ホーム > 特許ランキング > 学校法人 埼玉医科大学
特許7325075フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング剤、スクリーニング用キット、及びスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-03
(45)【発行日】2023-08-14
(54)【発明の名称】フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング剤、スクリーニング用キット、及びスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230804BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230804BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230804BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230804BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230804BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230804BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230804BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230804BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230804BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230804BHJP
C12N 5/0793 20100101ALN20230804BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230804BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20230804BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20230804BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230804BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
A61K45/00
A61K48/00
A61P3/10
C12N15/12
C07K14/705
C07K16/28
C12N5/071
C12N5/0793
C12N15/113 140Z
C12N15/115 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2018177931
(22)【出願日】2018-09-21
(65)【公開番号】P2020048426
(43)【公開日】2020-04-02
【審査請求日】2021-07-15
(73)【特許権者】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(72)【発明者】
【氏名】豊島 秀男
(72)【発明者】
【氏名】横尾 友隆
(72)【発明者】
【氏名】岡崎 康司
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５００２９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０９４１０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－１８３７６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－１７９５４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／００５３３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００６－５１６２５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２９８２００（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１７２７３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Int. J. Cancer，2013年，132(8)，pp.1731-1740
【文献】Biochem. Biophys. Res. Commun.，503(1)，2018年，pp.385-390，Epub 2018 Jun 15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、前記被験物質の有無に応じたフリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の増加、及びフリズルド３タンパク質の活性の増加よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する工程を含む、糖尿病予防若しくは治療用又はインスリン分泌促進用の、ランゲルハンス島β細胞の増殖促進剤及びランゲルハンス島β細胞のアポトーシス抑制剤を兼ねるランゲルハンス島β細胞の細胞数増加剤のスクリーニング方法。
【請求項2】
フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、前記被験物質の有無に応じたフリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の増加、及びフリズルド３タンパク質の活性の増加よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する工程を含む、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング方法であって、前記少なくとも１つの剤が、ランゲルハンス島β細胞の、増殖促進、及び、アポトーシス抑制、及び、細胞数増加による剤である、スクリーニング方法。
【請求項3】
前記フリズルド３タンパク質が下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質であり、前記フリズルド３遺伝子が下記（ｄ）及び（ｅ）のいずれかに記載の遺伝子である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長活性ないし誘導活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性及び／又はインスリン分泌促進活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｅ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長活性ないし誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング剤、スクリーニング用キット、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法、並びに、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリン分泌促進剤、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、及びインスリノーマ予防若しくは治療剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトＴＭ４ＳＦ２０として公知のポリペプチド又はそのフラグメントが膵臓β細胞の増加促進作用を持つことが知られ、このポリペプチド又はそのフラグメントは、膵臓β細胞の減少又は死滅を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に用いることが期待されている（特許文献１参照）。
ヒトＴＭ４ＳＦ２０のフラグメントである配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ベータジェニン（ｂｅｔａｇｅｎｉｎ）」ともいう。）が高い膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用を持ち、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つことが知られている（特許文献２参照）。
ヒトＴＭ４ＳＦ２０のフラグメントである配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ベータジェニン（ｂｅｔａｇｅｎｉｎ）」ともいう。）が高い膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用を持ち、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つことが知られている（特許文献２参照）。
【0003】
一方、いまだリガンドが同定されていないＧタンパク質共役型受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）が多数存在し、いわゆるオーファン（孤児）レセプター（Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれており、オーファンレセプターを標的としたアゴニスト又はアンタゴニストは新規の疾患治療薬として期待されている。
フリズルド３（Ｆｚｄ３；ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｃｌａｓｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）タンパク質は、ＧＰＣＲのクラスＦに分類されるオーファンレセプターとして知られ、全身で広く発現していることが示唆され、特に中枢神経系細胞で発現することが知られている（例えば、非特許文献１）。
フリズルド３（Ｆｚｄ３；ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｃｌａｓｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）タンパク質は、ＧＰＣＲのクラスＦに分類されるオーファンレセプターとして知られ、全身で広く発現していることが示唆され、特に中枢神経系細胞で発現することが知られている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２００９／０１３７９４号
【文献】国際公開第２０１４／１８９１２７号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７：４３２９５－４３３１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、フリズルド３タンパク質と膵島機能との関連性はこれまで知られていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング剤、該スクリーニング剤を含むスクリーニング用キット、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法、並びに、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリン分泌促進剤、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、及びインスリノーマ予防若しくは治療剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤の提供を目的とする。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング剤、該スクリーニング剤を含むスクリーニング用キット、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング方法、並びに、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリン分泌促進剤、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、及びインスリノーマ予防若しくは治療剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、オーファンレセプターの１つであるフリズルド３タンパク質がベータジェニンの受容体であることを見出し、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子がフリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニング剤になり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の通りである。
具体的には、本発明は以下の通りである。
【0008】
本発明の第１の態様は、
フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤のスクリーニング剤である。
フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤のスクリーニング剤である。
【0009】
本発明の第２の態様は、
フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング剤である。
フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング剤である。
【0010】
本発明の第３の態様は、
第１又は第２の態様に係るスクリーニング剤を含むスクリーニング用キットである。
第１又は第２の態様に係るスクリーニング剤を含むスクリーニング用キットである。
【0011】
本発明の第４の態様は、
フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含む、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤のスクリーニング方法である。
フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含む、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤のスクリーニング方法である。
【0012】
本発明の第５の態様は、
フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含む、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング方法である。
フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含む、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング方法である。
【0013】
本発明の第６の態様は、
フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーを含む、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤である。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーを含む、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤である。
【0014】
本発明の第７の態様は、
フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現の低下物質、又はフリズルド３タンパク質の阻害物質を含む、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、又はインスリノーマ予防若しくは治療剤であって、
前記低下物質が、フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のコーディング領域又は非翻訳領域の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである、剤である。
フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現の低下物質、又はフリズルド３タンパク質の阻害物質を含む、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、又はインスリノーマ予防若しくは治療剤であって、
前記低下物質が、フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のコーディング領域又は非翻訳領域の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである、剤である。
【発明の効果】
【0015】
第１及び第２の態様に係るスクリーニング剤並びに第３の態様に係るスクリーニング用キットは、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするため好適に使用し得る。
第４及び第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングすることができる。
