特許 7328654 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-08

(45)【発行日】2023-08-17

(54)【発明の名称】候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20230809BHJP

   A61B 5/055 20060101ALI20230809BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

A61B5/055 383

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2019551101

(86)(22)【出願日】2018-10-19

(86)【国際出願番号】 JP2018039064

(87)【国際公開番号】W WO2019087829

(87)【国際公開日】2019-05-09

【審査請求日】2021-10-15

(31)【優先権主張番号】P 2017213708

(32)【優先日】2017-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001270

【氏名又は名称】コニカミノルタ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】599029420

【氏名又は名称】田畑 泰彦

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】乾 智惠

(72)【発明者】

【氏名】望月 誠

(72)【発明者】

【氏名】平山 奈津実

(72)【発明者】

【氏名】前澤 明弘

(72)【発明者】

【氏名】田畑 泰彦

【審査官】山内 達人

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１１０７４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１１０７４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００５－２４１３７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／０５５８２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Inflammation and Regeneration，2014年，Vol.34, No.1，p.45-55

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ａ６１Ｂ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体の活性に与える影響を評価したい化合物である候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法において、
ＭＲＩ用の造影剤、Ｘ線撮像用の造影剤、ポジトロン断層撮像法（ＰＥＴ）用の造影剤、蛍光撮像用の造影剤、超音波撮像用の気泡、および光音響撮像用の造影剤からなる群から選択される信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞に、前記候補物質を投与する工程（ヒト体内の生細胞に外科的処理を伴う方法によって候補物質を投与する態様を除く）と、
前記投与する工程の前後を通じて、前記信号物質からの信号を経時的に検出する工程（ヒト体内から外科的処理を伴う方法によって信号を検出する態様を除く）と、
前記投与する工程の後において、前記投与する工程の前と比較して前記信号の減衰の度合いが低下したことの測定により、前記候補物質が生体の活性に与える影響を評価する工程と、
を含む評価方法。

【請求項2】

前記信号物質は磁性体である、請求項１に記載の評価方法。

【請求項3】

前記生分解性粒子は、徐放性を有する、請求項１または２に記載の評価方法。

【請求項4】

前記生分解性粒子は、ハイドロゲル粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項5】

前記生細胞は、肝細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項6】

前記生分解性粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ以上２．０μｍ以下の粒子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項7】

前記信号物質は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項8】

前記生分解性粒子は、前記信号物質を粒子内に内包する、請求項１～７のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項9】

前記信号物質は、Ｆｅ_３Ｏ_４を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項10】

前記投与する工程の後、所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、
前記投与する工程がなかったとして予測される、前記所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、
の強度差を算出し、
前記強度差から、前記候補物質が前記生細胞に与える影響の大きさを定量する工程をさらに含む、
請求項１～９のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項11】

前記信号の検出は、前記投与する工程の前後を通じての、生体に移植した前記生細胞からの信号の検出（ヒトの体内に移植した前記生細胞からの外科的処置を伴う方法による信号の検出を除く）である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の評価方法。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の評価方法に用いられる、信号物質を含有する生分解性粒子。

【請求項13】

請求項１２に記載の生分解性粒子と、生細胞と、を含むキット。

【請求項14】

生体の活性に与える影響を評価したい化合物である候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムにおいて、
ＭＲＩ用の造影剤、Ｘ線撮像用の造影剤、ポジトロン断層撮像法（ＰＥＴ）用の造影剤、蛍光撮像用の造影剤、超音波撮像用の気泡、および光音響撮像用の造影剤からなる群から選択される信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞であって、前記候補物質を投与された生細胞からの信号を、前記候補物質の投与の前後を通じて経時的に検出する、検出部を有し、
前記候補物質の投与の後において、前記候補物質の投与の前と比較して前記信号の減衰の度合いが低下したことの測定により、前記候補物質が生体の活性に与える影響を評価する、
評価システム。

【請求項15】

さらに、前記候補物質を投与される前の複数の時点において、前記信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞から前記検出部が検出した前記信号の強度から、前記信号の強度の減衰の度合いを予測する予測部と、
前記候補物質を投与した後の時点において前記検出部が前記生細胞から検出した前記信号の強度と、前記候補物質を投与した後の時点であって、前記検出部が前記信号の強度を前記生細胞から検出した時点における前記予測部が予測した前記信号の強度と、の強度差を算出する算出部と、
を有する、請求項１４に記載の評価システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムに関する。

【背景技術】

【0002】

創薬研究開発などにおいては、薬の候補となる新規な化合物について、その治療効果のみならず、副作用の有無なども評価される。たとえば、ある生体に投与された化合物が副作用を有するときは、当該生体の活性（代謝速度など）は低下するが、投与された化合物が副作用を有さないときは当該生体の活性は低下しない。これらの結果から、投与された後の生体の活性が低下した化合物は、副作用を有するものと評価される。

【0003】

上記生体の活性は、たとえば、生体の活性に与える影響を測定したい化合物（以下、単に「候補物質」ともいう。）を投与したマウスから採取した血清、血漿または尿などに含まれる代謝産物（たとえば、グリコーゲンなど）の量を測定して、評価される。この方法によれば、代謝を司る肝細胞の活性を測定して、上記候補物質が生体の活性に与える影響を評価することになる。

【0004】

一方で、磁性体を含有する粒子を細胞に取り込ませて、当該細胞を核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で測定する方法が知られている。たとえば、特許文献１には、磁性体としてのＦｅ_３Ｏ_４を含有する、特定のリン脂質から構成された膜を有するリポソームを取り込んだ血管平滑筋細胞を用いて、動脈硬化巣や経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の血管の再狭窄部を造影する方法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２００６－３３５７４５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ある候補物質に副作用があるか否かを評価するためには、当該候補物質を投与した細胞の活性を経時的に観察することが望ましい。しかし、細胞の活性を経時的に観察できる方法は今まで知られていなかった。そのため、通常は、マウスなどの生体に候補物質を投与して、投与後の当該生体から採取した血清、血漿または尿などに含まれる代謝産物（たとえば、グリコーゲンなど）の量から、肝細胞の活性を測定することで、候補物質が生体の活性に与える影響が評価されていた。

