特許 7324565 ＣＤ１２７に対する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-02

(45)【発行日】2023-08-10

(54)【発明の名称】ＣＤ１２７に対する抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20230803BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230803BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230803BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230803BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

A61K39/395 U

A61P1/04

A61P3/10

A61P5/14

A61P11/00

A61P17/00

A61P19/02

A61P25/00

A61P29/00 101

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/02

A61P37/08

C12N15/13 ZNA

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2017517406

(86)(22)【出願日】2015-06-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2017-08-17

(86)【国際出願番号】 EP2015062993

(87)【国際公開番号】W WO2015189302

(87)【国際公開日】2015-12-17

【審査請求日】2018-06-08

【審判番号】

【審判請求日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】62/010,117

(32)【優先日】2014-06-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】15305078.6

(32)【優先日】2015-01-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516371254

【氏名又は名称】オセ イムノセラピューティクス

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス ポイリエル

(72)【発明者】

【氏名】カロリネ マリ

(72)【発明者】

【氏名】ベルナルド バンホベ

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】牧野 晃久

【審判官】飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１１－５３０５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１７７９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５２２１７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N 1/00- 15/90

C07K 1/00- 19/00

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＤ１２７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片であって、該抗体又はその抗原結合性断片が、
以下のアミノ酸配列：
・ＶＨＣＤＲ１配列番号１０；
・ＶＨＣＤＲ２配列番号１２；及び
・ＶＨＣＤＲ３配列番号１４もしくは配列番号４８
を含むＶＨ鎖、及び
以下のアミノ酸配列：
・ＶＬＣＤＲ１配列番号１６もしくは配列番号５０；
・ＶＬＣＤＲ２配列番号１８もしくは配列番号５２；及び
・ＶＬＣＤＲ３配列番号２０
を含むＶＬ鎖を含む、前記抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項2】

－配列番号２及び配列番号４、又は
－配列番号６及び配列番号８、又は
－配列番号５４及び配列番号５６、又は
－配列番号２２及び配列番号２４、又は
－配列番号３６及び配列番号４２、又は
－配列番号３８及び配列番号４４、又は
－配列番号４０及び配列番号４６
からなる群からの重鎖及び軽鎖を含む、請求項１記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項3】

ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させない、請求項１又は２記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項4】

キメラ抗体又はヒト化抗体又は脱免疫化抗体である、請求項１～３のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片を含むキメラ分子である巨大分子であって、
該抗体、断片が機能的に異なる分子と関連しており、該キメラ分子が融合キメラタンパク質か、又は化学基もしくは生物学的分子の共有結合によって得られるコンジュゲートかのどちらかである、前記巨大分子。

【請求項6】

前記コンジュゲートの分子が、ＰＥＧポリマーもしくは標識である、請求項５記載の巨大分子。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合性断片又は請求項５もしくは６記載の巨大分子の、重鎖及び軽鎖をコードする、核酸分子又は核酸分子の組合せであって、
該核酸分子が、
－配列番号２及び配列番号４、又は
－配列番号６及び配列番号８、又は
－配列番号２２及び配列番号２４、又は
－配列番号３６及び配列番号４２、又は
－配列番号３８及び配列番号４４、又は
－配列番号４０及び配列番号４６、又は
－配列番号５４及び配列番号５６
からなる群から選択されるアミノ酸をコードする、前記核酸分子又は核酸分子の組合せ。

【請求項8】

前記核酸分子が、
－配列番号１及び配列番号３、又は
－配列番号５及び配列番号７、又は
－配列番号２１及び配列番号２３、又は
－配列番号３５及び配列番号４１、又は
－配列番号３７及び配列番号４３、又は
－配列番号３９及び配列番号４５、又は
－配列番号５３及び配列番号５５
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はこれらからなる、請求項７記載の核酸分子又は核酸分子の組合せ。

【請求項9】

請求項１～４のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合性断片又は請求項５もしくは６記載の巨大分子をコードする、核酸分子又は核酸分子の組合せであって、
該抗体もしくはその抗原結合性断片又は巨大分子が、
(i) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号１４、及び配列番号１６、及び配列番号１８、及び配列番号２０；又は
(ii) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号１４、及び配列番号５０、及び配列番号１８、及び配列番号２０；又は
(iii) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号１４、及び配列番号１６、及び配列番号５２、及び配列番号２０；又は
(iv) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号１４、及び配列番号５０、及び配列番号５２、及び配列番号２０；又は
(v) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号４８、及び配列番号１６、及び配列番号１８、及び配列番号２０；又は
(vi) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号４８、及び配列番号５０、及び配列番号１８、及び配列番号２０；又は
(vii) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号４８、及び配列番号１６、及び配列番号５２、及び配列番号２０、又は
(viii) 配列番号１０、及び配列番号１２、及び配列番号４８、及び配列番号５０、及び配列番号５２、及び配列番号２０
のアミノ酸を含むＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、前記核酸分子又は核酸分子の組合せ。

【請求項10】

前記核酸分子が、
(i) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号１５、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(ii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号４９、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(iii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号１５、及び配列番号５１、及び配列番号１９；又は
(iv) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号４９、及び配列番号５１、及び配列番号１９；又は
(v) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号１５、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(vi) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号４９、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(vii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号１５、及び配列番号５１、及び配列番号１９；又は
(viii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号４９、及び配列番号５１、及び配列番号１９
のヌクレオチド配列を含む、請求項９記載の核酸分子又は核酸分子の組合せ。

【請求項11】

請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項５もしくは６記載の巨大分子、又は請求項７～１０のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸分子の組合せを医薬ビヒクルとともに含む、医薬組成物。

【請求項12】

異なる活性成分、治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物、又は自己免疫疾患、アレルギー疾患、白血病、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、癌疾患、慢性ウイルス感染、炎症性疾患、移植、呼吸器疾患、もしくは自己免疫に関与する細胞に対して治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物をさらに含む、請求項１１記載の医薬組成物。

【請求項13】

患者における併用治療レジメンの治療又は追加治療レジメンの治療のための医薬組成物であって、
治療活性成分として、請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項５もしくは６記載の巨大分子、又は請求項７～１０のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸分子の組合せを含む、前記医薬組成物。

【請求項14】

異なる活性成分、治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物、又は自己免疫疾患、アレルギー疾患、白血病、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、癌疾患、慢性ウイルス感染、炎症性疾患、移植、呼吸器疾患、もしくは自己免疫に関与する細胞に対して治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物をさらに含む、請求項１３記載の医薬組成物。

【請求項15】

患者における併用治療レジメン又は追加治療レジメンに使用する医薬品の製造のための治療活性成分としての、請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項５もしくは６記載の巨大分子、又は請求項７～１０のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸分子の組合せ、又は請求項１１～１４のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。

【請求項16】

移植を必要としている及び／又はもうすぐ移植を受ける患者、及び／又は移植を受けた患者、及び／又は疾患を有するか、或いは該疾患のリスクがある患者の治療のための医薬組成物であって、
請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項５もしくは６記載の巨大分子、又は請求項７～１０のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸分子の組合せを含む、前記医薬組成物。

【請求項17】

自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、もしくは狼瘡、又は炎症性疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、もしくは脳脊髄炎、又はアレルギー疾患、又は癌疾患、又は呼吸器疾患、又は移植に関連する疾患からなる群から選択される疾患の治療のための医薬組成物であって、
請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項５もしくは６記載の巨大分子、又は請求項７～１０のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸分子の組合せを含む、前記医薬組成物。

【請求項18】

異なる活性成分、治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物、又は自己免疫疾患、アレルギー疾患、白血病、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、癌疾患、慢性ウイルス感染、炎症性疾患、移植、呼吸器疾患、もしくは自己免疫に関与する細胞に対して治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物をさらに含む、請求項１６又は１７記載の医薬組成物。

【請求項19】

移植を必要としている及び／又はもうすぐ移植を受ける患者、及び／又は移植を受けた患者を治療するための、及び／又は疾患を有するか、或いは該疾患のリスクがある患者を治療するための医薬品の製造のための、請求項１～４のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片、又は請求項５もしくは６記載の巨大分子、又は請求項７～１０のいずれか一項記載の核酸分子又は核酸分子の組合せ、又は請求項１１～１４のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。

【請求項20】

前記疾患が、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、もしくは狼瘡、又は炎症性疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、もしくは脳脊髄炎、又はアレルギー疾患、又は癌疾患、又は呼吸器疾患、又は移植に関連する疾患からなる群から選択される、請求項１９記載の使用。

【請求項21】

抗体を製造する方法であって、
－配列番号１及び配列番号３、又は
－配列番号５及び配列番号７、又は
－配列番号２１及び配列番号２３、又は
－配列番号３５及び配列番号４１、又は
－配列番号３７及び配列番号４３、又は
－配列番号３９及び配列番号４５、又は
－配列番号５３及び配列番号５５
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はこれらからなるポリヌクレオチドを、低いフコシル化特性を示す細胞で、抗体の回収を可能にする条件で発現させること、及び
ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達のアンタゴニストである抗体を回収すること
を含む、前記方法。

【請求項22】

抗体を製造する方法であって、
(i) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号１５、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(ii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号４９、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(iii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号１５、及び配列番号５１、及び配列番号１９；又は
(iv) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号１３、及び配列番号４９、及び配列番号５１、及び配列番号１９；又は
(v) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号１５、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(vi) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号４９、及び配列番号１７、及び配列番号１９；又は
(vii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号１５、及び配列番号５１、及び配列番号１９；又は
(viii) 配列番号９、及び配列番号１１、及び配列番号４７、及び配列番号４９、及び配列番号５１、及び配列番号１９
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、低いフコシル化特性を示す細胞で、抗体の回収を可能にする条件で発現させること、及び
ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達のアンタゴニストである抗体を回収すること
を含む、前記方法。

【請求項23】

前記抗体が請求項１～４のいずれか一項記載の抗体である、請求項２１又は２２記載の抗体を製造する方法。

【請求項24】

前記低いフコシル化特性を示す細胞が、鳥類ＥＢ６６細胞である、請求項２１～２３のいずれか一項記載の抗体を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＤ１２７又はｐ９０ ＩＬ－７Ｒ又はＩＬ－７Ｒアルファ又はＩＬ－７Ｒαと表される－ＩＬ－７Ｒａと記されることもある－インターロイキン７（ＩＬ－７）の受容体のアルファサブユニット、特に、ヒト細胞上に発現されるヒトＩＬ－７の受容体のアルファ鎖に対する抗体の分野に関する。これらの抗体は、ＩＬ－７－ＩＬ－７Ｒ相互作用に対するアンタゴニスト特性を有し、ＣＤ１２７陽性細胞に対する細胞傷害活性を提示し得るが、同じくその受容体の一部としてＣＤ１２７を用いるサイトカインであるＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞（ＤＣ）の成熟を増大させない。代わりに、又はさらに、これらの抗体は、ＣＤ１２７の内在化を誘導せず、及び／又はＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する。本発明の別の態様によれば、ＣＤ１２７の２ｂ部位由来の配列を含むヒトＣＤ１２７エピトープを認識する抗体が提供され、特に、該エピトープは、ドメインＤ１のヒトＣＤ１２７配列及びＣＤ１２７の２ｂ部位のヒトＣＤ１２７配列を含み、特に、該エピトープは、配列番号１１５（特に、配列番号１１０を含む）を含むＤ１由来の少なくとも１つの配列及び配列番号１１６の配列を含む２ｂ部位由来の配列を含み、かつ任意に、配列番号１１７（特に、配列番号１１１を含む）も含む。

【0002】

したがって、本発明の抗体は、ＩＬ－７シグナル伝達経路がリンパ球産生に関連する病因に寄与するとき、とりわけ、樹状細胞の成熟、より正確には、樹状細胞の共刺激分子の上方調節の増大が望ましくない場合、ヒト患者で診断される該病因に起因する状態を改善するための使用に好適である。

【背景技術】

【0003】

（生化学）
ＣＤ１２７は、ＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）とＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）に共通している。ＩＬ－７Ｒは、ＣＤ１２７とインターロイキン受容体の共通ガンマ鎖（γｃ）のヘテロ二量体から構成される。共通ガンマ鎖γｃは、本明細書において及び文献において、ＣＤ１３２と呼ばれることもある。ＩＬ－７Ｒは、インターロイキン７によって結合される。ＴＳＬＰ受容体は、ＣＤ１２７とサイトカイン受容体様因子２（ＣＲＬＦ２）のヘテロ二量体である。ＴＳＬＰ受容体はＴＳＬＰによって結合される。文献では、ＴＳＬＰＲを用いて、この受容体のＣＲＬＦ２鎖とＣＤ１２７／ＣＲＬＦ２複合体の両方を表すこともある。混乱を避けるために、以下において、ＴＳＬＰＲは、通常、この複合体を表す。

【0004】

ＣＤ１２７（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１６８７１）は４つのアイソフォームで存在し得る。Ｈ２０（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１６８７１．１）とも呼ばれる標準的アイソフォームは、１回膜貫通タンパク質であり、Ｎ－末端からＣ－末端にかけて、２０アミノ酸のシグナルペプチド、２１９アミノ酸の細胞外ドメイン、２５アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び１９５アミノ酸の細胞内ドメインからなる４５９個のアミノ酸を有する。他のアイソフォームは、Ｈ２０の細胞外ドメインの全て（又は大部分）の配列を共有し、様々に異なるＣ－末端配列を示す。アイソフォーム２及び４（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１６８７１－４及びＰ１６８７１－３）は分泌され、一方、アイソフォーム３（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ１６８７１－２）も膜貫通タンパク質である。シグナルペプチドのないＣＤ１２７の配列は、本明細書において、配列番号５７として提供される。本出願においてＣＤ１２７の付番されたアミノ酸に言及するとき、該配列は、付番の基準としての役割を果たす。ＣＤ１２７は、配列番号１１３の配列を有することが報告されており、その細胞外ドメインは、シグナルペプチドが除去されたとき、配列番号１１４の配列を有する。別途明記されない限り、ＣＤ１２７のアミノ酸に対して本明細書で使用される付番は、配列番号１１４からの付番である。

【0005】

ＣＤ１２７は、サイトカイン受容体相同性クラスＩ（ＣＲＨ Ｉ）受容体である。当技術分野で周知の通り、これらの受容体の細胞外ドメインは、Ｄ１及びＤ２と呼ばれる２つのフィブロネクチン３ドメインからなる。ＣＤ１２７の正確な結晶構造は、例えば、ＭｃＥｌｒｏｙらの文献（２００９）； ＭｃＥｌｒｏｙらの文献（２０１２）、及びＷａｌｓｈの文献（２０１２）で発表され、考察されており、特に、タンパク質構造データとして、構造バイオインフォマティクス研究共同体データバンク（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）（ＲＣＳＢ ＰＤＢ）のデータベースに、３ＵＰ１というアクセッション番号で開示されている。Ｄ１は、ＩＬ－７との結合に関与すると一般に考えられるが、Ｄ２は、γｃ鎖との（さらには、ＩＬ－７との）結合に関与する。重要なことに、本質的に配列番号１１４のアミノ酸１０９～１２７からなるドメインＤ２の部位２ｂ（Ｗａｌｓｈの文献、２０１２参照）は、特に、ＩＬ－７の存在下でのＣＤ１２７とγｃとの結合を可能にし又は該結合を増大させるＣＤ１２７－γｃ相互作用にとって極めて重要である。特に、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）に罹患している患者で同定されているＰ１１２及びＬ１１５における突然変異は、おそらくその病原性特徴をもたらすＤ２ドメインの疎水性コアを不安定にすると考えられる。上述のように、この２ｂ部位は、本質的にアミノ酸１０９～１２７からなり；当業者であれば、そのようなドメインの両端を１塩基の確度で必ずしも明確には規定し得ないということ、及びこの２ｂ部位を、言及された配列のどちらか又は両方の末端で、１つ、２つ、もしくは３つ多い又は１つ、２つ、もしくは３つ少ないアミノ酸を含むものであると理解し得るということを認識しているであろう。それゆえ、本明細書においてＣＤ１２７の２ｂ部位に言及するとき、これは、位置１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、又は１１２から始まり、位置１２４、１２５、１２６、又は１２７で終わるＣＤ１２７の配列；具体的には、特に、ＩＬ－７の存在下で、ＩＬ７－Ｒのγｃ鎖との本質的な結合部位を構成すると考えられるか又はそれが示されるような配列を指すものであると理解すべきである。

【0006】

（ＩＬ－７Ｒシグナル伝達）
ＩＬ－７のＩＬ－７Ｒへの結合は、Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）－１及び－３、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）、及びホスファチジルイノシトール ３－キナーゼ（ＰＩ３－ｋ）を含む、いくつかのシグナル伝達経路の活性化を誘発する。ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３経路が活性化されることが報告されているが、それらは主要な経路ではないように思われる。ＳＴＡＴ５経路の活性化は、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ－２の誘導及びアポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘのミトコンドリアへの侵入の防止に必要とされ、したがって、胸腺で発生するＴ細胞前駆細胞の生存に必要とされる。ＰＩ３－ｋ経路の活性化は、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｄのリン酸化及び細胞質保持をもたらす。

【0007】

（ＴＳＬＰＲシグナル伝達）
胸腺間質性リンホポイエチン（ＴＳＬＰ）は、リンパ球産生に活性があり、特に、免疫系の細胞の発生の調節に関与する上皮細胞サイトカインであり、該調節は、特に、該細胞の成熟に影響を及ぼす。ヒトＴＳＬＰ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３８７３２）は、樹状細胞の分極化を働かせ、Ｔ細胞及びＢ細胞の増殖及び分化を促進する因子である。ＴＳＬＰはまた、Ｔｒｅｇ細胞の発生を抑制する（Ｌｅｉらの文献、２０１１）。

【0008】

ＴＳＬＰ誘導性シグナル伝達経路は、分子レベルで、ＩＬ－７誘導性経路とは異なることが示されている。特に、その受容体へのＴＳＬＰの結合はＪａｋ－１も活性化させるが、それは、Ｊａｋ－３を活性化させることはなく、しかし、Ｊａｋ－２を活性化させる。これらの違いは、Ｊａｋ－１が両方の受容体によって共有されるＣＤ１２７と関連し、一方、Ｊａｋ－２がＣＲＬＦ２と関連し、Ｊａｋ－３がγｃと関連するという観察と一致している（Ｒｏｃｈｍａｎらの文献、２０１０）。ＳＴＡＴ５経路の活性化もＴＳＬＰ誘導性シグナル伝達について報告されている（Ｚｈｏｎｇらの文献、２０１４）。ＴＳＬＰの１つの主要な作用は、樹状細胞の活性化をもたらし、ＣＤ８０などの共刺激分子の過剰発現を誘導し、それにより、ＴＨ－２媒介性炎症応答を促進することである（Ｒｅｃｈｅらの文献、２００１）。

【0009】

（細胞生物学）
「ＣＤ１２７陽性細胞」は、その細胞表面でＣＤ１２７を発現する細胞を表す。ほとんどの場合、ＣＤ１２７陽性細胞は、ＩＬ－７Ｒを形成する複合体中に（ＩＬ－７Ｒ陽性細胞）及び／又はＴＳＬＰＲを形成する複合体中に（ＴＳＬＰＲ陽性細胞）、ＣＤ１２７を発現する。ＣＤ１２７は、様々な細胞によって発現され、これには、メモリーＴ細胞とナイーブＴ細胞によるものが含まれる。ＣＤ１２７は、特に、休止Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞を含むエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）によって、並びに未成熟Ｂ細胞によって発現されるが、とりわけ、休止ナチュラル調節性Ｔ細胞（ナチュラルＴｒｅｇ）によっては発現されない。ＩＬ－７Ｒαは、胸腺細胞の分化及びリンパ球のクローン性増殖の促進に不可欠である。

【0010】

ナイーブＴ細胞の恒常性にとってのＩＬ７－ＣＤ１２７経路の重要性は、従来型ＣＤ４^＋ Ｔ細胞上での膜結合型ＩＬ－７Ｒαの発現レベルが、健常個体及びＨＩＶ感染患者並びにＭＳ患者における新胸腺移出細胞（ＲＴＥ）－ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の頻度と相関することを示すいくつかの最近の研究によって強調されている（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅらの文献、２００７）（Ｂｒｏｕｘらの文献、２０１０）。ＩＬ－７Ｒαは、ＴＳＬＰ受容体の構成要素でもある。胸腺髄質の上皮細胞から構成される構造であるハッサル小体によるＴＳＬＰの分泌は、胸腺細胞からＴｒｅｇへの分化を誘導するように、ＣＤ１１ｃ^＋骨髄樹状細胞（ＭＤＣ）を条件付けることが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅらの文献、２００５ａ）。したがって、ＩＬ－７Ｒαノックアウトマウスで示されたように、ＩＬ－７受容体からのシグナルは、Ｔｒｅｇ発生に必要とされる（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉらの文献、２００８）。（Ｈａａｓらの文献、２０１１）において、著者らは、明確な遺伝的影響を伴わない、従来型Ｔ細胞上でのＩＬ－７Ｒα発現の低下及びＩＬ－７血漿レベルの上方調節を、ＭＳにおける新胸腺移出細胞－Ｔｒｅｇの頻度及びＴｒｅｇの機能の低下とともに示した（Ｈａａｓらの文献、２０１１）。

【0011】

ＩＬ－７がその同族受容体の膜トラフィッキングをどのようにして調節するのかということの詳細な解析は、リンパ球機能におけるＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒの役割の深い理解にとって極めて重要である。以前の研究により、Ｔ細胞のＩＬ－７刺激が、おそらくは受容体内在化が理由で、３０分以内にＣＤ１２７の表面下方調節をもたらすことが示唆された。より後の時点（２～６時間）で、ＩＬ－７は、ＣＤ１２７の転写下方調節を誘導することが示された。しかしながら、ＩＬ－７によるＣＤ１２７の内在化及びトラフィッキング機構の調節の実際の動力学はまだ解明されていない（Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓらの文献、２０１０）。ＩＬ－７誘導性シグナル伝達がＣＤ１２７内在化に依存するということ及びその後の受容体分解がＪＡＫ３活性に依存し、かつプロテアソームとリソソームの両方によって媒介されるということも示唆された。

【0012】

（生理病理学）
樹状細胞は、成熟後に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を促進する高レベルの共刺激分子、例えば、ＣＤ８０を発現する。それらは、Ｔ細胞で走化性を誘導する、ＴＡＲＣ（ＣＣＬ１７）というサイトカインを産生する。したがって、成熟樹状細胞は、例えば、喘息、関節リウマチ、結腸炎、多発性硬化症、及びブドウ膜炎で見られるような、Ｔ細胞応答が効果を現すいくつかの免疫媒介疾患の生理病理学に寄与する。成熟樹状細胞は、細胞、組織、又は臓器同種移植片の拒絶過程においても重要な役割を果たす。それゆえ、多くの治療戦略は、樹状細胞成熟を妨げることを目的としている。

【0013】

樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での共刺激分子の有無は、免疫応答の定性的及び定量的性質に顕著な影響を及ぼす。樹状細胞によるＣＤ８０の過剰発現は、ＤＣ成熟を引き起こし、メモリーＴ細胞活性化を増大させる（Ｂｏｕｒ－Ｊｏｒｄａｎらの文献、２０１１）。機構的には、ＣＤ２８とＣＤ８０との相互作用は、免疫シナプスの中心クラスターを占め、結合したＴＣＲと共局在し、それにより、免疫シナプスを安定化する（Ｄｕｓｔｉｎ及びＳｈａｗの文献、１９９９）（Ｇｒａｋｏｕｉらの文献、１９９９）。ＣＤ２８とＣＤ８０の間の相互作用は、実際、ＴＣＲがＨＬＡ分子と効率的に相互作用するための適切な間隔を生じさせる（Ｓｈａｗ及びＤｕｓｔｉｎの文献、１９９７）。

【0014】

多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄性疾患である。ＭＳ患者のＣＮＳにおける脱髄パッチの出現は、主にマクロファージとＴリンパ球から構成される免疫浸潤物と関連している。機構的なレベルでは、ＭＳは、自己免疫疾患と考えられる。ＭＳは、通常、主としてＣＤ４＋ Ｔ細胞によって媒介される疾患と考えられる。ＣＤ４＋の特定のサブセット：Ｔｈ１及び最近ではＴｈ１７がこの疾患の病態生理学に関係があるとされた。現在のところ、特定の役割を各亜集団のＴｈ１及びＴｈ１７に割り当てるのは依然として難しい。さらに、アルファ４（α４）－インテグリンの拮抗作用による白血球トラフィッキングの阻害は、現在、ＭＳ及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの炎症性疾患の治療のための及び同様にアテローム性動脈硬化症の治療のための治療的アプローチとして検証されている（Ｚｈｉらの文献、２０１４）。α４β７は、活性化マクロファージ、リンパ球のサブセット、ＮＫ細胞、肥満細胞、及び好酸球を含む、より限られた白血球セットで発現されている。

【0015】

ヒトＩＬ－７は、ヒトＴリンパ球上でのインビトロでのα４及びβ７インテグリンの強い発現を誘導し、α４、β７、及びα４／β７インテグリンを発現するヒトＴリンパ球の頻度を劇的に増大させる（図１９）。これらのインテグリンは、腸、脳、及び皮膚などの非リンパ系組織におけるＴリンパ球のホーミング及び保持に必要とされる（Ｄｅｎｕｃｃｉらの文献、２００９； Ｇｏｒｆｕらの文献、２００９）。

【0016】

ナイーブＴ細胞は、移植された臓器及び組織の急性拒絶の部分的な原因である。これらの細胞は、現在の免疫抑制薬（カルシニューリン阻害剤）によって、及び共刺激を遮断するモノクローナル抗体（抗接着、ＣＤ８０／８６阻害剤）によって制御することができる。メモリーＴ細胞も移植片拒絶の原因である。メモリーＴ細胞は、獲得免疫歴、主にウイルスに対するかつての反応が原因でヒトに蓄積する。メモリーＴ細胞は、我々の抗ウイルス防御と同種抗原との交差反応である「異種免疫」の結果として同種抗原によって再活性化され得ることが示されている（Ａｄａｍｓらの文献、２００３）。ナイーブＴ細胞とは対照的に、メモリーＴ細胞は、共刺激シグナルの必要性が低下して、素早く活性化するようにプログラムされているので、異種免疫は、寛容誘導に対する強力な障壁となる。メモリーＴ細胞は、慢性拒絶にも関与し得る。臓器移植及び組織移植における役割の他に、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞は、多くの自己免疫疾患の共通の原因でもある。これは、潰瘍性大腸炎（Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの文献、２０１１）、関節リウマチ、乾癬、又は移植片対宿主病の場合である。

【0017】

さらに、いくつかの悪性細胞は、ＩＬ－７Ｒを提示することが示されている。これは、セザリー皮膚リンパ腫（そのうちの６０％）、又は小児急性リンパ芽球性白血病の場合であり、小児急性リンパ芽球性白血病では、その症例の約１５％がＣＤ１２７の機能獲得型突然変異を発現し、これらの腫瘍を部分的にＩＬ－７依存性の状態にする（Ｓｈｏｃｈａｔらの文献、２０１１）。

【0018】

Ｔリンパ球の枯渇は、同種移植拒絶に対抗し又は自己免疫に抵抗するための明白な免疫抑制アプローチとなっている。しかしながら、全体的なＴ細胞枯渇は、免疫寛容の誘導に有利ではない場合がある。Ｔ細胞の亜集団又は選択的に活性化されたＴ細胞の標的化は、Ｔｒｅｇ細胞を修飾しなければ、免疫寛容促進アプローチとなり得る（Ｈａｕｄｅｂｏｕｒｇらの文献、２００９）。それゆえ、ＣＤ１２７は、免疫応答を調節することを目的としたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の魅力的な潜在的治療標的と考えることができる。なぜなら、そのようなモノクローナル抗体ならば、エフェクターリンパ球を枯渇させる可能性を有し得るが、調節性リンパ球を枯渇させる可能性を有し得ないからである。したがって、該モノクローナル抗体は、ＩＬ７－Ｒに対するＩＬ－７の接近に拮抗し、それにより、Ｔ細胞及びＢ細胞の機能及び成長を制限することによって、移植、自己免疫（Ｍｉｃｈｅｌらの文献、２００８）、及び悪性腫瘍において効力を示す可能性があると考えられる。

【0019】

ＩＬ－７経路を妨害するＣＤ１２７^＋細胞に対するモノクローナル抗体による治療ならば、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞を除去／中和すること、並びに／もしくはＴｒｅｇ細胞を維持しながら、その数を減少させることによるか、又はＣＤ１２７陽性悪性細胞を除去しもしくはその数を減少させることによって、その目的を果たすことができる。しかしながら、ＣＤ１２７^＋細胞に対するモノクローナル抗体による治療は、それが樹状細胞の活性化をもたらす場合、諸刃の剣として働く可能性がある。実際、ＣＤ１２７は、ＣＲＬＦ２と関連して、樹状細胞によっても発現され、ＴＳＬＰ受容体を形成する。ＴＳＬＰの存在下で、樹状細胞は活性化され、Ｔ細胞媒介性免疫応答を促進する。ＣＤ１２７に対するいくつかのモノクローナル抗体は、おそらくはＴＳＬＰがＴＳＬＰ受容体と相互作用する様式を改変することにより、ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させる性質を有する（培地条件とともに図７に示す）。結果として、ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させないＣＤ１２７に対するモノクローナル抗体による治療ならば、治療的利点を示すであろう。それならば、ＴＳＬＰを含む炎症環境で樹状細胞を活性化させるという欠点を伴うことなく、ＩＬ７Ｒ遮断の利益を示すであろう。

【0020】

刊行物（Ｒａｃａｐｅらの文献、２００９）において、著者らは、移植における潜在的治療標的としてのＩＬ－７受容体アルファ（ＩＬ７Ｒα）の利益を解析した。様々なＴ細胞及びＩＬ－７応答性細胞上でのＩＬ－７Ｒαの発現を再検討して、著者らは、ＩＬ－７Ｒαを発現するメモリーＴ細胞を標的とすることにより、マウスにおける同種移植生存が延長され得るかどうかを決定し、ＩＬ－７又はＩＬ－７Ｒαを標的とすることにより、Ｔｒｅｇ細胞が有利に存続すると結論付けている。将来の展望の中で、著者らは、治療的処置においてＩＬ－７又はＩＬ－７Ｒαのいずれかを標的とすることにより、ＣＤ１２７を発現する細胞の生存に対して異なる結果がもたらされる可能性があり、異なるタイプのリンパ球減少が誘発される可能性があることを指摘した。ＩＬ－７Ｒαに対する抗体の効果は、それらがブロッキング抗体であるのか又は中和抗体であるのか又は細胞傷害性抗体であるのかによるという問題も概念的な観点から提起された。それにもかかわらず、著者らは、そのような抗体を取得し、アッセイしたことを示すのではなく、むしろ、仮説の妥当性を評価するためのさらなる研究の必要性を表明した。

