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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-07
(45)【発行日】2023-08-16
(54)【発明の名称】タンパク質安定化剤
(51)【国際特許分類】
C12N 9/96 20060101AFI20230808BHJP
C08F 293/00 20060101ALI20230808BHJP
【ＦＩ】
C12N9/96
C08F293/00
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019117799
(22)【出願日】2019-06-25
(65)【公開番号】P2021003020
(43)【公開日】2021-01-14
【審査請求日】2022-01-17
(73)【特許権者】
【識別番号】000004341
【氏名又は名称】日油株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100156476
【弁理士】
【氏名又は名称】潮 太朗
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】森 秀晴
(72)【発明者】
【氏名】今村 龍太郎
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】特開２００６－１９１８６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Biomacromolecules (2019) Vol.20, pp.904－915
【文献】織維と工業 (1971) Vol.4, No.6, pp.307-312
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブロックＡとブロックＢからなるブロックコポリマーであり、前記ブロックＡは、下記式（１）で表される繰り返し構造を有しており、
前記ブロックＢは、下記式（２）で表される繰り返し構造を有しており、
前記ブロックＡと前記ブロックＢのモル比が、Ａ／Ｂ＝６７／３３から８５／１５である、ブロックコポリマーを含有するタンパク質安定化剤。
【化1】
Ｒ１、及び、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基から選択され、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基であり、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【化2】
Ｒ４は炭素数が１～１８の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、炭素数が６～２０
の芳香族基から選択され、
Ｒ５は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【請求項2】
前記式（１）中、前記Ｒ１、及び、前記Ｒ２が水素原子である、請求項１に記載のタンパク質安定化剤。
【請求項3】
前記式（２）中、前記Ｒ４がｎ－ブチル基である、請求項１または２に記載のタンパク質安定化剤。
【請求項4】
前記式（１）中、前記Ｒ１、及び、前記Ｒ２が水素原子であり、前記式（２）中、前記Ｒ４がｎ－ブチル基である、
請求項１～３のいずれかに記載のタンパク質安定化剤。
【請求項5】
前記ブロックコポリマーの数平均分子量が、１，０００から１，０００，０００である、請求項１～４のいずれかに記載のタンパク質安定化剤。
【請求項6】
前記タンパク質安定化剤の全質量を基準として、０．０１質量％以上かつ１０質量％以下の請求項１～５のいずれかに記載のブロックコポリマーと、水とを含む、タンパク質安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質安定化剤、特に、特定の構造を有するブロックポリマーを含むタンパク質安定化剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、医薬品、診断薬、再生医療の分野において、抗体、酵素、サイトカイン等の生理活性を有するタンパク質が広く利用されている。たとえば、医薬分野ではタンパク質・抗体が薬剤として投与されたり、診断薬分野では、抗体を用いた高感度なタンパクの検出が行われている。いずれの場合においても、タンパク質の構造または酵素活性を長期間に渡り保持することが必要となるが、ほとんどのタンパク質は、温度、凍結、ｐＨ、振動、塩濃度、酸化などのストレスによって容易に変性、失活する。中でも温度ストレスによる変性が顕著であり、タンパク質を保存する場合には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質安定化剤を添加し、冷蔵、冷凍保存することが行われている。
【0003】
近年では、タンパク質の輸送や保存を容易にする目的だけでなく、冷蔵設備の整っていない新興国内での診断薬の輸送や、災害時に冷蔵・冷凍保存が不可能になった場合のタンパク質の機能維持を目的として、４０℃を超える高温条件におけるタンパク質の長期間安定性が求められている。
【0004】
冷蔵条件で用いられる一般的なタンパク質安定化剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）があるが、高温条件ではＢＳＡ自体が変性、凝集してしまうため、安定化効果を発揮できない。
【0005】
室温以上でタンパク質を安定化させている例としては、非特許文献のＣｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，２０１７，２９５，１３５９－１３６９にて、ポリエチレングリコール－ポリオキサゾリンブロックコポリマー（ＰＥＧ－ＰＯＺ）が報告されている。
当該文献では、４０℃でタンパク質の劣化無く保存できるものの、その時間は２時間であり、長期間の保存とはいえない。さらに、当該文献に記載のように、ＰＥＧを親水ブロックとして有しているブロックコポリマーを高温条件で長期間保存した場合には、ＰＥＧが酸化劣化する可能性があり、長期間の保存に適さない恐れがある。
当該文献では、４０℃でタンパク質の劣化無く保存できるものの、その時間は２時間であり、長期間の保存とはいえない。さらに、当該文献に記載のように、ＰＥＧを親水ブロックとして有しているブロックコポリマーを高温条件で長期間保存した場合には、ＰＥＧが酸化劣化する可能性があり、長期間の保存に適さない恐れがある。
【0006】
特許文献である特開２００６－１９１８６３号公報には、４０％の高濃度グリセリンの存在下でポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ＰＥＧ－ＰＰＧ）をタンパク質に添加することで、４５℃で１４日間、安定化できることが報告されている。
しかしながら、医薬分野、診断薬分野で用いる場合、高濃度のグリセリンによる毒性の懸念や、後続の診断に悪影響を与える恐れがある。
しかしながら、医薬分野、診断薬分野で用いる場合、高濃度のグリセリンによる毒性の懸念や、後続の診断に悪影響を与える恐れがある。
【0007】
また、非特許文献であるＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅ．２０１９，２０，９０４－９１５には、Ｎ－アクリロイル－Ｌ－メチオニンメチルスルホニウム塩（Ａ－Ｍｅｔ（Ｓ＋）－ＯＨ）とブチルアクリレート（ＢＡ）ランダムコポリマー（ＳＭＢポリマー）が、比較的熱安定性の高いアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を３７℃の条件で１２日間、安定化できることが記載されている。また、熱安定性の低い西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に関しては、４℃の条件で８日間安定化できることが記載されている。
しかしながら、当該特許文献には、４０℃を超える高温条件についての記載や、ブロックコポリマーについての記載はない。
しかしながら、当該特許文献には、４０℃を超える高温条件についての記載や、ブロックコポリマーについての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２００６－１９１８６３号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，２０１７，２９５，１３５９－１３６９
【文献】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅ．２０１９，２０，９０４－９１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
以上、示したように、高温条件下で長期間タンパク質を安定化でき、低濃度添加するだけでタンパク質安定化効果を発現することができるタンパク質安定化剤が必要である。
【0011】
本発明の課題は、高温条件下で長期間タンパク質を安定化でき、低濃度添加するだけでタンパク質安定化効果を発現することができる、ブロックコポリマーを含むタンパク質安定化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上述の目的を達成するべく鋭意研究を重ねた結果、特定の分子構造を有するブロックコポリマーを含むタンパク質安定化剤が、上記課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明は、少なくとも下記の［１］～［６］を提供する。
すなわち、本発明は、少なくとも下記の［１］～［６］を提供する。
【0013】
［１］少なくともブロックＡとブロックＢを含むブロックコポリマーであり、
前記ブロックＡは下記式（１）で表される繰り返し構造を有しており、
前記ブロックＢは下記式（２）で表される繰り返し構造を有しており、
前記ブロックＡと前記ブロックＢのモル比が、Ａ／Ｂ＝５０／５０から９０／１０である、ブロックコポリマーを含有するタンパク質安定化剤が提供される。
（式（１）中、Ｒ１、及び、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基から選択され、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基であり、
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
（式（２）中、Ｒ４は炭素数が１～１８の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基から選択され、
Ｒ５は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
前記ブロックＡは下記式（１）で表される繰り返し構造を有しており、
前記ブロックＢは下記式（２）で表される繰り返し構造を有しており、
前記ブロックＡと前記ブロックＢのモル比が、Ａ／Ｂ＝５０／５０から９０／１０である、ブロックコポリマーを含有するタンパク質安定化剤が提供される。
【化1】
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【化2】
