特許 7328693 ホスホリパーゼＡ２を処理してＴ細胞の細胞死を調節する方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-08

(45)【発行日】2023-08-17

(54)【発明の名称】ホスホリパーゼＡ２を処理してＴ細胞の細胞死を調節する方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20230809BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20230809BHJP

   C12N 9/20 20060101ALI20230809BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N5/02

C12N9/20

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2019226752

(22)【出願日】2019-12-16

(65)【公開番号】P2021010360

(43)【公開日】2021-02-04

【審査請求日】2022-07-22

(31)【優先権主張番号】10-2019-0082571

(32)【優先日】2019-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 蜂毒（ｂｖＰＬＡ２）にＡｐｏｐｔｏｓｉｓを抑制して調節Ｔ細胞に及ぼす影響 １

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】519449013

【氏名又は名称】ジーエムピー バイオ カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】ベ，ヒョン－ス

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユン－ソブ

(72)【発明者】

【氏名】ク，ス－ジョン

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１５０９５１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Chung ES. et al.，Bee Venom Phospholipase A2, a Novel Foxp3+ Regulatory T Cell Inducer, Protects Dopaminergic Neurons by Modulating Neuroinflammatory Responses in a Mouse Model of Parkinson's Disease，J Immunol，2015年，Vol. 195(10)，pp. 4853-4860

【文献】Costa-Junior HM. et al.，Apoptosis-inducing factor of a cytotoxic T cell line: involvement of a secretory phospholipase A2，Cell Tissue Res，2006年，Vol. 324(2)，pp. 255-266

【文献】Cheroutre H. et al.，The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes，Nat Rev Immunol，2011年，Vol. 11(7)，pp. 445-456

【文献】村上 誠，ホスホリパーゼA2ファミリーの多様性と生命応答における役割，生化学，2018年，Vol. 90(3)，pp. 348-360

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上において、
蜂毒から分離されたホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）でＣＤ４陽性作用Ｔ細胞又は調節Ｔ細胞を処理して、ＣＤ４陽性作用Ｔ細胞又は調節Ｔ細胞のカスパーゼ－３の活性化を減少させ、シトクロムＣの活性化を減少させ、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の発現を増加させる方法。

【請求項2】

蜂毒から分離されたホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を含む、ＣＤ４陽性作用Ｔ細胞又は調節Ｔ細胞のカスパーゼ－３の活性化を減少させ、シトクロムＣの活性化を減少させ、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の発現を増加させるための培地組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２；ＰＬＡ２）によるＴ細胞の細胞死調節メカニズムとして、ガン、退行性疾患、脳疾患及び免疫関連疾患などの人間の殆ど全ての疾患に関与するＴ細胞の細胞死抑制効果に関する。

【背景技術】

【0002】

人間を構成している細胞の数を正確に測定することは難しいが、約数十兆個と推算する。そして、一日に５００億から７００億個の細胞は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）という細胞死機序を通じて死ぬと知られており、その分の細胞が新たに生成されるといえる。意図した細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ、ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、多細胞生物の個体発生と組職の恒常性を維持するために必須であると同時に、病原体の感染に対する先天性免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の防御戦略でもある。この細胞死機序は、大きく二つに区分することができるが、一つは紫外線やガンマ線、化学物質、ウイルス感染、栄養欠乏、酸素欠乏、ガン誘発遺伝子の発現などのストレスにより発生するｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｏｐｔｏｓｉｓとＴＮＦ－α、ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬなどのサイトカインが誘導するｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｏｐｔｏｓｉｓに区分することができる。二つの機序とも究極的にはｃａｓｐａｓｅという細胞内タンパク質分解酵素の活性化を通じて細胞死を誘導するようになる。

【0003】

一方、細胞死機序は、ガン及び退行性疾患、脳疾患、免疫疾患などの人間の殆ど全ての疾患に関与しており、結果としてこれらの疾病の主要ターゲットとして研究されている。しかし、細胞死の場合、殆ど全ての細胞で共通して起こる現象であるため、ｐ５３、ＴＮＦ－αなどの一般的な細胞死因子をターゲットとする場合、予期せぬ副作用が発生するなど、これらをターゲットとするには限界点となって来た。細胞死はその機能が喪失されれば、ガン細胞の場合、ＤＮＡ損傷、シグナル伝逹系の不均衡、ａｎｏｘｉａ、ｌｏｓｓ ｏｆ ａｎｃｈｏｒａｇｅなどの刺激下でも生存できるようになる。ガン細胞は生存と繁栄のために細胞死機序を無力化することができる多様な方法を考案した。腫瘍細胞がさらに悪性形質を有するように進化する過程は、細胞死過程を回避して生存するように広範囲な遺伝子変化が生じることである。もし細胞死に抵抗性を持つと、ガン発生だけでなく坑がん治療にも耐性を表す。