【0007】

しかし、グリコーゲンなどの代謝産物は、肝細胞以外にも筋組織の細胞などからも産出される。そのため、上記方法では、肝細胞の活性を正確に測定することができない。

【0008】

そのため、肝細胞などの特定の細胞の活性のみを直接に観察できる方法の開発が望まれている。たとえば、本発明者らは、特許文献１に記載のリポソームを取り込ませた細胞に、候補物質を投与し、当該細胞をＭＲＩで測定すれば、候補物質を投与した細胞の活性を経時的に観察できるのではないかと期待した。しかし、上記リポソームを取り込ませた細胞からは、経時的なＭＲＩ測定ができなかった。

【0009】

本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、細胞の活性を経時的に測定して候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、ならびに当該方法に用いる生分解性粒子、当該粒子と生細胞とを含むキット、および当該方法に用いるシステムを提供することを、その目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の課題は、以下の手段によって解決される。
［１］候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法において、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞に、前記候補物質を投与する工程と、前記投与する工程の前後を通じて、前記信号物質からの信号を経時的に検出する工程と、を含む評価方法。
［２］前記信号物質は磁性体である、［１］に記載の評価方法。
［３］前記生分解性粒子は、徐放性を有する、［１］または［２］に記載の評価方法。
［４］前記生分解性粒子は、ハイドロゲル粒子である、［１］～［３］のいずれかに記載の評価方法。
［５］前記生細胞は、肝細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の評価方法。
［６］前記生分解性粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ以上２．０μｍ以下の粒子である、［１］～［５］のいずれかに記載の評価方法。
［７］前記信号物質は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子である、［１］～［６］のいずれかに記載の評価方法。
［８］前記生分解性粒子は、前記信号物質を粒子内に内包する、［１］～［７］のいずれかに記載の評価方法。
［９］前記信号物質は、Ｆｅ_３Ｏ_４を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の評価方法。
［１０］前記投与する工程の後、所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、前記投与する工程がなかったとして予測される、前記所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、の強度差を算出し、前記強度差から、前記候補物質が前記生細胞に与える影響の大きさを定量する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかに記載の評価方法。
［１１］前記信号の検出は、前記投与する工程の前後を通じての、生体に移植した前記生細胞からの信号の検出である、［１］～［１０］のいずれかに記載の評価方法。
［１２］［１］～［１１］のいずれかに記載の評価方法に用いられる、信号物質を含有する生分解性粒子。
［１３］［１２］に記載の生分解性粒子と、生細胞と、を含むキット。
［１４］候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムにおいて、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞であって、前記候補物質を投与された生細胞からの信号を、前記候補物質の投与の前後を通じて経時的に検出する、検出部を有する評価システム。
［１５］さらに、前記候補物質を投与される前の複数の時点において、前記信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞から前記検出部が検出した前記信号の強度から、前記信号強度の減衰の度合いを予測する予測部と、前記候補物質を投与した後の時点において前記検出部が前記生細胞から検出した前記信号の強度と、前記予測部が予測した前記信号の強度と、の強度差を算出する算出部と、を有する、［１４］に記載の評価システム。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、細胞の活性を経時的に測定して候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、ならびに当該方法に用いる生分解性粒子、当該粒子と生細胞とを含むキット、および当該方法に用いるシステムが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、複合粒子からの信号強度の経時的な変化を模式的に示すグラフである。

【図2】図２は、候補物質を投与する前後における複合粒子からの信号強度の経時的な変化を模式的に示すグラフである。

【図3】図３Ａは、候補物質の投与前における、複合粒子を取り込ませた生細胞からの信号強度をプロットして得られる模式的なグラフであり、図３Ｂは、候補物質が生体の活性に与える影響を評価すべき時点Ｐ２における信号強度Ｓ１を予測する様子を示す模式的なグラフであり、図３Ｃは、時点Ｐ２で信号強度Ｓ２が実際に得られる様子を示す模式的なグラフであり、図３Ｄは、時点Ｐ２における予測された信号強度Ｓ１および実際に得られた信号強度Ｓ２から、候補物質が生体の活性に与える影響を定量的に評価する様子を示す模式的なグラフである。

【図4】図４は、本発明の一実施形態に係る候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムの構成を模式的に示すブロック図である。

【図5】図５Ａは、実施例において、複合粒子を移植したマウスに候補物質である乳酸鉄を投与したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図５Ｂは、実施例において、複合粒子を移植したマウスに候補物質である亜硫酸ナトリウムを投与したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図５Ｃは、実施例において、複合粒子を移植したマウスに候補物質であるカフェインを投与したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフである。

【図6】図６Ａは、実施例において、複合粒子を培養する培地に候補物質である乳酸鉄を添加したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図６Ｂは、実施例において、複合粒子を培養する培地に候補物質である亜硫酸ナトリウムを添加したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図６Ｃは、実施例において、複合粒子を培養する培地に候補物質であるカフェインを添加したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、特許文献１に記載のようなリポソームは細胞に取り込まれた後に分解されやすく、当該リポソームに含有させた磁性体もすぐに細胞から排出されてしまうため、経時的なＭＲＩ測定ができないことを見出した。

【0014】

これに対し、生分解性粒子に磁性体などの信号物質を含有させ、当該信号物質を含有する粒子を細胞に取り込ませれば、当該生分解性粒子が分解されるまでの間、上記信号物質からの信号を受信して当該細胞の活性を経時的に測定することが可能となる。

【0015】

上記信号物質を含有させた生分解性粒子（以下、単に「複合粒子」ともいう。）１００を生細胞に取り込ませたとき、当該細胞が生分解性粒子を取り込んでからの経過時間を横軸に、当該生細胞から検出される信号強度を縦軸にとると、図１に示すように、信号強度は時間とともに減衰する。これは、当該細胞が分泌する酵素によって細胞に取り込まれた生分解性粒子１１０が徐々に分解され、信号物質１２０が生分解性粒子１１０から徐放されて細胞内で溶解されたり細胞から放出されたりすることにより、細胞中の信号物質１２０の量が時間の経過とともに漸減するためである。