本発明によれば、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤を提供し得る。
また、本発明によれば、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、又はインスリノーマ予防若しくは治療剤を提供し得る。
第４及び第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングすることができる。
本発明によれば、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤を提供し得る。
また、本発明によれば、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、又はインスリノーマ予防若しくは治療剤を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ベータジェニンに対する受容体の探索結果を示す図である。
【図2】フリズルド３とベータジェニンとの結合試験結果を示す図である。
【図3】ベータジェニンペプチドを用いたＦｚｄ３安定的発現細胞増殖試験結果を示す図である。
【図4】Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いたＦｚｄ３発現細胞増殖抑制試験結果を示す図である。
【図5】Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いたＦｚｄ３発現細胞増殖抑制試験結果を示す図である。
【図6】Ｆｚｄ３発現細胞「増加」試験結果を示す図である。
【図7】ベータジェニンペプチドを用いたＦｚｄ３発現細胞におけるシグナル伝達経路確認試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【0018】
まず、第１～７の態様におけるフリズルド３タンパク質若しくは遺伝子及びその取得方法について説明する。
（フリズルド３タンパク質）
フリズルド３タンパク質は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質
フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
配列番号１は、ヒトフリズルド３タンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスフリズルド３タンパク質のアミノ酸配列を表す。
（フリズルド３タンパク質）
フリズルド３タンパク質は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質
フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
配列番号１は、ヒトフリズルド３タンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスフリズルド３タンパク質のアミノ酸配列を表す。
【0019】
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９０％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上である。
配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、フリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
本明細書で言う「９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９０％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上である。
配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、フリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【0020】
従って、配列表の配列番号１又は２に記載したフリズルド３のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がフリズルド３の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異タンパク質がフリズルド３と同様にフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長ないし誘導活性を有するタンパク質であれば、これらは全てフリズルド３の範囲内に属する。
フリズルド３タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
フリズルド３タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
【0021】
（フリズルド３遺伝子）
フリズルド３タンパク質（例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てフリズルド３遺伝子に属する。
配列番号３は、ヒトフリズルド３遺伝子をコードする塩基配列を示す。
また、配列番号４は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｈｏｕｓｅ ｍｏｕｓｅ））フリズルド３遺伝子をコードする塩基配列を示す。
フリズルド３遺伝子には、アミノ酸をコードするコーディング領域（ＣＤＳ）及びアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれる。
ＵＴＲとしては、開始コドンより上流に５’ＵＴＲが存在し、終始コドンより下流に３’ＵＴＲが存在する。
配列番号３において、５３０～２５３０番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～５２９番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２５３１～１３８０４番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
配列番号４において、４６４～２４６４番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～４６３番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２４６５～１２７４２番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
フリズルド３タンパク質（例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てフリズルド３遺伝子に属する。
配列番号３は、ヒトフリズルド３遺伝子をコードする塩基配列を示す。
また、配列番号４は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｈｏｕｓｅ ｍｏｕｓｅ））フリズルド３遺伝子をコードする塩基配列を示す。
フリズルド３遺伝子には、アミノ酸をコードするコーディング領域（ＣＤＳ）及びアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）が含まれる。
ＵＴＲとしては、開始コドンより上流に５’ＵＴＲが存在し、終始コドンより下流に３’ＵＴＲが存在する。
配列番号３において、５３０～２５３０番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～５２９番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２５３１～１３８０４番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
配列番号４において、４６４～２４６４番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～４６３番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２４６５～１２７４２番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
【0022】
フリズルド３遺伝子の具体例としては、下記（ｄ）及び（ｅ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられ、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来の遺伝子をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、下記（ｄ）の遺伝子であることが好ましい。
（ｄ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｅ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長活性ないし誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｅ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつフリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長活性ないし誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【0023】
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、更に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号３又は４に記載したフリズルド３遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
上述の通り、配列表の配列番号３又は４に記載したフリズルド３遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、フリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）及び／又はインスリン分泌促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号３又は４に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、フリズルド３遺伝子の範囲内のものである。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号３又は４に記載したフリズルド３遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
上述の通り、配列表の配列番号３又は４に記載したフリズルド３遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、フリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）及び／又はインスリン分泌促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号３又は４に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、フリズルド３遺伝子の範囲内のものである。
【0024】
（フリズルド３遺伝子の取得）
フリズルド３遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１～４に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（フリズルド３遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、フリズルド３遺伝子を単離することができる。
ＰＣＲ法によりフリズルド３遺伝子を取得することもできる。例えば、ヒト培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号３又は４に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
フリズルド３遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１～４に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（フリズルド３遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、フリズルド３遺伝子を単離することができる。
ＰＣＲ法によりフリズルド３遺伝子を取得することもできる。例えば、ヒト培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号３又は４に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
【0025】
本明細書中上記した、配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、フリズルド３発現細胞の増殖活性、該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進活性及び／又は神経軸索成長活性ないし誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号３又は４に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号３又は４に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【0026】
＜フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング剤＞
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤、及びその候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
本明細書において、スクリーニングとは、被験物質の母集団を少なくとも絞ることを意味する。
フリズルド３タンパク質に対するアゴニストは、第１の態様に係るスクリーニング剤を用いて上記細胞数増加剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
フリズルド３タンパク質に対するアンタゴニストは、第１の態様に係るスクリーニング剤を用いて上記細胞数低下剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
第１の態様に係るスクリーニング剤に含まれる「フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子」は、フリズルド３発現細胞に含有される態様の「フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子」であってもよい。
本明細書において、「フリズルド３発現細胞」はフリズルド３遺伝子若しくはタンパク質を発現する細胞を意味し、フリズルド３タンパク質を発現する細胞が好ましく、フリズルド３タンパク質を細胞膜に発現する細胞がより好ましく、フリズルド３タンパク質を細胞膜表面に発現する細胞が更に好ましい。
フリズルド３発現細胞として具体的には、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等が挙げられる。
また、フリズルド３発現細胞としては、膵β細胞株ＭＩＮ６細胞であってもよいし、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現する細胞であってもよく、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現するようにした、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等であってもよい。
本願明細書において、「細胞数増加」は、細胞の増殖促進及び該細胞のアポトーシス抑制により細胞数が増加することを意味し、例えば、細胞の増殖促進作用があったとしても、それよりも強いアポトーシス、ネクローシス等の作用により該細胞数が総和として減少することは含まない意味である。
第１の態様に係るスクリーニング剤を用いてスクリーニングされた上記細胞数増加剤は、フリズルド３発現細胞の増殖促進、及び該細胞のアポトーシス抑制のいずれをも行うことができ、したがって、上記細胞数増加剤は該細胞の増殖促進剤及びアポトーシス抑制剤を兼ね得る。
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤、及びその候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
本明細書において、スクリーニングとは、被験物質の母集団を少なくとも絞ることを意味する。
フリズルド３タンパク質に対するアゴニストは、第１の態様に係るスクリーニング剤を用いて上記細胞数増加剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
フリズルド３タンパク質に対するアンタゴニストは、第１の態様に係るスクリーニング剤を用いて上記細胞数低下剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
第１の態様に係るスクリーニング剤に含まれる「フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子」は、フリズルド３発現細胞に含有される態様の「フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子」であってもよい。
