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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-02
(45)【発行日】2023-08-10
(54)【発明の名称】腫瘍抗原に対するＬ２Ａ５抗体またはその機能的断片
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20230803BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230803BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230803BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230803BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230803BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230803BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230803BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230803BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230803BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230803BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230803BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230803BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230803BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12Q1/04
A61K39/395 T
A61P35/00
G01N33/53 S
G01N33/574 D
C12N15/13
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2020560859
(86)(22)【出願日】2019-01-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-07-01
(86)【国際出願番号】 PT2019000001
(87)【国際公開番号】W WO2019147152
(87)【国際公開日】2019-08-01
【審査請求日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】110526
(32)【優先日】2018-01-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(73)【特許権者】
【識別番号】520271403
【氏名又は名称】ウニベルシダーデ ノバ デ リジュボア
(73)【特許権者】
【識別番号】520271414
【氏名又は名称】インスティトゥート ポルトゥゲス デ オンコロジア ド ポルト エーフィジェ、エペエ
(73)【特許権者】
【識別番号】520271425
【氏名又は名称】ヘルムホルツ － ツェン － トゥルム ドレスデン － ロッセンドルフ － インスティトゥーテ オブ ラディオファーマシューティカル キャンサー リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ビデイラ、ポーラ アレクサンドラ キンテラ
(72)【発明者】
【氏名】ノボ、カルロス マヌエル メンデス
(72)【発明者】
【氏名】ローレイロ、リリアナ ラケル ロドリゲス
(72)【発明者】
【氏名】カラスカル、ミレーネ アデレイデ ド ロザリオ
(72)【発明者】
【氏名】フェレイラ、ホセ アレクサンドル リベイロ デ カストロ
(72)【発明者】
【氏名】パルマ、マリア アンジェリーナ デ サ
(72)【発明者】
【氏名】サントス、ルシオ ララ
(72)【発明者】
【氏名】リマ、ルイス カルロス オリベイラ
(72)【発明者】
【氏名】チャイ、ウェンガン
(72)【発明者】
【氏名】バックマン、マイケル
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－１９５６６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０５７９１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０４０５２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Loureiro, L. R. et al.，Challenges in Antibody Development against Tn and Sialyl-Tn Antigens，Biomolecules，5(3)，2015年08月11日，p.1783-1809
【文献】Tanaka, N et al.，Binding characteristics of an anti-Siaalpha2-6GalNAcalpha-Ser/Thr (sialyl Tn) monoclonal antibody (MLS132)，Eur J Biochem，263(1)，1999年07月，p.27-32
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／３０
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ｃ１２Ｑ １／０４
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
Ｃ１２Ｎ １５／１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の組合せを含む抗体であって、前記ＶＬが、配列番号６、８および１０にそれぞれ記載される、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２およびＬ－ＣＤＲ３を含み、かつ
前記ＶＨが、配列番号１２、１４および１６にそれぞれ記載される、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３を含み、前記抗体がシアリルＴｎ（ＳＴｎ）とα２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに結合する、
上記抗体。
【請求項2】
前記ＶＬが配列番号５、７および９を含み、かつ前記ＶＨが配列番号１１、１３および１５を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記ＶＬが配列番号４を含み、かつ前記ＶＨが配列番号３を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンが、ＳＴｎ、２，６－シアリルＴ、ジ－シアリルＴまたは２，６－シアロラクトサミンを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、グリコシル化部位でグリカン変化に供される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体が、その機能的抗体断片またはそのプローブであり、ＳＴｎとα２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項9】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体を使用して、対象の腫瘍を検出する方法であって、前記方法は、前記抗体の特異的結合に適した条件下において対象から得られた生物学的試料を請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体で染色する工程を含み、前記抗体の結合の存在または非存在が、細胞表面ＳＴｎ、２，６－シアリルＴ、ジ－シアリルＴまたは２，６－シアロラクトサミンを発現する腫瘍細胞の存在または非存在を示す、上記方法。
【請求項10】
前記生物学的試料が、単離された細胞、または組織、または腫瘍由来タンパク質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
医薬における使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項12】
がんの治療における使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項13】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項14】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１および／または配列番号２を含み、配列番号１がＨ－ＣＤＲ１の核酸配列ＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＣ（配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列）、Ｈ－ＣＤＲ２の核酸配列ＡＴＡＡＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴ（配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列）およびＨ－ＣＤＲ３の核酸配列ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号１６のアミノ酸配列をコードする核酸配列）を含み、かつ配列番号２がＬ－ＣＤＲ１の核酸配列ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣ（配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸配列）、Ｌ－ＣＤＲ２の核酸配列ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ（配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列）およびＬ－ＣＤＲ３の核酸配列ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列）を含む、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項15】
請求項１３または１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項16】
請求項１５に記載の宿主細胞を使用することを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌において同定された一群の抗原に対する抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブを提供する。
【背景技術】
【0002】
シアリルＴｎ（ＳＴｎ）は、ＧａｌＮＡｃ残基を介してα構成でポリペプチド鎖のセリン残基またはスレオニン残基にＯ結合したＮ‐アセチルガラクトサミンに結合したシアル酸、すなわち、Ｎｅｕ５Ａｃα－２，６ＧａｌＮＡｃからなる二糖である短いＯ‐グリカン抗原である。その意義は、正常な健康な組織には存在しないが、ほとんどすべての種類の癌腫に様々な頻度で検出されるという事実に関係している（Ｊｕｌｉｅｎ，Ｖｉｄｅｉｒａ，＆Ｄｅｌａｎｎｏｙ，２０１２）。さらに、ＳＴｎは、転移性、薬剤耐性および高悪性度の癌細胞の標的である。それらの興味を起こさせる特徴は以下の通りである。
１）ＳＴｎ発現と、ヒト癌細胞の発癌および転移能力ならびに癌開始細胞との関連（Ｏｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
２）ＳＴｎと、患者の予後不良、総生存率の低下および化学療法に対する応答の欠如との相関（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ならびに３）免疫防御からの回避（Ｃａｒｒａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
１）ＳＴｎ発現と、ヒト癌細胞の発癌および転移能力ならびに癌開始細胞との関連（Ｏｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
２）ＳＴｎと、患者の予後不良、総生存率の低下および化学療法に対する応答の欠如との相関（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ならびに３）免疫防御からの回避（Ｃａｒｒａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【0003】