Ｒ５は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【0014】
［２］前記式（１）中、前記Ｒ１、及び、前記Ｒ２が水素原子である、［１］に記載のタンパク質安定化剤。
【0015】
［３］前記式（２）中、前記Ｒ４がｎ－ブチル基である、［１］または［２］に記載のタンパク質安定化剤。
【0016】
［４］前記式（１）中、前記Ｒ１、及び、前記Ｒ２が水素原子であり、
前記式（２）中、Ｒ４がｎ－ブチル基である、
［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質安定化剤。
前記式（２）中、Ｒ４がｎ－ブチル基である、
［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質安定化剤。
【0017】
［５］前記ブロックコポリマーの数平均分子量が、１，０００から１，０００，０００である、［１］～［４］のいずれかに記載のタンパク質安定化剤。
【0018】
［６］前記タンパク質安定化剤の全質量を基準として、０．０１質量％以上かつ１０質量％以下の［１］～［５］のいずれかに記載のブロックコポリマーと、水とを含む、タンパク質安定化剤。
【発明の効果】
【0019】
高温条件下で長期間タンパク質を安定化でき、タンパク質への低濃度の添加のみでタンパク質安定化の効果を発現することができる、ブロックコポリマーを含むタンパク質安定化剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
＜タンパク質安定化剤＞
本発明におけるタンパク質安定化剤は、少なくとも、上述のブロックＡとブロックＢとを有するブロックコポリマーを含む。
＜タンパク質安定化剤＞
本発明におけるタンパク質安定化剤は、少なくとも、上述のブロックＡとブロックＢとを有するブロックコポリマーを含む。
【0021】
＜ブロックコポリマー＞
本発明におけるブロックコポリマーは、少なくともブロックＡとブロックＢを含み、ブロックＡは式（１）で表される繰り返し構造を有しており、ブロックＢは式（２）で表される繰り返し構造を有している。
本発明におけるブロックコポリマーは、少なくともブロックＡとブロックＢを含み、ブロックＡは式（１）で表される繰り返し構造を有しており、ブロックＢは式（２）で表される繰り返し構造を有している。
【0022】
式（１）で表されるブロックＡ中、Ｒ１、及び、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基から選択され、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基である。
式（１）で表されるブロックＡ中、直鎖アルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～３である。
炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
Ｒ１とＲ２が互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基とは、例えば、下記式（７）に示す置換基のアルキレン基である。
（式（７）中、ｍは、１から６の整数を表し、好ましくは２～６、より好ましくは２～４の整数である。）
【化3】
炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
Ｒ１とＲ２が互いに連結された炭素数１～６のアルキレン基とは、例えば、下記式（７）に示す置換基のアルキレン基である。
【化4】
【0023】
Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。
【0024】
式（１）で表されるブロックＡとしては、例えば、Ｒ１、Ｒ２が、共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるブロックＡ、Ｒ１がプロピル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるブロックＡ、Ｒ１がベンジル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるブロックＡが挙げられるが、合成の容易さから、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるブロックＡが好ましい。
【0025】
式（２）で表されるブロックＢ中、Ｒ４は炭素数が１～１８の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基から選択される。
式（２）で表されるブロックＢ中、直鎖アルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デカノイル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは２～１８であり、より好ましくは４～１８である。
炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
【化5】
炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
【0026】
Ｒ５は、水素原子もしくはメチル基を表す。
【0027】
式（２）で表されるブロックＢとしては、例えば、Ｒ４がｎ－ブチル基、Ｒ３が水素原子であるブロックＢ、Ｒ４がステアリル基、Ｒ５が水素原子であるブロックＢが挙げられるが、水等の極性の高い溶媒に対する溶解性の観点から、Ｒ４がｎ－ブチル基、Ｒ５が水素原子であるブロックＢが好ましい。
【0028】
ブロックコポリマーＡ及びＢのモル比としては、要求される機能が発揮されるように適宜決定できるが、例えば４０℃を超える高温の条件下でのタンパク質安定化効果の観点からは、ブロックＡとブロックＢがモル比でＡ（ブロックＡ）／Ｂ（ブロックＢ）＝５０／５０から９０／１０の範囲が好ましく、溶解性の観点からはＡ／Ｂ＝７０／３０から９０／１０がより好ましい。
また、Ａ／Ｂの値の範囲は、６０／４０から９０／１０、６５／３５から９０／１０、７５／２５から９０／１０等であっても良く、９０／１０の限界値の代わりに８５／１５等であっても良い。
また、Ａ／Ｂの値の範囲は、６０／４０から９０／１０、６５／３５から９０／１０、７５／２５から９０／１０等であっても良く、９０／１０の限界値の代わりに８５／１５等であっても良い。
【0029】
ブロックコポリマーの分子量は、特に限定されず要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調製して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１，０００から１０００，０００程度であり、ブロックコポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合には、数平均分子量が２，０００から１００，０００であることが好ましい。数平均分子量は、より好ましくは３，０００から８０，０００であり、さらに好ましくは５，０００から５０，０００である。
また、上述のブロックコポリマーの数平均分子量のより好ましい範囲としては、６，０００以上４０，０００以下であり、さらに好ましくは７，０００以上３０，０００以下であり、特に好ましくは、８，０００以上２０，０００以下である。
また、上述のブロックコポリマーの数平均分子量のより好ましい範囲としては、６，０００以上４０，０００以下であり、さらに好ましくは７，０００以上３０，０００以下であり、特に好ましくは、８，０００以上２０，０００以下である。
【0030】
ブロックコポリマーにおいて、式（１）で表される構成単位を含むブロックコポリマーＡ、及び、式（２）で表される構成単位含むブロックコポリマーＢとは異なる、他の繰り返し単位が含まれていても良い。すなわち、式（１）と式（２）で表される構成単位を形成するモノマーとは異なる他のモノマーに由来する構成単位が含まれていても良い。
他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられる。
他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられる。
【0031】
また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、ブロックコポリマーを構成する全モノマーを基準として、例えば３０モル％以下（式（１）及び式（２）の構成単位を形成するモノマーの合計が例えば７０モル％以下）であることが好ましく、より好ましくは１０モル％以下（式（１）及び式（２）の構成単位を形成するモノマーの合計が例えば９０モル％以下）である。
なお上記他のモノマー、すなわち、式（１）と式（２）で表される構成単位を形成するモノマーとは異なるモノマーは、ブロックＡ及びブロックＢとは異なるブロックを形成することが好ましい。
なお上記他のモノマー、すなわち、式（１）と式（２）で表される構成単位を形成するモノマーとは異なるモノマーは、ブロックＡ及びブロックＢとは異なるブロックを形成することが好ましい。
【0032】
＜ブロックコポリマーの合成＞
ブロックコポリマーの製造方法としてはラジカル重合が挙げられ、ラジカル重合のうちリビングラジカル重合法によりブロックコポリマーを製造することも可能である。具体的には、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）、ニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）、及び有機テルル化合物を用いるリビングラジカル重合（ＴＥＲＰ法）などが利用可能である。特にタンパク質安定化剤の用途では金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。前記ＲＡＦＴ重合の方法としては、公知の方法が利用可能であり、例えば、ＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８、及び米国特許第６，１５３，７０５号に記載されている方法が有効である。
ブロックコポリマーの製造方法としてはラジカル重合が挙げられ、ラジカル重合のうちリビングラジカル重合法によりブロックコポリマーを製造することも可能である。具体的には、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）、ニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）、及び有機テルル化合物を用いるリビングラジカル重合（ＴＥＲＰ法）などが利用可能である。特にタンパク質安定化剤の用途では金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。前記ＲＡＦＴ重合の方法としては、公知の方法が利用可能であり、例えば、ＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８、及び米国特許第６，１５３，７０５号に記載されている方法が有効である。
【0033】
ブロックコポリマーは、下記〔工程Ａ〕〔工程Ｂ〕を経てスルフィドブロックコポリマーを合成した後に、〔工程Ｃ〕を行う製造方法により製造することができる。
【0034】
〔工程Ａ〕