本明細書において、「フリズルド３発現細胞」はフリズルド３遺伝子若しくはタンパク質を発現する細胞を意味し、フリズルド３タンパク質を発現する細胞が好ましく、フリズルド３タンパク質を細胞膜に発現する細胞がより好ましく、フリズルド３タンパク質を細胞膜表面に発現する細胞が更に好ましい。
フリズルド３発現細胞として具体的には、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等が挙げられる。
また、フリズルド３発現細胞としては、膵β細胞株ＭＩＮ６細胞であってもよいし、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現する細胞であってもよく、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現するようにした、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等であってもよい。
本願明細書において、「細胞数増加」は、細胞の増殖促進及び該細胞のアポトーシス抑制により細胞数が増加することを意味し、例えば、細胞の増殖促進作用があったとしても、それよりも強いアポトーシス、ネクローシス等の作用により該細胞数が総和として減少することは含まない意味である。
第１の態様に係るスクリーニング剤を用いてスクリーニングされた上記細胞数増加剤は、フリズルド３発現細胞の増殖促進、及び該細胞のアポトーシス抑制のいずれをも行うことができ、したがって、上記細胞数増加剤は該細胞の増殖促進剤及びアポトーシス抑制剤を兼ね得る。
【0027】
第１の態様に係るスクリーニング剤を用いてスクリーニングされた上記細胞数増加剤は、任意の投与法（例えば、経口、非経口）により投与することにより、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等の有用なフリズルド３発現細胞を生体内において増加し得る医薬品として用い得る。
また、上記細胞数増加剤は、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等の有用なフリズルド３発現細胞を生体から採取した後、生体外において、採取した上記フリズルド３発現細胞に上記細胞数増加剤を接触（例えば、添加、投与等）させることにより、上記フリズルド３発現細胞を増加させた後に、増加させた上記フリズルド３発現細胞を生体内に戻す再生ないし細胞医療に適用し得る。
また、上記細胞数増加剤は、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等の有用なフリズルド３発現細胞を生体から採取した後、生体外において、採取した上記フリズルド３発現細胞に上記細胞数増加剤を接触（例えば、添加、投与等）させることにより、上記フリズルド３発現細胞を増加させた後に、増加させた上記フリズルド３発現細胞を生体内に戻す再生ないし細胞医療に適用し得る。
【0028】
一方、第１の態様に係るスクリーニング剤を用いてスクリーニングされた上記細胞数低下剤は、任意の投与法（例えば、経口、非経口）により投与することにより、疾患により異常に増殖したフリズルド３発現細胞（例えば、インスリノーマにより異常に増殖したランゲルハンス島β細胞）の細胞数を生体内において低下し得る医薬品として用い得る。
【0029】
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞の細胞数の変化（例えば、増減）、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とするスクリーニング方法に好適に使用し得る。
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する工程を含むスクリーニング方法に使用することが好ましい。
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する工程を含むスクリーニング方法に使用することが好ましい。
【0030】
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞がランゲルハンス島β細胞である場合、被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質が非存在下の場合に対して、被験物質の存在下において、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の増加、及びフリズルド３タンパク質の活性の増加よりなる群から選択される少なくとも１つが検出される場合、糖尿病予防若しくは治療剤又はインスリン分泌促進剤をスクリーニングすることができる。
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞がランゲルハンス島β細胞である場合、被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質が非存在下の場合に対して、被験物質の存在下において、フリズルド３発現細胞の細胞数の低下、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の低下、及びフリズルド３タンパク質の活性の低下よりなる群から選択される少なくとも１つが検出される場合、インスリノーマ予防若しくは治療剤又はインスリン分泌抑制剤をスクリーニングすることができる。
第１の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞がランゲルハンス島β細胞である場合、被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質が非存在下の場合に対して、被験物質の存在下において、フリズルド３発現細胞の細胞数の低下、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の低下、及びフリズルド３タンパク質の活性の低下よりなる群から選択される少なくとも１つが検出される場合、インスリノーマ予防若しくは治療剤又はインスリン分泌抑制剤をスクリーニングすることができる。
【0031】
本発明は、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング剤に関するものでもあり、
第２の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤及びそれらの候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
第２の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤及びそれらの候補化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【0032】
第２の態様に係るスクリーニング剤は、フリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とするスクリーニング方法に使用されることが好ましく、フリズルド３発現細胞の増殖及び該細胞のアポトーシス抑制よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とするスクリーニング方法に使用されることがより好ましく、フリズルド３発現細胞の増加を指標とするスクリーニング方法に使用されることが更に好ましい。
第２の態様において、フリズルド３発現細胞としては、ランゲルハンス島β細胞等が挙げられる。
また、フリズルド３発現細胞としては、膵β細胞株ＭＩＮ６細胞であってもよいし、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現する細胞であってもよく、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現するようにした、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等であってもよい。
第２の態様において、フリズルド３発現細胞としては、ランゲルハンス島β細胞等が挙げられる。
また、フリズルド３発現細胞としては、膵β細胞株ＭＩＮ６細胞であってもよいし、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現する細胞であってもよく、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現するようにした、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等であってもよい。
【0033】
＜スクリーニング用キット＞
第３の態様に係るスクリーニング用キットは、第１又は第２の態様に係るスクリーニング剤を含む。
第３の態様に係るスクリーニング用キットは、第１又は第２の態様に係るスクリーニング剤を含むフリズルド３発現細胞であってもよい。
第３の態様に係るスクリーニング用キットは、第１又は第２の態様に係るスクリーニング剤を含む。
第３の態様に係るスクリーニング用キットは、第１又は第２の態様に係るスクリーニング剤を含むフリズルド３発現細胞であってもよい。
【0034】
第３の態様に係るスクリーニング用キットは、フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する手段を含んでいることが好ましい。
【0035】
被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する上記手段として、例えば、被検物質とフリズルド３との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する手段が挙げられる。
被検物質とフリズルド３との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する上記手段としては、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する手段として知られる任意の手段が挙げられる。
被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する手段としては、例えば、セカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋等）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）シグナル、βアレスチンシグナル等を蛍光ないし化学ルミネセンスにより検出若しくは定量して上記シグナル伝達活性化若しくは抑制を検出若しくは定量する手段が挙げられ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）若しくは生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を用いて検出若しくは定量する手段であってもよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／ｋａｗａｒａ＿１６０４＿ｐ３．ｐｄｆ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｌｉｔ／ｐｄｆ／ＰＫ０５１２－０２＿０２．ｐｄｆ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｇｐｃｒ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。また、蛍光又は化学ルミネセンス読み出しに基づいた細胞ｃＡＭＰのレベルを測定する市販されている機能アッセイキットに関する概説（Ｗ．Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，１６，６５５－６６５））に記載の手段、特開２００８－１５７９３９号公報に記載の手段、再表２０１５／１２８８９４号公報に記載の手段、国際公開第２０１２／１５７７４６号パンフレットに記載の手段、Ｉｎｏｕｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，１０２１－１０２９（２０１２）に記載の手段等も挙げられる。
被検物質とフリズルド３との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する上記手段としては、被検物質とＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する手段として知られる任意の手段が挙げられる。
被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する手段としては、例えば、セカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋等）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）シグナル、βアレスチンシグナル等を蛍光ないし化学ルミネセンスにより検出若しくは定量して上記シグナル伝達活性化若しくは抑制を検出若しくは定量する手段が挙げられ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）若しくは生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を用いて検出若しくは定量する手段であってもよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／ｋａｗａｒａ＿１６０４＿ｐ３．ｐｄｆ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｌｉｔ／ｐｄｆ／ＰＫ０５１２－０２＿０２．ｐｄｆ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｇｐｃｒ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。また、蛍光又は化学ルミネセンス読み出しに基づいた細胞ｃＡＭＰのレベルを測定する市販されている機能アッセイキットに関する概説（Ｗ．Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，１６，６５５－６６５））に記載の手段、特開２００８－１５７９３９号公報に記載の手段、再表２０１５／１２８８９４号公報に記載の手段、国際公開第２０１２／１５７７４６号パンフレットに記載の手段、Ｉｎｏｕｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，１０２１－１０２９（２０１２）に記載の手段等も挙げられる。
【0036】
第１及び第２の態様に係るスクリーニング剤並びに第３の態様に係るスクリーニング用キットに供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、抗体でもよいし、核酸分子でもよいし、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
被験物質は、好ましくは、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、抗体、又は核酸分子であり、経口投与性及び製造コストの観点から、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）がより好ましい。また、フリズルド３タンパク質、又はフリズルド３遺伝子に対して特異性が高い観点からは、抗体、低分子化合物又は核酸分子が好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマー、又はフリズルド３遺伝子（ＣＤＳ又はＵＴＲ）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子であることがより好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマーが更に好ましい。
被験物質は、好ましくは、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、抗体、又は核酸分子であり、経口投与性及び製造コストの観点から、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）がより好ましい。また、フリズルド３タンパク質、又はフリズルド３遺伝子に対して特異性が高い観点からは、抗体、低分子化合物又は核酸分子が好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマー、又はフリズルド３遺伝子（ＣＤＳ又はＵＴＲ）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子であることがより好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマーが更に好ましい。
【0037】
＜フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング方法＞
第４の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含み、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤、及びその候補化合物をスクリーニングすることができる。
フリズルド３タンパク質に対するアゴニストは、第４の態様に係るスクリーニング方法において上記細胞数増加剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