α－２，６シアル酸は、典型的には癌バイオマーカーを終結させる。いくつかのタイプの癌では、短いα２，６シアリル化Ｏ‐グリカンが過剰発現している。それらは一般に、癌の進行および転移に関与している。さらに、それらは、シアル酸結合タンパク質（Ｓｉｇｌｅｃｓ）などの多くの免疫受容体による認識を通じて免疫回避に寄与する可能性がある（Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐａｕｌｓｏｎ，＆Ｖａｒｋｉ，２００７；Ｎｉｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【0004】
したがって、本発明は、癌バイオマーカーに特異的に結合する抗体、機能的抗体断片またはプローブを提供する。これらの抗体は、腫瘍細胞の特異的同定に加えて、免疫寛容を含め、腫瘍進行の根底にある機構に関与する、宿主細胞受容体によるそのようなリガンドの認識を遮断する可能性を有する。
【0005】
癌患者の治療に承認されている抗体は相当数ある（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／）。それらは以下を含む。
【0006】
１．癌特異的（関連）抗原を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）。組換えヒト化ｍＡｂ抗ＨＥＲ２トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））は、様々な科学刊行物、例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８：２８２５－２８３１に記載されている。抗ＨＥＲ２トラスツズマブは、乳癌患者のほぼ３０％に発現しているＨＥＲ２受容体を標的とする。特許国際公開第０１０５４２５号パンフレットは、抗ＨＥＲ２トラスツズマブ抗体に結合されたアルキル化アントラサイクリンを含む抗腫瘍組成物を記載している。ただし、これらの治療は限られた数の患者（乳癌患者の３０％）にしか利用できない。また、トラスツズマブ抗体が標的とするＨＥＲ２タンパク質は、心臓細胞などの関連する正常細胞にも発現し、これは、関連する心毒性の主な原因となる。本発明は、ＳＴｎ、またはα－２，６シアル酸により末端化されたグリカンの群により修飾された、様々なタイプの癌によって発現される、ＨＥＲ２を超えるさらに広範囲の多数の受容体を標的とする組換え抗体の開発を可能にする。これにより、さらに広範囲の癌患者群に対する治療法の開発が可能になる可能性がある。ＳＴｎ、およびα－２，６シアル酸により末端化されたグリカンの両方は、癌細胞によって高度に過剰発現されるため、特異性が高くなり、毒性が低下する可能性もある。
【0007】
２．免疫系の働きを停止させる分子を遮断するＭＡｂ。それらは免疫チェックポイント阻害剤と呼ばれ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を遮断する薬物を含む。ＰＤ－１阻害剤の例は、皮膚の黒色腫、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌およびホジキンリンパ腫の治療に承認されているペンブロリズマブ（キイトルーダ）およびニボルマブ（オプジーボ）である。ただし、免疫チェックポイントは即時の抗腫瘍応答をもたらさず、典型的にはアジュバント療法として使用される。また、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫系が体内のいくつかの正常な臓器を攻撃することを可能にし得、これにより、一部の人々に深刻な副作用を引き起こす可能性がある。
【0008】
３．癌細胞が分裂するために必要な細胞シグナル伝達を遮断するＭＡｂ。これらには、血管成長に影響を与えるＶＥＧＦを標的とするベバシズマブ（アバスチン（登録商標））と、細胞増殖に重要なＥＧＦＲと呼ばれる細胞タンパク質を標的とする抗体であるセツキシマブ（アービタックス（登録商標））とが含まれる。ただし、これらの抗体は細胞のシグナル伝達を遮断し、生理学的機構にも影響を及ぼし、高血圧、出血、血栓および腎障害などの毒性と関連している。
【0009】
腫瘍関連炭水化物抗原に対するヒト抗体をコードする核酸をクレームするいくつかの特許文献（欧州特許第２０１４３０２ Ａ１号明細書、国際公開第２０１５０５３８７１ Ａ４号パンフレット、米国特許第７４２３１２６ Ｂ２号明細書、欧州特許第２９９３１８４ Ａ１号明細書）がある。ただし、上記特許文献中のいずれの抗体も、本発明の抗体の標的であるＳＴｎ抗原を認識しない。
【0010】
特許出願欧州特許第２６８０００４（Ａ２）号明細書は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）またはＮ－グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を含有するＳＴｎ抗原を含むシアリル化グリカンに対する抗体をクレームしているが、本発明は、ＮｅｕＡｃを主に有するＳＴｎ抗原と、α－２，６シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的な抗体に関する。
【0011】
特許出願国際公開第１９９８０４６２４６ Ａ１号パンフレットおよび国際公開第１９９５０２９９２７ Ａ３号パンフレットは、２，６シアリルＴ抗原を含む腫瘍関連炭水化物抗原のα－Ｏ結合型複合糖質またはグリコシドを製造する方法をクレームする。癌を治療するための抗体を開発するために使用される可能性に言及しながら、これらの特許出願のいずれも、２，６‐シアリルＴ抗原を検出するための抗体配列を提供せず、本特許の主題である関連する２，６シアル酸含有抗原群も提供しない。
【0012】
ＮｅｕＧｃを含むシアル酸残基を認識するＩｇＭ抗体を特徴付けるカナダ特許第２７４３０３２ Ａ１号明細書、または脱Ｎ－アセチル化シアル酸に特異的に結合する抗体をクレームする米国特許第２０１６０１８４４５０ Ａ１号明細書および米国特許第８１４８３３５ Ｂ２号明細書、またはＮｅｕＧｃ構造を認識する抗体を含む欧州特許第２３０２３９０ Ａ１号明細書および米国特許第２０１２０１４２９０３ Ａ１号明細書特許出願などのいくつかの特許出願は、シアル酸残基に結合する抗体をクレームしている。一方、本発明は、ＧａｌＮＡｃ（ＳＴｎ抗原）に結合したＮｅｕＡｃだけでなく、α－２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群内のＮｅｕＡｃの構造も認識する抗体をクレームする。
【0013】
欧州特許第２２６１２５５ Ａ１号明細書特許出願は、単糖ＮｅｕＡｃを認識する、ニワトリにおける抗体の産生を記載し、米国特許第２０１１００３４６７６ Ａ１号明細書特許出願は、Ｎｅｕ５Ａｃ構造およびＮｅｕ５Ｇｃ構造の両方に対するポリクローナル抗体の産生および精製をクレームする。さらに、本発明は、オリゴ糖ＳＴｎ抗原と、α－２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とを標的とする、マウスにおいて産生されるｍＡｂをコードする核酸をクレームする。本発明は、正常細胞にも発現する単糖ＮｅｕＡｃだけでなく、腫瘍関連グリカンを区別することを可能にするため、これは利点である。
【0014】
さらに、米国特許第２０１０／００３４８２５ Ａ１号明細書特許出願は、長いＴｎ－またはＳＴｎ－ＭＵＣ１タンデムリピート糖ペプチドによる免疫化を使用する、ＭＵＣ１糖タンパク質に対する抗体の産生をクレームする。この研究は、標的構造が異なる、すなわち、ＭＵＣ１糖タンパク質を標的とし、グリカン構造を標的とせず、ＳＴｎもα－２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンも標的としないため、本発明とは異なる。
【0015】
国際公開第２０１６０５７９１６Ａ１号パンフレットの特許の抗体は、ＳＴｎ抗原を認識し、α－２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンを認識しない。
【0016】
上記によれば、腫瘍抗原は、正常細胞に同時に発現するため、腫瘍特異的でないことが多い。したがって、標的療法は、典型的には、オフターゲット効果のために関連する毒性を示す。腫瘍抗原は汎腫瘍抗原ではなく、特定のタイプまたはグレードの癌に限定される。したがって、標的療法は、典型的には、癌の特定のサブセットに限定される。
【0017】
その結果、癌細胞においてのみ同定された独特の抗原群に対する抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブを開発する必要がある。
【0018】
異なるタイプおよびサブタイプの癌細胞に過剰発現するＳＴｎ、２，６‐シアリルＴ、ジシアリルＴおよび２，６－シアロ－Ｎ－アセチルラクトサミンなどのシアリル化グリカンを標的とする抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブを産生することを可能にする独自の核酸配列は非常に重要である。
【0019】
本発明は、ＳＴｎと、α－２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに対するｍＡｂをコードするヌクレオチド配列に関する。これらの抗原は、癌では過剰発現されるが正常細胞では発現されない短鎖グリカンである。これらの抗原は免疫受容体のリガンドでもあり、腫瘍細胞に対する免疫系の活性を弱めるため、免疫チェックポイントのリガンドとも考えられ得る。
【0020】
説明
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とは、単一のＢ細胞クローンによって産生される抗体を指す。ＭＡｂは、Ｂ細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドであるハイブリドーマ、または免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする組換えＤＮＡを発現し、したがって単一の特異的抗体を産生する細胞株によっても産生され得る。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とは、単一のＢ細胞クローンによって産生される抗体を指す。ＭＡｂは、Ｂ細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドであるハイブリドーマ、または免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする組換えＤＮＡを発現し、したがって単一の特異的抗体を産生する細胞株によっても産生され得る。
【0021】
この抗体は細胞外環境に発現し、そこから精製される。
【0022】
抗体の特異性とは、１つの抗原、または特定のエピトープを共有する一群の抗原と反応するその能力である。抗原決定基としても知られているエピトープは、抗体によって認識される抗原の一部である。
【0023】
抗体はタンパク質の免疫グロブリンクラスに属し、２つの同一の重鎖（約５０～７０ｋＤａ）と２つの同一の軽鎖（約２５ｋＤａ）との集合体である。各重鎖または軽鎖のアミノ末端には、可変領域をコードする、１００～１３０個のアミノ酸の配列がある。各重鎖または軽鎖のカルボキシル末端には、定常領域をコードする配列がある。
各抗体は同じ抗原に２回結合する。すなわち、２価である。
各抗体は同じ抗原に２回結合する。すなわち、２価である。
【0024】
抗原結合断片（Ｆａｂ）とは、抗原に結合する抗体断片である。各Ｆａｂは、抗体の各重鎖および軽鎖からの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成されている。断片結晶化可能（Ｆｃ）領域は、２つの重鎖のカルボキシ末端の２つまたは３つのドメインから構成されている。Ｆａｂが抗原への結合を確実にするのに対して、Ｆｃ領域は各抗体がエフェクター免疫応答を引き起こすことを確実にする。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体、および補体タンパク質などの他の分子に結合し、食細胞による食作用を促進するオプソニン化、ナチュラルキラー細胞による細胞溶解、ならびに肥満細胞、好塩基球および好酸球の脱顆粒を含む様々な生理学的作用を媒介する。
【0025】
用語「可変ドメイン」または「可変領域」は、抗原と相互作用する、抗体の軽鎖または重鎖のアミノ末端部分である。それは、重鎖では約１２０～約１３０アミノ酸、軽鎖では約１００～約１１０アミノ酸の長さを有する。各可変領域の配列は、特に、特異的な抗原との相互作用に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）では実質的に変化する。ＣＤＲは、変化の少ないフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接している。軽鎖および重鎖のそれぞれのＣＤＲは３つである。ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は軽鎖内にある。ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３は重鎖内にある。
【0026】