【0021】

免疫関連疾患及びＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒαが関与する他の疾患、例えば、一部の乳癌を含む様々なタイプの癌における利用可能な治療アプローチの欠点を考慮すると、さらなる薬物候補、とりわけ、ヒト患者の免疫活性化を制御する、例えば、調節することを目的とした、より選択的な標的に対して活性のある候補が依然として必要とされている。

【0022】

これとの関連において、ＩＬ－７Ｒαに対するアンタゴニスト特性を有するＩＬ－７Ｒαに対するモノクローナル抗体がＷＯ２０１０／０１７４６８号に開示されており、多発性硬化症のような自己免疫疾患を治療する目的で、そのヒト化バージョンがＷＯ２０１１／０９４２５９号に開示されている。記載されている抗体は、ＩＬ－７のその受容体への結合に対するアンタゴニストであり、かつＩＬ－７のそのＣＤ１２７受容体との相互作用を必要とすると言われていたＴ_Ｈ１７及びＴ_Ｈ１細胞の増殖及び生存に対して活性があると言われている。免疫細胞の成熟、特に、樹状細胞の成熟に対するこれらの抗体の作用は検討されていない。加えて、これらの抗体は、ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を阻害しないと言われている（ＷＯ２０１１／０９４２５９号の１０７ページ）。同様に、糖尿病、狼瘡、関節リウマチ、及び他の自己免疫疾患の治療での使用が企図されている、ＷＯ２０１１／１０４６８７号又はＷＯ２０１３／０５６９８４号に報告された抗ＣＤ１２７抗体は、樹状細胞の成熟に対するその考えられる作用に関して論じられておらず、ＴＳＬＰ誘導性シグナル伝達とのその相互作用は報告されていない。さらに、Ｋｅｒｎらによって発表されているように（Ｋｅｒｎらの文献、２０１３； Ｋｅｒｎらの文献、２０１５）及び本明細書に示されているように、従来技術の抗ＣＤ１２７抗体は、受容体の内在化を誘導する。ＣＤ１２７の内在化も誘導するアンタゴニスト抗ＣＤ１２７抗体が皮膚のＩＶ型過敏症を制御しないのに対し（図１０）、内在化を誘導しないアンタゴニスト抗ＣＤ１２７抗体はそれを制御するので、内在化プロセスがシグナル伝達経路を活性化し、抗体のアンタゴニスト作用を緩和する可能性がある。最後に、従来技術の抗体は、ＣＤ１２７の２ｂ部位に由来する（すなわち、特に、配列番号１１４のアミノ酸１０９～１２７に由来する）配列を１つも含まないエピトープを認識し；かつＣＤ１２７とＩＬ７－Ｒのγｃ鎖との結合を妨害することが示されていない。

【0023】

ＣＤ１２７抗体の開発に対する最近の関心にもかかわらず、このように、ＩＬ７誘導性ＩＬ－７Ｒシグナル伝達の阻害に努力が集中している。それでもやはり、ＴＳＬＰ及びＴＳＬＰＲがいくつかの病理に関連付けられている。ＴＳＬＰは、皮膚及び肺の疾患において役割を果たし（Ｈｅ及びＧｅｈａの文献、２０１０）、かつヒト及びマウスの気道炎症疾患及びアトピー性皮膚炎を含む様々な病理と関連することが示されている（Ｙｉｎｇらの文献、２００８）（Ｊａｒｉｗａｌａらの文献、２０１１）。さらに、ＴＳＬＰは、腸の免疫及び炎症の調節と関連することが示されている（Ｔａｙｌｏｒらの文献、２００９）。ＴＳＬＰ及びＴＳＬＰＲが関与する他の病理としては、小児Ｂ細胞白血病（ｖａｎ Ｂｏｄｅｇｏｍらの文献、２０１２）、肺及び皮膚特異的アレルギー性疾患、自己免疫関連疾患（Ｒｏａｎらの文献、２０１２）、並びに乳癌を含む癌（Ｏｌｋｈａｎｕｄらの文献、２０１１）が挙げられる。

【0024】

それゆえ、抗ＣＤ１２７抗体がＩＬ－７誘導性及び／又はＩＬ－７－Ｒ媒介性機構の拮抗作用を通じた免疫関連疾患の治療の有望な候補であるということ、並びにそのような抗体がＴＳＬＰ受容体との関連におけるＣＤ１２７にも結合し、ＴＳＬＰ誘導性及び／又はＴＳＬＰ受容体媒介性機構を妨害するということは従来技術において十分に認知されているが、樹状細胞の成熟へのその考えられる関与は問題にされず、樹状細胞の成熟を増大させる効果を示さない抗体並びに／又はＣＤ１２７の内在化を誘導しない及び／もしくはＩＬ７誘導性内在化を阻害する抗体を得ることにある改善は、従来技術で一度も提案されなかった。

【0025】

既存の抗ＣＤ１２７抗体により、ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟の望ましくない増大が誘導される（しかし、該抗体はＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を阻害する）という驚くべき発見の後に、本発明者らは、そのような増大を示さない、したがって、疾患の治療、特に、自己免疫疾の治療により好適である抗体を開発した。さらに、本発明者らは、内在化を誘導しない及び／又はＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する抗体が、従来技術の抗体、例えば、ＭＤ７０７－１３と比較して、とりわけ、インビボで、高い効率を有することを発見した。

【発明の概要】

【0026】

本発明は、これとの関連において好適な、ＴＳＬＰ経路をマイナスにしか妨害しないＩＬ－７Ｒαに対するモノクローナル抗体に関する手段を提供する。したがって、本発明のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、本発明者らにより従来の抗ＣＤ１２７抗体で観察されたものとは逆に、ＴＳＬＰ誘導性の樹状細胞成熟を増大させない。さらに又は代わりに、本発明の抗体は、ＣＤ１２７の内在化を誘導しない及び／又はＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する。特定の実施態様において、本発明で提供される抗体は、これらのＤＣ成熟及び／又は内在化関連特性をＩＬ－７／ＩＬ－７－Ｒシグナル伝達に対するアンタゴニスト活性と組み合わせる。特定の実施態様において、本発明の抗体は、Ｔ細胞における、特に、インビボでの、α４、β７、及びα４／β７インテグリンのＩＬ７誘導性発現を阻害する。それゆえ、新規の作用機序を有するこれらのＭａｂは、ＣＤ１２７標的化の治療的利益を評価するための新しい製品となる。

【0027】

さらに、本発明者らは、本発明の好ましい抗体によって認識されるエピトープを開示しており、これにより、関連エピトープに結合し、かつ所望の特徴を維持している、別の抗体及び／又はその断片もしくは抗原結合性ドメイン又は他のタイプのポリペプチドに由来する構造的に関連する抗原結合性ドメインの容易な開発が可能となっている。

【0028】

Ｎ１３Ｂ２によって認識されるＣＤ１２７由来のエピトープは、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング（重複ペプチドスキャン又はｐｅｐｓｃａｎ解析と呼ばれることもある）によって同定された。これは、ｅｐ１（配列番号１１０）、ｅｐ２（配列番号１１１）、及びｅｐ３（配列番号８６）の配列からなるヒトＣＤ１２７のアミノ酸配列を含む。この技法は、標的タンパク質の重複セグメント及び非重複セグメント由来のオリゴペプチド配列のライブラリーを使用し、対象となる抗体に結合するその能力について試験する。標的タンパク質の様々な部分の非隣接ペプチドを組み合わせ、この組み合わせたペプチドに（例えば、ＣＬＩＰＳスキャフォールドを用いて）立体構造的硬直性を強要する（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらの文献、２００７）ことにより、不連続エピトープを非常に高い信頼性と正確性でマッピングすることができる（Ｃｒａｇｇの文献、２０１１）（Ｇａｓｅｉｔｓｉｗｅらの文献、２０１０）。タンパク質分解保護手順を用いた、エピトープのさらなる決定により、立体構造エピトープが配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７の配列を有するヒトＣＤ１２７のアミノ酸配列を含むことを決定することが可能となった。それゆえ、該エピトープは、ＣＤ１２７の２ｂ部位由来の配列を含む。さらに、該エピトープは、ＣＤ１２７のドメインＤ１とドメインＤ２の両方の配列、より具体的には、Ｄ１ドメイン由来の配列を２ｂ部位由来の配列とともに含む。本発明によるエピトープは、以下で詳細に記載されている。特に、該エピトープは、天然のＣＤ１２７におけるその立体構造配置の配列番号１１５（又は配列番号１１０）、配列番号１１６（又は配列番号８６）、及び配列番号１１７（又は配列番号１１１）からなる。

【0029】

特定の実施態様において、該モノクローナル抗体は、標的ＣＤ１２７＋細胞に対する細胞傷害作用も発揮し、また、該細胞の数を物理的に低下させる（亜集団の縮小）。

【0030】

したがって、本発明は、（ｉ）抗体－抗原相互作用を通じて、ＩＬ－７に対する受容体のアルファ鎖（ＣＤ１２７と表される）、とりわけ、ヒトＣＤ１２７陽性細胞によって発現されるＩＬ－７受容体のアルファ鎖に特異的に結合し、かつ（ｉｉ）ＴＳＬＰによって誘導される（例えば、細胞表面抗原ＣＤ８０及び／もしくはＣＤ４０の発現の増大によって特徴付けられる）樹状細胞の成熟を増大させず、かつ／又は（ｉｉｉ）ＣＤ１２７の内在化を誘導しない及び／もしくはＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する、抗体、抗体の抗原結合性断片、又は抗体もしくはその断片を含むキメラ分子などの、巨大分子に関する。

【0031】

本発明の特定の実施態様において、該巨大分子は、以下のアミノ酸配列：
・ＶＨＣＤＲ１配列番号１０；
・ＶＨＣＤＲ２配列番号１２；
・ＶＨＣＤＲ３配列番号１４もしくは配列番号４８；
・ＶＨ配列番号２２
のうちの少なくとも１つを含むＶＨ鎖及び／又は以下のアミノ酸配列：
・ＶＬＣＤＲ１配列番号１６もしくは配列番号５０；
・ＶＬＣＤＲ２配列番号１８もしくは配列番号５２；
・ＶＬＣＤＲ３配列番号２０；
・ＶＬ配列番号２４
のうちの少なくとも１つを含むＶＬ鎖
を含む。

【0032】

特定の実施態様において、該巨大分子は、ＣＤ１２７を発現するヒトＴ細胞（ＣＤ１２７＋細胞）に対する細胞傷害活性を示す。他の実施態様において、該巨大分子は、ＣＤ１２７を発現するヒトＴ細胞（ＣＤ１２７＋細胞）に対する細胞傷害活性を示さない。

【0033】

本発明はまた、該巨大分子を含む組成物、該巨大分子を得る方法、並びに該巨大分子及び組成物の使用に関する。

【0034】

本明細書で使用される場合、巨大分子は、５００Ｄａを超える分子量を有する、任意の分子、とりわけ、生体起源の分子又は生体起源の断片を含む分子を表す。巨大分子としては、ポリペプチド及び修飾ポリペプチド、例えば、グリコシル化ポリペプチド、並びにこれらのコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「抗体－抗原相互作用を通じてＣＤ１２７に特異的に結合する」巨大分子とは、該巨大分子とＣＤ１２７の間の相互作用が、本質的に、ＣＤ１２７に特異的な抗体とＣＤ１２７の間の相互作用と同じ相互作用にあるということを意味する。特に、該巨大分子は、該相互作用に関与する抗体の残基を、ＣＤ１２７タンパク質との同じ化学的結合の形成を可能にする空間配置で含み得る。特定の実施態様において、該巨大分子は、抗体のＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む。好ましい実施態様において、該巨大分子は、抗体のＶＨ鎖及び／又はＶＬ鎖のＣＤＲ配列の全てを含む。好ましい実施態様において、該巨大分子は、抗体のＶＨ鎖全体及び／又はＶＬ鎖全体を含む。

【0035】

特定の実施態様において、該巨大分子は、次のように定義される（以下の特徴のうちの少なくとも１つによって定義される）エピトープを認識するように産生、設計、又は選択される：
（ａ）該エピトープは、ＣＤ１２７の２ｂ部位から、特に、配列番号１１４のアミノ酸１０９～１２７から、より具体的には、配列番号１１４のアミノ酸１１０～１２５、１１０～１２０、１１２～１２０から、より具体的には、配列番号１１４のアミノ酸１１４～１１９（配列番号１１６に対応する）から取られた配列、特に、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸を含み；特に、該エピトープは、配列番号１１６を含み、特に、配列番号８６を含み；特に、該エピトープは、ＣＤ１２７のＰ１１２又はＬ１１５を含む；
（ｂ）上記の（ａ）の特徴に加えて、該エピトープは、ＣＤ１２７のＤ１ドメインから、特に、配列番号１１４のアミノ酸１～９８から取られた配列、特に、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸を含み；特に、該エピトープは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む（特に、ｅｐ１（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含む）、
（ｃ）上記の（ａ）の特徴及び任意に（ｂ）の特徴に加えて、該エピトープは、配列番号１１４のアミノ酸１８０～２２０から、特に、アミノ酸１９０～２００から取られた配列、特に、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸を含み；特に、該エピトープは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含み；特に、ｅｐ２（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）該エピトープは、配列番号１１５の配列及び配列番号１１６の配列を含むか、又は該エピトープは、配列番号１１７の配列及び配列番号１１６の配列を含み；特に、該エピトープは、配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７の配列を含む；
（ｅ）該エピトープは、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び／又は（ｄ）で定義されたＣＤ１２７の配列を含み、かつ明示的に言及されたもの以外のＣＤ１２７の（３つ、４つ、又は５つを超える連続するアミノ酸の）アミノ酸配列を含まない、すなわち、特に、該エピトープは、ＣＤ１２７由来の以下の配列のみを含む：
－特に、配列番号１１４のアミノ酸１０９～１２７、又は配列番号１１４のアミノ酸１１０～１２５、１１０～１２０、もしくは１１２～１２０、又は配列番号１１４のアミノ酸１１４～１１９（配列番号１１６に対応する）、又は配列番号８６に対応する配列からなる、並びに／或いは部位２ｂから取られた３つのアミノ酸もしくは３つ、４つ、５つ、６つ、７つを超えるアミノ酸の配列及び部位２ｂから取られた１９のアミノ酸又は１９、１８、１５、１１未満のアミノ酸の配列からなる、部位２ｂから取られた１つの配列、特に、ＣＤ１２７のＰ１１２又はＬ１１５を含むそのような配列；
－任意に、部位２ｂの配列に加えて、ＣＤ１２７のドメインＤ１から、特に、配列番号１１４のアミノ酸９８から取られた１つの配列、特に、配列番号１１０からなるもしくは配列番号１１５からなる、並びに／又は配列番号１１５を含むかもしくは配列番号１１５の配列に含まれる３つのアミノ酸もしくは３つ、４つ、５つ、６つ、７つを超えるアミノ酸の配列及び配列番号１１５を含むかもしくは配列番号１１５の配列に含まれる２０のアミノ酸もしくは２０、１８、１６、１１未満のアミノ酸の配列からなる、１つの配列；
－任意に、部位２ｂの配列に加えて、及び存在する場合、ドメインＤ１由来の任意の配列に加えて、配列番号１１４のアミノ酸１８０～２２０から取られた１つの配列；特に、配列番号１１１からなるもしくは配列番号１１７からなる、並びに／又は配列番号１１７を含むかもしくは配列番号１１７の配列に含まれる３つのアミノ酸もしくは３つ、４つ、５つ、６つ、７つを超えるアミノ酸の配列及び配列番号１１７を含むかもしくは配列番号１１７の配列に含まれる２０のアミノ酸もしくは２０、１８、１６、１１未満のアミノ酸の配列からなる、１つの配列；
該エピトープは、追加のアミノ酸を含む可能性があるが、これらの追加のアミノ酸は、ＣＤ１２７の配列から取られないことを条件とする（すなわち、該エピトープは、部位２ｂ由来の配列、並びに場合により、ドメインＤ１由来の任意の配列及び上記の配列番号１１４のアミノ酸１８０～２２０由来の任意の配列は別として、ＣＤ１２７の配列由来の３つ、４つ、又は５つを超える連続するアミノ酸を含まないことを条件とする）；
（ｆ）該エピトープは、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に記載の特徴に加えて、配列番号１１４の領域９９～１０８から取られた３つ、４つ、もしくは５つを超える連続するアミノ酸を含まず、配列番号１１４の領域１２８～１７９から取られた３つ、４つ、もしくは５つを超える連続するアミノ酸を含まず、及び／又は配列番号１１４の領域２２０～２３９から取られた３つ、４つ、もしくは５つを超える連続するアミノ酸を含まず、特に、配列番号１１４の領域９９～１０８、１２８～１７９、及び２２０～２３９のいずれかに由来する３つ、４つ、又は５つを超える連続するアミノ酸を含まない；
（ｇ）該エピトープは、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及び／又は（ｆ）で定義されたＣＤ１２７の配列の組合せを含み、ここで、いくつかのアミノ酸は、突然変異させられ、特に、欠失させられ及び／又は置換され、特に、類似の特性を有するアミノ酸によって置換され（保存的置換）；特に、該エピトープは、適切な場合、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）で定義されたように組み合わされた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及び／又は（ｆ）で定義されたＣＤ１２７の配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列からなるか又は該配列を含む；
（ｈ）該エピトープは、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び／又は（ｇ）で定義された特徴を有する立体構造エピトープである、すなわち、天然のＣＤ１２７内の該配列の立体構造を模倣する立体構造の（単量体としてか、又はγｃとの及び／もしくはＩＬ－７と関連した二量体としてかのいずれかの）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、及び／又は（ｇ）で定義された配列を含むか又は該配列からなる；
（ｉ）該エピトープは、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、及び／又は（ｈ）の特徴を有するＣＤ１２７の断片（すなわち、連続するアミノ酸のストレッチ）を含む；
（ｊ）該エピトープは、上記の（ｇ）で定義された特徴を有しており、予測可能な構造を持つペプチド集合の合成を可能にするＣＬＩＰＳ技術などの技術によって得られる。

【0036】

（ｂ）及び（ｃ）の特徴を有するエピトープの特定の実施態様において、該エピトープは、ｅｐ１及びｅｐ２という２つの配列の間に挿入されているＣＤ１２７のアミノ酸配列を含み、かつ任意に、これらの配列の上流（すなわち、ｅｐ１の配列のＮ－末端）及び／又は下流（すなわち、ｅｐ２の配列のＣ－末端）のヒトＣＤ１２７配列の任意の配列を含むようには拡張しないか、又は該配列の２以上のアミノ酸を含むようには拡張しない。他の特定の実施態様において、該エピトープは、ｅｐ１配列又はｅｐ２配列がどちらも、ヒトＣＤ１２７配列中のその隣接アミノ酸のいずれかを含むようには、又はｅｐ１とｅｐ２の間に挿入されているヒトＣＤ１２７の配列中のその隣接アミノ酸に由来する７つ、５つ、もしくは１つを超える連続するアミノ酸を含むようには拡張されないようなものであり； ｅｐ１配列及びｅｐ２配列の拡張を、この場合も、上記のように（ｅｐ１の）上流又は（ｅｐ２の）下流に限定することができる。特定の実施態様において、上記のエピトープ配列を含むＣＤ１２７の配列は、ヒトＣＤ１２７配列由来のその隣接アミノ酸を、ｅｐ１に隣接するＮ－末端の１アミノ酸を超えてもしくはＣ－末端の７アミノ酸を超えて、又はｅｐ２に隣接するＮ－末端の３０アミノ酸を超えてもしくはＣ－末端の３０アミノ酸を超えて含むようには拡張されない。

【0037】

該巨大分子が、ＣＤ１２７のいくつかの不連続なアミノ酸配列（すなわち、ＣＤ１２７の一次配列において連続していない配列）を含むエピトープを認識するように産生、設計、又は選択される実施態様において、該ＣＤ１２７配列のうちの１つを含むエピトープを認識する抗体を産生又は選択し、その後、これらの抗体の中で、他のＣＤ１２７配列（複数可）を認識するものを選択することが可能である（該後半の選択は、３以上の非隣接ＣＤ１２７配列が認識されることになる場合、連続的な選択によって実施することもできる）。

【0038】

本発明は、本発明のアンタゴニスト抗体によって認識される立体構造エピトープも含む。本発明は、この立体構造エピトープに結合する抗体も含む。これらの実施態様は、（ｉ）配列番号１１５との少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するドメイン及び／又は配列番号１１７との少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するドメイン、並びに（ｉｉ）配列番号１１６との少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するドメインを含むＣＤ１２７立体構造エピトープを含む。より具体的には、該ＣＤ１２７立体構造エピトープは、配列番号１１４のアミノ酸残基７３～７９及び／又は１１４～１１９並びにアミノ酸残基１９３～１９６を含む。本発明は、この立体構造エピトープに結合する抗体を含む。特定の実施態様において、該巨大分子は、配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７の配列を有するヒトＣＤ１２７のアミノ酸配列を含む立体構造エピトープを認識するように産生、設計、又は選択される。

【0039】

特に、上記の実施態様において、該抗体は、記載されている通りのエピトープからなるか又は該エピトープを含む免疫原に対して作製される、すなわち、該エピトープを含むか又は該エピトープからなる抗原による、ヒトではない動物、特に、哺乳動物の免疫によって最初に産生される。したがって、本発明はまた、エピトープが上記の通りである抗原に関し、特に、抗体の産生における免疫原としてのその使用に関し、並びに／或いは抗体もしくは抗原結合性断片又は他の巨大分子を産生するための選択及び／又は試験方法におけるその使用に関する。本発明はまた、該抗原を使用する該方法に関する。抗原は、ペプチド性構成成分に加えて、非ペプチド性構成成分を含むことができ、かつ／又は該エピトープの一部を形成しないペプチド性構成成分を含むことができるので、別途明記されない限り、又は文脈から明白でない限り、抗原の配列及び／又は該配列の特徴に言及する場合、該配列又は特徴は、該抗原のエピトープ部分の配列（又はその特徴）を表すもとの理解されるべきであることが本明細書において理解されるべきである。該抗原が該エピトープの一部を形成しないアミノ酸を含む場合、該アミノ酸は、ＣＤ１２７の３つ、４つ、又は５つを超える連続するアミノ酸を含まないことが好ましい。

【0040】

したがって、それが技術的に適切でないと思われない限り、抗体又はその断片に関して本明細書に開示される定義及び特徴は、本発明の任意の巨大分子に同様に適用される。

【0041】

（ＣＤ１２７の結合）
本発明によれば、ＩＬ－７Ｒαタンパク質への「結合」は、抗原－抗体型相互作用を指し、かつ抗体又はその抗原結合性断片の「特異的結合」特性を包含し、この特異的結合は、該抗体又は抗原結合性断片がＩＬ－７Ｒαタンパク質に結合する一方で、それらが他のタンパク質（例えば、共通のサイトカイン受容体γ鎖）に結合しないか又はそれに顕著により弱い親和性で結合することを意味する。特異的結合は、とりわけ、試験溶液のｐＨ及び塩含有量に関して生理的条件下で定義及び／又は決定されることが好ましい。結合及び結合特異性は、実施例に開示される試験に従ってアッセイすることができ、特に、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、又はウェスタンブロット解析によってアッセイすることができる。

【0042】

本発明の特定の実施態様において、該抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＬ－７－Ｒアルファ鎖がＴＳＬＰ受容体（ＣＣＲＦ２を含む； Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３８７３３； Ｒｅｃｈｅらの文献、２００１）中で複合体を形成した場合、それを標的とし、かつそれに結合する。

【0043】

特定の実施態様において、本発明の抗体もしくはその断片又はキメラ分子は、５Ｅ－１０Ｍよりも低い解離定数（Ｋｄ）で、単離されたタンパク質としてのＣＤ１２７に結合する。好ましい実施態様において、該解離定数（Ｋｄ）は、１Ｅ－１０Ｍよりも低いか、又は９Ｅ－１１Ｍよりも低いか、又は５Ｅ－１１Ｍよりも低い。

【0044】

特定の実施態様において、本発明の抗体もしくはその断片又はキメラ分子又は他の巨大分子は、ｅｐ１（配列番号１１０）及び／又はｅｐ２（配列番号１１１）の配列を含むヒトＣＤ１２７の抗原に結合する。特定の実施態様において、該抗原は、ｅｐ１とｅｐ２の両方を含むヒトＣＤ１２７の断片を含む（すなわち、該抗原は、ヒトＣＤ１２７のｅｐ１及びｅｐ２の配列並びに挿入配列を含む）。他の実施態様において、該抗原は、場合により、ヒトＣＤ１２７配列とは異なる他の起源の他の配列に加えて、ヒトＣＤ１２７のｅｐ１配列及びｅｐ２配列のみを含む。また他の実施態様において、ｅｐ１配列及び／又はｅｐ２配列は、ヒトＣＤ１２７由来のいくつかの追加のアミノ酸、特に、ｅｐ１のＮ－末端の最大１個のアミノ酸、ｅｐ１のＣ－末端の最大７個のアミノ酸、ｅｐ２のＮ－末端の最大１個、１０個、２０個、又は３０個のアミノ酸、ｅｐ２のＣ－末端の最大７個；１０個、２０個、又は３０個のアミノ酸を含むように拡張される。特定の抗原は：好ましくは、ｅｐ１とｅｐ２の両方を含む、上記のような抗原（ここで、ｅｐ１を含むＣＤ１２７の配列は、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を含むようには拡張しないか、又はヒトＣＤ１２７の配列中のｅｐ１のＮ－末端の１個よりも多いアミノ酸もしくはＣ－末端の７個よりも多いアミノ酸を含むようには拡張しない）；並びに上記のような抗原（ここで、ｅｐ２を含むＣＤ１２７の配列は、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を含むようには拡張しないか、又はヒトＣＤ１２７の配列中のｅｐ２のＮ－末端の３０個よりも多いアミノ酸又はＣ－末端の３０個よりも多いアミノ酸を含むようには拡張しない）；並びにこれらの両方の特徴を有する抗原を含む。特定の実施態様において、本発明の抗体もしくはその断片又はキメラ分子又は他の巨大分子は、配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７の配列を含むヒトＣＤ１２７の抗原に結合する。

【0045】

いくつかの実施態様において、該抗原は、（ＷＯ ２０１１１０４６８７ Ａ１号に記載されている）Ｃ１ＧＭ、Ｃ２Ｍ３、Ｐ３Ａ９、Ｐ４Ｂ３、Ｐ２Ｄ２、Ｐ２Ｅ１１、ＨＡＬ４０３ａ、及びＨＡＬ４０３ｂからなる群から選択されるモノクローナル抗体によって認識されるＩＬ－７Ｒのエピトープと重複しないか、又は該エピトープを含まない。いくつかの実施態様において、該抗体は、インターロイキン－７受容体アルファの残基Ｉ８２、Ｋ８４、Ｋ１００、Ｔ１０５、及びＹ１９２のいずれかを含まないもしくは該残基のうちのいくつかを含まない、特に、Ｋ１００を含まない及び／もしくはＴ１０５を含まない抗原に対して作製されるか、又はインターロイキン－７受容体アルファの残基Ｉ８２、Ｋ８４、Ｋ１００、Ｔ１０５、及びＹ１９２のいずれかを含まないもしくは該残基のうちのいくつかを含まない、特に、Ｋ１００を含まない及び／もしくはＴ１０５を含まないエピトープに結合する。いくつかの実施態様において、該抗原又はエピトープは、Ｋ１９４を含まないか、又はヒトＩＬ－７Ｒの残基Ｄ１９０、Ｈ１９１、及びＫ１９４からなる群から選択される残基のいずれかを含まないか、もしくは該残基の全てを含まない。特定の実施態様において、該抗原又はエピトープは、Ｉ８２もＫ８４も含まないか、又はＫ１００もＴ１０５も含まないか、又はＹ１９２を含まないか、又はＤ１９０もＨ１９１もＹ１９２もＫ１９４も含まない。

【0046】

ＣＤ１２７はＩＬ－７ＲとＴＳＬＰＲの両方に共通であるが、抗ＣＤ１２７抗体が、必ずしも、両者と関連したＣＤ１２７を認識する（すなわち、それと好適な条件で結合する）ものではないことに留意しなければならない。さらに、該抗体が、ＩＬ－７Ｒに関連した状態とＴＳＬＰＲに関連した状態の両方のＣＤ１２７に結合するとしても、それは、ＩＬ－７－ＩＬ－７Ｒ相互作用及びＴＳＬＰ－ＴＳＬＰＲ相互作用に対して必ずしも同じ効果を有するものではない。それは、例えば、ＩＬ－７ＲへのＩＬ－７の結合を妨げることができるが、ＴＳＬＰＲへのＴＳＬＰの結合を妨げることができない。さらに、該抗体とどちらかの受容体との結合は、リガンド－受容体相互作用に対する異なる効果を超えた、異なる効果を有することがある。実際、該抗体の結合は、リガンドとは独立に又はリガンドとの組合せで、受容体の立体構造を修飾し、それにより、受容体を活性化又は不活性化させる可能性がある。この効果は、どちらの受容体であるかによって異なることがあり、それは、実際、反対であることがあり：ＩＬ－７Ｒを不活性化させる抗体がＴＳＬＰＲを活性化させることがあり、逆の場合も同じである。

【0047】

本明細書で使用される場合、受容体を活性化させることは、リガンドがその受容体に結合したときに起こる生化学的変化の少なくとも一部を誘発することを意味する。これらの変化には、受容体構造の修飾（例えば、二量体化）；受容体のリン酸化並びに受容体結合タンパク質（例えば、Ｊａｎｕｓキナーゼ、ＳＴＡＴ転写因子など）の動員及び／又はリン酸化並びに／又は受容体の細胞内局在の変化（例えば、受容体内在化）が含まれ得る。本明細書で使用される場合、受容体を不活化させることは、そのリガンドの受容体への結合に伴う生化学的修飾の少なくとも一部を妨げるか、又は逆戻りさせることを意味する。例えば、受容体を構成的に活性化させ（すなわち、リガンドの非存在下でさえも活性化させ）、かつ薬剤、例えば、本発明の抗体の存在下で不活化させることができる。代わりに、又はさらに、リガンド誘導性活性化を、受容体を不活化させることによって、完全に又は部分的に阻害することができる。それゆえ、不活化は、数ある機構の中でも特に、リガンドの結合（及びその後の「活性化」事象）を妨げること、並びに／又はリガンドの結合（例えば、二量体化）に伴う構造の変化及び／もしくは受容体の細胞内位置の修飾を妨げることによって起こり得る（例えば、不活化剤は、受容体の内在化及び／又は分解を誘発し、それにより、リガンドによる活性化を妨げることができる）。

【0048】

（ＴＳＬＰ誘導性の樹状細胞成熟の増大の欠如）
本発明の抗体は、ＴＳＬＰ受容体中のＣＤ１２７に結合することができる（すなわち、ＣＤ１２７がＣＲＬＦ２との複合体中にあってＴＳＬＰ受容体を形成しているとき、ＣＤ１２７に結合することができる）。それゆえ、本発明の抗体は、ＴＳＬＰ誘導性及び／又はＴＳＬＰ受容体媒介性シグナル伝達を妨害することができる。

