特許 7325341 非天然ヌクレオチドの組み込み及びその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-03

(45)【発行日】2023-08-14

(54)【発明の名称】非天然ヌクレオチドの組み込み及びその方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230804BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20230804BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12P21/00 C

【請求項の数】 56

(21)【出願番号】P 2019572821

(86)(22)【出願日】2018-07-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-31

(86)【国際出願番号】 US2018041509

(87)【国際公開番号】W WO2019014267

(87)【国際公開日】2019-01-17

【審査請求日】2021-07-09

(31)【優先権主張番号】62/531,325

(32)【優先日】2017-07-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520000928

【氏名又は名称】シンソークス，インク．

(73)【特許権者】

【識別番号】501244222

【氏名又は名称】ザ スクリプス リサーチ インスティテュート

(74)【復代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】プタシン，ジェロド

(72)【発明者】

【氏名】カファロ，カロリーナ

(72)【発明者】

【氏名】エルニ，ハンス

(72)【発明者】

【氏名】ツァン，ヨーク

(72)【発明者】

【氏名】フィシャー，エミル シー．

(72)【発明者】

【氏名】フェルドマン，アーロン ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】ディエン，ヴィヴィアン ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ロムズバーグ，フロイド イー．

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１１５１６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１５７５５５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１８３７６１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００９／０３８１９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０２１４３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Zhang, Y. et al.，A semisynthetic organism engineered for the stable expansion of the genetic alphabet，PNAS，2017年，114 (6)，1317-1322

【文献】Wan, W. et al.，Pyrrolysyl-tRNA synthase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool，Biochim Biophys Acta，2014年，１８８４（６），1059-1070

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８

１５／００ － １５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００ － ４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００ － １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生する方法であって、該方法は、
突然変異体ｔＲＮＡを調製する工程であって、該突然変異体ｔＲＮＡは、
ＧＧＹ、ＧＹＧ、ＹＧＧ、ＧＡＹ、ＧＹＡ、ＹＧＡ、ＧＣＹ、ＧＹＣ、ＹＧＣ、ＧＵＹ、ＧＹＵ、ＹＧＵ、ＣＡＹ、ＣＹＡ、ＹＣＡ、ＣＧＹ、ＣＹＧ、ＹＣＧ、ＣＵＹ、ＣＹＵ、ＹＣＵ、ＣＣＹ、ＣＹＣ、ＹＣＣ、ＡＡＹ、ＡＹＡ、ＹＡＡ、ＡＧＹ、ＡＹＧ、ＹＡＧ、ＡＣＹ、ＡＹＣ、ＹＡＣ、ＡＵＹ、ＡＹＵ、ＹＡＵ、ＵＵＹ、ＵＹＵ、ＹＵＵ、ＵＡＹ、ＵＹＡ、ＹＵＡ、ＵＧＹ、ＵＹＧ、ＹＵＧ、ＵＣＹ、ＵＹＣ、ＹＵＣ、ＧＹＹ、ＹＧＹ、ＹＹＧ、ＣＹＹ、ＹＣＹ、ＹＹＣ、ＡＹＹ、ＹＡＹ、ＹＹＡ、ＵＹＹ、ＹＵＹ、ＹＹＵ、ＹＹＹ、ＧＧＸ、ＧＸＧ、ＸＧＧ、ＧＡＸ、ＧＸＡ、ＸＧＡ、ＧＣＸ、ＧＸＣ、ＸＧＣ、ＧＵＸ、ＧＸＵ、ＸＧＵ、ＣＡＸ、ＣＸＡ、ＸＣＡ、ＣＧＸ、ＣＸＧ、ＸＣＧ、ＣＵＸ、ＣＸＵ、ＸＣＵ、ＣＣＸ、ＣＸＣ、ＸＣＣ、ＡＡＸ、ＡＸＡ、ＸＡＡ、ＡＧＸ、ＡＸＧ、ＸＡＧ、ＡＣＸ、ＡＸＣ、ＸＡＣ、ＡＵＸ、ＡＸＵ、ＸＡＵ、ＵＵＸ、ＵＸＵ、ＸＵＵ、ＵＡＸ、ＵＸＡ、ＸＵＡ、ＵＧＸ、ＵＸＧ、ＸＵＧ、ＵＣＸ、ＵＸＣ、ＸＵＣ、ＧＸＸ、ＸＧＸ、ＸＸＧ、ＣＸＸ、ＸＣＸ、ＸＸＣ、ＡＸＸ、ＸＡＸ、ＸＸＡ、ＵＸＸ、ＸＵＸ、ＸＸＵ、又はＸＸＸから選択される突然変異体アンチコドン配列を含み、ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、

【化1】

から選択される非天然核酸塩基を含む非天然ヌクレオチドである、工程、
突然変異体ｍＲＮＡを調製する工程であって、該突然変異体ｍＲＮＡは、
ＧＧＹ、ＧＹＧ、ＹＧＧ、ＧＡＹ、ＧＹＡ、ＹＧＡ、ＧＣＹ、ＧＹＣ、ＹＧＣ、ＧＵＹ、ＧＹＵ、ＹＧＵ、ＣＡＹ、ＣＹＡ、ＹＣＡ、ＣＧＹ、ＣＹＧ、ＹＣＧ、ＣＵＹ、ＣＹＵ、ＹＣＵ、ＣＣＹ、ＣＹＣ、ＹＣＣ、ＡＡＹ、ＡＹＡ、ＹＡＡ、ＡＧＹ、ＡＹＧ、ＹＡＧ、ＡＣＹ、ＡＹＣ、ＹＡＣ、ＡＵＹ、ＡＹＵ、ＹＡＵ、ＵＵＹ、ＵＹＵ、ＹＵＵ、ＵＡＹ、ＵＹＡ、ＹＵＡ、ＵＧＹ、ＵＹＧ、ＹＵＧ、ＵＣＹ、ＵＹＣ、ＹＵＣ、ＧＹＹ、ＹＧＹ、ＹＹＧ、ＣＹＹ、ＹＣＹ、ＹＹＣ、ＡＹＹ、ＹＡＹ、ＹＹＡ、ＵＹＹ、ＹＵＹ、ＹＹＵ、ＹＹＹ、ＧＧＸ、ＧＸＧ、ＸＧＧ、ＧＡＸ、ＧＸＡ、ＸＧＡ、ＧＣＸ、ＧＸＣ、ＸＧＣ、ＧＵＸ、ＧＸＵ、ＸＧＵ、ＣＡＸ、ＣＸＡ、ＸＣＡ、ＣＧＸ、ＣＸＧ、ＸＣＧ、ＣＵＸ、ＣＸＵ、ＸＣＵ、ＣＣＸ、ＣＸＣ、ＸＣＣ、ＡＡＸ、ＡＸＡ、ＸＡＡ、ＡＧＸ、ＡＸＧ、ＸＡＧ、ＡＣＸ、ＡＸＣ、ＸＡＣ、ＡＵＸ、ＡＸＵ、ＸＡＵ、ＵＵＸ、ＵＸＵ、ＸＵＵ、ＵＡＸ、ＵＸＡ、ＸＵＡ、ＵＧＸ、ＵＸＧ、ＸＵＧ、ＵＣＸ、ＵＸＣ、ＸＵＣ、ＧＸＸ、ＸＧＸ、ＸＸＧ、ＣＸＸ、ＸＣＸ、ＸＸＣ、ＡＸＸ、ＸＡＸ、ＸＸＡ、ＵＸＸ、ＸＵＸ、ＸＸＵ、又はＸＸＸから選択される突然変異体コドン配列を含み、ここで、Ｘ及びＹはそれぞれ、

【化2】

から選択される非天然核酸塩基を含む非天然ヌクレオチドである、工程、及び
非天然アミノ酸を含有するタンパク質を、突然変異体ｔＲＮＡ及び突然変異体ｍＲＮＡを利用して合成する工程であって、ここで、突然変異体ｔＲＮＡの突然変異体アンチコドンは、突然変異体ｍＲＮＡの突然変異体コドンと対になる、工程、を含み、
ここで、前記タンパク質は、細胞において合成され、細胞は、フェオダクチルム・トリコルヌーツムからのヌクレオシド三リン酸輸送体及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む、
ことを特徴とする方法。

【請求項2】

前記細胞は微生物を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞は細菌を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞は大腸菌を含む、ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１つに記載の方法。

【請求項5】

前記突然変異体ｍＲＮＡ又は前記突然変異体ｔＲＮＡの前記非天然核酸塩基は、

【化3】

から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。

【請求項6】

前記突然変異体ｍＲＮＡ又は前記突然変異体ｔＲＮＡの前記非天然核酸塩基は、

【化4】

から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。

【請求項7】

前記突然変異体ｍＲＮＡ及び／又は前記突然変異体ｔＲＮＡ中の非天然核酸塩基は、

【化5】

から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。

【請求項8】

前記突然変異体ｍＲＮＡ中の非天然核酸塩基は、

【化6】

である、ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１つに記載の方法。

【請求項9】

前記突然変異体ｔＲＮＡ中の非天然核酸塩基は、

【化7】

である、ことを特徴とする請求項１乃至８の何れか１つに記載の方法。

【請求項10】

前記非天然ヌクレオチドは更に非天然糖部分を含む、ことを特徴とする請求項１乃至９の何れか１つに記載の方法。

【請求項11】

前記非天然ヌクレオチドの前記非天然糖部分は、２’位置での修飾：ＯＨ；置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３であって、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２であってもよく、ｎ及びｍは１～１０である、２’位置での修飾；及び／又は、５’位置での修飾：５’－ビニル、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、４’位置での修飾、４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

突然変異体アンチコドン又は突然変異体コドンは更に非天然バックボーンを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１つに記載の方法。

【請求項13】

突然変異体アンチコドン及び突然変異体コドンは更に非天然バックボーンを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１つに記載の方法。

【請求項14】

非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡへと転写中に組み込まれて、前記突然変異体コドンを含有する前記突然変異体ｍＲＮＡを生成する、ことを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１つに記載の方法

【請求項15】

非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｔＲＮＡへと転写中に組み込まれて、前記突然変異体アンチコドンを含有する前記突然変異体ｔＲＮＡを生成する、ことを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１つに記載の方法。

【請求項16】

前記突然変異体ｔＲＮＡに、非天然アミノ酸残基がチャージされる、ことを特徴とする請求項１乃至１５の何れか１つに記載の方法。

【請求項17】

前記非天然アミノ酸はｐ－アジド－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）である、ことを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１つに記載の方法。

【請求項18】

前記非天然アミノ酸は、Ｎ^６－［（２－プロピニルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）である、ことを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１つに記載の方法。

【請求項19】

前記突然変異体ｔＲＮＡは、メタノサルシナ・マゼイからのｔＲＮＡの突然変異体である、ことを特徴とする請求項１乃至１８の何れか１つに記載の方法。

【請求項20】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ピロリシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項１乃至１９の何れか１つに記載の方法。

【請求項21】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、チロシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項１乃至１９の何れか１つに記載の方法。

【請求項22】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ・バーケリに由来する、ことを特徴とする請求項１乃至２１の何れか１つに記載の方法。

【請求項23】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノカルドコックス・ヤンナスキイに由来する、ことを特徴とする請求項１乃至２１の何れか１つに記載の方法。

【請求項24】

ａ．フェオダクチルム・トリコルヌーツムからのヌクレオシド三リン酸輸送体と、
ｂ．

【化8】

から選択される非天然核酸塩基を含む突然変異体アンチコドンを含む突然変異体ｔＲＮＡと、
ｃ．アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、
ｄ．

【化9】

から選択される非天然核酸塩基を含む突然変異体コドンを含むｍＲＮＡと
を含み、ここで、突然変異体ｔＲＮＡの突然変異体アンチコドンは、突然変異体ｍＲＮＡの突然変異体コドンと対になる、細胞。

【請求項25】

前記細胞は更に、ｔＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４に記載の細胞。

【請求項26】

前記細胞は更に、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４又は２５に記載の細胞。

【請求項27】

前記細胞は更に、ｍＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４乃至２６の何れか１つに記載の細胞。

【請求項28】

前記細胞は更に、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４乃至２７の何れか１つに記載の細胞。

【請求項29】

前記細胞は更に、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４乃至２８の何れか１つに記載の細胞。

【請求項30】

ｔＲＮＡは、ＧＹＴ及びＧＹＣから選択される１つ以上のアンチコドンを含み、ここで、Ｙは前記非天然核酸塩基である、ことを特徴とする請求項２４乃至２９の何れか１つに記載の細胞。