【0004】

蜂毒は、密蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒａｎａ Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）のしっぽ部の毒嚢から排出される毒汁として、副腎皮質ホルモン類似作用、中枢神経系統に作用、循環系統に影響、消化系統に作用、陣痛作用、神経痛に作用、抗菌作用などがあると知られている。メリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）と蜂毒由来のホスホリパーゼＡ２（以下、ｂｖＰＬＡ２）が蜂毒の主要構成成分として知られているが、メリチンは２６個のアミノ酸で構成された細胞分解性タンパク質であり、ｂｖＰＬＡ２は細胞膜の燐脂質を加水分解する酵素である。

【0005】

現在まで知られた密蜂の蜂毒成分は４０余類で、多様な生理活性を示すメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、アパミン（ａｐａｍｉｎ）、ＭＣＤ－ペプチド（ＭＣＤ－ｐｅｐｔｉｄｅ）のような活性ペプチド、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２）のような酵素とドパミン、ヒスタミン等のようなアミン類がある。

【0006】

蜂毒は、昆虫の自己防御物質として、人体や動物に一時的または永久的に害を与えるために持っている化学的物質である。多様な成分で構成された蜂毒は、縫針療法で古くから民間療法の一つとして関節炎、通風などの疾患に使用されている。また、蜂毒は強い抗菌効果だけでなく、坑がん、坑痴呆、肌再生効果などが報告されている。特に、蜂毒由来ＰＬＡ２は、調節Ｔ細胞を活性化させて免疫恒常性の調節、自己免疫疾患の抑制、アレルギーの抑制などの多様な免疫関連疾患でその効能が報告された。

【0007】

蜂毒治療法は、治療用蜂を直接患部に刺されるようにするか、精製された蜂毒抽出物を経穴点などに注射する方法であり、蜂毒治療法が抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、抵細胞死（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、抗線維症（ａｎｔｉ－ｆｉｂｒｏｓｉｓ）効果があるという研究結果も多数発表され、臨床では局所的炎症やリウマチ、パーキンソン病などの多様な疾患に使われて来た。

【0008】

蜂毒由来のＰＬＡ２（ｂｖＰＬＡ２）は、細胞膜燐脂質のｓｎ－２エステル結合を加水分解して、アラキドン酸とリソリン脂質が遊離するように触媒する酵素である。多くの研究において、ｂｖＰＬＡ２がアレルギー性喘息、アルツハイマー疾患、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）による臓器炎症だけでなく、多様な疾患に保護効果があると報告されている。また最近の研究では、ＰＧＥ２の分泌を調節して免疫抑制作用を媒介するｂｖＰＬＡ２の新しい効能が明かされた。ｂｖＰＬＡ２がｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（ＤＣ）表面のＣＤ２０６受容器（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に直接結合してＰＧＥ２の発現を誘導し、ＰＧＥ２は未接触Ｔ細胞（ｎａｉｖｅＴ ｃｅｌｌｓ）のＥＰ２受容器（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合してＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ）への分化を誘導する。

【0009】

一方、Ｔ細胞は、まだ抗原に会わなかった未接触Ｔ細胞と、抗原に会って成熟した効果Ｔ細胞（補助Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、自然殺傷Ｔ細胞）、そして記憶Ｔ細胞に分類される。未接触Ｔ細胞（Ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）は、分化と成熟を経たが、未だ末梢で抗原に会わなかったＴ細胞である。抗原伝達細胞に提示された未だ認知されていないＭＨＣ：抗原複合体に会えばＴ細胞抗原受容体シグナル伝達過程（Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）を通じて抗原を認識し、効果Ｔ細胞として活性化されて適応免疫が始まる。表面には細胞接着分子（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）が存在する一方、効果Ｔ細胞の特徴であるＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６９と記憶Ｔ細胞の特徴であるＣＤ４５などは殆ど存在しない。ヘルパーＴ細胞（Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ、またはＴｈ ｃｅｌｌ）は、効果Ｔ細胞の中で他の白血球の分化及び活性化を調節することで体液性免疫を促進する細胞をいう。細胞表面にＣＤ４タンパク質を持っているという特徴のため、ＣＤ４Ｔ細胞ともいう。補助Ｔ細胞は、細部機能によって再びＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇなどに分類される。Ｔｈ１細胞は、インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）と腫瘍怪死因子ベータ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ、ＴＮＦ－β）を分泌することで、大食細胞の内部でエンドソームとリソソームが融合してエンドリソソームを形成するように誘導する。