【0049】

本発明者らは、驚くべきことに、ＴＬＳＰ受容体中のＣＤ１２７に対するものであり（又はこれを認識し）、かつＴＳＬＰ－ＴＳＬＰＲ相互作用とのいくらかの拮抗作用を示す既存の抗体が、それにもかかわらず、ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させ：該成熟がＴＳＬＰのみで処理した細胞よりもＴＳＬＰ及び該抗体で処理した細胞でより大きいことを発見した。これらの従来型抗体は、ＴＳＬＰ依存的樹状細胞成熟を増大させる。好ましい実施態様において、本発明の抗体又は断片は、免疫細胞、特に、樹状細胞の成熟についてＴＳＬＰと相乗作用しない。言い換えると、本発明の抗体は、ＴＳＬＰによって誘導される免疫細胞の成熟を増大させない。この効果は、特に、樹状細胞の成熟に関して望ましい。

【0050】

ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を阻害する抗ＣＤ１２７抗体の能力を、ＴＳＬＰ誘導性シグナル伝達及びその下流の結果（特に、樹状細胞の成熟）に対する該抗体のマイナスの（又は少なくともプラスではない）効果の妥当な予測因子と考えることはできないということが強調されるべきである。実際、本発明者らが発見したように、ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を効率的に阻害する抗体でさえも、ＣＤ４０又はＣＤ８０とＴＳＬＰＲとの発現によって測定される、ＴＳＬＰ依存的な樹状細胞の成熟を増大させ得る。

【0051】

ＴＳＬＰ誘導性の樹状細胞成熟は、一部の免疫細胞の成熟、とりわけ、一部の自己免疫疾患、喘息、及び移植で観察される、いわゆる、ＴＨ－２分化の決定因子であるマーカーとしての細胞マーカーＣＤ４０及び／又はＣＤ８０（Ｉｎａｂａらの文献、１９９５； Ｗａｔａｎａｂｅらの文献、２００５ｂ）の発現によって測定することができる。特定の実施態様において、ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞成熟の増大は、ＴＳＬＰのみで処理したＴＳＬＰＲ陽性細胞と比較した、ＴＳＬＰ及び本発明の巨大分子で処理したＴＳＬＰＲ陽性細胞における細胞表面マーカーＣＤ４０及び／又はＣＤ８０の発現の上昇を決定することによって評価される。

【0052】

特定の実施態様において、ＴＳＬＰ誘導性の樹状細胞成熟を増大させない巨大分子、特に、抗体又はその断片は、ＴＳＬＰのみ（巨大分子なし）による刺激と比較したとき、２５％を超えてＣＤ８０の発現を増大させない。好ましくは、ＣＤ８０の発現は、２０％を超えて、好ましくは、１０％を超えて、一層より好ましくは、５％を超えて増大しない。特定の好ましい実施態様において、ＣＤ８０の発現は、ＴＳＬＰのみで刺激した細胞と比較したとき、ＴＳＬＰ及び巨大分子で刺激した細胞で増大しないか又は減少する。

【0053】

特定の実施態様において、ＴＳＬＰ誘導性の樹状細胞成熟を増大させない巨大分子は、ＴＳＬＰのみ（巨大分子なし）による刺激と比較したとき、５０％を超えてＣＤ４０の発現を増大させない。好ましくは、ＣＤ４０の発現は、２５％を超えて、好ましくは、１０％を超えて、一層より好ましくは、５％を超えて増大しない。特定の好ましい実施態様において、ＣＤ４０の発現は、ＴＳＬＰのみで刺激した細胞と比較したとき、ＴＳＬＰ及び巨大分子で刺激した細胞で増大しないか又は減少する。

【0054】

樹状細胞成熟の測定も実施例（特に、実施例９参照）に例示されており、これを、当業者に公知の任意の標準的な方法、特に、樹状細胞成熟のマーカーとしての樹状細胞上でのＣＤ８０及び／又はＣＤ４０発現を決定するために好適な任意の方法に従って実施することができる。

【0055】

ＴＳＬＰシグナル伝達の望ましくない増強の欠如に関して抗ＣＤ１２７抗体の特性をアッセイするために、ＴＳＬＰＲを発現する細胞、例えば、哺乳動物のプロＢ細胞（例えば、本明細書で例示されるＢＡ／Ｆ３細胞）を使用することができる。

【0056】

（α４、β７、及びα４／β７インテグリンのＩＬ７誘導性発現の阻害）
特定の実施態様において、本発明の抗体（又は巨大分子）は、インビトロでのα４、β７、及びα４／β７インテグリンのＩＬ７誘導性発現を阻害する。α４、β７、及びα４／β７インテグリンのＩＬ７誘導性発現は、本明細書で使用される場合、α４インテグリン及びβ７インテグリンのどちらか又は両方の発現のレベルの増大、並びにα４、β７、及び／又はα４／β７インテグリンを発現するＴリンパ球の数又は比率の増大を表す。阻害は部分的であり得る、すなわち、ＩＬ７の存在下でのα４、β７、及びα４／β７インテグリンの発現のレベルは、抗体の存在下では、ベースラインレベル（すなわち、抗体もＩＬ７もない場合のレベル）よりも増大するが、抗体の非存在下では、より少なくなり；又は阻害は完全であり得る、すなわち、ＩＬ７の存在下及び抗体の存在下でのα４、β７、及びα４／β７インテグリンの発現のレベルは、ベースラインレベルほどの大きさである。

【0057】

特定の実施態様において、本発明の抗体は、インビトロでのα４、β７、及び／又はα４／β７インテグリンの発現を阻害する、すなわち、α４、β７、及び／又はα４／β７インテグリンの発現のレベルは、未処理の（すなわち、抗体もＩＬ７も用いない）細胞よりも、抗体で（かつＩＬ７を用いて及び／又はＩＬ７を用いないで）処理した細胞で低い。阻害の度合いは、用量依存的であり得る。発現の阻害は、実施例の節に記載されているように測定することができ、これを、当業者は、必要に応じて、例えば、本明細書に開示される特異的抗体、抗体の断片もしくは抗原結合性ドメイン、又は他の巨大分子に、及び／或いは特定疾患モデルに適合させることができる。

【0058】

好ましい実施態様において、本発明の抗体（又は巨大分子）は、インビボでのα４、β７、及び／又はα４／β７インテグリンの発現を阻害する。本明細書で使用される場合、この発現は、（ｉ）α４、β７、及び／もしくはα４／β７インテグリンの発現、（ｉｉ）α４、β７、及び／もしくはα４／β７陽性Ｔ－リンパ球の数及び／もしくは比率、並びに／又は（ｉｉｉ）α４、β７、及び／又はα４／β７陽性Ｔ－リンパ球の生着が、未処理の動物と比べて抗体で処理した動物から得られた試料で低下していることを意味する。本明細書で使用される場合、生着とは、移植した組織又は細胞の宿主の体内への取込みを表し、これは、通常、数時間から数日間の期間にわたって起こるプロセスである。特定の実施態様において、該動物は、哺乳動物、特に、非ヒト哺乳動物、とりわけ、マウスである。特定の実施態様において、該動物はヒトである。特定の実施態様において、該効果は、レシピエント動物、好ましくは、免疫不全マウスに注射されたヒトリンパ球で観察される。特定の実施態様において、免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを注射してから２週間後、インテグリンβ７陽性Ｔ細胞の平均パーセンテージは、未処理マウスと比べて抗体処理マウスで、少なくとも２５％、好ましくは、少なくとも５０％低下している。特定の実施態様において、免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを注射してから２週間後、インテグリンβ７陽性の生着したＴ細胞の平均パーセンテージは、未処理マウスと比べて抗体処理マウスで、少なくとも２５％、好ましくは、少なくとも５０％、及び一層より好ましくは、少なくとも７０％低下している。本発明の抗体又は巨大分子の効果は、実施例の節、特に、α４／β７インテグリンの発現及び生着についての実施例１６に示された方法を用いて決定することができ、これは、当業者が、必要に応じて、例えば、特異的抗体、その断片もしくは抗原結合性ドメイン、又は他の巨大分子に、及び／或いは特定疾患モデルに適合させることができる。

【0059】

（ＣＤ１２７内在化の阻害剤）
内在化とは、ＣＤ１２７などの細胞表面受容体が細胞の細胞質空間の内側に（おそらくは、細胞内区画又は膜の表面に／表面で）輸送され、その結果、細胞外空間からはもはや接近不可能となる細胞プロセスである、すなわち、内在化された受容体に、細胞外空間のリガンドは直接接触することができない。リガンドは、受容体の天然のリガンドであれ、受容体に結合した任意の人工リガンド又は他の分子であれ、受容体とともに内在化され得る。ほとんどの受容体は定期的な内在化を受け、その細胞表面発現は、内在化され、分解された受容体を新たに合成された／成熟した受容体に交換するか、又は直接的なリサイクリング、すなわち、内在化された受容体を輸送して細胞表面に戻すかのいずれかによって、一定に維持される。

【0060】

いくつかの刺激は、内在化の速度の増大及び／又は交換／リサイクリングの速度の減少をもたらし、それにより、受容体の細胞表面発現の純減をもたらし得る。本明細書で使用される場合、ＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化とは、転写下方調節などのより長期的な効果を除外するために限られたインキュベーション時間の後でインビトロで観察したときの、細胞外培地中のＩＬ７の存在によって誘導される（又はＩＬ－７の存在下で観察される）ＣＤ１２７の細胞表面発現の減少を表す。該限られた時間は、通常、約数十分、好ましくは、２時間未満、より好ましくは、１時間未満、及び一層より好ましくは、４５分以下、３０分以下、又は１５分以下である。

【0061】

好ましい実施態様において、本発明の抗体は、ＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する。したがって、本発明の抗体とともにインキュベートした場合、ＩＬ７の存在は、ＣＤ１２７の細胞表面発現の減少を全く誘導しないか、又は抗体なしでインキュベートした細胞よりもあまり強くないＣＤ１２７の細胞表面発現の減少を誘導する。特定の実施態様において、本発明の抗体とともにインキュベートした場合、細胞を５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７とともに３７℃で１５分間インキュベートしたときのＣＤ１２７細胞表面発現のレベルは、ＩＬ７なしでインキュベートした細胞における細胞表面発現レベルの少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％である。インビトロにおいて、該細胞表面発現は、上で示されたような限られた時間の後で測定されることが好ましい。加えて、ほとんどの細胞内在化プロセスは低い温度で阻害され、その効果は、通常、生理的温度、特に、３７℃で最も良好に観察される。しかしながら、細胞を、低い温度、特に、４℃でインキュベートすることも企図される。

【0062】

受容体に対する抗体が受容体の内在化を誘導し得ることが知られており、これは、受容体の細胞表面発現が抗体の存在下で減少するということを意味する。これは、特に、天然の内在化誘導性リガンドによって誘導される受容体の立体構造の変化を模倣する受容体の立体構造の変化を誘導することによって起こり得、この効果は、抗体によって認識されるエピトープに依存し得る。本明細書で使用される場合、「抗体がＣＤ１２７の内在化を誘導する」とは、抗体の存在下でインキュベートした細胞が、抗体の非存在下でインキュベートした細胞と比較してＣＤ１２７の細胞表面発現の減少を示すことを意味する。細胞表面発現は、限られたインキュベーション時間の後、及び上述のような温度条件で、インビトロで測定されることが好ましい。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤ１２７の内在化を誘導しない。したがって、抗体の存在下でインキュベートした細胞におけるＣＤ１２７の細胞表面発現は、それ以外は同一の条件で、ただし、抗体の非存在下でインキュベートした細胞における細胞表面発現と比べて低下しないか、又は顕著には低下しない。特定の実施態様において、５０ｎｇ／ｍＬの抗体の存在下で３７℃で３０～４５分間インキュベートしたとき、ＣＤ１２７細胞表面発現のレベルは、抗体の非存在下でインキュベートした細胞におけるそのレベルの少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％である。この効果は、ＩＬ７の非存在下で（抗体で処理した細胞と抗体で処理していない細胞の両方で）、ＩＬ７の存在下で、及び／又はその両方で観察され得る。

【0063】

上記の２つのＣＤ１２７内在化関連特徴（すなわち、ＩＬ７誘導性内在化の阻害又は内在化の非誘導）のどちらも抗体の効率の増大に寄与し得るが、両方の特徴の組合せは、さらにより効率的である可能性がある。本明細書に開示されるのは、ＩＬ７と該抗体の両方の存在下でＣＤ１２７の細胞表面発現が顕著には減少しない、好ましい実施態様を表す抗体である。そのような好ましい実施態様において、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７の存在下、３７℃で１５分間を含む、５０ｎｇ／ｍＬの抗体の存在下で４５分間のインキュベーションの後、ＣＤ１２７細胞表面発現のレベルは、抗体もＩＬ７も含まない培地中でインキュベートした対照細胞におけるそのレベルの少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％である。

【0064】

（ＣＤ１２７－γｃ鎖相互作用の妨害）
特定の実施態様によれば、本発明の巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＬ７－Ｒのγｃ鎖へのＣＤ１２７の結合を妨害し得る。これは、ＣＤ１２７とγｃ鎖が、抗体の非存在下で及び特にＩＬ－７の存在下で結合する条件（特に、化学的及び物理的条件）の下で、該抗体の存在が該結合を顕著に低下させるということを意味する。特定の実施態様において、抗体の存在下及びＩＬ－７の存在下で、ＣＤ１２７は、γｃに結合しない。特に、抗体の存在下及びＩＬ－７の存在下で、ＣＤ１２７と関連している（又は結合している）ことが見出されるγｃ鎖の量は、抗体の非存在下（又は別の抗ＣＤ－１２７抗体、例えば、ＭＤ７０７－１３の存在下）、それ以外は同一の条件で、特に、ＩＬ－７の存在下で結合する量の８０％未満、好ましくは５０％未満、一層より好ましくは２５％又は１０％未満である。抗体のそのような特徴は、特に、タンパク質の相互作用を試験するために当業者によく知られており、かつ本明細書において実施例２１に例示されている共免疫沈降法によって評価することができる。特に、細胞を被験抗体の存在下又は非存在下でインキュベートし、その後、タンパク質複合体の維持を可能にする条件で可溶化することができ、得られた溶解物を抗ＣＤ１２７免疫沈降に供し、ＣＤ１２７含有免疫沈降複合体中のγｃの存在を、抗γｃ抗体を用いるウェスタンブロッティングによって評価することができる（逆に、免疫沈降を、抗γｃ抗体を用いて実施し、ＣＤ１２７の存在を、抗ＣＤ１２７抗体を用いて評価することができる）。

【0065】

そのような抗体を得るための１つの方法は、ＣＤ１２７の２ｂ部位由来の配列を含むエピトープに対する該抗体を作製すること、又はそのようなエピトープを認識する抗体を選択することである。実際、γｃとの相互作用に重要な、この部位への該抗体の結合は、例えば、競合又は立体障害によって、γｃとＣＤ１２７との相互作用を妨害する可能性が高い。

【0066】

特に、この望ましい特徴を有する抗体を、例えば、抗体ライブラリー由来の抗ＣＤ１２７抗体から（このライブラリーが、２ｂ部位の配列を含む免疫原を用いることによって得られなかった場合を含む）、当業者に公知でかつそのような目的に容易に適合させることができる従来のスクリーニング手順によって選択することも可能である。特に、例えば、ＣＤ１２７（又はその細胞外ドメインのみ）を、そのようなスクリーニングに一般に使用される９６ウェルプレート又は同様の基材に結合させることができる。ライブラリーを構成する抗体を、個々に、各々１つのウェル中に添加し、γｃ鎖を各ウェルに添加することができる。プレートを洗浄した後、各ウェル中のγｃの存在を、例えば、蛍光に基づく方法によって試験することができる。所望の特徴を有する抗体を含有するウェルでは、γｃが全く検出されない（又は少量のγｃが検出される）。この手順を改変して、例えば、抗体を固体基材上に個々のスポットとしてむしろスポットし； ＣＤ１２７がスポットされた抗体に結合するのを可能にし、γｃ鎖がこのように固定されたＣＤ１２７鎖に結合するのを可能にすることが明らかに可能である。

【0067】

（ＩＬ－７－ＩＬ－７Ｒ相互作用に対するアンタゴニスト）
特定の実施態様によれば、本発明の巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片はさらに、インターロイキン７（ＩＬ－７）に対するアンタゴニスト特性を有し、それにより、ＣＤ１２７陽性細胞上のＣＤ１２７へのＩＬ－７の接近、すなわち、結合に拮抗する。

【0068】

「ＩＬ－７－ＩＬ－７Ｒ相互作用に対するアンタゴニスト特性」とは、ＩＬ－７Ｒアルファを標的とする本発明の抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤ１２７細胞、とりわけ、ヒトエフェクターＴ細胞、特に、ヒトメモリーＴ細胞上に発現されたＩＬ－７受容体の、その結合パートナーであるＩＬ－７、とりわけ、ヒトＩＬ－７への接近可能性を妨げる作用を有することを意味する。ＩＬ－７の結合に拮抗する結果として、本発明の抗体又はその機能的断片は、ＩＬ－７依存的な胸腺Ｔ細胞の発生を妨げることにより、リンパ球減少をもたらす。

【0069】

該アンタゴニスト特性は、特に、ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達に対する拮抗作用であり得る。ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達のアンタゴニストは、実施例に記載の通りにＳＴＡＴ５リン酸化の阻害を測定することによって同定することができる。ＩＬ７誘導性のＳＴＡＴ５リン酸化はＩＬ７Ｒ活性化のマーカーであり、ＩＬ７－ＩＬ７Ｒ相互作用に拮抗する抗体は、ＩＬ７誘導性のＳＴＡＴ５リン酸化を減少させると期待される。

【0070】

特定の実施態様において、本発明の巨大分子は、ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達のアンタゴニストである。特定の実施態様において、本発明の巨大分子は、ＩＬ７誘導性のＳＴＡＴ５リン酸化を阻害する。好ましい実施態様において、ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害は、わずか５０ｎｇ／ｍｌの抗体濃度で５０％よりも大きく、及び／又はＳＴＡＴ５リン酸化の阻害は、わずか１００ｎｇ／ｍｌの抗体濃度で８０％よりも大きい。ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害は、当業者に公知の方法によって、及び特に、実施例の節（特に、実施例３）に記載の方法によって評価することができる。

【0071】

（「ＴＳＬＰの結合のアンタゴニスト」）
本発明の抗体はＩＬ－７Ｒ中のＣＤ１２７に結合するので、それは、ＴＳＬＰＲ中のＣＤ１２７にも結合することができ、特に、立体障害によって及び／又は共通の結合部位での競合によって、それは、ＴＳＬＰＲへのＴＳＬＰの結合を阻害することができる。言い換えると、本発明の抗体は、ＴＳＬＰの結合に対するアンタゴニスト活性を示し得る。

【0072】

（「ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の阻害剤」）
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤ１２７陽性細胞のＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を阻害することができる。上述のように、ＴＳＬＰ刺激された樹状細胞は、ＴＡＲＣのレベルの上昇をもたらす。これは、ＴＳＬＰＲに対するその結合及びＴＳＬＰ結合のアンタゴニストとしてのその潜在的な作用によって生じ得る。

【0073】

特定の実施態様において、本発明の抗体及びその抗原結合性断片は、その成熟を増大させないその能力について選択されたものである（成熟は、例えば、ＣＤ４０及び／又はＣＤ８０細胞表面マーカーの発現の増大によって決定される）。

【0074】

ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生のレベルは、ＴＳＬＰのみで処理した細胞よりも、ＴＳＬＰと本明細書に記載の抗ＣＤ１２７抗体もしくはその断片又はキメラ分子とを併せて処理した細胞で低くなり得る。言い換えると、本発明の巨大分子は、ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の阻害剤であり得る。本発明の実施態様において、本明細書に記載の抗体もしくはその断片又はキメラ分子は、ＴＡＲＣ産生のレベルを減少させる。本発明の特定の実施態様において、ＴＳＬＰ及び抗体、断片、又はキメラ分子で処理した細胞におけるＴＡＲＣ産生のレベルは、ＴＳＬＰのみで処理した細胞におけるレベルと比較して、わずか１μｇ／ｍｌの抗体濃度で、１０％よりも大きく、好ましくは２０％よりも大きく低下する。ＴＡＲＣ産生の測定は、実施例（特に、実施例９）に示されており、当業者に公知の任意の標準的な方法を用いて、血液試料由来のＣＤ１２７陽性免疫細胞、特に、樹状細胞に対して実施することができる。

【0075】

（「細胞傷害活性」）
本発明の特定の実施態様において、ＩＬ－７受容体中に存在するＣＤ１２７分子に対する本発明の抗体又はその抗原結合性断片はさらに、ヒト細胞、とりわけ、該受容体を発現するヒトＴ細胞に対して細胞傷害性であるという性質を有する。本発明の抗体及びその断片の標的である、ＩＬ－７受容体の鎖としてのＣＤ１２７を発現するヒト細胞は、主にＴリンパ球であり、より正確には、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞を含む、エフェクターＴリンパ球の亜集団であるが、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）ではなく、とりわけ、休止ナチュラルＴｒｅｇではない。メモリーＴ細胞は、抗原プライミングの結果として発生し、二次エフェクター細胞及びメモリー細胞への再活性化及び分化の際にリコール増殖（ｒｅｃａｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を経る能力を含む、その機能的特性によって主に定義される。同様に、（ＩＬ－７－Ｒアルファ鎖を含む複合体としての）標的ＴＳＬＰ受容体は、Ｔヘルパーリンパ球、Ｂ細胞、及び樹状細胞分化を調節する。

【0076】

本発明の実施態様によれば、「Ｔ細胞に対する細胞傷害活性」又は細胞傷害特性を有する抗体及びその抗原結合性断片（細胞傷害性抗体）は、これらの細胞を死滅させることによってエフェクターＴ細胞集団の枯渇を生じさせ、したがって、投与したとき、これらの細胞の数を減少させる。これとは反対に、これらの抗体は、調節性Ｔ細胞の亜集団を改変しないか、又はそれを相当な程度にまでは改変せず、Ｔｒｅｇ細胞がその機能を果たすのを可能にする。これに関連して、特定の実施態様において、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞に対する調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の比率は、本発明の抗体の投与後に上昇することが観察されている。特定の実施態様において、本発明の抗体は、該比率を約１０％以上、上げることができる。特定の実施態様において、Ｔｅｆｆに対するＴｒｅｇの比率の上昇は約２０％である。

【0077】

本発明の特定の実施態様によれば、該細胞傷害性抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す。別の実施態様によれば、本発明の抗体はＡＤＣＣ特性を有しない。抗体のＡＤＣＣ能は、特異的細胞傷害性が１０％を上回ったときに陽性と見なした。ＡＤＣＣ特性は、ＡＤＣＣアッセイ、例えば、実施例（特に、実施例１０）に記載されている試験で評価することができる。抗体がラット抗体である場合、ＡＤＣＣアッセイで使用されるエフェクター細胞は、ラットのＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー）細胞である。抗体がヒト化されている場合、ＡＤＣＣアッセイは、ヒトＮＫ細胞に対して実施することができる。

【0078】

ＣＤ１２７陽性細胞に対する細胞傷害特性とアンタゴニスト特性の両方を有する本発明の抗体により、エフェクターＴ細胞の枯渇、とりわけ、メモリーＴ細胞の枯渇に対するこれらの特性の累積的作用が可能になり、とりわけ、それにより、より強い枯渇（ＣＤ１２７＋細胞のプールの消尽）及び対応する標的Ｔ細胞の数の低下が可能になる。

【0079】

上記の段落及び実施例には、これらの機能特性について試験する方法が記載されている。以下の節では、該抗体もしくは断片又はキメラ分子の様々な構造特性及び可能な修飾が詳述されている。これらの指針に照らして、当業者は、場合によっては、いくつかの構造的特徴を採用すれば機能的特徴が改変されないということを予測することができるので、及び／又は新たな構造特性の導入後に機能特性の損失について試験することによって、特に、所望の機能特性を有する抗体、例えば、Ｎ１３Ｂ２から始めて、所望の機能特性とともに下記の構造特性を有する抗体又は断片を得ることができるであろう。さらに、該抗体によって認識されるエピトープの本明細書における開示により、同じ機能的特徴を共有する他の抗体の開発は、ルーチンの手順となる。なぜなら、同じ又は類似したエピトープに対する抗体は、ＣＤ１２７に結合したときに類似の効果を引き起こすその能力について選択することができるからである。この場合も、簡単な試験手順が本明細書に開示されているので、当業者は、これらの試験を用いて、好適な抗体を選択することができる。

【0080】

本発明の好ましい実施態様において、該巨大分子は、Ｎ１３Ｂ２又はＮ１３Ｂ２のＣＤＲのうちの少なくとも１つを有する抗体であり、又は該断片はＮ１３Ｂ２の断片である。したがって、本発明は、ＶＨが、以下のアミノ酸配列：
・ＶＨＣＤＲ１配列番号１０；
・ＶＨＣＤＲ２配列番号１２；
・ＶＨＣＤＲ３配列番号１４；
のうちの少なくとも１つ、もしくは下記のそれらの好ましいヒト化変異体のうちの１つを含み、

【0081】

かつ／又はＶＬが、以下のアミノ酸配列：
・ＶＬＣＤＲ１配列番号１６；
・ＶＬＣＤＲ２配列番号１８；
・ＶＬＣＤＲ３配列番号２０
のうちの少なくとも１つ、もしくは下記のそれらの好ましいヒト化変異体のうちの１つを含む、抗体又はその断片に関する。

【0082】

特定の実施態様において、該巨大分子は、Ｎ１３Ｂ２のＣＤＲ配列、すなわち、ＶＨＣＤＲ１配列番号１０、ＶＨＣＤＲ２配列番号１２、ＶＨＣＤＲ３配列番号１４、ＶＬＣＤＲ１配列番号１６、ＶＬＣＤＲ２配列番号１８、及びＶＬＣＤＲ３配列番号２０のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つを含み、そのうちの任意の数を、下記のそれらの好ましいヒト化変異体のうちの１つに置き換えることができる。特定の実施態様において、該巨大分子は、Ｎ１３Ｂ２の６つ全てのＣＤＲ配列を含み、そのうちの任意の数を、下記のそれらの好ましいヒト化変異体のうちの１つに置き換えることができる。特定の実施態様において、該巨大分子は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。特定の実施態様において、該巨大分子は、配列番号２のアミノ酸配列及び／もしくは配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖並びに／又は配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖に関する他の特定の実施態様は、下に開示されるヒト化変異体である。特定の実施態様において、定常鎖は、図１２のラットＩｇＧ１ Ｆｃ鎖の配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０７５９）及び／又は配列番号３４の配列を有する。

【0083】

（断片）
本発明の抗体の「抗原結合性断片」は、抗体の一部、すなわち、おそらくはその天然の形態で、ヒトＩＬ－７のＩＬ－７受容体のアルファ鎖に対する抗原結合能を示す、本発明の抗体の構造の一部に対応する分子であり；そのような断片は、とりわけ、対応する４本鎖抗体の抗原結合特異性と比較して、該抗原に対する同じ又は実質的に同じ抗原結合特異性を示す。好都合なことに、該抗原結合性断片は、対応する４本鎖抗体と同様の結合親和性を有する。しかしながら、対応する４本鎖抗体に対して低下した抗原結合親和性を有する抗原結合性断片も本発明の範囲内に包含される。該抗原結合能は、抗体の親和性及び検討される断片の親和性を測定することによって決定することができる。これらの抗原結合性断片は、抗体の機能的断片と呼ぶこともできる。

【0084】

抗体の抗原結合性断片は、抗原（すなわち、ヒトＩＬ－７のＩＬ－７Ｒａ）の認識部位を包含し、それにより、抗原認識特異性を規定する、ＣＤＲ（相補性決定領域）と呼ばれるその超可変ドメイン又はその部分を含む断片である。４本鎖免疫グロブリンの各々の軽鎖及び重鎖（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）は、それぞれ、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３及びＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３と呼ばれる、３つのＣＤＲを有する。したがって、本発明は、特に、ＶＬ－ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＶＬ－ＣＤＲ２（配列番号１８）、ＶＬ－ＣＤＲ３（配列番号２０）並びにＶＨ－ＣＤＲ１（配列番号１０）、ＶＨ－ＣＤＲ２（配列番号１２）、及びＶＨ－ＣＤＲ３（配列番号１４）の中のＣＤＲ、下に開示されるそれらのヒト化変異体のうちの全てもしくは選択されたものを含むか又はこれらにある本発明の抗体の断片、或いはこれらの機能的部分、すなわち、好ましくは、ヒトＩＬ－７のＩＬ－７Ｒａに対する高い親和性を有する所望の結合特異性を示す部分に関する。

【0085】

本発明の特定の抗原結合性断片は、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを組み合わせている本発明の抗体のＶＨ鎖、特に、下に開示されるヒト化変異体を含む、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖の断片である。本発明の他の断片は、そのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを組み合わせている本発明の抗体のＶＬ鎖、特に、下に開示されるヒト化変異体を含む、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖の断片である。ＣＤＲ３領域が抗原認識特異性の決定因子であると思われる場合、ＶＨ－ＣＤＲ３及び／もしくはＶＬ－ＣＤＲ３を含むか又はこれらにある断片、特に、下に開示されるヒト化変異体を含む、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するＶＨ－ＣＤＲ３及び／もしくはＶＬ－ＣＤＲ３、或いはこれらの機能的部分がとりわけ好ましい。

【0086】

当業者は、基準付番体系（Ｍａｒｔｉｎの文献、２００１）を含む、記載されているこの点に関する標準的な定義を参照することによるか、又はＫａｂａｔの付番体系（Ｋａｂａｔらの文献、１９９２）を参照することによるか、又はＩＭＧＴの「真珠の首輪（ｃｏｌｌｉｅｒ ｄｅ ｐｅｒｌｅ）」アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｉｎｄｅｘ／Ｃｏｌｌｉｅｒｓ．ｈｔｍｌ， Ｌｅｆｒａｎｃらの文献、１９９９）を適用することによって、抗体の様々な領域／ドメインの位置を決定することができるであろう。この点に関して、本発明の配列の定義については、領域／ドメインの境界が参照体系毎に異なり得るということに留意されたい。したがって、本発明で定義される領域／ドメインは、抗体の可変ドメインの全長配列内の関連配列の長さ又は局在における約＋／－１０％の変動を示す配列を包含する。

【0087】

さらに、脱免疫化残基は、抗体又はその抗原結合性断片の可変ＣＤＲドメインに存在し得る。特定の実施態様において、該抗体又はその断片は脱免疫化されている。

【0088】

このように、４本鎖免疫グロブリンの構造に基づいて、フレームワーク及び定常ドメインの位置が、様々なクラスの抗体について、とりわけＩｇＧについて、特に哺乳動物のＩｇＧについて十分に定義されていることに留意しながら、抗原結合性断片を、利用可能なデータベース中の抗体の配列との比較及び従来技術（Ｍａｒｔｉｎの文献、２００１）によって、とりわけ、これらの配列における機能ドメインの位置の比較によって定義することができる。そのような比較は、抗体の３次元構造に関するデータも含む。