【請求項31】

ｔＲＮＡはアンチコドンＧＹＴを含む、ことを特徴とする請求項３０に記載の細胞。

【請求項32】

ｔＲＮＡはアンチコドンＧＹＣを含む、ことを特徴とする請求項３０に記載の細胞。

【請求項33】

ｍＲＮＡは、ＡＸＣ及びＧＸＣから選択される１つ以上のコドンを含み、ここで、Ｘは前記非天然核酸塩基である、ことを特徴とする請求項２４乃至３２の何れか１つに記載の細胞。

【請求項34】

ｍＲＮＡはコドンＡＸＣを含む、ことを特徴とする請求項３３に記載の細胞。

【請求項35】

ｍＲＮＡはコドンＧＸＣを含む、ことを特徴とする請求項３３に記載の細胞。

【請求項36】

非天然核酸塩基Ｙは、

【化10】

であることを特徴とする、請求項３０乃至３２の何れか１つ、あるいは請求項３０乃至３２の何れか１つに従属する場合の請求項３３乃至３５の何れか１つ、に記載の細胞。

【請求項37】

非天然核酸塩基Ｙは、

【化11】

であることを特徴とする、請求項３０乃至３２の何れか１つ、あるいは請求項３０乃至３２の何れか１つに従属する場合の請求項３３乃至３５の何れか１つ、に記載の細胞。

【請求項38】

非天然核酸塩基Ｘは、

【化12】

である、ことを特徴とする請求項３３乃至３５あるいは３７の何れか１つに記載の細胞。

【請求項39】

非天然核酸塩基Ｘは、

【化13】

である、ことを特徴とする請求項３３乃至３６の何れか１つに記載の細胞。

【請求項40】

ｍＲＮＡは以下の非天然核酸塩基

【化14】

を含み、ｔＲＮＡは以下の非天然核酸塩基

【化15】

を含む、ことを特徴とする請求項２４乃至３５、３７、及び３８の何れか１つに記載の細胞。

【請求項41】

突然変異体ｍＲＮＡ及び／又は突然変異体ｔＲＮＡ中の前記非天然核酸塩基は、

【化16】

から選択される、ことを特徴とする請求項２４乃至２９の何れか１つに記載の細胞。

【請求項42】

突然変異体ｍＲＮＡ中の前記非天然核酸塩基は、

【化17】

である、ことを特徴とする請求項４１に記載の細胞。

【請求項43】

突然変異体ｔＲＮＡ中の前記非天然核酸塩基は、

【化18】

である、ことを特徴とする請求項４１又は４２に記載の細胞。

【請求項44】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはメタノサルシナ・バーケリに由来する、ことを特徴とする請求項２４乃至４３の何れか１つに記載の細胞。

【請求項45】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはメタノカルドコックス・ヤンナスキイに由来する、ことを特徴とする請求項２４乃至４３の何れか１つに記載の細胞。

【請求項46】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ピロリシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項２４乃至４５の何れか１つに記載の細胞。

【請求項47】

前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、チロシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項２４乃至４５の何れか１つに記載の細胞。

【請求項48】

前記突然変異体ｔＲＮＡはメタノサルシナ・マゼイからのｔＲＮＡの突然変異体である、ことを特徴とする請求項２４乃至４７の何れか１つに記載の細胞。

【請求項49】

前記細胞は微生物である、ことを特徴とする請求項２４乃至４８の何れか１つに記載の細胞。

【請求項50】

前記細胞は細菌である、ことを特徴とする請求項２４乃至４８の何れか１つに記載の細胞。

【請求項51】

前記細胞は大腸菌である、ことを特徴とする請求項２４乃至４８の何れか１つに記載の細胞。

【請求項52】

非天然アミノ酸を含むタンパク質を細胞内で生成する方法であって、前記方法は、
ヌクレオシド三リン酸輸送体を使用して、請求項２４乃至５１の何れか１つに記載の細胞内に非天然ヌクレオチドを輸送する工程と、
前記細胞に非天然アミノ酸を提供する工程と
を含み、
ここで、前記非天然ヌクレオチドは、非天然オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドの転写中に、ＲＮＡポリメラーゼによって組み込まれて、突然変異体ｍＲＮＡ及び突然変異体ｔＲＮＡを生成し、及び、
前記非天然アミノ酸を含むタンパク質は、前記突然変異体ｍＲＮＡの翻訳中に、前記突然変異体ｔＲＮＡを利用して生成される、
方法。

【請求項53】

前記細胞に輸送された前記非天然ヌクレオチドは、非天然核酸塩基を含む、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記非天然核酸塩基は、

【化19】

である、ことを特徴とする請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記非天然アミノ酸はｐ－アジド－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）である、ことを特徴とする請求項５２乃至５４の何れか１つに記載の方法。

【請求項56】

前記非天然アミノ酸はＮ^６－［（２－プロピニルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）である、ことを特徴とする請求項５２乃至５４の何れか１つに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１７年７月１１日出願の米国仮特許出願６２／５３１，３２５号の利益を主張するものであり、当該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

オリゴヌクレオチド及びその適用は生物工学に革新をもたらした。しかし、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むオリゴヌクレオチドは各々、ＤＮＡでは４つの天然ヌクレオチドとしてアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ならびに、ＲＮＡでは４つの天然ヌクレオチドとしてアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウリジン（Ｕ）のみを含有し、これによりオリゴヌクレオチドの潜在的な機能及び用途が大きく制限される。

【0003】

例えば、ＰＣＲ又は等温の増幅系よってポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を配列特異的に合成する／増幅する能力（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写）には、生物工学に革新をもたらした。ナノテクノロジーにおける潜在的な適用の全てに加えて、これにより、ＲＮＡとＤＮＡのアプタマーと酵素のＳＥＬＥＸ（試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））を介してインビトロの発達などの多様な範囲の新しい技術が使用可能となった。例えば、Ｏｌｉｐｈａｎｔ ＡＲ， Ｂｒａｎｄｌ ＣＪ ＆ Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ （１９８９）， Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｎｄｏｍ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９：２９４４－２９４９；Ｔｕｅｒｋ Ｃ ＆ Ｇｏｌｄ Ｌ （１９９０）， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：５０５－５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ （１９９０）， Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４６：８１８－８２２を参照。

【0004】

幾つかの態様において、こうした適用は、天然の遺伝子アルファベット（ＤＮＡ中の４つの天然ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴ、ならびに、ＲＮＡ中の４つの天然のヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、及びＵ）に存在する限定された化学的／物理的な多様性によって制限される。本明細書には、拡張された遺伝子アルファベットを含有する核酸を生成する付加的な方法が開示される。

【発明の概要】

【0005】

本明細書には、特定の実施形態において、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生する方法が開示され、該方法は、突然変異体ｔＲＮＡを調製する工程であって、該突然変異体ｔＲＮＡは表１又は２から選択される突然変異体アンチコドン配列を含む、工程；突然変異体ｍＲＮＡを調製する工程であって、該突然変異体ｍＲＮＡは表１又は２から選択される突然変異体コドン配列を含む、工程；及び非天然アミノ酸を含有するタンパク質を、突然変異体ｔＲＮＡ及び突然変異体ｍＲＮＡを利用して合成する工程を含む。幾つかの例において、タンパク質は無細胞翻訳系において合成される。幾つかの例において、タンパク質は細胞（半合成生物又はＳＳＯ）において合成される。幾つかの例において、半合成生物は微生物を含む。幾つかの例において、半合成生物は細菌を含む。幾つかの例において、半合成生物は大腸菌を含む。幾つかの例において、突然変異体ｔＲＮＡの突然変異体アンチコドンは、表１－３から選択された突然変異体コドンと対になる。幾つかの例において、非天然アミノ酸は少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは非天然核酸塩基を含む。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドの非天然塩基は、２－アミノアデニン－９－イル、２－アミノアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２－チオシトシン、アデニン及びグアニンの２－プロピル及びアルキル誘導体、２－アミノ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザグアニン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－メチル－シトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５－ブロモ、ならびに、５－トリフルオロメチルウラシル及びシトシン；５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニルシトシン、５－ウラシル、５－置換、５－ハロ、５－置換ピリミジン、５－ヒドロキシシトシン、５－ブロモシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、及び５－ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６－アルキル誘導体、６－アザピリミジン、６－アゾ－ウラシル、６－アゾ－シトシン、アザシトシン、６－アゾ－チミン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、及び８－ヒドロキシルで置換されたアデニンならびにグアニン；Ｎ４－エチルシトシン、Ｎ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、二重形成の安定を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱交雑の核酸、サイズ拡張した核酸、フッ素処理した核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジン、シチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－カルボキシヒドロキシメチルウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルクエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５オキシ酢酸、ワイブトシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピルウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリン、ならびに、プリン塩基又はピリミジン塩基が複素環式化合物により置換されるものから成る群から選択される。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、以下の式（核酸塩基部分のみを示し、リボース及びリン酸塩のバックボーンは明瞭さのために省略する）から成る群から選択される。

【0006】

【化1】

【0007】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、以下の式（核酸塩基部分のみを示し、リボース及びリン酸塩のバックボーンは明瞭さのために省略する）から成る群から選択される。

【0008】

【化2】

【0009】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは更に非天然糖部分を含む。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドの非天然糖部分は、２’位置での修飾：ＯＨ；置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２、ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３から成る群から選択され、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２であってもよく、ｎ及びｍは１～約１０であり；及び／又は、前記非天然糖部分は、５’位置での修飾：５’－ビニル、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、４’位置での修飾、４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。幾つかの例において、突然変異体アンチコドン又は突然変異体コドンは更に非天然バックボーンを含む。幾つかの例において、突然変異体アンチコドン及び突然変異体コドンは更に非天然バックボーンを含む。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素によって認識される。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体コドンを含有する突然変異体ｍＲＮＡを生成する。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｔＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体アンチコドンを含有する突然変異体ｔＲＮＡを生成する。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体ｍＲＮＡを生成する。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｔＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体ｔＲＮＡを生成する。幾つかの例において、突然変異体ｔＲＮＡに非天然アミノ酸残基がチャージされる。幾つかの例において、非天然アミノ酸を含有するタンパク質は、翻訳中に突然変異体ｔＲＮＡ及び突然変異体ｍＲＮＡを利用して生成される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

本開示の様々な態様はとりわけ添付の請求項で説明されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載を参照することによって得られる：

【図1A】ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰ及び天然ｄＡ－ｄＴ塩基の対の化学構造を例示する。

【図1B】ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１及びｔＲＮＡ（ＧＹＴ）^Ｓｅｒを発現するために使用される遺伝子カセットを例示する。Ｐ_Ｔ７及びＴ_Ｔ７は、それぞれＴ７ ＲＮＡＰプロモーター及びターミネーターを意味する。ｓｆＧＦＰがｓｅｒＴの不在下で発現される対照において、ｓｆＧＦＰ Ｔ７ターミネーターに従う配列は存在しない。

【図1C】位置１５１－コドン及びアンチコドンがそれぞれ示されているｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒを発現する細胞の蛍光のグラフを例示する。マイナス記号は、発現カセットにおけるｓｅｒＴの欠如を意味する。ｔ＝０は、Ｔ７ ＲＮＡＰ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（存在する場合）の発現を誘導するためのＩＰＴＧの追加に相当し；ａＴｃは、ｓｆＧＦＰの発現を誘導するためにｔ＝０．５ｈにて追加された。ＡＧＴ、天然Ｓｅｒコドン；ＴＡＧ、アンバー終止コドン；ＣＴＡアンバーサプレッサーアンチコドン。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図1D】位置１５１－コドン及びアンチコドンがそれぞれ示されているｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒを発現する細胞の成長のグラフを例示する。マイナス記号は、発現カセットにおけるｓｅｒＴの欠如を意味する。ｔ＝０は、Ｔ７ ＲＮＡＰ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（存在する場合）の発現を誘導するためのＩＰＴＧの追加に相当し；ａＴｃは、ｓｆＧＦＰの発現を誘導するためにｔ＝０．５ｈにて追加された。ＡＧＴ、天然Ｓｅｒコドン；ＴＡＧ、アンバー終止コドン；ＣＴＡアンバーサプレッサーアンチコドン。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図1E】図１Ｃと図１Ｄに示される最後の時点にて集められ、α－ＧＦＰ抗体（Ｎ末端エピトープ）によりプローブされる、細胞からの溶解物のウエスタンブロット（ＯＤ_６００により標準化）を例示する。

【図1F】ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及び前駆体イオン強度に基づく定量により判定されるような、ｓｆＧＦＰ（ＡＧＴ）^１５１又はｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＹＴ）を発現する細胞から精製されたｓｆＧＦＰの位置１５１にて検出される、（図の説明文において１文字のコードにより示される）アミノ酸の相対存在量のグラフを例示する（＜０．１％（平均。両コドンに対して）にて検出されたアミノ酸は示されない；詳細については方法を、検出されたアミノ酸の完全なリストについて表４を参照）。データは個々のデータポイントの平均として示され、ｎ＝４の精製ｓｆＧＦＰサンプル、培養から各々は個々のコロニーから伝播され、図１Ｃと図１Ｄに示される最後の時点にて集められる。

