℃）、そしてＰＢＳで洗浄した。画像化フローサイトメトリー分析まで、アリコットを－２０℃で７０％エタノール中に保存した。
【0086】
以前記載されるように（Ｆｒｅｎｓｉｎｇら， ２０１６， Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ １０， ６８１－６８９）、分析を行った。簡潔には、細胞試料を、０．１％ＢＳＡおよび２％グリシンを含有するＰＢＳで２回洗浄し、それによって、３００ｘｇ、４℃で１０分間の遠心分離を用いた。次いで、試料を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、３７℃で３０分間ブロッキングした。洗浄後、本発明者らは、抗体インキュベーション（常に、暗所中、３７℃で１時間）を行った。モノクローナルマウス抗ＮＰ抗体ｍＡｂ６１Ａ５（Ｆｕｍｉｔａｋａ Ｍｏｍｏｓｅより寄贈）を１：５００の希釈で用いた。抗体は、ｖＲＮＰ複合体に生得的なコンホメーションでＮＰに優先的に結合する（Ｍｏｍｏｓｅら， ２００７， Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｙ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ９， １４２２－１４３３）。洗浄に続いて、二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート化ヤギ抗マウスｐＡｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ａ２１２３５）を１：５００の希釈で用い、そして次いで、細胞を２回洗浄した。ＤＡＰＩを添加することによって、核を視覚化した。
【0087】
Ｍ１染色のため、本発明者らはＦＩＴＣコンジュゲート化ｍＡｂマウス抗Ｍ１（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ、＃ＭＣＡ４０１ＦＸ）を１：１００の希釈で用いた。細胞を洗浄した後、これらを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。次いで、本発明者らは、ＲＮＡ分解のため５μＬのＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮアーゼＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、そして核染色のため０．５μＬの７－ＡＡＤ（Ｍｅｒｃｋ）を添加した。インキュベーションを、暗所中、室温で３０分間行った。最後に、細胞を洗浄した。６０ｘ拡大で試料あたり１０，０００細胞を獲得するため（破片および細胞二重体を排除した）、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ Ｘ Ｍａｒｋ ＩＩ（Ａｍｎｉｓ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。３７５および６４２ｎｍレーザーをｖＲＮＰ／ＤＡＰＩ染色試料の励起に利用し、そしてチャンネル１（ＣＨ１）および５（ＣＨ５）からのシグナルをＣＨ６上の明視野（ＢＦ）画像とともに獲得した。Ｍ１／７－ＡＡＤ染色細胞に関して、本発明者らは４８８および５６１ｎｍ励起レーザーを用い、そして検出のため、ＣＨ６上のＢＦを伴ってＣＨ２およびＣＨ５を用いた。一重染色陽性対照を用いて、レーザー出力を調整し、そして補償ファイルを得た。
【0088】
本発明者らは、画像分析のため、ＩＤＥＡＳソフトウェア（バージョン６．１）を用い、分析のため、焦点があった単細胞のみを用いた。核シグナル（ＤＡＰＩから得られる）と共局在するｖＲＮＰシグナルの蛍光強度（ＦＩ）の割合を計算することによって、ｖＲＮＰの細胞内局在を評価した。このため、それぞれ、ファンクション「形態」（ＣＨ１画像上）および「オブジェクト」（ＣＨ６上）を用いて、マスク「核」および「全細胞」を生成した。それぞれ、マスク「核」および「全細胞」内で、ＣＨ５上のフィーチャー「強度」を用いることによって、「強度ＣＨ５核」および「強度ＣＨ５全細胞」と称される新規フィーチャーを生成した。新規組み合わせフィーチャー「核中のＦＩ」を以下の定義で生成した：「強度ＣＨ５核」／「強度ＣＨ５全細胞」。ＣＨ１およびＣＨ５二重陽性細胞（焦点があった単細胞のもの）を、このフィーチャーを用いてヒストグラム上にプロットした。前記フィーチャーの平均値に１００を乗じることによって、核中のＦＩの割合（％）を計算した。Ｍ１局在を同じ方法で、しかし対応する検出チャネルの考慮下で評価した。
【0089】
単細胞分析は、ＰＲ８ウイルスにおける異常な表現型を持つウイルス下位集団の存在を示す
大きな細胞間変動を示す、細胞内Ｓ７ ｖＲＮＡ量に対するウイルス放出の依存性を研究するため、本発明者らは感染細胞の単細胞分析を行った。接着性Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞集団をＩＡＶに感染させ、そして次いでトリプシン処理して細胞懸濁物を得た。希釈細胞懸濁物を３８４ウェルプレートに移して、（平均して）ウェルあたり１細胞を得て、そして位相差顕微鏡検査によって、単細胞を含有するウェルを同定した。１２ｈｐｉで、本発明者らはプラークアッセイを用いて、これらの細胞からウイルス力価を定量化した。さらに、細胞を溶解し、そしてリアルタイム逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって細胞内ｖＲＮＡに関して分析した。感染実験をここで、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＲ８－ＮＩＢＳＣ）またはＲｏｂｅｒｔ－Ｋｏｃｈ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（ＰＲ８－ＲＫＩ）由来のインフルエンザウイルスＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）で行った。