【0016】

このとき、任意に定めた時点Ｐ１で上記複合粒子１００を取り込ませた生細胞に候補物質を投与すると、当該候補物質が生体の活性（代謝速度など）に与える影響の有無によってグラフの形状が変化する。たとえば、当該候補物質が細胞の活性を低下させないか、または低下させる度合いが小さい場合は、当該生細胞による酵素の分泌量は変わらないため、生分解性粒子１１０は分解され続けて、Ｐ１より後でも信号強度は同様の割合で減衰し続ける（図２の破線）。一方で、当該候補物質が細胞の活性を低下させる場合は、当該生細胞による酵素の分泌量が減少するため生分解性粒子１１０はもはや分解されにくく、Ｐ１より後で信号強度の減衰の度合いは低下する（信号強度の傾きがより水平に近くなる）か、または信号強度は減衰しなくなる（図２の実線）。

【0017】

このように、複合粒子１００を取り込ませた生細胞における、候補物質の投与（Ｐ１）前後での信号物質１２０からの信号強度の減衰の度合いの変化を測定することによって、当該候補物質が生体の活性に与える影響を評価することができる。

【0018】

たとえば、図３Ａに示すように、候補物質の投与前における、複合粒子１００を取り込ませた生細胞からの信号強度をプロットしていく。このプロットから算出される信号強度の減衰の度合いが続くものと仮定して、図３Ｂに示すように、候補物質を投与した後の時点であって、候補物質が生体の活性に与える影響を評価すべき任意に定めた時点Ｐ２における信号強度Ｓ１を予測する。一方で、時点Ｐ１で候補物質を投与すると、図３Ｃに示すように、実際に得られる信号強度は減衰の度合いが変化して、時点Ｐ２では信号強度Ｓ２が実際に得られる。そして、図３Ｄに示すように、この予測される信号強度Ｓ１と、実際に得られる信号強度Ｓ２と、の強度差（Ｓ２－Ｓ１）を求めれば、候補物質が生体の活性に与える影響を定量的に評価することも可能である。

【0019】

なお、複合粒子１００を取り込ませた直後は、生細胞からの信号強度の減衰の度合いが安定しないことがあるため、時点Ｐ２における信号強度Ｓ１の予測（図３Ｂ）は、複合粒子１００の取り込み後しばらく時間をおいて上記減衰の度合いが安定してから測定した信号強度をもとに行うことが好ましい。

【0020】

なお、上記時点Ｐ２における信号強度Ｓ１は、以前に同一条件で測定して得られた、候補物質の投与前における信号強度の減衰の度合いなどを用いて、予測された値であってもよい。

【0021】

また、このとき、条件を同一にして測定した、上記定量化された影響を比較することで、異なる物質間での生体の活性に与える影響の差や、同一の物質の投与量による生体の活性に与える影響の差などを、比較して評価することも可能である。

【0022】

なお、上述の説明では、信号強度の減衰の度合いが低下する（信号強度の傾きがより水平に近くなる）ことを測定して、候補物質が細胞の活性を低下させるか否か、および低下させる程度、を評価する方法を示したが、同様に、信号強度の減衰の度合いが高まる（信号強度の傾きがより垂直に近くなる）ことを測定して、候補物質が細胞の活性を高めるか否か、および高める程度、を評価することも、当然に可能である。

【0023】

１．複合粒子
１－１．信号物質
上記信号は、生細胞内に上記信号物質が存在することを確認できる信号であればよい。上記信号の例には、磁場（磁化量）、Ｘ線、ガンマ線および蛍光などの電磁波、ならびに、超音波および光音響信号などの音響波などが含まれる。

【0024】

上記信号物質は、上記信号を検出することにより生細胞内に存在することを確認でき、かつ生細胞内での分解および生細胞からの排出などによって上記生細胞内に残留しない物質であればよい。上記信号物質の例には、ＭＲＩ用の造影剤、Ｘ線撮像用の造影剤、ポジトロン断層撮像法（ＰＥＴ）用の造影剤、蛍光撮像用の造影剤、超音波撮像用の気泡、および光音響撮像用の造影剤などの公知の造影剤が含まれる。

【0025】

ＭＲＩ用の造影剤の例には、ガドリニウム（Ｇｄ）ならびに酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３およびフェライトなど）を含む磁性体が含まれる。

【0026】

Ｘ線撮像用の造影剤の例には、タングステン、白金、タンタル、イリジウム、金、硫酸バリウム、次炭酸ビスマス、三酸化ビスマス、オキシ塩化ビスマス、メトリザマイド、イオパミドール、イオタラム酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウムおよびメグルミンなどが含まれる。

【0027】

蛍光撮像用の造影剤の例には、フルオレセインおよびインドシアニングリーンなどを含む蛍光色素、ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質などが含まれる。

【0028】

光音響撮像用の造影剤の例には、金ナノ粒子、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、インドシアニングリーンおよびメチレンブルーなどが含まれる。

【0029】

上記信号物質は、生分解性粒子の表面または内部に存在すればよいが、信号物質をより長い時間細胞内に留める観点からは、信号物質は、生分解性粒子の内部に存在する（生分解性粒子に内包される）ことが好ましい。

【0030】

なお、本明細書において、信号物質が生分解性粒子に内包されるとは、生分解性粒子の平均粒子径をＸとして、生分解性粒子の表面から厚み０．０１Ｘの表層部に含まれる信号物質の平均濃度Ａと、表層部よりも生分解性粒子の内側に含まれる信号物質の平均濃度Ｂとの比Ａ／Ｂが０．２５未満であることを意味する。上記表層部および内部における信号物質の平均濃度は、表層部および内部から選択されたそれぞれ１０箇所について、Ｘ線光電子分光分析によって測定された信号物質の分子濃度を加算平均して得られる値とすることができる。

【0031】

これらのうち、より検出が容易であることから、ＭＲＩ用の造影剤が好ましく、Ｆｅ_３Ｏ_４がより好ましい。

【0032】

信号物質は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子であることが好ましい。上記平均粒子径が０．５ｎｍ以上であると、１個の信号物質からの検出性が十分に高くなるため、複合粒子に含有させる信号物質の数を減らすことができ、信号物質が導入されることによる細胞への負荷を減らすことができる。上記平均粒子径が５０ｎｍ以下であると、サイズが大きい信号物質が導入されることによる細胞への負荷を減らすことができる。