【0089】

本発明の具体的な実施態様を説明する目的で、抗体のＣＤＲを含む可変ドメインを含有する抗体の抗原結合性断片は、（Ｋａｂａｔらの文献、１９９２）、（Ｍａｒｔｉｎの文献、２００１）、及びさらには（Ｄｅｌｖｅｓらの文献、２０１１）を参照することにより十分に定義されるＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２を包含する。Ｆｖ断片は、疎水性相互作用によって１つに関連した抗体のＶＬドメインとＶＨドメインからなり； ｄｓＦｖ断片において、ＶＨ：ＶＬヘテロ二量体は、ジスルフィド結合によって安定化されており； ｓｃＦｖ断片において、ＶＬドメインとＶＨドメインは、柔軟なペプチドリンカーを介して互いに接続され、それにより、１本鎖タンパク質を形成している。Ｆａｂ断片は、抗体のパパイン消化によって得られる単量体の断片であり；これらは、ジスルフィド結合を介して１つに結合したＬ鎖全体とＨ鎖のＶＨ－ＣＨ１断片とを含む。Ｆ（ａｂ′）２断片は、ヒンジジスルフィドの下部での抗体のペプシン消化によって生じさせることができ；これは、２つのＦａｂ′断片、及びさらに免疫グロブリン分子のヒンジ領域の一部を含む。Ｆａｂ′断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより、Ｆ（ａｂ′）２断片から得ることができる。Ｆ（ａｂ′）２断片は二価である、すなわち、これらは、天然の免疫グロブリン分子のように、２つの抗原結合部位を含み；他方、Ｆｖ（Ｆａｂの可変部分を構成するＶＨ－ＶＬ二量体）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びＦａｂ′断片は一価である、すなわち、これらは、単一の抗原結合部位を含む。

【0090】

（キメラ抗体）
本発明の別の実施態様によれば、該抗体は修飾されており、結果として、異なる抗体、特に、異なる動物種から得られ、機能的抗体として１つに組み合わされた抗体のアミノ酸残基のドメイン又は鎖（複数可）を含む、キメラ抗体である。特定の実施態様において、本発明の巨大分子は、少なくとも２つの異なる種由来の抗体断片の集合体に存在するキメラ抗体である。特定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域を含む。そのような定常領域は、実施例において、Ｆｃ断片Ｇ１（配列番号２６）又はＦｃ断片Ｇ４（配列番号２８）又はＣＬカッパ断片（配列番号３０）により示されている。或いは、図１２に示されたヒトＦｃ断片（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６１）及び／又は配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしく配列番号１１２の配列を有するヒトＦｃ断片を使用することができる。特定の実施態様において、キメラ抗体は、齧歯類抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域を含む。特定の実施態様において、キメラ抗体は、配列番号２の配列（Ｎ１３Ｂ２－Ｇ１ｍ－ＶＨ－ＦｃＧ１ｍ（Ｅ３３３Ａ））又は配列番号６の配列（Ｎ１３Ｂ２－Ｇ４ｍ－ＶＨ－ＦｃＧ４ｍ（Ｓ２２８Ｐ））を有するＶＨ鎖及び配列番号４の配列（Ｎ１３Ｂ２－Ｇ１ｍ－ＶＬ－ＣＬカッパ）を有するＶＬ鎖を含む。

【0091】

（アフィチン、アンチカリン、及び他の抗体模倣物）
本発明の巨大分子は、本明細書において抗原結合性抗体模倣物とも呼ばれる、抗体の抗原結合能を模倣する抗原結合能を有する人工タンパク質も含む。そのようなタンパク質は、アフィチン及びアンチカリンを含む。アフィチンは、抗原に選択的に結合する能力を有する人工タンパク質である。これらは、古細菌ドメインに属する微生物であるスルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）で見出されたＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄに構造的に由来している。例えば、Ｓａｃ７ｄの結合面の１１個の残基の無作為置換に対応する変異体を作製することによって、Ｓａｃ７ｄの結合表面のアミノ酸を無作為化することにより、アフィチンライブラリーを作製することができ、得られたタンパク質ライブラリーを次々とリボソームディスプレイに供して、親和性をペプチド、タンパク質、ウイルス、及び細菌などの様々な標的に対するものとすることができる。アフィチンは抗体模倣物であり、バイオテクノロジーにおけるツールとして開発されているところである。これらは、様々な酵素の特異的阻害剤としても使用されている（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋらの文献、２００８）。当業者は、当技術分野で公知の、特に、特許出願ＷＯ２００８０６８６３７号及び上に引用された刊行物に開示されている方法、特に、ファージディスプレイ及び／又はリボソームディスプレイライブラリーの作製、並びに本明細書に開示されている抗原を用いたそのスクリーニングを用いて、所要の結合特性を有するアフィチンを容易に開発することができる。アンチカリンは、タンパク質か又は小分子かのいずれかの抗原に結合することができる人工タンパク質である。これらは、天然結合タンパク質のファミリーであるヒトリポカリンに由来する抗体模倣物である。アンチカリンは、約８倍小さく、約１８０アミノ酸のサイズ及び約２０ｋＤａの質量を有する（Ｓｋｅｒｒａの文献、２００８）。特に、特異的結合特性を有するアンチカリンのスクリーニング及び選択を可能にするアンチカリンファージディスプレイライブラリーが作製されている。当業者は、当技術分野で公知の、特に、ＥＰ特許ＥＰ１２７０７２５ Ｂ１号、米国特許ＵＳ８５３６３０７ Ｂ２号（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ及びＳｋｅｒｒａの文献、２００２）、及び上に引用された刊行物に開示されている方法、特に、ファージディスプレイ及び／又はリボソームディスプレイライブラリーの作製、並びに本明細書に開示されている抗原を用いたそのスクリーニングを用いて、所要の結合特性を有するアフィチンを容易に開発することができる。アンチカリンとアフィチンはどちらも、細菌発現系を含むいくつかの発現系で産生することができる。したがって、本発明は、アフィチン、アンチカリン、並びに特に、ＣＤ１２７への結合、ＣＤ１２７内在化の非誘導及び／又は阻害、ＤＣの成熟に関して、本明細書に記載の抗体の特徴を有する他の同様の抗体模倣物を提供するものであり、これらは全て、本発明の巨大分子として企図されている。

【0092】

（ヒト化）
特定の実施態様において、本発明の巨大分子は、ヒト化抗体又はその抗原結合性断片である。したがって、動物の免疫及びハイブリドーマからのモノクローナル抗体の産生の後、動物で、とりわけ、齧歯類動物で、特に、ラットで最初に得られたら、本発明の抗体を、フレームワーク内及び任意にさらにＣＤＲ配列内でのアミノ酸残基の置換によって、そのＶＨ配列及び／又はＶＬ配列内で修飾する。該ヒト化は、既知の技法に従って、リサーフェシングによるか又はＣＤＲ移植によって行うことができる。リサーフェシングは、とりわけ、齧歯類残基をヒトアミノ酸残基に置換することによって達成される。置換は、それによって抗原結合親和性が保持されるように、もとの抗体のフレームワーク構造及びさらにはＣＤＲ提示を維持し、それにより、リサーフェシングされた抗体におけるフレームワークとＣＤＲの相互作用が抗原と接触する表面の天然の立体構造を維持することを可能にするやり方で行う。

【0093】

本発明の抗体の好ましい実施態様は、以下の軽鎖及び重鎖を含む（ラット）Ｎ１３Ｂ２抗体のヒト化バージョンによって表される：

【0094】

ラットＮ１３Ｂ２のＣＤＲ配列及びＣＤＲ配列の外側のいくつかの他のアミノ酸が保存されており、かつ他の全てのアミノ酸がヒト抗体の配列と一致する、配列番号３６の配列を有するＮ１３Ｂ２－ｈ１の重鎖。この重鎖は、ヒト抗体重鎖との８７．８％の同一性を有する。ＣＤＲ配列の外側の以下の残基が保存されている：Ｋａｂａｔ位置Ｈ２４のＶ（図２３の位置２４；ヒト配列ではＡ）、Ｋａｂａｔ位置Ｈ３７のＶ（図２３の位置３７；ヒト配列ではＩ）、Ｋａｂａｔ位置Ｈ４９のＡ（図２３の位置４９；ヒト配列ではＳ）、及びＫａｂａｔ位置Ｈ７３のＤ（図２３の位置７４；ヒト配列ではＮ）；

【0095】

Ｎ１３Ｂ２－ｈ１の重鎖と比較して、ＣＤＲ配列の外側のＫａｂａｔ位置Ｈ３７、Ｈ４９、及びＨ７３のアミノ酸がヒト抗体重鎖の配列と一致するように修飾されている、配列番号３８の配列を有するＮ１３Ｂ２－ｈ２の重鎖；

【0096】

Ｎ１３Ｂ２－ｈ２の重鎖と比較して、ＣＤＲ３配列内のＫａｂａｔ位置Ｈ９６のＭ（図２３の位置１００）が、ヒト抗体重鎖の配列と一致するように及び／又は翻訳後修飾を回避するように、Ｌに突然変異させられている、配列番号４０の配列を有するＮ１３Ｂ２－ｈ３の重鎖。この位置の他の可能な残基としては、特に、Ａ、Ｆ、及びＩ、より好ましくは、Ｆ又はＩが挙げられる。したがって、Ｎ１３Ｂ２ ＶＨのＣＤＲ３配列の可能なヒト化変異体は、配列番号４８の配列を有する。

【0097】

ラットＮ１３Ｂ２のＣＤＲ配列及びＣＤＲ配列の外側のいくつかの他のアミノ酸が保存されており、かつ他の全てのアミノ酸がヒト抗体の配列と一致する、配列番号４２の配列を有するＮ１３Ｂ２－ｈ１の軽鎖。この軽鎖は、ヒト抗体軽鎖との８０％の同一性を有する。ＣＤＲ配列の外側の以下の残基が保存されている：Ｋａｂａｔ位置Ｌ４８のＶ（図２４の位置４８；ヒト配列ではＩ）、Ｋａｂａｔ位置Ｌ７１のＹ（図２４の位置７１；ヒト配列ではＦ）、及びＫａｂａｔ位置Ｌ８７のＦ（図２４の位置８７；ヒト配列ではＹ）；

【0098】

Ｎ１３Ｂ２－ｈ１の軽鎖と比較して、ＣＤＲ配列の外側のＫａｂａｔ位置Ｌ４８、Ｌ７１、及びＬ８７の３つのアミノ酸がヒト抗体軽鎖の配列と一致するように修飾されている、配列番号４４の配列を有するＮ１３Ｂ２－ｈ２の軽鎖；

【0099】

Ｎ１３Ｂ２－ｈ２の軽鎖と比較して、それぞれ、ＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列内のＫａｂａｔ位置Ｌ３１（図２４の位置３１）及び／又はＬ５２（図２４の位置５３）のアミノ酸が、ヒト抗体軽鎖の配列と一致するように及び／又は翻訳後修飾を回避するように、それぞれ、ＮからＱに及びＳからＴに突然変異させられている、配列番号４６の配列を有するＮ１３Ｂ２－ｈ３の軽鎖。Ｌ３１位置の他の可能なアミノ酸としては、Ｈ及びＲが挙げられる。ＣＤＲ３配列の他の可能な突然変異は、位置Ｌ５２のＳを保存すること及び位置Ｌ５１のＮ（図２４の位置５２）をＱ、Ｈ、Ｋ、又はＲに突然変異させることを含む。したがって、Ｎ１３Ｂ２ ＶＬのＣＤＲ１配列の可能なヒト化変異体は、配列番号５０の配列を有し、Ｎ１３Ｂ２ ＶＬのＣＤＲ２配列の可能なヒト化変異体は、配列番号５２の配列を有する。

【0100】

（多機能抗体又は断片）
本発明のこれらの基本的な抗原結合性断片を１つに組み合わせて、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディなどの多価抗原結合性断片を得ることができる。これらの多価抗原結合性断片も本発明の一部である。

【0101】

適切な場合、上述の修飾を組み合わせることができる。特定の実施態様において、該巨大分子は、キメラ抗体もしくはヒト化抗体及び／又は脱免疫化抗体である抗体である。

【0102】

（本発明の抗体を得る方法）
本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、特に、ヒトＴ細胞によって発現されるＣＤ１２７である分子に対して好都合に作製され、場合により、天然ポリペプチド又は組換え分子という形態での免疫から作製される。

【0103】

免疫は、下の実施例に開示されるプロトコルに従って実施することができ：組換えＣＤ１２７ Ｆｃキメラ（１０９７５－Ｈ０３Ｈ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）を用いて、ラット、例えば、ベルギーのルーヴァン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｖａｉｎ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）で入手可能なＬＯＵ／Ｃ Ｉｇｋ１ａ系統のラットを免疫した。或いは、配列番号１１５（特に、配列番号１１０を含む）のアミノ酸配列及び／又は配列番号１１７（特に、配列番号１１１を含む）のアミノ酸配列及び／又は配列番号１１６のアミノ酸配列を含む抗原（該抗原は、上で開示されているように、他の配列、特に、ヒトＣＤ１２７の他の配列をさらに含むか、又はこれを含まない）を、免疫原として使用することができる。ハイブリドーマは、以前に記載されている手順（Ｃｈａｓｓｏｕｘらの文献、１９８８）に従って、脾臓単核細胞を非分泌性かつアザグアニン耐性細胞株のＬＯＵラット免疫細胞腫ＩＲ９８３Ｆと融合させることにより得られた。まず、ハイブリドーマを、組換えＣＤ１２７分子（ＣＤ１２７ Ｆｃキメラ；１０９７５－Ｈ０３Ｈ， Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）に結合する分泌モノクローナル抗体の能力によってスクリーニングした。その後、ハイブリドーマを、ヒトＴ細胞によって発現されるＣＤ１２７に結合するそのモノクローナル抗体の能力について、及び図１に例示されているように、ヒト白血球上でＩＬ－７によって誘導されるＳＴＡＴ－５リン酸化の誘導を阻害する能力について、及びＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させないその能力についてスクリーニングした。

【0104】

本発明の特定の実施態様によれば、本発明のヒト化抗体は、Ｎ１３Ｂ２と呼ばれる抗体から、その可変重鎖（ＶＨ）のＣＤＲ領域及び／又はその可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲ領域のうちの１つ又は複数の突然変異によって得られ、特に、ある抗体は、ＶＨ及び／又はＶＬのいずれかのＣＤＲ３、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ１領域の中で少なくとも１つ又は２つのもとのＣＤＲ領域を保持しており、該修飾抗体は、もとのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３領域に対して、個々に検討されるＣＤＲ領域中に１０％未満の突然変異型アミノ酸残基、好ましくは、１個又は０個の突然変異型アミノ酸残基を有し、ここで、該もとのＣＤＲ領域は、
ｉ．配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ２；
ｉｉｉ．配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３；
ｉｖ．配列番号１６のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ１；
ｖ．配列番号１８のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ２；
ｖｉ．配列番号２０のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ３；
である。

【0105】

したがって、ＶＨＣＤＲ３は、配列番号４８のアミノ酸配列を有することができ； ＶＬＣＤＲ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を有することができ； ＶＬＣＤＲ２は、配列番号５２のアミノ酸配列を有することができる。

【0106】

特定の実施態様において、本発明の抗原結合性断片は、前の段落に記載されているように修飾されているＮ１３Ｂ２抗体の抗原結合性断片であり、該修飾された抗原結合性断片は、もとの抗原結合性断片に対して１０％未満の突然変異型アミノ酸残基を有する。

【0107】

本発明によって提供される教示を考慮して、本発明の抗体を発現させるために、当業者は、ハイブリドーマを調製するか、又は発現ライブラリー及び発現系などの代替技術を使用し、その後、ハイブリドーマによって分泌される抗体の構造を有し、かつその特性、特に、その結合及び中和特性を有する抗体を選択することができる。ｃＤＮＡライブラリーを本発明のハイブリドーマで発現されるＲＮＡから適切に調製し、適切な配列を選択し、発現させることができる。或いは、本発明の抗体又はその断片をコードするｃＤＮＡを合成によって調製する。

【0108】

本発明による「ハイブリドーマ細胞」は、選択された免疫原で予め免疫しておいた動物由来の抗体産生細胞（Ｂリンパ球）と得られた融合細胞に不死性を提供することが可能な骨髄腫細胞である融合パートナーの融合から作製される細胞である。骨髄腫細胞及び抗体産生細胞（Ｂ細胞、例えば、脾細胞）は、同じ起源のものであることができ、真核細胞、特に、同じ動物の哺乳動物細胞である。或いは、これらは、異なる起源のものであり、そのため、ヘテロハイブリドーマを生じることができる。非分泌性かつアザグアニン耐性細胞株であるＬＯＵラット免疫細胞腫ＩＲ９８３Ｆなどの骨髄腫細胞は、調製したハイブリドーマが所望の特異性のモノクローナル抗体のみを分泌することを可能にするために、免疫グロブリンを産生することができない細胞の中から選択される。ＡＤＣＣを促進するのに好適な他の細胞、例えば、組換え細胞での発現による抗体の調製のための以下のページに記載されている細胞をラット免疫細胞腫の代わりに使用することができる。そのような細胞は、低いフコシル化能を有するか又はフコシル化能を全く有しない細胞であることが好都合である。

【0109】

本発明を実施するのに好適なハイブリドーマの調製は、従来法によって行われる。実施態様は、特定の開示された特徴を融合パートナーとして使用される他の細胞に適合させることができる本出願の実施例において詳細に記載されている。

【0110】

抗体の抗原結合性断片は、抗体から出発して、とりわけ、パパイン消化もしくはペプシン消化を含む、周知の技法による酵素消化を用いることによるか、又は任意の適当な切断法を用いることによって得ることができる。或いは、これらは、該断片のアミノ酸配列をコードする核酸配列による組換えによって修飾された宿主細胞で発現させることができるか、又は合成、とりわけ、化学合成することができる。したがって、本発明の抗体は、修飾抗体及び該抗体の抗原結合性断片を含め、古典的な遺伝子工学技法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒの文献（１９９０）及び改訂版）によって記載されている技法によって調製することもできる。したがって、本発明は、シグナルペプチドを包含するバージョンのＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチド又はシグナルペプチドを包含しないバージョンのＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドに関する。シグナルペプチドは、細胞内でポリペプチドを調製するときに必要である場合がある。

【0111】

本発明の抗体又はその機能的断片をヒト患者への投与に使用することを目的として、とりわけ、該抗体に対する受容宿主又は患者の免疫反応を低下させるために、ヒト化モノクローナル抗体もしくはキメラモノクローナル抗体及び／又は脱免疫化抗体を、実施例に示されている抗体などの非霊長類抗体である本発明の抗体から得ることが有益であり得る。これらの変異体抗体の機能的断片は、ヒト化変異体、キメラ変異体、又は脱免疫化変異体としても得ることができる。

【0112】

ヒト化抗体である抗体又はその抗原結合性断片は、本発明の非ヒト抗体の可変鎖（ＶＨ及び／又はＶＬ）の定常領域（複数可）に存在するアミノ酸残基（複数可）を、標準的な定義及び付番によるヒト抗体中の対応する場所を有するヒトアミノ酸残基（複数可）に置換することによって得ることもでき、ここで、該置換レベルは、該フレームワーク領域中の残基の１％～２０％、特に、１％～１８％である。該定常領域には、特に、Ｋａｂａｔ付番を参照して特定される、４本鎖抗体で規定されたフレームワーク領域（ＦｗＲ）の定常領域が含まれる。

【0113】

本発明による修飾抗体の特定の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び／又は脱免疫化抗体を包含する。

【0114】

特定の修飾抗体は、ＣＤＲ領域に修飾アミノ酸残基を有し、該修飾は、非ヒト抗体の可変ドメイン中のＴ細胞エピトープの消失によって脱免疫化をもたらす。脱免疫化は、とりわけ、コンピュータ上での予測によって、抗体可変ドメイン中のＴ細胞エピトープを決定した後、それに続いて、抗体の可変鎖の配列に機能的Ｔ細胞エピトープを除去する点突然変異を導入することによって行うことができる。本発明の好ましい実施態様において、ＣＤＲ領域の修飾、とりわけ、ＣＤＲ３領域の修飾は、人体への投与を目的として脱免疫化するために、例えば、ＨＬＡ－クラスＩＩ／ペプチド複合体に対するＴ細胞受容体の結合親和性を減少させるために必要な程度に制限される。特定の実施態様において、ＶＨのＣＤＲ３領域及び／又はＶＬのＣＤＲ３領域は修飾されない。別の実施態様において、ＦＲ領域及び／又はＣＨ領域も修飾され、とりわけ、ヒト化される。

【0115】

本発明の枠内の抗体は、上に定義された特徴に基づく抗体を相応に包含し、これは、ヒト化抗体、とりわけ、本発明の抗体のフレームワーク領域（複数可）に存在するアミノ酸残基（複数可）を、標準的な定義及び付番によるヒト抗体中の対応する場所を有するヒトアミノ酸残基（複数可）に置換することによって得られる抗体である。脱免疫化を含むヒト化のためのフレームワーク領域中及び／又はＣＤＲ中のアミノ酸残基の置換レベルは、該フレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域中の残基の１％～２０％、特に、１％～１８％である。上述のように、ヒト化は、主に、もとの抗体のフレームワーク領域を標的とする。場合により、ヒト化は、代替的に又は同様に、ＣＤＲ領域（複数可）、とりわけ、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域（複数可）に関するものであってもよく、より具体的には、脱免疫化と呼ばれる。特定の実施態様において、１以下のアミノ酸が各々のＣＤＲ領域中で修飾される。ラット抗体Ｎ１３Ｂ２に由来するヒト化及び／又は脱免疫化抗体の例が本明細書に開示されている。

【0116】

したがって、ヒト化は、非ヒト抗体もしくは断片の配列と最も高い配列同一性を示すヒト生殖系列軽鎖又は重鎖フレームワークを検討し、対応するヒト残基（複数可）に適合させるために、該非ヒト抗体又はその断片において置換されることになるアミノ酸残基、とりわけ、抗体の表面に露出した残基を選択して、達成することができる。特定の実施態様において、ＦＲＬのうちの一部もしくは全て及び／又はＦＲＨ領域のうちの一部もしくは全ては、完全にヒトである、すなわち、ヒトフレームワーク配列の特性を示す。別の実施態様において、一部又は全てのＦＲ領域中の選択された残基が置換される。

【0117】

抗体をヒト化する方法も当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｏｕｔｌｅｄｅｇｅらによって記載されている（Ｅｄｗａｒｄ Ｇ． Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅの文献、１９９３）。これらの方法は、ｓｃＦｖなどの抗原結合性断片にも適用することができる。例として、「リサーフェシング」として知られる方法は、非ヒト抗体の可変領域のフレームワーク中の表面残基のセットをヒトの表面残基のセットと置き換えることに本質があり、一方、ＣＤＲ移植として知られる方法は、非ヒト抗体由来のＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植することからなる。ＣＤＲ移植は、通常、結合親和性を最適化するために、ヒトフレームワークのいくつかの残基の置換に本質があるフレームワーク最適化によって達成される。フレームワーク最適化の工程は、最近、コンビナトリアルライブラリーの使用によって簡素化されている（Ｒｏｓｏｋらの文献、１９９６）（Ｂａｃａらの文献、１９９７）。

【0118】

本発明は、特に、ＣＤＲ移植によってラットＮ１３Ｂ２抗体から得られるヒト化抗体に関する。それぞれ、ラットＮ１３Ｂ２のＶＨ及びＶＬ配列との強い相同性がある配列を有するヒトＶＨ及びＶＬ配列をデータベースにおいて選択した。Ｎ１３Ｂ２のＣＤＲ配列をこれらのヒト配列に移植した。ＣＤＲ配列の外側のいくつかの残基、特に、ＣＤＲのすぐ近くの残基及びバーニヤ残基として知られる残基は、抗原認識又は親和性に対して顕著な影響を及ぼし得る。上で及び実施例の節で、特に、実施例１２で詳述されているように、ヒト化抗体のいくつかのバージョン：全てのラット配列がＣＤＲ及び上述の構造的に重要な残基について保存されている最も保存的なもの、ヒト配列が構造的に重要な残基について選択されているバージョン、及びＣＤＲの外側の構造的に重要な残基に加えて、特に、酸化又は脱アミド化などの翻訳後修飾を妨げるために、ＣＤＲの内側のいくつかの残基が最初のラット配列から修飾されている、ヒト配列に最も近いバージョンを試験した。

【0119】

抗体のヒト化に利用可能な別の最近の戦略では、軽鎖及び重鎖のもとの非ヒトＣＤＲ３配列のみが保持され、一方、残りの配列は、ナイーブヒトＶ遺伝子ライブラリから選択される（Ｒａｄｅｒらの文献、１９９８）。

【0120】

本発明のキメラ抗体、ヒト化抗体、及び／又は脱免疫化抗体は、非修飾抗体のように、免疫グロブリンのいずれかのクラスに属することができる。好ましくは、これらは、ＩｇＧクラスのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４に属する。

【0121】

抗体の可変領域を適当なリンカー又は別の抗体の定常領域と組み合わせることによって組換え抗原結合性断片又はキメラ抗体を調製する方法は、当技術分野で周知である。

【0122】

本発明の抗体はモノクローナル抗体といわれ、これらの抗体の組成が均一である、とりわけ、抗原結合特異性に関して、したがって、可変領域組成に関して同一であるということを意味する。したがって、該抗体は、ハイブリドーマの技法に代わる技法によって得られたとしても、モノクローナルとみなすことができる。

【0123】

別の実施態様によれば、本発明は、本明細書に提供される定義のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片を含むキメラ分子に関するものでもあり、ここで、該抗体又はその機能的断片は、機能的に異なる分子と関連している。本発明のキメラ分子は、融合キメラタンパク質か、或いは抗体又は機能的断片の安定性及び／又は半減期を改善するための、共有結合、移植、化学基もしくは生物基（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒｏｕｐ）との化学結合、又は分子、例えば、ＰＥＧポリマーもしくはインビボでのプロテアーゼ切断に対する保護に好適な別の保護基もしくは分子との化学結合を含む、任意の好適な形態の結合から得られるコンジュゲートかのいずれかであることができる。同様の技法を用いて、とりわけ、化学的カップリング又は移植により、キメラ分子を、生物活性分子（該活性分子は、例えば、毒素、特に、シュードモナス外毒素Ａ（Ｒｉｓｂｅｒｇらの文献、２０１１）、植物毒素リシンのＡ鎖（ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔらの文献、２００１）、もしくはサポリン毒素（Ｆｌａｖｅｌｌらの文献、２００６）の中から選択される）、とりわけ、治療有効成分、抗体もしくは機能的断片を人体の特定の細胞もしくは組織に標的化するのに好適なベクター（とりわけ、タンパク質ベクターを含む）を用いて調製することができるか、又はとりわけ、抗体の断片を使用する場合、キメラ分子を標識もしくはリンカーと関連させることができる。

【0124】

抗体又はその機能的断片のＰＥＧ化は、それにより、とりわけ、治療への応用のための、宿主への活性物質の送達条件が改善されるので、特定の興味深い実施態様である。ＰＥＧ化は、抗体又は機能的断片の認識部位との干渉を妨げるために部位特異的であることができ、かつ高分子量ＰＥＧを用いて行うことができる。ＰＥＧ化は、抗体もしくは機能的断片の配列中に存在する遊離システイン残基を通じて、又は抗体もしくは機能的断片のアミノ酸配列中の付加された遊離システイン残基を通じて達成することができる。

【0125】

本発明は、本明細書で定義されているような抗体又はその機能的断片を含む組成物に関するものでもあり、ここで、該抗体又はその機能的断片は、抗体もしくはその機能的断片の均一な集団であるか、又はモノクローナル抗体もしくはその機能的断片である。

【0126】

場合によっては、生成物の組成物を用いて、所望の効果を得ることが可能であり、その場合、組成物中の生成物の各々が少なくとも１つの所望の効果を生じる。今回の場合、例えば、ＩＬ－７－ＩＬ－７Ｒ相互作用に対する阻害効果を有する分子とＣＤ１２７陽性細胞に対する細胞傷害効果を有する分子を組み合わせることが可能である。そのような組合せは本発明に含まれる。重要なことに、本発明において、生成物の組成物は、樹状細胞の成熟についてＴＳＬＰと相乗作用するべきではない。通常、これは、そのどれもが樹状細胞の成熟についてＴＳＬＰと個々に相乗作用しない生成物を組み合わせることを含む。

【0127】

特定の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体、断片、又はキメラ分子を含む化合物の組成物又は集合物に関するものであり、該組成物は、（ｉ）ＣＤ１２７陽性細胞、とりわけ、ＣＤ１２７＋ Ｔ細胞に対する細胞傷害活性を有する抗体もしくはその抗原結合性断片又はキメラ分子の集団、及び（ｉｉ）ヒトＩＬ－７に対するアンタゴニスト特性を有する抗体もしくはその機能的断片又はキメラ分子の集団を含み、これらの抗体集団は、混合物中で組み合わされているか、又は分離しているかのいずれかであり、この後者の選択肢においては、併用投与又は逐次投与用に製剤化される。抗体及び／又は機能的断片及び／又はキメラ分子は、樹状細胞の成熟についてＴＳＬＰと相乗作用しない。

【0128】

とりわけ、本発明の抗体を参照することによって本明細書に提供される定義は、それが技術的に明らかに適切でない場合を除いて、その抗原結合性断片にも同様に適用される。これらの定義は、本出願に開示されているような、巨大分子（特に、キメラ抗体又はキメラ分子）或いはこれらの抗体もしくはその抗原結合性断片を含むか又はこれらの抗体から得られる組成物にも適用される。本発明の抗体の抗原結合性断片は、概念的な観点又は設計上の観点から、抗体から誘導されるが、必ずしも生成物としての抗体に頼らずに、様々な技法によって調製することができることがさらに規定される。

【0129】

本発明はまた、本明細書に提供される定義のいずれかによる巨大分子をコードする核酸分子に関する。特定の実施態様において、本発明の核酸は、配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２、配列番号２４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号８６、配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸をコードする。特定の実施態様において、本発明の核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、もしくは５５の配列を含むか、又はこれらの配列にある。

【0130】

本発明の巨大分子の調製に好適なそのような核酸は、とりわけ：
ｉ．配列番号１もしくは配列番号５もしくは配列番号５４の配列を有するＶＨ領域、又は配列番号２１もしくは配列番号３５もしくは配列番号３７もしくは配列番号３９の配列を有するＶＨ領域の可変領域をコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ．配列番号３もしくは配列番号７もしくは配列番号５６の配列を有するＶＬ領域、又は配列番号２３もしくは配列番号４１もしくは配列番号４３もしくは配列番号４５の配列を有するＶＬ領域の可変領域をコードするポリヌクレオチド；
ｉｉｉ．配列番号９の配列を有するＶＨＣＤＲ１領域をコードするポリヌクレオチド、
ｉｖ．配列番号１１の配列を有するＶＨＣＤＲ２領域をコードするポリヌクレオチド、
ｖ．配列番号１３の配列又は配列番号４７の配列を有するＶＨＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチド、
ｖｉ．配列番号１５の配列又は配列番号４９の配列を有するＶＬＣＤＲ１領域をコードするポリヌクレオチド、
ｖｉｉ．配列番号１７の配列又は配列番号５１の配列を有するＶＬＣＤＲ２領域をコードするポリヌクレオチド、
ｖｉｉｉ．配列番号１９の配列を有するＶＬＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチド
の群の中で選択される。

