特許 7329552 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-09

(45)【発行日】2023-08-18

(54)【発明の名称】個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20230810BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20230810BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230810BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230810BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20230810BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/04

C12N15/10 100Z

C12N15/10 110Z

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2021020743

(22)【出願日】2021-02-12

(62)【分割の表示】P 2016575111の分割

【原出願日】2015-06-26

(65)【公開番号】P2021072863

(43)【公開日】2021-05-13

【審査請求日】2021-02-12

(31)【優先権主張番号】62/017,558

(32)【優先日】2014-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/061,567

(32)【優先日】2014-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516300726

【氏名又は名称】１０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ベンジャミン ジェイ． ハインドソン

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー マーティン ハインドソン

(72)【発明者】

【氏名】マイケル シュナール－レビン

(72)【発明者】

【氏名】ケビン ディーン ネス

(72)【発明者】

【氏名】ミルナ ヤロシュ

(72)【発明者】

【氏名】サージ サクソノフ

(72)【発明者】

【氏名】ポール ハーデンボル

(72)【発明者】

【氏名】ラジブ バラドワジ

(72)【発明者】

【氏名】シンイン ゼン

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ ベルグレーダー

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】BioTechniques，2001年，Vol.30, No.4, pp.892-897

【文献】Cell，2015年05月21日，Vol.161, pp.1202-1214

【文献】Cell，2015年05月21日，Vol.161, pp.1187-1201

【文献】Cell Reports，2012年，Vol.2, pp.666-673

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸配列決定法であって、
（ａ）複数の液滴中に複数のビーズと複数のプライマーを共区分化することであって、該複数の液滴のうちの１つの液滴が、（ｉ）ポリＡ３’末端核酸配列を含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子、（ｉｉ）該複数のプライマーからの１つのプライマー、および、（ｉｉｉ）該複数のビーズからの１つのビーズを含み、該ビーズは、該ビーズに結合された核酸バーコード分子を含み、該核酸バーコード分子はバーコード配列を含む、ことと；
（ｂ）該ｍＲＮＡ分子の３’末端の領域に該プライマーをハイブリダイズさせることと；
（ｃ）（ｉ）該プライマーを伸長して、該ｍＲＮＡ分子の該核酸配列に対応する複合配列を含む核酸生成物を生成し、（ｉｉ）該核酸生成物の３’末端に該核酸バーコード分子に対して相補的な末端配列を組込む、逆転写酵素を使用することと；
（ｄ）該核酸バーコード分子を（ｃ）において生成された該核酸生成物の該末端配列にハイブリダイズさせ、該核酸バーコード分子をテンプレートとして用いて該核酸生成物を伸長して、５’末端から３’末端に、（１）該ｍＲＮＡ分子の該核酸配列に対応する該複合配列および（２）該バーコード配列の相補体を含むバーコード化核酸分子を生成することと；
（ｅ）該バーコード化核酸分子またはその相補体を配列決定すること
とを含み、
（ａ）の後に、該核酸バーコード分子が該ビーズから放出される、方法。

【請求項2】

前記液滴がｍＲＮＡの由来する細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記液滴が１つの細胞のみを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

（ｂ）の前に前記細胞から前記ｍＲＮＡ分子を放出させることをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記ビーズがさらに、該ビーズに結合された複数の核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記複数の核酸分子の各々が前記バーコード配列を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記複数の核酸分子の各々が、前記複数の核酸分子にわたって変化する追加のバーコード配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記追加のバーコード配列が、前記複数の核酸分子の各核酸分子について異なる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

（ｅ）の前に、前記バーコード化核酸分子またはその相補体を、核酸増幅に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記核酸増幅が、前記バーコード化核酸分子またはその相補体を前記液滴から放出させることに続いて行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

（ｂ）～（ｄ）が前記液滴内で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記バーコード化核酸分子またはその相補体を前記液滴から放出させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記バーコード化核酸分子がさらに、５’末端に向かって、該バーコード化核酸分子またはその相補体が、シーケンサーのフローセルに結合することを可能にするための機能的配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ｍＲＮＡ分子の前記核酸配列に対応する前記複合配列が、前記核酸配列の相補体である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

（ｅ）の前に、前記バーコード化核酸分子またはその相補体と、一対のプライマーとを用いて、標的核酸配列を有するバーコード化核酸分子を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記標的核酸配列を有する前記バーコード化核酸分子またはその相補体が（ｅ）において配列決定される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記バーコード化核酸分子が生成される前に、前記核酸バーコード分子が前記ビーズから放出される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記バーコード化核酸分子が生成される間に、前記核酸バーコード分子が前記ビーズから放出される、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記バーコード化核酸分子が生成された後に、前記核酸バーコード分子が前記ビーズから放出される、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記ビーズがゲルビーズである、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記ビーズが、刺激を適用した際に分解可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記刺激が、還元剤である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記液滴が前記刺激を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記ビーズから前記核酸バーコード分子を放出することが、前記ビーズを分解させることを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

前記ビーズがジスルフィド結合を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記核酸バーコード分子が、ジスルフィド結合を介して前記ビーズに結合している、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月２６日出願の米国仮特許出願番号第６２／０１７，５５８号
及び２０１４年１０月８日出願の米国仮特許出願番号第６２／０６１，５６７号の優先権
を主張し、それらの出願のそれぞれは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細
書に組込まれる。

【背景技術】

【0002】

生物学及び生化学の材料及びシステムの分析及び特徴付けの顕著な進歩は、生命、健康
、疾患及び治療のメカニズムの理解における前例のない進歩をもたらしている。これらの
進歩の中で、生物系のゲノム構成を標的として特徴付ける技術は、遺伝子増幅技術の使用
及び実施、ならびに核酸配列決定技術の進歩を含む、最も画期的な結果をいくつかもたら
した。

【0003】

核酸配列決定法は、診断、予後診断、バイオテクノロジー、及び法医学的生物学を含む
幅広い生物医学的状況における情報を得るために使用することができる。配列決定として
は、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング及び連鎖停止法を含む基本的な方法、ま
たはショットガンシーケンシング及びブリッジＰＣＲを含むデノボシーケンシング法、ま
たはポロニーシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケン
シング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、Ｈ
ｅｌｉＳｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、ＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシングを含む
次世代法等が挙げられる。

【0004】

このような生物学的特徴付けの進歩にもかかわらず、多くの課題は未対処のままであり
、現在提供されている解決策による対処は相対的に不十分である。本開示は、既存の技術
の多くの欠点に対処するための新規な解決策及びアプローチを提供する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書では、個々の細胞または細胞小集団を分析するための方法、組成物、及びシス
テムが提供され、これには、それらの個々の細胞または細胞集団から核酸を分析すること
と、核酸をそれらの個々の細胞または細胞集団に帰属させることと、が含まれる。

【0006】

本開示の一態様は、細胞から核酸を分析する方法であって、離散区分に個々の細胞に由
来する核酸を提供することと、離散区分内の核酸に由来する１つまたは複数の第１の核酸
配列であって、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを結合させている１
つまたは複数の第１の核酸配列を生成することと、１つもしくは複数の第１の核酸配列ま
たは１つもしくは複数の第１の核酸配列に由来する１つもしくは複数の第２の核酸配列で
あって、共通のバーコード配列を含む１つもしくは複数の第２の核酸配列の特徴付けを行
うことと、その１つまたは複数の第２の核酸配列は；及び行われた特徴付けにおける共通
の核酸バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、個々の細胞に由来する１つ
もしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を識別すること
と、を含む、方法を提供する。

【0007】

いくつかの実施形態では、離散区分は離散液滴である。いくつかの実施形態では、オリ
ゴヌクレオチドは、個々の細胞に由来する核酸と共に離散区分に区分される。いくつかの
実施形態では、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも
５００，０００のオリゴヌクレオチドが、個々の細胞に由来する核酸と共に離散区分に区
分される

【0008】

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドをビーズに付着させて提供し、ビーズ上
の各オリゴヌクレオチドは同じバーコード配列を含み、ビーズは離散区分に個々の細胞と
共区分される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはビーズに放出可能に付着
している。いくつかの実施形態では、ビーズは分解性ビーズを含む。いくつかの実施形態
では、本方法は、１つまたは複数の第１の核酸配列の生成の前または最中に、ビーズの分
解をすることによってビーズからオリゴヌクレオチドを放出することを含む。いくつかの
実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は離散区分から１つまたは複数の第１の核酸
配列を放出することを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、特徴付けを行うことには、１つもしくは複数の第１の核酸配
列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を配列決定することを含む。本方法はまた、
１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列の配列から
個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の連続核酸配列をアセンブルすることも含み得る。
さらに、本方法は、個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の核酸配列に基づいて個々の細
胞を特徴付けることも含み得る。

【0010】

いくつかの実施形態では、核酸は離散区分内の個々の細胞から放出される。いくつかの
実施形態では、核酸は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのリボ核酸（Ｒ
ＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成させる
ことは、1つまたは複数の第1の核酸配列をもたらす条件下で核酸を逆転写させることを含
む。いくつかの実施形態では、逆転写は離散区分で生じる。いくつかの実施形態では、オ
リゴヌクレオチドは、離散区分に提供され、ポリＴ配列を含む。いくつかの実施形態では
、逆転写は、ポリＴ配列を核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせること
と、ポリＴ配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む。いくつかの実施
形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリＴ配列のハイブリダイゼーションを促進するアン
カー配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ランダム六
量体であり得る、ランダムプライミング配列を含む。いくつかの実施形態では、逆転写は
、ランダムプライミング配列を核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイズさせる
ことと、ランダムプライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含
む。

【0011】

いくつかの実施形態では、1つまたは複数の第１の核酸配列のうちの所与の１つは、核
酸の所与の１つの少なくとも一部に対して相補的な配列を有する。いくつかの実施形態で
は、離散区分は、複数の細胞の中で最大でも個々の細胞のみを含む。いくつかの実施形態
では、オリゴヌクレオチドは、固有の分子配列セグメントを含む。いくつかの実施形態で
は、本方法は、固有の分子配列セグメントの存在に少なくとも部分的に基づいて、核酸の
所与の核酸に由来する１つもしくは複数の第１の核酸配列または１つもしくは複数の第２
の核酸配列の個々の核酸配列を識別することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は
、固有の分子配列セグメントの存在に基づいて所与の核酸の量を決定することを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、本方法は、特徴付けを行う前に、１つまたは複数の第２の配
列を生成するために、１つまたは複数の追加配列を１つまたは複数の第１の配列に追加す
ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、スイッチオリゴヌクレオチドを用い
て、第１の追加核酸配列を１つまたは複数の第１の核酸配列に追加することを含む。いく
つかの実施形態では、スイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の第１の核酸配列
の少なくとも一部にハイブリダイズし、第１の追加核酸配列を１つまたは複数の第１の核
酸配列に結合させるためにテンプレート指向様式で伸長する。いくつかの実施形態では、
本方法は、第１の追加核酸配列に結合するより多くの第１の核酸配列の１つを増幅させる
ことを含む。いくつかの実施形態では、増幅は離散区分で生じる。いくつかの実施形態で
は、増幅は、第１の追加核酸配列に結合する１つまたは複数の第１の核酸配列を離散区分
から放出した後に生じる。

【0013】

いくつかの実施形態では、本方法は、増幅後に、１つまたは複数の第２の核酸配列を生
成するために、第１の追加配列に結合する１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは
複数の第２の追加核酸配列を追加することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは
複数の第２の追加配列を追加することは、第１の追加核酸配列に結合する１つまたは複数
の第１の核酸配列のそれぞれの一部を除去することと、１つまたは複数の第１の核酸配列
に１つまたは複数の第２の追加核酸配列を結合することと、を含む。いくつかの実施形態
では、除去は、第１の追加核酸配列に結合する（例えば、連結する）１つまたは複数の第
１の核酸配列の剪断によって完了する。