【図2A】培地における、同族のアンチコドン、ＰｙｌＲＳ、又は２０ｍＭのＰｒＫ（Ｎ^６－［（２－プロピニルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジンを有するｔＲＮＡ^Ｐｙｌの存在下（＋）又は不在下（－）において、位置１５１のコドンが示されているｓｆＧＦＰを発現する細胞の蛍光のグラフを例示する。蛍光は、図２Ｂに示される最後の時点にて判定された。アスタリスクは、ｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞におけるｔＲＮＡ^Ｐｙｌの欠如を意味する。ＴＡＣ、天然Ｔｙｒコドン；ＴＡＧ、アンバー終止コドン；ｎ．ｄ、判定されず。データは個々のデータポイントの平均として示され、各々は個々のコロニーから伝播される。

【図2B】図２Ａに示されるデータの部分集合の時間的経過解析を例示する。プラス及びマイナスの記号は、それぞれ培地における２０ｍＭのＰｒＫの存在又は不在を意味する。ｔ＝０は、ＰｙｌＲＳ、Ｔ７ ＲＮＡＰ、及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌの発現を誘導するためのＩＰＴＧの追加に相当し；ａＴｃは、ｓｆＧＦＰの発現を誘導するためにｔ＝１ｈにて追加された。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図2C】示された位置１５１のコドン及びアンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌを発現する細胞から精製されたｓｆＧＦＰのウェスタンブロットを例示し、それぞれＴＡＭＲＡのクリック抱合（ｃｌｉｃｋ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）及び／又は２０ｍＭのＰｒＫの培地への添加を伴う又は伴わないものである。ｔＲＮＡ^ＰｙｌはｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞には存在しない（－）。ｓｆＧＦＰは、図２Ｂに示される最後の時点にて集めた培養から精製された。ウェスタンブロットは、α－ＧＦＰ抗体により探索され、画像化されることで、ｓｆＧＦＰと抱合ＴＡＭＲＡの両方を検出した。

【図2D】それぞれＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及び前駆体イオン強度に基づく定量により判定されるような、ｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する（図２Ｂに示される最後の時点にて集められる）細胞から精製されたｓｆＧＦＰ、又は、示された位置１５１のコドン及び同族のアンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌの位置１５１での、（図の説明文における一文字のコードにより示される）アミノ酸の相対存在量のグラフを例示する（＜０．１％で検出されたアミノ酸（平均、全てコドンに対する）は示されず；詳細については方法、及び検出されたアミノ酸の完全なリストについては表４を参照）。データを個々のデータポイントの平均として示し、ｎ＝４の精製されたｓｆＧＦＰサンプル、培養からそれぞれが個々のコロニーから伝播される。

【図3A】それぞれ培地における５ｍＭのｐＡｚＦの存在下（＋）又は欠如下（－）における、示された位置１５１のコドン及び同族のアンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^ｐＡｚＦのｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞の蛍光のグラフを例示する。ｔ＝０は、ｐＡｚＦＲＳ、Ｔ７ ＲＮＡＰ、及びｔＲＮＡ^ｐＡｚＦの発現を誘導するためのＩＰＴＧの追加に相当し；ａＴｃは、ｓｆＧＦＰの発現を誘導するためにｔ＝０．５ｈにて追加された。ＴＡＣ、天然Ｔｙｒコドン；ＴＡＧ、アンバー終止コドン；データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。ｐＡｚＦが存在しない場合のｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１と共に観察された蛍光は、天然アミノ酸（恐らくＴｙｒ）でのｔＲＮＡ^ｐＡｚＦ（ＧＹＴ）のチャージ（ｃｈａｒｇｉｎｇ）に起因する。

【図3B】示された位置１５１のコドン及びアンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^ｐＡｚＦを発現する細胞から精製されたｓｆＧＦＰのウェスタンブロットを例示し、それぞれＴＡＭＲＡのクリック抱合及び／又は５ｍＭのｐＡｚＦの培地への添加を伴う又は伴わないものである。示される場合、マイナス記号は、ｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞におけるｔＲＮＡ^ｐＡｚＦの不在を意味する。ｓｆＧＦＰは、図３Ａに示される最後の時点にて集めた培養から精製された。ウェスタンブロットは、α－ＧＦＰ抗体により探索され、画像化されることで、ｓｆＧＦＰと抱合ＴＡＭＲＡの両方を検出した。

【図4】位置１５１にて様々なコドンを有するｓｆＧＦＰを発現する細胞の蛍光を例示する。示された位置１５１のコドンを有するｓｆＧＦＰプラスミドを運ぶ細胞は、ＯＤ_６００～０．５にまで成長し、ＩＰＴＧ及びａＴｃにより誘導された。蛍光測定値を誘導の３時間後に得た。データを個々のデータポイントにより平均として示し、ｎ＝単一コロニーから分割され且つ並行して成長される３つの培養である。

【図5A】示されたアンチコドンを有するｔＲＮＡ^Ｓｅｒを伴う又は伴わないｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１を発現する細胞の蛍光のグラフを用いた、天然のほぼ同族（ｎｅａｒ－ｃｏｇｎａｔｅ）のＡＸＣコドンのデコーディングを例示する。細胞を図１Ｃと図１Ｄに記載されるように誘導し、蛍光測定値は図１Ｃに示される最後の時点に相当する。ＧＹＴアンチコドンに関する、及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒの不在下（－ｔＲＮＡ）での値は、図１ＣとＤにおいて同じ値に相当する。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図5B】示されたアンチコドンを有するｔＲＮＡ^Ｓｅｒを伴う又は伴わないｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１を発現する細胞の成長のグラフを用いた、天然のほぼ同族のＡＸＣコドンのデコーディングを例示する。細胞を図１Ｃと図１Ｄに記載されるように誘導し、蛍光測定値は図１Ｃに示される最後の時点に相当する。ＧＹＴアンチコドンに関する、及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒの不在下（－ｔＲＮＡ）での値は、図１ＣとＤにおいて同じ値に相当する。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図6A】ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを有するＡＸＣ及びＧＸＣコドンをデコードする細胞のウェスタンブロット及び成長を例示する。培地において同族のアンチコドン、ＰｙｌＲＳ、又は２０ｍＭのＰｒＫを有するｔＲＮＡ^Ｐｙｌの存在下（＋）又は不在下（－）での、示された位置１５１のコドンを有する細胞からの（ＯＤ_６００により標準化される）溶解物のウェスタンブロット。ブロットはα－ＧＦＰ抗体（Ｎ末端エピトープ）により探索された。細胞は図２Ｂに記載されるように当量時点にて誘導され且つ集められた。

【図6B】図６Ａにおいて分析される培養の成長を例示する。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをアミノアシル化するのに必要な全ての構成要素が存在する場合、ｓｆＧＦＰ（ｔ＝１ｈ）の誘導と最終時点との間のＯＤ_６００の倍率変化は最大である。ＯＤ_６００の絶対値における変動は、Ｔ７ ＲＮＡＰ（及び存在する場合にはｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）の誘導（ｔ＝０）の開始時の細胞密度における小さな変動によるものである。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図7A】添加された非天然リボトリホスフェートに応じたｔＲＮＡ^Ｐｙｌ及び細胞の増殖を伴うＡＸＣ及びＧＸＣコドンのデコーディングを例示する。非天然リボトリホスフェート各々の存在下（＋）又は不在下（－）での、２０ｍＭのＰｒＫを伴う又は伴わない、示された位置１５１のコドン／アンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌを発現する細胞から精製されたｓｆＧＦＰ（下方のパネル）の蛍光。細胞は図２Ｂに記載されるように誘導され、蛍光測定値は、細胞を集める前、及びＴＡＭＲＡ及びウェスタンブロットのクリック抱合のためにｓｆＧＦＰタンパク質を精製する前に、誘導の終了時（～３．５ｈ）に得られた。

【図7B】添加された非天然リボトリホスフェートに応じたｔＲＮＡ^Ｐｙｌを有するＡＸＣ及びＧＸＣコドンをデコードするゲルを例示する。ウェスタンブロットは、α－ＧＦＰ抗体により探索され、画像化されることで、ｓｆＧＦＰと抱合ＴＡＭＲＡの両方を検出し；全てのレーンは添加されたＰｒＫにより成長される細胞から精製されたｓｆＧＦＰに相当する。データを個々のデータポイントにより平均として示し、ｎ＝３の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播され；ｎ．ｄ、判定されず。

【図7C】非天然デオキシリボトリホスフェート及び各非天然リボトリホスフェートの両方の存在下（＋）又は不在下（－）における、ｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞の蛍光及び成長のグラフを例示する。ｔ＝０は、Ｔ７ ＲＮＡＰの発現を誘導するためのＩＰＴＧの追加に相当し；ａＴｃは、ｓｆＧＦＰの発現を誘導するためにｔ＝１ｈにて追加された。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝３の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。使用される濃度では（方法を参照）、ｄＮａＭＴＰ及びｄＴＰＴ３ＴＰは細胞成長を阻害しないが、一方で両方の非天然リボトリホスフェート、具体的にＴＰＴ３ＴＰ、は、ある程度の成長阻害を示す。

【図7D】ＰｒＫ（２０ｍＭ）を添加した培養に相当する細胞増殖のグラフを例示し、その蛍光は図２Ｂに示される。天然コドンを有するｓｆＧＦＰを発現する細胞は、あらゆる非天然トリホスフェートを用いることなく成長したが、一方で非天然コドンを有するｓｆＧＦＰを発現する細胞は、非天然デオキシリボトリホスフェート及びリボトリホスフェートの両方を用いて成長した。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図8A】培地におけるＰｒＫ濃度に応じたｔＲＮＡ^Ｐｙｌを有するＡＸＣ及びＧＸＣコドンをデコードするゲルを例示する。ＴＡＭＲＡのクリック抱合及び示された濃度でのＰｒＫの培地への添加を伴う、示された位置１５１のコドン／アンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌを発現する細胞から精製されたｓｆＧＦＰのウェスタンブロット。ｓｆＧＦＰは、図２Ｂに記載されるように集められた細胞から誘導され且つ精製された。ウェスタンブロットは、α－ＧＦＰ抗体により探索され、画像化されることで、ｓｆＧＦＰと抱合ＴＡＭＲＡの両方を検出した。

【図8B】培地におけるＰｒＫ濃度に応じたｔＲＮＡ^Ｐｙｌを有するＡＸＣ及びＧＸＣコドンのデコーディングのグラフを例示する。それぞれ培地におけるＰｒＫ濃縮に応じた、示された位置１５１のコドン及びアンチコドンを有するｓｆＧＦＰ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌを発現する（ｃに示される最後の時点にて測定される）細胞の蛍光。０及び２０ｍＭのＰｒＫでの蛍光値は、それぞれ図２Ｂに示される（－）及び（＋）のＰｒＫ値と同じである。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【図8C】蛍光の時間的経過解析を例示する。鮮明度に関して、１つの代表的な培養のみが、各コドン／アンチコドンの対及びＰｒＫ濃度に対して示される。理論に縛られることなく、我々は、内因的なｔＲＮＡ及びｓｆＧＦＰにおけるＵＢＰ保持の損失によるデコーディングに対するＰｒＫの不在下で産生される低レベルのｓｆＧＦＰに起因すると考えた（表５）。しかし、ＰｒＫを含むｓｆＧＦＰの相対量（図８Ａ）、及び発現されたｓｆＧＦＰの絶対量（図８Ｂ及び図８Ｃ）は、培地におけるＰｒＫの増加に伴い用量依存的様式で増加し、最終的にほぼ完全なＰｒＫの取り込みをもたらし、このことは、ＡＸＣ及びＧＸＣコドンの内因的なリードスルーが、十分な濃度のチャージされたＰｒＫ－ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＧＹＴ）又はＰｒＫ－ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＧＹＣ）により効率的に抑えることができることを示唆している。