【0033】

検出精度をより高める観点から、信号物質は、複合粒子の全体積に対して１体積％以上９５体積％以下の量で含まれることが好ましい。

【0034】

１－２．生分解性粒子
上記生分解性粒子は、細胞内で加水分解されるか、または細胞内で分泌される酵素により分解される材料を含んで形成され、分解されることによって上記信号物質を徐放できる粒子であればよい。なお、リポソームは徐放性を有さないため、上記生分解性粒子には含まれない。

【0035】

徐放性を有するとは、生分解性粒子が、少なくとも信号を検出する期間は粒子径状を保って信号物質を粒子内に留めておき、かつ、少しずつ分解されていって信号物質を少しずつ放出していくことを意味する。

【0036】

信号物質の徐放性を高める観点からは、上記生分解性粒子は、ハイドロゲル粒子であることが好ましい。ハイドロゲル粒子とは、水を溶媒として形成可能なゲルから形成される粒子を意味する。典型的には、ハイドロゲル粒子は、網目構造を形成する親水性の高分子と、上記網目構造に取り込まれた水とを含む。

【0037】

ハイドロゲル粒子の例には、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アガロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デンプン、およびペクチンなどの多糖類、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、およびアルブミンなどのタンパク質、ポリ－γ－グルタミン酸、ポリ－Ｌ－リジン、およびポリアルギニンなどのポリアミノ酸、ならびに、アクリルアミド、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、およびポリビニルピロリドンなどの合成高分子から形成される粒子が含まれる。

【0038】

これらのうち、生細胞自らによって細胞内に取り込まれやすくして、取り込みの際の生細胞の損傷などを抑制可能とする観点からは、多糖類、タンパク質およびポリアミノ酸が好ましく、入手または作製の容易さからは、多糖類およびタンパク質がより好ましく、ゼラチンがさらに好ましい。

【0039】

上記ハイドロゲル粒子がゼラチンから形成されるゼラチン粒子であるとき、上記ゼラチン粒子は、その主成分がゼラチンからなる粒子であり、具体的には、アミノ酸測定装置で分析した際、アミノ酸１０００残基の内、グリシンが３００以上含まれており、アラニン、プロリン両方を含む粒子である。ゼラチンは、粒子を形成することができればよく、牛骨、牛皮、豚皮、豚腱、魚鱗および魚肉などに由来するコラーゲンを変性して得られる、公知のいかなるゼラチンを用いてもよい。ゼラチンは、以前から食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることが少ない。また、ゼラチンは生体内で分散消失するため、生体内から除去する必要がないという利点を有する。なお、上記ゼラチン粒子は、細胞内へのゼラチン粒子の取り込みが可能な限りにおいて、ゼラチン以外の成分を含有してもよい。なお、上記ゼラチン以外の成分の量は、体内に摂取したときに人体に与える害が無視できる範囲であることが好ましい。また、上記ゼラチン以外の成分は、生体内に蓄積せず排出されやすい物質からなることが好ましい。

【0040】

上記ゼラチン粒子を構成するゼラチンの重量平均分子量は、上記粒子径および膨潤度の条件を満たすゼラチン粒子を形成しやすくする観点から、１０００以上１０００００以下であることが好ましい。上記重量平均分子量は、たとえばパギイ法第１０版（２００６年）に準じて測定された値とすることができる。

【0041】

ゼラチン粒子を構成するゼラチンは、架橋していてもよい。架橋は、架橋剤による架橋でもよいし、架橋剤を用いずになされる自己架橋でもよい。

【0042】

上記架橋剤は、たとえば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基およびイミダゾール基などと化学結合を作る官能基を複数有する化合物であればよい。このような架橋剤の例には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド－メト－ｐ－トルエンスルホナート（ＣＭＣ）を含む水溶性カルボジイミド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテルおよびグリセロールポリグリシジルエーテルを含む２以上のエポキシ基を有する化合物、ならびにプロピレンオキサイドが含まれる。これらのうち、反応性をより高める観点からは、グルタルアルデヒドおよびＥＤＣが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。

【0043】

上記自己架橋の例には、熱の付与または電子線もしくは紫外線の照射による架橋が含まれる。

【0044】

ハイドロゲル粒子が含有する水の量は特に限定されないが、膨潤処理後において、ハイドロゲル粒子の全質量に対して１質量％以上９９質量％以下であることが好ましく、１０質量％以上９０質量％以下であることがより好ましく、１５質量％以上８０質量％以下であることがさらに好ましい。

【0045】

なお、本明細書において、膨潤処理後の生分解性粒子とは、乾燥時の生分解性粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られる生分解性粒子を意味する。また、本明細書において、乾燥時の生分解性粒子とは、８０℃の大気中に２４時間静置した後の生分解性粒子を意味する。

【0046】

生細胞自らによって細胞内に取り込まれやすくして、取り込みの際の生細胞の損傷などを抑制する観点からは、生分解性粒子は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５．０μｍ以下の粒子であることが好ましい。

【0047】

平均粒子径が５．０μｍ以下である生分解性粒子は、生細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされやすい。これは、上記粒子径が５．０μｍ以下である生分解性粒子は生細胞によって異物と認識されにくく、エンドサイトーシス等の活動により細胞内に取り込まれやすいからと考えられる。上記観点からは、生分解性粒子の粒子径は、３．０μｍ以下であることが好ましく、２．０μｍ以下であることがより好ましく、１．５μｍ以下であることがさらに好ましい。一方で、平均粒子径が０．５ｎｍ以上である生分解性粒子は、粒子内により多くの信号物質を担持させやすい。上記観点からは、生分解性粒子の粒子径は、２．０ｎｍ以上であることが好ましく、１０ｎｍ以上であることがより好ましい。特に、生分解性粒子の平均粒子径を１０ｎｍ以上２．０μｍ以下とすることで、複合粒子のハンドリング性をよくし、信号物質などの収容量を大きくし、かつ、生細胞自らの活動による細胞内への取り込みをなされやすくすることができる。