【0010】

一方、Ｔｈ２細胞は、様々な種類のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）を分泌してＢ細胞が形質細胞に分化するようにする。Ｔｈ１７細胞は、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）を分泌して好中性白血球を集まらせる。調節Ｔ細胞ともいうＴｒｅｇ細胞は、免疫反応を促進するのではなくむしろ抑制することで免疫の恒常性を維持し、自己免疫反応などを遮断する。調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ）は、免疫反応が最大に発生した後に再び普段状態に回復するｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓと自己由来組織には免疫反応をしない自己寛容（ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を核心機能とする特殊なＴ細胞である。生体外で増殖されたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓが体内に移植された時、多様な病理的変化を予防し、特に移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＧｖＨＤ）は、調節Ｔ細胞の臨床適用に非常に適合な疾患として知られている。細胞毒性Ｔ細胞は、グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）やパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）のような細胞毒性物質を分泌してウイルスに感染された細胞や腫瘍細胞などを殺す細胞である。細胞表面にＣＤ８タンパク質を持っているため、ＣＤ８ Ｔ細胞ともいう。補助Ｔ細胞とは反対に細胞性免疫を媒介してウイルス及びガン細胞を除去する。自然殺傷Ｔ細胞は、補助Ｔ細胞及び細胞毒性Ｔ細胞に比べて少ない割合で分布する効果Ｔ細胞の一つであり、表面にＴ細胞のようなＴ細胞抗原受容体（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）を持っているが、ＮＫ１．１のような自然殺細胞の特異的分子も持っている。自然殺傷Ｔ細胞は、ガンマインターフェロン、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）などを分泌して免疫反応を調節する役割をする。記憶Ｔ細胞は、抗原を認知したＴ細胞が分化及び選別過程を経た後、長期間生存して、後で抗原が再び侵入した時に速く活性化して効果Ｔ細胞の機能ができる潜在的能力を持った細胞をいう。未接触Ｔ細胞が抗原に会って活性化された状態の細胞、または効果Ｔ細胞がインターロイキン－７（ＩＬ－７）とインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の影響を受けて長期生存可能な記憶Ｔ細胞に分化する。

【0011】

免疫システムで抗原に対する免疫反応で増殖されたリンパ球は、免疫反応が終結した後は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を通じて恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を回復する。活性化されたリンパ球では、死滅受容体（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が高く表れるので、リンパ球は細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に非常に敏感に作用する。調節Ｔ細胞も細胞死シグナル（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ）に敏感に反応し、細胞死シグナルの変化は調節Ｔ細胞の生存可否と高い関連性がある。

【0012】

本研究では、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を処理した免疫細胞で、細胞死シグナル（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の変化を調べるために蜂毒由来のＰＬＡ２（ｂｖＰＬＡ２）を処理した後、ｃａｓｐａｓｅ－３とＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの両方に陽性である初期死滅細胞（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）を流動細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。また、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の初期過程を開始させるｃａｓｐａｓｅ－３の活性化程度をウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）で分析した。さらに、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制するＣＴＬＡ－４とＰＤ－１の発現程度を流動細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した結果、有意性のある結果を導出した。

【0013】

即ち、本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）によるＴ細胞の調節メカニズムとして、ガン、退行性疾患、脳疾患及び免疫関連疾患などの人間の殆ど全ての疾患に関与するＴ細胞の細胞死抑制効果に関する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本研究では、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）がＴ細胞の細胞死を調節するのかを確認し、特に、ＰＬＡ２がＴ細胞を増加させることが細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と関連があるかを調べた。また、細胞死初期段階（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）にＰＬＡ２が及ぼす影響を確認するために、流動細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行い、マウス膵膓細胞にＰＢＳとＰＬＡ２の処理後にａｎｔｉ－ＣＤ３／ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体のように７２時間培養した。その後、Ｔリンパ球の中で細胞死した細胞の数及び初期状態の細胞死した細胞数を測定した。細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の初期過程を開始させるｃａｓｐａｓｅ－３の活性化に対する影響を確認するために、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行い、さらに、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制するＣＴＬＡ－４とＰＤ－１の発現程度を流動細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）した。