【図8D】図８Ｃに示される実験に対するＰｒＫの様々な濃度における細胞成長の時間的経過解析を例示する。

【図9】蛍光が図３Ａに示される培養の細胞成長を例示する。データは平均±ｓ．ｄとして示され、ｎ＝４の培養、それぞれ個々のコロニーから伝播される。

【0011】

表４｜図１Ｆ及び図２Ｄに記載される実験に対するｓｆＧＦＰにおける位置１５１でのアミノ酸の相対存在量。それぞれ示された位置１５１のコドン及びアンチコドンを有するｔＲＮＡを有する又は有していないｓｆＧＦＰを発現する細胞から精製されたｓｆＧＦＰは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析された。レポーターペプチドＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＸ^１５１ＩＴＡＤＫ（Ｘ＝ＰｒＫ、或いはＫ又はＲを除く識別された天然アミノ酸）及びＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＸ^１５１（Ｘ＝Ｋ又はＲの場合）に対する抽出されたＭＳ１イオン強度は、全ての観察可能なレポーターペプチドに対するイオン強度の合計のパーセンテージとして表される。値の表は、ｓｆＧＦＰの位置１５１にて検出される全てのアミノ酸の平均相対存在量及び９５％ＣＩに相当し、ｎ＝４つの精製されたｓｆＧＦＰサンプルであり、培養から各々個々のコロニーから伝播される。＜０．１％の値（平均、それぞれの図において示されるコドンに対する）は、図１Ｆ及び図２Ｄに提示されるデータから除外される。

【0012】

表５｜ＵＢＰの保持。ｓｆＧＦＰの示された位置１５１のコドン及び示されたｔＲＮＡのアンチコドンを有するプラスミドにおけるＵＢＰの保持は、方法に記載されるように、ｓｆＧＦＰ誘導の前の時点、及び誘導の終了時に判定される。報告された値は、±９５％のＣＩの（これらの２つの時点での保持から算出される）誘導の期間にわたる平均ＵＢＰ保持であり、ｎ＝各々が個々のコロニーから伝播される４つの培養であり、アスタリスクで示される値は除外され、ｎ＝３である。ｎ／ａは適用可能でないことを示す（関連配列が天然又は不在であるためである）。全てのプラスミドは、２０ｍＭのＰｒＫ又は５ｍＭのｐＡｚＦの存在下で成長された培養から単離された（Ｓｅｒデコーディング実験を除く）。ＳｅｒＲＳは、内因的な大腸菌シンテターゼによるチャージを示す。マイナス記号は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを有する細胞におけるＰｙｌＲＳの不在、又は異所的に発現されたｔＲＮＡの不在を意味する。§により示される行における保持は培養に相当し、当該培養から、ｓｆＧＦＰが更に精製され、且つ、ＴＡＭＲＡ抱合ｓｆＧＦＰのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ及び／又はウェスタンブロットによってから分析され（図１Ｆ（Ｓｅｒ）、図２Ｄ（ＰｒＫ）、及び図３Ｂ（ｐＡｚＦ）を参照）；アスタリスクを有する行は図７Ａ－Ｄにおいて分析された培養に相当する。４つ全ての非天然トリホスフェートが同じ輸送体を介して細胞に侵入し、それにより互いの移入を競合的に阻害するという事実にもかかわらず、ＵＢＰ保持における差異は、培地におけるＮａＭＴＰ及び／又はＴＰＴ３ＴＰの存在下（＋）又は不在下（－）では観察されなかった。これらのデータ、及び、高忠実度でのＰｒＫの取り込みを伴う高レベルのｓｆＧＦＰ発現のための両方の非天然リボトリホスフェートの要件（図７Ａ－Ｄ）は、ＹＺ３におけるＰｔＮＴＴ２輸送体の発現レベルがＵＢＰ複製及び転写を維持するのに必要とされる、必須レベルの非天然トリホスフェートを移入することを総体的に実証する。

【0013】

表６｜Ｓｅｒ、Ｐｒｋ、及びｐＡｚＦの取り込み実験において発現されるｓｆＧＦＰタンパク質の収率。収率は、精製されたタンパク質の総量、及び精製に使用される培養の容積から算出された（方法を参照）。データは平均±ｓ．ｄであり（ｎ＝４つのｓｆＧＦＰサンプル、それぞれ個々のコロニーから伝播される培養から精製）、及び、図３Ａ（ｐＡｚＦＲＳに対する）における（＋）ｐＡｚＦサンプルに相当する培養と同様に、図１Ｆ（ＳｅｒＲＳに対する）及び図２Ｄ（ＰｙｌＲＳに対する）において分析された同じ培養から判定された。精製されたｓｆＧＦＰの収率は、それらが精製された培養の平均の全蛍光（ＯＤ_６００へと標準化されず）に匹敵する。蛍光値は、細胞がｓｆＧＦＰ精製のために集められた時点に相当する。図１Ｃ（Ｓｅｒ）、図２Ｂ（ＰｒＫ）、及び図３Ａ（ｐＡｚＦ）を参照。

【発明を実施するための形態】

【0014】

特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は全て、主張される主題が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を持っている。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、典型的且つ例示的なものにすぎず、請求された主題の内容を限定するものではないことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は、特に別記しない限り複数を含む。明細書と添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、他にその内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むということに留意しなければならない。本出願において、「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。更に、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、制限はない。

【0015】

本明細書で使用されるように、範囲と量は、「およその（ａｂｏｕｔ）」特定の値又は範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。従って、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。

【0016】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成上の目的のためであり、記載される主題を制限すると解釈されるものではない。

【0017】

概要
生命の情報は、４文字の遺伝子アルファベットによってコードされ、これは２つの塩基対の選択的な形成によって可能とされる：（ｄ）Ｇ－（ｄ）Ｃ及び（ｄ）Ａ－ｄＴ／Ｕ。２つの合成ヌクレオチド間に形成される第３の非天然塩基対（ＵＢＰ）はこのシステムを拡張し、それにより情報記憶の可能性を増大させ、潜在的な学術的意味及び実用的意味を持つ。報告されている種々様々な合成ヌクレオチドアナログの中で幾つかは、他の天然ＤＮＡ二重螺旋内で互いに安定して対になるが、ポリメラーゼによって認識されず、このことは、二重螺旋ＤＮＡにおいて安定した対を管理する力が、ポリメラーゼで媒介された複製を管理する力と同じではないことを示している。その結果、様々な手法が、複製可能なＵＢＰ、例えば、天然ヌクレオチドにより利用されない相補的な水素結合（Ｈ結合）パターンを介して相互作用するように設計されるＵＢＰ、を発達させるために取られている。天然塩基対はＨ結合を介して形成されるが、Ｈ結合が遺伝子情報の記憶（又は回収）の基礎となるのに十分な唯一の力であると演繹的に仮定する理由は存在しない。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｆ）のクレノウ断片が、非天然ヌクレオチドｄＦによりｄＡと対になり、そのジフルオロトルエン核酸塩基は、有意なＨ結合が可能でないチミンの模倣形状であることが、実証されている。このことは、ＤＮＡ複製の「幾何学的な選択」機構を支持し、且つ、Ｈ結合以外の力も複製に起因することを示唆している。

【0018】

インビトロでタンパク質へと複製され、転写され、且つ翻訳されるＵＢＰの発達は、天然情報の記憶及び回収の基礎となる力への見識をもたらし、及び、更に化学的及び合成的な生物学において広範な適用を可能とする。しかし、ＵＢＰを発達させる多くの労力の最終目標は、半合成生物（ＳＳＯ）、増加した（非天然又は合成、ヒトにより作成されたものを意味する）情報を安定して記憶及び回収する有機体、の土台としてのインビボでの使用である。更に、そのようなＳＳＯには、ヒトの健康に対するものを含む革新的な実際的応用がある。最も著しいことに、ＳＳＯは、タンパク質治療の分野の成長に革新をもたらす。しかし、従来の小分子治療と比較して、タンパク質治療は、２０の天然アミノ酸と共に利用可能な有限の化学的多様性により、それらの分子特性がひどく制限されている。

【0019】

我々は近年、大腸菌ＳＳＯの作成を報告しており、当該大腸菌ＳＳＯは、海洋性羽状珪藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）からのヌクレオシド三リン酸輸送体により（ＰｔＮＴＴ２）、培地から必要な非天然トリホスフェートを移入し、その後、それらを使用してＵＢＰ ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３を含有するプラスミドを複製する。我々はそれ以来、ＵＢＰを含有するＤＮＡがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＳＳＯにおいて転写され得ること、及び、非天然ヌクレオチドがｍＲＮＡのコドンへと組み込まれる場合に、ｎｃＡＡをチャージされ且つアンチコドンにおいて同族の非天然ヌクレオチドを含有する様々なｔＲＮＡが効率的且つ選択的に非天然コドンをデコードし得ることを示している。ＵＢＰは様々なコドンの様々な位置にて組み合わることができるので、このことはＵＢＰを使用して多数の異なるｎｃＡＡを有するタンパク質をコードすることができることを示唆している。

【0020】

本明細書には、特定の実施形態において、突然変異体ｔＲＮＡを利用する非天然アミノ酸を含有するタンパク質の合成のための方法、組成物、及びキットが開示される。幾つかの例において、タンパク質は無細胞翻訳系において合成される。幾つかの例において、タンパク質は細胞又は半合成生物（ＳＳＯ）において合成される。幾つかの例において、半合成生物は微生物を含む。幾つかの例において、半合成生物は細菌を含む。幾つかの例において、半合成生物は大腸菌を含む。幾つかの例において、突然変異体ｔＲＮＡは突然変異体アンチコドン配列を含んでいる。幾つかの例において、突然変異体アンチコドン配列は表１に例示されるアンチコドン配列である。幾つかの例において、突然変異体アンチコドン配列は表２に例示されるアンチコドン配列である。幾つかの例において、突然変異体アンチコドン配列は表３に例示されるアンチコドン配列である。

【0021】

【表1】

【0022】

【表2】

【0023】

【表3】

【0024】

幾つかの例では、突然変異体ｔＲＮＡの突然変異体アンチコドンは、突然変異体コドンと対になっている。幾つかの実施形態において、突然変異体コドンは表１において例示される突然変異体コドンである。幾つかの実施形態において、突然変異体コドンは表２において例示される突然変異体コドンである。幾つかの実施形態において、突然変異体コドンは表３において例示される突然変異体コドンである。

【0025】

幾つかの実施形態において、表１、表２、及び表３で例示されるＹ及びＸは、非天然ヌクレオチドの非天然塩基を表わす。幾つかの実施形態において、非天然塩基は、２－アミノアデニン－９－イル、２－アミノアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２－チオシトシン、アデニンとグアニンの２－プロピル及びアルキル誘導体、２－アミノ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザグアニン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－メチル－シトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５－ブロモ、ならびに、５－トリフルオロメチルウラシル及びシトシン；５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニルシトシン、５－ウラシル、５－置換、５－ハロ、５－置換ピリミジン、５－ヒドロキシシトシン、５－ブロモシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、及び５－ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６－アルキル誘導体、６－アザピリミジン、６－アゾ－ウラシル、６－アゾ－シトシン、アザシトシン、６－アゾ－チミン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、及び８－ヒドロキシルで置換されたアデニンならびにグアニン；Ｎ４－エチルシトシン、Ｎ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、二重形成の安定を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱交雑の核酸、サイズ拡張した核酸、フッ素処理した核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジン、シチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－カルボキシヒドロキシメチルウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルクエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５オキシ酢酸、ワイブトシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピルウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリン、ならびに、プリン塩基又はピリミジン塩基が複素環式化合物と取り替えられるものから成る群から選択される。

【0026】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、以下の式（核酸塩基部分のみを示しており、明確にするためにリボースとリン酸塩の骨格は省略されている）から成る群から選択される。

【0027】

【化3】

【0028】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、以下の式（核酸塩基部分のみを示しており、明確にするためにリボースとリン酸塩の骨格は省略されている）から成る群から選択される。

【0029】

【化4】

【0030】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドはさらに非天然糖部分を含む。幾つかの例において、非天然糖部分は、２’位置での修飾：ＯＨ；置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；Ｏ－アルキル－Ｏアルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３から成る群から選択され、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ_２）ｎＯ］ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）ｎ－ＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＮ［（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３）］_２であってもよく、ｎ及びｍは１～約１０であり；及び／又は、前記非天然糖部分は、５’位置での修飾：５’－ビニル、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、４’位置での修飾、４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。

【0031】

幾つかの例において、突然変異体アンチコドン又は突然変異体コドンはさらに非天然骨格を含む。幾つかの例において、突然変異体アンチコドンはさらに非天然骨格を含む。幾つかの例において、突然変異体コドンはさらに非天然骨格を含む。例によっては、非天然骨格は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステラーゼ、アミノアルキルホスホトリエステラーゼ、Ｃ_１－Ｃ_１０ホスホン酸塩、３’アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸、３’－アミノホスホロアミド酸、アミノアルキルホスホロアミド酸、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステラーゼ、及びボラノリン酸塩からなる群から選択される。