【0131】

本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、又は５５の配列に関して修飾されたヌクレオチドを有し、かつ：
（ａ）それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、もしくは５６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、並びに／又は
（ｂ）それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、もしくは５５の配列を有するポリヌクレオチドのうちの１つとのその全長にわたる少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、及び最も好ましくは、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有し、並びに／又は
（ｃ）配列番号１、３、５、７、２１、２３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５３、もしくは５５の配列を有し、かつ抗原結合性断片を含むかもしくは抗原結合性断片からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの断片である、
ポリヌクレオチドに関する。

【0132】

本発明のポリヌクレオチドは、とりわけ、宿主細胞における発現のための、最適化された配列であることもできる。この分野の最適化法は、従来の方法である。

【0133】

本発明のポリヌクレオチド断片は、少なくとも９ヌクレオチド、特に、少なくとも１８ヌクレオチドの配列を好都合に有し、かつそのもとの配列よりも短く、とりわけ、それぞれ、示された全長ＶＨ又はＶＬ配列よりも短い。

【0134】

特定の実施態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明による巨大分子をコードする配列の他に、抗体鎖をコードする配列の上流に、産生細胞で発現されたときに該タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドをコードする配列を含むことが好都合である場合がある。これらは、該タンパク質を検出し及び／又は該タンパク質の精製を容易にするための、１以上のマーカーペプチドをコードする１以上の配列も含むことができる。

【0135】

本発明はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのクローニング用及び／又は発現用のベクターに関する。特定の実施態様において、本発明のベクターは、転写及び発現のための調節配列を含む、哺乳動物細胞内でのクローニング及び／又は発現に好適なプラスミドである。

【0136】

本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドで組み換えられた細胞又は細胞株、とりわけ、哺乳動物又は鳥類の細胞又は細胞株に関する。例えば、全体的なフコシル化を低下させるように遺伝子改変されたチャイニーズハムスター卵巣細胞。実際、コアフコシル化を欠く抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の顕著な増強を示す（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎらの文献、２０１０）。別の例は、もともと低いフコシル化特性を有するＥＢ６６細胞株である（Ｏｌｉｖｉｅｒらの文献、２０１０）。

【0137】

したがって、本発明は、抗体又はその抗原結合性断片を調製する方法であって：
（ａ）動物、とりわけ、哺乳動物を、ヒトＩＬ－７受容体のヒトアルファ鎖、好ましくは、配列番号１１５（及び／もしくは配列番号１１０）並びに／又は配列番号１１７（及び／もしくは配列番号１１１）並びに／又は配列番号１１６（及び／もしくは配列番号８６）の配列を有するヒトＣＤ１２７の配列を含むその抗原（該抗原は、上で開示されているように、ヒトＣＤ１２７の他の配列を含むか、又はこれを含まない）で免疫し、必要な場合、該動物を同じ免疫原で追加免疫し、免疫に応答する動物由来の脾臓細胞又はリンパ節細胞を回収し、該細胞を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを得た後に、モノクローナル抗体を単離すること、並びに／或いは
（ｂ）そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、そのヌクレオチド配列が組換え形態である本明細書に開示されるポリヌクレオチドを、細胞内で、抗体の回収を可能にする条件で発現させること、並びに
（ｃ）特に、ＣＤ１２７の２ｂ部位由来の配列を含み、かつ特に、そのような配列及びさらにＣＤ１２７のＤ１ドメイン由来の配列を含む、本明細書に定義されるエピトープを認識する抗体、特に、ヒトＩＬ－７受容体のアルファ鎖に対する所望の結合親和性を有する抗体を回収すること
を含む、方法にも関する。

【0138】

本発明の特定の実施態様において、該抗体又はその断片は、低いフコシル化特性を示す細胞、例えば、鳥類ＥＢ６６細胞で調製される。

【0139】

本発明は、抗体を選択する方法であって、場合により、本明細書に記載の方法のうちの１つによって、ＣＤ１２７、特に、上で開示されているその抗原に特異的に結合する抗体又はその断片を得る工程、並びにこれらの抗体の中で、免疫細胞、特に、樹状細胞のＴＳＬＰ誘導性成熟を増大させないもの、ＣＤ１２７の内在化を誘導しないもの、並びに／又はＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害するもの、並びに／又はα４、β７、及び／もしくはα４／β７インテグリンのインビトロ及び／もしくはインビボ発現を阻害するものを選択する工程を含む、方法にも関する。選択は、細胞表面マーカーＣＤ４０及び／もしくはＣＤ８０のＴＳＬＰ誘導性発現の増減について試験するための又はＣＤ１２７の内在化に対する効果について試験するための又はα４、β７、及びα４／β７インテグリンの発現に対する効果について試験するための、実施例の節に記載されている手順のいずれかを用いて行うことができる。そのような試験を、例えば、９６ウェルプレートで好都合に行って、多くの候補抗体の迅速かつ効率的なスクリーニングを可能にすることができ、古典的な免疫染色及びフローサイトメトリー解析により、読出しを行うことができる。したがって、本発明は、抗体、その抗原結合性断片、又は他の巨大分子を選択する方法であって、以下の工程：
ａ．巨大分子を、ＣＤ１２７に対する、特に、本明細書に開示されるその抗原に対する該巨大分子の結合能に関して試験する工程（例えば、実施例１、実施例２、実施例６、及び／もしくは実施例７に記載されている）；
ｂ．巨大分子の存在によって誘導されるＣＤ１２７発現細胞におけるＣＤ１２７の内在化を試験する工程（例えば、図１６及び／もしくは実施例５に記載されている）；
ｃ．巨大分子によるＣＤ１２７発現細胞におけるＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化の阻害を試験する工程（例えば、図１６及び／もしくは実施例５に記載されている）；
ｄ．巨大分子の存在下でＴＳＬＰによって誘導されるＤＣの成熟の増大を試験する工程（例えば、図５、図６、及び／もしくは実施例９に見られる）；
のうちの少なくとも１つを含むか又はこれらからなり、任意に、以下の工程：
ｅ．巨大分子によるＩＬ－７誘導性シグナル伝達、特に、ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害を試験する工程（例えば、図１、図２、及び／又は実施例３に見られる）；
ｆ．巨大分子によるＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の阻害を試験する工程（例えば、実施例９、図５、及び／又は図６に見られる）；
ｇ．巨大分子によるα４、β７及び／又はα４／β７インテグリン発現、特に、Ｔ－リンパ球での細胞表面発現の発現の阻害を試験する工程（例えば、実施例１６、図１９、及び／又は図２０に見られる）；
ｈ．特に、ＩＬ－７の存在下での、抗体によるＣＤ１２７のγｃ鎖への結合の妨害を試験する工程（例えば、実施例２１、図２８に見られる）
のうちの少なくとも１つを含む、方法に関する。
これらの試験工程の各々の後に、本明細書に開示される所望の機能的特徴を有する１以上の巨大分子を選択する。
上述のように、抗体が、ＣＤ１２７の配列中で連続していない配列を含むエピトープを認識することが望ましい場合、ＣＤ１２７の単一の連続配列からなる（又は本質的に該配列からなる）エピトープの断片の認識（又は該断片への結合）を順次試験することが可能である。例えば、配列番号１１５、配列番号１１６、及び配列番号１１７を含むエピトープを認識する抗体を得ることが望ましい場合、第１に、本質的に配列番号１１６からなるエピトープを認識する抗体を選択し、次いで、第２に、これらの第１の選択された抗体の中で、本質的に配列番号１１５からなるエピトープを認識する抗体を選択し、その後、これらの第２の選択された抗体の中で、配列番号１１７から本質的になるエピトープを認識する抗体を選択することが可能である。選択の順序を、単に一例として提供されたこの順序と比べて、改変することができることが明白である。

【0140】

本発明の別の目的は、本発明による巨大分子を医薬ビヒクルとともに含む医薬組成物であり、ここで、該医薬組成物は任意に、異なる活性成分をさらに含む。

【0141】

本発明はまた、ヒト患者に投与されたときに、ヒトＣＤ１２７陽性細胞の生存又は増殖、特に、ヒトＣＤ１２７陽性エフェクター細胞、とりわけ、ＣＤ１２７＋メモリーＴ細胞、とりわけ、ＣＤ１２７＋でもＣＤ８＋でもあるメモリーＴ細胞、又はＣＤ１２７＋かつＣＤ４＋細胞であるメモリーＴ細胞の生存又は増殖を制御するのに好適な製剤中に、本発明の巨大分子を活性成分としてを含む組成物又は上で定義されているような医薬組成物に関する。特定の実施態様において、本発明の巨大分子を活性成分として含む組成物は、患者に投与されたときに、樹状細胞の分化及び／又は成熟を制御するのに好適な製剤中にある。

【0142】

本発明の組成物は、特に、アレルギー又は自己免疫に関与する細胞に対する治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物をさらに含むことができる。説明のために、対象となる例示的な免疫モジュレーターは、Ｔ細胞を標的とする他のモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ３、抗ＩＣＯＳ、もしくは抗ＣＤ２８抗体、又は補助細胞を標的とする組換えタンパク質もしくは抗体、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇもしくは抗ＣＤ４０抗体である。

【0143】

本発明は、それを必要としている患者における併用治療レジメン又は追加治療レジメンにおいて活性成分として使用するための、本明細書に定義又は例示されているような抗体もしくはその抗原結合性断片又はキメラ分子にも関する。また企図されるのは、それを必要としている患者における併用治療レジメン又は追加治療レジメンにおける治療活性成分としての本発明の巨大分子、核酸、細胞、又は細胞株の使用である。

【0144】

本発明による巨大分子、核酸、ベクター、細胞、細胞株、医薬組成物、又は本明細書に定義される組成物は、特に、免疫応答によって、とりわけ、メモリーＴ細胞応答によって影響を受ける病理学的状態を治療するためのヒト患者における使用のために提案されている。したがって、本発明者らは、抗体もしくはその抗原結合性断片、本発明によるキメラ分子、医薬組成物、又は本明細書に定義される組成物を、自己免疫又はアレルギー疾患、特に、アレルギー性皮膚障害、腸障害の治療に、又は移植片拒絶反応に、又は白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病（例えば、Ｔ－ＡＬＬ）もしくはリンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫の治療、又は癌疾患、例えば、ＣＤ１２７＋細胞と関連する乳癌、腎臓癌、膀胱癌、肺癌、膵癌の治療に、又はＴ細胞皮膚リンパ腫、例えば、セザリーリンパ腫の治療に、又はＩＬ－７－Ｒ／ＴＳＬＰ経路の機能獲得型突然変異を有する急性リンパ芽球様白血病の治療に使用することを提案した。

【0145】

様々な実施態様において、本発明は、ＣＤ１２７陽性細胞を枯渇させる一方で、ＣＤ１２７陰性細胞を保持するための、本明細書に定義されているような巨大分子の使用に関する。

【0146】

様々な実施態様において、本発明は、ＣＤ１２７陽性細胞の分化及び／又は増殖及び／又は成熟、特に、ＩＬ－７及び／又はＴＳＬＰによって誘導される分化、増殖、又は成熟を妨げる一方で、ＣＤ１２７陰性細胞に対して直接的にはほとんど又は全く影響を及ぼさないための、本明細書に定義されているような巨大分子の使用に関する。

【0147】

特定の実施態様において、本発明は、ＩＬ－７誘導性シグナル伝達を妨害することによって、ナイーブ及びメモリーＴ細胞を消失させ／中和する一方で、Ｔｒｅｇ細胞を保持するための、本明細書に定義されている巨大分子の使用に関する。

【0148】

特定の実施態様において、本発明はまた、それに限らないが、おそらくＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）による及び任意にＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）による抗体の細胞傷害作用の結果として、リンパ球の亜集団、又はＣＤ１２７を発現する他の細胞集団（正常なもしくは病的状態のＴ及びＢリンパ球、ＮＫ細胞、樹状細胞、並びに上皮細胞を含む他の細胞型を含む）を枯渇させるための、本明細書に定義されている巨大分子の使用に関する。

【0149】

上記の実施態様において、企図される使用は、本発明の核酸、ベクター、細胞、細胞株、及び組成物にも適用可能である。

【0150】

「治療」又は「治療的処置」とは、実施される投与工程が、ＩＬ－７経路と関連する、すなわち、ＣＤ１２７陽性細胞の活性化又は増殖と関連する障害（複数可）に罹患している、それを必要としている動物又はヒト患者の臨床状態の改善をもたらすことを意味する。そのような治療は、ＩＬ－７経路に関連する、すなわち、ＣＤ１２７陽性細胞の活性化又は増殖に関連する障害（複数可）と関連する症状を消失させ又は緩和することによって、動物又はヒト患者の臨床状態を改善することを目的とする。好ましい実施態様において、本発明による治療は、健康の回復を可能にする。好ましい実施態様において、該治療は、免疫細胞の成熟の増大、特に、樹状細胞の成熟の増大による望まない負の効果を有しない。

【0151】

本発明は、優勢な寛容原性状態、又はそれとは反対に、免疫応答のレベルの制御及び悪性ＣＤ１２７陽性細胞の破壊が必要とされる場合の寛容の欠如をもたらす、ヒト患者における免疫応答の変化を含む病的状態の治療における巨大分子の使用を含む。

【0152】

本発明は、移植片拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー疾患、呼吸器疾患、慢性ウイルス感染、リンパ腫、白血病、又は固形腫瘍（例えば、乳癌）に起因するものを含む他の癌疾患によって誘導される病状などの病状がＣＤ１２７陽性細胞及びＩＬ－７シグナル伝達経路と関連している場合、並びに樹状細胞の成熟の増大が回避されなければならない場合、これらの病状において使用するのに好適な手段を提供する。

【0153】

特定の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患もしくはアレルギー疾患の治療のための、又は白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病の治療のための、又はリンパ腫の治療のための、又は癌疾患の治療のための、又は慢性ウイルス感染の治療のための、又は炎症性疾患の治療のための、又は呼吸器疾患の治療のための、又は移植に関連する症状の治療のための、ヒト患者における本発明の巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は組成物の使用に関する。

【0154】

特定の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患もしくはアレルギー疾患の治療のための、又は白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病の治療のための、又はリンパ腫の治療のための、又は癌疾患の治療のための、又は慢性ウイルス感染の治療のための、又は炎症性疾患の治療のための、又は呼吸器疾患の治療のための、又は移植に関連する症状の治療のための、ヒト患者における本発明の巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は組成物の投与を含む、治療方法に関する。
本発明のさらなる特徴及び特性は、以下の実施例及び図面から明白であろう。

【図面の簡単な説明】

【0155】

（図面の簡単な説明）

【図1】ＩＬ－７Ｒシグナル伝達の阻害。抗ヒトＩＬ－７Ｒαモノクローナル抗体に用量応答的なＩＬ－７誘導性ｐＳＴＡＴ５＋ Ｔリンパ球の阻害。Ｎ１３Ｂ２（四角）、Ｎ１３Ｅ５（丸）、及びＮ１３Ｋ１２（三角）。ｐＳＴＡＴ５（％）：ＦＡＣＳで測定したときの、リン酸化－ＳＴＡＴ５について陽性である細胞の比率（％）。用量依存的なＳＴＡＴ５リン酸化阻害は３つのクローンについて同様であり、３つとも全て、５０ｎｇ／ｍｌで効率的に（およそ５０％の阻害）及び１００～５００ｎｇ／ｍｌで完全に（＞９５％の阻害）、リン酸化を阻害する。

【図2】Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂによるＩＬ－７Ｒシグナル伝達の阻害。軸は図１と同様である。（Ａ）ＭＤ７０７－３ ｍＡｂ（丸）と比較したときのＮ１３Ｂ２ ｍＡｂに用量応答的なＩＬ－７誘導性ｐＳＴＡＴ５＋ Ｔリンパ球の阻害（四角）。どちらも齧歯類フォーマットである。（Ｂ）０．１ｎｇ／ｍｌ（白抜きの図記号）又は５ｎｇ／ｍｌ（黒塗りの図記号）の組換えヒトＩＬ－７の存在下でＮ１３Ｂ２のヒトＩｇＧ１（四角）及びヒトＩｇＧ４（丸）キメラ形態を用いた（Ａ）と同じ実験。Ｎ１３Ｂ２は、ＳＴＡＴ ５を阻害するのにＭＤ７０７－１３よりも効率的であるが（Ｎ１３Ｂ２については１００ｎｇ／ｍｌで、それ対して、ＭＤ７０７－１３については１０００ｎｇ／ｍＬで、～５０％の阻害）、Ｎ１３Ｂ２の異なるＩｇＧアイソタイプは、同程度の阻害効率を示す。

【図3】（Ａ）ラットＮ１３Ｂ２抗ＣＤ１２７抗体の結合試験。Ｎ１３Ｂ２抗体又はＭＤ７０７－１をＣＤ１２７固定化抗原上に様々な濃度で注入した。Ｒｅｓｐ． ｄｉｆｆ：応答差。時間：秒で示した時間（総持続時間：２０分）。Ｂｌｋ：ブランク（抗体なし）。会合曲線及び解離曲線をＢＩＡｅｖａｌ ４ソフトウェア上の「Ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅ」というモデルで解析した。結果を下の表１に示す。

【表1】

【表2】

【図4】新規の抗体Ｎ１３Ｂ２の抗ＣＤ１２７活性を、組換えｈＣＤ１２７抗原を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。ＯＤ ４５０ｎｍ： ４５０ｎｍでの光学密度。Ａ．Ｎ１３Ｂ２（黒塗りの丸）のＣＤ１２７結合活性を前の抗体世代（ＭＤ７０７－１（白抜きの菱形）、ＭＤ７０７－３（白抜きの三角）、及びＭＤ７０７－６（黒塗りの四角））と比較した。Ｎ１３Ｂ２は、アッセイで最も効率的なバインダーのように見える。Ｂ．異なるＮ１３Ｂ２フォーマット（ラットのＩｇＧ１（丸）又はＩｇＧ４（四角））間のＣＤ１２７活性を比較した。結合活性における有意な差は観察されなかった。

【表3】

【図5】骨髄樹状細胞によるＴＳＬＰ誘導性ＴＡＲＣ（胸腺及び活性化調節ケモカイン、ＣＣＬ１７）産生及びＣＤ８０細胞表面マーカーの発現。なし：刺激なし。ＬＰＳ：リポ多糖による刺激。ＴＳＬＰ：ＴＳＬＰによる刺激。Ａ）ＥＬＩＳＡによる上清中のＴＡＲＣ産生の定量及びＢ）培地のみ、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、又は１５ｎｇ／ｍｌのＴＳＬＰとともに２４時間培養したヒト血液ＣＤ１Ｃ＋樹状細胞のフローサイトメトリーによるＣＤ８０細胞表面発現。データは、３回の独立した実験の平均±標準誤差又は平均（ＳＥＭ）濃度である。

【図6】抗ヒトＣＤ１２７抗体によるＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の阻害。１５ｎｇ／ｍｌのＴＳＬＰ及び様々な濃度の抗ヒトＣＤ１２７抗体：Ｎ１３Ｂ２抗体（丸）、ＭＤ７０７－６（三角）、及び対照としての抗ＴＳＬＰ（Ｘ）とともに２４時間培養したヒト血液ＣＤ１Ｃ＋樹状細胞の上清中のＴＡＲＣ産生のＥＬＩＳＡによる定量。データは、３人の異なる血液ドナーの３回の独立した実験を代表するものである。Ｎ１３Ｂ２はＴＡＲＣ分泌の阻害をごく控えめにしか阻害しないが（６μｇ／ｍＬで～２０％の阻害）、ＭＤ７０７－１３及び抗ＴＳＬＰＲは、より効率的な阻害剤である（それぞれ、～５０％及び～７０％の阻害）。

【図7】樹状細胞成熟のＴＳＬＰ誘導性ＣＤ８０及びＣＤ４０発現マーカーに対する抗ＣＤ１２７抗体の効果。細胞を１５ｎｇ／ｍｌのＴＳＬＰにより２４時間活性化した。抗ＣＤ１２７抗体のＮ１３Ｂ２、ＭＤ７０７－３、及びＭＤ７０７－６を上清に６μｇ／ｍｌで添加した。細胞表面におけるＣＤ８０（Ａ）及びＣＤ４０（Ｂ）発現をＦＡＣＳにより解析した。データは、３回の独立した実験を代表するものであり、対照細胞（培地＝抗体なし、ＴＳＬＰあり）における発現の％で表されている。試験した抗体のうち、Ｎ１３Ｂ２だけが、ＴＳＬＰ処理細胞におけるＣＤ４０及びＣＤ８０の細胞表面発現を増大させない。

【図8】キメラＮ１３Ｂ２（ＩｇＧ１又はｉｇＧ４）抗ヒトＣＤ１２７抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）。エフェクター（Ｅ）として使用されるヒトＮＫ細胞を、標的細胞としてのヒトＣＤ１２７がトランスフェクトされたＢＡＦ／３細胞株（エフェクター１０に対して標的細胞１の比率）とともに及び様々な濃度のキメラＮ１３Ｂ２ ＩｇＧ１（黒塗りの四角）、Ｎ１３Ｂ－ＩｇＧ４（白抜きの四角）、又はキメラＭＤ７０７－３（Ｘ）とともに４時間インキュベートした。比細胞傷害性のパーセンテージを５１Ｃｒ放出により決定した。

【図9】ヒト化免疫不全マウスで化学的に誘導された結腸炎を改善するラットＮ１３Ｂ２抗ＣＤ１２７ ｍＡｂの効力。ＰＢＳ（実線／黒塗りの三角）又はＮ１３Ｂ２抗ＩＬ７Ｒα抗体（破線、白抜きの三角）を注射した後、０日目（直腸内投与したときに重度の結腸炎を誘導する２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）による化学的処理の開始）から、生存（Ａ）及び体重の変化（Ｂ）を毎日モニタリングした。（Ｂ）において、各々の点は、平均体重データ（＋／－ＳＥＭ）を表している； Ｈｕ－ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ群について、ｎ＝６及びＴＮＢＳ群＋抗ＩＬ－７Ｒαについて、ｎ＝６。処理群において、生存は増大し、体重減少は低下している。

【図10】Ｎ１３Ｂ２＿Ｇ１ＭキメラＶＨ鎖及びＶＬ鎖のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。Ｆｃ鎖は小文字で表示され、各配列中の３つのＣＤＲには下線が引かれている。アステリスク（^＊）は、アミノ酸配列中の終止コドンを表す。

【図11】Ｎ１３Ｂ２＿Ｇ４Ｍキメラのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。Ｆｃ鎖は小文字で表示され、各配列中の３つのＣＤＲには下線が引かれている。アステリスク（^＊）は、アミノ酸配列中の終止コドンの位置を表す。

【図12】３つの選択的ヒトＦｃ鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）のアミノ酸配列並びにラットＮ１３Ｂ２抗体（ＩｇＧ１）のＦｃ鎖のアミノ酸配列。

【図13】抗ＣＤ１２７ ＥＬＩＳＡ結合アッセイ：ヒトＣＤ１２７Ｆｃをコーティングし、抗ヒトカッパ抗体を用いて顕示させた。新規の抗体Ｎ１３Ｂ２の抗ＣＤ１２７活性を、組換えｈＣＤ１２７抗原を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。様々なＮ１３Ｂ２抗体フォーマット（ｗｔ（Ｘ）、ＩｇＧ４ヒト化ｈ１（黒塗りの四角）、ｈ２（白抜きの丸）、又はｈ３（黒塗りの三角）抗体）間のＣＤ１２７活性を比較した。ＯＤ：光学密度。

【表4】

【図14】抗ＣＤ１２７抗体によるＰ－ＳＴＡＴ５阻害：Ａ．用量依存的な様式での、及び０．１ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－７の存在下のラットＮ１３Ｂ２ ｗｔ（Ｘ）抗体と比較された、Ｔリンパ球上でのヒト化Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂによるＩＬ７誘導性Ｐ－ＳＴＡＴ５の阻害（Ｎ１３Ｂ２ ｈ１（黒塗りの四角）、ｈ２（白抜きの丸）、及びｈ３（黒塗りの三角）。Ｂ．前の抗体世代の様々な抗ＣＤ１２７抗体を、ＩＬ７依存的Ｐ－ＳＴＡＴ５を阻害するその能力について比較した：ＭＤ７０７ ３（丸）、ＭＤ７０７ ４（三角）、及びＭＤ７０７ １３（四角）。

【表5】

【図15】ラット抗ＣＤ１２７抗体と比べたヒト化抗ＣＤ１２７抗体の安定性アッセイ。抗体濃度を、３７℃で７日後（ラットＮ１３Ｂ２ｗｔ（＋）又はヒト化Ｎ１３Ｂ２ ｈ３（四角））及び－８０℃で７日後（ラットＮ１３Ｂ２ｗｔ（Ｘ）又はヒト化Ｎ１３Ｂ２ ｈ３（三角））並びに４回の凍結／解凍事象後（菱形）にＥＬＩＳＡにより測定した。

【表6】

【表7】

【図16】サイトメトリーによる競合及び内在化アッセイ。ヒト末梢血単核細胞を、いくつかの抗ＣＤ１２７ ｍＡｂとともに、４℃（斜交棒）もしくは３７℃（黒棒）のいずれかで３０分間インキュベートするか、又は３７℃でＩＬ－７なしで３０分間、その後、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－７（灰色の棒）とともに１５分間インキュベートした：（Ａ）１０μｇのクローンＭＤ７０７－５、ＭＤ７０７－１２、もしくはＭＤ７０７－１３、又はキメラＮ１３Ｂ２－Ｇ４；（Ｂ）５０ｎｇのＮ１３Ｂ２、ＨＡＬクローンＨ３Ｌ４もしくは１Ａ１１、又は対照としての培地。その後、細胞を、４℃で、市販の抗ヒトＣＤ１２７ ｍＡｂで染色して、細胞膜レベルでのＩＬ－７受容体アルファ鎖発現を評価した。 ＭＤ７０７－５、ＭＤ７０７－１２、及びＭＤ７０７－１３抗体は、３７℃で、ＩＬ－７あり又はなしで、受容体の内在化を誘導したが、キメラＮ１３Ｂ２－Ｇ４は誘導しなかった。ＨＡＬ抗体は、いずれの条件でもＣＤ１２７細胞表面発現の減少を誘導した。４℃での結果は、１Ａ１１抗体が標識に使用した抗体とわずかに競合する一方、ＨＡＬが強い競合を示し、Ｎ１３Ｂ２が競合を示さないことを示している。３７℃では、細胞表面染色がＨＡＬの存在下で観察されなかったが、１Ａ１１単独でＣＤ１２７の細胞表面発現の強い減少を誘導し、ＩＬ－７と組み合わせたとき、この細胞表面発現は～９０％減少した。対照的に、Ｎ１３Ｂ２は、ＣＤ１２７の細胞表面発現を４℃で低下させず、単独で使用したときにＣＤ１２７の細胞表面発現の減少を誘導せず、ＩＬ－７の存在下で観察される減少を阻害した。

【図17】（Ａ）非ヒト霊長類におけるＮ１３Ｂ２及びＭＤ７０７－１３ ｍＡｂ投与の薬物動態試験及び薬力学試験。ヒヒ（アヌビスヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ））を１０ｍｇ／ｋｇのＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ１（ｎ＝３、黒塗りの四角）、Ｎ１３Ｂ２－ＩｇＧ４（ｎ＝３、黒塗りの丸）、又はＭＤ７０７－１３－ＩｇＧ４（ｎ＝３、白抜きの丸）で静脈内処理した。抗ＣＤ１２７ ｍＡｂの血清濃度をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。（Ｂ）並行して、血液Ｔリンパ球の表面におけるＣＤ１２７の発現をフローサイトメトリーによりモニタリングし、ｍＡｂの注射前に測定されたレベル（破線で示す）に対して正規化した。^＊ｐ＜０．０５。全血漿レベルは、３つ全ての抗体について、経時的に同程度である。ＣＤ１２７の細胞表面発現はＭＤ７０７－１３による処理の～８日後に減少しているが、そのような減少は、試験したＮ１３Ｂ２クローンのいずれでも観察されない。

【図18】ヒヒ（アヌビスヒヒ）を１０ｍｇ／ｋｇのＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ１（ｎ＝３、黒塗りの四角）、Ｎ１３Ｂ２－ＩｇＧ４（ｎ＝３、黒塗りの丸）、又はＭＤ７０７－１３－ＩｇＧ４（ｎ＝３、白抜きの丸）で静脈内処理した。血液及びリンパ節中の調節性Ｔリンパ球（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ２５ｈｉｇｈ Ｆｏｘｐ３＋）の頻度（ＣＤ４陽性Ｔ細胞の％として表す）並びに調節性Ｔリンパ球の絶対カウント数（細胞／ｍＬで表す）を０日目及びｍＡｂの投与から２週間後にモニタリングした。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。３つ全ての抗体が、調節性Ｔ細胞の血液中の総数及び血液とリンパ節の両方における比率を増大させる。

【図19】α４、β７、及びα４／β７インテグリン発現のインビトロ阻害。Ａ．ＦＡＣＳによりアッセイされた、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７あり又はなしでの培養から９日後のα４陽性及びα４／β７陽性ヒトＴ－リンパ球のパーセンテージ。Ｂ．上と同じ。表示された濃度のＮ１３Ｂ２ ｍＡｂを０日目の培養物に添加した。破線は、対照条件（ＩＬ－７及びＮ１３Ｂ２ ｍＡｂなし）でのベースラインレベルを示した。ＩＬ－７誘導性のα４、β７、及びα４／β７インテグリン発現の増大は、インビトロでヒト化Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂにより妨げられる（これは、～２μｇ／ｍＬ抗体で完全に阻害される）。

【図20】α４、β７、及びα４／β７インテグリン発現のインビボ阻害。４０×１０^６個のヒト末梢血単核細胞を放射線照射免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２受容体ガンマ鎖ノックアウトマウス）に腹腔内注射した。ＦＡＣＳにより評価された、対照バッファー（ｎ＝５）又はＮ１３Ｂ２ ｍＡｂ（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）による処理から２週間後の血中β７陽性Ｔリンパ球（左）及びβ７陽性ヒトＴリンパ球の生着（右）のパーセンテージ。^＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ１３Ｂ２は、β７陽性Ｔ細胞の比率、及びβ７陽性Ｔ細胞の生着を有意に低下させる。