大きな細胞間変動を示す、細胞内Ｓ７ ｖＲＮＡ量に対するウイルス放出の依存性を研究するため、本発明者らは感染細胞の単細胞分析を行った。接着性Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞集団をＩＡＶに感染させ、そして次いでトリプシン処理して細胞懸濁物を得た。希釈細胞懸濁物を３８４ウェルプレートに移して、（平均して）ウェルあたり１細胞を得て、そして位相差顕微鏡検査によって、単細胞を含有するウェルを同定した。１２ｈｐｉで、本発明者らはプラークアッセイを用いて、これらの細胞からウイルス力価を定量化した。さらに、細胞を溶解し、そしてリアルタイム逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって細胞内ｖＲＮＡに関して分析した。感染実験をここで、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＲ８－ＮＩＢＳＣ）またはＲｏｂｅｒｔ－Ｋｏｃｈ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（ＰＲ８－ＲＫＩ）由来のインフルエンザウイルスＡ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）で行った。
【0090】
驚くべきことに、１０の感染多重度（ＭＯＩ）のＰＲ８－ＮＩＢＳＣでの感染に際して、低い感染性ウイルス力価を示す個々の細胞は、Ｓ５またはＳ８に比較して、比較的高くそして不釣り合いなレベルのＳ７ ｖＲＮＡを含有した。特に、プラーク力価を示さない（ゼロプラーク形成単位（ＰＦＵ））細胞は、ほとんどもっぱら、Ｓ７セグメントのこの過剰な比率の量を含有した。１～１０ＰＦＵを放出する細胞の大部分もまた、こうしたレベルを含有した。さらに、単細胞の間のウイルス力価の分布は、二峰性であるようであり、約１～１０ＰＦＵを放出するサブセットを含めて、２つの細胞下位集団が観察可能である。さらに、過剰な比率のＳ７レベルを有する細胞は、融解曲線分析におけるＳ７アンプリコンの異なる変性温度によって示されるように、（等モル比を持つ細胞に比較して）異なるＳ７ ｖＲＮＡ配列を含有するようであった。したがって、ＰＲ８ ＮＩＢＳＣは、異なるＳ７セグメントを持つビリオンの下位集団を含有しうると推測されてきている。
【0091】
こうした下位集団が異なるシードウイルス中にも存在するかどうかを試験するため、本発明者らは、細胞を、１０のＭＯＩでＰＲ８－ＲＫＩに感染させた。しかし、Ｓ７に関しては、こうした異常な振る舞いは観察されなかった。本発明者らは、Ｓ５またはＳ８に比較してＳ７ ｖＲＮＡの過剰な比率のレベルを観察せず、また、ウイルス力価のヒストグラムにおいてもいかなる二峰性も認識しなかった。同時に、ウイルス放出を示さない細胞の割合は、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製に関しては非常に低かった（ＰＲ８－ＮＩＢＳＣウイルスでの感染に関する４３％と比較して、わずか３％）。
【0092】
単細胞感染実験を用いてＯＰ７ウイルス下位集団を濃縮可能であり、そしてプラーク精製によって枯渇可能である
ＰＲ８－ＮＩＢＳＣシードウイルスにおける推定上のウイルス下位集団を濃縮可能であるかどうかを調べるため、本発明者らは、１０のＭＯＩでの単細胞感染実験（上述の通り）を行い、そして個々の細胞の上清における子孫ビリオンを、集密ＭＤＣＫ細胞を用いて拡大した。すべてのシードウイルスを、続く単細胞実験のため、１０のＭＯＩで力価決定した。
ＰＲ８－ＮＩＢＳＣシードウイルスにおける推定上のウイルス下位集団を濃縮可能であるかどうかを調べるため、本発明者らは、１０のＭＯＩでの単細胞感染実験（上述の通り）を行い、そして個々の細胞の上清における子孫ビリオンを、集密ＭＤＣＫ細胞を用いて拡大した。すべてのシードウイルスを、続く単細胞実験のため、１０のＭＯＩで力価決定した。
【0093】
実際、いくつかの単細胞由来ウイルスシードでの感染実験は、非常に顕著な異常な表現型を示した。特に、感染細胞は、Ｓ５またはＳ８に比較して、過剰な比率のレベルのＳ７ ｖＲＮＡをもっぱら含有した。これらのウイルスは、ここで、「ＯＰ７シードウイルス」と称される。さらに、ＯＰ７シードウイルス１番（ＯＰ７－１）に感染した細胞の９３％は、ウイルス放出をまったく示さない一方、ＯＰ７－２およびＯＰ７－５に関しては、割合は、それぞれ９５％および９０％であった。残りの細胞は、非常に低いウイルス力価（１～１０ＰＦＵ）を生じた。５５の単細胞由来ウイルスシード（４回の独立の実験で得られた）のうち、わずか５つのウイルスシードが望ましい表現型を示した。
【0094】
ＯＰ７ビリオンは、ビリオン中に顕著なＳ７を除いて、不完全なｖＲＮＡ内容物のため、非感染性である
ＯＰ７ウイルスの濃縮に成功したため、本発明者らは次に、ＯＰ７シードウイルス感染のさらなる特徴を探求するために、細胞集団に基づく実験を行った。このため、ＭＤＣＫ細胞を１０のＭＯＩで感染させ、そして赤血球凝集アッセイ（ＨＡ）によってウイルス力価に関して、そして１２ｈｐｉでの５０％組織培養感染性用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって感染性ビリオンに関して評価した。リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって、細胞内ｖＲＮＡおよび放出ビリオンのｖＲＮＡを定量化した。ＨＡ力価から得たウイルス粒子濃度に基づいて、感染性ウイルス粒子の割合およびビリオンあたりのｖＲＮＡの量を計算した。ＰＲ８－ＲＫＩウイルスに関して、本発明者らは、Ｓ５、Ｓ７およびＳ８に関しておよそ５のウイルス粒子あたりのｖＲＮＡコピー数を得て、これは予期される値である１と同じ桁でありそしてしたがって合理的に一致する。したがって、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスのビリオンあたりのｖＲＮＡの数を、すべての残りのウイルスの標準化に用いた（参照として）。Ｓ５、Ｓ７およびＳ８を、すべてのゲノムセグメントの代表として定量化した。
ＯＰ７ウイルスの濃縮に成功したため、本発明者らは次に、ＯＰ７シードウイルス感染のさらなる特徴を探求するために、細胞集団に基づく実験を行った。このため、ＭＤＣＫ細胞を１０のＭＯＩで感染させ、そして赤血球凝集アッセイ（ＨＡ）によってウイルス力価に関して、そして１２ｈｐｉでの５０％組織培養感染性用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって感染性ビリオンに関して評価した。リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって、細胞内ｖＲＮＡおよび放出ビリオンのｖＲＮＡを定量化した。ＨＡ力価から得たウイルス粒子濃度に基づいて、感染性ウイルス粒子の割合およびビリオンあたりのｖＲＮＡの量を計算した。ＰＲ８－ＲＫＩウイルスに関して、本発明者らは、Ｓ５、Ｓ７およびＳ８に関しておよそ５のウイルス粒子あたりのｖＲＮＡコピー数を得て、これは予期される値である１と同じ桁でありそしてしたがって合理的に一致する。したがって、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスのビリオンあたりのｖＲＮＡの数を、すべての残りのウイルスの標準化に用いた（参照として）。Ｓ５、Ｓ７およびＳ８を、すべてのゲノムセグメントの代表として定量化した。