【0032】

幾つかの例では、非天然ヌクレオチドはポリメラーゼによって認識される。幾つかの例において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素である。幾つかの例では、ポリメラーゼはΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、Ｌ１７、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、ストッフェル断片、Ｖｅｎｔ（商標）ａｎｄ Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ－Ｄ、ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ逆転写酵素である。

【0033】

幾つかの例では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ１－クレノウ断片、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＯＬＢポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、又はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素である。

【0034】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ポリメラーゼによってｍＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体コドンを含有する突然変異体ｍＲＮＡを生成する。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ポリメラーゼによってｍＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体ｍＲＮＡを生成する。

【0035】

幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ポリメラーゼによってｔＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体アンチコドンを含有する突然変異体ｔＲＮＡを生成する。幾つかの例において、非天然ヌクレオチドは、ポリメラーゼによってｔＲＮＡへと転写中に組み込まれて、突然変異体ｔＲＮＡを生成する。

【0036】

幾つかの例では、突然変異体ｔＲＮＡは非天然アミノ酸残基を表す。幾つかの例では、非天然アミノ酸残基は、Ｌｉｕ Ｃ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｐ．Ｇ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１０， ７９， ４１３に記載されるような非天然アミノ酸である。

【0037】

幾つかの例において、非天然アミノ酸を含有するタンパク質は、突然変異体ｔＲＮＡ及び突然変異体ｍＲＮＡを利用して翻訳中に生成される。幾つかの例では、非天然アミノ酸を含有するタンパク質は、無細胞翻訳系で生成される。幾つかの例において、タンパク質は細胞あるいは半合成生物（ＳＳＯ）において合成される。幾つかの例において、半合成生物は微生物を含む。幾つかの例において、半合成生物は細菌を含む。幾つかの例において、半合成生物は大腸菌を含む。

【0038】

核酸
核酸（例えば、本明細書では、標的核酸、標的ヌクレオチド配列、所望の核酸配列、あるいは所望の核酸領域とも呼ばれる）は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（短い阻害ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡ、あるいはｍＲＮＡなどの任意のソースあるいは組成物であり得、及び、任意の形態（例えば、線形、円形、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）であり得る。核酸はヌクレオチド、ヌクレオシド、又はポリヌクレオチドを含み得る。核酸は天然及び非天然の核酸を含み得る。核酸はさらに、ＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログ、及び／又は、非天然骨格など）などの非天然核酸を含み得る。「核酸」との用語は、ポリヌクレオチド鎖の特定の長さを指すか意味するものと理解され、したがって、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドもその定義に含まれる。典型的な天然ヌクレオチドとしては、限定されないが、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＧＭＰが挙げられる。典型的な天然デオキシリボヌクレオチドとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＧＭＰが挙げられる。典型的な天然リボヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、及びＧＭＰが挙げられる。ＲＮＡに関しては、ウラシル塩基がウリジンである。核酸はしばしば、ベクター、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、又は複製するあるいは複製されることが可能な他の核酸である。非天然核酸は核酸アナログであり得る。

【0039】

非天然核酸
ヌクレオチドアナログ（すなわち、非天然ヌクレオチド）は、塩基、糖、又はリン酸塩部分のいずれかになんらかの修飾を含有するヌクレオチドを含む。修飾は化学的修飾を含み得る。修飾は、例えば、３’ＯΗ又は５’ＯΗの基、骨格、糖成分、又はヌクレオチド塩基の修飾であり得る。修飾は、非天然型リンカー分子及び／又は鎖間あるいは鎖内の架橋の追加を含み得る。一態様において、修飾された核酸は、３’ＯΗ又は５’ＯΗの基、骨格、糖成分、あるいはヌクレオチド塩基の１つ以上の修飾、及び／又は非天然型リンカー分子の追加を含む。一態様において、修飾された骨格は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含む。一態様において、修飾された糖は、（修飾されたＤＮＡ中の）デオキシリボース以外の、又はリボース（修飾されたＲＮＡ）以外の糖を含む。一態様において、修飾された塩基は、（修飾されたＤＮＡ中の）アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンとは別の塩基、あるいは、（修飾されたＲＮＡ中の）アデニン、グアニン、シトシン、又はウラシルとは別の塩基を含む。

【0040】

核酸は少なくとも１つの修飾された塩基を含み得る。塩基部分の修飾は、異なるプリン又はピリミジン塩基と同様に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕの天然及び合成の修飾も含むことになる。幾つかの実施形態において、修飾は、（修飾されたＤＮＡ中の）アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンの修飾された形態、又は（修飾されたＲＮＡ中の）アデニン、グアニン、シトシン、又はウラシルの修飾された形態に対する。

【0041】

非天然核酸の修飾された塩基としては、限定されないが、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチル、シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンとグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、 ５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（偽ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、及び他の８－置換されたアデニン及びグアニン、５－ハロ、とりわけ、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換されたウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザデニン、ならびに、３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられる。特定の非天然核酸、例えば、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、及び、Ｎ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン、二本鎖形成の安定性を増大させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱交雑の核酸、サイズ拡張した核酸、フッ素処理した核酸、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびに、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６で置換されたプリン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル、アデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、ならびに２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＩ_１／４）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（偽ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、及び他の８－置換されたアデニン及びグアニン、５－ハロ、とりわけ、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、他の５－置換されたウラシル、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環と取り替えられたもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、及び５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、ならびに、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，８４５，２０５号；第４，９１０，３００号；第４，９４８，８８２号；第５，０９３，２３２号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，６８１，９４１号；第５，７５０，６９２号；第５，７６３，５８８号；第５，８３０，６５３号、及び第６，００５，０９６号；ＷＯ９９／６２９２３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ９：８０７－８１３；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ．Ｉ．，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０， ８５８－ ８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３；及び、Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３， ２７３－２８８に記載されるもの。追加の塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３， ａｎｄ Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９－３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ． ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３で見られる。

【0042】

様々な複素環塩基及び様々な糖部分（及び糖アナログ）を含む非天然核酸は当該技術分野で入手可能であり、この核酸は、天然の核酸の主要な５つの塩基成分以外の１つ又は複数の複素環塩基を含み得る。例えば、複素環塩基としては、ウラシル－５－イル、シトシン－５－イル、アデニン－７－イル、アデニン－８－イル、グアニン－７－イル、グアニン－８－イル、４－アミノピロロ［２．３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２．３－ｄ］ピリミジン－３－イルの基が挙げられ、プリンは９－位置を介して、核酸の糖部分に結合し、ピリミジンは１－位置を介して、ピロロピリミジンは７－位置を介して、ピラゾロピリミジンは１－位置を介して、核酸の糖部分に結合する。

【0043】

ヌクレオチドアナログもリン酸塩部分で修飾され得る。修飾されたリン酸塩部分としては、限定されないが、２つのヌクレオチド間の結合が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、及び、３’－アルキレンホスホン酸塩とキラルホスホン酸塩を含む他のアルキルホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、３’－アミノホスホロアミダートとアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノリン酸塩を含むように、修飾され得るリン酸塩部分が挙げられる。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸塩結合又は修飾されたリン酸塩結合は、３’－５’結合あるいは２’－５’結合を介することがあり得、及び、その結合は、３’－５’から５’－３’あるいは２’－５’から５’－２’などの逆極性を含み得ることが理解されよう。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。多くの米国特許は、修飾されたリン酸塩を含有するヌクレオチドをどのようにして作って使用するかについて教示しており、限定されないが、第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；及び第５，６２５，０５０号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。

【0044】

非天然核酸は、２’，３’－ジデオキシ－２’，３’－ジデヒドロ－ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６４６０）、５’－置換されたＤＮＡ及びＲＮＡ誘導体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３９６１；Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．，１９９５， ６０， ７８８－７８９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９９， ９， ８８５－８９０；及び、Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９１， １０（１－３）， ３３９－３４３；Ｌｅｏｎｉｄ ｅｔ ａｌ， １９９５， １４（３－５）， ９０１－９０５；及び、Ｅｐｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ２００４， ８７， ３００４－３０２０；ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００４７２０； ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００２３４２； ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３２１６； ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２０４３５； ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５４７９； ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４８４； ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５６７１８； ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６７５６０），あるいは、修飾塩基を用いて一リン酸塩として作られた５’置換された単量体（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ２００４， ２３ （１ ＆ ２）， ３１７－３３７）を含み得る。

【0045】

非天然核酸は、糖環（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９９３）の５’－位置及び２’－位置の修飾、例えば、５’－ＣＨ_２置換された２’－Ｏ－保護されたヌクレオシド（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ２０００， ８３， １１２７－１１４３ 及び Ｗｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １９９９， １０， ９２１－９２４）を含み得る。非天然核酸は、オリゴヌクレオチドへの取り込みのために調製されたアミド結合ヌクレオシド二量体を含み得、ここで、二量体中の３’結合ヌクレオシド（５’～３’まで）は、２’－ＯＣＨ_３と５’－（Ｓ）－ＣＨ_３を含む（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｙｎｌｅｔｔ， １９９７， １２８７－１２９０）。非天然核酸は２’置換された５’－ＣＨ_２（又はＯ）修飾されたヌクレオシドを含むことができる（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２０）。非天然核酸は５’メチレンホスホナートＤＮＡ及びＲＮＡ単量体、及び二量体を含み得る（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．，１９９３，３４，２７２３－２７２６；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｙｎｌｅｔｔ， １９９５，７，７０３－７０５； 及び、Ｈｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００２，８５，２７７７－２８０６）。非天然核酸は、２’－置換（ＵＳ２００６／００７４０３５）を有する５’－ホスホン酸塩単量体、及び他の修飾された５’－ホスホン酸塩単量体（ＷＯ９７／３５８６９）を含むことができる。非天然核酸は５’修飾されたメチレンホスホナート単量体（ＥＰ６１４９０７及びＥＰ６２９６３３）を含むことができる。非天然核酸は、５’又は６’位置にヒドロキシル基を含む５’又は６’－ホスホン酸塩リボヌクレオシドのアナログを含み得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ， Ｓｕｌｆｕｒ ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ， ２００２， ７７７， １７８３－１７８６； Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２０００， ８， ２５０１－２５０９， Ｇａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，２００７， ９２５－９３３ ａｎｄ Ｈａｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，１９７６， １９（８）， １０２９－１０３３）。非天然核酸は、５’－リン酸基を有する、５’－ホスホン酸塩デオキシリボヌクレオシド単量体及び二量体を含み得る（Ｎａｗｒｏｔ ｅｔ ａｌ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ２００６， １６（１）， ６８－８２）。非天然核酸は６’－ホスホン酸塩基を有するヌクレオシドを含み得、５’又は／及び６’－位置は、非置換であるか、あるいは、チオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ_３）３）（及びそのアナログ）；メチレンアミノ基（ＣＨ_２ＮＨ_２）（及びそのアナログ）、あるいはシアノ基（ＣＮ）（及びそのアナログ）で置換される（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｙｎｌｅｔｔ， ２００１， ４， ４６７－４７２；Ｋａｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，１９８６， ２９， １０３０－１０３８ ａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，１９８２， ２５， １１７９－１１８４；Ｖｒｕｄｈｕｌａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，１９８７， ３０， ８８８－８９４；Ｈａｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，１９７６， １９， １３７１－１３７７；Ｇｅｚｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １９８３， １０５（２６）， ７６３８－７６４０ ａｎｄ Ｈａｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １９７３， ９５（１３）， ４４０４－４４１４）

【0046】

非天然核酸は、糖部の修飾を含み得る。本発明の核酸は、１つ以上のヌクレオシドを随意に含み得、糖類は修飾されている。そのような糖修飾されたヌクレオシドは、増強されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性、又は他のある程度の有益な生物学的なプロパティを与え得る。特定の実施形態において、核酸は化学的に修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学的に修飾されたリボフラノース環の実施例としては、限定されないが、置換基（５’及び／又は２’置換基を含む）の追加；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための２つの環原子の架橋；リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、又はＣ（Ｒ_１）（Ｒ_２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル、又は保護基）との取り替え；及び、これらの組み合わせが挙げられる。化学的に修飾された糖の例は、ＷＯ ２００８／１０１１５７、ＵＳ２００５／０１３０９２３、及びＷＯ ２００７／１３４１８１で見られる。