【図21】インビボ乾癬モデルのＤＴＨモデルに対するＮ１３Ｂ２抗体の効果。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）ワクチンを接種したヒヒ（アヌビスヒヒ）に２０００（Ａ）又は１０００（Ｂ）ユニットの精製ツベルクリンの皮内注射を投与して、遅延型過敏症応答を誘導し、紅斑の直径を毎日記録した（アステリスク；破線）。１カ月後、動物を１０ｍｇ／ｋｇのＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ１（ｎ＝３、黒塗りの四角）、Ｎ１３Ｂ２－ＩｇＧ４（ｎ＝３、黒塗りの丸）、又はＭＤ７０７－１３－ＩｇＧ４（ｎ＝３、白抜きの丸）で静脈内処理した。ｍＡｂ投与から４時間後、動物に、２０００（Ａ）又は１０００（Ｂ）ユニットの精製ツベルクリンの皮内注射を再投与して、遅延型過敏症応答を誘導し、紅斑の直径を毎日記録した（実線）。Ｎ１３Ｂ２は、２回目の投与後の紅斑の直径により測定したとき、メモリーリンパ球応答を阻害するが、ＭＤ７０７－１３抗体は阻害しない。

【図22】ヒヒ （アヌビスヒヒ）を１０ｍｇ／ｋｇのＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ１（ｎ＝３、黒塗りの四角）、Ｎ１３Ｂ２－ＩｇＧ４（ｎ＝３、黒塗りの丸）、もしくはＭＤ７０７－１３－ＩｇＧ４（ｎ＝３、白抜きの丸）、又は対照バッファー（ｎ＝３、破線）で静脈内処理した。４時間後、動物に、１．５ｍｌの１０％ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の静脈内注射を投与した。比抗ＳＲＢＣ ＩｇＧ力価をＳＲＢＣの投与から１週間後及び２週間後にモニタリングし、０日目のその力価に対して正規化した。^＊ｐ＜０．０５。Ｎ１３Ｂ２は、比ＩｇＧ力価により測定したとき、液性免疫応答を阻害するが、ＭＤ７０７－１３は阻害しない。

【図23】ヒト化Ｎ１３Ｂ２ ＶＨ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ＿ｈ３のタンパク質配列：灰色の配列はＣＤＲであり、下線かつ太字のアミノ酸は突然変異型であり（Ｖ４２Ｉ、Ａ５４Ｓ、Ｄ８２Ｎ、Ｍ１０８Ｌ）、下線の配列は突然変異型ＩｇＧ４配列（Ｓ２２８Ｐ）である。

【図24】ヒト化Ｎ１３Ｂ２ ＶＬ Ｃカッパ＿ｈ３のタンパク質配列：灰色の配列はＣＤＲであり、下線かつ太字のアミノ酸は突然変異型であり（Ｖ５４Ｉ、Ｙ７７Ｆ、Ｆ９３Ｙ＋Ｎ３１Ｑ、Ｓ５９Ｔ）、下線の配列は突然変異型ＩｇＧ４配列（Ｓ２２８Ｐ）である。

【図25】Ｎ１３Ｂ２は、炎症マウスモデルで死を防ぐ：移植片対宿主病をヒト化マウスで誘導した（実施例１３参照）。０日目に５０００万個のヒトＰＢＭＣを注射され、処理を受けなかった（白抜きの四角、ｎ＝１４）又は５ｍｇ／ｋｇのキメラＮ１３Ｂ２の腹腔内注射で週に３回処理された（黒塗りの丸、ｎ＝１９）、生き残ったＮＳＧマウスのパーセンテージ。

【図26】Ｎ１３Ｂ２は、炎症マウスモデルで結腸の炎症を特異的に妨げる（実施例１３参照）。安楽死の時点で（すなわち、２５％体重減少時又は注射から１００日後）、０日目に５０００万個のヒトＰＢＭＣを注射され、５ｍｇ／ｋｇのＮ１３Ｂ２で週に３回処理された（黒）又は処理されなかった（白）、ＮＳＧマウスの各組織における炎症細胞浸潤物を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した１０μｍのスライド上での組織学的検査により解析した。結果を次のように示す：Ａ．結腸、Ｂ．腸、Ｃ．肝臓、及びＤ．肺。データは、群当たり少なくともｎ＝８の平均＋／－ＳＥＭである。

【図27】Ｎ１３Ｂ２抗体によって認識されるＣＤ１２７タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６８７１）上のエピトープドメイン。太字フォントのアミノ酸は、Ｎ１３Ｂ２によって認識される立体構造エピトープを形成する配列に対応し；灰色の背景のアミノ酸はＩＬ－７との相互作用に重要であり；抹消線が引かれているアミノ酸はＣＤ１２７のシグナルペプチドを構成する。

【図28】抗ｈＣＤ１２７抗体を用いたＣＤ１２７／ＩＬ７／ＣＤ１３２複合体の共免疫沈降試験（実施例２１）。レーン：１－ＰＢＬのみ、２－ＰＢＬ＋ＩＬ７、３－ＰＢＬ＋ＩＬ７＋Ｎ１３Ｂ２、４－ＰＢＬ＋ＩＬ７＋ＭＤ７０７－１３、５－ＣＤ１３２－Ｆｃ（７２Ｋｄａ）又はＣＤ－１２７－Ｆｃ（８０ＫＤａ）。抗ｈＣＤ１２７カラム（ＭＤ７０７－９）上での試料の共免疫沈降。溶出物を、（Ａ）ウサギ抗ヒトＣＤ１３２抗体を用いるウェスタンブロットにより解析し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体で顕示させたか、又は（Ｂ）ラット抗ヒトＣＤ１２７抗体を用いるウェスタンブロットにより解析し、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ラット抗体で顕示させた。

【実施例】

【0156】

（実施例）
（実施例１．新規の抗ヒトＣＤ１２７ Ｍａｂの調製及び選択）
ラットを組換えｈＣＤ１２７－Ｉｇ（免疫グロブリンの定常断片と融合したｈＣＤ１２７－Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ；照会番号１０９７５－Ｈ０３Ｈ）で免疫し、モノクローナル抗体を従来法によって得た。使用した免疫プロトコルは、次の通りであった：組換えＣＤ１２７ Ｆｃキメラ（１０９７５－Ｈ０３Ｈ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）を用いて、ＬＯＵ／Ｃ Ｉｇｋ１ａ系統のラットを免疫した。５０マイクログラムのタンパク質を完全フロイントアジュバントに懸濁させ、皮下投与した。２０日後、不完全フロイントアジュバントに懸濁させたタンパク質のリコール注射を行った。別の同様のリコール注射を６０日目に行い、追加免疫注射を、１００マイクログラムのタンパク質を用いて、９０日目に行い、４日後に、脾臓細胞を回収した。

【0157】

ハイブリドーマは、以前に記載されている手順（Ｃｈａｓｓｏｕｘらの文献、１９８８）に従って、脾臓単核細胞を非分泌性かつアザグアニン耐性細胞株のＬＯＵラット免疫細胞腫ＩＲ９８３Ｆと融合させることにより得た。まず、ハイブリドーマを、組換えＣＤ１２７分子（ＣＤ１２７ Ｆｃキメラ； １０９７５－Ｈ０３Ｈ， Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）に結合する分泌モノクローナル抗体の能力によってスクリーニングした。

【0158】

選択後、ハイブリドーマをＤＭＥＭ完全培地中で培養した。上清を限外濾過（Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ， Ｐａｌｌ）により濃縮し、プロテインＧクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ， ＧｅＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で親和性により精製した。溶出は、ｐＨ ２．８の０．１Ｍのグリシン溶出バッファーを用いて行った。得られた精製免疫グロブリンをヒトＣＤ１２７に対する活性ＥＬＩＳＡでアッセイ評価した。

【0159】

分泌された抗体による組換えＣＤ１２７の認識に基づいて選択された第１の選択クローンの中で、２つを、ヒトＴ細胞によって発現されるＣＤ１２７の認識に関して及びＴＳＬＰに対するそのアンタゴニスト特性に関して、フローサイトメトリーによりさらに選択した。

【0160】

抗体を産生し、そのアイソタイプ及びその親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いた表面プラズモン共鳴測定により特徴付けた。

【0161】

（実施例２．ＥＬＩＳＡによって評価される抗－ｈ－ＣＤ１２７ ＭａｂのｒＣＤ１２７認識）
組換えｈＣＤ１２７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ；照会番号１０９７５－Ｈ０８Ｈ）をプラスチック上に固定化し、増加用量のＭａｂを添加して、結合を測定した。インキュベーション及び洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ラットカッパ鎖（ＡｂｄＳｅｒｏｔｅｃ）を添加し、従来法により顕示させた。結合を各抗体について確認した。

【0162】

（実施例３．ＩＬ７シグナル伝達（ｐＳＴＡＴ５）の阻害）
健常ボランティアからフィコール勾配によって採取されたヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、様々な濃度の対象となる抗体を含む無血清培地中、室温で１５分間インキュベートし、その後、０．１又は５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－７（ｒｈＩＬ－７； ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、照会番号ＰＨＰ０４６）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。ｒｈＩＬ－７で処理しなかったＰＢＭＣをバックグラウンドシグナルとして解析し、一方、抗体なしでＩＬ－７処理した細胞を陰性対照として設定した。その後、ＰＢＭＣを素早く冷却し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄して、反応を停止させた。その後、細胞を冷えたＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、照会番号５５４７２２）とともに１５分間インキュベートし、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（Ｂｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２回洗浄し、抗ヒトＣＤ３ ＦＩＴＣ抗体（Ｂｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、照会番号５５７６９４）で氷上で３０分間染色した。その後、ＰＢＭＣをＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで２回洗浄し、ＢＤ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（Ｂｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、照会番号５５８０５０）中で３０分間透過処理した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファー（並びに／又は１％ＢＳＡ及び０．１％アジドを含むＰＢＳ）中で２回洗浄し、抗ヒトｐＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ ６４７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、照会番号６１２５９９）とともに室温で３０分間インキュベートした。試料をＢＤ ＣＡＮＴＯ ＩＩ ＦＡＣＳ装置で解析した。図１及び図２に示すように、Ｎ１３Ｂ２及びそれから誘導されたキメラ抗体（Ｎ１３Ｂ２－Ｇ１及びＮ１３Ｂ２－Ｇ４）は、ＳＴＡＴ５リン酸化の強い阻害剤であり；わずか５０ｎｇ／ｍｌの濃度で５０％を超える阻害、わずか１００ｎｇ／ｍｌの抗体濃度で８０％を超える阻害（０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７の場合）又は９０％を超える阻害（５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７の場合）である。
（実施例４．様々な抗ヒトＩＬ－７Ｒαモノクローナル抗体の半阻害濃度（ＩＣ５０）を表１に示す）

【表8】

【0163】

（実施例５．サイトフルオロメトリーによるＩＬ７Ｒ内在化アッセイ）
内在化アッセイは、Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓらの文献（２０１０）及びＬｕｏらの文献（２０１１）の材料及び方法に詳述されているように、共焦点顕微鏡を用いて実施することができた。ＩＬ－７の非存在でのＣＤ１２７の内在化を観察するために、５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の抗体ｈＮ１３Ｂ２、ＨＡＬクローンＨ３Ｌ４（米国特許第８，６３７，２７号）もしくは１Ａ１１（国際特許出願ＷＯ２０１１０９４２５９号）、又は１０μｇ／ｍｌの最終濃度の抗体ＭＤ７０７－５、ＭＤ７０７－１２、ＭＤ７０７－１３、もしくはＮ１３Ｂ２－Ｇ４を、ヒトＰＢＭＣ（１０００００細胞／ウェル）とともに、無血清培地（ＴｅｘＭＡＣＳ， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中、４℃又は３７℃で３０分間インキュベートした。ＩＬ－７の非存在下でのＣＤ１２７の内在化を観察するために、同じプレインキュベーション条件を抗体とともに３７℃で用い、その後、細胞を０．１ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ７（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、照会番号ＰＨＰ０４６）で、３７℃で１５分間刺激した。反応を４℃で停止させ、細胞をＰＢＳ－１％ＢＳＡ－０．１％アジドで３回洗浄した後、ＰＢＳ－１％ＢＳＡ－０．１％アジドに１／１０で希釈したＰＥ標識抗ＣＤ１２７（クローンｈＩＬ７Ｒ－Ｍ２１， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、照会番号５５７９３８）で染色し、４℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＣａｎｔｏＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるサイトフルオロメトリーにより解析した。図１６に示す結果は、３回の独立した実験を代表するものである。

【0164】

この方法は、スクリーニングを実施するために、及びＩＬ７依存的又はＩＬ７非依存的ＣＤ１２７内在化を阻止する抗体を選択するために、９６ウェルプレートで容易に適応可能である。

【0165】

（実施例６．抗ＣＤ１２７抗体親和性試験）
抗ｈＣＤ１２７抗体の親和性をＢｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴により測定した。

【0166】

ＣＭ５チップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＮＨＳ／ＥＤＣ混合物の注入により７分間活性化した。ＣＤ－１２７Ｆｃ（５００μｇ／ｍＬ）を５ｍＭマレイン酸バッファーｐＨ６．２に希釈し、スクシンイミドエステル残基に３００ＲＵのフッキング信号まで注入した。遊離の反応性残基を１ＭエタノールアミンｐＨ８．５の注入により不活化した。抗体を固定化されたＣＤ１２７の上に結果の節で規定されている濃度範囲で注入した。注入速度は４０μＬ／分に設定し、会合を３分間及び解離を１０分間測定した。各解析サイクルの間、５Ｍ ＭｇＣｌ２の溶液を６０秒間注入することにより、チップを再生した。

【0167】

得られたセンサーグラムをＢＩＡｅｖａｌ ４ソフトウェア上の「Ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅ」というモデルで解析した。

【0168】

図３及びその中の表２に示したように、ラット由来Ｎ１３Ｂ２及びキメラ化Ｎ１３Ｂ２は、ＣＤ１２７に対する高い親和性を示し、ＫＤは、４．９Ｅ－１１Ｍ～８．Ｅ－１１Ｍ（ラット由来Ｎ１３Ｂ２）、３．７７．Ｅ－１０（Ｎ１３Ｂ２－Ｇ１）、及び１．７０．Ｅ－１０（Ｎ１３Ｂ２－Ｇ４）の範囲であった。ラット由来ＭＤ７０７－１抗体は、ＣＤ１２７に対してラット由来Ｎ１３Ｂ２よりも低い親和性を示した。

【0169】

（実施例７．抗ＣＤ１２７抗体結合活性）
サンドイッチＥＬＩＳＡのために、ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体を１．２μｇ／ｍｌでＰ９６－プレートにコーティングし、精製抗体を添加して、標準範囲の関数で濃度を測定した。インキュベーション及び洗浄の後、マウス抗ヒト軽鎖、カッパ特異的（Ａｂｃａｍ、照会番号ａｂ７９１１５又はＥｆｆｉｍｕｎｅ、クローンＮａＭ７６－５Ｆ３）＋ペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、照会番号７１５－０３６－１５１）抗体を添加し、従来法により顕示させた。

【0170】

抗ｈＣＤ１２７抗体の結合活性をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により評価した。ＥＬＩＳＡアッセイのために、組換えｈＣＤ１２７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ；照会番号１０９７５－Ｈ０８Ｈ）をプラスチック上に１μｇ／ｍｌで固定化し、精製抗体を添加して、結合を測定した。インキュベーション及び洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ラットカッパ鎖（ＡｂｄＳｅｒｏｔｅｃ）を添加し、従来法により顕示させた。

【0171】

図４及び表３に示したように、Ｎ１３Ｂ２抗体のＥＬＩＳＡによって測定したときの結合活性は高く、ラットＮ１３Ｂ２抗ｈＣＤ１２７抗体については、ＥＤ５０＝６５．６ｎｇ／ｍＬ（ＥＤ５０＜７５ｎｇ／ｍｌ及びＥＤ５０＜１００ｎｇ／ｍｌ）であり、Ｎ１３Ｂ２から誘導される２つのキメラ抗体（ｃＮ１３Ｂ２－Ｇ１及びｃＮ１３Ｂ２－Ｇ４）については、１２．０ｎｇ／ｍｌ及び１２．６ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０（ＥＤ５０＜１５ｎｇ／ｍｌ）である。

【0172】

（実施例８．安定性アッセイ）
ヒト化及びキメラ精製Ｎ１３Ｂ２－Ｇ１を３７℃又は－８０℃で７日間インキュベートした。２つのアッセイ：ＥＬＩＳＡアッセイによる抗ＣＤ１２７の結合及びゲル濾過による凝集体の形成を用いて、抗体の安定性を測定した。活性ＥＬＩＳＡアッセイのために、組換えｈＣＤ１２７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ；照会番号１０９７５－Ｈ０８Ｈ）をプラスチック上に１μｇ／ｍｌで固定化し、上清の希釈物を添加して、結合を測定した。インキュベーション及び洗浄の後、マウス抗ヒト軽鎖（カッパ特異的）＋ペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウス抗体を添加し、従来法により顕示させた。凝集体形成の解析のために、試料をゲル濾過クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００， １０／３００ＧＬ， ＧｅＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で解析して、試料由来の凝集体と単量体を分離し、評価した。

【0173】

（実施例９．成熟樹状細胞マーカーＣＤ８０及びＣＤ４０のＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生及び発現）
骨髄樹状細胞（ＤＣ）を、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ－１）＋樹状細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、健常ボランティア（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ， Ｎａｎｔｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）の血液から単離した。骨髄樹状細胞を、１０％胎仔ウシ血清、１％ピルビン酸塩、１％Ｈｅｐｅｓ、１％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中で培養した。細胞を、ＴＳＬＰ（１５ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、又は培養培地のみの存在下、様々な濃度のラット抗ヒトＣＤ１２７抗体を添加して、平らな９６ウェルプレートに、５．１０４細胞／ウェルで播種した。培養から２４時間後、細胞を、成熟のＣＤ８０細胞表面マーカー（抗ＣＤ８０－Ｖ４５０（ＢＤ＃５６０４４２））について、フローサイトメトリーにより解析し、上清を回収し、ＴＡＲＣ産生についてＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄシステム， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＵＳＡ）により解析した。

【0174】

抗体の非存在下、又は１μｇ／ｍｌもしくは６μｇ／ｍｌのＮ１３Ｂ２もしくはＭＤ７０７－６もしくは市販の抗ＴＳＬＰＲ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、照会番号ＡＦ９８１）の存在下における上記のようなＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を測定することにより、該産生の阻害を評価した。図６に示したように、Ｎ１３Ｂ２は、ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生を、わずか１μｇ／ｍＬの濃度で２５％を超えて、すなわち、この濃度でＭＤ７０７－６と同じぐらい効率的に阻害した。

【0175】

抗体の非存在下（この条件の場合、発現は１００％で正規化される）、又は６μｇ／ｍｌのＮ１３Ｂ２、ＭＤ７０７－３、もしくはＭＤ７０７－６抗体の存在下で、上記のようなＣＤ４０及びＣＤ８０細胞表面マーカーのＴＳＬＰ誘導性発現を測定することにより、該発現の阻害を評価した（ＣＤ４０については、抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製の抗ＣＤ４０－ＦＩＴＣ、照会番号５５５５８８）を、上でＣＤ８０について記載されている条件と同様の条件で使用した）。図７に示したように、ＭＤ７０７－３とＭＤ７０７－６は両方とも、ＣＤ４０及びＣＤ８０発現の増大を誘導したが、ＭＤ７０７－３は、ＳＴＡＴ５活性化の優れた阻害剤かつＣＤ１２７の優れたバインダーであり（図２及び図４）、ＭＤ７０７－６は、ＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の強い阻害剤である（図６）。この増大は、ＣＤ８０については、少なくとも２０％、ＣＤ４０については、５０％であった。対照的に、本発明の抗体Ｎ１３Ｂ２は、ＴＳＬＰ誘導性のＣＤ４０発現もＣＤ８０発現も増大させなかった。その代わりに、該発現は、ＴＳＬＰのみの存在下よりもＴＳＬＰと抗体の存在下で低かった。

【0176】

（実施例１０．抗ヒトＣＤ１２７ Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））
ＡＤＣＣとは、標的細胞上に発現するエピトープに対する抗体の結合、並びにその後の、主にグランザイム／パーフォリン系機構による標的細胞の死滅をもたらす、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター免疫細胞（本質的にＮＫ細胞及び活性化リンパ球）のＦｃ依存性動員を指す。

【0177】

エフェクター細胞は、磁気ビーズ（ＮＫ単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｕｔｏＭＡＣＳ細胞選別装置を用いた陰性選択によって末梢血単核細胞から単離された新鮮な初代ヒトＮＫ細胞であった。ＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）， １００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０，１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２（Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。標的細胞（ヒトＣＤ１２７がトランスフェクトされたＢＡＦ／３細胞株（Ｐａｒｋらの文献、２０００））を、１００μＣｉ（３．７ＭＢｑ）の５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、３７℃で１時間標識し、培養培地で５回洗浄した。標的細胞を希釈抗体又は添加剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）（培養培地）とともに、室温で１５分間インキュベートし、１００００個の細胞を９６ウェルＵ底プレートに入れた。エフェクターＴ細胞を、１０：１の細胞比（最終容量：２００μｌ）で、３７℃で４時間のインキュベーションの期間、添加した。その後、合計２５μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で計数した。

【0178】

ラット起源のＭＤ７０７－３ ＭａｂとキメラＮ１３Ｂ２－Ｇ１ Ｍａｂ（したがって、ＩｇＧ１型のＦｃドメインを有する）はどちらも、ＡＤＣＣを誘発した。キメラＮ１３Ｂ２－Ｇ４（ＩｇＧ４型のＦｃドメインを有する）はＡＤＣＣ活性を示さず、陰性対照として使用された。興味深いことに、親和性と結合とＡＤＣＣ特性の間に直接の相関関係はなく、ＡＤＣＣ特性を結合解析から予測することができないことを示している。

【0179】

（実施例１１．抗ヒトＣＤ１２７ Ｍａｂのヌクレオチド及びアミノ酸配列）
Ｎ１３Ｂ２クローンのＶＨ領域及びＶＬ領域を、ＲＡＣＥ ＰＣＲ技術を用いてシークエンシングした。簡潔に述べると、全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、得られたｃＤＮＡを、ｄＡＴＰ及びターミナルトランスフェラーゼ酵素を用いて、分子の３′末端でポリアデニル化させた。１回目の３５サイクルのＰＣＲ反応は、オリゴｄＴアンカープライマー及びＨｅｒｃｕｌｅａｓｅ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。２回目の３５サイクルのＰＣＲは、ネステッドＰＣＲアンカープライマーを用いて行った。その後、得られたＰＣＲ産物を大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）内でＴＡクローニングし、アンピシリンで選択した後、得られたコロニーを制限酵素プロファイリングによってスクリーニングし、挿入されたｃＤＮＡをシークエンシングした。

【0180】

（実施例１２．ヒト化）
ラットＮ１３Ｂ２モノクローナル抗体のヒト化は、標準的なＣＤＲ移植技術を用いて達成した。この方法の原理は、ヒトでの抗体免疫原性を低下させるだけでなく、ＣＤＲ移植された分子の生物物理学的特性を改善することも目的として、ヒト抗体がラットモノクローナル抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むように、ヒト抗体を作り直すことである。

【0181】

ＣＤＲ移植によるヒト化には、もとのラット抗体由来の抗原結合残基がヒト化バージョンで保持されていることが必要となる。「バーニア」残基と呼ばれるＣＤＲに隣接する残基は、ＣＤＲ立体構造に影響を及ぼすこと及び抗原認識を微調整することが見出された。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）は、ＣＤＲ立体構造を「標準」残基によって分離した。該残基の中にはＣＤＲ自体の内部に位置するものもあれば、フレームワーク領域中に位置するものもある。それゆえ、これらの「バーニア」残基及び「標準」残基の同定は、極めて重要な工程である。使用したプロトコルは、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫのＧｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ及びその共同研究者ら（Ｐａｕｓ及びＷｉｎｔｅｒの文献、２００６）によって開拓された手法に基づくものであり、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲ残基を使用している。

【0182】

ラットＮ１３Ｂ２ ＣＤＲ領域が移植されるヒトフレームワークアクセプター領域の選択は、ラットＮ１３Ｂ２のＶＨ及びＶＬ配列をインプットとするＩｇＢＬＡＳＴ－免疫グロブリン可変領域配列の解析を容易にするためにＮＣＢＩで開発されたツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ； Ｙｅらの文献、２０１３）を用いて、ＩＭＧＴラット及びヒトＶ遺伝子データベースを検索することにより達成した。それに加えて、ここで適用される戦略は、タンパク質及びｃＤＮＡ由来配列中に見られる体細胞超突然変異を含まない天然のヒト配列であるヒト生殖系列配列を使用する。ラットＶＬ及びＶＨ配列に最もよく似ている生殖系列遺伝子を通常選択した。ヒト生殖系列フレームワークアクセプターのＶＨ領域及びＶＬ領域をもとのＮ１３Ｂ２のＶＨ及びＶＬ抗体配列アラインメントにより、以下の基準に基づいて同定した：１．Ｋａｂａｔにより定義されたフレームワーク及びＣＤＲにわたる配列同一性、２．同一かつ互換性のある鎖間接触面残基、３．もとのＣＤＲ標準立体構造及びバーニア残基を有する支持ループ。

【0183】

結合活性と生物活性を維持している最も優れたものを選ぶために、ヒト化のいくつかの異なる配列をＮ１３Ｂ２について試験した。Ｎ１３Ｂ２のヒト化変異体については、Ｎ１３Ｂ２抗体のヒト化重鎖（ＶＨ）の可変配列を、ＥｃｏＲＶにより、ｈＩｇＧ１のＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含むｐＦｕｓｅＣＨＩｇ－ｈＧ１ｅ４発現プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅ）にクローニングし、ＡＤＣＣを増大させるためにＥ３３３Ａで突然変異させた。Ｎ１３Ｂ２抗体のヒト化軽鎖（ＶＬ）の可変配列を、ＢｓｉＷＩにより、ヒトＣＬカッパを含むｐＦｕｓｅ２ＣＬＩｇ－ｈｋ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅ）にクローニングした。

【0184】

ＣＯＳ細胞で、本発明者らは、リポフェクトアミン法により、ＶＨ－ｈＦｃＧ１を含むプラスミドを、ＶＬ－ＣＬｋを含むプラスミドとともに共トランスフェクトした。４８～７２時間のインキュベーションの後、上清を回収し、ｐＨ ２．８の０．１Ｍのグリシン溶出バッファーを用いるプロテインＧクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ， ＧｅＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で親和性により精製した。精製抗体をＰＢＳ中で透析し、濃縮した。これらをサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量し、ＣＤ１２７抗原に対する活性アッセイで試験した。

【0185】

（実施例１３．様々なインビボ炎症性疾患モデルでのＩＬ－７に対する抗ＩＬ７Ｒα抗体の試験）
ヒト化ＮＳＧマウスでの結腸炎の誘導におけるアンタゴニスト抗体の効果を調べることを目的として、本発明者らは、測定可能な効果を示してきたＴＮＢＳモデルで一連の実験を行った。ＴＮＢＳ（２，４，６，トリニトロベンゼンスルホン酸）などのハプテンの使用により、免疫モデルを模倣するものを誘導することが可能になる（Ｎａｎｃｅｙらの文献、２００８）。結腸炎は、０日目に、エタノールに溶解したＴＮＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｌ′Ｉｓｌｅ ｄ′Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅ， Ｆｒａｎｃｅ）を４匹のヒト化マウスに直腸内投与することにより、マウスで誘導される。はじめに、ガス混合物の吸入により、マウスに麻酔をかける。７日目に、これらの動物をいくつかの試験用にＣＯ２中毒による麻酔の下で屠殺した（データは示さない）。一部の動物は、その臨床スコアが悪かったため、７日目よりも前に屠殺した。

【0186】

それゆえ、２つの新しいマウス群を、ＴＮＢＳ処理の前日から始めて２日毎に、ＰＢＳか又は２１０μＬの０．７ｍｇ／ｍＬのＮ１３Ｂ２ 抗ＩＬ７Ｒαの注射液かのいずれかで処理した。このモデルの開発において行われた解析と同様の解析を行った。

【0187】

その後、本発明者らは、Ｎ１３Ｂ２抗体の効力をヒト化移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）マウスモデルで試験した。このモデルは、広範囲の炎症性疾患を模倣する。いくつかの７～１２週齢のＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγ－／－（ＮＳＧ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｌ′ａｒｂｒｅｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）に放射線照射し（３Ｇｙ）、Ｐｏｉｒｉｅｒらの文献（２０１２）に以前に記載されたように、健常ドナー由来の５０００万個のヒトＰＢＭＣを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入した。その後、動物を無菌状態で維持し、体重の発達及び臨床評価について、週に３回モニタリングした。対照群は、細胞の注入後、未処理のまま放置し、処理群は、０日目から、週に３回、５ｍｇ／ＫｇのキメラＮ１３Ｂ２ ｍＡｂのｉ．ｐ注射を受けた。体重が２０％減少したとき、マウスにＧＶＨＤの診断を与えた。体重が２５％を超えて減少したことが分かった動物、及び０日目から１００日後に生存している動物は安楽死させた。安楽死の後、結腸、腸、肝臓、及び肺の組織を組織学的解析用に液体窒素及びＴｉｓｓｕ－ｔｅｋ中で凍結させた。これらの組織由来の凍結切片（１０μｍ）を室温で１時間風乾させた後、室温で１０分間アセトン固定し、その後、ヘマトキシリン及びエオシン溶液で染色した。結果を図２５及び図２６に示す。

【0188】

（実施例１４．様々な臨床パラメータの解析）
生存（図９Ａ）：本発明者らは、化学的処理及び抗ＩＬ７Ｒα抗体の使用による生存率を評価した。生存のパーセンテージは、Ｈｕ－ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ群よりもＨｕ－ＴＮＢＳ＋ＩＬ７Ｒα群にとって重要である傾向にある（図９Ａ）。実際、本発明者らは、Ｈｕ－ＴＮＢＳ群＋ＩＬ７Ｒαのマウスのうちの１００％が最大５日間生存することを観察したが、Ｈｕ－ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ群では、３匹の動物をＪ５よりも前に安楽死させなければならなかった。

【0189】

体重（図９Ｂ）：０日目から５％ＴＮＢＳ／５０％エタノールを直腸内注射するＴＮＢＳ処理群で、本発明者らは、両方の群について最大２０％の体重減少を観察した。しかしながら、Ｈｕ－ＴＮＢＳ＋ＩＬ７Ｒα群では、動物はＪ３から体重が増え、一方、Ｈｕ－ＴＮＢＳ＋ＰＢＳ群では、体重減少が続いた（図９Ｂ）。これらのマウスは、生物学的データを収集するために屠殺しなければならず、より長期のプロトコルであれば、体重の再増加が確認されたであろうということに留意することが重要である。

【0190】

生存（図２５）：本発明者らは、ヒトＰＢＭＣの注射（ＧｖＨＤ発症）及び抗ＩＬ７Ｒα抗体Ｎ１３Ｂ２の使用による生存率を評価した。生存している動物の割合は、動物を抗体で処理したとき、対照動物（６０日後の対照動物の死亡率は１００％）よりも３０％高い。この結果は、Ｎ１３Ｂ２抗体がＧｖＨＤ及び死を防御することを示している。