【0048】

また、生分解性粒子のアスペクト比は、１．０以上１．４以下であることが好ましい。上記アスペクト比が１．４以下であると、生分解性粒子は膨潤の前後を通じてより球形に近い形状を保ちやすく、生分解性粒子および生細胞を含む溶液において、生分解性粒子と生細胞とがより均一な形状および大きさの接触面で接しやすくなるため、生分解性粒子間での取り込まれやすさの差が生じにくいと考えられる。そのため、上記アスペクト比を有する易取込性生分解性粒子は、細胞へ取り込まれる生分解性粒子の量、および生分解性粒子を取り込む細胞の量、をより制御しやすいと考えられる。上記易取込性生分解性粒子のアスペクト比は、生分解性粒子の長径を生分解性粒子の短径で除算して求めた値とすることができる。

【0049】

また、生分解性粒子の長径は、２．０μｍ以下であることが好ましい。長径が２．０μｍ以下であると、生分解性粒子は膨潤の前後を通じてより小さい粒子径を保ちやすく、生細胞自らの活動によって細胞内に取り込まれやすいと考えられる。上記観点からは、上記長径は、１．８μｍ以下であることがより好ましく、１．５μｍ以下であることがさらに好ましい。

【0050】

なお、本明細書において、生分解性粒子の粒子径は、生分解性粒子の長径と短径とを加算平均した値とすることができる。また、生分解性粒子の長径、短径、粒子径およびアスペクト比は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像した画像を解析して得られる、膨潤処理後の生分解性粒子から任意に選択した複数の生分解性粒子（たとえば、２０個の生分解性粒子）の長径、短径、粒子径およびアスペクト比を加算平均した値とすることができる。

【0051】

１－３．複合粒子の製造方法
上記生分解性粒子は、溶融した生分解性粒子の材料を含む液体（以下、単に「材料溶液」ともいう。）の液滴を加熱管または乾燥室の雰囲気中に吐出して乾燥させる方法（気中滴下法）、材料溶液の液滴を疎水性溶媒内に吐出して分散させる方法（液中滴下法）、および、材料溶液をエマルジョン化してゼラチンを含む微小液滴を分散させる方法（液中分散法）等によって、材料溶液を粒子化して、製造することができる。

【0052】

このとき、信号物質を含ませた材料溶液を、上述の方法などで粒子化することで、信号物質が生分解性粒子に内包された複合粒子を得ることができる。また、上述の方法などで信号物質を含有しない生分解性粒子を製造した後に、信号物質を生分解性粒子に付与して、信号物質が生分解性粒子の表面または内部に含有された複合粒子を得ることもできる。

【0053】

上記信号物質を含ませた材料溶液は、材料溶液と信号物質とを混合して得てもよいし、材料溶液中で信号物質を合成して、信号物質と溶融した生分解性粒子の材料とを含むスラリーとしてもよい。このとき、上記スラリーに相分離誘起剤を添加して、信号物質が生分解性粒子に内包された複合粒子を得ることができる。上記スラリーに相分離誘起剤を添加する方法によれば、信号物質が材料溶液中で凝集しにくく、かつ、信号物質が生分解性粒子の内部により均一に分散しやすいため、信号物質がより均一に徐放されやすい複合粒子が得られやすく、候補物質が生体の活性に与える影響の評価精度をより高めやすいため好ましい。

【0054】

たとえば、信号物質としてＦｅ_３Ｏ_４を担持したゼラチン粒子を製造する場合には、Ｆｅ_３Ｏ_４の原料となるＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２ＯおよびＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏと、ゼラチンとを含む水溶液を調製し、そこにアルカリ溶液（たとえば、ＮａＯＨ、ＮＨ_３、ＫＯＨなどの溶液）を添加して溶液のｐＨを７以上に調整し、Ｆｅ_３Ｏ_４を合成すれば、材料溶液中にＦｅ_３Ｏ_４が均一に分散したスラリーが得られる。

【0055】

上記得られたスラリーに相分離誘起剤を添加すれば、相分離誘起剤の添加によってゼラチンのコアセルベーションが生じ、Ｆｅ_３Ｏ_４を内包するゼラチン粒子が形成される。

【0056】

相分離誘起剤は、生分解性粒子の材料を粒状化することが可能な成分である限り特に限定されない。相分離誘起剤の例には、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、および１－ブタノールなどを含むアルコール類、ならびにアセトンなどを含む有機溶媒が含まれる。

【0057】

また、上記スラリーに相分離誘起剤を添加する方法によれば、スラリー中の生分解性粒子の材料の濃度を調整することで、得られる複合粒子の平均粒子径を調整することができる。つまり、スラリー中の生分解性粒子の材料の濃度が高いほど、得られる複合粒子の平均粒子径は大きくなり、スラリー中の生分解性粒子の材料の濃度が低いほど、得られる複合粒子の平均粒子径は小さくなる傾向がある。

【0058】

また、上記スラリーに相分離誘起剤を添加する方法によれば、スラリー中のゼラチン濃度または相分離誘起剤の添加量などを調製することで、信号物質の分散の均一性を調整できると考えられる。

【0059】

たとえば、平均粒子径が２００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、信号物質が粒子中に均一に分散したゼラチン粒子を製造するためには、スラリー中のゼラチン濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下とし、相分離誘起剤の添加量を、前記スラリー１ｍｌ当たり２ｍｌ以上５０ｍｌ以下とすることが好ましい。

【0060】

また、ゼラチン粒子に担持される信号物質の量は、ゼラチンを粒状化する前のスラリーにおける信号物質の濃度に依存する。スラリーに含まれる信号物質の濃度は、スラリーの全質量に対して１質量％以上３０質量％であることが好ましい。

【0061】

２．生細胞
上記生細胞は、上記生分解性粒子を細胞膜の内側に取り込み、かつ、分解などできる細胞であればよい。

【0062】

生分解性粒子を細胞膜の内側に取り込むとは、細胞を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で撮像した画像において、生分解性粒子が細胞膜の内側に確認される状態になることを意味する。また、細胞への生分解性粒子の取り込みは、信号物質からの信号が細胞内から検出されることでも、確認することができる。