工程Ａは、下記式（４）で表されるスルフィド（メタ）アクリルアミドモノマーのラジカル重合を行い、中間体であるスルフィドポリマーを得る工程である。
工程Ａは、下記式（４）で表されるスルフィド（メタ）アクリルアミドモノマーのラジカル重合を行い、中間体であるスルフィドポリマーを得る工程である。
【化6】
【0035】
式（４）中、Ｒ１は、特に限定されないが、式（１）におけるＲ１と同様に定義され得る。
すなわち、式（４）中、Ｒ１は、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が６～２０の芳香族基から選択される。直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～３である。
芳香族基は、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であることが好ましい。
すなわち、式（４）中、Ｒ１は、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が６～２０の芳香族基から選択される。直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～３である。
芳香族基は、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であることが好ましい。
【0036】
式（４）中、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。
【0037】
式（４）で表されるスルフィドモノマーとしては、例えば、Ｒ１が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマー、Ｒ１がプロピル基、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマー、Ｒ１がベンジル基、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマーが挙げられるが、合成の容易さからＲ１が水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマーが好ましい。
【0038】
式（４）で表されるスルフィドモノマーのうち、Ｒ１が水素原子であるスルフィドモノマーを用いる場合については、合成の容易さの観点から、非特許文献Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅ．，２０１９，２０，９０４に記載の（メタ）アクリル酸クロライドを用いて、メチオニンの（メタ）アクリル化を行うことが好ましい。またＲ１が、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは芳香族基であるスルフィドモノマーである場合には、それぞれに対応するアルキルハライド、芳香族ハライドとシステインの反応を行った後に（メタ）アクリル化に供することでスルフィドモノマーが得られる。
【0039】
式（４）で表されるスルフィドモノマーのＲＡＦＴ重合は 通常のラジカル重合にＲＡＦＴ剤を添加することにより行われ得る。ＲＡＦＴ剤は、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、２－シアノ－２－プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、２－フェニル－２－プロピルベンゾジチオエート、メチル２－フェニル－２－（フェニル－カーボノチオイルチオ）アセテート、４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタノール、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカーボネート、２－（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、２－（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸３－アジド－１－プロパノールエステル、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート、２－シアノプロパン－２－イル－Ｎ－メチル－Ｎ－ピリジン４－イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル－２－エチルザンテートから選択され、例えば、Ｒ３が水酸基である前記式（４）で表されるスルフィドモノマーを用いる場合には、重合制御可能なモノマーとＲＡＦＴ剤の組み合わせの観点から、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエートが好ましい。
ＲＡＦＴ剤の使用量としては、式（４）で表されるスルフィドモノマー１００質量部に対して通常０．０１から２０質量部が好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。
ＲＡＦＴ剤の使用量としては、式（４）で表されるスルフィドモノマー１００質量部に対して通常０．０１から２０質量部が好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。
【0040】
式（４）で表されるスルフィドモノマーのＲＡＦＴ重合は、熱重合または光重合により行うことができる。前記熱重合は、熱重合開始剤を用いて行うことができる。熱重合開始剤としては、たとえば、過酸化物系ラジカル開始剤（過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム等）または、アゾ系ラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス－ジメチルバレロニトリル（ＡＤＶＮ）等）、２，２’－アゾビスシアノ吉草酸（ＡＣＶＡ）、アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ－０４４）、水溶性あるいは油溶性のレドックス系ラジカル開始剤（ジメチルアニリンと過酸化ベンゾイルからなる）が使用できる。
ラジカル開始剤の使用量は、式（４）で表されるスルフィドモノマー１００質量部に対して通常０．０１から１０質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。重合温度および重合時間は、ラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、式（４）で表されるスルフィドモノマーの重合を、ＡＩＢＮを重合開始剤として用いて行う場合、重合温度は４０～９０℃、好ましくは５０～８０℃、より好ましくは６０～７０℃である。重合時間は１～４８時間、好ましくは１～２４時間、より好ましくは２～２４時間である。
ラジカル開始剤の使用量は、式（４）で表されるスルフィドモノマー１００質量部に対して通常０．０１から１０質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。重合温度および重合時間は、ラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、式（４）で表されるスルフィドモノマーの重合を、ＡＩＢＮを重合開始剤として用いて行う場合、重合温度は４０～９０℃、好ましくは５０～８０℃、より好ましくは６０～７０℃である。重合時間は１～４８時間、好ましくは１～２４時間、より好ましくは２～２４時間である。
【0041】
式（４）で表されるスルフィドモノマーは、そのままバルク状態で重合に用いてよく、また溶媒を加えた溶液重合や懸濁重合、乳化重合に供することもできる。また溶媒としては前記式（４）で表されるスルフィドモノマーが溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえば、アセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、エタノール、メタノール、水などの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。
【0042】
式（４）で表されるスルフィドモノマーを重合して得られるスルフィドポリマーは、そのまま未精製で用いられるほか、好ましくは、過剰な溶媒の減圧留去、再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
【0043】
式（４）で表されるスルフィドモノマーを重合中に得られる、前記スルフィドポリマーを反応容器から取り出すことなく、次工程〔工程Ｂ〕に進むこともできる。
【0044】
〔工程Ｂ〕
工程Ｂは、上記〔工程Ａ〕で製造されたスルフィドポリマーをマクロＲＡＦＴ剤として使用し、下記式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーの重合を行い、中間体であるスルフィドブロックコポリマーを得る工程である。
式（５）中、Ｒ４は炭素数が１～１８の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６～２０の芳香族基から選択される。直鎖アルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デカノイル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは２～１８であり、より好ましくは４～１８である。
炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
工程Ｂは、上記〔工程Ａ〕で製造されたスルフィドポリマーをマクロＲＡＦＴ剤として使用し、下記式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーの重合を行い、中間体であるスルフィドブロックコポリマーを得る工程である。
【化7】
炭素数６～２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
【0045】
Ｒ５は、水素原子もしくはメチル基を表す。
マクロＲＡＦＴ剤の使用量としては、式（５）で表される（メタ）アクリルモノマー１００ｍｏｌに対して通常０．０１から５０ｍｏｌが好ましく、より好ましくは０．１から３０ｍｏｌである。
マクロＲＡＦＴ剤の使用量としては、式（５）で表される（メタ）アクリルモノマー１００ｍｏｌに対して通常０．０１から５０ｍｏｌが好ましく、より好ましくは０．１から３０ｍｏｌである。
【0046】
式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーのＲＡＦＴ重合は、熱重合または光重合により行うことができる。熱重合は、熱重合開始剤を用いて行うことができる。熱重合開始剤としては、たとえば、過酸化物系ラジカル開始剤（過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム等）または、アゾ系ラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス－ジメチルバレロニトリル（ＡＤＶＮ）等）、２，２’－アゾビスシアノ吉草酸（ＡＣＶＡ）、アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ－０４４）、水溶性あるいは油溶性のレドックス系ラジカル開始剤（ジメチルアニリンと過酸化ベンゾイルからなる）が使用できる。