「機能的抗体断片またはプローブ」という表現は、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含むか、抗体の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のいずれかを含む、抗体の一部である。機能的抗体断片またはプローブは、断片またはプローブが由来する最初の抗体の結合活性のほとんどまたは全部を保持する。そのような機能的抗体断片またはプローブは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびミニボディを含み得る。
【0027】
用語「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかである任意の長さのヌクレオチドの配列を指す。
【0028】
ヌクレオチド配列は転写されてｍＲＮＡを生成することができ、ｍＲＮＡは次いでポリペプチドおよび／またはその断片に翻訳される。
【0029】
本発明に由来する潜在的な治療とは、ＳＴｎの発現またはα－２，６シアリル化グリカンの群の発現に関連する疾患の治療、管理または改善に対する使用を指す。本実施形態では、可能な治療とは、その天然または改変された形態にある、本発明に由来する抗体、機能的抗体断片またはプローブを指す。
【0030】
また、疾患の治療、管理または改善のために有用であることがよく知られているか、そのために使用されてきたか、現在使用されている薬剤と組み合わせて、可能な治療を本発明に含めることができる。
【0031】
診断剤としての潜在的な使用とは、対象に投与した際に疾患の診断に役立つ物質を指す。そのような物質は、疾患の進行に由来するプロセスの疾患の局在を検出および／または定義するために使用することができる。また、特定の治療に対する応答または疾患の予後を予測するのに役立ち得る物質も含まれる。特定の実施形態では、診断剤の使用とは、本発明の抗体または機能的抗体断片またはプローブと、蛍光、酵素または二次抗体などのレポーター分子とのコンジュゲーションを意味する。
【0032】
シアリルＴｎ、別名、ＳＴｎ、シアロシルＴｎ、シアリル化Ｔｎ、Ｎｅｕ５Ａｃ－α２，６ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、または「表面抗原分類」命名法によりＣＤ１７５ｓとも呼ばれるものは、最も単純なシアリル化ムチン型Ｏ－グリカンである。ＳＴｎは、セリン／スレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）にＯ結合したＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）αに（炭素６を介して）結合したシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）α－２，６［Ｎｅｕ５Ａｃ－α２，６ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］を含む切断されたＯ－グリカンである。シアリル化は、ムチン型Ｏ－グリカンに通常見られる様々なコア構造の形成を防ぐ。
【0033】
ＳＴｎは、癌患者の有害転帰および予後不良に関連している。ＳＴｎ抗原の生合成は、シアリルトランスフェラーゼＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１の発現、およびＣＯＳＭＣ遺伝子のヘテロ接合性の変異または消失に関連している。
【0034】
ＳＴｎはヒトの癌腫の８０％超に発現しており、癌患者の予後不良に関連している。
【0035】
本発明は、抗体重鎖もしくは抗体軽鎖またはその機能的抗体断片もしくはプローブをコードするヌクレオチド配列を提供し、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる抗体重鎖もしくは抗体軽鎖またはその機能的抗体断片もしくはプローブは、表１および表２に列挙されるＣＤＲのうちの１つ以上を有する。ＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブは、ＳＴｎに、またはα－２，６シアリル化グリカンの群に特異的に結合することができる。具体的には、結合には、例Ｉで提供されるような特異性、親和性および／または結合活性が含まれる。
【0036】
別の態様では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその機能的断片は、補体依存性細胞傷害活性および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を含み得る。
【0037】
本発明の抗体の産生方法は、２つの細胞を融合してハイブリドーマを産生すること、宿主細胞に本発明のヌクレオチド配列を導入すること、本発明の抗体のコードされた重鎖および／または軽鎖または機能的断片を産生するための条件下で、かつそのために十分な時間にわたり宿主細胞を培養すること、および抗体または機能的断片の重鎖および／または軽鎖を精製することを含むことができる。
【0038】
ＳＴｎに、またはα－２，６シアリル化抗原の群に結合する、本発明の抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブの組換え発現には、本発明の抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブの重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの構築が含まれ得る。
【0039】
ベクターは、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。このようなベクターはまた、キメラ配列を起源とする他のコードヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ベクターは、本発明の抗体、その機能的抗体断片またはプローブのアミノ酸配列に続いて、重鎖全体もしくは軽鎖全体、または重鎖全体および軽鎖全体の両方を含むキメラタンパク質の発現を可能にする、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（国際公開第８６／０５８０７号パンフレットおよび国際公開第８９／０１０３６号パンフレット）を含み得る。
【0040】
発現ベクターは、トランスフェクション／形質導入技術によって宿主細胞に移入することができ、得られた細胞は、本発明の抗体またはその機能的断片を産生する。したがって、本発明は、本発明の抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブをコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を含む。
【0041】
宿主細胞は、挿入されたヌクレオチド配列に由来する産物の特徴を改変するように選択することができる。
【0042】
一実施形態では、これらの宿主細胞は、コードされたタンパク質に、グリコシル化部位もしくはリン酸化部位または他の改変を加えることができる。別の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質の正しいプロセシングおよび細胞移動／分泌を提供することができる。
【0043】
一本鎖断片可変抗体（ｓｃＦｖ）とは、リンカーを介して結合され、一価の抗原結合部位を形成するＶＬ領域およびＶＨ領域のみを含む機能的抗体断片を指す。ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディは、ｓｃＦｖの二量体、三量体または四量体を含む抗体であり、すなわち、それぞれ２つ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、同じであっても異なっていてもよい２つ、３つおよび４つの抗原結合部位をそれぞれ形成する。
【0044】
本発明の得られる抗体、その機能的抗体断片またはプローブは、１つ以上の結合部位を有し得る。複数の結合部位を含む場合、これらの部位は互いに同一であっても、異なっていてもよい。２つの異なる結合部位の場合、抗体、機能的抗体断片またはプローブは「二重特異性」抗体と呼ばれる。
【0045】
本発明の抗体の特異性を保持しながら、親和性を改善するＣＤＲ領域に変異を導入するために、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発を使用することができる。
【0046】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体、機能的抗体断片またはプローブは、１つ以上の診断剤または治療剤もしくは任意の他の所望の分子にコンジュゲートまたは融合される。得られたコンジュゲートされた抗体、機能的抗体断片またはプローブは、ＳＴｎまたはα－２，６シアリル化グリカンの発現に関連する疾患の発症、発現、進行および／または重症度のモニタリングまたは診断に有用であり得る。
【0047】
例として、限定するものではないが、細胞殺傷または他の効果を誘導するために、抗体が治療剤にコンジュゲートされ得る。治療剤は、化学療法薬；タキサン；代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、抗有糸分裂剤、ホルモン、ヌクレオシド類似体、キナーゼ阻害剤、放射性金属イオン、毒素、サイトカインまたは抗血管新生剤であり得る。
【0048】
本発明の抗体または機能的断片はまた、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリーならびにイムノブロッティングなどの従来の免疫組織学的方法またはイムノアッセイを使用して、任意の生物学的試料中のＳＴｎまたはα－２，６シアリル化グリカンの発現を検出するために使用され得る。
【0049】
有効濃度で提供される医薬組成物に、本発明の抗体、その機能的抗体断片またはプローブを単独で含めるか、コンジュゲートするか、組み合わせて、最小限の副作用で治療的に有用な効果をもたらすことができる。
【発明の概要】
【0050】
本発明は、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）と、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体、その機能的抗体断片またはプローブを提供する。
【0051】
抗体、その機能的抗体断片またはプローブは、抗原結合部位に結合する。可変重鎖および可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列の例は、それぞれ配列番号１および２である。
【0052】
抗体は、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）を含むムチンによりマウスを免疫化した後に得られた。ヌクレオチド配列は、Ｌ２Ａ５モノクローナル抗体に由来した。１つのヌクレオチド配列は、可変重（ＶＨ）鎖（配列番号１）を提供し、Ｈ－ＣＤＲ１（ＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＡＣ、アミノ酸配列番号１２）、Ｈ－ＣＤＲ２（ＡＴＡＡＡＣＴＡＣＧＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴ、アミノ酸配列番号１４）およびＨ－ＣＤＲ３（ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＣＴＡＣ、アミノ酸配列番号１６）を含む。１つのヌクレオチド配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）：Ｌ－ＣＤＲ１（ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣ、アミノ酸配列番号６）、Ｌ－ＣＤＲ２（ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ、アミノ酸配列番号８）およびＬ－ＣＤＲ３（ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧ、アミノ酸配列番号１０）を含む可変軽（ＶＬ）鎖（配列番号２）を提供する。
【0053】
軽鎖のＬ‐ＣＤＲ１、Ｌ‐ＣＤＲ２およびＬ‐ＣＤＲ３と重鎖のＨ‐ＣＤＲ１、Ｈ‐ＣＤＲ２およびＨ‐ＣＤＲ３との組合せは、二糖ＳＴｎ抗原を認識するだけでなく、意外にも、癌にも過剰発現される、α‐２，６シアル酸により末端化されたグリカンの群も認識するペプチド配列をコードする独自の配列を生成する。これらのペプチド配列は、追加の抗体、機能的抗体断片またはプローブを生成するために使用される。抗体、機能的抗体断片またはプローブによって認識されるグリカンのこの全体的な群は、
シアリルＴｎ：
ＮｅｕＡｃα－６ＧａｌＮＡｃα／β１－
２，６－シアリルＴ：
Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－
│
ＮｅｕＡｃα２－６
ジシアリルＴ：
ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－
│
ＮｅｕＡｃα２－６
２，６－シアロ－Ｎ－アセチルラクトサミン：
ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃβ１－を含む。
シアリルＴｎ：
ＮｅｕＡｃα－６ＧａｌＮＡｃα／β１－
２，６－シアリルＴ：
Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－