【0063】

上記生細胞の例には、骨髄、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管、小腸、心臓弁、皮膚、血管、角膜、眼球、硬膜、骨、気管および耳小骨を含む各種臓器から摘出された生体試料または検体に由来する細胞、市販の株化細胞、ならびに皮膚幹細胞、表皮角化幹細胞、網膜幹細胞、網膜上皮幹細胞、軟骨幹細胞、毛包幹細胞、筋幹細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、外胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を含む幹細胞ならびにこれらの幹細胞から分化した細胞を含む公知の細胞などが含まれる。

【0064】

これらの細胞のうち、代謝活性が高い細胞が好ましく、肝臓に由来するかまたは培養された肝細胞がより好ましい。

【0065】

生細胞による生分解性粒子の取り込みは、液体中に生分解性粒子と生細胞とを添加して、エンドサイトーシスによる取り込みなどの生細胞自らの活動によって取り込ませる方法、および外部からの操作によって生細胞に導入する方法によって行うことができる。

【0066】

生細胞自らの活動によって生分解性粒子を取り込ませる方法の例には、生分解性粒子と生細胞とを液中で撹拌する方法や、生分解性粒子が含まれる細胞培養液中で生細胞を培養する方法が含まれる。なお、上述した平均粒子径を有する生分解性粒子は、生細胞自らによる取り込み効率が高いため、細胞への取り込みを促進するために他の成分との複合体を形成させる操作は特に必要ない。生細胞の活性の低下を最小限に抑える観点からは、上記のうち、生分解性粒子と生細胞とを液中で混合し培養する方法が好ましい。

【0067】

外部からの操作によって導入する方法の例には、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が含まれる。

【0068】

これらのうち、生分解性粒子を導入させる際に生細胞の活性を低下させにくくする観点からは、生細胞自らの活動によって導入する方法が好ましく、上記複合体を形成せずに生細胞に取り込ませる方法がより好ましい。

【0069】

生分解性粒子および生細胞が添加される液体としては、細胞培養液を用いることができる。上記細胞培養液は、公知の緩衝液または生理食塩水であってもよく、例えば、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）およびその他の公知のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。

【0070】

生細胞の活性を高めて生細胞自らの活動によって生分解性粒子を細胞内に取り込ませやすくする観点からは、上記撹拌時の上記細胞培養液の温度は、１５℃以上５０℃以下であることが好ましく、３５℃以上４５℃以下であることがより好ましい。

【0071】

生細胞自らの活動によって生分解性粒子を細胞膜の内側へ取り込ませるとき、たとえば、生分解性粒子と上記生細胞とを含む細胞培養液を振とうして、導入を促進してもよい。

【0072】

生分解性粒子を取り込んだ細胞は、そのまま培養させてもよいし、生分解性粒子を取り込んだ後に生体内に移植してもよい。候補物質が生体の活性に与える影響をより正確に評価したい場合は、生分解性粒子を取り込んだ細胞を生体内に移植して、生体内に定着した当該細胞が含有する信号物質からの信号を検出することが好ましい。たとえば、上記細胞から作製したスフェロイドを、門脈内に留置したカテーテルを通じてマウスに注入すれば、注入されたスフェロイドは、肝細胞索に輸送されて定着する。

【0073】

生分解性粒子を取り込んだ細胞への候補物質の投与は、上記細胞が候補物質に接触できる限りにおいて特に限定されない。たとえば、上記細胞を含む培地に候補物質を添加してもよいし、上記細胞を移植した生体に、口蓋内、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、腸内、鞘内、および肝臓内などへの直接投与、ならびに注射および点滴などによる投与などが可能である。

【0074】

３．キット
上記生細胞および上記複合粒子は、これらを含むキットとすることができる。あるいは、上記生細胞、上記生分解性粒子および上記信号物質は、これらを含むキットとすることができる。上記キットは、いずれも、上記生細胞を培養するための培地を含んでもよい。

【0075】

４．候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム
上述した候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法は、図４に示すような、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞であって、上記候補物質を投与された生細胞からの信号を、上記候補物質の投与の前後を通じて経時的に検出する、検出部２１０を有するシステム２００によって、実行することができる。

【0076】

検出部２１０は、上記信号物質からの信号を経時的に検出し、信号強度を経時的に測定できればよく、信号物質の種類に応じて、ＭＲＩ装置、Ｘ線撮像装置、ポジトロン断層撮像装置、蛍光撮像装置、および光音響撮像装置などとすることができる。

【0077】

上記システムは、上記候補物質を投与される前の複数の時点において、上記信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞から検出部２１０が検出した前記信号の強度から、上記信号強度の減衰の度合いを予測する、予測部２２０を備えていてもよい。予測部２２０は、図３Ａに示すような、生細胞からの信号強度から、図３Ｂに示すように、候補物質を投与した後の時点であって、候補物質が生体の活性に与える影響を評価すべき任意に定めた時点Ｐ２における信号強度Ｓ１を予測することができればよい。

【0078】

また、上記システムは、上記候補物質を投与した後の時点において検出部２１０が上記生細胞から検出した上記信号の強度と、予測部２２０が予測した上記信号の強度と、の強度差を算出する算出部２３０を備えていてもよい。算出部２３０は、図３Ｃに示すように、時点Ｐ２で信号強度Ｓ２が実際に得られたとき、図３Ｄに示すように、予測部２２０が時点Ｐ２における信号強度として予測した信号強度Ｓ１と、実際に得られた信号強度Ｓ２と、の強度差を求めることができればよい。なお、上記予測した信号強度Ｓ１は、事前に同様の条件で実験して得られ、記憶部２５０に記憶された値を参照して用いてもよい。

【0079】

また、上記システムは、検出部２１０が検出した信号強度および算出部２３０が算出した上記強度差などを表示する表示部２４０、および、算出部２３０が算出した上記強度差を記憶する記憶部２５０などを備えていてもよい。

【0080】

予測部２２０および算出部２３０の動作は、これらの機能部の機能を実行するためのプログラムを、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２６０が記憶部２５０としても機能するＲＯＭ（Read Only Memory）から読み出してＲＡＭ（Random Access Memory）に展開し、展開したプログラムをＣＰＵ２６０が実行することで、制御される。