【0191】

組織浸潤物（図２６）：処理済又は未処理の死亡動物及び生存（ただし、安楽死させた）動物由来の結腸、腸、肝臓、及び肺を、それらの炎症細胞浸潤率について組織学的に解析した（組織学的スコアを決定した）。本発明者らは、Ｎ１３Ｂ２で処理した動物の結腸が対照よりも少ない細胞浸潤物を含むことを観察した。腸、肝臓、及び肺では、両方の条件の間で違いが観察されなかった。

【0192】

Ｎ１３Ｂ２で処理した動物は、対照と比較して３０％の生存率を示した。炎症を特徴付ける細胞浸潤物は、腸、肝臓、及び肺組織における処理によっては修飾されず、この炎症モデルでは、Ｎ１３Ｂ２が、これらの組織における炎症を防御しないことを示している。しかしながら、Ｎ１３Ｂ２は、結腸における細胞浸潤物の５０％減少を誘導した。この効果は、図１９及び２０に示されているようなα４β７インテグリン発現に対するＮ１３Ｂ２抗体の活性と相関している可能性がある。実際、α４β７インテグリンは、活性化リンパ球の腸へのホーミングにおいて重要な役割を果たすことが知られている。したがって、Ｎ１３Ｂ２抗体によって誘導されるインテグリン発現の減少は、結腸で観察される細胞浸潤物の減少に関与している可能性がある（図２６）。他の組織における防御の外見上の欠如は、ここで使用したモデルに特有のものである可能性があり、抗体の防御的効果が結腸に限定されるという結論を導くものではないであろうということが強調されるべきである。特に、処理した動物のはるかにより高い生存は、抗体の防御的効果が動物の全身状態に対して強いプラスの影響を及ぼすことを示している。

【0193】

（実施例１５．非内在化ＣＤ１２７抗体のインビボ効率）
（動物）
ヒヒ（フランス・ルセのＣＮＲＳ霊長類学センターから得たアヌビスヒヒ）は、ツベルクリン皮膚試験を含む全ての検疫試験について陰性であった。フランス国立保健医学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ Ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）の施設倫理ガイドラインの勧告に従って、動物を本発明者らの実験室の巨大動物施設で飼育した。実験は全て、Ｚｏｌｅｔｉｌ（Ｖｉｒｂａｃ， Ｃａｒｒｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）による全身麻酔下で行われた。薬物動態試験及び薬力学試験を、ＤＴＨ実験において、１０ｍｇ／ｋｇのＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ１又はＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ４又はＭＤ７０７－１３－ＩｇＧ４のいずれかの静脈内ボーラスを受けている５匹のヒヒに対して行った。

【0194】

（ＢＣＧワクチン接種及びＤＴＨアッセイ）
Ｐｏｉｒｉｅｒら（Ｐｏｉｒｉｅｒらの文献、２０１１）に準拠して、ＤＴＨ皮膚試験の４週間前と２週間前に、ヒヒの肢の上部領域に、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン（０・１ｍｌ； ２～８ ￥１０５ ＵＦＳ； Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ ＭＳＤ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）で２回皮内（ｉ．ｄ．）免疫した。ＤＴＨ皮膚試験前の抗原特異的なＴ細胞免疫を調べるために、免疫の達成を、製造元の指示に従って、新たに単離されたＰＢＭＣに対するインターフェロン（ＩＦＮ）－ｇ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ（非ヒト霊長類ＩＦＮ－ｇ ＥＬＩＳＰＯＴキット； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡ）により確認した。皮内反応（ＩＤＲ）を、動物の右背中の皮膚で、０．１ｍｌの２つの用量（１０００ＵＩ又は２０００ＵＩ）のツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ； Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）の反復皮内注射により実施した。生理食塩水（０．１ｍｌ）を陰性対照として使用した。注射部位での皮膚応答をノギスを用いて測定した。各々の硬結性紅斑の直径を、３日目から８日目まで、２人の観察者が測定し、直径が＞４ｍｍの場合に陽性と見なした。読取りの平均を記録した。ＤＴＨ又は対照（生理食塩水）部位由来の皮膚生検を４日目に１回２連で行い、免疫組織化学的解析用にＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ， Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ ｄ′Ａｓｃｑ， Ｆｒａｎｃｅ）中に入れた。２回目のＩＤＲを３週間のウォッシュアウト期間の後に行い、動物は、この２回目のＰＰＤ投与の１日前に、１０ｍｇ／ｋｇのキメラＣＤ１２７抗体（Ｎ１３Ｂ２－ＩｇＧ１又はＮ１３Ｂ２－ＩｇＧ４又はＭＤ７０７－１３－ＩｇＧ４）のいずれかの１回のｉ．ｖ．注射を受けた。３回目のＩＤＲをさらに３～６週間のウォッシュアウト期間の後に行い、動物を未処理のまま放置した。場合によっては、４回目のＩＤＲをもう３カ月のウォッシュアウト期間の後に行い、動物を同じく未処理のまま放置した。

【0195】

（実施例１６．マウスモデルでのインビトロ及びインビボにおけるＴ細胞表面でのα４β７発現：）
Ｔ細胞表面でのＩＬ７誘導性α４β７発現を測定するために、ヒトＴ－リンパ球を、３７℃で９日間、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、照会番号ＰＨＰ０４６）で刺激した。反応を４℃で停止させ、洗浄した後、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５標識抗α４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６３６４４クローン９Ｆ１０）及びＰＥ標識抗β７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＩＢ５０４）で染色した。α４インテグリンの陽性細胞、その後、β７陽性細胞をフローサイトメトリーにより測定した。Ｎ１３Ｂ２ヒト化抗体を、０日目に、細胞培養物に、０．０１～２０ｕｇ／ｍｌの様々な濃度で添加した。

【0196】

インビボで、４０×１０^６個のヒト末梢血単核細胞を放射線照射免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２受容体ガンマ鎖ノックアウトマウス）に腹腔内注射した。対照バッファー（ｎ＝５）又はＮ１３Ｂ２ ｍＡｂ（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）で処理してから２週間後、血液中のβ７陽性Ｔリンパ球のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定し、β７陽性ヒトＴリンパ球の生着をフローサイトメトリーにより測定した。この生着は、特異的抗体（ＢＤ製のＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４５、照会番号５７７４８及びＢＤ製のＰｅｒＣＰＣｙ５．５抗マウスＣＤ４５、照会番号５５０９９４）を用いて、ヒトＣＤ４５陽性細胞をマウスＣＤ４５陽性細胞と識別することによってフローサイトメトリーにより測定し、その後、ヒトβ７陽性細胞を解析した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＩＢ５０４）。

【0197】

（実施例１７．ペプチドマイクロアレイを用いた抗体プロファイリング）
ｐｅｐｔｉｄｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｅｐＳｔａｒ（商標）ペプチドマイクロアレイは、ガラス表面に化学選択的かつ共有結合的に固定化されている、抗原又は他の源に由来する精製合成ペプチドを含む。立体障害によって生じる偽陰性を回避するために、最適化された親水性リンカー部分がガラス表面と抗原由来ペプチド配列の間に挿入されている。技術的な理由で、全てのペプチドがＣ－末端グリシンを含む。試料のプロファイリング実験を５２個のペプチドからなるペプチドライブラリーに対して行った。ペプチドの完全なリストを下に示す：

【表9】

【0198】

合計９つの試料を、マルチウェルフォーマットを用いて、マイクロアレイスライド上でインキュベートした。Ｎ１３Ｂ２抗体及び他の試料について、４つの異なる濃度を適用した（１０、１、０．１、及び０．０１μｇ／ｍｌ）。１つの陰性対照インキュベーション（２次抗体のみ）を並行して実施した。アッセイ対照としての役割を果たすために、ヒト及びマウスＩｇＧタンパク質を各ペプチドセットと並べて共固定化した。全てのインキュベーションを２つのスライドを用いて並行して実施した。蛍光標識検出抗体のみを適用してペプチドに対する偽陽性結合を評価することにより、各スライド上の２つのペプチドミニアレイを対照インキュベーションとして用いた。スライドを洗浄し、乾燥させた後、それらを６３５ｎｍで高解像度レーザースキャナーでスキャンして、蛍光強度の画像を取得した。これらの画像を定量して、各ペプチドの平均ピクセル値を得た。１μｇ／ｍｌのＣｙ５で標識した２次抗体の抗ラットＩｇＧ（ＪＩＲ ２１２－１７５－０８２）。バッファー及び溶液。使用したバッファーは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＪＰＴ）を含むＴＢＳ－バッファーとアッセイバッファーＴ２０（Ｐｉｅｒｃｅ， ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ ＴＢＳ Ｔ２０， ＃３７５３６）とであった。獲得及び解析は、ペプチドマイクロアレイ（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ；バッチ＃２６６８）、マルチウェルインキュベーションチャンバー、Ａｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ Ｓｃａｎｎｅｒ ４２００ＡＬ、スポット認識ソフトウェアＧｅｎｅＰｉｘ、及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ， Ｒを用いて行った。

【0199】

（実施例１８．質量分析によるエピトープマッピング）
質量分析を用いて、立体構造エピトープを同定した。エピトープのシークエンシングは、ＭＡＬＤＩ質量分析計を用いて行った。この装置は、８００～４０００Ｄａのペプチド配列を容認する。対象となるタンパク質の消化により、タンパク質を小さい断片（潜在的エピトープ）に切断することが可能になる。理想的には、消化酵素は、エピトープの境界のなるべく近くで切断しなければならない。消化酵素の選択は、組換えタンパク質の配列中の酵素切断頻度に従って行われるべきである。２回目の消化は、１回目の消化の最後に得られたエピトープのサイズを低下させるために検討される。選択される酵素によって、プロファイルは大きく異なる。配列上に消化物が最もよく分布している酵素は、キモトリプシンである。適切な切断頻度を有し、かつ対象となる配列上で十分に分布している第２の酵素は、Ｇｌｕ Ｃである。

【0200】

エピトープは立体構造的であるので、親和性クロマトグラフィーにおける複合体の消化が優先される。対象となる配列の同定は、抗原－抗体複合体の形成による酵素消化に対するエピトープの保護に基づく。親和性クロマトグラフィー及び消化を経た後、エピトープの断片を溶出させ、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ Ｂｒｕｋｅｒ）によりシークエンシングする。対象となるタンパク質の３Ｄ構造は利用可能であり、これを得られた結果と比較する。

【0201】

Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６８７１［２１－２３９］（配列番号１１４）：は、ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ）インターロイキン－７受容体サブユニットアルファのトポロジカルドメイン（Topological domain）に対応する：

【化1】

【0202】

コンピュータ上での、ＣＤ１２７消化酵素の選択（配列番号１１４に対応する配列中の上記の下線のアミノ酸を参照されたい）：キモトリプシンを消化酵素として選んだ。切断部位（太線）、ペプチド数、切断の頻度が好適である。Ｇｌｕ－Ｃ酵素を第２の消化酵素として選んだ。得られる８００～４０００Ｄａの間に含まれる重量のペプチドの数が好適である。Ｇｌｕ－Ｃ切断の頻度及び切断部位の場所（細線）が好適である。使用した手順は、従来的かつ当業者に周知であり、Ｓｕｃｋａｕらの文献（１９９０）及びＰａｐａｃらの文献（１９９４）に記載されている。

【0203】

材料及び試薬：質量分析ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＩＩ ｄｅ Ｂｒｕｋｅｒ； Ｈｉ－ｔｒａｐ ＮＨＳカラム（照会番号：１７－０７１６－０１－ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；キモトリプシン（照会番号：１１４１８４６７００１－Ｒｏｃｈｅ）； Ｇｌｕ Ｃ（照会番号：１１４２０３９９００１－Ｒｏｃｈｅ）； Ｚｉｐ／ＴＩＰ Ｃ１８（照会番号：ＺＴＣ１８Ｓ０９６－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；重炭酸アンモニウム（照会番号：０９８３０－Ｓｉｇｍａ）；グリシン（照会番号：Ｇ７１２６－Ｓｉｇｍａ）； ＮａＣｌ（照会番号：２７８００．３６０－ＶＷＲ）。

【0204】

フェーズ１：溶液中での遊離タンパク質及び抗体の消化。室温又は３７℃で１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、及び一晩のキモトリプシン又はＧｌｕ Ｃによる遊離抗原及び抗体の溶液中消化。消化ペプチドの分析は、消化ペプチドの質量分析（ＭＳ）により行った。これらの実験により、酵素消化の好適な条件（時間及び温度）を確立することが可能になる。目的は、抗原を十分に消化すると同時に、抗体の構造にはなるべく小さい影響しか及ぼさないことである。最適な条件は：キモトリプシン消化：室温で１時間； Ｇｌｕ－Ｃ 消化：３７℃で一晩であることが明らかにされた。抗原及び抗体の各消化物を質量分析ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦにより分析した。

【0205】

フェーズ２：全固定Ａｃ＋全抗原の複合体の全消化。抗ＣＤ１２７モノクローナル抗体Ｎ１３Ｂ２－Ｇ１（バッチ２１０４１５）のカップリングを標準的な手順に従ってＨｉ－Ｔｒａｐ ＮＨＳカラム上で行った。カラム上での抗原免疫捕捉を１時間行い、抗原－抗体複合体の形成を可能にした。４本のカラムＨｉ－Ｔｒａｐ ＮＨＳ上でのＮ１３Ｂ２－Ｇ１抗体カップリング効率は、次の通りであった：８４％、８４％、８３％、及び８３％。一貫性のある、同一のカップリング収率が得られた。

【0206】

この複合体の消化を、１／５０、すなわち、５０ｍｇの抗体に１ｍｇの酵素の比率で、上述の対照により決定された温度及び期間で行った。その後、カラムを洗浄バッファー（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム）で洗浄して、未結合の抗原ペプチドを除去し、回収する。緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－２Ｍ ＮａＣｌ）中での洗浄工程も行って、非特異的ペプチドを除去する。洗浄後、溶出を溶出溶媒（５０ｍＭグリシンｐＨ ２）で行って、特異的に抽出し、（エピトープに対応すると予測される）特異的に結合したペプチドを回収する。

【0207】

ＭＡＬＤＩ分析：洗浄画分及び溶出画分をＣ１８マトリクス上での疎水性クロマトグラフィーにより濃縮する。その後、これらを質量分析ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦにより分析する。ＭＳ分析は、ペプチドの質量を正確に測定することができ、実験的質量とコンピュータ上での遊離抗原の消化によって得られるペプチドの理論上の質量との比較は、ペプチドの同定を可能にし；必要であれば、ペプチドの配列を確認するために、ＭＳ／ＭＳ分析を行うことができる。

【0208】

キモトリプシン消化後の溶出物のスペクトルより、下の表１０の抗原ペプチドに対応し得る、９１２．４９； １０８６．４７； １８４３．０３； ２１０４．１６； １９４４．９７； １５６４．７３； １８３５．９７； ２０２２．０５； ２４２４，２２、及び２８５８，４２Ｄａ：の質量を有するペプチドの存在が明らかになっている。

【表10】

【0209】

Ｇｌｕ－Ｃ消化後の溶出物のスペクトルより、下の表１１の抗原ペプチドに対応し得る、１２００．４３； １３０９．６８； ２１０８．９７； ２１９１．０４； ２６９９．４３； ３１７０，６８、及び３２６４，７０Ｄａの質量を有する本発明者らの関心対象のタンパク質の消化ペプチドの存在が明らかになっている。

【表11】

【0210】

これら２つの消化物のおかげで、本発明者らは、ｈＮ１３Ｂ２とＣＤ１２７抗原の間の相互作用に関与する３つの部位（下の表１２）を同定することができた。対象となる配列を制限するために、塩バッファー洗浄から得られたペプチドを除外した。

【表12】

【0211】

抗原ＣＤ１２７上でのＮ１３Ｂ２抗体のエピトープマッピングは、ＩＬ７／ＣＤ１２７経路に対する抗体活性にとって重要な３つの異なる配列を示した（図２７）。ＩＬ７／ＣＤ１２７相互作用の３Ｄ結晶学解析（ＭｃＥｌｒｏｙらの文献、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２００９， ＰＤＢ：３ＤＩ２）によると、これらの配列のうちの２つ（配列番号１１５及び配列番号１１７）は構造的に閉じており、ＩＬ７とＣＤ１２７との結合に関与する領域に位置している。同定された３番目の配列（配列番号１１６）は、受容体のＤ２ドメイン（受容体のガンマ鎖であるＣＤ１３２と相互作用することが予測されるドメイン（Ｗａｌｓｈらの文献、２０１２））の部位２ｂに位置している。Ｎ１３Ｂ２は、ＩＬ７－ＣＤ１２７相互作用及びＣＤ１２７－ＣＤ１３２ヘテロ二量体形成を阻害するタンパク質の２つの部分に位置するＣＤ１２７上の立体構造エピトープを認識する。Ｎ１３Ｂ２の結合は、Ｗａｌｓｈ ＳＴによって予測されたような「３成分のＩＬ７Ｒａ／ＩＬ７／ｇ鎖複合体」の形成を不安定にするに違いなく、これにより、複合体の内在化が阻止される。

【0212】

（実施例１９．結果）
以前に記載されたように（Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓらの文献、２０１０）、ＩＬ－７単独で、ＩＬ－７媒介シグナル伝達に必要とされるＴリンパ球の表面でのＩＬ－７受容体アルファ鎖（ＣＤ１２７）の速やかな内在化（３０～４０％）が誘導される。ここで、本発明者らは、Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂがＩＬ－７誘導性のＣＤ１２７内在化を妨げ、かつ単独ではこの内在化を誘導しないことを記載した（図１６）。対照的に、本発明者らは、ＧＳＫ製の抗ヒトＣＤ１２７ １Ａ１１クローン（特許出願ＷＯ２０１１０９４２５９号）が、単独で又はＩＬ－７と組み合わせて３７℃で適用されたとき、Ｔリンパ球の表面でのＣＤ１２７の発現を劇的に減少させることを記載した（図１６）。この効果は、いくつかの市販の抗ＩＬ７Ｒ抗体（ｅＢｉｏＲＤＲ５及びＭＢ１５－１８Ｃ９、データは示さない）による様々な染色を用いて観察された。キメラＮ１３Ｂ２ ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃ－ドメインを有するようなフォーマットにしたもの）を１０ｍｇ／Ｋｇで非ヒト霊長類に静脈内投与した後、本発明者らは、２週間の追跡調査期間にわたって、Ｔ－リンパ球の表面でのＣＤ１２７発現の低下を測定することがなかった（図１７Ｂ）。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ヒトＣＤ１２７ ＭＤ７０７－１３クローン（ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ－ドメインを有するようなフォーマットにしたもの；ＷＯ２０１３／０５６９８４号）で並行して静脈内処理した他の非ヒト霊長類において、本発明者らは、Ｔ－リンパ球の表面でのＣＤ１２７の有意な減少（６０％）を観察した（図１７Ｂ）。Ｔ－リンパ球上で抗ヒトＣＤ１２７ ｍＡｂが結合した後のこのＣＤ１２７の内在化は、Ｐｆｉｚｅｒのグループによっても以前に発表されており、そこで、このグループは、その抗ヒトＣＤ１２７ ｍＡｂ（クローンＨＡＬ－Ｈ３Ｌ４、米国特許第８，６３７，２７３号）が、ヒト及び非ヒト霊長類の血液細胞に対してエクスビボで、並びに非ヒト霊長類に静脈内投与した後にインビボで、ＣＤ１２７内在化を顕著に誘導することを記載した（Ｋｅｒｎらの文献、２０１３）。

【0213】

Ｋｅｒｎらによる最近の刊行物（Ｋｅｒｎらの文献、２０１５）において、ＣＤ１２７占有が調べられ、競合アッセイが行われた。ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の抗ＣＤ１２７ ＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１クローンは、ＣＤ１２７に対する結合についてＨＡＬ／Ａｂ１抗体（Ｐｆｉｚｅｒグループ製）と競合することが示された。本発明の図１６に示すように、ＨＡＬ抗体（クローンＨ３Ｌ４、米国特許第８６３７２７３号）を、ＣＤ１２７発現及び内在化に関して、Ｎ１３Ｂ２及び１Ａ１１と比較した。これらの結果は、ＨＡＬ抗体とＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１特許との競合を示し、これにより、Ｋｅｒｎらの文献（２０１５）のデータが確認された。しかしながら、Ｎ１３Ｂ２は、ＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１と競合しない。Ｋｅｒｎらは、ＨＡＬ／Ａｂ１が単独で、注射後４日から８日まで、細胞表面におけるＣＤ１２７発現のインビボでの下方調節を誘導することも示した。これらの結果は、ＭＤ７０７－１３クローンに関して本発明の図１７Ｂに示された結果と同様である。図１７Ｂは、抗体の注射後４日から１０日までの細胞表面におけるＣＤ１２７発現の下方調節を示している。このインビボ効果を、同じく観察されたインビトロでのＭＤ７０７－１３依存的な細胞内へのＣＤ１２７の内在化と関連付けることができる。

【0214】

ペプチドマイクロアレイ及び質量分析によるエピトープ研究により、Ｎ１３Ｂ２によって認識されるＣＤ１２７上の立体構造エピトープが同定された。このエピトープは、Ｄ１にのみ位置するエピトープを認識する従来技術の抗体（実施例１７）とは対照的に、ドメインＤ１及びＤ２に位置する。さらに、図１６は、従来技術の抗体がＣＤ１２７の内在化を誘導する一方で、Ｎ１３Ｂ２がそれを誘導しないことを示している。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ１２７内在化を誘導しないというＮ１３Ｂ２の性質がドメインＤ１とＤ２の両方に位置するエピトープを認識するその性質と関係があるという結論を下している。

【0215】

まとめると、これらの結果及び以前の報告結果により、ＩＬ－７受容体に対するＩＬ－７の結合を遮断すると記載されている抗ヒトＣＤ１２７ ｍＡｂ（１Ａ１１クローン、ＨＡＬ／Ａｂ１クローン及びＨ３Ｌ４クローン、並びにＭＤ７０７－１３クローン）が、ＩＬ－７受容体シグナル伝達と関連しかつそれに必要とされるＩＬ－７受容体アルファ鎖の内在化も誘導することが示された。対照的にかつ驚異的な方法で、Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂは、ＣＤ１２７内在化を誘導しない独特の性質を有しており、それは、ＩＬ－７によって誘導されるそのような内在化を妨げる。これらの結果は、ＩＬ－７受容体シグナル伝達（例えば、ＳＴＡＴ５リン酸化、図１４Ｂ）をインビトロで効果的に妨げるＣＤ１２７－内在化インデューサーｍＡｂ（例えば、ＭＤ７０７－１３クローン）が、インビボでメモリー細胞性免疫応答（図２１）も液性免疫応答（図２２）も妨げることができないという観察と関連付けられなければならない。対照的に、本発明者らは、ＩＬ－７受容体シグナル伝達（ＳＴＡＴ５リン酸化）を効果的に遮断するが、ＣＤ１２７内在化をヒトＴリンパ球上でエクスビボで及び非ヒト霊長類でインビボで誘導しないＮ１３Ｂ２ ｍＡｂが、遅延型過敏症メモリー細胞性応答（図２１）及び異種ヒツジ赤血球に対する免疫（図２２）を妨げることを記載した。メモリー液性応答の制御に関してＮ１３Ｂ２のアイソタイプ間で違いは観察されなかったが、本発明者らは、ＩｇＧ４フォーマットのＮ１３Ｂ２が、ＩｇＧ１と比較して、より効果的にメモリー細胞性応答を妨げることに気付いた。ＭＤ７０７－１３処理動物とＮ１３Ｂ２処理動物の間でｍＡｂ曝露及び血清濃度に関する違いは観察されなかった。同様に、本発明者らは、Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂ又はＭＤ７０７－１３ ｍＡｂのいずれかで処理した動物における調節性Ｔリンパ球の有意な増加も観察した（図２２）。

【0216】

ヒトＩＬ－７は、ヒトＴリンパ球上でのインビトロでのα４及びβ７インテグリンの強い発現を誘導し、α４、β７、及びα４／β７インテグリンを発現するヒトＴリンパ球の頻度を劇的に増大させた（図１９Ａ）。これは、腸、脳、及び皮膚などの非リンパ系組織でのＴリンパ球のホーミング及び保持に必要とされる（Ｇｏｒｆｕらの文献、２００９， ＤｅＮｕｃｃｉらの文献、２００９）。それに伴って、本発明者らは、Ｎ１３Ｂ２ ｍＡｂが、α４とβ７の両方の発現をインビトロで用量依存的に阻害すること、並びにα４陽性及びα４／β７陽性ヒトＴリンパ球の頻度を減少させることを観察した（図１９Ｂ）。同様に、ヒト末梢血単核細胞から免疫不全マウスに移植した後、本発明者らは、Ｎ１３Ｂ２抗体が、処理して１週間後（データは示さない）及び２週間後のβ７陽性Ｔリンパ球のパーセンテージ及びこれらの細胞の数（すなわち、生着）を顕著にかつ急速に減少させることを観察した（図２０）。２つの異なる炎症モデルで得られた結果は、Ｎ１３Ｂ２抗ＩＬ７Ｒα抗体が、炎症性疾患に対する、特に、結腸炎における効率的な治療であり得ることを示している。

【0217】

（実施例２０．立体構造エピトープの作製）
ＣＬＩＰＳペプチドを用いて、これらのＣＬＩＰＳペプチドを、所望の抗体を誘導する活性のある強力な免疫原に変換する目的で、抗原の天然の２次構造及び３次構造を適切に模倣することができる（Ｂｏｓｈｕｉｚｅｎらの文献、２０１４）。ＣＬＩＰＳ技術は、２つ、３つ、又は４つのアンカーポイントを保有する小さな柔軟性のない実体（化学的スキャフォールド）との反応による線状ペプチドの（多重）環状化を伴う。このアンカーは、ペプチドの１種類の官能基（すなわち、チオール）のみと反応し、複数の共有結合を介してペプチドに結合する。ペプチドは、スキャフォールドの周囲にフォールディングし、柔軟性を解放しながら、輪郭のはっきりとした３次元構造をゆっくりと取り、中心のスキャフォールド実体が「クモの巣の中のクモ」のようになる。

【0218】

この技術は、完全合成の特注のスキャフォールドを利用する。ＣＬＩＰＳスキャフォールドは、サイズ、極性、剛性、溶解度、官能性、及び「ＳＳ－架橋」距離が主に異なる。これらのスキャフォールドを用いて、ペプチドの緩い末端を取り付ける。ペプチド配列内に適切に配置された場合、得られるＣＬＩＰＳペプチドは、線状配列と比較して、インタクトなタンパク質上の対応する領域の３Ｄ－構造にはるかによく類似している可能性が高い。ＣＬＩＰＳ－環状化は、天然のＬ－システイン残基上で行うことができるが、配列中のほとんど全ての所望の位置に人為的に導入されたＤ－及びＬ－（ホモ）システイン上でも行うことができる。したがって、ＣＬＩＰＳ化ペプチドの構造及び寸法を意のままに変化させることができる。環状化反応は、長くても３０分間持続し、室温で進行し、いかなる種類の触媒作用も必要としない。さらに、これは、完全な水性条件及び中性ｐＨ（７．５～８．０）の下で適用することができ、それゆえ、細菌ファージのような非常に感度の高い生物システムと適合性がある。最後に、この反応は、高収率の環状生成物を促進しかつ重合を回避する、高希釈条件（１０～１００μＭ）で実行することができる。この技術は、用途が極めて広く、その応用の容易さの点で独特である。

【0219】

抗受容体抗体の線状エピトープと不連続エピトープの両方を再構築するために、線状の多量体重複ペプチドを、Ｃ末端が各々の３ｕｌウェル（プレート当たり４５５ウェル）の底に共有結合し、かつ各々のウェルが異なるペプチドを含むように、クレジットカード大のポリプロピレンプレート上に直接合成する。単一ドメインペプチドの各々において、環状化ジシステイン架橋を形成させて、プレートに付着しているペプチドに、拘束されたループを挿入した。Ｔｅｅｌｉｎｇらの文献（２００６）では、対象となる抗体によって認識される不連続エピトープを再構築する目的で、対象となるペプチドを有する環状化ペプチドを作製する方法が説明されている。簡潔に述べると、プレートに結合したジシステイン含有ペプチドを、例えば、ＣＸＸＸＸＣ－プレート、ＸＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸプレート、又はＣＸＸＸＸＣ－プレートなど、システインがペプチドに沿って４～１３ａａの間隔となるようにまず合成する。その後、水溶液中でａ，ａ－ジブロモキシレンと反応させることによってペプチドを環状化して、様々な数のアミノ酸を含有するシステインループを提供する。この化学修飾により、ジスルフィド架橋が提供するよりも安定なループが提供される（Ｎｉｅｄｅｒｆｅｌｌｎｅｒらの文献、２０１１）。

【0220】

（実施例２１．ＣＤ１２７及びγｃの共免疫沈降）
ＣＤ１２７のγｃ鎖への結合に対するＮ１３Ｂ２の効果及び従来技術の抗体の効果を調べるために、ＩＬ－７により刺激し、抗体の非存在下又はＭＤ７０７－１３もしくはＮ１３Ｂ２抗体の存在下でインキュベートした細胞で共免疫沈降実験を行った。抗体の非存在下では、ＣＤ１２７及びγｃは、共免疫沈降することが示された。細胞とＭＤ７０７－１３とのインキュベーションは、この共免疫沈降を妨げなかったが、Ｎ１３Ｂ２とのインキュベーションは、そのような共免疫沈降の欠如をもたらした。それゆえ、本発明者らの抗体は、ＣＤ１２７のγｃ鎖への結合を妨害することができるが、従来技術の抗体は、そのような特徴を有しない。

【0221】

抗ＣＤ１２７の存在下で複合体ＣＤ１２７－ＣＤ１３２－ＩＬ７を共免疫沈降するために、ヒトＰＢＬをラット抗ｈＣＤ１２７抗体（１０μｇ／ｍｌのラットＮ１３Ｂ２又はＭＤ７０７－１３）とともに、３７℃で３０分間インキュベートした後、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、照会番号ＰＨＰ０４６）で、３７℃で１５分間刺激した。反応を４℃で停止させ、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、共免疫沈降キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ ＩＰキット、照会番号２６１４８）の溶解バッファーを添加した。

【0222】

精製カラム抗ヒトＣＤ１２７を共免疫沈降キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ ＩＰキット、照会番号２６１４８）を用いて調製した。製造元によって推奨される手順に従って、カラムに７５μｇの非競合ラット抗ヒトＣＤ１２７（Ｅｆｆｉｍｕｎｅ、ＭＤ７０７－９）をカップリングさせた。非特異的バインダーを除去するために、溶解物をカップリングさせていないカラム上で予備精製した。その後、溶解物を抗ＣＤ１２７カラム上に添加し、回転撹拌しながら４℃で２時間インキュベートをした。カラムを洗浄バッファーで２回洗浄し、その後、溶出バッファーで溶出させた。回収した試料をウェスタンブロットにより解析した。