│
ＮｅｕＡｃα２－６
ジシアリルＴ：
ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－
│
ＮｅｕＡｃα２－６
２，６－シアロ－Ｎ－アセチルラクトサミン：
ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃβ１－を含む。
【0054】
そのような特異性を有する抗体は、現在の抗体および抗体ベースの抗癌療法とは対照的に、腫瘍特異性が高く、正常細胞に対する反応性が低いか存在しないため、特に興味深い。
【0055】
本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本明細書に提供される核酸配列を含むことができ、核酸配列は、抗体、機能的抗体断片またはプローブの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインをコードする。核酸配列の例は、それぞれ、配列番号１および２である。
【0056】
別の態様では、本発明は、対象の腫瘍を検出する方法に使用するための、ＳＴｎと、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体、その機能的抗体断片またはプローブを提供する。
【0057】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗体、機能的抗体断片またはプローブおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0058】
別の実施形態では、本発明は、細胞間相互作用または受容体－リガンド相互作用を遮断する抗体、機能的抗体断片またはプローブを含む医薬組成物を提供する。
【0059】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することにより、必要とする対象の疾患を治療または予防する方法を提供する。
【0060】
本開示は、本明細書の開示を限定することを意図せずに、理解を容易にするために、例示された実施形態の添付の図面を提示する。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】間接ＥＬＩＳＡを使用したＬ２Ａ５抗体の力価と動物ムチンへの結合とを示す。シアリダーゼを用いて前処理したか前処理していないウシ顎下ムチン（ＢＳＭ）の様々な被覆濃度を使用して、抗体滴定を行った。陰性対照としてリン酸緩衝液を使用し、陽性対照としてＢＳＭへの抗ＳＴｎ抗体Ｂ７２．３の結合を使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂの結合を検出した。
【図2】腫瘍細胞の細胞表面へのＬ２Ａ５の結合を示す。フローサイトメトリーによって、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１遺伝子を形質導入され、ひいてはＳＴｎ抗原を過剰発現する癌細胞株またはＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１遺伝子を形質導入していない癌細胞株（野生型）を使用して、Ｌ２Ａ５抗体の結合を評価した。図は、ＳＴｎ陽性およびＷＴ乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における相対細胞数Ｌ２Ａ５抗体の代表的なヒストグラムを示す。３Ｆ１抗体（抗ＳＴｎ抗体）を使用したか、二次抗マウスＩｇ－ＦＩＴＣ抗体（灰色のプロファイル）を使用した。シアリル化抗原への結合特異性を評価するために、シアリダーゼ処理によってＳＴｎ発現細胞株を脱シアリル化した。実線および破線は、それぞれシアリダーゼ未処理細胞およびシアリダーゼ処理済み細胞のヒストグラムを表す。Ｘ軸は、ＳＴｎ発現に関連する蛍光を表す。
【図3】膜結合タンパク質および組換えヒトムチン１（ＭＵＣ１）に対するＬ２Ａ５抗体の反応性を示す。ＳＴｎを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の膜抽出物に対する、およびＳＴｎ＋ヒトＩｇ Ｆｃ領域によって強く修飾されたＭＵＣ１のキメラタンパク質に対する抗ＳＴｎ抗体３Ｆ１およびＬ２Ａ５の結合のウエスタンブロット分析。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ＋膜抽出物（Ａ）およびキメラタンパク質ＭＵＣ１ ＳＴｎ－ＩｇＧ（Ｂ）を３Ｆ１抗体およびＬ２Ａ５抗体により染色した。未処理の膜抽出物およびキメラタンパク質（ＮＴ）のブロッティングに加えて、膜抽出物試料はシアリダーゼを使用した脱シアリル化であるか（Ｔ）、非グリコシル化ＭＵＣ１ ＳＴｎ－ＩｇＧタンパク質を使用した（Ｕｎｇ）。
【図4】パラフィン包埋膀胱癌における免疫組織化学によって測定されたＬ２Ａ５抗体の反応性を示しており、ａ）Ｌ２Ａ５（左）染色は高い伸展および強い強度を示しているのに対して、ＳＴｎにのみ結合するＢ７２．３（中央）ｍＡｂおよびＴＫＨ２（右）ｍＡｂは、低い感度、弱い強度での形質導入、および特異的染色の伸展の低下を示している。ｂ）利用可能な抗体と比較したＬ２Ａ５の感度。Ｌ２Ａ５（左）は、同じ領域で異なる反応性を示すＢ７２．３（中央）およびＴＫＨ２（右）とは異なり、減少した量の抗原（矢印）を認識する。Ｃ）抗体反応性における癌組織のシアリダーゼ処理の効果。シアリダーゼによる処理およびＬ２Ａ５とのインキュベーションの後、Ｌ２Ａ５によって付与された染色は完全に消失する。左：シアリダーゼを使用せず、右：シアリダーゼを使用。
【図5】パラフィン包埋結腸直腸癌における免疫組織化学によって測定されたＬ２Ａ５抗体の反応性を示す。図は、ＳＴｎ抗原に対する抗体と比較したＬ２Ａ５の反応性を示している。Ｌ２Ａ５（左）は、Ｂ７２．３（中央）およびＴＫＨ２（右）の反応性と比較すると、伸展および強度の点で反応性の増加を示している。
【図6】パラフィン包埋膀胱癌における免疫組織化学によるＬ２Ａ５抗体の反応性を示す。図は、Ｂ７２．３およびＴＫＨ２抗ＳＴｎ抗体と比較した場合のＬ２Ａ５抗体の高い特異性の免疫組織化学的証拠を示している。ａ）－転移性膀胱癌試料におけるＬ２Ａ５の腫瘍特異性。Ｌ２Ａ５は腫瘍細胞（矢印）に主に存在し、リンパ球集団、血管および結合組織には存在しない。ｂ）－正常な結腸直腸組織におけるＬ２Ａ５（左）抗体およびＢ７２．３（右）抗体の反応性。Ｌ２Ａ５は腸細胞（矢印、左）とのかすかな反応性を示し、Ｂ７２．３は杯細胞（右）と反応する。
【図7】Ｌ２Ａ５抗体が結合するグリカン抗原配列を示す。グリカンマイクロアレイ分析によってグリカン特異性を決定した。
【図8】本発明の目的である、Ｌ２Ａ５の核酸によってコードされるアミノ酸を含む部分から構成される標的モジュール（ＴＭ）のインビボ抗腫瘍能力を示す。Ｌ２Ａ５由来ＴＭは抗体断片であり、Ｌ２Ａ５と同じ反応性、すなわち抗ＳＴｎ ＴＭを有する。ＵｎｉＣＡＲ Ｔ細胞を介したＳＴｎ陽性細胞の殺傷は、標的特異的であり、ＴＭの存在に厳密に依存していた。
【図9】本発明の目的である、Ｌ２Ａ５の核酸によってコードされるアミノ酸を含む部分から構成される標的モジュール（ＴＭ）のインビボ抗腫瘍能力を示す。Ｌ２Ａ５由来ＴＭは抗体断片であり、Ｌ２Ａ５と同じ反応性、すなわち抗ＳＴｎ ＴＭを有する。ＳＴｎ＋腫瘍を発現する動物モデルへの抗ＳＴｎ ＴＭおよびＵｎｉＣＡＲ Ｔ細胞（Ｋｏｒｉｓｔｋａ ｅｔ ａｌ ２０１４）の養子移入は、ＳＴｎ陽性腫瘍の効果的かつＴＭ依存的な根絶を示す。図８は、ＳＴｎ抗原に特異的なＴＭを備えたＵｎｉＣＡＲ Ｔ細胞を使用すると、腫瘍細胞が死滅することを示す。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較検定とともに一元配置分散分析を使用して、統計分析を行った（＊＊ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【0062】
本発明は、ＳＴｎと、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体、その機能的抗体断片またはプローブを提供する。
【0063】
抗体、その機能的抗体断片またはプローブは、抗原結合部位に結合する。可変重鎖および可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列の例は、それぞれ配列番号１および２である。
【0064】
本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本明細書に提供される核酸配列を含むことができ、核酸配列は、抗体、機能的抗体断片またはプローブの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインをコードする。
【0065】
本発明はさらに、ＳＴｎと、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体、その機能的抗体断片またはプローブを産生するための組成物を提供する。
【0066】
組成物は、抗体、機能的抗体断片またはプローブの抗原結合部位をコードするヌクレオチド配列を含む。組成物は、可変重鎖および可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0067】
本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、本明細書に提供される核酸配列を含むことができ、核酸配列は、抗体、機能的抗体断片またはプローブの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインをコードする。
【0068】
別の態様では、本発明は、対象の腫瘍を検出する方法に使用するための、ＳＴｎと、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体、その機能的抗体断片またはプローブを提供する。
【0069】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗体、機能的抗体断片またはプローブをコードするヌクレオチド配列および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0070】
別の実施形態では、本発明は、細胞間相互作用または受容体－リガンド相互作用を遮断する抗体、機能的抗体断片またはプローブをコードするヌクレオチド配列を含む医薬組成物を提供する。
【0071】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することにより、必要とする対象の疾患を治療または予防する方法を提供する。
【0072】
該方法は、
ａ）ＳＴｎと、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体を用いて、腫瘍を有する可能性のある対象から得られた生物学的試料を染色する工程を含み、前述の染色は、ＳＴｎ、２，６－シアリルＴ、ジシアリルＴまたは２，６－シアロラクトサミン（ｓｉａｌｏｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）に対する抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブの特異的結合に適した条件下で行われ、
ｂ）抗体の結合の存在または非存在は、細胞表面ＳＴｎ、２，６－シアリルＴ、ジシアリルＴまたは２，６－シアロラクトサミンを発現する腫瘍細胞の存在または非存在を示す。
ａ）ＳＴｎと、α２，６－結合シアル酸により末端化されたグリカンの群とに特異的に結合する抗体を用いて、腫瘍を有する可能性のある対象から得られた生物学的試料を染色する工程を含み、前述の染色は、ＳＴｎ、２，６－シアリルＴ、ジシアリルＴまたは２，６－シアロラクトサミン（ｓｉａｌｏｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）に対する抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブの特異的結合に適した条件下で行われ、
ｂ）抗体の結合の存在または非存在は、細胞表面ＳＴｎ、２，６－シアリルＴ、ジシアリルＴまたは２，６－シアロラクトサミンを発現する腫瘍細胞の存在または非存在を示す。
【0073】
本明細書で使用される生物学的試料は、単離された細胞、または組織、または腫瘍由来タンパク質を含む。
【0074】
シアリル化グリカンは、その発現が無視できる程度であった対応する健常細胞と比較して、いくつかのタイプの癌細胞に過剰発現している。最も高いＳＴｎ頻度は、膵癌、結腸直腸癌および卵巣癌に見出され、そこでは癌細胞のほぼ１００％がＳＴｎを発現する（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１２）。膀胱癌での頻度は７５％である（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ ２０５）。肺腺癌は８０％近くを発現し、子宮頸癌、胆管細胞癌、食道癌、結腸癌および乳癌は５０～７０％の頻度を有する。さらに、ＳＴｎ過剰発現は発癌の早期に生じ、高い組織学的グレード分類に関与することが多い細胞分化の消失が、ＳＴｎ発現を正に調節する（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ）。