【0047】

修飾された核酸は修飾された糖又は糖アナログを含み得る。したがって、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「アナログ」シクロペンチル基であり得る。糖はピラノシル、又はフラノシル形態であり得る。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、又は、２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであり得、糖は、［α］又は［β］アノマー構成のいずれかのそれぞれの複素環塩基に結合し得る。糖修飾としては、限定されないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡアナログ、２’－アミノＲＮＡアナログ、２’－フルオロＤＮＡ、及び２’－アルコキシ又はアミノＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル－ウリジン及び２’－Ｏ－メチル－シチジンを含み得る。糖修飾は、２’－Ｏ－アルキル置換されたデオキシリボヌクレオシド、及び、２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドを含む。これらの糖又は糖アナログ、及び、それぞれの「ヌクレオシド」（ここで、上記糖又はアナログは複素環塩基（核酸塩基）に結合している）の調製は知られている。糖修飾は他の修飾を用いて作られ、他の修飾と組み合わされてもよい。

【0048】

糖部分の修飾は、非天然修飾と同様に、リボース及びデオキシリボースの天然修飾も含む。糖修飾は、限定されないが、２’位置の以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；あるいはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルを含み、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_１０アルケニル、あるいはＣ_２－Ｃ_１０アルキニル及びアルキルであり得る。２’糖修飾はさらに、限定されないが、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＮＨ_２、及び、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）Ｊ_２を含み、ｎとｍは１～約１０までである。

【0049】

２’位置での他の修飾は、限定されないが、Ｃ_１－Ｃ_１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を向上させるための基、あるいは、オリゴヌクレオチドの薬力学的な特性を改善するための基、及び、同様の特性を有する他の置換基を含む。同様の修飾が、糖での他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’－５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われ得る。修飾された糖はさらに、ＣＨ_２とＳなどの架橋環酸素で修飾を含むものを含んでいる。ヌクレオチド糖アナログは、ペントフラノシル糖の適所にシクロブチル部分などの糖ミメティックを有し得る。そのような修飾された糖構造の調製を教示する多くの米国特許があり、例えば、第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；及び第５，７００，９２０号などであり、これらの各々は全体として引用することで本明細書に組み込まれ、一連の塩基修飾について詳述及び記載している。これらの特許の各々は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0050】

修飾された糖部分を有する核酸の例は、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ_３、及び２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３置換基を含む核酸を含む。２’位置の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、及びＯ－Ｃ Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、及びＯ－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）から選択され得、ここで、Ｒ_ｍ及びＲ_ｎはそれぞれ独立してＨあるいは置換又は非置換のＣ_１－Ｃ_１０アルキルである。

【0051】

特定の実施形態において、本発明の核酸は１つ以上の二環式核酸を含む。特定のそのような実施形態において、二環式核酸は、４’及び２’リボシル環原子との間に架橋を含む。ある実施形態では、本明細書で提供される核酸は１つ以上の二環式核酸を含み、ここで、架橋は４’～２’の二環式核酸を含む。こうした４’～２’の二環式核酸は、限定されないが、以下の式の１つを含む：４’－（ＣＨ_２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ_２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’及び４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－０－２’、及びこれらのアナログ（２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号）；４’－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）－０－２’及びそのアナログ（ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２００８／１５０７２９、ＵＳ２００４／０１７１５７０、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，２ ０９， ７４， １１８－１３４）、及び２００８年１２月８日に公開されたＷＯ２００８／１５４４０１）。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８， ４， ４５５－４５６； Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９８， ５４， ３６０７－３６３０； Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００， ９７， ５６３３－５６３８； Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．，１９９８， ８， ２２１９－２２２２； Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，１９９８， ６３， １００３５－１００３９； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２９（２６） ８３６２－８３７９ （Ｊｕｌ． ４， ２００７）； Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ． Ｄｒｕｇｓ， ２００１， ２， ５５８－５６１； Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ， ２００１， ８， １－７； Ｏｒａｍ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２００１， ３， ２３９－２４３；米国特許第７，０５３，２０７号、第６，２６８，４９０号、第６，７７０，７４８号、第６，７９４，４９９号、第７，０３４，１３３号、第６，５２５，１９１号、第６，６７０，４６１号、及び、第７，３９９，８４５号；国際出願ＷＯ２００４／１０６３５６、ＷＯ１９９４／１４２２６、ＷＯ２００５／０２１５７０、及びＷＯ２００７／１３４１８１；米国特許公報ＵＳ２００４／０１７１５７０号、ＵＳ２００７／０２８７８３１号、及びＵＳ２００８／００３９６１８号；米国特許シリアル番号１２／１２９，１５４号、６０／９８９，５７４号、６１／０２６，９９５号、６１／０２６，９９８号、６１／０５６，５６４号、６１／０８６，２３１号、６１／０９７，７８７号、６１／０９９，８４４号；及びＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４、及びＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２、ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３；及び、米国特許４，８４９，５１３号；５，０１５，７３３号；５，１１８，８００号；及び５，１１８，８０２号を参照。

【0052】

特定の実施形態において、核酸は連結された核酸を含み得る。核酸は任意の核酸間結合も使用して一緒に結合され得る。核酸間結合基の２つのメインクラスは、リン原子の存在あるいは不在によって定義される。核酸間結合を含有する代表的なリンとしては、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミダート、及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。核酸間結合を含有する代表的な非リンとしては、限定されないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；及び、Ｎ，Ｎ－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－）が挙げられる。ある実施形態では、キラル原子を有する核酸間結合は、別のエナンチオマー、例えば、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートとして、ラセミ混合物を調製することができる。非天然核酸は単一の修飾を含み得る。非天然核酸は、複数の部分の１つ内に、又は異なる部分間に、複数の修飾を含み得る。

【0053】

核酸への骨格リン酸塩の修飾は、限定されないが、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート（架橋又は非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、及びボラノリン酸塩を含み、任意の組み合わせで使用され得る。他の非リン酸塩結合も使用され得る。

【0054】

幾つかの実施形態において、骨格修飾（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びホスホロジチオエートヌクレオチド間結合）は、修飾された核酸に免疫調節活性を与えることができ、及び／又は、そのインビボでの安定性を増強することができる。

【0055】

亜リン酸誘導体（あるいは修飾されたリン酸基）は、糖又は糖アナログ部分に結合され得、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルホスホナート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなどであり得る。修飾されたリン酸塩結合あるいは非リン酸塩結合を含有する例示的なポリヌクレオチドは、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： １８４１－１８４８； Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２３１８－２３２３； ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２９６６－２９７３； Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ （１９９７） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ： ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ” ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ， （ＤＪ． Ｃｈａｄｗｉｃｋ ａｎｄ Ｇ． Ｃａｒｄｅｗ， ｅｄ．） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； （Ｚｏｎ （１９９３） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ” ｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １６５－１９０）； （Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７１） ＪＡＣＳ ９３：６６５７－６６６５） ； （Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７：７２４７－７２４６）， （Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＪＯＣ ６２：７２７８－７２８７） （Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４５３，４９６）； Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ， Ｊ． ２００１， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８： １１５７－１１７９で見つけることができる。

【0056】

骨格の修飾は、ホスホジエステル結合を、アニオン性基、中性基、あるいはカチオン基などの代替部分と取り替えることを含む。そのような修飾の例としては、以下が挙げられる：アニオン性ヌクレオシド間結合；Ｎ_３’～Ｐ５’ホスホロアミダート修飾；ボラノリン酸塩ＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；ホスホン酸メチルなどの中性のヌクレオシド間結合；アミド結合ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）結合；ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合；スルホニル基を含む骨格；モルホリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；及び、正電荷のデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）オリゴ（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ， Ｊ． ２００１， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８： １１５７－１１７９）。修飾された核酸は、１つ以上の修飾、例えば、ホスホジエステルとホスホロチオエートの結合の組み合わせなどのリン酸塩結合の組み合わせを含む、キメラあるいは混合骨格を含み得る。

【0057】

リン酸塩の置換基は、例えば、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は、１つ以上の短鎖ヘテロ原子あるいは複素環ヌクレオシド間結合であり得る。これらは、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホンの骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）及びチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）の骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルの骨格；骨格を含むアルケン；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノの骨格；スルフォナートとスルホンアミドの骨格；アミド骨格；ならびに、混合したＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２の構成部分を有する他のもの、を含む。多くの米国特許は、これらのタイプのリン酸塩交換物をどのように作り使用するかについて開示しており、限定されないが、第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７７，４３９号を含み、その各々は引用によって本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドの糖とリン酸塩の部分の両方が例えば、アミド型結合（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）（ＰＮＡ）と取り替えられ得ることも、ヌクレオチド置換で理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び、第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのようにして作り使用するかを教示しており、その各々は、引用によって本明細書に組み込まれる。（同様に、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７－１５００も参照）。抱合体は、ヌクレオチド又はヌクレオチドのアナログに化学的に結合され得る。そのような抱合体としては、限定されないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ． ， １９９４， ４， １０５３－１０６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． ＫＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，１９９２， ６６０， ３０６－３０９； Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ． ， １９９３， ３， ２７６５－２７７０）、チオールコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ， １９９２， ２０， ５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールあるいはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭ５ＯＪ， １９９１， １０， １１１１－１１１８； Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０， ２５９， ３２７－３３０； Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールあるいはトリエチルアンモニウム ｌ－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ， １９９５， ３６， ３６５１－３６５４； Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ， １９９０， １８， ３７７７－３７８３）、ポリアミンあるいはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４， ９６９－９７３）、あるいはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ， １９９５， ３６， ３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５，１２６４， ２２９－２３７）、あるいは、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステリン部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６， ２７７， ９２３－９３７）が挙げられる。多くの米国特許がそのような抱合体の調製を教示しており、限定されないが、以下を含む：米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；及び、第５，６８８，９４１号を含み、これらの各々は全体的に参照によって本明細書に組み込まれる。

【0058】

ポリメラーゼ
ポリメラーゼのとりわけ有益な機能は、既存の核酸を鋳型として使用して、核酸鎖の重合を触媒することである。有益な他の機能は本明細書の他の場所に記載される。有益なポリメラーゼの実施例はＤＮＡポリメラー及びＲＮＡポリメラーゼを含む。

【0059】

ポリメラーゼ非天然核酸の特異性、処理能力、あるいは他の特徴を改善するための能力は、例えば、増幅、配列決定、標識、検出、クローニング、及び他の多くのものを含む、非天然核酸取り込みが望まれる様々な文脈において非常に望ましい。本発明は、非天然核酸のための修飾された特性を有するポリメラーゼ、そのようなポリメラーゼを製造する方法、そのようなポリメラーゼを使用する方法、及び以下の完全な検討後に明らかになるだろう他の多くの特徴を提供する。

【0060】

幾つかの例では、本明細書に開示されるのは、例えば、ＤＮＡ増幅中に、成長する鋳型コピーに非天然核酸を組み込むポリメラーゼを含む。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼの活性部位を修飾して、活性部位への非天然核酸の立体の侵入阻害を減少するように、ポリメラーゼを修飾することができる。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、非天然核酸の１つ以上の非天然な特徴との相補性を提供するように修飾することができる。従って、本発明は、異種あるいは組換えポリメラーゼを含む組成物及びそれらの使用方法を含む。

【0061】

ポリメラーゼはタンパク質工学に関する方法を使用して修飾することができる。例えば、結晶構造に基づいて分子モデリングを実行して、標的活動を変更するために突然変異を起こすことができるポリメラーゼの位置を同定することができる。置換の標的として同定された残基は、Ｂｏｒｄｏ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１７： ７２１－７２９ （１９９１） ａｎｄ Ｈａｙｅｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９９： １５９２６－ １５９３１ （２００２）などに記載されるエネルギー最小化モデリング、相同性モデリング、及び／又は保存的アミノ酸置換を使用して、選択された残基と交換することができる。

【0062】

様々なポリメラーゼのいずれかは、例えば、生物系及びその機能的変異体から単離されたタンパク質ベースの酵素を含む、本明細書に記載される方法あるいは組成物に使用することができる。以下に例証されるものなどの特定のポリメラーゼへの言及は、特に明記しない限り、それらの機能的変異体を含むと理解されるだろう。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは野生型ポリメラーゼである。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、修飾ポリメラーゼあるいは突然変異ポリメラーゼである。

【0063】

活性部位領域への非天然核酸の侵入を改善するための、及び活性部位領域における非天然ヌクレオチドと配位させる（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ）ための特徴を有するポリメラーゼも使用することができる。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼは修飾ヌクレオチド結合部位を有する。

【0064】

幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼは、非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である非天然核酸に対する特異性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、修飾された糖を含まない天然核酸及び／又は非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である修飾された糖を含む非天然核酸に対する特異性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、修飾された塩基を含まない天然核酸及び／又は非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である修飾された塩基を含む非天然核酸に対する特異性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、三リン酸塩を含む天然核酸及び／又は三リン酸塩を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、三リン酸塩を含む非天然核酸に対する特異性を有する。例えば、修飾野生型ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、二リン酸塩又は一リン酸塩を有する非天然核酸、リン酸塩を有しない非天然核酸、又はそれらの組み合わせに対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、三リン酸塩を含む非天然核酸に対する特異性を有する。