【0014】

いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数のＲＮＡ断
片を生成するために、１つまたは複数の第１の核酸配列を転写させることを含む。いくつ
かの実施形態では、転写は、離散区分からの1つまたは複数の第１の核酸配列の放出後に
生じる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＴ７プロモーター配列を含む。
いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数のＲＮＡ配列
のそれぞれの一部を除去することと、１つまたは複数のＲＮＡ配列への追加配列を結合さ
せることと、を含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方法は、１つま
たは複数の第２の核酸配列を生成するために、追加配列に結合する１つまたは複数のＲＮ
Ａ配列を逆転写させることを含む。いくつかの実施形態では、特徴付けを行う前に、本方
法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることを含む。いくつかの実施形態で
は、特徴付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数のＤＮＡ配列を生成するために、１
つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることを含む。いくつかの実施形態では、特徴付
けを行う前に、本方法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、１つまた
は複数のＤＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、１つまたは複数のＤＮＡ配列に
１つまたは複数の追加配列を結合させることと、を含む。いくつかの実施形態では、特徴
付けを行う前に、本方法は、１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、核酸は、個々の細胞からのＲＮＡの逆転写から生成された相
補的（ｃＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはプライミング
配列を含み、離散区分に提供される。いくつかの実施形態では、プライミング配列はラン
ダムＮ量体を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成す
ることは、プライミング配列をｃＤＮＡにハイブリダイズさせることと、プライミング配
列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、離散区分は、オリゴヌクレオチドの相補配列を含むスイッチ
オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列
を生成することは、スイッチオリゴヌクレオチドを核酸由来の核酸断片の少なくとも一部
にハイブリダイズさせることと、スイッチオリゴヌクレオチドをテンプレート指向の様式
で伸長させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配
列を生成することは、オリゴヌクレオチドを１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させ
ることを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列は、核酸由来
の核酸断片である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の第１の核酸配列を生成す
ることは、オリゴヌクレオチドを核酸に結合させる（例えば、連結させる）ことを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、複数の区分は離散区分を含む。いくつかの実施形態では、複
数の区分は、１つの区分あたり平均１つ未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、複
数の区分の２５％未満の区分は細胞を含まない。いくつかの実施形態では、複数の区分は
、それぞれ少なくとも１つの区分化された細胞を有する離散区分を含む。いくつかの実施
形態では、離散区分の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、ま
たは１％未満は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも離散区分のサブ
セットはビーズを含む。いくつかの実施形態では、離散区分の少なくとも７５％、少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくと
も９９％は、少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズを含む。いくつかの実施
形態では、離散区分は、区分化された核酸バーコード配列を含む。いくつかの実施形態で
は、離散区分は、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも１
００，０００の異なる区分化された核酸バーコード配列を含む。いくつかの実施形態では
、複数の区分は、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも１
００，０００の区分を含む。

【0018】

別の態様では、本開示は、複数の異なる細胞タイプの集団における細胞を特徴付ける方
法であって、集団内の個々の細胞からの核酸を離散区分へ提供することと、共通の核酸バ
ーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを、離散区分であって、複数の異なる区分が異な
る共通の核酸バーコード配列を含む、離散区分内の核酸の１つまたは複数の断片に結合さ
せることと、複数の離散区分の核酸の１つまたは複数の断片を特徴付けることと、共通バ
ーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、１つまたは複数の断片を個々の細胞
に帰属させることと、複数の離散区分における１つまたは複数の断片の特徴付けに基づい
て、集団内の複数の個々の細胞を特徴付けることと、を含む方法を提供する。

【0019】

いくつかの実施形態では、本方法は、核酸を断片化することを含む。いくつかの実施形
態では、離散区分は液滴である。いくつかの実施形態では、核酸の１つまたは複数の断片
を特徴付けることは、個々の細胞からのリボソームデオキシリボ核酸を配列決定すること
を含み、個々の細胞を特徴付けることは、細胞の属、種、株または変異体を識別すること
を含む。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、マイクロバイオームサンプルに由来す
る。いくつかの実施形態では、個々の細胞は、ヒト組織サンプルに由来する。いくつかの
実施形態では、個々の細胞は、哺乳類の循環細胞に由来する。いくつかの実施形態では、
個々の細胞は、法医学的サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、核酸は、離散区
分の個々の細胞から放出される。

【0020】

本開示のさらなる態様は、個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、複数
の異なる細胞表面特徴結合基タイプであって、各異なる細胞表面結合基タイプは異なる細
胞表面特徴に結合することができ、かつ存在する場合は、１つまたは複数の細胞表面特徴
結合基とその細胞表面特徴のそれぞれとの間の結合を可能にする条件下で、それに結合し
たレポーターオリゴヌクレオチドを含む、複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプを有す
る細胞をインキュベートすることと、細胞を、バーコード配列を含む複数のオリゴヌクレ
オチドを含む区分に区分化することと、バーコード配列を区分に存在するオリゴヌクレオ
チドレポーター基に結合させることと、オリゴヌクレオチドレポーター基及び結合したバ
ーコードを配列決定することと、配列決定されたレポーターオリゴヌクレオチドに基づい
て細胞上に存在する細胞表面特徴を特徴付けることと、を含む方法を提供する。

【0021】

本開示のさらなる態様は、複数の区分を含む組成物であって、複数の区分のそれぞれは
、個々の細胞、及び共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む組
成物を提供する。いくつかの実施形態では、複数の区分は、エマルジョン中の液滴を含む
。いくつかの実施形態では、複数の区分のそれぞれの中のオリゴヌクレオチドの集団は、
複数の区分のそれぞれの中に配置されたビーズに結合する。いくつかの実施形態では、個
々の細胞には、それらの細胞表面特徴それぞれに関連する複数の異なる細胞表面特徴結合
基が結合しており、各異なるタイプの細胞表面特徴結合基は、異なるヌクレオチド配列を
含むオリゴヌクレオチドレポーター基を含む。いくつかの実施形態では、複数の異なる細
胞表面特徴結合基は、複数の異なる細胞表面特徴に対する結合親和性を有する複数の異な
る抗体または抗体断片を含む。

【0022】

本開示のさらなる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示される以下に記
載の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は
、他の異なる実施形態を可能とし、そのいくつかの詳細は、全て開示から逸脱することな
く様々な明白な点において変更可能である。従って、図面及び説明は、本質的に例示的な
ものであり、限定的なものではないと見なされるべきである。

【0023】

参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、ま
たは特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組込まれているかのように示されている
のと同じ程度で、参照により本明細書に組込まれる。参照により組込まれる刊行物及び特
許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、本明細書は、そのよう
な任意の矛盾する材料に代わるかつ／または優先することを意図している。