【0095】
本発明者らは、ＲＰ８－ＲＫＩ、ＰＲ８－ＮＩＢＳＣおよびＰＰウイルスに比較して、ＯＰ７シードウイルスの特性の顕著な相違を見出さなかった。すべてのウイルスは、高い感染性力価を示し、これはおそらく、高いＭＯＩで細胞に感染することを可能にする完全に感染性であるＳＴＶの顕著な存在のためである可能性が高かった。しかし、１０のＭＯＩでのＯＰ７シードウイルスでの感染に際して、本発明者らは再び、本発明者らの先の単細胞実験と同様に、Ｓ５およびＳ８に比較して、細胞内Ｓ７ ｖＲＮＡの過剰な比率の量を観察した。興味深いことに、Ｓ５およびＳ８のレベルは、ＰＲ８－ＲＫＩおよびＰＰウイルス複製に比較して、有意に減少していた（少なくとも１桁）。さらに、ＯＰ７シードウイルス感染細胞由来のウイルス子孫の大部分は非感染性であった。より具体的には、感染性ビリオンの割合は、ＯＰ７－５に関する０．０２％からＯＰ７－４に関する０．７％の範囲であった。ＰＲ８－ＲＫＩまたはＰＰウイルス複製に比較して、これは、ＯＰ７－４に関してほぼ３ ｌоｇ１０、そしてＯＰ７－５シードウイルス感染に関しては１を超えるｌоｇ１０の産生ビリオン感染性の減少に相当する。ＯＰ７シードウイルス感染に対するＨＡ力価が、ＰＲ８－ＲＫＩに比較して、（平均して）０．８ ｌоｇ１０、そしてＰＰウイルス複製に比較して、少なくとも０．３ ｌоｇ１０単位減少していたこともやはり注目される。感染性ビリオンが低い割合であることは、セグメント特異的ＲＴ－ＰＣＲの結果が、ＯＰ７シードウイルス感染に際して産生されるビリオンにおけるサブゲノムＲＮＡの顕著な集積を示さないため、慣用的なＤＩＰ（ｃＤＩＰ）の存在によっては説明不能である。以下において、本発明者らは、ＯＰ７シードウイルスでの感染に際して放出されたウイルス粒子を「ＯＰ７ビリオン」と称する。
【0096】
ＯＰ７ビリオンの低い感染性は、むしろ、その少ないｖＲＮＡ内容物によって説明されうる。より具体的には、ビリオンあたりのＳ５およびＳ８の計算される数は、ＰＲ８－ＲＫＩおよびＰＰウイルス粒子に比較して、およそ１桁減少していた。興味深いことに、Ｓ７ ｖＲＮＡの数は影響を受けなかった。したがって、この結果は、ＯＰ７ビリオンがｖＲＮＡ内容物に関して不完全であり（Ｓ７を除く）、このため該ビリオンがシングルヒット（ｓｉｎｇｌｅ－ｈｉｔ）感染に際して複製不能となることを明らかに示す。残りの感染性は、ＳＴＶの存在によって与えられる可能性が高い。さらに、ＯＰ７ビリオンは、透過型電子顕微鏡検査の陰性染色（ｎｓ－ＴＥＭ）によって示されるように、ＰＲ８－ＲＫＩおよびＰＰビリオンに比較して、わずかにより小さいようであった。さらに、よく分離された表面スパイクタンパク質を持つ球状のＯＰ７ウイルス粒子（ＰＲ８－ＲＫＩおよびＰＰビリオンと同様）が観察されたことから、粒子形態は影響を受けていないようであった。要約すると、本発明者らは、ＯＰ７ビリオンが、主に取り込まれるＳ７を例外として、ゲノムｖＲＮＡ内容物の欠如の結果として非感染性であることを示す。
【0097】
Ｓ７－ＯＰ７の突然変異ｖＲＮＡ、影響するコードタンパク質、パッケージングシグナルおよびプロモーター領域
次に、本発明者らは、ゲノム突然変異を含有するかどうかを解明するため、ＯＰ７ビリオン由来のｖＲＮＡ配列を決定した。末端の配列決定のため、本発明者らは、ＲＮＡの環状連結に基づく方法を改善した（ｄｅ Ｗｉｔら， ２００７， Ｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９， ８５－８９）。試料体積が限定されているため、４つのＯＰ７および３つのＰＰウイルスのみを配列決定した。本発明者らの実験によって、Ｓ７－ＯＰ７のｖＲＮＡ上に有意な量の突然変異が明らかになった。置換の数は、ＰＲ８－ＲＫＩ、ＰＰウイルスおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＰＲ８（ＮＣ＿００２０１６．１）の参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）に比較して、３６～４１の範囲であった。Ｓ７－ＯＰ７に関する最高の配列類似性は、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ＰＲ８配列に関して見出されたことに注目されたい。対照的に、Ｓ５およびＳ８は、より少ない改変を示し、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスおよびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ（Ｓ５に関してはＮＣ＿００２０１９．１、およびＳ８に関してはＮＣ＿００２０２０．１）に比較して８～１６ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてＰＰウイルスに比較して０～３ｎｔの相違であった。
次に、本発明者らは、ゲノム突然変異を含有するかどうかを解明するため、ＯＰ７ビリオン由来のｖＲＮＡ配列を決定した。末端の配列決定のため、本発明者らは、ＲＮＡの環状連結に基づく方法を改善した（ｄｅ Ｗｉｔら， ２００７， Ｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９， ８５－８９）。試料体積が限定されているため、４つのＯＰ７および３つのＰＰウイルスのみを配列決定した。本発明者らの実験によって、Ｓ７－ＯＰ７のｖＲＮＡ上に有意な量の突然変異が明らかになった。置換の数は、ＰＲ８－ＲＫＩ、ＰＰウイルスおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＰＲ８（ＮＣ＿００２０１６．１）の参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）に比較して、３６～４１の範囲であった。Ｓ７－ＯＰ７に関する最高の配列類似性は、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ＰＲ８配列に関して見出されたことに注目されたい。対照的に、Ｓ５およびＳ８は、より少ない改変を示し、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスおよびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ（Ｓ５に関してはＮＣ＿００２０１９．１、およびＳ８に関してはＮＣ＿００２０２０．１）に比較して８～１６ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてＰＰウイルスに比較して０～３ｎｔの相違であった。