【0015】

その結果、本発明のＰＬＡ２を処理した実験群で細胞死初期段階のＴ細胞が顕著に減少し、ＰＬＡ２を処理した実験群でｃａｓｐａｓｅ－３の活性化が劇的に減少し、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制するタンパク質であるＣＴＬＡ－４とＰＤ－１が相当増加した。また、細胞死のマーカーであるＦｏｘｐ３、Ｈｅｌｉｏｓの発現が増加することから、結果としてＰＬＡ２が細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制してＴ細胞を増加させることで、ガン、退行性疾患、脳疾患及び免疫関連疾患に保護効果があることを確認した。

【課題を解決するための手段】

【0016】

上記の課題を解決するために、本発明は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上において、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理して、Ｔ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を調節する方法を提供する。

【0017】

また、本発明は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上において、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理して、Ｔ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する方法を提供する。

【0018】

本発明の一実施例において、前記Ｔ細胞はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節Ｔ細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0019】

本発明の一実施例において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－作用Ｔ細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0020】

本発明の一実施例において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋細胞毒性Ｔ細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0021】

本発明の一実施例において、前記細胞死は、細胞死初期段階であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0022】

本発明の一実施例において、前記方法は、ｃａｓｐａｓｅ－３またはｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃの活性化を減少させることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0023】

本発明の一実施例において、前記方法は、細胞死マーカーであるＦｏｘｐ３、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びＨｅｌｉｏｓのいずれか一つ以上の発現を増加させることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0024】

また、本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を含む、Ｔ細胞の細胞死抑制用培地組成物を提供する。

【0025】

また、本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を個体に処理して、Ｔ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する方法を提供する。

【0026】

最後に、本発明は、上記の方法によってホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が細胞死を抑制してＴ細胞を増加させることで、免疫恒常性の調節、自己免疫疾患の抑制、アレルギーの抑制などの多様な免疫関連疾患及びガン、退行性疾患、脳疾患の予防または治療に効果があることが期待される。

【発明の効果】

【0027】

本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）によるＴ細胞の調節メカニズムとして免疫反応に重要な役割をするＴリンパ球の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の抑制効果に関するもので、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上において、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理してＴ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制することでＴ細胞を増加させる効果があるため、多様な免疫疾患またはガン、退行性疾患、脳疾患の治療及び予防に効果的であり、その関連産業に有用に使用されることができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が作用Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）及び調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の細胞死数を示す図面である。

【図2】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増加に及ぼす影響を示す図面である。

【図3】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の表現型に及ぼす影響を示す図面である。

【図4】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に及ぼす影響を示す図面である。

【図5】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理した後、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体と培養して細胞死した細胞数を示す図面である。

【図6】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）によるＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞死抑制機序がＩＬ－２依存的な現象であるかを確認した結果を示す図面である。

【図7】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が細胞死初期段階（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に及ぼす影響を示す図面である。

【図8】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理した後、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体と培養してＴ細胞の中で初期段階の細胞死した細胞の数を示す図面である。

【図9】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）がｃａｓｐａｓｅ－３の活性化に及ぼす影響を示す図面である。

【図10】細胞死によって増加するｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３がホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）処理で減少することをウエスタンブロットを通じて確認した図面である。

【図11】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）がＰＤ－１タンパク質の発現に及ぼす影響を示す図面である。

【図12】ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）がＣＴＬＡ－４タンパク質の発現に及ぼす影響を示す図面である。

【図13】調節Ｔ細胞関連の細胞死のマーカーであるＦｏｘｐ３、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ｈｅｌｉｏｓの発現程度を確認した図面である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上において、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理して、Ｔ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を調節する方法を提供することを目的とする。

【0030】

また、本発明は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ上において、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を処理して、Ｔ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する方法を提供する。

【0031】

本発明の一実施例において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節Ｔ細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0032】

本発明の一実施例において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－作用Ｔ細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0033】

本発明の一実施例において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋細胞毒性Ｔ細胞であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0034】

本発明の一実施例において、前記細胞死は、細胞死初期段階であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0035】