第４の態様に係るスクリーニング方法においてスクリーニングされた上記細胞数増加剤は、フリズルド３発現細胞の増殖促進、及び該細胞のアポトーシス抑制のいずれをも行うことができ、したがって、上記細胞数増加剤は該細胞の増殖促進剤及びアポトーシス抑制剤を兼ね得る。
フリズルド３タンパク質に対するアンタゴニストは、第１の態様に係るスクリーニング方法において上記細胞数低下剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
フリズルド３発現細胞として具体的には、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等が挙げられる。
また、フリズルド３発現細胞としては、膵β細胞株ＭＩＮ６細胞であってもよいし、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現する細胞であってもよく、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現するようにした、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等であってもよい。
第４の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含み、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤又は低下剤、及びその候補化合物をスクリーニングすることができる。
フリズルド３タンパク質に対するアゴニストは、第４の態様に係るスクリーニング方法において上記細胞数増加剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
第４の態様に係るスクリーニング方法においてスクリーニングされた上記細胞数増加剤は、フリズルド３発現細胞の増殖促進、及び該細胞のアポトーシス抑制のいずれをも行うことができ、したがって、上記細胞数増加剤は該細胞の増殖促進剤及びアポトーシス抑制剤を兼ね得る。
フリズルド３タンパク質に対するアンタゴニストは、第１の態様に係るスクリーニング方法において上記細胞数低下剤及びその候補化合物としてスクリーニングされ得る。
フリズルド３発現細胞として具体的には、ランゲルハンス島β細胞、中枢神経系細胞等が挙げられる。
また、フリズルド３発現細胞としては、膵β細胞株ＭＩＮ６細胞であってもよいし、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現する細胞であってもよく、遺伝子組み換え技術によりフリズルド３を発現するようにした、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等であってもよい。
【0038】
本発明は、フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含む、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤のスクリーニング方法に関するものでもあり、
第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤並びにそれらの候補化合物をスクリーニングし得る。
第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子を用いる工程を含み、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤並びにそれらの候補化合物をスクリーニングし得る。
【0039】
第４及び第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とすることが好ましい。
フリズルド３タンパク質の活性としては、フリズルド３発現細胞の増殖活性及び／又は該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進、神経軸索成長活性ないし誘導活性等が挙げられる。
フリズルド３タンパク質の活性としては、フリズルド３発現細胞の増殖活性及び／又は該細胞のアポトーシス抑制活性（好ましくは、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加活性）、インスリン分泌促進、神経軸索成長活性ないし誘導活性等が挙げられる。
【0040】
第４及び第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞がランゲルハンス島β細胞である場合、被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質が非存在下の場合に対して、被験物質の存在下において、フリズルド３発現細胞の細胞数の増加、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の増加、及びフリズルド３タンパク質の活性の増加よりなる群から選択される少なくとも１つが検出される場合、糖尿病予防若しくは治療剤又はインスリン分泌促進剤をスクリーニングすることができる。
上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前の系（例えば、野生型）、又は陰性対照（フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は機能に影響しない物質を投与した対照）の系）におけるフリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は活性に対して、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがより好ましい。
上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前の系（例えば、野生型）、又は陰性対照（フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は機能に影響しない物質を投与した対照）の系）におけるフリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は活性に対して、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがより好ましい。
【0041】
第４及び第５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞がランゲルハンス島β細胞である場合、被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質が非存在下の場合に対して、被験物質の存在下において、フリズルド３発現細胞の細胞数の低下、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の低下、及びフリズルド３タンパク質の活性の低下よりなる群から選択される少なくとも１つが検出される場合、インスリノーマ予防若しくは治療剤又はインスリン分泌抑制剤をスクリーニングすることができる。
上記低下の程度としては統計的に有意な低下であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前の系（例えば、野生型）、又は陰性対照（フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は機能に影響しない物質を投与した対照）の系）におけるフリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は活性に対して、１／２以下であることが好ましく、１／４以下であることがより好ましく、１／１０以下であることがさらに好ましく、発現又は活性がなくなることが特に好ましい。
上記低下の程度としては統計的に有意な低下であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前の系（例えば、野生型）、又は陰性対照（フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は機能に影響しない物質を投与した対照）の系）におけるフリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現又は活性に対して、１／２以下であることが好ましく、１／４以下であることがより好ましく、１／１０以下であることがさらに好ましく、発現又は活性がなくなることが特に好ましい。
【0042】
スクリーニング方法としては、上記を指標とする限り、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）等の任意のスクリーニング方法であってもよい。
スクリーニング方法の好ましい一例としては、フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出することが挙げられる。
スクリーニング方法の好ましい一例としては、フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出することが挙げられる。
【0043】
フリズルド３タンパク質の活性の変化の分析としては、例えば、上記被験物質の非投与下における任意の組織におけるフリズルド３発現細胞の細胞数に対する上記被験物質の投与下におけるフリズルド３発現細胞の細胞数の変化を測定することにより分析することができる。
フリズルド３タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ノザンブロット、サザンブロット又はＲＴ－ＰＣＲ等の常法により行うことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
また、フリズルド３タンパク質の発現量の測定は、抗体を用いたウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
フリズルド３タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ノザンブロット、サザンブロット又はＲＴ－ＰＣＲ等の常法により行うことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
また、フリズルド３タンパク質の発現量の測定は、抗体を用いたウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
【0044】
また、フリズルド３遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、インシリコでも各種のヒト組織におけるフリズルド３遺伝子の発現を検出することができる。また、インビボ、インビトロでも、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利用することにより、各種のヒト組織におけるフリズルド３遺伝子の発現を検出することができる。フリズルド３遺伝子の発現の検出は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノザンブロット、サザンブロット等の常法により行うことができる。
【0045】
ＰＣＲを行なう場合、プライマーは、フリズルド３遺伝子のみを特異的に増幅できるものであれば特に限定されず、フリズルド３遺伝子の配列情報に基づき適宜設定することができる。例えば、フリズルド３遺伝子又は上記遺伝子の発現制御領域の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用することができる。より具体的には、フリズルド３遺伝子又は上記遺伝子の発現制御領域の塩基配列中の連続した１０～６０残基、好ましくは１０～４０残基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【0046】
上記したオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機を用いて常法により製造することができる。該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、例えば、検出したいｍＲＮＡの一部の塩基配列において、５’末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー、３’末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等を挙げることができる。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、それぞれの融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドであって、１０～６０塩基程度のものが挙げられる、１０～４０塩基程度のものが好ましい。また、本発明においては、上記したオリゴヌクレオチドの誘導体を用いることも可能であり、例えば、該オリゴヌクレオチドのメチル体やホスホロチオエート体等を用いることもできる。
【0047】
第４及び５の態様に係るスクリーニング方法は、フリズルド３発現細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する工程を含むことが好ましい。
【0048】
被験物質の有無に応じたフリズルド３発現細胞の細胞数の変化、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子の発現の変化、及びフリズルド３タンパク質の活性の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを検出する方法として、例えば、被検物質とフリズルド３との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する方法が挙げられる。
被検物質とフリズルド３との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する上記方法としては、被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する方法として知られる任意の方法が挙げられる。
被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する方法としては、例えば、セカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋等）、ＰＫＡシグナル、βアレスチンシグナル等を蛍光ないし化学ルミネセンスにより検出若しくは定量して上記シグナル伝達活性化若しくは抑制を検出若しくは定量する方法が挙げられ、ＦＲＥＴ若しくはＢＲＥＴを用いて検出若しくは定量する手段であってもよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／ｋａｗａｒａ＿１６０４＿ｐ３．ｐｄｆ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｌｉｔ／ｐｄｆ／ＰＫ０５１２－０２＿０２．ｐｄｆ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｇｐｃｒ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。また、蛍光又は化学ルミネセンス読み出しに基づいた細胞ｃＡＭＰのレベルを測定する市販されている機能アッセイキットに関する概説（Ｗ．Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，１６，６５５－６６５））に記載の方法、特開２００８－１５７９３９号公報に記載の手段、再表２０１５／１２８８９４号公報に記載の方法、国際公開第２０１２／１５７７４６号パンフレットに記載の手段、Ｉｎｏｕｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，１０２１－１０２９（２０１２）に記載の方法等も挙げられる。
被検物質とフリズルド３との結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する上記方法としては、被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する方法として知られる任意の方法が挙げられる。
被検物質とＧＰＣＲとの結合により誘導されるシグナル伝達活性化若しくは抑制を検出する方法としては、例えば、セカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋等）、ＰＫＡシグナル、βアレスチンシグナル等を蛍光ないし化学ルミネセンスにより検出若しくは定量して上記シグナル伝達活性化若しくは抑制を検出若しくは定量する方法が挙げられ、ＦＲＥＴ若しくはＢＲＥＴを用いて検出若しくは定量する手段であってもよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｄｆ／ｋａｗａｒａ＿１６０４＿ｐ３．ｐｄｆ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ／ｌｉｔ／ｐｄｆ／ＰＫ０５１２－０２＿０２．ｐｄｆ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｇｐｃｒ－ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。また、蛍光又は化学ルミネセンス読み出しに基づいた細胞ｃＡＭＰのレベルを測定する市販されている機能アッセイキットに関する概説（Ｗ．Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，１６，６５５－６６５））に記載の方法、特開２００８－１５７９３９号公報に記載の手段、再表２０１５／１２８８９４号公報に記載の方法、国際公開第２０１２／１５７７４６号パンフレットに記載の手段、Ｉｎｏｕｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，１０２１－１０２９（２０１２）に記載の方法等も挙げられる。