【0075】
シアリル化グリカンは、高い親和性および特異性を有する抗体、機能的抗体断片またはプローブによって標的化することができる。本発明はさらに、ＳＴｎと、α－２，６シアル酸により末端化されたグリカンの群とに結合する抗体、機能的抗体断片またはプローブを産生するための組成物を提供する。
【0076】
例Ｉに記載されているような方法を使用して、ヒツジ血清ムチンによる６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化によって、これらの組成物を得た。
【0077】
例ＩＩまたはＩＩＩまたはＶＩに記載されているような方法によって、ＳＴｎ陽性細胞株、ＳＴｎ陽性ムチンまたは細胞溶解物に対して反応性を示すマウス血清を選択した。ＳＴｎに対する反応性を有する血清を示すそれらの免疫化マウスから脾細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）と融合させて、抗体を発現する不死化ハイブリドーマ細胞を得た。
【0078】
例ＩＶに記載されているものなどのハイブリドーマ技術の方法は、当技術分野で十分に記載されている。
【0079】
例ＩＩまたはＩＩＩまたはＶＩに記載されているような方法により、ＳＴｎに対する抗体の存在についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。抗体の産生および特性評価のために、選択したハイブリドーマを増殖させた。得られたいくつかの抗ＳＴｎ ｍＡｂから、リード候補としてｍＡｂ Ｌ２Ａ５を選択し、その後の分析に使用した。例ＩＩに記載され、図１に示されている方法を使用して、ＳＴｎの含有量が高いムチンタンパク質に対する反応性と、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂの抗体価とを決定した。さらに、シアリダーゼ処理による脱シアリル化を行って、Ｌ２Ａ５抗体によるシアリル化構造の認識を評価した。図１に示すように、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂの反応性は、ｍＡｂ濃度とともに対数的に増大する。ＢＳＭに対する高い免疫反応性が観察され、６０００のエンドポイント力価に達した。さらに、シアリダーゼによる処理は、ＢＳＭに対するこの抗体の反応性の低下を明確に示し、シアリル化構造に対する特異的かつ依存的な結合を示した。例ＩＩに記載されているものと同様の方法であるが、ＳＴｎを有するムチンタンパク質を脱シアリル化（アシアロ）ムチンによって置換した方法では、Ｌ２Ａ５抗体が反応性を示さなかったことは注目に値する。
【0080】
シアリル化グリカンは癌細胞に過剰発現し、高い親和性および特異性を有する抗体、機能的抗体断片またはプローブによって標的化することができる。
【0081】
本発明は、ＳＴｎと、α－２，６シアル酸により末端化されたグリカンの群とに結合する抗体、その機能的抗体断片またはプローブを産生するための組成物を提供する。
【0082】
グリコシル化は、治療用ｍＡｂの品質および開発にとって重要である。グリコシル化パターンは、選択された発現系または培養条件によって変化し、これにより、その薬物動態および薬物動力に大きな影響を与える。したがって、分子の安全性および有効性を確保するには、グリコシル化の制御が不可欠である。治療的癌細胞標的化では、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）および直接細胞アポトーシスが効果にとって重要である。
【0083】
マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０で産生されたＭＡｂは、正常なヒトＩｇＧでは天然に見出されない糖を付加することができ、これにより、免疫原性の点で影響を与える。
【0084】
本発明の実施形態では、ＩｇＧ分子のグリカン組成の変化は、治療用抗体の効果を高めるために、マンノース残基、シアル酸残基、フコース残基およびガラクトース残基の操作を通じてグリコシル化部位Ａｓｎ８８およびＡｓｎ２９７で行われる（Ｌｉｍｉｎｇ Ｌｉｕ ２０１５における概説）。
【0085】
一実施形態では、非ヒト抗体をヒト化することができ、これは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）に含まれる元の非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）に由来する目的のアミノ酸配列を含むキメラ免疫グロブリンの構築を指す。ヒト化抗体では、ヒト抗体のＣＤＲアミノ酸残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、ＣＤＲ領域の全部またはほぼ全部は非ヒト抗体のＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部または一部はヒト免疫グロブリンのＦＲ領域である。
【0086】
一実施形態では、Ｔ細胞などの免疫細胞が、抗体（全部または一部）または抗体に結合する受容体、すなわちキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変される。ＣＡＲとは、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラ受容体を生成する分子である。一実施形態では、これらの改変Ｔ細胞の抗原認識ドメインは、腫瘍関連抗原に結合する。一実施形態では、それは、ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞の養子細胞移入に関する。
【0087】
限定するものではないが、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、特にＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系を使用してＣＡＲを発現するようにＴ細胞を特異的に操作することを含め、当技術分野で公知の様々な技術を使用して、ＣＡＲを産生することができる（国際公開第２０１４１９１１２８ Ａ１号パンフレット）。別の実施形態では、特定のヒト細胞表面タンパク質およびタグに特異的な結合部分から構成される標的モジュールが使用され、タグは、任意のヒト核タンパク質、好ましくはヒト核Ｌａタンパク質に由来する（国際公開第２０１６０３０４１４ Ａ１号パンフレット）。
【0088】
また、本発明の抗体または機能的断片をナノ粒子に結合し、リポソーム膜に挿入して、高体温療法に有用なアポトーシスおよび金属イオンを誘導するインサイチュ毒性化合物を送達するための特異的なベクターとして使用することができる。
【0089】
例Ｉに記載されているような方法を使用して、ヒツジ血清ムチンによる６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化によって、本発明の抗体、その機能的抗体断片またはプローブを産生するための組成物を得た。例ＩＩまたはＩＩＩまたはＶＩに記載されているような方法によって、ＳＴｎ陽性細胞株、ＳＴｎ陽性ムチンまたは細胞溶解物に対して反応性を示すマウス血清を選択した。ＳＴｎに対する反応性を有する血清を示すそれらの免疫化マウスから脾細胞を採取し、骨髄腫細胞と融合させて、抗ＳＴｎ抗体を発現する不死化ハイブリドーマ細胞を得た。例ＩＶに記載されているものなどのハイブリドーマ技術の方法は、当技術分野で十分に記載されている。例ＩＩまたはＩＩＩまたはＶＩに記載されているような方法により、ＳＴｎに対する抗体の存在についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。抗体の産生および特性評価のために、選択したハイブリドーマを増殖させた。得られたいくつかの抗ＳＴｎ ｍＡｂから、リード候補としてｍＡｂ Ｌ２Ａ５を選択し、その後の分析に使用した。例ＩＩに記載され、図１に示されている方法を使用して、ＳＴｎの含有量が高いムチンタンパク質に対する反応性と、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂの抗体価とを決定した。さらに、シアリダーゼ処理による脱シアリル化を行って、Ｌ２Ａ５抗体によるシアリル化構造の認識を評価した。図１に示すように、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂの反応性は、ｍＡｂ濃度とともに対数的に増大する。
【0090】
ＢＳＭに対する高い免疫反応性が観察され、６０００のエンドポイント力価に達した。さらに、シアリダーゼによる処理は、ＢＳＭに対するこの抗体の反応性の低下を明確に示し、シアリル化構造に対する特異的かつ依存的な結合を示した。例ＩＩに記載されているものと同様の方法であるが、ＳＴｎを有するムチンタンパク質を脱シアリル化（アシアロ）ムチンによって置換した方法では、Ｌ２Ａ５抗体が反応性を示さなかったことは注目に値する。
【0091】
例ＩＩＩに記載されている方法を使用することによって、生存可能なＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に対するＬ２Ａ５ ｍＡｂの結合を確認した。モデルとして、遺伝子ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１の過剰発現に起因してＳＴｎ抗原を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞を使用した。図２に示すように、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂは８０～８８％のＳＴｎ＋細胞に対して高い反応性を示す。シアリダーゼによる癌細胞株の処理後、反応性は相当低下した。また、図２に示すように、Ｌ２Ａ５は、ＳＴｎ抗原を発現しない野生型ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に対する結合を示さなかった。まとめると、これらの結果から、癌細胞表面に提示されたＳＴｎ抗原に対するＬ２Ａ５ ｍＡｂの特異性および選択性が確認された。また、図２に示すように、ＳＴｎとも反応する他の抗ＳＴｎ抗体は、癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と比較して、わずかに異なる結合プロファイルを示す。
【0092】
ＳＴｎ担持膜タンパク質に対するＬ２Ａ５ ｍＡｂの結合特異性を確認するために、例ＶＩに記載されているアッセイを行った。図３に示すように、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、したがってＳＴｎを過剰発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に由来するタンパク質と反応した。プロファイルは、２４５ｋＤａ超ならびに約１６０ｋＤａ、約８５ｋＤａ、約５０ｋＤａおよび約４０ｋＤａの分子量を有するタンパク質に対して反応性を示した。膜タンパク質の脱シアリル化後、反応性の低下または消失が観察され、シアリル化タンパク質に対するＬ２Ａ５ ｍＡｂの結合が確認されている。ＳＴｎ抗原を発現しない野生型癌細胞由来の膜タンパク質は、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂと陽性の反応性を示さなかった。また、図３に示すように、Ｌ２Ａ５はＭＵＣ１ ＳＴｎ－ＩｇＧ（約１８０ｋＤａ）に対して強固な結合を示したが、非グリコシル化ＭＵＣ１ ＳＴｎ－ＩｇＧに対する結合は示さなかった。まとめると、これらの結果は、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂが、ＳＴｎを発現する癌細胞の膜抽出物中のＳＴｎ抗原、およびＭＵＣ１などのＳＴｎキャリアタンパク質上のＳＴｎ抗原を認識することを示している。
【0093】
Ｌ２Ａ５および２つの抗ＳＴｎ ｍＡｂを用いて、１５例の膀胱腫瘍（８例の膀胱切除術および７例の転移）および１５例の結腸直腸腫瘍（腺癌および腺腫）を含む一連の３０例を染色した。図４に示すように、転移例に関して、膀胱腫瘍はいずれも、分析された全ｍＡｂに対して陽性であった。Ｌ２Ａ５、Ｂ７２．３およびＴＫＨ２ ｍＡｂについて、それらのうち３例は陽性であり、３例は陰性であった。１例は、他のｍＡｂではなく、Ｌ２Ａ５による染色の減少を示す。Ｌ２Ａ５では抗原検出の感度がわずかに高いことに留意されたい。図４に示すように、膀胱癌例では、ＴＫＨ２およびＢ７２．３は同様の反応性を示すが、Ｌ２Ａ５は比較的高い反応性を示す。この特異性および感度は、シアリダーゼによる癌組織の酵素処理後に消失した。
【0094】
図５に示すように、結腸直腸癌の全例は、抗ＳＴｎ ｍＡｂおよびＬ２Ａ５に対して陽性であったが、伸展および強度の点で異なるパターンを示した。Ｌ２Ａ５（左）の結合は、Ｂ７２．３（中央）またはＴＫＨ２（右）の染色パターンと比較して、ほとんどの病理組織（約７０％）で同様の強度および伸展を示している。
【0095】
図６ａ）に示すように、転移性膀胱癌試料では、Ｌ２Ａ５は腫瘍細胞と主に反応し、リンパ球集団、血管または結合組織とは反応しない。図６ｂ）（正常な結腸直腸癌組織）では、Ｌ２Ａ５（左）が腸細胞に非特異的な染色を示すのに対して、Ｂ７２．３（右）は杯細胞と反応する。
【0096】
膀胱腫瘍モデルでは、Ｌ２Ａ５染色は唯一の腫瘍性である。Ｌ２Ａ５は、低密度のＳＴｎを伴う浸潤部位および転移部位での付加的なスポットを含め、尿路上皮腫瘍細胞に特異的な染色を示す。