本発明の一実施例において、前記方法は、ｃａｓｐａｓｅ－３またはｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃの活性化を減少させることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0036】

本発明の一実施例において、前記方法は、細胞死マーカーであるＦｏｘｐ３、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びＨｅｌｉｏｓのいずれか一つ以上の発現を増加させることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。

【0037】

また、本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を含む、Ｔ細胞の細胞死抑制用培地組成物を提供する。

【0038】

また、本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）を個体に処理して、Ｔ細胞の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する方法を提供する。

【0039】

従って、本発明は、上記の方法によってホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ＰＬＡ２）が細胞死を抑制してＴ細胞を増加させることで、免疫恒常性の調節、自己免疫疾患の抑制、アレルギーの抑制などの多様な免疫関連疾患及び、ガン、退行性疾患、脳疾患の予防または治療に効果があることが期待される。

【0040】

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態で本発明を詳しく説明する。但し、下記の実施形態は、本発明に対する例示として提示されるもので、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にし得ると判断される場合は、その詳細な説明を省略することができ、これによって本発明が制限されるものではない。本発明は、後述する特許請求の範囲の記載及びこれから解釈される均等範疇内で多様な変形及び応用が可能である。

【0041】

また、本明細書で使用される用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好ましい実施例を適切に表現するために使用された用語であり、これは、使用者、運用者の意図または本発明が属する分野の慣例などによって変わることができる。従って、本用語に対する定義は、本明細書全般にわたった内容に基づいて出されるべきである。明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とすると、これは特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。

【0042】

本明細書全体にわたって、特定物質の濃度を表すために使用される「％」は、別途の言及がない場合、固体／固体は（ｗ／ｗ）％、固体／液体は（ｗ／ｖ）％、そして液体／液体は（ｖ／ｖ）％である。

【0043】

以下で、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。但し、上記実施例及び実験例は、本発明に対する例示として提示されるもので、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にし得ると判断される場合は、その詳細な説明を省略することができ、これにより本発明が制限されるものではない。本発明は、後述する特許請求の範囲の記載及びこれから解釈される均等範疇内で多様な変形及び応用が可能である。

【実施例】

【0044】

実施例１．実験の準備及び実験方法
１．１．実験用マウスの準備及び細胞培養
生後６～７週の雄Ｆｏｘｐ３^ＥＧＦＰＣ５７ＢＬ／７マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購買した。全ての実験用マウスに空調され、病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）のない環境で１２時間ずつ昼／夜を交互に維持させた。また、実験期間中は、飼料と水を自由に摂取させた。全ての過程は＜Ｒｕｌｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ＞、＜Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｉｍａｌｓ＞を遵守して行われた。

【0045】

実験用マウスを吸入麻酔剤（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔させた後、脾臓を摘出して４０μｍ細胞濾過器（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に通過させた。赤血球が溶解された後に脾臓細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い出し、ＲＰＭＩ－１６４０（ＷｅｌＧＥＮＥ ＩＮＣ．，大邱，韓国）で再浮遊させた。培養液には、１０％のＦＢＳ、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）が添加された。脾臓細胞には、ｐｌａｔｅ－ｂｏｕｎｄ ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）とｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）の単一クローン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に０．４μｇ／ｍｌのＰＬＡ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を処理した。１００ｎＭのラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）のみを単独で処理した細胞群が実験対照群として備えられた。脾臓細胞を３７℃で７２時間培養させた。

【0046】

１．２．流動細胞分析（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）方法
培養された細胞をチューブに分液した後、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗い出し、蛍光標識された抗体と共に４℃で３０分間培養させた。ａｎｔｉ－ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ａｎｔｉ－ＣＤ１２７－ＰＥ、ａｎｔｉ－ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４－ＰＥ、及びａｎｔｉ－ＰＤ－１－ＰＥ抗体が流動細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）に使用された。細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）有無を確認するために、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＡＰＣ、ＰＩ、ａｎｔｉ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３／７－ＦＩＴＣ 抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標識者として使用した。機器はＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、統計分析はＦＬＯＷＪＯ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を利用して施された。

【0047】

１．３．ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）方法
細胞をＰｒｏ－ＰＲＥＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ソウル，韓国）で溶解させ、４℃で３０分間維持した。タンパク質濃度は小血清アルブミン（ＢＳＡ）を基準値として、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方式を利用して測定した。抽出されたタンパク質の中で同一の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で分離して、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に移動させた。その後、メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）全体に３％の無脂肪牛乳を塗布し、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０が含有されたＰＢＳで室温で１時間維持した。