【0098】
図３は、ゲノムセグメントのいくつかの機能領域に関する、配列番号１のＲｅｆＳｅｑに比較した、Ｓ７－ＯＰ７ ｖＲＮＡの３７の点突然変異を例示する。
異なるＳ７配列に関して、Ｓ７－ＯＰ７上で同定されたすべての突然変異のうち、本発明者らは、これらを、異常な表現型を潜在的に生じうる、３５置換に限定した。ＯＰ７ウイルスは、さらなる置換を示すＯＰ７－４を除いて同一のＳ７配列を示し、ＯＰ７－４はこの単離体の表現型が全体としてより顕著ではなかったため、分析から排除した。さらに、この研究において、ＯＰ７ウイルスにその表現型を比較しなかったため、本発明者らは、ＲｅｆＳｅｑに対する置換を考慮しなかった。したがって、ＰＲ８－ＲＫＩおよびすべてのＰＰウイルスのＳ７配列に関して、本発明者らは３５の同一のヌクレオチド間置換を観察する。
異なるＳ７配列に関して、Ｓ７－ＯＰ７上で同定されたすべての突然変異のうち、本発明者らは、これらを、異常な表現型を潜在的に生じうる、３５置換に限定した。ＯＰ７ウイルスは、さらなる置換を示すＯＰ７－４を除いて同一のＳ７配列を示し、ＯＰ７－４はこの単離体の表現型が全体としてより顕著ではなかったため、分析から排除した。さらに、この研究において、ＯＰ７ウイルスにその表現型を比較しなかったため、本発明者らは、ＲｅｆＳｅｑに対する置換を考慮しなかった。したがって、ＰＲ８－ＲＫＩおよびすべてのＰＰウイルスのＳ７配列に関して、本発明者らは３５の同一のヌクレオチド間置換を観察する。
【0099】
配列番号２のＳ７－ＯＰ７のこれらの３５の置換は、ゲノムセグメントのいくつかの機能領域に関する（図１）。コード領域は、３２（３３）の突然変異を含有し、それぞれ、コードされるＭ１に関して１０の保存的および２つの非保存的アミノ酸（ａａ）置換、ならびにＭ２に関して４つおよび２つの突然変異を生じる。２７位で、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスがアラニン（Ａ）をそしてＰＰウイルスがチロシン（Ｔ）を含有するため、Ｍ２に関しては置換Ａ／Ｔ２７Ｖが示されることに注目されたい。Ｍ１核局在化シグナル（ＮＬＳ）および核排出シグナル（ＮＥＳ）は改変を示さず、そしてＭ１およびＭ２リーディングフレーム中にさらなる停止コドンは観察されなかった。さらに、本発明者らは、Ｍ２ ｍＲＮＡのスプライシングに影響を及ぼす部位、すなわちドナー、ブランチおよびアクセプター部位、ならびにポリピリミジン・トラクトに置換を見出さなかった。
【0100】
興味深いことに、３つ（４つ）の突然変異が非翻訳領域（ＵＴＲ）において観察され、これらはｖＲＮＡ両端のプロモーターおよびセグメント特異的非コード領域を含む。プロモーター領域は非常に保存されており、そしてそれぞれ、ｖＲＮＡの５’および３’端の非コーディング１３および１２ヌクレオチド（ｎｔ）を含む。さらに、Ｓ７－ＯＰ７ ｖＲＮＡ上で、本発明者らは、以前、「スーパープロモーター」と称されたＧ３Ａ／Ｃ８Ｕ突然変異（Ｂｅｌｉｃｈａ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら， ２０１２， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＢ１ ａｎｄ ＰＡ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６， ５９２６－５９３０）を同定した。さらに、本発明者らは、ゲノムセグメントに応じて、通常、多型である（Ｕ／Ｃ）、３’端の４番目の位（Ｃ４Ｕ）での置換を同定した。これらの３つの位での置換は、ＯＰ７ビリオンの他のセグメントでも、またＰＰおよびＰＲ８－ＲＫＩウイルスのすべてのセグメントでも見出されなかった。さらに、ＵＴＲおよびｖＲＮＡ両端のコード領域の近位部分を含む、Ｓ７のセグメント特異的ゲノムパッケージングシグナル配列は、１６（１７）ヌクレオチドの置換によって影響を受けた。総合すると、Ｓ７－ＯＰ７のｖＲＮＡは、有意な量の突然変異を示す一方、Ｓ５およびＳ８配列における置換の度合いはより低かった。３５（３７）の置換は、全ゲノムセグメントに分布し、これらはＭ１およびＭ２タンパク質配列、プロモーター領域、およびゲノムパッケージングシグナルに影響を及ぼす。
【0101】
Ｓ７－ＯＰ７上の「スーパープロモーター」は、ＯＰ７シードウイルス感染に際して改変されたウイルスＲＮＡ合成を引き起こす
各ゲノムｖＲＮＡセグメントは、ウイルス核タンパク質（ＮＰ）および三分子ウイルスポリメラーゼを含む、ウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＰ）複合体にキャプシド形成される。ひとたび核に入ると、これらはウイルスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写および相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の複製の両方に関与する。ｃＲＮＡは、それ自体、ｃＲＮＰ中でキャプシド形成され、そして子孫ｖＲＮＡ合成のための複製中間体として働く。ＯＰ７シードウイルス感染に際してのウイルスＲＮＡ合成に対するプロモーター突然変異（Ｓ７－ＯＰ７のｖＲＮＡ上に見出される）の潜在的な影響を調べるため、本発明者らは次に、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって細胞内ウイルスＲＮＡを、そしてウェスタンブロットによってウイルスタンパク質を調べた。以下において、本発明者らは、参照／ＷＴウイルス感染のため、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスを用いた。１２ｈｐｉまでに、ＯＰ７シードウイルス感染中のＳ７のｖＲＮＡはＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製のＳ５、Ｓ７およびＳ８に比較して、匹敵する量に達した。さらに、Ｓ５およびＳ８ ｖＲＮＡのレベルは有意に減少し（およそ１桁）、これは本発明者らの先の観察と一致する。