【0024】

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理
が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面（本
明細書の「Ｆｉｇｕｒｅ（図面）」及び「ＦＩＧ．」）を参照することによって、本発明
の特徴及び利点がより良く理解されることになる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞から核酸を分析する方法であって、
（ａ）個々の細胞に由来する核酸を離散区分に提供することと、
（ｂ）前記離散区分内の前記核酸に由来する１つまたは複数の第１の核酸配列であって
、共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを結合させている前記１つまたは
複数の第１の核酸配列を生成することと、
（ｃ）前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第１の核
酸配列に由来する１つもしくは複数の第２の核酸配列であって、共通のバーコード配列を
含む前記１つもしくは複数の第２の核酸配列の特徴付けを行うことと、
（ｄ）（ｃ）で行われた前記特徴付けにおける前記共通の核酸バーコード配列の存在に
少なくとも部分的に基づいて、前記個々の細胞に由来する前記１つもしくは複数の第１の
核酸配列または１つもしくは複数の第２の核酸配列を識別することと、を含む、前記方法
。
（項目２）
前記離散区分が離散液滴である、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドが、前記個々の細胞に由来する前記核酸と前
記離散区分に共に区分される、項目１に記載の方法。
（項目４）
（ａ）において、少なくとも１０，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分
に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目３に記載の方法。
（項目５）
（ａ）において、少なくとも１００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区
分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目４に記載の方法。
（項目６）
（ａ）において、少なくとも５００，０００の前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区
分に前記個々の細胞に由来する前記核酸と共に区分される、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ａ）において、前記オリゴヌクレオチドがビーズに付着されて提供され、ビーズ上の
各オリゴヌクレオチドが同じバーコード配列を含み、前記ビーズが前記離散区分に前記個
々の細胞と共に区分される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチドが前記ビーズに放出可能に付着している、項目７に記載の方法
。
（項目９）
前記ビーズが分解性ビーズを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
（ｂ）の前または最中に、前記ビーズの分解を介して前記ビーズから前記オリゴヌクレ
オチドを放出することをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
（ｃ）の前に、前記離散区分から前記１つまたは複数の第１の核酸配列を放出すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
（ｃ）が、前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２
の核酸配列を配列決定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つもしくは複数の第１の核酸配列または前記１つもしくは複数の第２の核酸配列
から、前記個々の細胞のゲノムの少なくとも一部の連続核酸配列をアセンブルすることを
さらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記個々の細胞が、前記個々の細胞の前記ゲノムの少なくとも一部の前記核酸配列に基
づいて特徴付けされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸が、前記離散区分内の前記個々の細胞から放出される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
（b）が、前記1つまたは複数の第1の核酸配列をもたらす条件下で前記核酸を逆転写さ
せることをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記逆転写が前記離散区分で生じる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記オリゴヌクレオチドが、前記離散区分に提供され、かつポリＴ配列をさらに含む、
項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記逆転写が、前記ポリＴ配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部にハイブリダイ
ズさせることと、前記ポリＴ配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む
、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記オリゴヌクレオチドが、前記ポリＴ配列のハイブリダイゼーションを促進するアン
カー配列をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記オリゴヌクレオチドが、ランダムプライミング配列をさらに含む、項目２０に記載
の方法。
（項目２４）
前記ランダムプライミング配列がランダム六量体である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記逆転写が、前記ランダムプライミング配列を前記核酸のそれぞれの少なくとも一部
にハイブリダイズさせることと、前記ランダムプライミング配列をテンプレート指向の様
式で伸長させることと、を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記1つまたは複数の第１の核酸配列のうちの所与の１つが、前記核酸の所与の１つの
少なくとも一部に対する配列相補性を有する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記離散区分が、複数の細胞の中で、最大でも前記個々の細胞のみを含む、項目１に記
載の方法。
（項目２８）
前記オリゴヌクレオチドが、固有の分子配列セグメントをさらに含む、項目１に記載の
方法。
（項目２９）
前記固有の分子配列セグメントの存在に少なくとも部分的に基づいて、前記核酸の所与
の核酸に由来する前記１つもしくは複数の第１の核酸配列、または前記１つもしくは複数
の第２の核酸配列の個々の核酸配列を識別することをさらに含む、項目２８に記載の方法
。
（項目３０）
前記固有の分子配列セグメントの存在に基づいて前記所与の核酸の量を決定することを
さらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の配列を生成するために、１つまたは複数の
追加配列を前記１つまたは複数の第１の配列に追加することをさらに含む、項目１に記載
の方法。
（項目３２）
スイッチオリゴヌクレオチドを用いて、第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第
１の核酸配列に追加することをさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記スイッチオリゴヌクレオチドが、前記１つまたは複数の第１の核酸配列の少なくと
も一部にハイブリダイズさせ、前記第１の追加核酸配列を前記１つまたは複数の第１の核
酸配列に結合させるためにテンプレート指向様式で伸長する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の追加核酸配列に結合する前記より多くの第１の核酸配列のうちの１つを増幅
させることをさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記増幅が前記離散区分で生じる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記増幅が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列
を前記離散区分から放出した後に生じる、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記増幅後に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記第１の追
加配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列に１つまたは複数の第２の追加核
酸配列を追加することをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記１つまたは複数の第２の追加配列の追加が、前記第１の追加核酸配列に結合する前
記１つまたは複数の第１の核酸配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは
複数の第１の核酸配列に前記１つまたは複数の第２の追加核酸配列を結合させることと、
を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記除去が、前記第１の追加核酸配列に結合する前記１つまたは複数の第１の核酸配列
の剪断によって完了する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記結合が連結によって完了する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＲＮＡ断片を生成するために、前記１つまたは複数の
第１の核酸配列を転写させることをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目４２）
前記転写が、離散区分からの前記1つまたは複数の第１の核酸配列の放出後に生じる、
項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記オリゴヌクレオチドが、Ｔ７プロモーター配列をさらに含む、項目４１に記載の方
法。
（項目４４）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数のＲＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、
前記１つまたは複数のＲＮＡ配列に追加配列を結合させることと、をさらに含む、項目
４３に記載の方法。
（項目４５）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記追加配列
に結合する前記１つまたは複数のＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、項目４４
に記載の方法。
（項目４６）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、
項目４５に記載の方法。
（項目４７）
（ｃ）の前に、１つまたは複数のＤＮＡ配列を生成するために、前記１つまたは複数の
ＲＮＡ配列を逆転写させることをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を生成するために、前記１つまた
は複数のＤＮＡ配列のそれぞれの一部を除去することと、前記１つまたは複数のＤＮＡ配
列に１つまたは複数の追加配列を結合させることと、をさらに含む、項目４７に記載の方
法。
（項目４９）
（ｃ）の前に、前記１つまたは複数の第２の核酸配列を増幅させることをさらに含む、
項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記核酸が、前記個々の細胞からのＲＮＡの逆転写から生成された相補的（ｃＤＮＡ）
を含む、項目１に記載の方法。
（項目５１）
前記オリゴヌクレオチドがプライミング配列をさらに含む、離散区分に提供される、項
目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記プライミング配列が、ランダムＮ量体を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
（ｂ）が、前記ライミング配列を前記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせることと、前記プ
ライミング配列をテンプレート指向の様式で伸長させることと、を含む、項目５１に記載
の方法。
（項目５４）
前記離散区分が、前記オリゴヌクレオチドの相補配列を含むスイッチオリゴヌクレオチ
ドを含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）
（ｂ）が、前記スイッチオリゴヌクレオチドを前記核酸由来の核酸断片の少なくとも一
部にハイブリダイズさせることと、前記スイッチオリゴヌクレオチドをテンプレート指向
の様式で伸長させることと、を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記１つまたは複数の第１の核酸配列に結合させ
ることを含む、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記１つまたは複数の第１の核酸配列が前記核酸由来の核酸断片である、項目１に記載
の方法。
（項目５８）
前記（ｂ）が、前記オリゴヌクレオチドを前記核酸に結合させることを含む、項目１に
記載の方法。
（項目５９）
前記結合させることが連結させることを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
複数の区分が離散区分を含む、項目１に記載の方法。
（項目６１）
前記複数の区分が、１つの区分あたり平均１つ未満の細胞を含む、項目６０に記載の方
法。
（項目６２）
前記複数の区分の２５％未満の区分が細胞を含まない、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記複数の区分が、それぞれ少なくとも１つの区分された細胞を有する離散区分を含む
、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記離散区分の２５％未満が複数の細胞を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも離散区分のサブセットがビーズを含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記離散区分の少なくとも７５％が、少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビー
ズを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記離散区分が、区分された核酸バーコード配列をさらに含む、項目６３に記載の方法
。
（項目６８）
前記離散区分が、少なくとも１，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含む
、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記離散区分が、少なくとも１０，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を含
む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記離散区分が、少なくとも１００，０００の異なる区分された核酸バーコード配列を
含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記複数の区分が、少なくとも１，０００の区分を含む、項目６０に記載の方法。
（項目７２）
前記複数の区分が少なくとも１０，０００の区分を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記複数の区分が、少なくとも１００，０００の区分を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
複数の異なる細胞タイプの集団における細胞を特徴付ける方法であって、
（ａ）前記集団内の個々の細胞からの核酸を離散区分へ提供することと、
（ｂ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを、前記離散区分であって
、複数の異なる区分が異なる共通の核酸バーコード配列を含む、前記離散区分内の個々の
細胞からの前記核酸の１つまたは複数の断片に結合させることと、
（ｃ）前記複数の離散区分からの前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けて、
共通バーコード配列の存在に少なくとも部分的に基づいて、前記１つまたは複数の断片を
個々の細胞に帰属させることと、
（ｄ）前記複数の離散区分における前記１つまたは複数の断片の前記特徴付けに基づい
て、前記集団内の複数の個々の細胞を特徴付けることと、を含む、前記方法。
（項目７５）
前記核酸を断片化することをさらに含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記離散区分が液滴である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記核酸の前記１つまたは複数の断片を特徴付けることが、前記個々の細胞からのリボ
ソームデオキシリボ核酸を配列決定することを含み、前記個々の細胞を特徴付けることが
、細胞の属、種、株または変異体を識別することを含む、項目７４に記載の方法。
（項目７８）
前記個々の細胞がマイクロバイオームサンプルに由来する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記個々の細胞がヒト組織サンプルに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８０）
前記個々の細胞が哺乳類の循環細胞に由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８１）
前記個々の細胞が法医学的サンプルに由来する、項目７４に記載の方法。
（項目８２）
前記核酸が、前記離散区分の前記個々の細胞から放出される、項目７４に記載の方法。
（項目８３）
個々の細胞または細胞集団を特徴付ける方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞表面特徴結合基タイプであって、各異なる細胞表面結合基タイ
プは異なる細胞表面特徴に結合することができ、かつ存在する場合は、１つまたは複数の
細胞表面特徴結合基とその細胞表面特徴それぞれとの間の結合を可能にする条件下で、そ
れに結合したレポーターオリゴヌクレオチドを含む、前記複数の異なる細胞表面特徴結合
基タイプを有する細胞をインキュベートすることと、
（ｂ）前記細胞を、バーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む区分に区分
することと、
（ｃ）前記バーコード配列を前記区分に存在するオリゴヌクレオチドレポーター基に結
合させることと、
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドレポーター基及び結合したバーコードを配列決定するこ
とと、
（ｅ）配列決定されたレポーターオリゴヌクレオチドに基づいて前記細胞上に存在する
細胞表面特徴を特徴付けることと、を含む方法。
（項目８４）
複数の区分を含む組成物であって、前記複数の区分のそれぞれが、（ｉ）個々の細胞、
及び（ｉｉ）共通の核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの集団を含む組成物。
（項目８５）
前記複数の区分がエマルジョン中の液滴を含む、項目８４に記載の組成物。
（項目８６）
前記複数の区分のそれぞれの中の前記オリゴヌクレオチドの集団が、前記複数の区分の
それぞれの中に配置されたビーズに結合される、項目８４に記載の組成物。
（項目８７）
前記個々の細胞には、それらのそれぞれの細胞表面特徴に関連する複数の異なる細胞表
面特徴結合基が結合しており、各異なるタイプの細胞表面特徴結合基は、異なるヌクレオ
チド配列を含むオリゴヌクレオチドレポーター基を含む、項目８４に記載の組成物。
（項目８８）
前記複数の異なる細胞表面特徴結合基が、複数の異なる細胞表面特徴に対して結合親和
性を有する複数の異なる抗体または抗体断片を含む、項目８７に記載の組成物。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】個々の細胞または小グループの細胞を区分化するためのマイクロ流体チャンネル構造を概略的に示す。

【図2】細胞及び追加の試薬を含むビーズまたはマイクロカプセルを共に区分化するためのマイクロ流体チャンネル構造を概略的に示す。

【図3】細胞の核酸の増幅及びバーコード化のための例示的プロセスを概略的に示す。

【図4】配列データを個々の細胞または細胞群に帰属させて、それらを特徴付けるのに使用する際の、細胞の核酸のバーコード化の使用の概略図を提示する。

【図5】標識された細胞結合性リガンドに関与する細胞を示す概略図を提示する。

【図6】本明細書に記載の方法を用いてＲＮＡ分析を実施するための例示的なワークフローの概略図を提示する。

【図7】本明細書に記載の方法を用いたリボ核酸（ＲＮＡ）の分析で使用するための、例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。

【図8】個々のバーコードを有するビーズと共に区分化された個々の細胞の画像を提供する。

【図9A】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。

【図9B】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。

【図9C】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。

【図9D】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。

【図9E】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造、及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作の概略図を提示する。

【図10】ＲＮＡの例示的な分析における使用及びインビトロ転写のための配列の使用のための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。

【図11】ＲＮＡ分析及びＲＮＡ分析を実施するための例示的な操作で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。

【図12A】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。

【図12B】ＲＮＡの分析で使用するための例示的なバーコード化オリゴヌクレオチド構造の概略図を提示する。

【図13A】区分におけるテンプレートスイッチの逆転写及びＰＣＲからの例示的な収率の図を提示する。

【図13B】区分におけるテンプレートスイッチの逆転写及びＰＣＲからの例示的な収率の図を提示する。

【図13C】区分におけるテンプレートスイッチの逆転写及びＰＣＲからの例示的な収率の図を提示する。

【図14A】様々な細胞数を有する区分における逆転写及びｃＤＮＡ増幅からの例示的な収率の図を提示する。

【図14B】様々な細胞数を有する区分における逆転写及びｃＤＮＡ増幅からの例示的な収率の図を提示する。

【図15】様々な入力細胞濃度でのｃＤＮＡ合成及びリアルタイム定量的ＰＣＲからの例示的な収率、及び一定の細胞入力濃度での収率に及ぼすプライマー濃度の変動の影響の図を提示する。

【図16】インビトロ転写からの例示的な収率の図を提示する。

【図17】本明細書で提供される方法を実施するようにプログラムされるかまたさもなければそのように構成された例示的なコンピュータ制御システムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明の様々な実施形態が本明細書に示されて説明されているが、当業者には、そのよ
うな実施形態は単なる例示的なものとして提供されることが明らかであろう。当業者は、
本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、及び置換を想到し得る。本明細書に記
載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が使用され得ることが理解されるべきで
ある。

【0027】

値が範囲として記載されている場合、そのような開示は、特定の数値または特定のサブ
範囲が明示されているかにかかわらず、そのような範囲内の全ての想定されるサブ範囲、
及びそのような範囲内の特定の数値の開示を含むことが理解されるであろう。

【0028】

Ｉ．単一細胞分析
先進的な核酸配列決定技術は、個々の生物及び比較的純粋な生物学的サンプルの実質的
な配列情報を提供することを含む、生物学的材料を配列決定することにおける驚異的な結
果をもたらしている。しかし、これらのシステムは、サンプルの全体的な構成のごく一部
を表し得る、かつ個々の配列情報がさらに有益なものとなり得る生物学的サンプル中の細
胞のサブ集団を識別して特徴付けることにおいて有効であるとは証明されていない。

【0029】

ほとんどの核酸配列技術は、配列決定する核酸を、組織または他のサンプル由来の細胞
の集合から抽出する。細胞集団の平均を表す遺伝物質を抽出するために、細胞を一斉に処
理することができ、その後、これを所与の配列決定技術のために構成された配列決定可能
なＤＮＡライブラリーへと処理することができる。理解されるように、ＤＮＡまたは核酸
の観点から議論されることが多いが、細胞由来の核酸は、例えば、様々なＲＮＡ－ｓｅｑ
方法の任意のものを用いて、配列決定のためのｃＤＮＡを生成するように処理され得る、
例えば、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡなどを含むＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。この処理後、細
胞特異的マーカーが存在しない場合、サンプル中の細胞のサブセットまたは全ての細胞に
よって寄与されたものとして遺伝子物質を帰属させることは、そのようなアンサンブルア
プローチにおいて事実上不可能である。

【0030】

また、このようなアンサンブルサンプル調製法では、特徴を細胞の集団の特定のサブセ
ットに帰属させることができないことに加えて、最初から、細胞のサンプル中の多数の構
成成分を識別かつ特徴付ける傾向があり、少数成分、例えば、１つの細胞、少数の細胞、
またはサンプル中の全細胞のわずかな割合の細胞によって寄与される遺伝物質を選別する
ことができるようには設計されていない。同様に、例えばｍＲＮＡの発現レベルを分析す
る場合、アンサンブルアプローチは、発現レベルの点で不均一である細胞集団からの潜在
的に著しく不正確なデータを提示する傾向があるであろう。いくつかの場合では、発現が
、分析された集団におけるごく少数の細胞において高く、かつ集団の細胞の大部分には存
在しない場合、アンサンブル法は全集団に対して低レベルの発現を示すであろう。

【0031】

この元の多数のバイアスは、これらのサンプルからシーケンンシングライブラリーを構
築する際に使用される処理操作によって、さらに拡大され、さらに圧倒的なものとなる。
特に、ほとんどの次世代配列決定技術は、シーケンシングライブラリーに十分なＤＮＡを
生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応などの、核酸断片の幾何学的増幅に依存している
。しかし、そのような幾何学的増幅は、サンプル中の多数の成分の増幅に偏っており、そ
のような少数及び大多数の成分の開始比を保存していない場合がある。例として、サンプ
ルが特定の細胞タイプ、例えば宿主組織細胞由来の９５％のＤＮＡ、及び別の細胞タイプ
、例えば癌細胞由来の５％のＤＮＡをサンプル中に含む場合、ＰＣＲに基づく増幅は、比
較指数関数的増幅（より高い濃度の反復倍加はより小さい画分のものを即座に上回る）及
び増幅試薬及びリソースの隔離の関数（プライマー及び他の増幅試薬を優先的に利用する
場合、より大きな画分が増幅される）の両方として、少数のＤＮＡの代わりに多数のＤＮ
Ａを優先的に増幅させることができる。