【0048】

また、ｃａｓｐａｓｅ－３抗血清（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）とβ－ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）をそれぞれ１：１０００で希釈して室温で２時間培養した。メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を一度洗浄した後、１：５０００で希釈された２次抗体（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ付着）と１時間培養した。また、実験対照群として同一のメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）をβ－ａｃｔｉｎ特異抗体を利用して再測定した。化学発光試薬（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使って特定バンドが表れるようにした。

【0049】

１．４．調節Ｔ細胞の準備
脾臓細胞の中でＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，ＵＳＡ）を利用してｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）方法で分離された。ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ混合液とａｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓを利用してＣＤ４^＋Ｔ細胞を先ず選別した後、ＰＥ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２５ ａｎｔｉｂｏｄｙとａｎｔｉ－ＰＥ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓを利用してＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を選別した。流動細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した結果、Ｔｒｅｇ細胞の純度は７８％以上と確認された。

【0050】

１．５．統計処理方法
二つまたは二つ以上の実験群から出た非正規分布データにはｏｎｅ－ｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）分析とＴｕｋｅｙ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔを利用するか、Ｐｒｉｓｍ ５．０１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで有意性検証をした。Ｐ＜０．０５の場合，統計的に有意であるみて、実験結果は平均±平均の標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｍｅａｎ，ＳＥＭ）で表した。

【0051】

実施例２．ホスホリパーゼＡ２が調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に及ぼす影響の確認
２．１．ホスホリパーゼＡ２を処理していない状態におけるＴ細胞の細胞死
実験に使用されたホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２）は、蜂毒由来のホスホリパーゼＡ２（ｂｖＰＬＡ２）を使って以下の実験を進行した。

【0052】

実験に先立ち、ｂｖＰＬＡ２を処理していない状態におけるＴ細胞の細胞死の数を染色を通じて測定してみた。図１に示すように、（Ａ）作用Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－）と（Ｂ）調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）の染色を通じて７－ＡＡＤとＡｎｎｅｘｉｎ Ｖのいずれも陽性である細胞死数が調節Ｔ細胞で２倍以上存在することを確認し、（Ｃ）作用Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－）と（Ｄ）調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）の染色を通じてｃａｓｐａｓｅ－３とＡｎｎｅｘｉｎ Ｖのいずれも陽性である初期細胞死数が調節Ｔ細胞で顕著に増加することを確認した。

【0053】

２．２．ホスホリパーゼＡ２がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇの増加に及ぼす影響
ｂｖＰＬＡ２が調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導する効果を確認するために、脾臓細胞にＰＢＳ、ｂｖＰＬＡ２、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）をそれぞれ処理した後、７２時間後にａｎｔｉ－ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７とａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｃｙ７と標識した後、流動細胞分析法（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を識別するために、先ず全体リンパ球細胞の中でＣＤ４^＋細胞をプログラムで選択し、その中でＣＤ２５^＋細胞とＦｏｘｐ３^＋細胞を選別して結果を導出した。

【0054】

また、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）が実験室環境でｍｕｒｉｎｅ（ネズミ科の動物）と人間のＦｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ増殖を促進するという研究結果に基づいて、実験群の正常な発現を確認するためにラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を処理した実験対照群を準備した。

【0055】

その結果、図２のように、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓは、ＰＢＳ処理群（Ａ）で２．９９％、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）処理群（Ｂ）で６．０３％、ｂｖＰＬＡ２を処理群（Ｃ）で５．７９％、ｂｖＰＬＡ２とラパマイシンを処理した実験群でＰＢＳ処理群より有意に高いことが表れ（ｐ＜０．０５）、ｂｖＰＬＡ２処理群とラパマイシン処理群の間には大きな差異点がなかった。

【0056】

実施例３．ホスホリパーゼＡ２がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇの表現型に及ぼす影響の確認
ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌは、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ）とＣＤ１２７の発現程度によってｒｅｓｔｉｎｇ Ｔｒｅｇ（ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ１２７^ｌｏｗ）、ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒＴｒｅｇ（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ１２７^ｌｏｗ）、ｍｅｍｏｒｙ Ｔｒｅｇ（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ１２７^ｈｉ）に区分することができる。