【実施例】

【0081】

以下において、本発明の具体的な実施例を説明する。なお、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定して解釈されない。

【0082】

１．複合粒子の作製
（合成条件１）
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製、Ｇ－２６１３Ｐ）の濃度が５０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した２００ｍｌのゼラチン水溶液を用意し、これに０．８３５ｇのＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏおよび０．７６０ｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏを添加した。このゼラチン水溶液に、さらに、４０ｍｌの２８％ＮＨ_３水溶液を添加して、ゼラチンスラリーを得た。

【0083】

上記ゼラチンスラリーを６０℃に加温して、ゼラチンおよび磁性体粒子（信号物質）としてのＦｅ_３Ｏ_４を含む複合粒子を得た。このとき、ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２ＯおよびＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏの添加量、またはゼラチンスラリーの加温時間を調整して、生分解性粒子または磁性体粒子の平均粒子径が異なる複合粒子からなる複合粒子１～複合粒子６を製造した。

【0084】

上記ゼラチンをシリコーンおよびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に変更した以外は同様にして、それぞれ複合粒子１０および複合粒子１１を製造した。

【0085】

（合成条件２）
上記ゼラチンスラリーに対して、相分離誘起剤としてアセトンを添加して、５０℃で混合した。その後、０．１ｍｇのグルタルアルデヒドを加え３時間撹拌したのち、１Ｍのグリシン水溶液を添加した。ゼラチンスラリー中に析出した粒子を回収し、純粋で洗浄して、ゼラチンおよびＦｅ_３Ｏ_４粉末を含む複合粒子を得た。このとき、ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２ＯおよびＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏの添加量、またはアセトンの添加量を調整して、生分解性粒子または磁性体粒子の平均粒子径が異なる複合粒子からなる複合粒子７～複合粒子９を製造した。

【0086】

（平均粒子径の測定）
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて上記作製した複合粒子１～複合粒子１１を撮像し、撮像された画像をＭｏｕｎｔｅｃｈ社製画像解析式粒度分布ソフトウェアＭａｃ－Ｖｉｅｗを用いて解析して、任意に選択した２０個の複合粒子中に含まれる合計４０個の磁性体粒子の短径および長径を求め、これらの短径および長径の平均値を複合粒子が含有する磁性体粒子の平均粒子径とした。

【0087】

上記合成条件１または合成条件２で複合粒子１～複合粒子１１作製する際に得られたゼラチンスラリーを超純水で希釈し、ＨＯＲＩＢＡ 製ナノ粒子解析装置ｓｚ１００を用いて、複合粒子１～複合粒子１１に含まれるＦｅ_３Ｏ_４（信号物質）の平均粒子径を測定した。

【0088】

２．複合粒子の測定
２－１．複合粒子の平均粒子径
ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｚ－１００（株式会社堀場製作所製）を用いて、上記作製し複合粒子１～複合粒子１１に含まれる複合粒子の体積平均粒子径を光子相関法で測定した。

【0089】

２－２．磁性体粒子の平均粒子径
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて上記作製した複合粒子１～複合粒子１１を撮像し、撮像された画像をＭｏｕｎｔｅｃｈ社製画像解析式粒度分布ソフトウェアＭａｃ－Ｖｉｅｗを用いて解析して、任意に選択した２０個の複合粒子中に含まれる合計４０個の磁性体粒子の短径および長径を求め、これらの短径および長径の平均値を複合粒子が含有する磁性体粒子の平均粒子径とした。

【0090】

２－３．磁性体粒子の内包
上記作製した複合粒子１～複合粒子１１を市販のＦｅ染色キットで染色したところ、複合粒子１～複合粒子１１のすべてにおいて、粒子内に磁性体（ＦｅＣｌ_３）が内包されていることが確認された。

【0091】

３．細胞内への複合粒子の導入および評価
３－１．細胞内への導入
肝細胞培養キットＰ－２（マウス）（コスモ・バイオ株式会社製）に含まれる増殖用培地を用いて、マウス由来の肝細胞（ＮＣＴＣ－Ｃｌｏｎｅ １４６９ （Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ） 、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）を培養した。

【0092】

上記細胞を培養した培地に１ｍｇの複合粒子１～複合粒子１１を加えて、４０℃で２４時間保管して上記細胞に上記複合粒子を導入し、評価用サンプル１～評価用サンプル１１を得た。

【0093】

３－２．細胞による取り込みの評価
上記評価用サンプルの一部を取り出し、以下の手順によって、細胞膜の内側に取り込まれた複合粒子が確認できるか否かを観察し、以下の基準によって判定した。

【0094】

（細胞及びＦｅの染色）
培養した細胞に１％パラホルムアルデヒド１ｍｌを加えて細胞固定化処理を行った。次いで、下記組成のＦｅ染色液１ｍｌを加えてＦｅを染色した。さらに、下記の濃度に調整した核染色液１ｍｌを加えて細胞を染色した。

【0095】

（Ｆｅ染色液の組成）
下記の２液を同体積混合してＦｅ染色液を調製した。
・２０体積％ ＨＣＬ(濃塩酸を５倍希釈したもの）
・１０質量％ Ｋ_４（Ｆｅ（ＣＮ_６））水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）

【0096】

（核染色液の組成）
硫酸アンモニウム５質量部と、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄ ０．１質量部とを、蒸留水１００質量部に混合して核染色液を調製した。

【0097】

（複合粒子を取り込んだ細胞数のカウント）
任意に選択された２０個の細胞を光学顕微鏡で観察して、細胞膜の内側に青い染色部位（複合粒子中のＦｅに由来する）が確認できるか否かを観察し、以下の基準で評価した。

【0098】

◎ 上記２０個の細胞のうち、５０％以上（１０個以上）の細胞で、細胞膜の内側に染色部位が確認された
○ 上記２０個の細胞のうち、１０％以上５０％未満（２個以上１０個未満）の細胞で、細胞膜の内側に染色部位が確認された
× 上記２０個の細胞のうち、１０％未満（２個未満）の細胞で、細胞膜の内側に染色部位が確認されたか、または細胞膜の内側に染色部位が確認される細胞は存在しなかった