各ゲノムｖＲＮＡセグメントは、ウイルス核タンパク質（ＮＰ）および三分子ウイルスポリメラーゼを含む、ウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＰ）複合体にキャプシド形成される。ひとたび核に入ると、これらはウイルスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写および相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の複製の両方に関与する。ｃＲＮＡは、それ自体、ｃＲＮＰ中でキャプシド形成され、そして子孫ｖＲＮＡ合成のための複製中間体として働く。ＯＰ７シードウイルス感染に際してのウイルスＲＮＡ合成に対するプロモーター突然変異（Ｓ７－ＯＰ７のｖＲＮＡ上に見出される）の潜在的な影響を調べるため、本発明者らは次に、リアルタイムＲＴ－ｑＰＣＲによって細胞内ウイルスＲＮＡを、そしてウェスタンブロットによってウイルスタンパク質を調べた。以下において、本発明者らは、参照／ＷＴウイルス感染のため、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスを用いた。１２ｈｐｉまでに、ＯＰ７シードウイルス感染中のＳ７のｖＲＮＡはＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製のＳ５、Ｓ７およびＳ８に比較して、匹敵する量に達した。さらに、Ｓ５およびＳ８ ｖＲＮＡのレベルは有意に減少し（およそ１桁）、これは本発明者らの先の観察と一致する。
【0102】
興味深いことに、Ｓ７のｍＲＮＡは、Ｓ５およびＳ８と比較して、そしてＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製のすべてのｍＲＮＡに関して、より高いピーク量に到達し、６～８ｈｐｉの間で３～６倍の増加が観察された。同様に、Ｓ７ ｃＲＮＡは、他のセグメントのｃＲＮＡに比較して、そしてＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製のすべての測定したｃＲＮＡに比較して、ＯＰ７シードウイルス感染に際して、上昇したレベルに到達した。この増加は、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製に関して、６～８ｈｐｉの間で、おおよそ７倍であった。ＯＰ７シードウイルス感染におけるＳ８ ｃＲＮＡの量は、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製のものに匹敵した；しかし、Ｓ５ ｃＲＮＡのレベルはわずかに減少した。さらに、細胞内Ｍ１タンパク質は、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製に比較して、ＯＰ７シードウイルス感染に際してより多い量まで集積するようである一方、核タンパク質（ＮＰ）およびポリメラーゼ酸（ＰＡ）タンパク質の量は減少するようであった。
【0103】
以前、Ｓ２またはＳ３いずれかのｖＲＮＡ上のＧ３Ａ／Ｃ８Ｕ「スーパープロモーター」を所持する人工ＩＡＶが再構築された（Ｂｅｌｉｃｈａ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら， ２０１２， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＢ１ ａｎｄ ＰＡ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６， ５９２６－５９３０）。感染に際して、観察された表現型は、ＯＰ７シードウイルス感染に際してのＳ７に比較した際、「スーパープロモーター」を所持するセグメントからのウイルスＲＮＡおよびタンパク質合成に関して、同一の特徴を示した。さらに、該著者らは、「スーパープロモーター」を持たないウイルスに比較した際、より強いＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）誘導を示した。本発明者らは、「スーパープロモーター」を含有しないＰＲ８－ＲＫＩウイルスに感染した細胞に比較して、ＯＰ７シードウイルスに感染した細胞において、上昇したＩＦＮ－ベータおよびミクソウイルス耐性遺伝子１（Ｍｘ１）転写物レベルによって示されるように、同様の知見を得た。
【0104】
突然変異Ｍ１－ＯＰ７の核集積増進は、ｖＲＮＰの核保持を引き起こしうる
ひとたび核に入ると、Ｍ１は、ｖＲＮＰの核排出を仲介する。ＯＰ７ウイルスのＭ１タンパク質（Ｍ１－ＯＰ７）は修飾を示したため、本発明者らは次に、細胞内タンパク質輸送が、ＯＰ７シードウイルス感染に際して改変されるかどうかを調べた。この目的に向けて、本発明者らは画像化フローサイトメトリーを用いた。それぞれ、核染色７－ＡＤＤまたはＤＡＰＩと組み合わせて、抗Ｍ１または抗ｖＲＮＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のいずれかを用いて、感染細胞を染色した。核シグナルと共局在する蛍光シグナルの量に基づいて、核中のそれぞれのタンパク質／複合体の割合を計算した。
ひとたび核に入ると、Ｍ１は、ｖＲＮＰの核排出を仲介する。ＯＰ７ウイルスのＭ１タンパク質（Ｍ１－ＯＰ７）は修飾を示したため、本発明者らは次に、細胞内タンパク質輸送が、ＯＰ７シードウイルス感染に際して改変されるかどうかを調べた。この目的に向けて、本発明者らは画像化フローサイトメトリーを用いた。それぞれ、核染色７－ＡＤＤまたはＤＡＰＩと組み合わせて、抗Ｍ１または抗ｖＲＮＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のいずれかを用いて、感染細胞を染色した。核シグナルと共局在する蛍光シグナルの量に基づいて、核中のそれぞれのタンパク質／複合体の割合を計算した。
【0105】