【0049】
第４及び第５の態様に係るスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、抗体でもよいし、核酸分子でもよいし、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
被験物質は、好ましくは、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、抗体、又は核酸分子であり、経口投与性及び製造コストの観点から、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）がより好ましい。また、フリズルド３タンパク質、又はフリズルド３遺伝子に対して特異性が高い観点からは、抗体、低分子化合物又は核酸分子が好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマー、又はフリズルド３遺伝子（ＣＤＳ又はＵＴＲ）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子であることがより好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマーが更に好ましい。
被験物質は、好ましくは、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、抗体、又は核酸分子であり、経口投与性及び製造コストの観点から、低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）がより好ましい。また、フリズルド３タンパク質、又はフリズルド３遺伝子に対して特異性が高い観点からは、抗体、低分子化合物又は核酸分子が好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマー、又はフリズルド３遺伝子（ＣＤＳ又はＵＴＲ）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子であることがより好ましく、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体若しくはアプタマーが更に好ましい。
【0050】
＜フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤＞
第６の態様に係るフリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤（以下、単に「第６の態様に係る剤」ともいう。）は、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーを含む。
上記抗体又はアプタマーは、フリズルド３タンパク質に選択的に結合し、かつアゴニストとして作用する抗体又はアプタマーが好ましく、フリズルド３タンパク質のリガンド結合部位に選択的に結合し、かつアゴニストとして作用する抗体又はアプタマーがより好ましい。
第６の態様に係るフリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤（以下、単に「第６の態様に係る剤」ともいう。）は、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーを含む。
上記抗体又はアプタマーは、フリズルド３タンパク質に選択的に結合し、かつアゴニストとして作用する抗体又はアプタマーが好ましく、フリズルド３タンパク質のリガンド結合部位に選択的に結合し、かつアゴニストとして作用する抗体又はアプタマーがより好ましい。
【0051】
（抗体）
上記フリズルド３タンパク質に特異的に結合でき、かつアゴニストとして作用する抗体であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ポリクローナル抗体は、抗原（フリズルド３タンパク質）を免疫した動物から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原（フリズルド３タンパク質）を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗原は、各種ヒト培養細胞からフリズルド３タンパク質を精製するか、フリズルド３タンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することにより調製できる。また、抗原は、フリズルド３タンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原をウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
上記フリズルド３タンパク質に特異的に結合でき、かつアゴニストとして作用する抗体であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ポリクローナル抗体は、抗原（フリズルド３タンパク質）を免疫した動物から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原（フリズルド３タンパク質）を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗原は、各種ヒト培養細胞からフリズルド３タンパク質を精製するか、フリズルド３タンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することにより調製できる。また、抗原は、フリズルド３タンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原をウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
【0052】
抗原の投与は、１回目の投与の後１～２週間おきに３～１０回行うことができる。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫測定法等に従い、抗体価を測定することにより調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示す非ヒト哺乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源として使用することができる。ポリクローナル抗体は、上記の血清を分離、精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を使用することができ、特に好ましくは脾細胞を使用することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を使用することができ、特に好ましくは脾細胞を使用することができる。
【0053】
骨髄腫細胞としては、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であるＰ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）株［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１－７（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）株［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１－５１９（１９７６）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）株［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９－２７０（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）株［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８－１５５０（１９７９）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）株［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５－４９７（１９７５）］等のマウス由来の株化細胞を用いることができる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地］に懸濁したのち、７～１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地］に懸濁したのち、７～１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる。
【0054】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ－セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ若しくはＧ－カラム、若しくはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等による方法を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
【0055】
抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト化抗体を用いることが好ましい。これらのヒト型化抗体やヒト化抗体は、トランスジェニックマウスなどの哺乳動物を用いて作製することができる。ヒト型化抗体については、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）〕、野口浩〔医学のあゆみ １６７：４５７－４６２（１９９３）〕に記載されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
【0056】
上記した抗体のうち、フリズルド３タンパク質に特異的に結合し、かつアゴニストとして作用し得る抗体は、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤として使用することができる。
【0057】
フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤として抗体を医薬組成物の形態で使用する場合には、上記抗体を有効成分として使用し、さらに薬学的に許容可能な担体、希釈剤（例えば、免疫原性アジュバントなど）、安定化剤または賦形剤などを用いて医薬組成物を調製することができる。抗体を含むフリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアルまたは安定化水性調製物中に投薬形態に製剤化することができる。
【0058】
（アプタマー）
第６の態様に係る剤のもう１つの好ましい態様としては、フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーを含むフリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤が挙げられる。
アプタマーとは、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡで構成され、その立体構造により標的タンパク質と結合してアゴニスト（機能を促進）又はアンタゴニスト（機能を阻害）として作用し得る核酸医薬品をいう（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ３１－１，２０１６，ｐｐ１０－１４）。
第６の態様に係る剤においては、アプタマーがアゴニストとして作用することが好ましい。
アプタマーは標的タンパク質に対する結合性及び特異性が高く、免疫原性が低く、化学合成により製造することができ、保存安定性も高い。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、フリズルド３タンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、１５～６０塩基であることが好ましく、２０～５０塩基であることがより好ましく、２５～４７塩基であることが更に好ましく、２６～４５塩基であることが特に好ましい。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーはＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法により取得することができる（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ３１－１，２０１６，ｐｐ１０－１４）。
第６の態様に係る剤のもう１つの好ましい態様としては、フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーを含むフリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤が挙げられる。
アプタマーとは、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡで構成され、その立体構造により標的タンパク質と結合してアゴニスト（機能を促進）又はアンタゴニスト（機能を阻害）として作用し得る核酸医薬品をいう（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ３１－１，２０１６，ｐｐ１０－１４）。
第６の態様に係る剤においては、アプタマーがアゴニストとして作用することが好ましい。
アプタマーは標的タンパク質に対する結合性及び特異性が高く、免疫原性が低く、化学合成により製造することができ、保存安定性も高い。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、フリズルド３タンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、１５～６０塩基であることが好ましく、２０～５０塩基であることがより好ましく、２５～４７塩基であることが更に好ましく、２６～４５塩基であることが特に好ましい。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーはＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法により取得することができる（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ３１－１，２０１６，ｐｐ１０－１４）。
【0059】
第６の態様に係る剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができる。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体又はアプタマーの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１００ｍｇ程度の範囲である。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体又はアプタマーの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１００ｍｇ程度の範囲である。
【0060】
＜フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤＞
第７の態様に係るフリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤（以下、単に「第７の態様に係る剤」ともいう。）は、フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現の低下物質、又はフリズルド３タンパク質の阻害物質を含む。
第７の態様に係るフリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤（以下、単に「第７の態様に係る剤」ともいう。）は、フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現の低下物質、又はフリズルド３タンパク質の阻害物質を含む。
【0061】
（ｓｉＲＮＡ）
フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現の低下物質としては、フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが好ましい。
フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する３０ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましく、フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する２５ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることがより好ましい。
フリズルド３遺伝子若しくはタンパク質の発現の低下物質としては、フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが好ましい。
フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する３０ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましく、フリズルド３遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する２５ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることがより好ましい。