ラジカル開始剤の使用量は、式（５）で表される（メタ）アクリルモノマー１００質量部に対して、通常０．０１から１０質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。重合温度および重合時間は、ラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーの重合を、ＡＩＢＮを重合開始剤として用いて行う場合、重合温度は４０～９０℃、好ましくは５０～８０℃、より好ましくは６０～７０℃である。重合時間は１～４８時間、好ましくは１～２４時間、より好ましくは２～２４時間である。
ラジカル開始剤の使用量は、式（５）で表される（メタ）アクリルモノマー１００質量部に対して、通常０．０１から１０質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。重合温度および重合時間は、ラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーの重合を、ＡＩＢＮを重合開始剤として用いて行う場合、重合温度は４０～９０℃、好ましくは５０～８０℃、より好ましくは６０～７０℃である。重合時間は１～４８時間、好ましくは１～２４時間、より好ましくは２～２４時間である。
【0047】
式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーは、そのままバルク状態で重合に用いてよく、また溶媒を加えた溶液重合や懸濁重合、乳化重合に供することもできる。また溶媒としては式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーが溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえば、アセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、エタノール、メタノール、水などの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。
【0048】
式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーを重合して得られる、前記スルフィドブロックコポリマーはそのまま未精製で用いられるほか、好ましくは、過剰な溶媒の減圧留去、再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
【0049】
〔工程Ｃ〕
工程Ｃは、上記〔工程Ａ〕と〔工程Ｂ〕とを経て得られたスルフィドブロックコポリマーと、式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程である。
工程Ｃは、上記〔工程Ａ〕と〔工程Ｂ〕とを経て得られたスルフィドブロックコポリマーと、式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程である。
【化8】
【0050】
式（６）中、Ｘは前記スルフィドブロックコポリマーと反応できるものなら、特に限定されず、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メシル基（メタンスルフォニル基）、トシル基（ｐ－トルエンスルホニル基）、及び、トリフルオロメタンスルホニル基から選択され、好ましくは、臭素原子、あるいはヨウ素原子であり、さらに好ましくはヨウ素原子である。
前記式（６）中、Ｒ２は特に限定されないが、式（１）におけるＲ１と同様に定義され得る。式（６）中、Ｒ２は、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が６～２０の芳香族基から選択される。
直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～３である。
また、芳香族置換基とは例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ２は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基であることが好ましい。
前記式（６）中、Ｒ２は特に限定されないが、式（１）におけるＲ１と同様に定義され得る。式（６）中、Ｒ２は、水素原子、炭素数が１～６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が６～２０の芳香族基から選択される。
直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２－ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１～３である。
また、芳香族置換基とは例えば、フェニル基、ｐ－ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～１０である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ２は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基であることが好ましい。
【0051】
式（６）で表されるスルフィド反応性化合物としては、例えば、両性イオンポリマーの水への親水性を維持する観点から、ヨードメタン、ヨードエタン、ヨードプロパン、ヨードブタンが好ましい。
【0052】
スルフィドブロックコポリマーと式（６）で表されるスルフィド反応性化合物との反応に用いられる溶媒としては、スルフィドブロックコポリマーとスルフィド反応性化合物が溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえばアセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、メタノールなどの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。溶媒の使用量は、スルフィドブロックコポリマーに対して質量比で１～１００倍量、好ましくは１～５０倍量、もっとも好ましくは１～３０倍量である。
【0053】
式（６）で表されるスルフィド反応性化合物の使用量は、スルフィドブロックコポリマーに対して質量比で０．１～１００倍量、好ましくは０．１～５０倍量、もっとも好ましくは０．１～３０倍量である。
【0054】
スルフィドブロックコポリマーと式（６）で表されるスルフィド反応性化合物との反応温度は、使用する溶媒にもよるものの、通常－２０～１００℃、好ましくは０～７０℃、もっとも好ましくは２０～５０℃の範囲である。反応時間は、反応温度、用いる前記スルフィドポリマーの分子量、前記スルフィド反応性化合物の種類により異なるが、通常１～７２時間程度が好ましく、より好ましくは１～２４時間である。
【0055】
以上のように、上述のスルフィドブロックコポリマーと、上記式（６）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させて、式（１）の繰り返し構造を持つブロックＡと式（２）の繰り返し構造を持つブロックＢからなるブロックコポリマーを得ることができる。得られたブロックコポリマーはそのまま未精製でも用いられるほか、好ましくは、過剰な前記スルフィド反応性化合物の減圧留去、再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
【0056】
上述の〔工程Ａ〕において、スルフィド（メタ）アクリルアミドモノマーの代わりに上記式（５）で表される（メタ）アクリルモノマーを使用することで、中間体である（メタ）アクリルポリマーを製造することができる。また、上述の〔工程Ｂ〕において、（メタ）アクリルモノマーの代わりに上記式（４）で表されるスルフィドモノマーを使用した場合にもスルフィドブロックポリマーを製造できる。
【0057】
本発明のタンパク質安定化剤は通常水を含んで使用し、タンパク質の更なる安定化を目的として添加剤を添加することができる。本発明のタンパク質安定化剤は、好ましくは、水溶性であり、ブロックコポリマーを含む水溶液であることがより好ましい。
【0058】
タンパク質安定化剤に含まれる水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましく、また水を含有する各種緩衝液であってもよい。各種緩衝液としては、タンパク質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、これらを混合して使用してもよい。
【0059】
タンパク質安定化剤中に含有されるブロックコポリマーの濃度としては、毒性や後続の診断に悪影響を与えないこと、対象のタンパク質の安定性にあわせて添加するタンパク質安定化剤の濃度を自由に設計できる点から考慮される。タンパク質安定化剤の全質量を基準としたブロックコポリマーの濃度は、０．０１質量％以上１０質量％以下であることが好ましく、０．０５質量％以上５質量％以下であることがさらに好ましい。０．０１質量％より低い濃度ではタンパク質安定化効果を発揮できない恐れがあり、１０質量％より高い濃度では毒性や後続の診断に悪影響を与える恐れがある。一方、上述の範囲であれば、タンパク質安定化剤溶液は有効なタンパク質安定化効果を示し、かつ、タンパク質の溶解、又はタンパク質溶液との混合を良好に実施できる。
【0060】
タンパク質安定化剤に含まれる添加剤としては、タンパク質のさらなる安定化を目的として通常この分野で用いられるその他の試薬類等であって、例えば、糖類、安定化対象のタンパク質以外のタンパク質、塩類、界面活性剤等が挙げられる。
【0061】
糖類としては、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース等が挙げられる。
【0062】
タンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。
【0063】
塩類としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩等の無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸および有機酸の塩等が挙げられる。
【0064】
界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｔｗｅｅｎ２０、プルロニック等が挙げられる。
【0065】
タンパク質安定化剤中に含有される上述の添加剤の含有量は、タンパク質安定化効果があれば特に限定されないが、０．１質量％以上であることが好ましく、１質量％以上がより好ましい。上限値としては、主溶媒である水に溶解する限り特に制限はないが、例えば、３０質量％以下、好ましくは２０質量％以下である。これらの範囲であれば、タンパク質安定化剤は有効なタンパク質安定化効果を示すことができる。
【0066】
上述の添加剤中、４０℃を超える高温条件でのタンパク質の安定化において好ましくは糖類、特に好ましくはスクロースである。
【0067】
本発明のタンパク質安定化剤は、タンパク質溶液に添加して用いることができる。タンパク質溶液とは、タンパク質のみが溶解している溶液のことである。またタンパク質安定化剤に対象のタンパク質を溶解させてもよく、タンパク質溶液とタンパク質安定化剤とを調製し、両溶液を混合してもよい。