４．５ｈｐｉまでは、核中のＭ１の割合は、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製において安定して増加し、その産生に続く核移入を示した。同時に、３～４．５ｈｐｉに、核中のｖＲＮＰの割合は、急激な減少を示し、これはウイルスゲノムの核排出を示す。したがって、核におけるＭ１の集積は、ｖＲＮＰの核排出に一致した。４．５ｈｐｉ後、ウイルス複製サイクルの経過に伴って、どちらの割合も連続して減少した。対照的に、ＯＰ７シードウイルス感染細胞に関しては、４．５ｈｐｉ後であっても、核におけるＭ１の割合の強い増加を観察可能である。画像は、９ｈｐｉでのＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製に比較して、ＯＰ７シードウイルス感染に際してのＭ１の増進された核集積を例示する。さらに、ｖＲＮＰの大きな割合が３～４．５ｈｐｉで核を離れるようである一方、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製に比較して示されるように、６ｈｐｉ以後に、ある程度のｖＲＮＰは核に留まるようであった。要約すると、画像フローサイトメトリー分析は、ＯＰ７シードウイルス感染に際して、突然変異Ｍ１－ＯＰ７の増進された核集積を示し、これが、ｖＲＮＰのある割合の見かけ上の核保持を引き起こす可能性もある。
【0106】
ＯＰ７ウイルスは、同時感染研究において、ＩＡＶの複製に干渉する
慣用的ＤＩ－ＲＮＡ（ｃＤＩ－ＲＮＡ）は、そのＦＬ対応物よりも増殖上の利点、すなわち増進されたゲノム複製および子孫ビリオン内への優先的な取り込みを有すると考えられる。興味深いことに、Ｓ７－ＯＰ７の突然変異ｖＲＮＡは、増殖において非常に類似の利点を有するようであった。本発明者らはしたがって、ＯＰ７ウイルスは、さらに、ｃＤＩＰと別の特徴：ＳＴＶの複製への干渉も共有すると仮定した。この可能性をさらに探索するため、本発明者らは同時に、ＩＡＶおよびＯＰ７ウイルスで細胞を同時感染させた。
慣用的ＤＩ－ＲＮＡ（ｃＤＩ－ＲＮＡ）は、そのＦＬ対応物よりも増殖上の利点、すなわち増進されたゲノム複製および子孫ビリオン内への優先的な取り込みを有すると考えられる。興味深いことに、Ｓ７－ＯＰ７の突然変異ｖＲＮＡは、増殖において非常に類似の利点を有するようであった。本発明者らはしたがって、ＯＰ７ウイルスは、さらに、ｃＤＩＰと別の特徴：ＳＴＶの複製への干渉も共有すると仮定した。この可能性をさらに探索するため、本発明者らは同時に、ＩＡＶおよびＯＰ７ウイルスで細胞を同時感染させた。
【0107】
実際、同時感染実験は、ＰＲ８－ＲＫＩウイルスの減弱された複製を示した（図２Ａ）。ＰＲ８－ＲＫＩのみ（ＭＯＩ＝１０）に感染させた細胞に比較して、同時感染させた細胞（１０のＭＯＩでＯＰ７およびＰＲ８－ＲＫＩウイルス両方）は、減少したＨＡ力価（０．８単位分）、放出されるビリオンの感染性の重度の減少（＝３桁）、ならびにＳ５およびＳ８に関してＳ７ ｖＲＮＡの過剰な比率の量（細胞内および放出されたウイルス粒子において）を示した。したがって、ＯＰ７シードウイルスのみ（ＭＯＩ＝１０）に感染した細胞に比較した際、（より顕著ではないとしても）同じ表現型がこうした混合感染において観察された。さらに、干渉強度は、ＯＰ７シードウイルスのＭＯＩを減少させると、希釈可能であった。
【0108】
ＯＰ７ウイルスがまた、ヒト細胞株においても、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製への干渉を示すかどうかを調べるため、本発明者らは次に、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）およびＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来）を同時感染研究において用いた。再び、実験は、ＰＲ８－ＲＫＩのみに感染した細胞に比較して、ＨＡ力価の減少、放出されるビリオンの感染性の強い減少および産生されるウイルス粒子におけるＳ７ ｖＲＮＡの過剰な比率のレベルによって示されるように、干渉を明らかにした（図２Ｂ、２Ｃ）。同様に、ＭＤＣＫ細胞における同時感染研究はまた、ＨＡ力価および放出されるビリオンの感染性の減少によって示されるように、Ｈ１Ｎ１サブタイプのパンデミックインフルエンザウイルスＡ／カリフォルニア／７／２００９（Ｈ１Ｎ１－ｐｄｍ０９）への、そしてさらには異種Ｈ３Ｎ２サブタイプインフルエンザウイルスＡ／香港／４８０１／２０１４への干渉も示した（図２Ｄ、２Ｅ）。総合すると、本発明者らの実験は、ＭＤＣＫ細胞および２つのヒト細胞株の両方における、ＰＲ８－ＲＫＩウイルス複製へのＯＰ７ウイルスの強い干渉、ならびにＨ１Ｎ１－ｐｄｍ０９およびＨ３Ｎ２ウイルス複製への干渉を立証した。
【0109】
考察
これまでに、ＤＩＰは主に、その内部ゲノム欠失に関して同定され、そして特徴づけられてきた。対照的に、本研究において、本発明者らは、ゲノムセグメントの１つにおけるヌクレオチド置換を含有するＩＡＶ由来ＤＩＰの新規タイプの発見を報告する。ＯＰ７ウイルスは、ＳＴＶとの同時感染に際して、ｃＤＩＰと非常に類似の特徴、すなわち（ｉ）他のセグメントに勝るＤＩゲノムのゲノム複製の増進、（ｉｉ）子孫ビリオン内への優勢なパッケージング、（ｉｉｉ）自然免疫誘導の増進、（ｉｖ）ゲノム情報を欠くため非感染性であるウイルス粒子の放出、および（ｖ）ＳＴＶの複製への干渉を共有する。
これまでに、ＤＩＰは主に、その内部ゲノム欠失に関して同定され、そして特徴づけられてきた。対照的に、本研究において、本発明者らは、ゲノムセグメントの１つにおけるヌクレオチド置換を含有するＩＡＶ由来ＤＩＰの新規タイプの発見を報告する。ＯＰ７ウイルスは、ＳＴＶとの同時感染に際して、ｃＤＩＰと非常に類似の特徴、すなわち（ｉ）他のセグメントに勝るＤＩゲノムのゲノム複製の増進、（ｉｉ）子孫ビリオン内への優勢なパッケージング、（ｉｉｉ）自然免疫誘導の増進、（ｉｖ）ゲノム情報を欠くため非感染性であるウイルス粒子の放出、および（ｖ）ＳＴＶの複製への干渉を共有する。
【0110】
高いＭＯＩの単細胞感染研究によって、個々の感染細胞の下位集団における異常なＯＰ７の表現型を認識し、そしてこれらの細胞の上清において、放出されたＯＰ７ビリオンを採取することが可能になった。単一ＩＡＶ感染細胞のウイルス力価が最大（理論的に）おおよそ１０００ＰＦＵにしか到達しないため、低いＭＯＩ感染しか生じえない、およそ１ｘ１０６細胞を用いて、この上清におけるウイルスの増殖を行った。典型的には、低ＭＯＩ条件下、ｃＤＩＰを含有するウイルスシードでの感染は、高い感染性のウイルス力価を導くことが可能であり、これはまた、生じるＯＰ７シードウイルスに関しても当てはまった。これらの感染条件は、同時感染事象を減少させ、そして細胞は、大部分、単一ウイルス粒子によって感染する。したがって、ＳＴＶ感染細胞は、主に感染性のウイルス子孫を生じる；が、最初は、ＤＩＰのみに感染した細胞は、ウイルス産生には寄与できない。さらに、特定の時間ウィンドウに関して、これらの細胞はなお、新規に産生されるＳＴＶに同時感染し、これは続いて、これらの細胞を（主に）ＤＩＰ産生型に変換する。したがって、低ＭＯＩ感染に関しては、通常、放出されるウイルス集団において、感染性ビリオンが優勢である。対照的に、生じたＯＰ７シードウイルスを高ＭＯＩで用いると、本発明者らは、非常に低い割合の放出感染性ビリオンを観察し；この結果は、ｃＤＩＰを含有するシードウイルスからもまた予期可能である。この感染条件は、同時感染事象を育成し、そしてしたがって、早い時期にＳＴＶでＤＩＰ感染細胞を補完する。したがって、ＤＩゲノムが増殖上、利点を有する結果として、生じるウイルス集団において、主に、非感染性のＤＩＰが集積する。