【0062】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある標的遺伝子の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。
二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、フリズルド３遺伝子またはそれらの部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（フリズルド３遺伝子）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’－Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’－ＹｎＹｎ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１－３’
３’－ＸｎＸｎ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１－５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、フリズルド３遺伝子またはそれらの部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（フリズルド３遺伝子）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’－Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’－ＹｎＹｎ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１－３’
３’－ＸｎＸｎ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１－５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
【0063】
逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な配列を介した配列である。逆向き反復配列としては、標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは０～３００ｂｐ程度、より好ましくは０～１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは０～３００ｂｐ程度、より好ましくは０～１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
【0064】
本発明では、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込むことにより、哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができる。本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
【0065】
第７の態様に係る剤は、細胞内への取り込みを向上させる観点から、リポフェクション用担体を更に含んでいてもよいが含んでいなくてもよい。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体（例えばリポソーム、コレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
例えば、ｓｉＲＮＡは、リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてフリズルド３遺伝子の発現を低下させることができる。
有効成分である二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１０ｍｇ程度の範囲である。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体（例えばリポソーム、コレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
例えば、ｓｉＲＮＡは、リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてフリズルド３遺伝子の発現を低下させることができる。
有効成分である二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１０ｍｇ程度の範囲である。
【0066】
第７の態様に係る剤は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0067】
（フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマー）
フリズルド３タンパク質の活性の阻害物質としては、フリズルド３タンパク質の活性を阻害する限り、抗体、高分子化合物（核酸等）、低分子化合物等任意の物質であってもよい。
フリズルド３タンパク質の活性の阻害物質の好ましい態様の１つとして、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーを含むフリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤が挙げられる。
上記抗体又はアプタマーは、フリズルド３タンパク質に選択的に結合し、かつアンタゴニストとして作用する抗体又はアプタマーが好ましく、フリズルド３タンパク質のリガンド結合部位に選択的に結合し、かつアンタゴニストとして作用する抗体又はアプタマーがより好ましい。
フリズルド３タンパク質の活性の阻害物質としては、フリズルド３タンパク質の活性を阻害する限り、抗体、高分子化合物（核酸等）、低分子化合物等任意の物質であってもよい。
フリズルド３タンパク質の活性の阻害物質の好ましい態様の１つとして、フリズルド３タンパク質に選択的に結合する抗体又はアプタマーを含むフリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤が挙げられる。
上記抗体又はアプタマーは、フリズルド３タンパク質に選択的に結合し、かつアンタゴニストとして作用する抗体又はアプタマーが好ましく、フリズルド３タンパク質のリガンド結合部位に選択的に結合し、かつアンタゴニストとして作用する抗体又はアプタマーがより好ましい。
【0068】
（（抗体））
上記フリズルド３タンパク質に特異的に結合でき、かつアンタゴニストとして作用する抗体であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
抗体の入手方法（製造方法）としては、＜フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤＞において上述した方法と同様に行うことができる。
上記フリズルド３タンパク質に特異的に結合でき、かつアンタゴニストとして作用する抗体であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
抗体の入手方法（製造方法）としては、＜フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤、糖尿病予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤＞において上述した方法と同様に行うことができる。
【0069】
フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤として抗体を医薬組成物の形態で使用する場合には、上記抗体を有効成分として使用し、さらに薬学的に許容可能な担体、希釈剤（例えば、免疫原性アジュバントなど）、安定化剤または賦形剤などを用いて医薬組成物を調製することができる。抗体を含むフリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアルまたは安定化水性調製物中に投薬形態に製剤化することができる。
【0070】
（（アプタマー））
フリズルド３タンパク質の活性の阻害物質の好ましい態様の１つとして、フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーとしては、第７の態様に係る剤においては、アンタゴニストとして作用することが好ましい。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、フリズルド３タンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、１５～６０塩基であることが好ましく、２０～５０塩基であることがより好ましく、２５～４７塩基であることが更に好ましく、２６～４５塩基であることが特に好ましい（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ３１－１，２０１６，ｐｐ１０－１４）。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーの取得方法は上述の通りである。
フリズルド３タンパク質の活性の阻害物質の好ましい態様の１つとして、フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーとしては、第７の態様に係る剤においては、アンタゴニストとして作用することが好ましい。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、フリズルド３タンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、１５～６０塩基であることが好ましく、２０～５０塩基であることがより好ましく、２５～４７塩基であることが更に好ましく、２６～４５塩基であることが特に好ましい（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ３１－１，２０１６，ｐｐ１０－１４）。
フリズルド３タンパク質に選択的に結合するアプタマーの取得方法は上述の通りである。
【0071】
第７の態様に係る剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができる。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体又はアプタマーの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１００ｍｇ程度の範囲である。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体又はアプタマーの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１００ｍｇ程度の範囲である。
【実施例】
【0072】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
【0073】
＜ベータジェニンに対する受容体の探索、並びにフリズルド３とベータジェニンとの結合試験＞
（フリズルド３（Ｆｚｄ３）発現コンストラクトの作製）
膵β細胞株ＭＩＮ６細胞よりＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）にてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて逆転写し、そのｃＤＮＡを鋳型にしてｍＦｚｄ３をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｐＣＡＧＧＳベクターに挿入し、Ｆｚｄ３発現コンストラクトを作製した。作製したコンストラクトは、シークエンサーを用いて塩基配列を確認した。
（フリズルド３（Ｆｚｄ３）発現コンストラクトの作製）
膵β細胞株ＭＩＮ６細胞よりＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）にてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて逆転写し、そのｃＤＮＡを鋳型にしてｍＦｚｄ３をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｐＣＡＧＧＳベクターに挿入し、Ｆｚｄ３発現コンストラクトを作製した。作製したコンストラクトは、シークエンサーを用いて塩基配列を確認した。
【0074】
（ベータジェニンペプチドの蛍光標識）
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するベータジェニン合成ペプチド（ＩＬＳ社製）をＥＺ－Ｌｉｎ（登録商標）ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてビオチン化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））にて一晩透析することにより未反応ビオチンを除去し精製した。ビオチン標識ベータジェニンペプチドはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）と３７℃１時間反応させ、蛍光標識ベータジェニンペプチドを作製した。
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するベータジェニン合成ペプチド（ＩＬＳ社製）をＥＺ－Ｌｉｎ（登録商標）ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いてビオチン化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））にて一晩透析することにより未反応ビオチンを除去し精製した。ビオチン標識ベータジェニンペプチドはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）と３７℃１時間反応させ、蛍光標識ベータジェニンペプチドを作製した。
【0075】
（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への遺伝子導入）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰｏｌｙ Ｌ－Ｌｙｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）でコーティングした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，＃３６０３）に２×１０４／ウェルで播種し、２４時間後にＦｕＧＥＮＥ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてトランスフェクションした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰｏｌｙ Ｌ－Ｌｙｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）でコーティングした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，＃３６０３）に２×１０４／ウェルで播種し、２４時間後にＦｕＧＥＮＥ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてトランスフェクションした。
【0076】
（蛍光標識ベータジェニン結合試験）
トランスフェクション４８時間後、ＰＢＳ（－）で洗浄し、５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製；核染色剤）入りＤＭＥＭ培地に交換後３７℃２０分間インキュベートした。
１００ｎＭ蛍光標識ベータジェニンペプチド／５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２入りＤＭＥＭ培地に交換後３７℃５分間インキュベートし、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で画像を取得した。
なお、陽性コントロールとして、受容体の存在が予測されるＭＩＮ６細胞を用い、ＨＥＫ２９３Ｔと同時に同細胞数播種した。
トランスフェクション４８時間後、ＰＢＳ（－）で洗浄し、５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製；核染色剤）入りＤＭＥＭ培地に交換後３７℃２０分間インキュベートした。
１００ｎＭ蛍光標識ベータジェニンペプチド／５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２入りＤＭＥＭ培地に交換後３７℃５分間インキュベートし、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で画像を取得した。
なお、陽性コントロールとして、受容体の存在が予測されるＭＩＮ６細胞を用い、ＨＥＫ２９３Ｔと同時に同細胞数播種した。
【0077】
図１（ａ）は陽性コントロールとして、ベータジェニンの受容体の存在が予測されるＭＩＮ６細胞を用いた蛍光標識ベータジェニンとの結合試験結果を示す図である。
図１（ｂ）は陰性コントロールとして空ベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔにおける蛍光標識ベータジェニンとの結合試験結果を示す図である。
図１（ｃ）は、Ｆｚｄ３遺伝子をトランスフェクションしてＦｚｄ３を発現するＨＥＫ２９３Ｔにおける蛍光標識ベータジェニンとの結合試験結果を示す図である。