【0065】

幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対して緩い特異性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対する特異性、及び天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、修飾された糖を含む非天然核酸に対する特異性、及び天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、修飾された塩基を含む非天然核酸に対する特異性、及び天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。

【0066】

エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、野生型の特徴であるか、あるいは変異体又は組換えられたポリメラーゼによって付与される特徴であり得る。例えば、エキソマイナスクレノウ断片は、３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片の突然変異型である。

【0067】

本発明の方法は、内因性３～５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くか、あるいは例えば、突然変異により３～５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性が無効になっている、任意のＤＮＡポリメラーゼの基質範囲を拡張するために使用することができる。ＤＮＡポリメラーゼの例には、ｐｏｌＡ、ｐｏｌＢ（例えば、Ｐａｒｒｅｌ ＆ Ｌｏｅｂ， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ ２００１を参照）ｐｏｌＣ、ｐｏｌＤ、ｐｏｌＹ、ｐｏｌＸ及び逆転写酵素（ＲＴ）が含まれるが、好ましくは、進行性忠実度が高いポリメラーゼ（ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４６４３）である。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼあるいは野生型ポリメラーゼは、天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、非天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。

【0068】

幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼは、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、非天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼは、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、非天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性及び天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。幾つかの実施形態において、修飾ポリメラーゼは、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、天然核酸に対する３’～５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。

【0069】

関連する態様において、本発明は修飾ポリメラーゼを製造する方法を提供し、上記方法は、親ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を構造的にモデル化する工程と、１つ以上の複合体の安定性、あるいは複合体の安定性又はヌクレオチドのアクセス又は活性部位での結合に影響を与えるヌクレオチド相互作用特徴、あるいは活性部位のヌクレオチドアナログに対する相補的特徴とを同定する工程と、及びこれらの特徴を含むかあるいは除去するように親ポリメラーゼを変異させる工程と、を含む、修飾ポリメラーゼを製造する方法を提供する。例えば、ポリメラーゼを突然変異させて、活性部位に対する非天然ヌクレオチドの立体アクセス（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｃｅｓｓ）を改善するか、あるいは非天然ヌクレオチドとポリメラーゼとの間の電荷－電荷あるいは疎水的相互作用を改善することができる。上記方法は、結果として得られる修飾ポリメラーゼが、親ポリメラーゼと比較して、成長する核酸コピーへのヌクレオチドあるいは非天然ヌクレオチドの取り込みの増加を示すか否かを判断することも含む。

【0070】

ポリメラーゼは、核酸からの解離の速度に従って特徴づけることができる。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、１つ以上の天然及び非天然核酸の比較的低い解離速度を有する。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、１つ以上の天然及び非天然核酸の比較的高い解離速度を有する。上記解離速度は、本明細書に記載される方法で反応速度を合わせるために調整することができるポリメラーゼの活性である。

【0071】

ポリメラーゼは、特定の天然核酸及び／又は非天然核酸、あるいは天然核酸及び／又は非天然核酸の収集物と共に使用される場合、それらの忠実度に従って特徴づけることができる。忠実度とは、核酸鋳型のコピーを作る際に、ポリメラーゼが成長する核酸鎖へと正確な核酸を組み込む精度を一般的に指す。ポリメラーゼ鎖鋳型核酸二元複合体中の同じ部位で鎖合成をめぐって競い合うために、天然核酸及び非天然核酸が、例えば、等しい濃度で存在する場合、正確な天然核酸及び非天然核酸の組み込み対不正確な天然核酸及び非天然核酸の組み入れの比率として、ＤＮＡポリメラーゼの忠実性を測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ忠実度は、天然核酸及び非天然核酸の（ｋｃａｔ／ＫＭ）と、不正確な天然核酸及び非天然核酸の（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ）の比率として計算可能であり：ここで、ｋ_ｃａｔ及びｋ_ｍは、 定常状態酵素反応速度論（Ｆｅｒｓｈｔ， Ａ． Ｒ． （１９８５） Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ２ｎｄ ｅｄ．，ｐ ３５０， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．、参照により本明細書に組み込まれる）におけるミハエリス・メンテンパラメータである。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性の有無に関わらず、少なくとも約１００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１ｘ１０^６の忠実度値を有する。

【0072】

天然源あるいはその変異体からのポリメラーゼは、特定の構造を有する非天然核酸の取り込みを検出するアッセイを使用してスクリーニングすることができる。一実施例において、ポリメラーゼは、非天然核酸あるいはＵＢＰ；例えば、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、あるいはｄ５ＳＩＣＳＴＰ－ｄＮａＭＴＰ ＵＢＰを組み込む能力についてスクリーニングすることができる。野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸の修飾された特性を呈するポリメラーゼ、例えば、異種ポリメラーゼを使用することができる。例えば、修飾された特性は、例えば、Ｋ_ｍ、ｋ_ｃａｔ、Ｖ_ｍａｘ、非天然核酸（又は、自然発生のヌクレオチド）の存在下におけるポリメラーゼ処理能力、非天然核酸の存在下におけるポリメラーゼによる平均鋳型リード長、非天然核酸に対するポリメラーゼの特異性、非天然核酸の結合速度、生成物（ピロリン酸、三リン酸塩など）の放出速度、分岐速度、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。一実施形態では、修飾された特性は、非天然核酸のｋ_ｍの減少及び／又は非天然核酸のｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍあるいはＶ_ｍａｘ／Ｋ_ｍの増加である。同様に、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸の結合速度の増加、生成物放出速度の増加、及び／又は分岐速度の減少を随意に有する。

【0073】

同時に、ポリメラーゼは、成長する核酸コピーへと、天然核酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔを組み込むことができる。例えば、ポリメラーゼは、対応する野生型ポリメラーゼより少なくとも約５％（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）高い天然核酸の比活性と、天然核酸の存在下における野生型ポリメラーゼより少なくとも５％（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）高い、鋳型の存在下における天然核酸の処理能力とを随意に示す。随意に、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼより少なくとも約５％（例えば、約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、あるいは１００％以上）高い、自然発生のヌクレオチドに対するｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍあるいはＶ_ｍａｘ／Ｋ_ｍを示す。

【0074】

特定の構造の非天然核酸を組み込む能力を有し得る本明細書で使用されるポリメラーゼは、定向進化アプローチを使用して生成することもできる。核酸合成アッセイは、様々な非天然核酸のいずれかに対して特異性を有するポリメラーゼ変異体をスクリーニングするために使用することができる。例えば、ポリメラーゼ変異体は、核酸へと、非天然核酸あるいはＵＢＰ；例えば、ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭアナログ、又はｄＴＰＴ３－ｄＮａＭ ＵＢＰを組み込む能力についてスクリーニングすることができる。幾つかの実施形態において、そのようなアッセイは、例えば、組換えポリメラーゼ変異体を使用するインビトロのアッセイである。そのような定向進化技術は、本明細書に記載される非天然核酸のいずれかに対する活性に適したポリメラーゼの変異体をスクリーニングするために使用することができる。

【0075】

記載される組成物の修飾ポリメラーゼは随意に、修飾された及び／又は組換えΦ２９型ＤＮＡポリメラーゼであり得る。随意に、ポリメラーゼは、修飾された及び／又は組換えΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、あるいはＬ１７ポリメラーゼであり得る。

【0076】

本発明における一般的に有用な核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及び突然変異体あるいはそれらの変化型を含む。ＤＮＡポリメラーゼ及びその特性は、とりわけ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ． （１９９１）に詳細が記載されている。本発明における有用な既知の従来のＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないが、パイロコッカス・フリオサス （Ｐｆｕ） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｇｅｎｅ， １０８： １， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）， バイロコッカス・ヴェッセイ （Ｐｗｏ） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２０：１８６－８， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）， サーマス・サーモフィラス （Ｔｔｈ） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１），バチルス・ステアロサーモフィルス ＤＮＡポリメラーゼ （Ｓｔｅｎｅｓｈ ａｎｄ ＭｃＧｏｗａｎ， １９７７， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（サーモコッカス・リトラリス）（ＴＩｉ） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる， Ｃａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ， １９： ４１９３， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）， ９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）， ストッフェルフラグメント（Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）， サーモシーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ）， Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）， テルモトガ・マリティマ（Ｔｍａ） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ ａｎｄ Ｓａｂｉｎｏ， １９９８ Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ． Ｒｅｓ， ３１ ：１２３９）， テルムス・アクウァーティクス （Ｔａｑ） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ， １９７６， Ｊ． Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ， １２７： １５５０）， ＤＮＡポリメラーゼ， パイロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ） ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ （Ｔａｋａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３：４５０４）， ＪＤＦ－３ ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＪＤＦ－３， 特許出願国際公開第０１３２８８７からの）， パイロコッカス ＧＢ－Ｄ （ＰＧＢ－Ｄ） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる， Ｊｕｎｃｏｓａ－Ｇｉｎｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １６：８２０， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）， ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ （好熱性テルモトガ・マリティマからの； Ｄｉａｚ ａｎｄ Ｓａｂｉｎｏ， １９９８ Ｂｒａｚ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｒｅｓ， ３１ ：１２３９； ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）， Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ （サーモコッカス ゴルゴナリウス（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）からの， Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）， 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ （Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ， １９８３， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ． １１ ：７５０５）， Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ （Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ， １９８１， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６：３１１２）， 及び古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼ ＩＩ （Ｃａｎｎ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１４２５０）が挙げられる。中温性ポリメラーゼ及び好熱性ポリメラーゼの両方が考慮される。好熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないが、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、ストッフェルフラグメント、Ｖｅｎｔ（商標）及びＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、及びその突然変異体、変異体、ならびに誘導体が挙げられる。３‘エキソヌクレアーゼが欠損している突然変異体であるポリメラーゼが考慮される。本発明において有用な逆転写酵素は、限定されないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ、及び他のレトロウイルス（Ｌｅｖｉｎ， Ｃｅｌｌ ８８：５－８ （１９９７）； Ｖｅｒｍａ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ４７３：１－３８ （１９７７）； Ｗｕ ｅｔ ａｌ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３：２８９－ ３４７（１９７５）を参照）からの逆転写酵素を含む。さらに、ポリメラーゼの例としては、限定されないが、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＶｅｎｔＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００４） “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７９（１２）， １１８３４－１１８４２； Ｇａｒｄｎｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｋ “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｇａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｒｃｈａｅｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２７（１２） ２５４５－２５５３．）を含む。非好熱生物から単離されたポリメラーゼは熱失活であり得る。例はファージからのＤＮＡポリメラーゼである。様々なソースのいずれかからのポリメラーゼを改変して、高温条件に対するそれらの耐性を増大あるいは減少することができることが理解されるだろう。幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは好熱性であり得る。幾つかの実施形態において、好熱性ポリメラーゼは熱失活であり得る。好熱性ポリメラーゼは、高温条件又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に利用されるような熱サイクリング条件に典型的に有用である。

【0077】

幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、Φ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、Ｌ１７、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、ストッフェルフラグメント、Ｖｅｎｔ（商標）及びＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ－Ｄ、ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を含む。

【0078】

幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ１－クレノウ断片、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＯＬＢポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素、又はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素である。

【0079】

加えて、そのようなポリメラーゼは、例えば、ポリメラーゼによるＤＮＡへの非天然核酸残基の取り込みを含む増幅あるいは配列決定の文脈におけるリアルタイムアプリケーションを含む、ＤＮＡ増幅及び／又は配列決定アプリケーションに使用することができる。他の実施形態では、組み込まれる非天然核酸は天然残基と同じであり得、例えば、その場合、非天然核酸の標識あるいは他の部分が、取り込み中にポリメラーゼの作用によって除去されるか、あるいは、非天然核酸は、天然核酸と区別する１つ以上の特徴を有することができる。

【0080】

地球上の全ての生命の少なくとも最後の共通の祖先以来、遺伝子情報は、２つの塩基対の形成によって伝播及び検索される４文字のアルファベットで保存されている。合成生物学の中心となる目標は、新たな生命体及び機能を作成することであり、この目標への最も一般的な経路は、そのＤＮＡが第３の非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する２つの追加の文字を抱える半合成生物（ＳＳＯ）を作成することである。以前に、そのようなＳＳＯを生成する我々の努力は、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）（ＰｔＮＴＴ２）からのヌクレオシド三リン酸トランスポーターのおかげで結果的に大腸菌の菌株の作成へと至り、培地から必要な非天然三リン酸塩を移入し、その後、それらを使用して、ＵＢＰ ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３を含むプラスミドを複製する（図１Ａ）。ＳＳＯは、増加した情報を保存するが検索はせず、それは、ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡへのＵＢＰのインビボの転写、非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡのアミノアシル化、及び最後に、リボソームでデコードする際のＵＢＰの効率的な参加を必要とする。ここで、我々は、２つの異なる非天然コドンを有するｍＲＮＡ及び同族の非天然アンチコドンを有するｔＲＮＡへの、ｄＮａＭとｄＴＰＴ３を含むＤＮＡのインビボの転写、及び、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）への天然あるいは非基準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の部位特異的な取り込みを指示するためのリボソームでのそれらの効率的なデコードを報告する。結果は、水素結合とは別の相互作用が情報蓄積及び検索のすべてのステップに寄与し得ることを実証する。結果として生じるＳＳＯは、増加した情報をコード化と検索の両方を行い、新たな生命体ならびに機能の作成のためのプラットフォームとして機能するべきである。