【0068】
本発明のタンパク質安定化剤が、安定化させるタンパク質としては、特に限定されないが、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ペニシリナーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾチーム等が挙げられる。
【0069】
本発明のタンパク質安定化剤によってタンパク質を安定化させるにあたって、保存温度は、２℃から８０℃であることが好ましい。２℃より低い温度ではタンパク質安定化剤が凍結する可能性があり、８０℃より高い温度になると、溶液中の水分が沸騰する可能性があるからである。特に、本発明のタンパク質安定化剤を用いることで、４０℃以上、あるいは、５０℃以上、例えば、４０℃から８０℃の高温下でも、タンパク質安定化効果が発揮される。
【実施例】
【0070】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお各合成例において、核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）には日本電子社製ＪＭＴＣ－４００を用いた。
【0071】
＜ブロックコポリマーＢの合成＞
（合成例１－１：Ｒ１＝水素原子、Ｒ２＝水素原子、Ｒ３＝水素原子である式（４）で表されるスルフィドモノマー（モノマー２）の合成）
四つ口フラスコにＬ－メチオニンメチルエステル（１）（１０．０ｇ，５０．０ｍｍｏｌ）を入れ、ＴＨＦ１００ｍＬに溶解させた。反応溶液を０℃まで冷却し、トリエチルアミン（１５ｍＬ，１０８ｍｍｏｌ）、アクリル酸クロライド（５．４ｍｌ， ６０ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下した。その後、反応系を室温まで昇温し、１時間攪拌した。反応溶液にメタノール２ｍｌを加え、室温でさらに１時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、ＭＴＢＥ２００ｍＬを加え、有機相を飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍＬで二回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５０ｍＬで一回、飽和食塩水１００ｍｌで一回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。
得られた化合物をアセトニトリル５０ｍＬに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液４０ｍＬを加え、室温で２時間攪拌した。反応液を４Ｎ塩酸で中和後、溶媒を減圧留去した。反応液のｐＨが３となるようにｐＨを調整した後、酢酸エチル１５０ｍＬで抽出した。有機相を飽和食塩水１００ｍｌで一回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去することでモノマー２を得た。
収量７．６ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
６．２－６．４ｐｐｍ（ＣＨ ２ ＝ＣＨ，ｍ，２Ｈ），５．６５ｐｐｍ（ＣＨ２＝ＣＨ，ｔ，１Ｈ）， ４．６３ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ，ｔ，１Ｈ），２．４－２．６ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ，ｍ，２Ｈ），２．０－２．２ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ，ｍ，２Ｈ），１．９２ｐｐｍ（Ｓ－ＣＨ ３ ，ｓ，３Ｈ）
（合成例１－１：Ｒ１＝水素原子、Ｒ２＝水素原子、Ｒ３＝水素原子である式（４）で表されるスルフィドモノマー（モノマー２）の合成）
【化9】
得られた化合物をアセトニトリル５０ｍＬに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液４０ｍＬを加え、室温で２時間攪拌した。反応液を４Ｎ塩酸で中和後、溶媒を減圧留去した。反応液のｐＨが３となるようにｐＨを調整した後、酢酸エチル１５０ｍＬで抽出した。有機相を飽和食塩水１００ｍｌで一回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去することでモノマー２を得た。
収量７．６ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
６．２－６．４ｐｐｍ（ＣＨ ２ ＝ＣＨ，ｍ，２Ｈ），５．６５ｐｐｍ（ＣＨ２＝ＣＨ，ｔ，１Ｈ）， ４．６３ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ，ｔ，１Ｈ），２．４－２．６ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ，ｍ，２Ｈ），２．０－２．２ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ，ｍ，２Ｈ），１．９２ｐｐｍ（Ｓ－ＣＨ ３ ，ｓ，３Ｈ）
【0072】
（合成例１－２：ポリマー３の合成）
二口フラスコにモノマー２（４．３ｇ,２０．０ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート（９３ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（３３ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を入れ、ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させた。１５分間、窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。３時間後の反応溶液をＭＴＢＥ２００ｍｌで再沈殿させ、ポリマー３を得た。
収量 ２．７ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．３－４．６ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），２．６－２．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ），２．０－２．６ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ，Ｓ－ＣＨ ３ ），１．６－２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
【化10】
収量 ２．７ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．３－４．６ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），２．６－２．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ），２．０－２．６ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ，Ｓ－ＣＨ ３ ），１．６－２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
【0073】
（合成例１－２：ポリマー４の合成）
二口フラスコにブチルアクリレート（３８．４ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）、ポリマー３（２３６ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（１．６ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を入れ、エタノール（１ｍＬ）に溶解させた。１５分間、窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。１４時間後の反応溶液をＭＴＢＥ／ヘキサン（１／１ ｖ／ｖ）５０ｍｌで再沈殿させ、ポリマー４を得た。
収量２２０ｍｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．４－４．８ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），３．８－４．３ｐｐｍ（（Ｃ＝Ｏ）－ＯＣＨ ２ ），２．５－２．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ），２．２－２．５（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ）２．０－２．２ｐｐｍ（Ｓ－ＣＨ ３ ），１．６ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －），１．４ｐｐｍ，（－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ３），１．０ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ３ ），１．２－２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
【化11】
収量２２０ｍｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．４－４．８ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），３．８－４．３ｐｐｍ（（Ｃ＝Ｏ）－ＯＣＨ ２ ），２．５－２．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ），２．２－２．５（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ）２．０－２．２ｐｐｍ（Ｓ－ＣＨ ３ ），１．６ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －），１．４ｐｐｍ，（－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ３），１．０ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ３ ），１．２－２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
【0074】
（合成例１－３：ブロックコポリマーＢの合成）
ナスフラスコにポリマー４（１００ｍｇ）をいれ、エタノール１ｍＬに溶解した。反応溶液にヨードメタン１００μＬを加え、室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ブロックコポリマーＢを得た。
収量 １１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝８３：１７