図１（ｂ）は陰性コントロールとして空ベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔにおける蛍光標識ベータジェニンとの結合試験結果を示す図である。
図１（ｃ）は、Ｆｚｄ３遺伝子をトランスフェクションしてＦｚｄ３を発現するＨＥＫ２９３Ｔにおける蛍光標識ベータジェニンとの結合試験結果を示す図である。
【0078】
図１（ａ）に示したように、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により黒くなっている部分の他に、蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分が見られ、ＭＩＮ６細胞において蛍光標識ベータジェニンが受容体に結合していることが分かる。
図１（ｂ）には、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により黒くなっている部分の以外に、蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分がほとんど見られず、Ｆｚｄ３を発現していないモックの細胞には蛍光標識ベータジェニンが結合しないことが分かる。
図１（ｃ）には、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により黒くなっている部分の他に、蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分が見られ、Ｆｚｄ３を発現している細胞には蛍光標識ベータジェニンが結合していることが分かる。
図１（ｂ）には、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により黒くなっている部分の以外に、蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分がほとんど見られず、Ｆｚｄ３を発現していないモックの細胞には蛍光標識ベータジェニンが結合しないことが分かる。
図１（ｃ）には、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２により黒くなっている部分の他に、蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分が見られ、Ｆｚｄ３を発現している細胞には蛍光標識ベータジェニンが結合していることが分かる。
【0079】
図２はフリズルド３とベータジェニンとの結合試験を示す図である。
図２に示した結果から明らかなように、Ｆｚｄ３を発現していないモックのＨＥＫ２９３Ｔでは、ビオチン標識していないベータジェニン及びストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７(又はＡｌｅｘａ６４７)を添加した系はもちろんのこと、ビオチン標識ベータジェニン及びストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７(又はＡｌｅｘａ６４７)を添加した系であっても、蛍光標識ベータジェニンによる白くなっている部分はほとんど見られないことが分かる。
また、Ｆｚｄ３を発現しているＨＥＫ２９３Ｔでも、ビオチン標識していないベータジェニン及びストレプトアビジン６４７を添加した系は蛍光標識ベータジェニンによる白くなっている部分はほとんど見られないことが分かる。
一方、Ｆｚｄ３を発現しているＨＥＫ２９３Ｔにおいて、ビオチン標識ベータジェニン及びストレプトアビジン６４７を添加した系では蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分が見られ、Ｆｚｄ３を発現している細胞には蛍光標識ベータジェニンが結合していることが分かる。
以上の結果から、ベータジェニンの受容体として細胞にはＦｚｄ３が発現していることが分かる。
図２に示した結果から明らかなように、Ｆｚｄ３を発現していないモックのＨＥＫ２９３Ｔでは、ビオチン標識していないベータジェニン及びストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７(又はＡｌｅｘａ６４７)を添加した系はもちろんのこと、ビオチン標識ベータジェニン及びストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７(又はＡｌｅｘａ６４７)を添加した系であっても、蛍光標識ベータジェニンによる白くなっている部分はほとんど見られないことが分かる。
また、Ｆｚｄ３を発現しているＨＥＫ２９３Ｔでも、ビオチン標識していないベータジェニン及びストレプトアビジン６４７を添加した系は蛍光標識ベータジェニンによる白くなっている部分はほとんど見られないことが分かる。
一方、Ｆｚｄ３を発現しているＨＥＫ２９３Ｔにおいて、ビオチン標識ベータジェニン及びストレプトアビジン６４７を添加した系では蛍光標識ベータジェニンにより白くなっている部分が見られ、Ｆｚｄ３を発現している細胞には蛍光標識ベータジェニンが結合していることが分かる。
以上の結果から、ベータジェニンの受容体として細胞にはＦｚｄ３が発現していることが分かる。
【0080】
＜ベータジェニンペプチドを用いたＦｚｄ３発現細胞増殖試験＞
（Ｓｔａｂｌｅ発現細胞株の樹立）
１０ｃｍディッシュに１×１０５でＣＨＯ－Ｋ１細胞（理研ＢＲＣ社製）を播種し、ＦｕＧＥＮＥ６にてＭｏｃｋ（モック）若しくはＦｚｄ３コンストラクト及び１／１０量のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターをコトランスフェクトし、その４８時間後に１／２０量で継代培養した。この時点より４００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社製）を培地に添加し、１週間に２回培地交換を行った。コロニー形成が確認出来た後、細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ社製）で剥離し、０．５ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェルプレートに継代し、約１週間培養した。細胞増殖の確認出来たウェルを２４ウェルプレート、６ｃｍディッシュへと継代し、保存ストック及び遺伝子発現確認用細胞とした。発現はｑＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットで確認し、クローンを決定した。
（Ｓｔａｂｌｅ発現細胞株の樹立）
１０ｃｍディッシュに１×１０５でＣＨＯ－Ｋ１細胞（理研ＢＲＣ社製）を播種し、ＦｕＧＥＮＥ６にてＭｏｃｋ（モック）若しくはＦｚｄ３コンストラクト及び１／１０量のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターをコトランスフェクトし、その４８時間後に１／２０量で継代培養した。この時点より４００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社製）を培地に添加し、１週間に２回培地交換を行った。コロニー形成が確認出来た後、細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ社製）で剥離し、０．５ｃｅｌｌ／ウェルで９６ウェルプレートに継代し、約１週間培養した。細胞増殖の確認出来たウェルを２４ウェルプレート、６ｃｍディッシュへと継代し、保存ストック及び遺伝子発現確認用細胞とした。発現はｑＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットで確認し、クローンを決定した。
【0081】
（５－エチニル－２’－でオキシウリジン（ＥｄＵ）取込試験）
モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的（Ｓｔａｂｌｅ）発現ＣＨＯ細胞をＰｏｌｙ Ｌ－Ｌｙｓｉｎ、コラーゲンタイプ１でコーティングした８ウェルチャンバースライド（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に１×１０５／ウェルで播種し、２４時間後に、１００ｎＭベータジェニンペプチド±１０μＭのＵ０１２６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ社製）入り、０．５％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地に交換し、血清飢餓で７０時間培養した。最後にＥｄＵ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１０μＭになるように添加し、２時間培養し、蛍光染色を行った。染色はＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４イメージングキット（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、添付の説明書に従い染色し、封入後ＢＺ－Ｘ７００にて観察した。
モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的（Ｓｔａｂｌｅ）発現ＣＨＯ細胞をＰｏｌｙ Ｌ－Ｌｙｓｉｎ、コラーゲンタイプ１でコーティングした８ウェルチャンバースライド（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に１×１０５／ウェルで播種し、２４時間後に、１００ｎＭベータジェニンペプチド±１０μＭのＵ０１２６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ社製）入り、０．５％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地に交換し、血清飢餓で７０時間培養した。最後にＥｄＵ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１０μＭになるように添加し、２時間培養し、蛍光染色を行った。染色はＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４イメージングキット（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、添付の説明書に従い染色し、封入後ＢＺ－Ｘ７００にて観察した。
【0082】
なお、ＥｄＵはチミジンのヌクレオシド類似体であり、活発なＤＮＡ合成の間にＤＮＡに取り込まれることから、細胞増殖のマーカーとなり得ることが知られている。
Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４イメージングキット（Ｔｈｅｒｍｏ社製）の色素におけるアジド基とエチニル基が反応し検出し得ることが知られている。
Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４イメージングキット（Ｔｈｅｒｍｏ社製）の色素におけるアジド基とエチニル基が反応し検出し得ることが知られている。
【0083】
また、ＭＡＰキナーゼキナーゼ１及び２（ＭＡＰＫＫ若しくはＭＥＫ１／２）はＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）をリン酸化して活性化させることが知られている。上記Ｕ０１２６はＭＡＰキナーゼキナーゼ１及び２の選択的阻害剤として知られ、ＥＲＫのリン酸化による活性化を阻害し、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２を同等に阻害することが知られている。
【0084】
図３は、ベータジェニンペプチドを用いたＦｚｄ３安定的発現細胞増殖試験結果を示す図である。図３中、白く見える部分はＥｄＵの蛍光標識部分を示しＤＮＡ合成が活発に起こり、細胞が増殖していることを示す。
黒く見える部分はＤＮＡに結合するＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）による標識部分を示す。
黒く見える部分はＤＮＡに結合するＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）による標識部分を示す。
【0085】
図３に示した結果から明らかなように、培地にベータジェニンペプチドもＵ０１２６も添加させないビヒクルのみでは、モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞いずれもＥｄＵの取り込みは見られなかった。
また、培地に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合、モックＣＨＯ細胞ではＥｄＵの取り込みは見られないが、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞ではＥｄＵの取り込みが見られ、ＤＮＡ合成が活発に起こっていることがわかり、細胞増殖が活発に起こっていることがわかる。
この結果から、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することによりフリズルド３発現細胞の増殖促進剤をスクリーニングすることができるといえる。
また、培地に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合、モックＣＨＯ細胞ではＥｄＵの取り込みは見られないが、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞ではＥｄＵの取り込みが見られ、ＤＮＡ合成が活発に起こっていることがわかり、細胞増殖が活発に起こっていることがわかる。
この結果から、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することによりフリズルド３発現細胞の増殖促進剤をスクリーニングすることができるといえる。
【0086】
また、培地に１００ｎＭベータジェニンペプチドとともに１０μＭのＵ０１２６を添加した場合、モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞いずれもＥｄＵの取り込みは見られなかった。
このことは、リガンドであるベータジェニンによる受容体であるフリズルド３タンパク質への結合によるシグナル伝達が、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の少なくとも１部を経由していることが示唆され、Ｕ０１２６によりそのシグナル伝達が阻害されたことが示唆される。
このことは、リガンドであるベータジェニンによる受容体であるフリズルド３タンパク質への結合によるシグナル伝達が、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の少なくとも１部を経由していることが示唆され、Ｕ０１２６によりそのシグナル伝達が阻害されたことが示唆される。
【0087】
なお、本発明者らは、ＴＵＮＥＬ標識を用いてベータジェニンペプチドの添加がＦｚｄ３安定的発現細胞のアポトーシスを抑制することを確認している。
このことから、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することによりフリズルド３発現細胞のアポトーシス抑制剤をスクリーニングすることができるともいえる。
このことから、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することによりフリズルド３発現細胞のアポトーシス抑制剤をスクリーニングすることができるともいえる。
【0088】
また、本発明者らは、Ｆｚｄ３安定的発現細胞であるβ細胞を含むヒト及びマウスランゲルハンス島においてベータジェニンペプチドの添加がインスリン分泌を促進することを確認している。
このことから、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することによりインスリン分泌促進剤をスクリーニングすることができるともいえる。
このことから、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することによりインスリン分泌促進剤をスクリーニングすることができるともいえる。
【0089】
また、本発明者らは、抗生剤ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルマウスにおいてベータジェニンペプチドの添加がβ細胞数の増加及び糖尿病の抑制することを確認している。
このことから、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することにより糖尿病予防若しくは治療剤をスクリーニングすることができるともいえる。
このことから、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子をスクリーニング剤として使用して、フリズルド３タンパク質に対するアゴニストを探索することにより糖尿病予防若しくは治療剤をスクリーニングすることができるともいえる。
【0090】
＜Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いたＦｚｄ３発現細胞増殖抑制試験＞
Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、細胞に５ｎＭのｓｉＲＮＡをリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製）にて導入した。Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出後、ｑＲＴ－ＰＣＲにてノックダウン効率を算出した。
Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い、細胞に５ｎＭのｓｉＲＮＡをリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製）にて導入した。Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出後、ｑＲＴ－ＰＣＲにてノックダウン効率を算出した。