【0223】

ウェスタンブロットのために、ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲル（分離ゲルについては１０％、スタッキングゲルについては４％、厚さ１．５ｍｍ）を調製し、５０μｌの変性させた溶出物（変性については： ０．１Ｍ ＤＴＴ、９５℃で１０分）を各ウェルに添加した。ＣＤ１２７Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ；照会番号１０９７５－Ｈ０８Ｈ）及びＣＤ１３２Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ；照会番号１０５５５－Ｈ０２Ｈ）組換えタンパク質をウェスタンブロット検出用の対照として添加した（５μｇ／ウェル）。２００Ｖで１時間３０分間の泳動、及び２０Ｖで３５分間のニトロセルロース膜上への転写の後、飽和を、５％ミルク中、室温で２時間行った。

【0224】

検出を開始するために、ウサギ抗ヒトＣＤ１３２抗体（ａｎｔｉｃｏｒｐｓ－ｅｎ－ｌｉｇｎｅ， Ｆｒａｎｃｅ、照会番号ＡＢＩＮ７４１８４０）を、１／５０で、一晩４℃で添加し、その後、１／２０００のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、照会番号１１１－０３５－１４４）で、室温で１時間顕示させる。脱ハイブリダイゼーションの後、膜を１／２００のラット抗ヒトＣＤ１２７抗体（Ｅｆｆｉｍｕｎｅ， ＭＤ７０７－９）とともに４℃で一晩インキュベートし、１／１０００のペルオキシダーゼ標識ロバ抗ラット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、照会番号７１２－０３５－１５３）で、室温で１時間顕示させた。各々の顕示について、ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、照会番号３４０８０）を用いて、化学発光によりペルオキシダーゼを検出し、結果をＦｕｊｉ ４０００カメラで読み取った。

【0225】

図２８は、ＣＤ１２７／ＩＬ７／ＣＤ１３２複合体の共免疫沈降の結果を示している。本発明者らは、細胞をＮ１３Ｂ２抗体とともにインキュベートする場合を除く全ての条件で、ＣＤ１３２鎖（６０ＫＤａ）がＣＤ１２７と共免疫沈降することを観察した（２８Ａ）。しかしながら、図２８Ｂに示すように、各々の条件で、ＣＤ１２７（７０ＫＤａ）は、ＭＤ７０７－９抗体によって十分に免疫沈降され、このことは、Ｎ１３Ｂ２及びＭＤ７０７－１３がＣＤ１２７の認識についてＭＤ７０７－９と競合しなかったことを示している。Ｎ１３Ｂ２抗体は、ＩＬ－７の存在下でのＣＤ１２７／ＣＤ１３２の複合体形成を阻害する。これらの結果は、ＣＤ１２７上でのＮ１３Ｂ２抗体のエピトープマッピングと一致しており、Ｎ１３Ｂ２がＩＬ７Ｒアルファ鎖のドメインＤ２の部位２ｂ内のアミノ酸配列に結合することを示している（Ｗａｌｓｈらの文献、Ｉｍｍｕｎｏｌ ｒｅｖ． ２０１２）。

【0226】

まとめると、これらの結果は、Ｎ１３Ｂ２抗体が、ＩＬ－７の存在下で、部位２ｂにおけるＣＤ１２７／ＣＤ１３２相互作用のアンタゴニストであるだけでなく、ＩＬ７／ＣＤ１２７相互作用のアンタゴニストでもあることを示し、これにより、ＩＬ７及び／又は従来技術の抗ＣＤ１２７抗体で観察されたＣＤ１２７の内在化に対する該抗体の阻害活性を説明することができる。
以下の番号付き実施態様は、本発明の好ましい実施態様を構成する。
１．ＣＤ１２７に特異的に結合し、かつＣＤ１２７の内在化を誘導しない、抗体又は抗体の抗原結合性断片又は抗原結合性抗体模倣物。
２．ＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する、特に、実施態様１による、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
３．抗体又は断片の存在下でのＩＬ－７処理細胞におけるＣＤ１２７の細胞表面発現が、抗体の非存在でインキュベートした細胞におけるそのレベルの少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％である、実施態様１又は２による抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
４．ＣＤ１２７に特異的に結合し、それにより、サイトカイン受容体のγｃ共通鎖へのＣＤ１２７の結合を妨害する、抗体又はその抗原結合性断片。
５．ＣＤ１２７に結合したとき、サイトカイン受容体のγｃ共通鎖へのＣＤ１２７の結合を妨害する、実施態様１～３のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片。
６．特に、測定が、該抗体の存在下又は非存在下でインキュベートされた、細胞表面でＩＬ７受容体を発現するインタクトな細胞由来のＣＤ１２７含有分子複合体を含む細胞溶解物に対して行われるとき、その存在下で、ＣＤ１２７に結合したγｃの量が、抗体の非存在下で、それ以外は同一の条件で測定される該量の８０％未満、好ましくは５０％未満、一層より好ましくは２５％又は１０％未満である、実施態様４又は５のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片。
７．ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達のアンタゴニストである、上記の実施態様のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
８．実施態様５３～６７のいずれかによる抗原又は該抗原のエピトープに対して特異的に結合し、及び／又は作製された、特に、上記の実施態様のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
９．ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させない、特に、上記の実施態様のいずれかによる、ＣＤ１２７に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
１０．α４、β７、及び／又はα４／β７インテグリンの発現を阻害する、上記の実施態様のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
１１．インビボで、特に、免疫不全マウスに注射されたヒトＴ細胞で、α４、β７、及び／又はα４／β７インテグリンの発現を阻害する、実施態様１０による抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
１２．以下のアミノ酸配列：
・ＶＨＣＤＲ１配列番号１０；
・ＶＨＣＤＲ２配列番号１２；
・ＶＨＣＤＲ３配列番号１４もしくは配列番号４８；又は
・ＶＨ配列番号２２
のうちの少なくとも１つを含むＶＨ鎖、及び／或いは以下のアミノ酸配列：
・ＶＬＣＤＲ１配列番号１６もしくは配列番号５０；
・ＶＬＣＤＲ２配列番号１８もしくは配列番号５２；
・ＶＬＣＤＲ３配列番号２０；又は
・ＶＬ配列番号２４
のうちの少なくとも１つを含むＶＬ鎖を含む、特に、上記の実施態様のいずれかによる、ＣＤ１２７に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
１３．ＶＨＣＤＲ１配列番号１０、ＶＨＣＤＲ２配列番号１２、ＶＨＣＤＲ３配列番号１４又は配列番号４８、ＶＬＣＤＲ１配列番号１６又は配列番号５０、ＶＬＣＤＲ２配列番号１８又は配列番号５２、及びＶＬＣＤＲ３配列番号２０からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのＣＤＲ配列を含む、実施態様１２による抗体又はその断片もしくは模倣物。
１４．ＶＨＣＤＲ１配列番号１０、ＶＨＣＤＲ２配列番号１２、ＶＨＣＤＲ３配列番号１４又は配列番号４８、ＶＬＣＤＲ１配列番号１６又は配列番号５０、ＶＬＣＤＲ２配列番号１８又は配列番号５２、及びＶＬＣＤＲ３配列番号２０の６つ全てのＣＤＲ配列を含む、実施態様１３による抗体又はその断片もしくは模倣物。
１５．－ＶＨ鎖が、配列番号２の配列もしくは配列番号６の配列もしくは配列番号５４の配列を有するＶＨ鎖にあるか、又は配列番号２２の配列もしくは配列番号３６の配列もしくは配列番号３８の配列もしくは配列番号４０の配列を含み；かつ
－ＶＬ鎖が、配列番号４の配列もしくは配列番号５６の配列を有するＶＬ鎖にあるか、又は配列番号２４の配列もしくは配列番号４２の配列もしくは配列番号４４の配列もしくは配列番号４６の配列を含む、
実施態様１４による抗体。
１６．キメラ抗体又はヒト化抗体又は脱免疫化抗体である、上記の実施態様のいずれかによる抗体。
１７．重鎖が配列番号５２の配列を有し、かつ軽鎖が配列番号５４の配列を有する、ヒト化されかつ脱免疫化された抗体である、実施態様１３による抗体。
１８．上記の実施態様のいずれかによる抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物を含むキメラ分子である巨大分子であって、該抗体が機能的に異なる分子と関連しており、該キメラ分子が、融合キメラタンパク質か、又は化学基もしくは分子、例えば、ＰＥＧポリマーもしくは標識抗体の共有結合によって得られるコンジュゲートかのどちらかである、前記巨大分子。
１９．アフィチン又はアンチカリンである、上記の実施態様のいずれかによる巨大分子。
２０．５Ｅ－１０Ｍよりも低い、とりわけ、１Ｅ－１０Ｍよりも低い、とりわけ、５Ｅ－１１Ｍよりも低いＫｄでＣＤ１２７に結合する、上記の実施態様のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２１．ＣＤ１２７陽性細胞に対する細胞傷害活性を示す、上記の実施態様のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２２．ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させず、ここで、ＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞成熟の増大が、ＴＳＬＰのみで処理した細胞と比較した、ＴＳＬＰで処理しかつ該巨大分子で処理したＴＳＬＰ受容体陽性細胞における細胞表面マーカーＣＤ４０及び／又はＣＤ８０の発現の上昇を決定することによって評価される、上記の実施態様のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２３．ＣＤ８０の発現が、ＴＳＬＰのみで処理した細胞と比較して、ＴＳＬＰで処理しかつ該巨大分子で処理したＴＳＬＰ受容体陽性細胞で、２５％以下、好ましくは１０％以下上昇する、実施態様２２による巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２４．ＣＤ８０の発現が、ＴＳＬＰのみで処理した細胞と比較して、ＴＳＬＰで処理しかつ該巨大分子で処理したＴＳＬＰ受容体陽性細胞で上昇しないか又は減少する、実施態様２３による巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２５．ＣＤ４０の発現が、ＴＳＬＰのみで処理した細胞と比較して、ＴＳＬＰで処理しかつ該巨大分子で処理したＴＳＬＰ受容体陽性細胞で５０％以下、好ましくは２５％以下上昇する、実施態様２２による巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２６．ＣＤ４０の発現が、ＴＳＬＰのみで処理した細胞と比較して、ＴＳＬＰで処理しかつ該巨大分子で処理したＴＳＬＰ受容体陽性細胞で上昇しないか又は減少する、実施態様２５による巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
２７．上記の実施態様のいずれかの抗体もしくはその抗原結合性断片、又は巨大分子をコードする核酸分子。
２８．配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；配列番号４２；配列番号４４；配列番号４６；配列番号４８；配列番号５０；配列番号５２；配列番号５４、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸をコードする、実施態様２７による核酸分子。
２９．配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；配列番号４９；配列番号５１；配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択される、実施態様２８による核酸分子。
３０．実施態様２７～２９のいずれかのポリヌクレオチドのクローニング用及び／又は発現用のベクター、とりわけ、哺乳動物細胞でのクローニング及び／又は発現に好適なプラスミド。
３１．実施態様２７～３０のいずれかによるポリヌクレオチドで組み換えられた細胞又は細胞株、とりわけ、哺乳動物細胞又は細胞株。
３２．実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物を医薬ビヒクルとともに含む医薬組成物であって、さらなる異なる活性成分を任意に含む、前記医薬組成物。
３３．ヒト患者に投与したとき、樹状細胞分化／成熟を制御するのに好適な製剤中の、実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物を治療活性成分として含む医薬組成物、或いは実施態様３２の医薬組成物。
３４．特に、自己免疫疾患もしくはアレルギー疾患、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、癌疾患、慢性ウイルス感染、炎症性疾患、移植、呼吸器疾患、又は自己免疫に関与する細胞に対する治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物をさらに含む、実施態様３２又は３３の医薬組成物。
３５．それを必要としている患者における併用治療レジメン又は追加治療レジメンにおいて治療活性成分として使用するための、実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物或いは実施態様２７～３０のいずれかの核酸或いは実施態様３１の細胞又は細胞株。
３６．疾患を有する患者、特に、ヒト患者の治療において使用するための、実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物或いは実施態様２７～３０のいずれかの核酸或いは実施態様３１の細胞又は細胞株或いは実施態様３２～３４のいずれかの医薬組成物。
３７．疾患のリスクがある患者、特に、ヒト患者の治療において使用するための、実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物或いは実施態様２７～３０のいずれかの核酸或いは実施態様３１の細胞又は細胞株或いは実施態様３２～３４のいずれかの医薬組成物。
３８．疾患が、自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、及び狼瘡である、実施態様３６及び／又は実施態様３７による使用のための巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は医薬組成物。
３９．疾患が、炎症性疾患、特に、ＩＢＤ及び脳脊髄炎である、実施態様３６及び／又は実施態様３７による使用のための巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は医薬組成物。
４０．疾患がアレルギー疾患である、実施態様３６及び／又は実施態様３７による使用のための巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は医薬組成物。
４１．疾患が癌疾患である、実施態様３６及び／又は実施態様３７による使用のための巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は医薬組成物。
４２．疾患が呼吸器疾患である、実施態様３６及び／又は実施態様３７による使用のための巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は医薬組成物。
４３．疾患が移植に関するものであり、特に、移植の結果である、実施態様３６及び／又は実施態様３７による使用のための巨大分子、核酸、細胞、細胞株、又は医薬組成物。
４４．疾患を有するか又は疾患のリスクがある患者における実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物或いは実施態様２７～３０のいずれかの核酸或いは実施態様３１の細胞又は細胞株或いは実施態様３２～３４の医薬組成物の投与を含む治療方法。
４５．疾患が、自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、及び狼瘡である、実施態様４４による治療方法。
４６．疾患が、炎症性疾患、特に、ＩＢＤ及び脳脊髄炎である、実施態様４４による治療方法。
４７．疾患がアレルギー疾患である、実施態様４４による治療方法。
４８．疾患が癌疾患である、実施態様４４による治療方法。
４９．疾患が呼吸器疾患である、実施態様４４による治療方法。
５０．疾患が移植に関するものであり、特に、移植の結果である、実施態様４４による治療方法。
５１．移植を必要としている及び／もしくはもうすぐ移植を受ける患者、特に、ヒト患者、並びに／又は移植を受けた患者の治療において使用するための、実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物或いは実施態様２７～３０のいずれかの核酸或いは実施態様３１の細胞又は細胞株或いは実施態様３２～３４のいずれかの医薬組成物。
５２．移植を必要としている及び／もしくはもうすぐ移植を受ける患者並びに／又は移植を受けた患者における実施態様１～２６のいずれかによる巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物或いは実施態様２７～３０のいずれかの核酸或いは実施態様３１の細胞又は細胞株或いは実施態様３２～３４の医薬組成物の投与を含む治療方法。
５３．エピトープが、ＣＤ１２７の部位２ｂ由来の配列を含むか又は該配列からなり、特に、ＣＤ１２７の部位２ｂ由来の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸を含む、抗原。
５４．エピトープが、配列番号１１４のアミノ酸１０９～１２７からなる部位由来の、特に、アミノ酸１１０～１２５、１１２～１２５、１１２～１２０からなる部位由来の配列を含むか又はこれらの配列からなり、特に、該部位由来の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸を含む、実施態様５３による抗原。
５５．エピトープが、ＣＤ１２７の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸を含み、該連続するアミノ酸がＰ１１２及び／又はＬ１１５を含む、実施態様５３又は５４のいずれかによる抗原。
５６．エピトープが、配列番号１１６の配列からなるか又は該配列を含み、特に、配列番号８６の配列を含む、実施態様５３～５５のいずれかによる抗原。
５７．エピトープが、ＣＤ１２７のＤ１ドメイン由来の、特に、配列番号１１４のアミノ酸１～９８由来の配列、特に、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸も含む、実施態様５３～５６のいずれかによる抗原。
５８．エピトープが、配列番号１１５の配列を含むか又は該配列からなる、特に、配列番号１１０を含むか又は該配列からなるヒトＣＤ１２７の配列を含む、実施態様５７による抗原。
５９．エピトープが、配列番号１１４のアミノ酸１８０～２２０由来の配列、特に、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つの連続するアミノ酸も含み、特に、該配列番号１１４のアミノ酸１８０～２２０由来の配列が、配列番号１１７の配列からなるか又は該配列を含み、特に、配列番号１１１の配列を含むか又は該配列からなる、実施態様５３～５８のいずれかによる抗原。
６０．エピトープが：
配列番号１１０の配列もしくは配列番号１１５の配列；
配列番号１１１の配列もしくは配列番号１１７の配列；及び
配列番号８６の配列もしくは配列番号１１６の配列
からなるヒトＣＤ１２７配列の配列からなるか又はこれらの配列を含む、実施態様５３～５９のいずれかによる抗原。
６１．エピトープが、配列番号１１４のアミノ酸９９～１０８の配列由来の３つ、４つ、もしくは５つよりも多くの連続するアミノ酸を含まず、及び／又は配列番号１１４のアミノ酸１２８～１７９の配列由来の３つ、４つ、もしくは５つよりも多くの連続するアミノ酸を含まず、及び／又は配列番号１１４のアミノ酸２２０～２３９の配列由来の３つ、４つ、もしくは５つよりも多くの連続するアミノ酸を含まず、特に、配列番号１１４の該アミノ酸配列のいずれかに由来の３つ、４つ、又は５つよりも多くの連続するアミノ酸を含まない、実施態様５３～６０のいずれかによる抗原。
６２．配列番号１１０を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を、Ｎ－末端の１アミノ酸を超えて、又はＣ－末端の７アミノ酸を超えて含むようには拡張しない、実施態様５３又は６０のいずれかによる抗原。
６３．配列番号１１０を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するＮ－末端及び／又はＣ－末端のアミノ酸を１つでも含むようには拡張しない、実施態様６１による抗原。
６４．配列番号１１１を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を、Ｎ－末端の３０アミノ酸を超えて、又はＣ－末端の３０アミノ酸を超えて含むようには拡張しない、実施態様５３～６３のいずれかによる抗原。
６５．配列番号１１１を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するＮ－末端及び／又はＣ－末端のアミノ酸を１つでも含むようには拡張しない、実施態様６４による抗原。
６６．エピトープが立体構造エピトープであり、特に、該エピトープに含まれるＣＤ１２７由来のペプチドが、天然のＣＤ１２７又はその細胞外ドメイン中の、特に、リガンドなしのその単量体形態の、γｃに結合したその形態の、及び／又はＩＬ７に結合したその形態のＣＤ１２７中の対応するペプチドの立体構造を模倣する立体構造である、実施態様５３～６５のいずれかによる抗原。
６７．エピトープが立体構造エピトープであり、その中で、ＣＤ１２７由来のペプチドが、それらを所望の立体構造に保持する堅い分子骨格に結合している、実施態様６６による抗原、特に、ＣＬＩＰＳ技術を用いて得られるような抗原。
６８．実施態様５３～６７のいずれかに定義されているエピトープ。
６９．実施態様５３～６７のいずれかによって定義される抗原をコードする核酸。
７０．抗体を製造する方法であって、非ヒト動物を実施態様５３～６７のいずれかに定義されている抗原に対して免疫することを含む、前記方法。
７１．抗体、抗体の断片、又は抗体模倣物、特に、実施態様７０と同様に得られる抗体又はその断片もしくは模倣物を選択する方法であって、実施態様５３～６７のいずれかに定義されている少なくとも１つの抗原に対する該抗体の結合能をアッセイする工程を含み、特に、各工程がＣＤ１２７の単一の連続配列からなる異なるペプチドに対する結合能をアッセイする、いくつかの連続的なそのような工程を含む、前記方法。
７２．巨大分子、特に、抗体、特に、実施態様７０と同様に得られる抗体、又はそのような抗体の抗原結合性断片もしくは模倣物を選択する方法であって、ＣＤ１２７に対する、特に、実施態様５３～６７のいずれかに定義されているその抗原に対する巨大分子の結合能を試験する工程及び任意に実施態様２０による巨大分子を選択する工程を含むか又はこれらの工程からなる、前記方法。
７３．実施態様７１又は７２のいずれかによる、巨大分子を選択する方法であって、抗原がＣＤ１２７のいくつかの不連続ペプチドを含み、該方法がいくつかの工程を含み、該工程の各々がＣＤ１２７の該ペプチドのうちの１つに対する巨大分子の結合能を試験することからなる、前記方法。
７４．特に、実施態様７１～７３のいずれかによる、巨大分子、特に、抗体、特に、実施態様７０と同様に得られる抗体又はそのような抗体の抗原結合性断片もしくは模倣物を選択する方法であって、巨大分子の存在によって誘導されるＣＤ１２７発現細胞におけるＣＤ１２７の内在化を試験する工程を含むか又はこの工程からなる、前記方法。
７５．特に、実施態様７１～７４のいずれかによる、巨大分子、特に、抗体、特に、実施態様７０と同様に得られる抗体又はそのような抗体の抗原結合性断片もしくは模倣物を選択する方法であって、ＣＤ１２７発現細胞におけるＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化の巨大分子による阻害を試験する工程及び任意に実施態様３による巨大分子を選択する工程を含むか又はこれらの工程からなる、前記方法。
７６．特に、実施態様７１～７５のいずれかによる、巨大分子、特に、抗体、特に、実施態様７０と同様に得られる抗体又はそのような抗体の抗原結合性断片もしくは模倣物を選択する方法であって、該巨大分子が、ＣＤ１２７へのその結合によって、ＣＤ１２７のγｃ鎖への結合を妨げる能力をアッセイする工程を含むか又は該工程からなる、前記方法。
７７．特に、実施態様７１～７６のいずれかによる、巨大分子、特に、抗体、特に、実施態様７０と同様に得られる抗体又はそのような抗体の抗原結合性断片もしくは模倣物を選択する方法であって、巨大分子の存在下でＴＳＬＰによって誘導されるＤＣの成熟の増大を試験する工程及び任意に実施態様２２～２６のいずれかによる巨大分子を選択する工程を含むか又はこれらの工程からなる、前記方法。
７８．以下の工程：
ａ．巨大分子によるＩＬ－７誘導性シグナル伝達、特に、ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害を試験する工程；
ｂ．巨大分子によるＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の阻害を試験する工程；
ｃ．巨大分子によるα４、β７、及び／又はα４／β７インテグリン発現、特に、Ｔ－リンパ球での細胞表面発現の発現の阻害を試験する工程
のうちの１つ又は複数をさらに含む、実施態様７１～７７のいずれかによる方法。
（参考文献）

【化2】

本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
ＣＤ１２７に特異的に結合し、かつＣＤ１２７の２ｂ部位から取られた配列を含むエピトープを認識する、抗体又は抗体の抗原結合性断片又は抗原結合性抗体模倣物。
（構成２）
ＣＤ１２７に特異的に結合し、かつＣＤ１２７の内在化を誘導せず、及び／又はＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害する、抗体又は抗体の抗原結合性断片又は抗原結合性抗体模倣物。
（構成３）
ＣＤ１２７に特異的に結合し、それにより、サイトカイン受容体のγｃ共通鎖へのＣＤ１２７の結合を妨害する、抗体又はその抗原結合性断片。
（構成４）
（ｉ）ＣＤ１２７の内在化を誘導せず、及び／もしくはＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化を阻害し、並びに／又は（ｉｉ）ＣＤ１２７に結合したとき、サイトカイン受容体のγｃ共通鎖へのＣＤ１２７の結合を妨害する、構成１記載の抗体又は抗体の抗原結合性断片又は抗原結合性抗体模倣物。
（構成５）
ＣＤ１２７に結合したとき、サイトカイン受容体のγｃ共通鎖へのＣＤ１２７の結合を妨害する、構成２記載の抗体又は抗体の抗原結合性断片又は抗原結合性抗体模倣物。
（構成６）
ＩＬ－７によって誘導されるＩＬ－７Ｒシグナル伝達のアンタゴニストである、構成１～５のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
（構成７）
特に、５Ｅ－１０Ｍよりも低い、とりわけ、１Ｅ－１０Ｍよりも低い、とりわけ、５Ｅ－１１Ｍよりも低いＫｄで、配列番号１１６（又は配列番号８６）の配列並びに配列番号１１０（もしくは配列番号１１５）の配列及び／又は配列番号１１１（もしくは配列番号１１７）の配列を含むか又はこれらの配列からなる、特に、配列番号１１０の配列及び配列番号１１１の配列を含むか又はこれらの配列からなるヒトＣＤ１２７のエピトープ配列に特異的に結合し、かつ該エピトープ配列を認識する抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物であって
ｉ．配列番号１１０を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を、Ｎ－末端の１アミノ酸を超えて、又はＣ－末端の７アミノ酸を超えて含むようには拡張せず；及び／又は
ｉｉ．配列番号１１１を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を、Ｎ－末端の３０アミノ酸を超えて、又はＣ－末端の３０アミノ酸を超えて含むようには拡張しない、
前記抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
（構成８）
ＣＤ１２７に特異的に結合し、かつＴＳＬＰによって誘導される樹状細胞の成熟を増大させない、構成１～６のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
（構成９）
ＣＤ１２７に特異的に結合し、以下のアミノ酸配列：
・ＶＨＣＤＲ１配列番号１０；
・ＶＨＣＤＲ２配列番号１２；
・ＶＨＣＤＲ３配列番号１４もしくは配列番号４８；又は
・ＶＨ配列番号２２
のうちの少なくとも１つを含むＶＨ鎖及び／或いは以下のアミノ酸配列：
・ＶＬＣＤＲ１配列番号１６もしくは配列番号５０；
・ＶＬＣＤＲ２配列番号１８もしくは配列番号５２；
・ＶＬＣＤＲ３配列番号２０；又は
・ＶＬ配列番号２４；
のうちの少なくとも１つを含むＶＬ鎖を含み、特に、ＶＨＣＤＲ１配列番号１０、ＶＨＣＤＲ２配列番号１２、ＶＨＣＤＲ３配列番号１４又は配列番号４８、ＶＬＣＤＲ１配列番号１６又は配列番号５０、ＶＬＣＤＲ２配列番号１８又は配列番号５２、及びＶＬＣＤＲ３配列番号２０からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのＣＤＲ配列を含む、構成１～８のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物。
（構成１０）
－前記ＶＨ鎖が、配列番号２の配列もしくは配列番号６の配列もしくは配列番号５４の配列を有するＶＨ鎖にあるか、又は配列番号２２の配列もしくは配列番号３６の配列もしくは配列番号３８の配列もしくは配列番号４０の配列を含み；かつ
－前記ＶＬ鎖が、配列番号４の配列もしくは配列番号５６の配列を有するＶＬ鎖にあるか、又は配列番号２４の配列もしくは配列番号４２の配列もしくは配列番号４４の配列もしくは配列番号４６の配列を含む、
構成９記載の抗体。
（構成１１）
キメラ抗体又はヒト化抗体又は脱免疫化抗体、特に、ヒト化されかつ脱免疫化された抗体であり、ここで、前記重鎖が配列番号５２の配列を有し、かつ前記軽鎖が配列番号５４の配列を有する、構成１～１０のいずれか一項記載の抗体。
（構成１２）
構成１～１１のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物を含むキメラ分子である巨大分子であって、該抗体が機能的に異なる分子と関連しており、該キメラ分子が、融合キメラタンパク質か、又は化学基もしくは分子、例えば、ＰＥＧポリマーもしくは標識抗体の共有結合によって得られるコンジュゲートかのどちらかである、前記巨大分子。
（構成１３）
構成１～１２のいずれか一項記載の抗原、抗体、その抗原結合性断片もしくは模倣物、又は巨大分子、特に、配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；配列番号４２；配列番号４４；配列番号４６；配列番号４８；配列番号５０；配列番号５２；配列番号５４、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸をコードする核酸分子、特に、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；配列番号４９；配列番号５１；配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択される核酸分子。
（構成１４）
構成１～１２のいずれか一項記載の巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物、或いは構成１３記載の核酸を医薬ビヒクルとともに含む医薬組成物であって、さらなる異なる活性成分、特に、自己免疫疾患もしくはアレルギー疾患、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、癌疾患、慢性ウイルス感染、炎症性疾患、移植、呼吸器疾患、又は自己免疫に関与する細胞に対して、特に、治療的免疫モジュレーター作用を有する追加の化合物を任意に含む、前記医薬組成物。
（構成１５）
それを必要としている患者における併用治療レジメン又は追加治療レジメンにおける治療活性成分として使用するための、構成１～１２のいずれか一項記載の巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物、或いは構成１３記載の核酸、或いは構成１４記載の医薬組成物。
（構成１６）
移植を必要としている及び／又はもうすぐ移植を受ける患者、特に、ヒト患者、並びに／或いは移植を受けた患者並びに／或いは疾患、特に、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、もしくは狼瘡、又は炎症性疾患、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び脳脊髄炎、又はアレルギー疾患、又は癌疾患、又は呼吸器疾患、又は移植に関連する疾患を有するか、或いは該疾患のリスクがある患者の治療において使用するための、構成１～１２のいずれか一項記載の巨大分子、特に、抗体又はその抗原結合性断片もしくは模倣物、或いは構成１３記載の核酸、或いは構成１４記載の医薬組成物。
（構成１７）
配列番号１１６（もしくは配列番号８６）の配列並びに配列番号１１０（もしくは配列番号１１５）の配列及び／又は配列番号１１１（もしくは配列番号１１７）の配列を含むか又はこれらの配列からなる、特に、配列番号１１５の配列及び配列番号１１０（もしくは配列番号１１５）の配列及び配列番号１１１（もしくは配列番号１１７）の配列を含むか又はこれらの配列からなるヒトＣＤ１２７のエピトープ配列からなる抗原であって、
（ｉ）配列番号１１０を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を、Ｎ－末端の１アミノ酸を超えて、又はＣ－末端の７アミノ酸を超えて含むようには拡張せず；及び／又は
（ｉｉ）配列番号１１１を含むヒトＣＤ１２７のエピトープ配列が、ヒトＣＤ１２７の配列中の該配列に隣接するアミノ酸を、Ｎ－末端の３０アミノ酸を超えて、又はＣ－末端の３０アミノ酸を超えて含むようには拡張しない、
前記抗原。
（構成１８）
非ヒト動物を構成１７記載の抗原に対して免疫することを含む、抗体の製造方法。
（構成１９）
抗体、特に、構成１８記載のように得られる抗体、そのような抗体の抗原結合性断片もしくは模倣物、又は別の巨大分子を選択する方法であって、以下の工程：
ａ．ＣＤ１２７に対する、特に、構成１７記載のその抗原に対する該巨大分子の結合能を試験する工程；
ｂ．該巨大分子の存在によって誘導されるＣＤ１２７発現細胞におけるＣＤ１２７の内在化を試験する工程；
ｃ．該巨大分子によるＣＤ１２７発現細胞におけるＩＬ７誘導性のＣＤ１２７内在化の阻害を試験する工程；
ｄ．該巨大分子の存在下でＴＳＬＰによって誘導されるＤＣの成熟の増大を試験する工程；
のうちの少なくとも１つを含むか又はこれらの工程からなり、かつ任意に、以下の工程：
ｅ．該巨大分子によるＩＬ－７誘導性シグナル伝達、特に、ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害を試験する工程；
ｆ．該巨大分子によるＴＳＬＰ誘導性のＴＡＲＣ産生の阻害を試験する工程；
ｇ．該巨大分子によるα４、β７、及び／又はα４／β７インテグリン発現、特に、Ｔ－リンパ球での細胞表面発現の発現の阻害を試験する工程
のうちの１つ又は複数をさらに含む、
前記方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

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