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ＋２０％Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．４－４．７ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），３．８－４．３（ＣＯＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２（ＢＡ）），３．４－３．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ（ＣＨ３）２），３．０－３．２ｐｐｍ（ＣＨ２－Ｓ（ＣＨ ３ ）２），１．６ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －），１．２ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ３），０．９ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ３ ），１．２－２．８ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ、ポリマー主鎖）
【化12】
収量 １１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝８３：１７
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ＋２０％Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．４－４．７ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），３．８－４．３（ＣＯＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２（ＢＡ）），３．４－３．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ（ＣＨ３）２），３．０－３．２ｐｐｍ（ＣＨ２－Ｓ（ＣＨ ３ ）２），１．６ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －），１．２ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ３），０．９ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ３ ），１．２－２．８ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ、ポリマー主鎖）
【0075】
得られたブロックコポリマーＢの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、以下のようにしてもとめた。すなわち、ブロックコポリマーＢの前駆体であるポリマー４を、トリメチルシリルジアゾメタンによりメチルエステル化処理した後に、ゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定として下記の機器を用い、下記の条件で測定を行った。
ポンプに島津製作所（株）社製 ＬＣ－７２０ＡＤを、検出器（示差屈折率計）に島津製作所（株）社製 ＲＩＤ１０Ａを、検出器（ＵＶ）にＳＰＤ－２０Ａを用いた。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製 Ｍｉｘｅｄ－Ｄ（粒子径 ５μｍ、カラムサイズ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、１１．５ｍＭ 臭化リチウム含有ジメチルホルムアミドを用いた。測定条件は、流速 ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度 ４０℃、サンプル濃度 ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量 ７０μＬであった。スタンダートとしてメチルメタクリレートを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定を行ない、メチルエステル化ポリマーの数平均分子量をポリマーＢの数平均分子量に換算した結果、ブロックコポリマーＢの数平均分子量は１００００、分子量分布は１．３３であった。
ポンプに島津製作所（株）社製 ＬＣ－７２０ＡＤを、検出器（示差屈折率計）に島津製作所（株）社製 ＲＩＤ１０Ａを、検出器（ＵＶ）にＳＰＤ－２０Ａを用いた。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製 Ｍｉｘｅｄ－Ｄ（粒子径 ５μｍ、カラムサイズ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、１１．５ｍＭ 臭化リチウム含有ジメチルホルムアミドを用いた。測定条件は、流速 ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度 ４０℃、サンプル濃度 ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量 ７０μＬであった。スタンダートとしてメチルメタクリレートを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定を行ない、メチルエステル化ポリマーの数平均分子量をポリマーＢの数平均分子量に換算した結果、ブロックコポリマーＢの数平均分子量は１００００、分子量分布は１．３３であった。
【0076】
＜ブロックコポリマーＣの合成＞
（合成例２－１：ポリマー５の合成）
ブチルアクリレート（５４．８ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記合成例１－２と同様にしてポリマー５を合成した。
収量２２８ｍｇ
（合成例２－１：ポリマー５の合成）
ブチルアクリレート（５４．８ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記合成例１－２と同様にしてポリマー５を合成した。
収量２２８ｍｇ
【0077】
（合成例２－２：ブロックコポリマーＣの合成）
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＣを合成した。
収量１１１ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝８５：１５
得られたブロックコポリマーＣの数平均分子量および分子量分布は、上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＣの数平均分子量は８６００、分子量分布は１．１６であった。
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＣを合成した。
収量１１１ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝８５：１５
得られたブロックコポリマーＣの数平均分子量および分子量分布は、上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＣの数平均分子量は８６００、分子量分布は１．１６であった。
【0078】
（比較合成例３－１：ポリマー６の合成）
ブチルアクリレート（１２．８ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は上記合成例１－２と同様にしてポリマー６を合成した。
収量４００ｍｇ
ブチルアクリレート（１２．８ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は上記合成例１－２と同様にしてポリマー６を合成した。
収量４００ｍｇ
【0079】
（比較合成例３－２：ブロックコポリマーＡの合成）
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＡを合成した。
収量１１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝９６：４
得られたブロックコポリマーＡの数平均分子量および分子量分布は上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＡの数平均分子量は８７００、分子量分布は１．３６であった。
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＡを合成した。
収量１１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝９６：４
得られたブロックコポリマーＡの数平均分子量および分子量分布は上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＡの数平均分子量は８７００、分子量分布は１．３６であった。
【0080】
＜ブロックコポリマーＤの合成＞
（比較合成例４－１：ポリマー７の合成）
ブチルアクリレート（２９８ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は上記合成例１－２と同様にしてポリマー７を合成した。
収量４００ｍｇ
（比較合成例４－１：ポリマー７の合成）
ブチルアクリレート（２９８ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は上記合成例１－２と同様にしてポリマー７を合成した。
収量４００ｍｇ
【0081】
（比較合成例４－２：ブロックコポリマーＤの合成）
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＤを合成した。
収量１１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝３１：６９
得られたブロックコポリマーＤの数平均分子量および分子量分布は上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＤの数平均分子量は１１０００、分子量分布は１．４１であった。
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＤを合成した。
収量１１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝３１：６９
得られたブロックコポリマーＤの数平均分子量および分子量分布は上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＤの数平均分子量は１１０００、分子量分布は１．４１であった。
【0082】
＜ブロックコポリマーＥの合成＞
（合成例５－１：ポリマー８の合成）
二口フラスコにブチルアクリレート（１．５ｇ,７．５ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート（３４．５ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（１．２ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を入れ、ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させた。１５分間、窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２時間後の反応溶液をアセトンで透析（ＭＷＣＯ＝１０００Ｄａ）し、溶媒を減圧留去することで、ポリマー８を得た。