【0032】

これらの問題のいくつかは、増幅を必要としない単一分子システムなどの様々な配列決
定システムを利用することによって対処することができるが、単一分子システム及び他の
次世代配列決定システムのアンサンブル配列決定方法も十分に大きな入力ＤＮＡ要件の要
求を有することができる。特に、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＭＲＴ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムのような単一分子配列決定システムは、５００ナノグラム
（ｎｇ）～１０マイクログラム（μｇ）超のサンプル入力ＤＮＡ要件を有することができ
、これは個々の細胞または細胞のさらに小さなサブ集団から得ることができるものよりも
はるかに大きい。同様に、他のＮＧＳシステムは、約５０ｎｇ～約１μｇのサンプル中の
サンプルＤＮＡの出発量に合わせて最適化することができる。

【0033】

ＩＩ．細胞の区画化及び特徴付け
しかし、本明細書で開示されるのは、小さな細胞の集団から、かつ、いくつかの場合に
は、特に細胞の集団がより大きい状況において、個々の細胞からの核酸を特徴付けるため
の方法及びシステムである。この方法及びシステムは、個々の細胞または細胞の小集合か
ら抽出可能な非常に少量の入力核酸を処理して配列決定することができるというさらなる
利点とともに、他の次世代システムのスループットが高い非増幅単一分子法の帰属の利点
を提供する。

【0034】

特に、本明細書に記載の方法は、例えば、個々の細胞または細胞の小グループ由来の核
酸を含む、個々の細胞または細胞の小さな集団の解析を区画化し、次いで、その分析を、
核酸が由来する個々の細胞または細胞の小グループに帰属させることを可能にする。これ
は、細胞集団が、５０／５０混合の細胞タイプ、９０／１０混合の細胞タイプ、もしくは
実質的に任意の比率の細胞タイプ、及び完全な不均一混合の異なる様々な細胞タイプ、ま
たはこれらの間の任意の混合物を表すかどうかにかかわらず、達成することができる。異
なる細胞タイプは、個体の異なる組織タイプに由来する、異なる個体に由来する、異なる
属、種、株、変異体、または上記の任意のもしくは全ての任意の組み合わせに由来する細
胞または生物有機体を含み得る。例えば、異なる細胞タイプは、環境の、法医学の、微生
物もしくは他のサンプルまたは細胞タイプの様々な他の混合物の任意のものに由来する個
体、複数の異なる細菌種、株及び／または変異体由来の正常及び腫瘍組織を含み得る。

【0035】

一態様では、本明細書に記載の方法及びシステムは、細胞を含有するサンプル材料由来
の個々の細胞の核酸内容物の区画化、堆積化または区分化を、分散した区画または区分（
本明細書では互換的に区分と呼ばれる）に提供し、ここで個々の区分は、その内容物と他
の区分の内容物との分離を維持する。個々の細胞の特性を特定の区画に後で帰属させるた
めに、固有の識別子、例えばバーコードを、区画化されたまたは区分化された細胞を保持
する区分に、事前に、続けて、または同時に送達させることができる。

【0036】

本明細書で使用される場合、いくつかの態様では、区分は、コンテナまたは容器（ウェ
ル、マイクロウェル、チューブ、例えば、ＢｉｏＴｒｏｖｅナノアレイなどのナノアレイ
基材の貫通ポート、または他のコンテナ）を指す。しかし、多くのいくつかの態様では、
区画または区分は、流体流内で流動可能な区分を含む。これらの区分は、例えば、内部流
体の中心またはコアを取り囲む外部バリアを有するマイクロカプセルまたはマイクロベシ
クルから構成されてもよく、またはそれらは、そのマトリックス内に材料を搭載かつ／ま
たは保持することができる多孔性マトリックスであってもよい。しかし、いくつかの態様
では、これらの区分は、非水性連続相、例えば油相中に水性流体の液滴を含む。様々な異
なる容器が、例えば、２０１３年８月１３日出願の米国特許出願第１３／９６６，１５０
号に記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書
に組込まれる。同様に、非水性または油連続相中で安定な液滴を生成するためのエマルジ
ョンシステムが、例えば、米国特許公開番号第２０１０／０１０５１１２号に詳細に記載
されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込ま
れる。

【0037】

エマルジョン中の液滴の場合、個々の細胞を離散区分に割り当てることは、一般に、水
性流体の細胞の流れを、非水性流体の流れに導入し、それにより２つの流れの合流部で液
滴を生成することによって達成され得る。特定の濃度レベルの細胞の水性細胞含有流を提
供することによって、細胞数の観点から、得られる区分の占有レベルを制御することがで
きる。単一細胞区分が望ましいいくつかの場合では、占有されている区分が主に単独で占
有されることを確実にするために、区分が１区分あたり平均１個未満の細胞を含むように
、流体の相対流速を制御することが望ましい場合がある。同様に、より高い割合の区分が
占有されるように、例えば、占有されていない区分の割合がごく小さなものとなるように
、流速を制御することが望まれる場合がある。いくつかの態様では、流れ及びチャンネル
アーキテクチャーは、所望の数の単一占有区分が、確実に特定のレベルの占有されていな
い区分よりも少なくなり、かつ特定のレベルの複数の占有された区分より少なくなるよう
に制御される。

【0038】

多くの場合、システム及び方法は、占有された区分（１つまたは複数のマイクロカプセ
ルを含む区分）の実質的に大部分が、占有された区分あたり１つ未満の細胞を含むことを
保証するために使用される。いくつかの場合、区分化プロセスは、占有区分の２５％未満
が１つ超の細胞を含むように制御され、多くの場合、占有区分の２０％未満が１つ超の細
胞を有するが、いくつかの場合では、占有区分の１０％未満またはさらに５％未満が区分
あたり１つ超の細胞を含む。

【0039】

追加として、または代替として、多くの場合、過剰な数の空の区分の生成を避けること
が望ましい。これは、十分な数の細胞を区分化領域に提供することによって達成され得る
が、ポアソン分布によると、複数の細胞を含む区分の数が増加することが予想される。従
って、本明細書に記載の態様に従って、多くの場合、生成された区分の５０％以下が非占
有となるように、すなわち、１つ未満の細胞を含み、生成された区分の２５％以下、生成
された区分の１０％以下が非占有となるように、区分化領域に向かう１つまたは複数の細
胞、または他の流体の流れが制御される。さらに、いくつかの態様では、これらのフロー
は、単一の占有区分の非ポアソン分布を提示するが、より低いレベルの非占有区分を提供
するように制御される。言い換えると、いくつかの態様では、上述した任意の単一占有率
を依然として提供しながら、上述の範囲の非占有の区分を得ることができる。例えば、多
くの場合、本明細書に記載のシステム及び方法の使用は、２５％未満、２０％未満、１５
％未満、１０％未満～、多くの場合、５％未満～の複数の占有率を有しながら、５０％未
満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、及びいくつかの場合、５％未満
～の非占有区分を有する区分を結果的に生成する。

【0040】

理解されるように、上記占有率は、バーコードオリゴヌクレオチドを担持する細胞及び
ビーズの両方を含む区分にも適用可能である。特に、いくつかの態様では、占有された区
分全体の実質的な割合は、ビーズ及び細胞の両方を含むことになる。特に、少なくとも５
０％の区分が少なくとも１つの細胞及び少なくとも１つのビーズによって占有されるか、
または少なくとも７５％の区分が同様に占有されるか、または少なくとも８０％もしくは
少なくとも９０％の区分が同様に占有されると定めることが望ましい場合がある。さらに
、区分内に単一の細胞及び単一のビーズを提供することが所望される場合、少なくとも５
０％の区分が同様に占有され、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％
、またはさらに少なくとも９０％の区分が同様に占有され得る。

【0041】

実質的に単一占有区分を提供することに関して説明されているが、特定の場合、例えば
、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の細胞及び／またはビーズを単一の区分内に含む、
複数の占有区分を提供することが望ましい。従って、上述のように、流体及び区分化流体
を含む細胞及び／またはビーズの流動特性を制御して、そのような複数の占有区分を提供
することができる。特に、フローパラメーターは、区分の５０％超、７５％超、及びいく
つかの場合８０％超、９０％超、９５％超またはそれ以上の所望の占有率を提供するよう
に制御され得る。

【0042】

さらに、多くの場合、単一の区分内の複数のビーズは、それに関連する様々な試薬を含
むことができる。そのような場合、様々なビーズ源、すなわち、様々な関連試薬を含むも
のから、共通チャンネルまたは液滴生成接合部に、その共通チャンネルまたは液滴生成接
合部への様々なチャンネル注入口を介して様々なビーズを導入することが有利であり得る
。そのような場合、チャンネルまたは接合部への様々なビーズの流れ及び頻度は、各源か
らのマイクロカプセルの所望の比率を提供しながら、そのようなビーズが所望の数の細胞
を有する区分に確実に対形成されるか組み合わされるように制御することができる。

【0043】

本明細書に記載の区分は、多くの場合、例えば、１０μＬ未満、５μＬ未満、１μＬ未
満、９００ピコリットル（ｐＬ）未満、８００ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未
満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３００ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未
満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ未満、１ｐＬ未満、５００ナノリットル（ｎ
Ｌ）未満、またはさらには１００ｎＬ、５０ｎＬ未満、もしくはさらに低い極めて小さな
体積を有することを特徴とする。

【0044】

例えば、液滴ベースの区分の場合、液滴は、１０００ｐＬ未満、９００ｐＬ未満、８０
０ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３０
０ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ
未満、またはさらには１ｐＬ未満の、全体積を有することができる。ビーズと共に区分化
される場合、例えば共区分化された細胞を含む、区分内のサンプル流体体積は、上述の体
積の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０
％未満、２０％未満、またはさらには上述の体積の１０％未満となる場合がある。

【0045】

本明細書の他の箇所に記載されているように、種を区分化によって、区分の集団が生成
され得る。そのような場合、区分の集団を生成するように、任意の適切な数の区分を生成
することができる。例えば、本明細書に記載の方法では、少なくとも約１，０００個の区
分、少なくとも約５，０００個の区分、少なくとも約１０，０００個の区分、少なくとも
約５０，０００個の区分、少なくとも約１００，０００個の区分、少なくとも約５００，
０００個の区分、少なくとも約１，０００，０００個の区分、少なくとも約５，０００，
０００個の区分、少なくとも約１０，０００，０００個の区分、少なくとも約５０，００
０，０００個の区分、少なくとも約１００，０００，０００個の区分、少なくとも約５０
０，０００，０００個の区分、または少なくとも約１，０００，０００，０００個の区分
を含む区分の集団を生成することができる。さらに、区分の集団は、非占有区分（例えば
、空の区分）及び占有区分の両方を含み得る。

【0046】

特定の場合、マイクロ流体チャンネルネットワークは、本明細書に記載の区分を生成す
るのに特に適している。そのようなマイクロ流体デバイスの例には、２０１４年４月４日
出願の米国特許出願第６１／９７７，８０４号にて詳細に記載されているものが含まれ、
その全開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる。細胞の
水性混合物を非水性流体に押出させる多孔質膜を含む、代替の機構も、個々の細胞の区分
化に用いることができる。そのようなシステムは一般に、例えば、Ｎａｎｏｍｉ，Ｉｎｃ
．から入手可能である。

【0047】

個々の細胞を区分化するための単純化されたマイクロ流体チャンネル構造の例を図１に
示す。本明細書の他の箇所に記載されているように、いくつかの場合では、占有されてい
る区分の大部分は、占有された区分あたり１つ以下の細胞を含み、いくつかの場合、生成
された区分の一部は占有されていない。しかし、いくつかの場合、占有されている区分の
中には、１超の細胞を含むものもある。いくつかの場合、区分化プロセスは、占有区分の
２５％未満が１超の細胞を含むように、多くの場合では、占有区分の２０％未満が１超の
細胞を有するように、さらに、いくつかの場合では、占有区分の１０％未満またはさらに
５％未満が区分あたり１超の細胞を含むように制御され得る。図示されるように、チャン
ネル構造は、チャンネル接合部１１０で連通するチャネンルセグメント１０２、１０４、
１０６、及び１０８を含むことができる。動作中、浮遊細胞１１４を含む第１の水性流体
１１２は、チャンネルセグメント１０２に沿って接合部１１０に輸送され、一方、水性流
体１１２と混和しない第２の流体１１６は、チャンネルセグメント１０４及び１０６から
接合部１１０に送達され、チャンネルセグメント１０８に流入する個々の細胞１１４を含
む水性流体の分離液滴１１８を生成する。