【0099】

表１に、評価用サンプル１～１１について、生分解性粒子の材料、合成条件および平均粒子径、信号物質（Ｆｅ_３Ｏ_４）の平均粒子径、磁性体粒子（信号物質）が内包されているか否かの評価結果、ならびに取り込み評価の結果を示す。

【0100】

【表1】

【0101】

表１から明らかなように、生分解性粒子がゼラチンを材料とする粒子であると、細胞自らの活動による複合粒子の取り込みがなされやすかった。また、生分解性粒子の平均粒子径が１０ｎｍ以上２．０μｍ以下であると、細胞自らの活動による複合粒子の取り込みがなされやすかった。

【0102】

４．複合粒子を取り込んだ生細胞のマウスへの導入
４－１．スフェロイドの作製
スフェロイド作成用の容器（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ、住友ベークライト株式会社製、「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」は同社の登録商標）を用いて評価用サンプルＮｏ．２に含まれる細胞をさらに培養し、これらのサンプルに含まれる細胞からスフェロイドを作製した。

【0103】

４－２．マウスへの導入
門脈内に留置したカテーテルを通じて、上記スフェロイドをマウスに注入した。

【0104】

５．候補物質が生体の活性に与える影響の評価
ＭＲＩシステム（実験小動物用 高性能コンパクトＭＲＩシステム Ｍシリーズ Ｍ３、プライムテック株式会社製）を用いて、上記スフェロイドを導入したマウスの、導入部位から測定されるＴ２値を、導入から１時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後に、測定した。

【0105】

上記４８時間後のＴ２値を測定した直後のマウスに、表２に示す候補物質を静脈からの注射により投与した。候補物質は、いずれも濃度４０ｍｇ／ｍｌとして、表２に示す量の物質が投与されるよう注射量を調整した。

【0106】

さらに、上記ＭＲＩシステムを用いて、候補物質を注入したマウスのＴ２値を、候補物質の注入から２４時間後（スフェロイドの導入から７２時間後）および２４０時間後（スフェロイドの導入から２８８時間後）に、測定した。

【0107】

表２に、マウスに注入した候補物質の種類、濃度、投与量および注入した試薬量（濃度と投与量との積）、ならびに上記各時点における測定されたＴ２値を示す。

【0108】

【表2】

【0109】

６．複合粒子への候補物質の投与
評価用サンプルＮｏ．２に含まれる細胞をプレート上でさらに培養し、表３に示す候補物質を上記プレートにさらに添加した。

【0110】

７．候補物質が生体の活性に与える影響の評価
ＭＲＩシステム（実験小動物用 高性能コンパクトＭＲＩシステム Ｍシリーズ Ｍ３、プライムテック株式会社製）を用いて、上記複合粒子を取り込ませた細胞から測定されるＴ２値を、細胞濃度が１×１０^５個程度になった時点から１時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後に、測定した。

【0111】

上記４８時間後のＴ２値を測定した直後の上記プレートに、表３に示す候補物質を添加した。候補物質は、いずれも濃度１μｇ／ｍｌとして、表３に示す量の物質が投与されるよう添加量を調整した。

【0112】

さらに、上記ＭＲＩシステムを用いて、候補物質を添加した後の細胞のＴ２値を、候補物質の添加から２４時間後（細胞濃度が１×１０^５個程度になった時点から７２時間後）および２４０時間後（細胞濃度が１×１０^５個程度になった時点から２８８時間後）に、測定した。

【0113】

表３に、上記プレートに注入した候補物質の種類、濃度、投与量および注入した試薬量（濃度と投与量との積）、ならびに上記各時点における測定されたＴ２値を示す。

【0114】

【表3】

【0115】

図５に、表２に示す試験結果を、横軸を経過時間、縦軸を信号強度として、候補物質ごとにプロットして得られるグラフを示す。図５Ａは、試験１～試験４（候補物質：乳酸鉄）の結果を示すグラフであり、図５Ｂは、試験５～試験７（候補物質：亜硫酸ナトリウム）の結果を示すグラフであり、図５Ｃは、試験８～試験９（候補物質：カフェイン）の結果を示すグラフである。

【0116】

図６に、表３に示す試験結果を、横軸を経過時間、縦軸を信号強度として、候補物質ごとにプロットして得られるグラフを示す。図６Ａは、試験１０～試験１３（候補物質：乳酸鉄）の結果を示すグラフであり、図６Ｂは、試験１４～試験１５（候補物質：亜硫酸ナトリウム）の結果を示すグラフであり、図６Ｃは、試験１６～試験１７（候補物質：カフェイン）の結果を示すグラフである。

【0117】

図５および図６から、特に候補物質の投与量が多いときに、候補物質の投与後にグラフの減衰の度合いが大きく低下することがわかる（図５Ａの試験４、図５Ｂの試験７、図５Ｃの試験９、図６Ａの試験１３，図６Ｂの試験１５、図６Ｃの試験１７）。

【0118】

これらの結果から、各候補物質について、細胞の活性が低下するかを推測する投与量を評価することができる。また、これらの結果から、異なる候補物質についても、投与量を同一にすることで、細胞の活性を低下させる程度を候補物質間で比較することが可能であることも理解され得る。

【0119】

本出願は、２０１７年１１月６日出願の日本国出願番号２０１７－２１３７０８号に基づく優先権を主張する出願であり、当該出願の特許請求の範囲、明細書および図面に記載された内容は本出願に援用される。

【産業上の利用可能性】

【0120】

本発明の方法は、候補物質の投与による生細胞の活性の変化を経時的かつ定量的に測定することができる。そのため、本発明の方法は、新規な医薬候補化合物についての、副作用の評価、無毒性量の定量、および医薬効果の評価などを容易にすることが期待される。

【符号の説明】

【0121】

１００ 複合粒子
１１０ 生分解性粒子
１２０ 信号物質
２００ システム
２１０ 検出部
２２０ 予測部
２３０ 算出部
２４０ 表示部
２５０ 記憶部
２６０ ＣＰＵ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】