【0057】

脾臓細胞をＴｒｅｇ ｃｅｌｌ表現型マーカー（ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７）で染色した後、流動細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。

【0058】

実験の結果、図３（Ａ）に示すように、ｒｅｓｔｉｎｇ Ｔｒｅｇの割合は、ｂｖＰＬＡ２（ｐ＜０．０１）とラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（ｐ＜０．００１）処理群でＰＢＳ処理群に比べて有意に増加し、一方、図３（Ｂ）及び図３（Ｃ）を参照すると、ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔｒｅｇ（ｐ＜０．０５）とｍｅｍｏｒｙ Ｔｒｅｇ（ｐ＜０．０１）の割合は、ｂｖＰＬＡ２処理群でＰＢＳ処理群に比べて有意に減少した。

【0059】

実施例４．ホスホリパーゼＡ２が細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に及ぼす影響の確認
ｂｖＰＬＡ２がＴ細胞の細胞死に如何なる影響を及ぼすかを確認するために、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＡＰＣとｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）染色を利用した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、死滅細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）の細胞膜ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ｓｅｒｉｎ（ＰＳ）と結合し、ＰＩ染色はｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌとｎｅｃｒｏｔｉｃ ｃｅｌｌで細胞核と結合するため、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶとＰＩを同時に利用して初期段階（ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ）と末期段階（ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ）の死滅細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）を判別することができる。

【0060】

（１）実験の結果、図４に示すように、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶとＰＩの両方に陽性を表したＴｒｅｇ ｃｅｌｌの割合は、ＰＢＳ処理群（Ａ）で６．５５％、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）処理群（Ｂ）で６．５９％、ｂｖＰＬＡ２処理群（Ｃ）で３．６６％と表れた。Ａｎｎｅｘｉｎ ＶとＰＩの両方に陽性を表したＴｒｅｇ ｃｅｌｌの数字はＰＢＳ処理群とラパマイシン処理群よりｂｖＰＬＡ２処理群で非常に有意に少なかった（ｐ＜０．０１）。即ち、ｂｖＰＬＡ２を処理した群でａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌの絶対的な数字と割合のいずれもが減少することを確認した。

【0061】

（２）また、図５に示すように、マウス膵膓細胞をＰＢＳとｂｖＰＬＡ２処理した後、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体のように７２時間培養した後、ＣＤ４^＋Ｔリンパ球中で細胞死した細胞の数を測定した結果、ＰＩとＡｎｎｅｘｉｎ Ｖのいずれも陽性である細胞死がｂｖＰＬＡ２を処理した細胞では１．５倍ほど減少することを確認した。

【0062】

（３）ｂｖＰＬＡ２によるＣＤ４^＋Ｔ細胞の細胞死抑制機序がＩＬ－２依存的な現象であるかを確認した結果、図６に示すように、ＩＬ－２の添加に非依存的にｂｖＰＬＡ２処理群で細胞死の減少が表れることを確認することができた。

【0063】

実施例５．ホスホリパーゼＡ２が細胞死初期段階（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に及ぼす影響の確認
カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）の活性化は、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の初期段階に必須な過程である。細胞死の初期過程にｂｖＰＬＡ２が関与するかを確認するために、ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｃａｐａｓｅ－３ ｓｕｂｓｔｒａｔｅとＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＡＰＣ、７－ＡＡＤ（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｇ ｄｙｅ）で蛍光標識して流動細胞分析法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。７－ＡＡＤに陰性である細胞を選別した後、ｃａｓｐａｓｅ－３とＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの両方に陽性である初期死滅細胞（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）を測定した。

【0064】

（１）測定の結果、図７に示すように、ＰＢＳ処理群（Ａ）では１０．９％、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）処理群（Ｂ）では５．８８％、ｂｖＰＬＡ２処理群（Ｃ）では０．１５％と観察された。ｂｖＰＬＡ２処理群で初期死滅細胞（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）がＰＢＳ処理群に比べて統計的に非常に有意に減少した（ｐ＜０．０１）。ラパマイシン処理群でも初期死滅細胞（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）の減少が確認されるが、統計的に優位な程度ではなかった。