【0048】

いくつかの態様では、第２の流体１１６は、例えば、得られた液滴の合体を阻害しなが
ら、その液滴を安定化させるためのフルオロ界面活性剤を含む、フッ素化油のような油を
含む。特に有用な区分化流体及びフルオロ界面活性剤の例は、例えば、米国特許公開第２
０１０／０１０５１１２号に記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全
体が参照により本明細書に組込まれる。

【0049】

他の態様では、液滴ベースを区分化することに加えて、またはそれに代えて、細胞は、
１つまたは複数の個々の細胞または細胞の小グループを搭載している外殻または層または
多孔質マトリックスを含み、かつ他の試薬を含み得るマイクロカプセル内に封入されても
よい。細胞のカプセル化は、様々なプロセスによって実施することができる。一般に、そ
のようなプロセスによって、分析される細胞を含む水性流体と、ポリマー前駆体に特定の
刺激を加えたときにゲルまたは他の固体または半固体マトリックスに形成することができ
るポリマー前駆物質とを組み合わせる。そのような刺激としては、例えば、熱刺激（加熱
または冷却のいずれか）、光刺激（例えば、光硬化によるもの）、化学的刺激（例えば、
架橋によるもの、前駆体の重合開始（例えば、開始剤添加によるもの）、などが挙げられ
る。

【0050】

細胞を含むマイクロカプセルの調製は、様々な方法によって行うことができる。例えば
、個々の細胞または小グループの細胞を含むマイクロカプセルを形成するために、エアナ
イフ液滴またはエアロゾル発生器を使用して、前駆体流体の液滴をゲル化溶液中に分散さ
せることができる。同様に、例えばＮａｎｏｍｉ，Ｉｎｃ．から入手可能なものなどの膜
に基づくカプセル化システムが、本明細書に記載のマイクロカプセルを生成するために使
用され得る。いくつかの態様では、図１に示すようなマイクロ流体システムを、本明細書
に記載のように、細胞をカプセル化するのに容易に使用することができる。特に、かつ図
１を参照すると、細胞及びポリマー前駆体材料を含む水性流体は、チャンネル接合部１１
０に流入し、ここで非水性流体１１６の流れを介して、個々の細胞１１４を含む液滴１１
８に区分化される。カプセル化方法の場合、非水性流体１１６は、ポリマー前駆体を重合
させかつ／または架橋させて混入した細胞を含むマイクロカプセルを形成させる開始剤も
含むこともできる。特に有用なポリマー前駆体／開始剤の対の例には、例えば、２０１４
年２月７日出願の米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第
６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６
，３８３号に記載されたものが含まれ、これらの全開示は、全ての目的のためにその全体
が参照により本明細書に組込まれる。

【0051】

例えば、ポリマー前駆体材料が線状ポリマー材料、例えば線状ポリアクリルアミド、Ｐ
ＥＧ、または他の線状ポリマー材料を含む場合、活性化剤は架橋剤、または形成された液
滴内の架橋剤を活性化する化学物質を含むことができる。同様に、重合性モノマーを含む
ポリマー前駆体の場合、活性化剤は重合開始剤を含んでもよい。例えば、ポリマー前駆体
がアクリルアミドモノマーとＮ，Ｎ’－ビス－（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣ）コ
モノマーとの混合物を含む特定の場合には、テトラエチルメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ
）などの薬剤を、チャンネルセグメント１０４及び１０６内の第２の流体流内に供給する
ことができ、これによって、アクリルアミド及びＢＡＣの架橋ポリマーネットワークまた
はヒドロゲルへの共重合化が開始する。

【0052】

液滴の形成時に第２の流体流１１６と第１の流体流１１２とが接合部１１０で接触する
と、ＴＥＭＥＤは、第２の流体１１６から線状ポリアクリルアミドを含む水性の第１の流
体１１２に拡散し、これによって、液滴内のポリアクリルアミドの架橋が活性化すること
になり、その結果、例えばヒドロゲル、マイクロカプセル１１８などのゲルが、細胞１１
４を混入する固体または半固体のビーズまたは粒子として形成される。ポリアクリルアミ
ドのカプセル化に関して説明されているが、他の「活性化可能な」カプセル化組成物もま
た、本明細書に記載の方法及び組成物との関連で使用することができる。例えば、アルギ
ネート液滴の形成及びそれに続く二価の金属イオン、例えばＣａ２＋への暴露を、記載さ
れたプロセスを用いたカプセル化プロセスとして使用することができる。同様に、アガロ
ース液滴も、例えば、冷却時など、温度ベースのゲル化によってカプセルに変換され得る
。理解されるように、いくつかの場合、カプセル化された細胞は、例えば、時間の経過に
より、または、特定の刺激を適用することにより、細胞またはその内容物を、マイクロカ
プセルから、例えば、液滴などの追加の区分に放出させるのに十分にマイクロカプセルを
分解することで、マイクロカプセルから選択的に放出可能であり得る。例えば、上記のポ
リアクリルアミドポリマーの場合、マイクロカプセルの分解は、ポリマーマトリックスを
架橋するジスルフィド結合を切断するために、ＤＴＴなどの適切な還元剤の導入によって
実現することができる（例えば、２０１４年２月７日出願の米国仮特許出願第６１／９４
０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６
月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号参照、これらの全開示は、全ての
目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる）。

【0053】

理解されるように、カプセル化された細胞または細胞集団は、保存可能であり、液滴に
基づいて区分化された細胞よりも運搬が容易であるという特定の潜在的な利点を提供する
。さらに、いくつかの場合、異なる刺激の存在下または不在下のいずれかで、そのような
細胞の経時的変化を特徴付けるために、分析される細胞を選択された時間の間インキュベ
ートすることが望ましい場合がある。そのような場合、個々の細胞のカプセル化すること
によって、エマルジョン液滴中の単純な区分化よりも長いインキュベーションが可能とな
る場合があるが、いくつかの場合、液滴区分化細胞を、異なる時間の間、例えば、少なく
とも１０秒、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、
少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、または少
なくとも１０時間以上インキュベートすることもできる。以上で示唆したように、細胞の
カプセル化により、他の試薬が共に区分化される細胞の区分化が構成され得る。代替とし
て、カプセル化された細胞を、上記他の区分、例えば液滴に容易に堆積させることができ
る。

【0054】

特定の態様によれば、細胞は、区分内の細胞の内容物を放出させるために、溶解試薬と
ともに区分化されてもよい。そのような場合、溶解剤は、例えば、チャンネル接合部１１
０の追加のチャンネルまたはチャンネル上流を介して、区分化結合部／液滴への細胞を導
入するのと同時にまたはその直前に、細胞懸濁液と接触させることができる。溶解剤の例
には、異なる細胞タイプ、例えば、グラム陽性または陰性細菌、植物、酵母、哺乳類など
の溶解に使用される溶解酵素など、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、リゾスタフィン
、ラビアーゼ、キタラーゼ、リチカーゼ、及び例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉ
ｎｃ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能な様々な他の溶解酵素、ならびに他の市
販の溶解酵素などの生物活性試薬が含まれる。他の溶解剤は、追加的にまたは代替的に細
胞と共に区分化されて、細胞の内容物を区分に放出させることができる。例えば、いくつ
かの場合、界面活性剤に基づく溶解溶液を、細胞を溶解するのに用いることができるが、
これらは、界面活性剤が安定なエマルジョンを妨害し得るエマルジョンベースのシステム
ではあまり望ましくない場合がある。いくつかの場合、溶解溶液は、非イオン性界面活性
剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びＴｗｅｅｎ２０などを含み得る。いくつかの場
合、溶解溶液は、イオン性界面活性剤、例えば、サルコシル及びドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）などを含み得る。同様に、他の方法を用いる溶解方法が使用されてもよく、エ
レクトロポレーション、熱的、音響的、または機械的細胞崩壊なども、例えば、細胞のカ
プセル化封入体の任意の孔径が細胞崩壊後の所望のサイズの核酸断片を保持するのに十分
小さい場合に、液滴区分化に加えてまたはその代わりになり得る、細胞のカプセル化など
の非エマルジョンベースの区分化などの特定の場合に使用されてもよい。

【0055】

上記の細胞と共に区分化された溶解剤に加えて、例えば、プロテイナーゼＫなどのＤＮ
ａｓｅ及びＲＮａｓｅ不活性化剤または阻害剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、及びその後
の核酸の処理における異なる細胞溶解成分の除去またはさもなければその負の活性または
影響の低減に使用される他の試薬を含む、他の試薬も細胞と共に区分化され得る。さらに
、カプセル化された細胞の場合、細胞を適切な刺激に暴露して、共に区分化したマイクロ
カプセルから細胞またはその内容物を放出させることができる。例えば、いくつかの場合
、マイクロカプセルを分解させるために、かつ細胞またはその内容物をより大きな区分へ
放出させるために、カプセル化された細胞とともに化学的刺激を共区分化することができ
る。いくつかの場合、この刺激は、本明細書の他の箇所に記載されている、それぞれのビ
ーズまたは区分からオリゴヌクレオチドを放出するための刺激と同じであってもよい。代
替の態様では、これは、オリゴヌクレオチドが同じ区分へ放出されるのとは異なる時間に
カプセル化された細胞が区分に放出されることを可能にするために、異なる重複しない刺
激であってもよい。

【0056】

細胞のＤＮＡを断片化するためのエンドヌクレアーゼ、細胞の核酸断片を増幅させてそ
の増幅された断片にバーコードオリゴヌクレオチドを結合させるのに使用されるＤＮＡポ
リメラーゼ酵素及びｄＮＴＰなどの追加の試薬も、細胞と共に区分化され得る。追加の試
薬は、末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素、プライマー及びオリゴヌクレオチド、
ならびにテンプレートスイッチに使用することができるスイッチオリゴヌクレオチド（本
明細書では「スイッチオリゴ」とも呼ばれる）を含む逆転写酵素も含み得る。いくつかの
場合、ｃＤＮＡの長さを増大させるためにテンプレートスイッチを使用することができる
。テンプレートスイッチの一例では、ｃＤＮＡは、テンプレート、例えば、細胞のｍＲＮ
Ａの逆転写から生成することができ、この場合、末端トランスフェラーゼ活性を有する逆
転写酵素は、付加的なヌクレオチド、例えばポリＣを、テンプレートによってコード化さ
れていないｃＤＮＡ、例えばｃＤＮＡの末端に添加することができる。スイッチオリゴは
、追加のヌクレオチド、例えばポリＧに対して相補的な配列を備え得る。ｃＤＮＡ上の追
加のヌクレオチド（例えば、ポリＣ）は、スイッチオリゴ上の追加のヌクレオチド（例え
ば、ポリＧ）に対して相補的な配列にハイブリダイズすることができ、これにより、スイ
ッチオリゴを、逆転写により、ｃＤＮＡをさらに伸長させるために、テンプレートとして
使用することができる。スイッチオリゴは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ロックド核酸
（ＬＮＡ）を含む修飾された核酸、または任意の組み合わせを含み得る。

【0057】

いくつかの場合、スイッチオリゴの長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１
０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１
１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１
２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１
３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１
４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１
５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１
６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１
７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１
８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１
９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２
０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２
１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２
２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２
３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２
４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０ヌクレオチド以上であ
ってよい。

【0058】

いくつかの場合、スイッチオリゴの長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、
３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４
９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２
、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、
７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８
９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、
１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、
１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、
１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、
１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、
１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、
１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、
１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、
１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、
１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、
１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、
２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、
２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、
２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、
２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、
２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、または２５０ヌク
レオチド以上であってよい。

【0059】

いくつかの場合、スイッチオリゴの長さは、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、
３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５
０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３
、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、
７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９
０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２
、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２
、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２
、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２
、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２
、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２
、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２
、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２
、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２
、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２
、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２
、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２
、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２
、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２
、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２
、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９または２５０ヌクレオチド
であってよい。