【0111】
本発明者らのデータは、これらの放出されるＯＰ７ビリオンが、その減少したｖＲＮＡ内容物のため非感染性であることを示す。より具体的には、ＷＴビリオンに比較して、ｖＲＮＡの数は、おおよそ１桁減少する一方、Ｓ７の量は影響を受けなかった。これらの計算された数は、理論的には、（ｉ）わずか～１０％の粒子が完全である、すなわちこれらは８つの異なるゲノムセグメント各々を含有する一方、残りのビリオンはＳ７しか含有しないか、あるいは（ｉｉ）すべてのウイルス粒子がＳ７を含有する；が、これらは残りの７つのセグメントのかなりの部分を欠く、ウイルス集団を生じうる。しかし、感染性ビリオンの割合は、（ＷＴビリオンに比較して）２桁より多く減少するため、第二のシナリオのみが決定的であるようである。残りの感染性は、残ったＳＴＶの存在、８つの機能性セグメントのランダムなパッケージング（より詳細には以下を参照されたい）、または同時感染を通じた、すべての機能性ゲノムセグメントでの感染細胞の補完によって説明可能である。さらに、ＯＰ７ビリオンがウイルス複製において不全であるという本発明者らの結論は、ＰＲ８－ＮＩＢＳＣウイルス（ＯＰ７ウイルスを含有する）由来のプラーク精製の結果によってさらに支持される。各プラークは、単一ウイルス粒子による細胞の感染から生じると仮定可能である。しかし、生じる４３のウイルス単離体のいずれも、感染実験において、ＯＰ７ウイルス表現型を示さず、このことは、ＯＰ７ビリオンが増殖不能であることを示す。
【0112】
Ｓ７のセグメント特異的ゲノムパッケージングシグナル配列は、１６（１７）の突然変異によって影響を受け、これは、ＯＰ７ビリオンの異常なｖＲＮＡ内容物を説明しうる。典型的には、ウイルス組み立ておよび出芽は、よく編成されたプロセスであり、この中で、８つの異なるｖＲＮＡが、各ウイルス粒子内に選択的に取り込まれ、これにはパッケージングシグナルが伴う。しかし、株に応じて、最大２０％のビリオンがなお、少なくとも１つのｖＲＮＡのパッケージングに失敗しうる。さらに、シグナル配列においてすでに４つの突然変異がｖＲＮＡパッケージングを破壊可能であるため、ＩＡＶゲノムパッケージングプロセスにおいて、Ｓ７が重要な役割を果たすと示唆された（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら， ２００８， Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔ ７ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２， １１８６９－１１８７９）。ＯＰ７シードウイルスを用いた感染実験の本発明者らの結果と同様、該著者らは、（ＷＴウイルス複製に比較して）２桁より大きい放出された感染性ビリオンの割合の劇的な減少を観察した。この減少は、ビリオンのうちわずかしか完全ゲノムを取り込まないランダムパッケージングプロセスに関して予測される減少と等しかった。対照的に、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎおよび同僚らは、放出されるウイルス粒子において、Ｓ７ ｖＲＮＡの過剰提示を観察しなかった（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、２００８、上記を参照されたい）。破壊されたゲノムパッケージングおよびＳ７ ｖＲＮＡの観察された過剰な比率の細胞内レベルの組み合わせが、前記ビリオンの形成を生じうる可能性がある。あるいは、Ｓ７－ＯＰ７の突然変異ｖＲＮＡに対してはさらなる機構が作用しうる。しかし、最終的に、ＯＰ７ビリオンにおいて、Ｓ７－ＯＰ７が他のゲノムセグメントより優勢となり；これは、ＦＬ対応物よりも優先的にパッケージングされるｃＤＩ－ＲＮＡとの類似性を示しうる観察である。
【0113】
以前、Ｓ２またはＳ３いずれかのｖＲＮＡ上のＧ３Ａ／Ｃ８Ｕ「スーパープロモーター」を所持する人工ＩＡＶが再構築された（Ｂｅｌｉｃｈａ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら， ２０１２， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＢ１ ａｎｄ ＰＡ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６， ５９２６－５９３０）。感染に際して、観察された表現型は、ＯＰ７シードウイルス感染に際してのＳ７－ＯＰ７（Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕを所持する）に比較した際、Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕを所持するセグメントからのウイルスＲＮＡおよびタンパク質合成に関して、非常に類似の細胞内特徴を示した。
より具体的には、（ｉ）Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕを所持するｖＲＮＡを除く、すべてのゲノムセグメントのｖＲＮＡレベルの強い減少、（ｉｉ）前記セグメント由来のｍＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびタンパク質合成の増進、ならびに（ｉｉｉ）ＷＴウイルス複製に比較した、Ｉ型ＩＦＮレベルの増加が観察されてきている。後者の観察に関して、誘導の増加は、免疫刺激性ＲＮＡ分子の量の増加によって引き起こされる可能性が高いことが示された。自然免疫のこうした誘導増進はまた、慣用的ＤＩＰでの感染に関しても観察される。さらなるＧ４Ｕ置換（本明細書において、Ｓ７－ＯＰ７に記載される）もまた、プロモーター機能に影響を及ぼしうる。