【0065】

（２）図８に示すように、マウス膵膓細胞をＰＢＳとｂｖＰＬＡ２処理した後、ａｎｔｉ－ＣＤ３／ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体のように７２時間培養した後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の中で初期状態の細胞死した細胞の数を測定した結果、ａｃｔｉｖｅ ｃａｓｐａｓｅ－３とＡｎｎｅｘｉｎ Ｖのいずれも陽性である初期細胞死がｂｖＰＬＡ２を処理した細胞では顕著に減少した。

【0066】

実施例６．ホスホリパーゼＡ２がｃａｓｐａｓｅ－３の活性化に及ぼす影響の確認
（１）細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の過程の中でｃａｓｐａｓｅ－３の活性化は核心的なメカニズムである。ｃａｓｐａｓｅ－３は、３２ｋＤａのタンパク質加水分解性の全酵素として、１２ｋＤａと１７ｋＤａのサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）に分割されながら活性化される。実施例４と実施例５で ｂｖＰＬＡ２が死滅細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）を減少させることを確認した後、ｂｖＰＬＡ２がｃａｓｐａｓｅ－３の活性化にも影響を及ぼすかを確認するために、脾臓細胞にｂｖＰＬＡ２を処理して３７℃の室温で０、１、３、６、２４、７２時間、それぞれ培養してウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）方式でタンパク質バンドを測定した。

【0067】

その結果、図９（Ａ）に示すように、ｂｖＰＬＡ２処理群でｃａｓｐａｓｅ－３の分割が非常に顕著に減少したことを確認した。ＰＢＳ処理群では、ｃａｓｐａｓｅ－３の分割が１時間（１ｈ）以後に明確に観察されるが、ｂｖＰＬＡ２処理群では、２４時間（２４ｈ）以後の結果からｃａｓｐａｓｅ－３の分割が観察された。また、図９（Ｂ）は、マウス膵膓細胞のウエスタンブロットの結果でＰＢＳ処理した正常群の場合、培養７２時間目にＰｒｏｃａｓｐａｓｅ－３がｂｖＰＬＡ２を処理した群よりさらに活性化されることを確認することができた。

【0068】

（２）また、細胞死によって増加するｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３が蜂毒由来のＰＬＡ２処理で減少することをウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じて確認した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ－ｂｅａｄで分離した作用Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－）と調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ；ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）をａｎｔｉ－ＣＤ３／ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体のように７２時間培養した後、細胞死が増加することを細胞死マーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３とｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃを通じて観察した。その結果、図１０に示すように、蜂毒由来のＰＬＡ２を処理した時にｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３とｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃの発現が減少することを確認することができた。

【0069】

実施例７．ホスホリパーゼＡ２が細胞死マーカーの発現に及ぼす影響の確認
Ｔ細胞のＣＴＬＡ－４とＰＤ－１タンパク質は、Ｔ細胞の活性を抑制する抑制受容器（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。ｂｖＰＬＡ２がこれらの抑制性タンパク質の発現に及ぼす影響を確認するために、ａｎｔｉ－ＣＤ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉ－ＣＤ２５ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ染色を利用して流動細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）をした。

【0070】

実験の結果、図１１及び図１２に示すように、ＰＢＳ処理群のＰＤ－１が９．０７％、ＣＴＬＡ－４が１．５９％であり、ｂｖＰＬＡ２処理群のＰＤ－１が２０．４％、ＣＴＬＡ－４が３．８１％と確認された。即ち、ｂｖＰＬＡ２処理群でＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌにおけるＰＤ－１（ｐ＜０．０５）とＣＴＬＡ－４（ｐ＜０．０５）発現が有意に増加した。図１３は、調節Ｔ細胞関連の細胞死のマーカーであるＦｏｘｐ３、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、Ｈｅｌｉｏｓの発現程度を確認した結果であり、調節Ｔ細胞関連の細胞死マーカーのいずれもがｂｖＰＬＡ２を処理した時に正常より増加する傾向を表すことを確認した。

【0071】

従って、本発明を通じて蜂毒（ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ）由来の有効物質ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）によるＴ細胞の調節メカニズムとして免疫反応に重要な役割をするＴリンパ球の細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制することで、Ｔ細胞を増加させる方法を確認した。

【0072】

これまで本発明についてその好ましい実施例を中心として説明した。

【0073】

本発明が属する技術分野で通常の知識を持った者は本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で変形された形態に具現可能なことが理解できるであろう。従って、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されるべきである。本発明の範囲は前述した説明ではなく、特許請求の範囲に表れており、それと同等な範囲内にある全ての差異点は、本発明に含まれると解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】