【0060】

細胞の内容物がそれぞれの区分に放出されると、その区分内に含まれる核酸は、区分内
でさらに処理され得る。本明細書に記載の方法及びシステムによると、個々の細胞の核酸
の内容物には、一般に、それらの核酸が、特徴付けられる際、同じ１つの細胞または複数
の細胞に由来するものとして帰属されるように、固有の識別子が付与されている。個々の
細胞または細胞群に特徴を帰属させる能力は、個々の細胞または細胞群に特異的に固有の
識別子を割り当てることによって提供されるが、これは、本明細書に記載の方法及びシス
テムの別の有利な態様となる。特に、細胞の構成要素（及び結果として、その特徴）に固
有の識別子でタグ付けするかまたは標識化するために、例えば、バーコードの形態の固有
の識別子が、個々の細胞または細胞の集団に割り当てられまたはそれと関連付けられる。
次いで、これらの固有の識別子は、細胞の構成要素及び特徴を個々の細胞または細胞群に
帰属させるのに使用される。いくつかの態様では、これは、個々の細胞または細胞群を固
有の識別子と共に区分化することによって行われる。いくつかの態様では、固有の識別子
は、個々の細胞の核酸の内容物に付着するか、さもなければそれと関連付けられるか、ま
たは細胞の他の構成要素、特にこれらの核酸の断片に結合することができる核酸バーコー
ド配列を含むオリゴヌクレオチドの形態で提供される。オリゴヌクレオチドは、所与の区
分内のオリゴヌクレオチドの間では、その中に含まれる核酸バーコード配列は同じである
が、異なる区分の間では、オリゴヌクレオチドは異なるバーコード配列を有することがで
き、かつそれを有するか、または少なくとも所与の分析において全ての区分にわたる多数
の異なるバーコード配列を表すことができるように、区分化される。いくつかの態様では
、所与の区分には１つの核酸バーコード配列のみを関連付けることができるが、いくつか
の場合、複数の異なるバーコード配列が存在してもよい。

【0061】

核酸コード配列は、オリゴヌクレオチドの配列内に６～約２０以上のヌクレオチドを含
み得る。いくつかの場合、バーコード配列の長さは、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以上であり
得る。いくつかの場合、バーコード配列の長さは、少なくとも６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以
上であり得る。いくつかの場合、バーコード配列の長さは、最大６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ
以下であり得る。これらのヌクレオチドは、完全に隣接していてもよく、すなわち隣接す
るヌクレオチドの単一の区間内にあってもよいか、または１つまたは複数のヌクレオチド
によって分離された複数の別個のサブ配列に分離されてもよい。いくつかの場合、分離さ
れたバーコードサブ配列は、約４～約１６ヌクレオチドの長さであってよい。いくつかの
場合、バーコードサブ配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。いくつかの場合、バーコードサブ
配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。いくつかの場合、バーコードサブ配列は、最
大４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドま
たはそれ以下であり得る。

【0062】

共に区分化されたオリゴヌクレオチドは、共に区分化された細胞由来の核酸の処理にお
いて有用な他の機能配列を含むことができる。これらの配列は、例えば、区分内の個々の
細胞由来のゲノムＤＮＡを増幅させるための標的化またはランダム／ユニバーサル増幅プ
ライマー配列を含みながら、例えば、配列の存在を識別するためのもしくはバーコード化
された核酸をプルダウンするための、関連するバーコード配列、配列決定プライマーもし
くはプライマー認識部位、ハイブリダイゼーションもしくはプローブ配列、または多数の
他の潜在的機能配列のいずれかを結合させる。さらに、オリゴヌクレオチドならびに関連
するバーコード及び他の機能配列を、サンプル材料と共に区分化することは、例えば、２
０１４年２月７日出願の米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出
願の第６１／９９１，０１８号、ならびに２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１
４／３１６，３８３号、及び２０１４年２月７日出願の米国特許出願第１４／１７５，９
３５号に記載されており、それらの全開示は、全ての目的のために参照によりその全体が
本明細書に組込まれる。認識されるように、例えば、複数の液滴の合体を含む、オリゴヌ
クレオチドを共に区分化するための他の機構も使用することができ、この場合、１つの液
滴は、オリゴヌクレオチド、または、例えば、マイクロ流体システム内の液滴などの、区
分へのオリゴヌクレオチドのマイクロディスペンシングを含む。

【0063】

簡潔には、一例では、ビーズに放出可能に付着した多数の上記オリゴヌクレオチドをそ
れぞれ含むビーズ、微粒子、またはマイクロカプセルが提供され、この場合、特定のビー
ズに付着したオリゴヌクレオチドの全てが同じ核酸バーコード配列を含むことになるが、
多数の多様なバーコード配列は、使用されるビーズ集団にわたって表される。特に有用な
例では、例えば、ポリアクリルアミドポリマーマトリックスを含むヒドロゲルビーズは、
多数のオリゴヌクレオチド分子を担持することができるので、固体支持体及びオリゴヌク
レオチドを区分へ送達するためのビヒクルとして使用され、かつ本明細書の他の箇所に記
載されているように、特定の刺激に暴露されたときにそれらのオリゴヌクレオチドを放出
するように構成され得る。いくつかの場合、ビーズの集団は、少なくとも１，０００個の
異なるバーコード配列、少なくとも５，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１
０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも少なくとも５０，０００個の異なるバ
ーコード配列、少なくとも１００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも１，０
００，０００の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００，０００の異なるバーコー
ド配列、または少なくとも１０，０００，０００の異なるバーコード配列を含む多様なバ
ーコード配列ライブラリーを提供することになる。さらに、各ビーズは、多数のオリゴヌ
クレオチド分子が付着された状態で提供され得る。特に、個々のビーズ上のバーコード配
列を含むオリゴヌクレオチド分子の数は、少なくとも１，０００個のオリゴヌクレオチド
分子、少なくとも５，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１０，０００個の
オリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なく
とも１００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５００，０００個のオリゴ
ヌクレオチド分子、少なくとも１，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なく
とも５，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１０，０００，０００
個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド
分子、少なくとも１００，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、及びある場合に
は少なくとも１０億個のオリゴヌクレオチド分子であってよい。

【0064】

さらに、ビーズの集団が区分化される場合、得られる区分の集団は、少なくとも１，０
００個の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００個の異なるバーコード配列、少な
くとも１０，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも少なくとも５０，０００個の
異なるバーコード配列、少なくとも１００，０００個の異なるバーコード配列、少なくと
も１，０００，０００個の異なるバーコード配列、少なくとも５，０００，０００個の異
なるバーコード配列、または少なくとも１０，０００，０００個の異なるバーコード配列
を含む、多様なバーコードライブラリーも含むことができる。さらに、集団の各区分は、
少なくとも１，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５，０００個のオリゴヌ
クレオチド分子、少なくとも１０，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５０
，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００個のオリゴヌクレオチ
ド分子、少なくとも５００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１，０００
，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも５，０００，０００個のオリゴヌクレ
オチド分子、少なくとも１０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも
５０，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００，０００
個のオリゴヌクレオチド分子、及びいくつかの場合には少なくとも１０億個のオリゴヌク
レオチド分子を含むことができる。

【0065】

いくつかの場合、区分内の単一または複数のビーズのいずれかに付着している所与の区
分内に、複数の異なるバーコードを組込むことが望ましい場合がある。例えば、いくつか
の場合、例えば、所与の区分にバーコードのより強いアドレスまたは帰属を与えることに
よって、所与の区分からの出力を二重にまたは独立して確認するものとして、混合されて
いるが既知であるバーコード配列セットは、後続の処理において識別がより大きく保証さ
れる場合がある。

【0066】

オリゴヌクレオチドは、ビーズに特定の刺激を加えると、ビーズから放出可能である。
いくつかの場合、刺激は、例えば、オリゴヌクレオチドを放出する光不安定な結合の切断
を介した光刺激であってもよい。他の場合には、熱刺激を使用することができ、この場合
、ビーズ環境の温度の上昇によって、オリゴヌクレオチドの結合がビーズから切断される
か、またはオリゴヌクレオチドがビーズから放出される。さらに他の場合には、オリゴヌ
クレオチドのビーズへの結合を切断するか、またはさもなければビーズからオリゴヌクレ
オチドを放出させる化学的刺激が使用される。このタイプのシステムの例は、２０１３年
８月１３日出願の米国特許出願第１３／９６６，１５０号、及び２０１４年２月７日出願
の米国仮特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の第６１／９９１
，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号に
記載されており、その全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組
込まれる。ある場合には、そのような組成物は、上記の細胞のカプセル化のためのポリア
クリルアミドマトリックスを含み、ＤＴＴなどの還元剤へ暴露することにより、付着した
オリゴヌクレオチドを放出するために分解され得る。

【0067】

本明細書に記載の方法及びシステムに従って、付着したオリゴヌクレオチドを含むビー
ズは、単一のビーズ及び単一の細胞が個々の区分内に含まれるように、個々の細胞と共に
区分化される。上記のように、単一細胞／単一ビーズの占有が最も望ましい状態であるが
、複数の占有区分（細胞、ビーズのいずれかまたはその両方を単位とする）または非占有
区分（細胞、ビーズのいずれかまたはその両方を単位とする）が存在することが多いこと
を理解されたい。図２には、バーコードオリゴヌクレオチドを含む細胞及びビーズを共に
区分化するためのマイクロ流体チャンネル構造の例が、概略的に示されている。本明細書
の他の箇所に記載されているように、いくつかの態様では、全占有区分の実質的な割合は
、ビーズ及び細胞の両方を含み、いくつかの場合、生成される区分の一部は非占有となる
。いくつかの場合、区分の一部は、１：１で区分化されていないビーズ及び細胞を有して
もよい。いくつかの場合、例えば、単一の区分内に２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の
細胞及び／またはビーズを含む、複数の占有区分を提供することが望ましい場合がある。
図示のように、チャンネルセグメント２０２、２０４、２０６、２０８、２１０は、チャ
ンネル接合部２１２で流体連通するように設けられている。個々の細胞２１４を含む水流
は、チャンネルセグメント２０２を通ってチャンネル接合部２１２に向かって流れる。上
述のように、これらの細胞は、区分化プロセスの前に、水性流体中に懸濁されていてもよ
いか、または予めカプセル化されてもよい。

【0068】

同時に、バーコード担持ビーズ２１６を含む水流が、チャンネルセグメント２０４を通
ってチャンネル接合部２１２に向かって流れる。非水性の区分化流体２１６は、側部チャ
ンネル２０６及び２０８のそれぞれからチャンネル接合部２１２に導入され、混合流は流
出チャンネル２１０に流入する。チャンネル接合部２１２内で、チャンネルセグメント２
０２及び２０４からの２つの混合水流が合流し、共に区分化された細胞２１４及びビーズ
２１６を含む液滴２１８に区分化される。上述のように、チャンネル接合部２１２で合流
する各流体の流れ特性を制御すること、及びチャンネル接合部の形状を制御することによ
って、生成された区分２１８内でビーズ、細胞、またはその両方の所望の占有レベルを達
成するために、合流及び区分化を最適化することができる。

【0069】

いくつかの場合、細胞の溶解が区分化時またはその後にのみ開始するように、溶解剤、
例えば、細胞溶解酵素を、例えば、チャンネルセグメント２０４を流れるビーズ流を用い
て区分内に導入することができる。細胞のＤＮＡを断片化するためのエンドヌクレアーゼ
、細胞の核酸断片を増幅させて増幅された断片にバーコードオリゴヌクレオチドを結合さ
せるのに使用されるＤＮＡポリメラーゼ酵素及びｄＮＴＰなどの追加の試薬も、この構成
において区分に添加えることができる。上記のように、多くの場合、ＤＴＴのような化学
的刺激を、それぞれのビーズからバーコードを区分に放出するのに使用することができる
。そのような場合、例えば、区分２１８内で、２つの流れが合流した後にのみバーコード
が放出されるように、チャンネルセグメント２０２内に細胞含有流とともに化学刺激を提
供することが特に望ましい場合がある。しかし、細胞がカプセル化されている場合、例え
ば、ビーズからオリゴヌクレオチドを放出し、かつそのマイクロカプセルから細胞を放出
する共通の化学的刺激の導入は一般に、チャンネル接合部２１２の上流にあるか、または
それに接続する別個の追加の側部チャンネル（図示せず）からもたらされてもよい。