収量 ０．５ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．０－４．１ｐｐｍ（（Ｃ＝Ｏ）－ＯＣＨ ２ ）１．６ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －），１．４ｐｐｍ，（－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ３），０．９－１．０ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ３ ）
（合成例５－１：ポリマー８の合成）
【化13】
収量 ０．５ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．０－４．１ｐｐｍ（（Ｃ＝Ｏ）－ＯＣＨ ２ ）１．６ｐｐｍ（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －），１．４ｐｐｍ，（－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ３），０．９－１．０ｐｐｍ（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ３ ）
【0083】
（合成例５－２：ポリマー９の合成）
二口フラスコにモノマー２（１０６ｍｇ,０．５０ｍｍｏｌ）、ポリマー９（４１ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（０．８ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）を入れ、エタノール（１ｍＬ）に溶解させた。１５分間、窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。１４時間後の反応溶液をＭＴＢＥ／ヘキサン（１／１ ｖ／ｖ）５０ｍｌで再沈殿させ、ポリマー９を得た。
収量１２０ｍｇ
【化14】
収量１２０ｍｇ
【0084】
（合成例５－３：ブロックコポリマーＥ）
上記合成例１－３と同様にしてブロックコポリマーＥを合成した。
収量１１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝６７：３３
得られたブロックコポリマーＥの数平均分子量および分子量分布は上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＥの数平均分子量は１８３００、分子量分布は１．５４であった。
【化15】
収量１１０ｍｇ
組成比ｘ：ｙ＝６７：３３
得られたブロックコポリマーＥの数平均分子量および分子量分布は上記合成例１－３と同様にして求めた。ブロックコポリマーＥの数平均分子量は１８３００、分子量分布は１．５４であった。
【0085】
＜ランダムコポリマーＦの合成＞
（比較合成例１－１：ポリマー１０の合成）
二口フラスコにモノマー２（１．８ｇ，９．０ｍｍｏｌ）、ブチルアクリレート（１２８ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート（４６．６ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロ二トリル（１６．４ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍｌ）に溶解させた。１５分間、窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をＭＴＢＥ／Ｈｅｘａｎｅ混合溶媒２００ｍｌで再沈殿させ、ポリマー１０を得た。
収量 １．８ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）
４．１－４．６ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），３．９－４．１（ＣＯＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２（ＢＡ）），２．６－２．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ），２．０－２．６ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ，Ｓ－ＣＨ ３ ），１．６－２．６ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ３（ＢＡ）、ポリマー主鎖），０．８－１．０ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ３ （ＢＡ））
（比較合成例１－１：ポリマー１０の合成）
【化16】
収量 １．８ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）
４．１－４．６ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ），３．９－４．１（ＣＯＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２（ＢＡ）），２．６－２．８ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ），２．０－２．６ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ，Ｓ－ＣＨ ３ ），１．６－２．６ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ３（ＢＡ）、ポリマー主鎖），０．８－１．０ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ３ （ＢＡ））
【0086】
（比較合成例１－２：ランダムコポリマーＦの合成）
ナスフラスコにポリマー１０（１．００ｇ）をいれ、エタノール１０ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン２ｍＬを加え、室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ランダムコポリマーＦを得た。
収量 １．８ｇ
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝８６：１４
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．１－４．６ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ、ＣＯＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２（ＢＡ）），３．２－３．４ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ（ＣＨ３）２），２．８－３．０ｐｐｍ（ＣＨ２－Ｓ（ＣＨ ３ ）２），１．０－２．４ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ３（ＢＡ）、ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ、ポリマー主鎖），０．８－１．０ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ３ （ＢＡ））
得られたランダムコポリマーＦの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は、実施例１と同様であった。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製 Ｍｉｘｅｄ－Ｄ（粒子径 ５μｍ、カラムサイズ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、０．５質量％ 臭化リチウム含有クロロホルム／メタノール＝６／４ （ｖ／ｖ）を用いた。測定条件は、流速 ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度 ４０℃、サンプル濃度 ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量 ７０μＬであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ランダムコポリマーＦの数平均分子量は８３００、分子量分布は１．３１。
【化17】
収量 １．８ｇ
組成比（モル比） ｘ：ｙ＝８６：１４
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．１－４．６ｐｐｍ（ＮＨ－ＣＨ－ＣＯＯＨ、ＣＯＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２（ＢＡ）），３．２－３．４ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｓ（ＣＨ３）２），２．８－３．０ｐｐｍ（ＣＨ２－Ｓ（ＣＨ ３ ）２），１．０－２．４ｐｐｍ（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＨ３（ＢＡ）、ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｓ、ポリマー主鎖），０．８－１．０ｐｐｍ（ＣＨ２－ＣＨ ３ （ＢＡ））
得られたランダムコポリマーＦの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は、実施例１と同様であった。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製 Ｍｉｘｅｄ－Ｄ（粒子径 ５μｍ、カラムサイズ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、０．５質量％ 臭化リチウム含有クロロホルム／メタノール＝６／４ （ｖ／ｖ）を用いた。測定条件は、流速 ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度 ４０℃、サンプル濃度 ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量 ７０μＬであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ランダムコポリマーＦの数平均分子量は８３００、分子量分布は１．３１。
【0087】
＜実施例１－１＞
（タンパク質安定化剤の調製）
実施例１で合成したブロックコポリマーＢを濃度が０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させ、タンパク質安定化剤を調製した。
（タンパク質安定化剤の調製）
実施例１で合成したブロックコポリマーＢを濃度が０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させ、タンパク質安定化剤を調製した。