【0081】

緑色蛍光タンパク質、及びｓｆＧＦＰなどの変異体は、様々な天然及びｎｃＡＡを許容すると示されている位置Ｙ１５１を含むアンバー抑制システムを使用する、ｎｃＡＡの取り込みに関する研究のためのモデルシステムとして機能した（図４）。非天然コドンのデコードを調査するために、我々は、まず、ｓｆＧＦＰの位置１５１でのＳｅｒの取り込みに注目した。なぜなら、大腸菌セリン・アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＳｅｒＲＳ）がｔＲＮＡアミノアシル化のアンチコドン認識に依拠せず、したがって、非効率的なチャージの潜在的な合併症を排除するためである。ＳＳＯ株ＹＺ３は、ｓｆＧＦＰ及び大腸菌ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ遺伝子（ｓｅｒＴ）をコードするプラスミドで形質転換され、ｓｆＧＦＰコドン１５１（ＴＡＣ）は非天然コドンＡＸＣ（ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１；Ｘ＝ＮａＭ）と置き換えられ、ならびにｓｅｒＴのアンチコドンは非天然アンチコドンＧＹＴ（ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＹＴ）；Ｙ＝ＴＰＴ３と置き換えられた（図１Ｂ）。形質転換体を、ｄＮａＭＴＰ及びｄＴＰＴ３ＴＰで補足された培地中で成長させ、その後、ＮａＭＴＰ及びＴＰＴ３ＴＰ、ならびにイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）でさらに補足して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＹＴ）の発現を誘発した。ｔＲＮＡ誘発の短い期間の後、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を加えて、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１の発現を誘発した。

【0082】

誘発後、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１をコードするがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＹＴ）を欠く対照プラスミドで形質転換された細胞は、位置１５１で天然Ｓｅｒコドンを有するｓｆＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ（ＡＧＴ）^１５１；図１Ｃ）をコードするプラスミドで形質転換された細胞と比較して、劇的に減少した蛍光を示した。さらに、細胞増殖は、おそらくリボソームの停止及び分離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）により、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１（図１Ｄ）の誘発の際にプラトーに達し始めた。これらの細胞の溶解物を、抗ＧＦＰの抗体を用いたウェスタンブロットにさらし、それは、ｓｆＧＦＰ発現の有意な減少と、非天然コドンの位置で切断されたｓｆＧＦＰの存在を明らかにした（図１Ｅ）。これに対して、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＹＴ）の両方をコードするプラスミドで形質転換された細胞は、ｓｆＧＦＰ（ＡＧＴ）^１５１（図１Ｃ）を発現する対照細胞とほぼ等しい蛍光を示し、細胞増殖はｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１（図１Ｄ）の誘発の際にプラトーに達することなく、及び、これらの細胞からの溶解物のウェスタンブロットは完全長のｓｆＧＦＰタンパク質のみを明らかにした（図１Ｅ）。さらに、我々は、ＡＸＣコドンをデコードするために、同一様式で発現される４つすべての天然のほぼ同族（ｎｅａｒ－ｃｏｇｎａｔｅ）のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＮＴ）；Ｎ＝Ｇ、Ｃ、Ａ、又はＴ）の能力を評価した。いずれの場合にも、蛍光はほとんど観察されず、増殖異常が残った（図５Ａ及び５Ｂ）。これらのデータは、ＰｔＮＴＴ２が、両方の非天然ヌクレオチドのデオキシトリホスフェート及びリボトリホスフェートの両方を移入することができること、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、インビボで非天然ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ及びｔＲＮＡを転写することができること、ならびに、リボソームが、非天然アンチコドンを用いて非天然コドンを効率的にデコードすることを実証する。

【0083】

デコードの忠実度を評価するために、我々は、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳによって、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ（ＧＹＴ）の両方を発現する細胞から精製されたタンパク質を分析し、ピーク強度によって相対的定量を分析した。これは、位置１５１でのＳｅｒの９８．５±０．７％（９５％のＣＩ、ｎ＝４）の取り込みを明らかにし、Ｉｌｅ／Ｌｅｕは主な不純物であった（図１Ｆ及び表４）。ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１遺伝子におけるＵＢＰの保持が９８±２％（９５％のＣＩ、ｎ＝４）であり（表５）、及び、Ｘ→Ｔは、典型的に、複製中の主要な突然変異である（ＡＸＣの場合はＩｌｅコドンＡＴＣを結果としてもたらす）ことを考慮すると、我々は、位置１５１にＳｅｒを含まないタンパク質の大部分は複製中のＵＢＰの損失が原因であるとし、非天然コドンを用いた翻訳の忠実度は高いとの結論を下す。

【0084】

【表4】

【0085】

【表5】

【0086】

ＵＢＰを有するｎｃＡＡのコード化を実証するために、我々は、上記で使用されるものと類似するが、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ遺伝子がメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＧＹＴ）遺伝子と置き換えられたプラスミドを構築した。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、ｎｃＡＡ Ｎ^６－［（２－プロピニルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）を有するメタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）ピロリジン・アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｙｌＲＳ）によって選択的に負荷することができる。コドンＡＸＣに加えて、我々は、コドンＧＸＣ及び対応するｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＧＹＣ）も分析した。ＩＰＴＧ誘導性ＰｙｌＲＳをコードする別個のプラスミドを保有するＳＳＯは、必要なプラスミドを用いて形質転換され、ＰｒＫの添加の有無にかかわらず成長した。ＰｙｌＲＳ、同族の非天然ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、又はＰｒＫのいずれかの不在下でｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１あるいはｓｆＧＦＰ（ＧＸＣ）^１５１のいずれかを発現する細胞用いた対照実験において、我々は、低い細胞の蛍光（図２Ａ）、ｓｆＧＦＰのトランケーション（図６Ａ及び６Ｂ）、ならびに細胞増殖（図６Ｂ）におけるプラトーのみを観察した。これに対して、その同族の非天然ｔＲＮＡを有するいずれかの非天然ｍＲＮＡについては、ＰｙｌＲＳが存在し、かつＰｒＫが加えられた場合、我々は、高い蛍光（ＡＸＣとＧＸＣについてそれぞれｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１の６４％及び６９％）（図２Ａ及び２Ｂ）、完全長のｓｆＧＦＰの強固な生成（図６Ａ）、及び正常な成長（図６Ｂ）を観察した。

【0087】

ＰｒＫの取り込みを検証するために、ｓｆＧＦＰを、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩを使用して、細胞溶解物からアフィニティー精製し、銅触媒されたクリックケミストリーにさらして、カルボキシテトラメチルローダミン（ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（ＴＡＭＲＡ）色素（ＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ_４－Ｎ_３）を付着させることにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中にｓｆＧＦＰの電気泳動移動度がシフトすることが分かったため、ウエスタンブロット（図２Ｃ）によってＰｒＫ取り込みの忠実度を評価することができた。我々は、強いＴＡＭＲＡ信号を観察し、及び、ＰｒＫで補足された培地中で培養され、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１とｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＧＹＴ）あるいはｓｆＧＦＰ（ＧＸＣ）^１５１とｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＧＹＣ）を発現する細胞から精製される場合には、実質的に全てのｓｆＧＦＰがシフトしたことを観察した（図２Ｃ）。これに対して、ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰ、又はその両方が不在の場合、ＴＡＭＲＡ信号あるいはシフトしたｓｆＧＦＰは、ほとんど又は全く観察されなかった（図７Ａ及び７Ｂ）。最後に、ＴＡＭＲＡ信号あるいはシフトしたｓｆＧＦＰは、いずれかの非天然ｔＲＮＡを有するｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞から精製されたタンパク質においては観察されなかった（図２Ｃ）。このデータは、非天然アンチコドンを有するｔＲＮＡによって非天然コドンをデコードすることにより、ＰｒＫがｓｆＧＦＰへと特異的に組み込まれることを実証する。

【0088】

我々は、最適なＰｒＫ濃縮（図８Ａ－８Ｄ）で、ｓｆＧＦＰの５４±４及び５５±６μｇ／ｍＬを精製した（ｓ．ｄ．、ｎ＝４、それぞれＡＸＣ及びＧＸＣコドンのｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１対照の～４０％（表６））。さらに、質量分析に基づいて、ＰｒＫを有するｓｆＧＦＰの純度は、ＡＸＣコドンで９６．２±０．３％（９５％のＣＩ、ｎ＝４）及びＧＸＣコドンで９７．５±０．７％（９５％のＣＩ、ｎ＝４）であった（図２Ｄ）。精製されたｓｆＧＦＰタンパク質の収率は、非天然リボトリホスフェート（図７Ｃ及び７Ｄ）の添加による成長の中程度の低下のために、アンバー抑制よりもわずかに低く（８７±６μｇ／ｍＬ、ｓ．ｄ．、ｎ＝４（表６））、両方の非天然コドンのデコードは、細胞密度に正規化される場合、アンバー抑制よりも高い蛍光を結果としてもたらし（図２Ａ及び２Ｂ）、非天然コドンでデコードすることは、アンバー抑制よりも効率的であることを示唆する。

【0089】

ＵＢＰを有する他のｎｃＡＡのコード化を調べるために、我々は、ＡＸＣコドンを有するｐ－アジド－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）及び進化したメタノカルドコックス・ヤンナスキイ ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ^Ｔｙｒペア（ｐＡｚＦＲＳ／ｔＲＮＡ^ｐＡｚＦ）のコード化を調べた。シンテターゼの誘導及び成長培地へのｐＡｚＦの添加により、我々は、天然ｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１を発現する細胞と同等の強固な蛍光、ならびにｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１とｔＲＮＡ^ｐＡｚＦ（ＧＹＴ）による正常な成長を観察した（図３Ａ、図９）。完全長のｓｆＧＦＰを精製し（８６±６μｇ／ｍＬ、ｓ．ｄ．、ｎ＝４；ｓｆＧＦＰ（ＴＡＣ）^１５１対照の６８％、表６）、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）群を使用する銅を含まないクリックケミストリーを行い、ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ）を結合した。我々は、ｓｆＧＦＰ（ＡＸＣ）^１５１及びｔＲＮＡ^ｐＡｚＦ（ＧＹＴ）を発現する細胞から単離され、ｐＡｚＦの存在下において培養されたｓｆＧＦＰへの、強固なＴＡＭＲＡの結合を観察した（図３Ｂ）。我々は、アジド部分の分解のためにｐＡｚＦ取り込みの忠実度を正確に評価することができなかったが、ｓｆＧＦＰタンパク質の～９３％がシフトし、これは、アンバー抑制によって生成された～９５％がシフトしたｓｆＧＦＰと比べて優れている（図３Ｂ）。

【0090】

【表6】

地球上の全ての生命の少なくとも最後の共通の祖先以来、４ヌクレオチド遺伝子アルファベットのみで書かれたコドンのデコードによって、タンパク質が生成されてきた。我々は、拡張された遺伝子アルファベットで書かれた２つの新たなコドンのデコードをここで実証し、ｎｃＡＡをタンパク質へと部位特異的に組み込むために上記新たなコドンを使用した。情報の蓄積及び検索の全てのステップにおいて、非常に明らかに天然塩基対の中心となる水素結合は、相補的なパッキング及び疎水性力と少なくとも部分的に置き換えられることを我々は見つけた。デコードの新規なメカニズムにもかかわらず、非天然コドンは、完全に天然な相当物と同じくらい効率的にデコードすることができる。我々は、２つの非天然コドンのデコードのみを調べたが、ＵＢＰはこれらに制限される可能性は低く、ＵＢＰの保持を補強する最近報告されたＣａｓ９編集システムと組み合わされた場合、それは、今まで使用されてきたよりも多くのコドンを利用可能にする可能性が高いだろう。したがって、報告されたＳＳＯは、天然生物には利用できない様々な形態及び機能を利用することができる半合成生命の新たな形態の最初のものにすぎないかもしれない。

【0091】

本発明の好ましい実施形態が本明細書で示されかつ記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多数の変形、変更、及び置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びその同等物の範囲内の方法及び構造は、それにより包含されることが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】