【0070】

理解されるように、例えば、保護試薬、同様のプロテイナーゼＫ類、キレート剤、核酸
伸長剤、複製剤、ポリメラーゼなどの転写もしくは増幅試薬、逆転写酵素、トランスポゾ
ンに基づく方法（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ）に用いることができるトランスポザーゼ、ヌ
クレオシド三リン酸もしくはＮＴＰ類似体、プライマー配列及びそのような反応で使用さ
れる二価金属イオンなどの追加の補因子、リガーゼ酵素及び連結配列などの連結反応試薬
、染料、標識、または他の標識試薬を含む多くの他の試薬を、細胞、ビーズ、溶解剤、及
び化学的刺激とともに共区分化することができる。

【0071】

チャンネルネットワークは、例えば、本明細書で説明されるように、適切な流体構成要
素に流体結合され得る。例えば、入口チャンネルセグメント、例えば、チャンネルセグメ
ント２０２、２０４、２０６、及び２０８は、チャンネル接合部２１２に供給すべき材料
の適切な源に流体結合される。例えば、チャネンルセグメント２０２は、分析される細胞
２１４の水性懸濁液の源に流体的に結合されることになり、チャンネルセグメント２０４
は、ビーズ２１６の水性懸濁液源に流体結合されることになる。次いで、チャンネルセグ
メント２０６及び２０８は、非水性流体の１つまたは複数の源に流体結合される。これら
の源は、マイクロ流体デバイスの本体構造内に画定された、またはそれに接続された単純
な容器から、デバイス外の供給源、マニホールドなどから流体を送達する流体導管にわた
る様々な異なる流体構成要素のいずれかを含んでもよい。同様に、出口チャンネルセグメ
ント２１０は、区分化された細胞のための受容容器または導管に流体結合され得る。さら
に、これは、マイクロ流体デバイスの本体に画定された容器であってもよく、または、区
分化された細胞を後続のプロセス操作、器具、または構成要素に送達するための流体導管
であってもよい。

【0072】

図８は、油中水エマルジョン中の水性液滴中にビーズを含有するバーコードオリゴヌク
レオチドと共に区分化された個々のＪｕｒｋａｔ細胞の画像を示す。図示されるように、
個々の細胞は、容易に個々のビーズと共に区分化され得る。認識されるように、個々の細
胞投入の最適化は、本明細書の他の箇所に記載されているように、区分あたりの望ましい
細胞投入を達成するために、マイクロ流体システム内で細胞集団の希釈を実現することを
含む多くの方法によって行うことができる。

【0073】

操作では、個々の細胞の核酸内容物は、一旦溶解されると、例えば、断片化、増幅及び
バーコード化、ならびに他の機能配列の添加を含む区分内でさらなる処理を行うのに利用
可能なものとなる。上記のように、断片化は、核酸をより小さな断片に断片化するために
、エンドヌクレアーゼなどの剪断酵素を共に区分化することによって達成され得る。これ
らのエンドヌクレアーゼには、タイプＩＩ及びタイプＩＩの制限エンドヌクレアーゼなら
びにニッキングエンドヌクレアーゼなどの他の核酸切断酵素などを含む、制限エンドヌク
レアーゼが含まれ得る。いくつかの場合、断片化が所望されず、完全長の核酸が区分内に
保持されていてもよく、またはカプセル化された細胞または細胞の内容物の場合には、区
分化の前に、例えば、本明細書に記載の酵素的方法によって、または、例えば、機械的方
法、例えば、機械的、音響的、もしくは他の剪断などによって、断片化を実施することが
できる。

【0074】

細胞が、一旦共に区分化され、溶解されてそれらの核酸を放出すると、ビーズ上に配置
されたオリゴヌクレオチドは、それらの核酸の断片をバーコード化して増幅させるのに使
用され得る。サンプル核酸の断片を増幅かつバーコード化することにおいてこれらのバー
コードオリゴヌクレオチドを使用する特に明確なプロセスは、前に参照により組込まれた
、２０１４年２月７日出願の米国仮特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月
９日出願の第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第
１４／３１６，３８３号に詳細に記載されている。簡潔には、一態様では、細胞と共に区
分化されたビーズ上に存在するオリゴヌクレオチドは、そのビーズから細胞の核酸を有す
る区分に放出される。オリゴヌクレオチドは、バーコード配列と共に、その５’末端にプ
ライマー配列を含むことができる。このプライマー配列は、細胞の核酸上の多数の異なる
領域をランダムにプライミングすることを意図するランダムオリゴヌクレオチド配列であ
ってもよいか、または細胞のゲノムの特定の標的領域のプライム上流を標的とする特異的
プライマー配列であってもよい。

【0075】

オリゴヌクレオチドのプライマー部分は、一旦放出されると、細胞の核酸の相補的な領
域にアニールすることができる。また、細胞及びビーズと共に区分化された伸長反応試薬
、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、補因子（例えば、Ｍｇ２＋また
はＭｎ２＋）は、細胞の核酸をテンプレートとして用いてプライマー配列を伸長させて、
プライマーがアニールする細胞の鎖の相補的断片を生成し、その相補的断片は、オリゴヌ
クレオチド及びその関連するバーコード配列を含む。複数のプライマーをアニーリングし
て細胞の核酸の異なる部分にそれを伸長させることにより、核酸の重複した相補的な断片
の大きなプールをもたらされ、それぞれの断片は、それが作製された区分を示す独自のバ
ーコード配列を含む。いくつかの場合、これらの相補的断片は、それ自体が、区分に存在
するオリゴヌクレオチドによってプライミングされたテンプレートとして使用されて、さ
らにバーコード配列を含む相補体の相補体を生成し得る。いくつかの場合、この複製プロ
セスは、第１の相補体が複製されたときに、ヘアピン構造または部分的ヘアピン構造の形
成を可能にするために、その末端またはその付近に２つの相補的配列を生成するように構
成され、分子がさらなる反復コピーを作製するためのベースとなる能力を減少させる。本
明細書に記載される場合、細胞の核酸は、細胞内の任意の所望の核酸を含むことができ、
その核酸には、例えば、細胞のＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、例えばメッセンジ
ャーＲＮＡなどが含まれる。例えば、いくつかの場合、本明細書に記載の方法及びシステ
ムは、発現ｍＲＮＡの特徴付け（例えば、そのようなｍＲＮＡの存在及び定量化を含む）
に使用することができ、かつ、例えばそのようなｍＲＮＡの存在及び定量化を含めて、使
用され、ＲＮＡ配列決定プロセスを特徴付けプロセスとして含むことができる。代替的に
または追加的に、細胞と友に区分化された試薬は、ＤＮＡ配列決定が使用される配列決定
プロセスを容易にするために、ＲＮＡをｃＤＮＡへ変換するための試薬、例えば逆転写酵
素及び試薬を含み得る。特徴付けられる核酸がＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含むいくつかの
場合において、この一例の概略図が図３に示されている。

【0076】

図示されるように、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチオチドは、例えば、エマル
ジョン中の液滴３０２中に、サンプル核酸３０４と共に区分化される。本明細書の他の箇
所に記載されているように、オリゴヌクレオチド３０８は、サンプル核酸３０４と共に区
分化されたビーズ３０６に提供されてもよく、そのオリゴヌクレオチドは、パネルＡに示
されるように、ビーズ３０６から放出可能である。オリゴヌクレオチド３０８は、１つま
たは複数の機能配列、例えば配列３１０、３１４、及び３１６に加えて、バーコード配列
３１２を含む。例えば、オリゴヌクレオチド３０８は、バーコード配列３１２、及び所与
の配列決定システム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ（登録商標）またはＭｉｓ
ｅｑ（登録商標）システムのフローセルにおいて結合のために使用されるＰ５配列に対す
る結合または固定化配列として機能し得る配列３１０を含むものとして示されている。図
示のように、オリゴヌクレオチドは、サンプル核酸３０４の一部のプライミング複製のた
めのランダムまたは標的Ｎ量体を含み得るプライマー配列３１６も含む。オリゴヌクレオ
チド３０８には、シーケンシングシステムにおける合成反応によるポリメラーゼ媒介性の
テンプレート指向性配列決定をプライミングするのに使用される「ｒｅａｄ１」すなわち
Ｒ１プライミング領域などの配列決定プライミング領域を提供し得る配列３１４も含まれ
る。理解されるように、機能配列は、様々な異なる配列決定システム、例えば、４５４
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰｒｏｔｏｎまたはＰＧＭ、Ｉｌｌｕ
ｍｉｎａ Ｘ１０など、及びその要求に適合するように選択され得る。多くの場合、バー
コード配列３１２、固定化配列３１０、及びＲ１配列３１４は、所与のビーズに付着した
オリゴヌクレオチドの全てに共通のものであり得る。プライマー配列３１６は、ランダム
なＮ量体プライマーに対して変化し得るか、または特定の標的化された応用のための所定
のビーズ上のオリゴヌクレオチドに共通なものであり得る。

【0077】

理解されるように、いくつかの場合、機能配列は、ＲＮＡ－ｓｅｑの応用に有用なプラ
イマー配列を含み得る。例えば、いつかの場合、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＲ
ＮＡ－ｓｅｑの逆転写をプライミングするためのポリＴプライマーを含み得る。さらに他
の場合には、例えば、個々のビーズに含まれる、所与の区分内のオリゴヌクレオチド、例
えば、個々のビーズに含まれるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー及びＲ
ＮＡ配列決定プライマーの両方、例えば、ビーズに結合したオリゴヌクレオチド内に含ま
れるポリＴのプライマー配列などの共通バーコード配列に加えて、複数のタイプのプライ
マー配列を含み得る。そのような場合、単一の区分化された細胞では、ＤＮＡ及びＲＮＡ
配列決定プロセスの両方が行われる。

【0078】

プライマー配列３１６の存在に基づいて、オリゴヌクレオチドは、パネルＢに示される
サンプル核酸をプライミングすることができ、これによって、ポリメラーゼ酵素ならびに
ビーズ３０６及びサンプル核酸３０４と共に区分化された他の伸長試薬を用いて、オリゴ
ヌクレオチド３０８及び３０８ａを伸長させることが可能となる。パネルＣに示されるよ
うに、オリゴヌクレオチドを伸長させた後、オリゴヌクレオチドは、ランダムＮ量体プラ
イマーで、サンプル核酸３０４の複数の異なる領域にアニールするオリゴヌクレオチドを
伸長させた後、複数の重複する相補体または核酸断片（例えば断片３１８及び３２０など
）が作製される。これらの構築物は、サンプル核酸の部分に対して相補的な配列部分、例
えば配列３２２及び３２４を含むが、本明細書では概して、バーコード配列が結合したサ
ンプル核酸３０４の断片を含むものと称される。

【0079】

次いで、パネルＤに示されるように、バーコード化された核酸断片では、例えば、配列
分析による特徴付けを行うことができるか、または、それらを、本プロセスにおいてさら
に増幅させることができる。例えば、ビーズ３０６から放出された、例えば、オリゴヌク
レオチド３０８ｂなどの追加のオリゴヌクレオチドも、断片３１８及び３２０をプライミ
ングすることができる。これは、断片３１８で示されている。特に、オリゴヌクレオチド
３０８ｂ中のランダムＮ量体プライマー３１６ｂ（これは、多くの場合、所与の区分内の
他のランダムＮ量体、例えば、プライマー配列３１６と異なり得る）の存在に基づいて、
さらにオリゴヌクレオチドは、断片３１８とアニールして伸長されて、サンプル核酸配列
の一部の複製を含む配列３２８を含む断片３１８の少なくとも一部に対する相補体３２６
を作製する。オリゴヌクレオチド３０８ｂの伸長は、それが断片３１８のオリゴヌクレオ
チド部分３０８を介して複製するまで継続する。本明細書の他の箇所に記載され、かつパ
ネルＤに示されるように、オリゴヌクレオチドは、例えば、断片３１８内に含まれるオリ
ゴヌクレオチド３０８の配列３１６及び３１４を介した複製の後、所望の点でポリメラー
ゼによる複製の停止を促すように構成することができる。これは、本明細書に記載される
ように、例えば、使用されるポリメラーゼ酵素によって処理され得ない異なるヌクレオチ
ド及び／またはヌクレオチド類似体の組込みを含む、異なる方法によって達成され得る。
例えば、これには、非ウラシル耐性ポリメラーゼがその領域の複製を停止するのを防ぐた
めに、配列領域３１２内でのヌクレオチドを含むウラシルの含有を含まれ得る。その結果
、バーコード配列３１２、結合配列３１０、Ｒ１プライマー領域３１４、及びランダムＮ
量体配列３１６ｂを含む、一端に完全長オリゴヌクレオチド３０８ｂを含む断片３２６が
作製される。配列の他方の末端には、第１のオリゴヌクレオチド３０８のランダムＮ量体
に対する相補体３１６’、及び配列３１４’として示される、Ｒ１配列の全部または一部
に対する相補体が含まれ得る。次いで、Ｒ１配列３１４及びその相補鎖３１４’は、部分
的ヘアピン構造３２８を形成するために一緒にハイブリダイズすることができる。理解さ
れるように、ランダムＮ量体は異なるオリゴヌクレオチド間で異なるため、これらの配列
及びそれらの相補体はヘアピン形成に関与するとは考えられない。例えば、ランダムＮ量
体３１６の相補体である配列３１６’は、ランダムＮ量体配列３１６ｂに相補的であると
は考えられない。これは、他の応用、例えば、Ｎ量体が所与の区分内のオリゴヌクレオチ
ド間で共通する、標的化プライマーには当てはまらない。