【0088】
（タンパク質溶液の調製）
西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、濃度が２ｕｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、タンパク質溶液を調製した。
西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、濃度が２ｕｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、タンパク質溶液を調製した。
【0089】
（タンパク質安定化効果の評価）
上述のタンパク質安定化剤１ｍＬに、上記タンパク質溶液５０μＬを加え、評価用溶液を調整した。この評価用溶液を４℃、５０℃の両温度でそれぞれ保存し，７日後、９６ウェルプレートに１０μＬずつ加え、そこにＡＢＴＳ（２，２‘－アゾビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）アンモニウム塩）溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μＬを加え、室温で３０分間、振とうさせた。振とう後、１質量％のドデシル硫酸ナトリウム溶液１００μＬを加え、反応を停止した。４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、タンパク質安定化効果の評価を行った。
すなわち評価用溶液調製直後の吸光度と、上述の保存による７日後の吸光度を測定し、下記数式（数式１）により、酵素活性残存率（％）を算出した。タンパク質安定化効果は、酵素活性残存率により評価し、酵素活性残存率が高いほどタンパク質安定化効果が高いことを表す。評価結果を表１に示す。
測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件：室温 ４１０ｎｍ
上述のタンパク質安定化剤１ｍＬに、上記タンパク質溶液５０μＬを加え、評価用溶液を調整した。この評価用溶液を４℃、５０℃の両温度でそれぞれ保存し，７日後、９６ウェルプレートに１０μＬずつ加え、そこにＡＢＴＳ（２，２‘－アゾビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）アンモニウム塩）溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μＬを加え、室温で３０分間、振とうさせた。振とう後、１質量％のドデシル硫酸ナトリウム溶液１００μＬを加え、反応を停止した。４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、タンパク質安定化効果の評価を行った。
すなわち評価用溶液調製直後の吸光度と、上述の保存による７日後の吸光度を測定し、下記数式（数式１）により、酵素活性残存率（％）を算出した。タンパク質安定化効果は、酵素活性残存率により評価し、酵素活性残存率が高いほどタンパク質安定化効果が高いことを表す。評価結果を表１に示す。
測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件：室温 ４１０ｎｍ
【0090】
【数1】
【0091】
＜実施例１－２～実施例１－３＞
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＣ、Ｅを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＣ、Ｅを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0092】
＜実施例１－４＞
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＣを０．１質量％、スクロースを１５質量％用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＣを０．１質量％、スクロースを１５質量％用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0093】
＜比較例１－１＞
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＡを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＡを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0094】
＜比較例１－２＞
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＤを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＤを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0095】
＜比較例１－３＞
タンパク質安定化剤としてランダムコポリマーＦを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤としてランダムコポリマーＦを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0096】
＜比較例１－４＞
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみ使用したこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみ使用したこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0097】
＜比較例１－５＞
タンパク質安定化剤としてＢＳＡを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤としてＢＳＡを用いたこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0098】
＜比較例１－６＞
タンパク質安定化剤を用いずにスクロース１５質量％を使用したこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
タンパク質安定化剤を用いずにスクロース１５質量％を使用したこと以外は、実施例１－１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。
【0099】
表１に示すとおり、４℃の保存条件においてはブロックコポリマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅにおいてタンパク質安定化効果が確認できた。一方で５０℃の保存条件においてはブロックコポリマーＢ、Ｃ、Ｅにおいてのみタンパク質安定化効果を確認できた。比較例１－１におけるブロックコポリマーＡ、比較例１－２におけるブロックコポリマーＤではタンパク質安定化効果は低かった。
したがって、ブロックＡ／ブロックＢのモル比が、概ね５０／５０～９０／１０であるとき、タンパク質安定化の効果が特に高いといえる。
したがって、ブロックＡ／ブロックＢのモル比が、概ね５０／５０～９０／１０であるとき、タンパク質安定化の効果が特に高いといえる。
【0100】
さらに実施例１－２と比較例１－５から、ブロックコポリマーの添加により、一般的なタンパク質安定化剤であるＢＳＡよりも、５０℃の保存条件においてはタンパク質安定化効果が高いことわかる。実施例１－２と比較例１－３から、ブロックコポリマーとランダムコポリマーを比較した場合、ブロックコポリマーの安定化効果が高いことがわかる。
【0101】
また、実施例１－４に示すとおり、ブロックコポリマーＣに加え、１５質量％のスクロースを添加することでさらにタンパク質安定化効果を高めることができることがわかる。
【0102】
＜実施例２－１＞
（溶解性試験）
タンパク質安定化剤として、ブロックコポリマーＢを１質量％および０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）にそれぞれ溶解させ、２５℃での溶解性を目視で観察した。評価結果を表２に示す。
（溶解性試験）
タンパク質安定化剤として、ブロックコポリマーＢを１質量％および０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）にそれぞれ溶解させ、２５℃での溶解性を目視で観察した。評価結果を表２に示す。
【0103】
＜実施例２－２～実施例２－３＞
タンパク質安定化剤として、ブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＣ、Ｅを使用したこと以外は、実施例２－１と同様にして行った。評価結果を表２に示す。
タンパク質安定化剤として、ブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＣ、Ｅを使用したこと以外は、実施例２－１と同様にして行った。評価結果を表２に示す。
【0104】
＜比較例２－１＞
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＡを使用したこと以外は、実施例２－１と同様にして行った。評価結果を表２に示す。
タンパク質安定化剤としてブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＡを使用したこと以外は、実施例２－１と同様にして行った。評価結果を表２に示す。
【0105】
＜比較例２－２＞
タンパク質安定化剤として、ブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＤを使用したこと以外は、実施例２－１と同様にして行った。評価結果を表２に示す。
タンパク質安定化剤として、ブロックコポリマーＢの代わりにそれぞれブロックコポリマーＤを使用したこと以外は、実施例２－１と同様にして行った。評価結果を表２に示す。
【0106】
実施例２－１から実施例２－３に示すように、ブロックコポリマーＢ、Ｃ、Ｅは１質量％の濃度においても可溶であった。
比較例２－２に示すように、ブロックＡの割合が少ないブロックコポリマーＤでは１質量％時に不溶となった。
実施例１の結果とあわせ、ブロックＡ／ブロックＢのモル比が５０／５０から９０／１０のブロックコポリマーについては、タンパク質安定化剤としてより高濃度のブロックコポリマーを含有できるといえ、対象のタンパク質の安定性にあわせて、添加するタンパク質安定化剤の濃度を自由に設計できる。
比較例２－２に示すように、ブロックＡの割合が少ないブロックコポリマーＤでは１質量％時に不溶となった。
実施例１の結果とあわせ、ブロックＡ／ブロックＢのモル比が５０／５０から９０／１０のブロックコポリマーについては、タンパク質安定化剤としてより高濃度のブロックコポリマーを含有できるといえ、対象のタンパク質の安定性にあわせて、添加するタンパク質安定化剤の濃度を自由に設計できる。
【0107】
【表1】
【0108】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0109】
以上、示したように、４０℃を超える高温条件下でも長期間、タンパク質を安定化でき、低濃度添加するだけでタンパク質安定化効果を発現することができるタンパク質安定化剤が提供された。