【0091】
図４はＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞にコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系において培地に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合のＦｚｄ３発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した値を１００％とし、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを添加した系のノックダウン効率（％）を示したグラフである。
図４から、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡによりＦｚｄ３の発現が１／１０に低下していることがわかる。
図４から、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡによりＦｚｄ３の発現が１／１０に低下していることがわかる。
【0092】
図５はＦｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを用いたＦｚｄ３発現細胞増殖抑制試験結果を示す図である。
図５に示した結果から明らかなように、Ｆｚｄ３を発現しないモックＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系では、培地にビヒクルのみを添加した場合及び１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合のいずれでもＥｄＵの取り込みが見られず増殖が起こっていないことがわかる。
また、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系において培地にビヒクルのみを添加した場合にもＥｄＵの取り込みが見られず増殖が起こっていないことがわかる。
一方、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系において培地に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合にはＥｄＵの取り込みが起こり、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞の増殖が活発に起こっていることがわかる。すなわち、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡではＦｚｄ３遺伝子をノックダウンしていないことが分かる。
これに対し、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを添加した系では、培地にビヒクルのみを添加した場合及び１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合のいずれでもＥｄＵの取り込みが見られず増殖が起こっていないことがわかる。すなわち、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡによりＦｚｄ３遺伝子がノックダウンされてＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞の増殖が抑制されていることが分かる。
図５に示した結果から明らかなように、Ｆｚｄ３を発現しないモックＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系では、培地にビヒクルのみを添加した場合及び１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合のいずれでもＥｄＵの取り込みが見られず増殖が起こっていないことがわかる。
また、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系において培地にビヒクルのみを添加した場合にもＥｄＵの取り込みが見られず増殖が起こっていないことがわかる。
一方、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡを添加した系において培地に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合にはＥｄＵの取り込みが起こり、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞の増殖が活発に起こっていることがわかる。すなわち、Ｆｚｄ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡではないコントロールのｓｉＲＮＡではＦｚｄ３遺伝子をノックダウンしていないことが分かる。
これに対し、Ｆｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを添加した系では、培地にビヒクルのみを添加した場合及び１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合のいずれでもＥｄＵの取り込みが見られず増殖が起こっていないことがわかる。すなわち、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡによりＦｚｄ３遺伝子がノックダウンされてＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞の増殖が抑制されていることが分かる。
【0093】
以上図４及び５に示した結果から、フリズルド３タンパク質若しくは遺伝子が、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤又はインスリノーマ予防若しくは治療剤のスクリーニング剤として使用し得るといえる。
また、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡが、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、又はインスリノーマ予防若しくは治療剤として使用し得るといえる。
また、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡが、フリズルド３発現細胞の細胞数低下剤、又はインスリノーマ予防若しくは治療剤として使用し得るといえる。
【0094】
＜Ｆｚｄ３発現細胞「増加」試験＞
（生存細胞数カウント測定）
モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，＃３６０３）に１×１０３／ウェルで播種し、２４時間後にリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸを用いてｓｉＲＮＡを遺伝子導入した。その１２時間後に１００ｎＭベータジェニンペプチド入り、０．５％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地に交換し、その２４時間後の細胞数を計測した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、細胞の内在性のＡＴＰをマルチラベルプレートカウンター（ＡＲＶＯ ＭＸ）にて発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ；ＲＬＵ）として定量することで生存細胞数を測定した。
（生存細胞数カウント測定）
モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，＃３６０３）に１×１０３／ウェルで播種し、２４時間後にリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸを用いてｓｉＲＮＡを遺伝子導入した。その１２時間後に１００ｎＭベータジェニンペプチド入り、０．５％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓＦ－１２培地に交換し、その２４時間後の細胞数を計測した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、細胞の内在性のＡＴＰをマルチラベルプレートカウンター（ＡＲＶＯ ＭＸ）にて発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ；ＲＬＵ）として定量することで生存細胞数を測定した。
【0095】
図６（ａ）はＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞にビヒクルのみを添加した場合と１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した場合との生存細胞数をＲＬＵとして示すグラフである。
図６（ｂ）はＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した系においてコントロールのｓｉＲＮＡを添加した場合とＦｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを添加した場合との生存細胞数をＲＬＵとして示すグラフである。
図６（ｂ）はＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞に１００ｎＭベータジェニンペプチドを添加した系においてコントロールのｓｉＲＮＡを添加した場合とＦｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡを添加した場合との生存細胞数をＲＬＵとして示すグラフである。
【0096】
図６（ａ）に示した結果から明らかなように、ベータジェニンペプチドがアゴニストとして作用してＦｚｄ３発現細胞数が増加していることが分かる。
この結果は、ベータジェニンペプチド刺激によりＦｚｄ３発現細胞が増殖しているのみならず、また、Ｆｚｄ３発現細胞のアポトーシスが抑制されているのみならず、ベータジェニンペプチド刺激によりＦｚｄ３発現細胞の細胞数が総和として増加していることを示している。
また、図６（ｂ）に示した結果から明らかなように、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡによりＦｚｄ３発現細胞の細胞数が低下していることが分かる。
この結果は、ベータジェニンペプチド刺激によりＦｚｄ３発現細胞が増殖しているのみならず、また、Ｆｚｄ３発現細胞のアポトーシスが抑制されているのみならず、ベータジェニンペプチド刺激によりＦｚｄ３発現細胞の細胞数が総和として増加していることを示している。
また、図６（ｂ）に示した結果から明らかなように、Ｆｚｄ３遺伝子に対して特異的なｓｉＲＮＡによりＦｚｄ３発現細胞の細胞数が低下していることが分かる。
【0097】
以上図６に示した結果から、フリズルド３発現細胞及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた上記系が、フリズルド３発現細胞の細胞数増加剤若しくは低下剤、糖尿病予防若しくは治療剤、インスリノーマ予防若しくは治療剤、及びインスリン分泌促進剤若しくは分泌抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤をスクリーニングするためのスクリーニングキットないしシステムとして機能し得ることがわかる。
【0098】
＜ベータジェニンペプチドを用いたＦｚｄ３発現細胞におけるシグナル伝達経路確認試験＞
（細胞サンプル調製）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０５／６ｃｍディッシュに播種し、その２４時間後にＦｕＧＥＮＥ６にてトランスフェクションし、その２４時間後に０．５％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地に交換し血清飢餓を起こした。あるいは、モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞を６ｃｍディッシュに３×１０５播種し２４時間培養後、血清飢餓にした。
血清飢餓２４時間後にベータジェニンペプチド入り培地で刺激し、図７に記載の所定の時間後（０分、１分、３分、１０分）に回収、氷冷ＰＢＳ（－）で２回洗浄し回収した。
（細胞サンプル調製）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０５／６ｃｍディッシュに播種し、その２４時間後にＦｕＧＥＮＥ６にてトランスフェクションし、その２４時間後に０．５％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地に交換し血清飢餓を起こした。あるいは、モックＣＨＯ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞を６ｃｍディッシュに３×１０５播種し２４時間培養後、血清飢餓にした。
血清飢餓２４時間後にベータジェニンペプチド入り培地で刺激し、図７に記載の所定の時間後（０分、１分、３分、１０分）に回収、氷冷ＰＢＳ（－）で２回洗浄し回収した。
【0099】
（ウエスタンブロット）
回収した細胞を１２０μＬの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｖａｎａｄａｔｅ，１０ｍＭβ－ｇｌｙｃｅｒｏｈｏｓｐｈａｔｅ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社製），０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ－４０）でタンパク抽出し、氷上３０分後１５，０００ｒｐｍ４℃３０分間遠心しクリアライセートを得た。ＳＤＳサンプルバッファーで懸濁後、９５℃５分間煮沸し、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。１次抗体：ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、２次抗体：抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ社製）と反応後、Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ社製）で室温５分間反応させ、ＬＡＳ－４０００（ＧＥ）にて可視化した。
回収した細胞を１２０μＬの細胞溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｖａｎａｄａｔｅ，１０ｍＭβ－ｇｌｙｃｅｒｏｈｏｓｐｈａｔｅ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ ＤＴＴ，１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社製），０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ－４０）でタンパク抽出し、氷上３０分後１５，０００ｒｐｍ４℃３０分間遠心しクリアライセートを得た。ＳＤＳサンプルバッファーで懸濁後、９５℃５分間煮沸し、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。１次抗体：ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、２次抗体：抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ社製）と反応後、Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ社製）で室温５分間反応させ、ＬＡＳ－４０００（ＧＥ）にて可視化した。
【0100】
図７（ａ）は、ベータジェニンペプチド刺激によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＲＫ１／２のリン酸化を確認した結果を示す図であり、（ｂ）は、ベータジェニンペプチド刺激によりＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞におけるＥＲＫ１／２のリン酸化を確認した結果を示す図である。
図７（ａ）及び（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞いずれにおいてもベータジェニンペプチド刺激３分後及び１０分後においてリン酸化ＥＲＫ１／２のバンドが濃くなっていることが分かる。
この結果から、リガンドであるベータジェニンによる受容体であるフリズルド３タンパク質への結合によるシグナル伝達が、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の少なくとも１部を経由しているといえる。
図７（ａ）及び（ｂ）に示した結果から明らかなように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＦｚｄ３安定的発現ＣＨＯ細胞いずれにおいてもベータジェニンペプチド刺激３分後及び１０分後においてリン酸化ＥＲＫ１／２のバンドが濃くなっていることが分かる。
この結果から、リガンドであるベータジェニンによる受容体であるフリズルド３タンパク質への結合によるシグナル伝達が、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の少なくとも１部を経由しているといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】