結腸直腸試料では、Ｌ２Ａ５は癌組織と反応するが、非病理組織とも反応する。染色は基本的に腸細胞に局在するが、Ｂ７２．３またはＴＫＨ２により得られた非特異的染色は杯細胞に存在する。結腸直腸試料では、Ｌ２Ａ５を用いて、Ｌ２Ａ５による異形成組織の弱い染色の存在を検出することができたが、染色の特異的な局在はなかった。
結腸直腸試料では、Ｌ２Ａ５は癌組織と反応するが、非病理組織とも反応する。染色は基本的に腸細胞に局在するが、Ｂ７２．３またはＴＫＨ２により得られた非特異的染色は杯細胞に存在する。結腸直腸試料では、Ｌ２Ａ５を用いて、Ｌ２Ａ５による異形成組織の弱い染色の存在を検出することができたが、染色の特異的な局在はなかった。
【0097】
さらに詳細に炭水化物結合特異性を調べるために、好適な固体表面に印刷された構造的に多様なグリカンプローブから構成されたグリカンマイクロアレイを使用して抗体を分析した。結果から、ＳＴｎの選択的認識による特異性が確認されたが、以下に対する結合も観察され、
シアリルＴｎ：
ＮｅｕＡｃα－６ＧａｌＮＡｃα１／β１
２，６－シアリルＴ：
Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－
│
ＮｅｕＡｃα２－６
ジシアリルＴ：
ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－ＡＯ
│
ＮｅｕＡｃα２－６
２，６－シアロラクトサミン：
ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃβ１
また、マイクロアレイに存在した他の抗原配列に対する結合は実質的に存在しない。結合された配列を図７に要約する。
シアリルＴｎ：
ＮｅｕＡｃα－６ＧａｌＮＡｃα１／β１
２，６－シアリルＴ：
Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－
│
ＮｅｕＡｃα２－６
ジシアリルＴ：
ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１－ＡＯ
│
ＮｅｕＡｃα２－６
２，６－シアロラクトサミン：
ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃβ１
また、マイクロアレイに存在した他の抗原配列に対する結合は実質的に存在しない。結合された配列を図７に要約する。
【0098】
Ｌ２Ａ５ ｍＡｂ軽鎖および重鎖のＣＤＲ（配列番号６、８、１０、１２、１４、１６）可変領域およびＦＲ（配列番号５、７、９、１１、１３、１５）可変領域のアミノ酸配列を決定するために、例ＩＸに記載されている方法を使用した。
【0099】
例
以下の例は、本開示の様々な態様の単なる例示として提供されており、決して本開示を限定するものと解釈されるべきではない。それらは、抗体の特性評価、選択および産生に関する。
以下の例は、本開示の様々な態様の単なる例示として提供されており、決して本開示を限定するものと解釈されるべきではない。それらは、抗体の特性評価、選択および産生に関する。
【0100】
例Ｉ
抗体産生－免疫化
抗体を産生する例示的な方法が提供されるが、他の任意の標準的な方法を使用することができる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生は、ハイブリドーマ技術に従って行った。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により１：１（Ｖ／Ｖ）で乳化したヒツジ顎下ムチン（ＯＳＭ）１０μｇを用いて、６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ，ＵＫ）を腹腔内免疫し、続いて不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により乳化したＯＳＭを２１日間間隔で２回追加注射した。マウスの頬から血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡによって、ＳＴｎ結合特異性について、採取した血清をスクリーニングした。血清が所望かつ特異的な免疫応答を示した場合、殺処分し脾臓を採取する３日前に、対応するマウスに対して最後のブースト注射を行う。
抗体産生－免疫化
抗体を産生する例示的な方法が提供されるが、他の任意の標準的な方法を使用することができる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生は、ハイブリドーマ技術に従って行った。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により１：１（Ｖ／Ｖ）で乳化したヒツジ顎下ムチン（ＯＳＭ）１０μｇを用いて、６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ，ＵＫ）を腹腔内免疫し、続いて不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により乳化したＯＳＭを２１日間間隔で２回追加注射した。マウスの頬から血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡによって、ＳＴｎ結合特異性について、採取した血清をスクリーニングした。血清が所望かつ特異的な免疫応答を示した場合、殺処分し脾臓を採取する３日前に、対応するマウスに対して最後のブースト注射を行う。
【0101】
例ＩＩ
ＥＬＩＳＡ
ＳＴｎ発現タンパク質であるウシ顎下ムチン（ＢＳＭ）に対するＥＬＩＳＡにより、マウス血清滴定と、ハイブリドーマ上清のスクリーニングとを決定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した５０μｌのＢＳＭ（３μｇ／ｍｌ）により９６ウェルプレートのウェルをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。シアリル化構造に対するスクリーニングしたハイブリドーマ上清の特異的結合を評価するために、シアリダーゼ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝６．０）で希釈した２５ｍＵ／ｍｌのクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（Ｒｏｃｈｅ）から得られた５０μｌのシアリダーゼをウェルのサブセットに加え、３７℃で９０分間インキュベートした。シアリダーゼ処理後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔ）を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した後、５％脱脂粉乳を用いて６０分間ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、希釈したマウス血清またはハイブリドーマ上清をウェルに加え、９０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでプレートを４回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ（１：１０００）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と６０分間インキュベートした。追加の３回の洗浄工程の後、５０μｌのテトラメチルベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）基質を各ウェルに加え、プレートを暗所でインキュベートし、５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍで光学密度を測定した。目的の抗体の最も高い力価を生じるマウスを融合のために選択した。ハイブリドーマ細胞の抗体産生をスクリーニングするために、同じ手順を行った。
ＥＬＩＳＡ
ＳＴｎ発現タンパク質であるウシ顎下ムチン（ＢＳＭ）に対するＥＬＩＳＡにより、マウス血清滴定と、ハイブリドーマ上清のスクリーニングとを決定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した５０μｌのＢＳＭ（３μｇ／ｍｌ）により９６ウェルプレートのウェルをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。シアリル化構造に対するスクリーニングしたハイブリドーマ上清の特異的結合を評価するために、シアリダーゼ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝６．０）で希釈した２５ｍＵ／ｍｌのクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（Ｒｏｃｈｅ）から得られた５０μｌのシアリダーゼをウェルのサブセットに加え、３７℃で９０分間インキュベートした。シアリダーゼ処理後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔ）を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した後、５％脱脂粉乳を用いて６０分間ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、希釈したマウス血清またはハイブリドーマ上清をウェルに加え、９０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでプレートを４回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ（１：１０００）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と６０分間インキュベートした。追加の３回の洗浄工程の後、５０μｌのテトラメチルベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）基質を各ウェルに加え、プレートを暗所でインキュベートし、５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍで光学密度を測定した。目的の抗体の最も高い力価を生じるマウスを融合のために選択した。ハイブリドーマ細胞の抗体産生をスクリーニングするために、同じ手順を行った。
【0102】
例ＩＩＩ
フローサイトメトリーの調製および分析
ＳＴｎおよび非ＳＴｎ発現親細胞を安定に発現するヒト膀胱細胞株およびヒト乳房細胞株を使用したフローサイトメトリーによって、抗体またはハイブリドーマ上清の結合を決定した。条件ごとに約３×１０５個の細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。シアリル化構造に対するスクリーニングされたハイブリドーマ上清および抗体の特異的結合を評価するために、１００ｍＵ／ｍｌのシアリダーゼを用いて、３７℃で９０分間試料を処理した。シアリダーゼ処理後、細胞を洗浄し、抗ＳＴｎ ｍＡｂ Ｂ７２．３、３Ｆ１、ＴＫＨ２、およびハイブリドーマ上清と４℃で３０分間インキュベートした。続く洗浄工程を行い、暗所で１５分間かけて、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇ（Ｄａｋｏ；希釈１：１０）を用いて一次抗体を検出した。洗浄後、各試料に対してフローサイトメーターを使用して、各試料からデータを取得した。
フローサイトメトリーの調製および分析
ＳＴｎおよび非ＳＴｎ発現親細胞を安定に発現するヒト膀胱細胞株およびヒト乳房細胞株を使用したフローサイトメトリーによって、抗体またはハイブリドーマ上清の結合を決定した。条件ごとに約３×１０５個の細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。シアリル化構造に対するスクリーニングされたハイブリドーマ上清および抗体の特異的結合を評価するために、１００ｍＵ／ｍｌのシアリダーゼを用いて、３７℃で９０分間試料を処理した。シアリダーゼ処理後、細胞を洗浄し、抗ＳＴｎ ｍＡｂ Ｂ７２．３、３Ｆ１、ＴＫＨ２、およびハイブリドーマ上清と４℃で３０分間インキュベートした。続く洗浄工程を行い、暗所で１５分間かけて、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇ（Ｄａｋｏ；希釈１：１０）を用いて一次抗体を検出した。洗浄後、各試料に対してフローサイトメーターを使用して、各試料からデータを取得した。
【0103】
例ＩＶ
抗体産生－ハイブリドーマ技術