より具体的には、（ｉ）Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕを所持するｖＲＮＡを除く、すべてのゲノムセグメントのｖＲＮＡレベルの強い減少、（ｉｉ）前記セグメント由来のｍＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびタンパク質合成の増進、ならびに（ｉｉｉ）ＷＴウイルス複製に比較した、Ｉ型ＩＦＮレベルの増加が観察されてきている。後者の観察に関して、誘導の増加は、免疫刺激性ＲＮＡ分子の量の増加によって引き起こされる可能性が高いことが示された。自然免疫のこうした誘導増進はまた、慣用的ＤＩＰでの感染に関しても観察される。さらなるＧ４Ｕ置換（本明細書において、Ｓ７－ＯＰ７に記載される）もまた、プロモーター機能に影響を及ぼしうる。
【0114】
重要なことに、Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕ突然変異のみでは、全ＯＰ７ウイルス表現型を生じず、これは、Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕを所持するｖＲＮＡセグメントが、ＯＰ７ウイルス感染におけるＳ７－ＯＰ７とは異なり、感染の背景において、子孫ビリオン内に主にはパッケージングされないためである（Ｂｅｌｉｃｈａ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら， ２０１２， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＢ１ ａｎｄ ＰＡ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６， ５９２６－５９３０）。これは、ＯＰ７ウイルスの欠損性および干渉性表現型のためには、Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕに加えて、さらなる突然変異（Ｓ７－ＯＰ７に見られるもの）が必要であることを示す。さらに、Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕ突然変異が、ＤＩＰ様表現型を生じることはなお記載されなかった。Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕ置換はこれまでに、ＩＡＶのｖＲＮＡ内に人工的に導入されたに過ぎなかった。したがって、Ｓ７－ＯＰ７が選択によって、「天然に」Ｇ３Ａ／Ｃ８Ｕを得たようであることは注目に値する。その結果、Ｓ７－ＯＰ７のゲノムｖＲＮＡは、他のゲノムセグメントに比較して、おおよそ１０倍高い細胞内レベルまで集積する。この特徴は、再び、ＦＬ対応物よりも優先的に合成される慣用的なＤＩゲノムに対する類似性を示す；が、これは別の理由のため、すなわちおそらくは、長さが減少していることによる、より迅速な集積の結果である。
【0115】
Ｓ７－ＯＰ７のコード領域は、３２（３３）の突然変異を示し、Ｍ１およびＭ２（イオンチャネル）タンパク質に関する２つの非保存的置換の両方を生じる。他の機能の中でも、両タンパク質はまた、ウイルス組み立てにも重要であり、これは、ＯＰ７ビリオンの異常なｖＲＮＡ内容物に関するさらなる説明を提供しうる。さらに、タンパク質の改変はまた、ウイルス形態にも影響を及ぼす可能性もあり、線維状ビリオンを含む多様な形態型を示す。
【0116】
Ｍ１タンパク質はまた、ｖＲＮＰの核排出にも関与する。本発明者らは、Ｍ１－ＯＰ７のＮＬＳおよびＮＥＳにおける改変を同定しなかったが、にも関わらず、該タンパク質は、ＯＰ７シードウイルス感染に際して、核における異常に高い集積を示した。同時に、ＷＴウイルス複製に比較して、ｖＲＮＰの割合は、核において保持されるようであった。この背景において、Ｍ１がウイルス核排出タンパク質（ＮＥＰ）およびｖＲＮＰの結合を仲介し、これが次に、ＮＥＰに位置するＮＥＳによって核から排出される複合体を形成すると考えられる。したがって、ＮＥＰおよび／またはｖＲＮＰへのＭ１－ＯＰ７の結合部位が改変され、これがこれらの核保持を導くと考えられる。ｖＲＮＰのある割合は、感染後早い時点で核から排出され、これは同時感染ＳＴＶからのある程度の機能的なＭ１の合成によって説明されうることに注目されたい。ゲノムｖＲＮＰの部分的な核保持は、ＯＰ７ウイルス同時感染に際して観察されるウイルス力価の減少に寄与しうる。したがって、突然変異Ｍ１－ＯＰ７の妨害された機能が、ＯＰ７ウイルスの干渉能に、またはさらにウイルス複製における欠陥に寄与すると考えられる。
【0117】
ＯＰ７ビリオンは、適切な同種および異種ＩＡＶ株のウイルス複製への強い干渉、ならびにヒト細胞株における干渉を示すため、抗ウイルス療法の有望な候補でありうる。さらに、ＯＰ７シードウイルス感染に際して観察される自然免疫誘導の増進は、抗ウイルス療法の背景において、さらに有益でありうる。
【0118】
要約すると、本発明者らは、ＯＰ７ビリオンが、ＩＡＶに由来する、ＤＩＰのまだ認識されていない型であると提唱する。Ｓ７－ＯＰ７のｖＲＮＡは、ＩＡＶ複製に対して強い阻害効果を発揮し、ウイルス構成要素の産生を減少させる一方、それ自体の複製および蔓延を支持する。特に、「スーパープロモーター」は、ｖＲＮＡにゲノム複製における利点を与える一方、突然変異パッケージングシグナルから生じる可能性もある他の未知の機構が、ウイルス粒子内への該分子の優勢な取り込みを生じる。同時に、ＯＰ７ウイルス粒子における他のゲノムｖＲＮＡセグメントの欠如によって、これらはウイルス複製不全となる。最後に、ＩＡＶ複製への強い干渉能のため、ＯＰ７ビリオンは、抗ウイルス療法のための有望な候補であることがわかる可能性もある。
【0119】
したがって、本発明記載の核酸分子、特に配列番号３のｐｉＲＮＡは、インフルエンザウイルス複製に対する阻害性および干渉性効果を有する抗ウイルス剤として、適切な手段に相当する。したがって、本発明記載の核酸配列、ならびに本発明記載の組成物およびウイルス様粒子およびウイルスベクターは、ウイルス感染の予防的および療法的治療を可能にする適切なワクチンおよび薬学的組成物に相当する。ｐｉＲＮＡの存在は、ウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスの天然感染の蔓延を阻害しうる。さらに、自然免疫反応に対する陽性の効果のため、抗ウイルス効果のさらなる促進が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】