免疫したマウスから得られた脾細胞とＳｐ２／０骨髄腫（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）細胞とを３：１の比で混合し、標準的なプロトコルを使用して、ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシドの存在下で融合させた。次いで、９６ウェル平底マイクロプレート（Ｏｒａｎｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に細胞を播種し、ＨＡＴ（１×１０－４Ｍヒポキサンチン、４×１０－７Ｍアミノプテリン、１．６×１０－５Ｍチミジン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．２ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地中で維持し、３７℃で７～１２日間インキュベートした。ＢＳＭに反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を増殖させ、間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、少なくとも３回の限界希釈法によりクローニングして、安定な単一クローン細胞株を得た。ＨＡＴを補充していない選択培地中で、選択したハイブリドーマを３７℃で培養した。シアリル化構造、特にＳＴｎに特異的な１つのハイブリドーマＬ２Ａ５を選択し、４回の限界希釈によりクローニングした。
抗体産生－ハイブリドーマ技術
免疫したマウスから得られた脾細胞とＳｐ２／０骨髄腫（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）細胞とを３：１の比で混合し、標準的なプロトコルを使用して、ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシドの存在下で融合させた。次いで、９６ウェル平底マイクロプレート（Ｏｒａｎｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に細胞を播種し、ＨＡＴ（１×１０－４Ｍヒポキサンチン、４×１０－７Ｍアミノプテリン、１．６×１０－５Ｍチミジン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．２ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地中で維持し、３７℃で７～１２日間インキュベートした。ＢＳＭに反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を増殖させ、間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、少なくとも３回の限界希釈法によりクローニングして、安定な単一クローン細胞株を得た。ＨＡＴを補充していない選択培地中で、選択したハイブリドーマを３７℃で培養した。シアリル化構造、特にＳＴｎに特異的な１つのハイブリドーマＬ２Ａ５を選択し、４回の限界希釈によりクローニングした。
【0104】
例Ｖ
ＳＴｎ発現の免疫組織化学分析
地方倫理委員会に従って、１５例の結腸直腸腫瘍（腺癌および腺腫）および１５例の膀胱腫瘍（８例の膀胱切除術および７例の転移）を含む一連の３０例を得た。さらに、腫瘍に隣接する正常な結腸直腸組織の５例を含めた。ビオチン／ストレプトアビジン系を使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、ＳＴｎについてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織をスクリーニングした。要約すると、キシレンを用いてＦＦＰＥ組織切片を脱パラフィンし、段階的な一連のアルコール洗浄により再水和し、最大出力定格で５分間溶液を予熱した後、マイクロ波内で１５分間クエン酸緩衝液ｐＨ６．０（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）を使用して熱誘導抗原回収に供した。切片を０．３％過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と２５分間インキュベートし、ＵＶ Ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）を用いてブロックし、抗ＳＴｎ ｍＡｂ Ｂ７２．３、ＴＫＨ２（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）およびＬ２Ａ５を入れた湿式チャンバー内で４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、組織切片に二次抗体を加えてからストレプトアビジンとインキュベートした。３，３’－ジアミノベンジジン（ＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）と４分間インキュベートすることによりＳＴｎを視覚化した。最後に、ヘマトキシリンを用いて核を１分間対比染色した。ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで１：５、１：５および１：３にそれぞれ希釈した抗ＳＴｎ ｍＡｂ Ｂ７２．３、ＴＫＨ２およびＬ２Ａ５ハイブリドーマ培養上清を使用して、ＳＴｎ発現を評価した。陽性対照切片および陰性対照切片を並行して試験した。一次抗体の非存在下で陰性対照切片を行った。陽性対照としてＳＴｎ＋腫瘍組織を使用した。腫瘍細胞内の褐色発色産物の顕微鏡的存在によって抗ＳＴｎ ＴＫＨ２抗体の免疫反応性が観察された場合、腫瘍を陽性として分類した。ＳＴｎ発現およびＬ２Ａ５染色は、２名の独立した観察者が二重盲検下で評価し、経験豊富な病理学者が検証した。意見の相違があった場合は常にスライドを再検討し、合意に達した。抗体特異性を評価するために、過酸化水素とのインキュベーション後にシアリダーゼ処理を行い、ＳＴｎ抗原からシアル酸を除去することにより、抗体による認識を阻害した。したがって、この酵素処理後の陽性染色（３７℃で４時間、０．２Ｕ／ｍＬ）は非特異的であると考えられた。
ＳＴｎ発現の免疫組織化学分析
地方倫理委員会に従って、１５例の結腸直腸腫瘍（腺癌および腺腫）および１５例の膀胱腫瘍（８例の膀胱切除術および７例の転移）を含む一連の３０例を得た。さらに、腫瘍に隣接する正常な結腸直腸組織の５例を含めた。ビオチン／ストレプトアビジン系を使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、ＳＴｎについてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織をスクリーニングした。要約すると、キシレンを用いてＦＦＰＥ組織切片を脱パラフィンし、段階的な一連のアルコール洗浄により再水和し、最大出力定格で５分間溶液を予熱した後、マイクロ波内で１５分間クエン酸緩衝液ｐＨ６．０（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）を使用して熱誘導抗原回収に供した。切片を０．３％過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と２５分間インキュベートし、ＵＶ Ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）を用いてブロックし、抗ＳＴｎ ｍＡｂ Ｂ７２．３、ＴＫＨ２（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）およびＬ２Ａ５を入れた湿式チャンバー内で４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、組織切片に二次抗体を加えてからストレプトアビジンとインキュベートした。３，３’－ジアミノベンジジン（ＩｍｍＰＡＣＴ（商標）ＤＡＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）と４分間インキュベートすることによりＳＴｎを視覚化した。最後に、ヘマトキシリンを用いて核を１分間対比染色した。ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで１：５、１：５および１：３にそれぞれ希釈した抗ＳＴｎ ｍＡｂ Ｂ７２．３、ＴＫＨ２およびＬ２Ａ５ハイブリドーマ培養上清を使用して、ＳＴｎ発現を評価した。陽性対照切片および陰性対照切片を並行して試験した。一次抗体の非存在下で陰性対照切片を行った。陽性対照としてＳＴｎ＋腫瘍組織を使用した。腫瘍細胞内の褐色発色産物の顕微鏡的存在によって抗ＳＴｎ ＴＫＨ２抗体の免疫反応性が観察された場合、腫瘍を陽性として分類した。ＳＴｎ発現およびＬ２Ａ５染色は、２名の独立した観察者が二重盲検下で評価し、経験豊富な病理学者が検証した。意見の相違があった場合は常にスライドを再検討し、合意に達した。抗体特異性を評価するために、過酸化水素とのインキュベーション後にシアリダーゼ処理を行い、ＳＴｎ抗原からシアル酸を除去することにより、抗体による認識を阻害した。したがって、この酵素処理後の陽性染色（３７℃で４時間、０．２Ｕ／ｍＬ）は非特異的であると考えられた。
【0105】
例ＶＩ
ウエスタンブロット（ＷＢ）
製造業者の指示に従って、膜タンパク質抽出キットを使用して細胞株から膜タンパク質を単離した。製造業者の推奨に従って、タンパク質アッセイキットを使用して、得られたタンパク質の量を推定した。膜タンパク質抽出物（５０μｇ）、またはＳＴｎ（１μｇ）（ＢＳＭおよびＭＵＣ１ ＳＴｎ－ＩｇＧ）を含有する精製タンパク質を変性させ、８％勾配アクリルアミドゲル上にロードし、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供し、標準手順に従ってフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ０．２μｍ ＰＶＤＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に電気泳動的に転写した。ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％（ＴＢＳ－Ｔ）中の１０％脱脂粉乳を用いてメンブレンを１時間ブロックした後、ＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗体抗ＳＴｎ Ｂ７２．３、３Ｆ１またはＬ２Ａ５上清と４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＴＢＳ－Ｔで１：２５００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇを１時間使用して、標識タンパク質を明らかにした。洗浄後、Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔウエスタンブロット基質（Ｒｏｃｈｅ）によって標識タンパク質を明らかにし、次いでＸ線フィルムに露光した。
ウエスタンブロット（ＷＢ）
製造業者の指示に従って、膜タンパク質抽出キットを使用して細胞株から膜タンパク質を単離した。製造業者の推奨に従って、タンパク質アッセイキットを使用して、得られたタンパク質の量を推定した。膜タンパク質抽出物（５０μｇ）、またはＳＴｎ（１μｇ）（ＢＳＭおよびＭＵＣ１ ＳＴｎ－ＩｇＧ）を含有する精製タンパク質を変性させ、８％勾配アクリルアミドゲル上にロードし、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供し、標準手順に従ってフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ０．２μｍ ＰＶＤＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に電気泳動的に転写した。ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％（ＴＢＳ－Ｔ）中の１０％脱脂粉乳を用いてメンブレンを１時間ブロックした後、ＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗体抗ＳＴｎ Ｂ７２．３、３Ｆ１またはＬ２Ａ５上清と４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＴＢＳ－Ｔで１：２５００に希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇを１時間使用して、標識タンパク質を明らかにした。洗浄後、Ｌｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔウエスタンブロット基質（Ｒｏｃｈｅ）によって標識タンパク質を明らかにし、次いでＸ線フィルムに露光した。
【0106】
例ＶＩＩ
ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ単離に１×１０６個～５×１０６個のハイブリドーマ細胞を使用した。細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、製造業者の指示に従って、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、抽出された全ＲＮＡを定量し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に記載されているように、最大２μｇを逆転写に使用した。２５℃で１０分間、その後３７℃で１２０分間および８５℃で５秒間の熱サイクル条件を使用して、ｃＤＮＡ合成を行った。反応を最後に保持し、４℃に冷却した。
ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ単離に１×１０６個～５×１０６個のハイブリドーマ細胞を使用した。細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、製造業者の指示に従って、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、抽出された全ＲＮＡを定量し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に記載されているように、最大２μｇを逆転写に使用した。２５℃で１０分間、その後３７℃で１２０分間および８５℃で５秒間の熱サイクル条件を使用して、ｃＤＮＡ合成を行った。反応を最後に保持し、４℃に冷却した。
【0107】
例ＶＩＩＩ
抗体配列決定－ｓｃＦｖ断片
プライマー対ＶＨ Ｆｏｒｗａｒｄ（ＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ）／ＶＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ（ＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴ）およびＶＬ Ｆｏｒｗａｒｄ（ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ）／ＶＬ Ｒｅｖｅｒｓｅ（ＴＴＴＴＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ）を使用して、ｃＤＮＡからＬ２Ａ５ ＭＡｂの可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを増幅した。ＰＣＲはいずれも、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ ２ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。９４℃で３分間の初期溶融、続いて９５℃で４５秒、７０℃で１分間および６８℃で２分間の熱サイクル条件を使用した。次いで、反応を６８℃で５分間保持し、４℃に冷却した。製造業者のプロトコルに従って、精製したＰＣＲ産物をさらにｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）クローニングベクターにクローニングした。製造業者のプロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｌｕｓ ｍｉｄｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してプラスミドを単離した。ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙベクター用のＴ７プロモータープライマーを使用して、Ｓｅｑｌａｂ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が配列決定を行った。
これらの組成物は、臨床用途および診断用途のために一貫した品質で製造することができる。
抗体配列決定－ｓｃＦｖ断片
プライマー対ＶＨ Ｆｏｒｗａｒｄ（ＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ）／ＶＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ（ＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴ）およびＶＬ Ｆｏｒｗａｒｄ（ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ）／ＶＬ Ｒｅｖｅｒｓｅ（ＴＴＴＴＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ）を使用して、ｃＤＮＡからＬ２Ａ５ ＭＡｂの可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを増幅した。ＰＣＲはいずれも、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ ２ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。９４℃で３分間の初期溶融、続いて９５℃で４５秒、７０℃で１分間および６８℃で２分間の熱サイクル条件を使用した。次いで、反応を６８℃で５分間保持し、４℃に冷却した。製造業者のプロトコルに従って、精製したＰＣＲ産物をさらにｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）クローニングベクターにクローニングした。製造業者のプロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｌｕｓ ｍｉｄｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してプラスミドを単離した。ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙベクター用のＴ７プロモータープライマーを使用して、Ｓｅｑｌａｂ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が配列決定を行った。
これらの組成物は、臨床用途および診断用途のために一貫した品質で製造することができる。
【0108】
例ＩＸ
抗体ドメイン
配列分析ツールＩｇＢＬＡＳＴを使用してＩＭＧＴ Ｖドメイン描写システム（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）を検索して、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂのＦＲドメインおよびＣＤＲドメインのアミノ酸配列をコードする可変重鎖（ＶＨ）ヌクレオチド配列および可変軽鎖（ＶＬ）ヌクレオチド配列を決定した。
抗体ドメイン
配列分析ツールＩｇＢＬＡＳＴを使用してＩＭＧＴ Ｖドメイン描写システム（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ；ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）を検索して、Ｌ２Ａ５ ｍＡｂのＦＲドメインおよびＣＤＲドメインのアミノ酸配列をコードする可変重鎖（ＶＨ）ヌクレオチド配列および可変軽鎖（ＶＬ）ヌクレオチド配列を決定した。
【0109】
例Ｘ
標的モジュールへの核酸のクローニング
記載されている通り（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ ２０１６）であるが、ＣＤＲ領域をＬＡ２５核酸配列に置き換えて、抗ＳＴｎ標的モジュール（ＴＭ）を行った。標準的なクロム放出アッセイを使用して、Ｔ細胞媒介腫瘍殺傷を測定した。ベクター対照（ＥＧＦＰマーカータンパク質のみをコードするベクター骨格）、ＵｎｉＣＡＲ Ｓｔｏｐ構築物（細胞内シグナル伝達ドメインを欠く）またはα－Ｅ５Ｂ９シグナル伝達構築物（ＵｎｉＣＡＲ ２８／ζ）（Ｍｉｔｗａｓｉ ２０１７）のいずれかを移植したＴ細胞と、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株およびＭＣＲ ＳＴｎ＋細胞株をインキュベートした。８０ｎＭの抗ＳＴｎ ＴＭ（ａ－ＳＴｎ ＴＭ）の存在下または非存在下で、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比で、それぞれ遺伝子操作されたＴ細胞とともに両細胞株を２４時間培養した。
標的モジュールへの核酸のクローニング
記載されている通り（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ ２０１６）であるが、ＣＤＲ領域をＬＡ２５核酸配列に置き換えて、抗ＳＴｎ標的モジュール（ＴＭ）を行った。標準的なクロム放出アッセイを使用して、Ｔ細胞媒介腫瘍殺傷を測定した。ベクター対照（ＥＧＦＰマーカータンパク質のみをコードするベクター骨格）、ＵｎｉＣＡＲ Ｓｔｏｐ構築物（細胞内シグナル伝達ドメインを欠く）またはα－Ｅ５Ｂ９シグナル伝達構築物（ＵｎｉＣＡＲ ２８／ζ）（Ｍｉｔｗａｓｉ ２０１７）のいずれかを移植したＴ細胞と、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株およびＭＣＲ ＳＴｎ＋細胞株をインキュベートした。８０ｎＭの抗ＳＴｎ ＴＭ（ａ－ＳＴｎ ＴＭ）の存在下または非存在下で、５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比で、それぞれ遺伝子操作されたＴ細胞とともに両細胞株を２４時間培養した。
【0110】
例ＸＩ
インビボ抗腫瘍活性
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ細胞を形質導入してホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現させ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ－Ｌｕｃ細胞を得た。記載されている通り（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ ２０１６）であるが、ＣＤＲ領域をＬＡ２５核酸配列に置き換えて、抗ＳＴｎ標的モジュール（ＴＭ）を行った。マウス１匹当たり、１．５×１０６個の腫瘍細胞と、１×１０６個のＵｎｉＣＡＲ ２８／ζ Ｔ細胞および１０μｇの抗ＳＴｎ ＴＭとを混合した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ－Ｌｕｃ細胞（１．５×１０６）を単独で、またはＴＭを含まない１×１０６個のＵｎｉＣＡＲ ２８／ζ Ｔ細胞と混合して、未処理対照として使用した。それぞれの混合物を雌ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスに皮下注射し、それぞれ５匹のマウスからなる３群の動物を得た。２００μＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（１５ｍｇ／ｍＬ）の腹腔内注射を０日目に開始し、続いて１日目、３日目、６日目および８日目に行った後に、麻酔したマウスの発光イメージングを１０分間行った。
インビボ抗腫瘍活性
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ細胞を形質導入してホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現させ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ－Ｌｕｃ細胞を得た。記載されている通り（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ ２０１６）であるが、ＣＤＲ領域をＬＡ２５核酸配列に置き換えて、抗ＳＴｎ標的モジュール（ＴＭ）を行った。マウス１匹当たり、１．５×１０６個の腫瘍細胞と、１×１０６個のＵｎｉＣＡＲ ２８／ζ Ｔ細胞および１０μｇの抗ＳＴｎ ＴＭとを混合した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＳＴｎ－Ｌｕｃ細胞（１．５×１０６）を単独で、またはＴＭを含まない１×１０６個のＵｎｉＣＡＲ ２８／ζ Ｔ細胞と混合して、未処理対照として使用した。それぞれの混合物を雌ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスに皮下注射し、それぞれ５匹のマウスからなる３群の動物を得た。２００μＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（１５ｍｇ／ｍＬ）の腹腔内注射を０日目に開始し、続いて１日目、３日目、６日目および８日目に行った後に、麻酔したマウスの発光イメージングを１０分間行った。
【0111】
本発明は、抗体市場および癌研究／開発分野の両方に新製品を提供する。
【0112】
本発明は、癌において同定された一群の抗原に対する抗体またはその機能的抗体断片もしくはプローブを産生するための組成物を提供する。
【0113】
表１は、それぞれ配列番号１および２として同定された、クローンＬ２Ａ５の可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖のヌクレオチド配列、ならびにそれぞれ配列番号３および４として同定された、可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖のコードされたアミノ酸配列の例を示す。
【表1】
【0114】
表２は、クローンＬ２Ａ５の６つのフレームワーク領域（ＦＲ）および６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２およびＨ－ＣＤＲ３、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）のコードされたアミノ酸配列を示し、配列番号５～１６のヌクレオチド配列として同定される。
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a)】
【図4b)】
【図4c)】
【図5】
【図6a)】
【図6b)】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】