【0080】

これらの部分的なヘアピン構造を形成することにより、サンプル配列の第１レベルの複
製物をさらなる複製からの除去すること、例えば、コピーの反復コピーを防止することを
可能にする。部分ヘアピン構造は、作製された断片、例えば、断片３２６のその後の処理
のための有用な構造を提供する。

【0081】

一般に、細胞の核酸の増幅は、区分内のバーコード化された重複断片が、細胞のゲノム
の特定の部分または全部の少なくとも１倍の適用範囲、対象のゲノムまたはその関連部分
の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０
倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、またはそれ以上の適用範囲を構成するまで実
行される。一旦バーコード化断片が生成されると、それらでは適切な配列決定システム、
例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ（登録商標）、Ｍｉｓｅｑ（登録商標）またはＸ
１０システムで直接配列決定されるか、または、例えば、逆読み取りのための第２の配列
決定プライマー、サンプルインデックス配列などの他の機能配列のさらなる増幅、結合な
どのさらなる処理が行われてもよい。

【0082】

複数の異なる区分からの断片の全てを、本明細書に記載のように高スループットシーケ
ンサー上での配列決定のためにプールすることができるが、この場合、プールされた断片
は、異なる細胞または小さな細胞集団の核酸に由来する多数の断片を含むが、所与の細胞
の核酸由来の断片は同じバーコード配列を共有することになる。特に、各断片はその起源
の区分、ひいてはその単一細胞または細胞の小集団に応じてコード化されるため、その断
片の配列は、そのバーコードの存在に基づいてその細胞またはそれらの細胞に帰属させる
ことができるが、このことは、複数の区分からの様々な配列断片を、異なる細胞の個々の
ゲノムのアセンブリーに適用するのにも役立つ。これは、図４に概略的に示されている。
一例に示されるように、第１の細胞４００由来の第１の核酸４０４及び第２の細胞４０２
由来の第２の核酸４０６はそれぞれ、上述のようにそれらの独自のバーコードオリゴヌク
レオチドのセットで区分化される。核酸は、細胞由来の染色体、全ゲノム、または他の大
きな核酸を含み得る。

【0083】

各区分内で、各細胞の核酸４０４及び４０６は、第１の断片（複数可）の第２の断片の
重複セット、例えば第２の断片セット４０８及び４１０を別々に提供するように処理され
る。また、この処理によって、第２の断片にバーコード配列が提供されるが、特定の第１
の断片由来の第２の断片それぞれのバーコード配列は同じである。図示のように、第２断
片セット４０８のバーコード配列は「１」で示され、断片セット４１０のバーコード配列
は「２」で示される。バーコードの多様なライブラリーを、多数の異なる断片セットを差
別的にバーコード化するのに使用することができる。しかし、異なる第１の断片由来の全
ての第２の断片セットが異なるバーコード配列でバーコード化される必要はない。実際、
多くの場合、複数の異なる第１の断片を、同じバーコード配列を含むように同時に処理す
ることができる。多様なバーコードライブラリーが、本明細書の他の箇所に詳細に記載さ
れている。

【0084】

例えば、断片セット４０８及び４１０由来のバーコード化断片を、例えば、Ｔｈｅｒｍ
ｏ－Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．のＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ部門から
入手可能な合成技術による配列を使用する配列決定のためにプールすることができる。配
列は、一旦配列されると、配列読み取りデータ４１２は、例えば、集約された読み取りデ
ータ４１４及び４１６に示されるように、含有されるバーコードに少なくとも部分的に基
づいて、またいくつかの場合には、断片自身の配列に部分的に基づいて、それぞれの断片
セットに帰属させることができる。次いで、各断片セットの帰属させた配列読み取りデー
タは、アセンブルされて、各細胞の核酸のアセンブルされた配列、例えば、配列４１８及
び４２０を提供し、これは、個々の細胞、例えば、細胞４００及び４０２に帰属させるこ
とができる。

【0085】

細胞内に存在する遺伝物質を分析することに関して記載されているが、本明細書に記載
の方法及びシステムは、個々の細胞へ試薬の割り当て、かつその試薬に反応するするそれ
らの細胞の帰属分析または特徴付けを提供することによって、個々の細胞または細胞集団
の他の態様を特徴付ける能力を含む、より広範な適用性を有する。これらの方法及びシス
テムは、例えば、研究、診断、病原体識別、及び他の多くの目的のために、細胞を特徴付
けることができることにおいて特に価値がある。例として、例えば、分化のクラスターま
たはＣＤタンパク質のような細胞表面タンパク質などの、広範囲の異なる細胞表面特徴は
、癌のような疾患の特徴付けにおいて有意な診断関連性を有する。

【0086】

１つの特に有用な応用では、本明細書に記載の方法及びシステムは、例えば、タンパク
質、受容体などの細胞表面特徴といった細胞特徴を特徴付けるのに使用され得る。特に、
本明細書に記載の方法は、上記のように区分化された場合に、例えばＤＮＡ配列決定技術
を用いて、個々の細胞または細胞集団内のそのような細胞特徴の存在を確認するために、
また、いくつかの場合には、それらの相対的な存在量または量を確認するために、バーコ
ード化されて分析され得るこれらの細胞特徴にレポーター分子を結合させるのに使用され
得る。

【0087】

特定の例では、潜在的な細胞結合リガンド、例えば、抗体、抗体断片、細胞表面受容体
結合分子などのライブラリーは、例えば、異なるレポーターオリゴヌクレオチド配列が特
定のリガンドと結合し、従って特定の細胞表面特徴に結合することができる場合、第１の
セットの核酸レポーター分子と結合させて提供され得る。いくつかの態様では、ライブラ
リーの異なるメンバーは、異なるオリゴヌクレオチド配列標識の存在によって特徴付けさ
れてもよく、例えば、第１のタイプの細胞表面タンパク質または受容体に対する抗体は、
第１の既知のレポーターオリゴヌクレオチド配列と関連付けられており、第２のレセプタ
ータンパク質に対する抗体は、それと関連付けられている異なる既知のレポーターオリゴ
ヌクレオチド配列を有することになる。細胞は、共に区分化される前に、例えば、受容体
、タンパク質などの異なる細胞表面特徴の広範なパネルに対する抗体を表すことができ、
かつそれらの関連するレポーターオリゴヌクレオチドを含むリガンドのライブラリーとイ
ンキュベートされることになる。結合していないリガンドは細胞から洗浄され、次いで細
胞は上記のバーコードオリゴヌクレオチドと共に区分化される。結果として、区分には、
細胞または細胞（複数）、ならびに結合したリガンド及びそれらの既知の関連レポーター
オリゴヌクレオチドが含まれることになる。

【0088】

区分内で細胞を溶解させる必要なしに、細胞の核酸ではレポーターオリゴヌクレオチド
に対して上記のバーコード化操作を行い、バーコード化されたレポーターオリゴヌクレオ
チドを生成させることができるが、この場合、レポーターオリゴヌクレオチドの存在によ
って特定の細胞表面特徴の存在を示すことができ、また、バーコード配列によって、その
細胞または細胞の集団と共に区分化されたバーコード配列に基づいて、ある範囲の異なる
細胞表面特徴を所与の個々の細胞または細胞集団に帰属させることが可能となる。その結
果、より広範な細胞集団内で細胞表面特徴の細胞ごとのプロファイルを生成することがで
きる。本明細書に記載の方法及びシステムのこの態様は、以下でより詳細に説明される。

【0089】

この例は図５で概略的に示される。図示のように、細胞５０２及び５０４によって表さ
れる細胞の集団は、細胞表面結合試薬、例えば抗体、細胞表面結合タンパク質、リガンド
などのライブラリーとインキュベートされるが、この場合、異なるタイプの結合基はそれ
ぞれ、リガンド及び関連レポーター分子５０６、５０８、５１０、及び５１２（レポータ
ー分子は別に影付き丸で示されている）として示されている、それに付随する関連付けら
れた核酸レポーター分子を含む。細胞がライブラリーによって結合された表面特徴を発現
する場合、リガンド及びそれらに付随するレポーター分子は、細胞表面と結合または連結
することができる。次いで、個々の細胞は、それらの結合したリガンド／レポーター分子
、及び本明細書の他の箇所に記載された個々のバーコードオリゴヌクレオチドビーズ、例
えば、ビーズ５２２及び５２４のそれぞれと、別個の区分、例えば液滴５１４及び５１６
に区分化される。本明細書中に記載の他の例と同様に、バーコード化オリゴヌクレオチド
はビーズから放出され、所与の区分では共通であるが異なる区分間では大幅に変化するバ
ーコードで各区分内に存在するレポーター分子をバーコード配列に結合させるのに使用さ
れる。例えば、図５に示されるように、区分５１４の細胞５０２に結合するレポーター分
子はバーコード配列５１８でバーコード化され、区分５１６の細胞５０４に結合するレポ
ーター分子はバーコード５２０でバーコード化される。その結果、レポーター分子によっ
て反映されるように細胞の表面リガンドを反映するが、共通のバーコード配列により個々
の細胞に実質的に起因させることができるオリゴヌクレオチドのライブラリーが提供され
、これによって、細胞の表面特性の単一細胞レベルプロファイリングが可能となる。理解
されるように、このプロセスは、細胞表面受容体に限定されず、多様な特定の細胞構造、
化学、または他の特性の存在を識別するのに使用され得る。

【0090】

ＩＩＩ．単一細胞分析の応用
特定の個々のエル（ｅｌｌｓ）の分析、異なる細胞タイプの集団内の異なる細胞タイプ
の分析、環境、ヒトの健康、疫学法医学に関する、細胞の大集団の分析及び特徴付けを含
む、本明細書に記載の単一細胞処理及び分析方法及びシステムの多様な応用が存在する。

【0091】

本明細書に記載される単一細胞分析プロセスの特に有用な応用は、癌細胞の配列決定及
び特徴付けでの応用である。特に、上記で示唆されたアンサンブル配列決定プロセスを含
む従来の分析技術は、特に正常組織細胞の海に存在する癌細胞のゲノム構成の小さな変異
を選別するのに高度には熟達していない。さらに、腫瘍細胞の間でさえも、様々な変異が
存在し、配列決定に対するアンサンブルアプローチによってマスクされ得る（例えば、Ｐ
ａｔｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｈｉｇｈｌｉｇｈ
ｔｓ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ
ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃ
ｅ．１２５４２５７参照（２０１４年６月１２日にオンラインで公開）。癌細胞は、固形
腫瘍、血液悪性腫瘍、細胞系に由来してもよく、また循環腫瘍細胞として得られてもよく
、また、癌細胞に上記の区分化プロセスを行ってもよい。分析時、個々の細胞配列を単一
の細胞または小さな細胞群に由来するものとして識別して、それらを正常組織細胞配列に
対して区別することができる。さらに、その全開示が全ての目的のために参照によりその
全体が本明細書に組込まれる、２０１４年６月２６日出願の同時係属中の米国仮特許出願
第６２／０１７，８０８号に記載されているように、各細胞から段階的配列情報を得るこ
ともでき、それによって癌細胞内のハプロタイプ変異のより明確な特徴付けを可能にする
。単一細胞分析アプローチは、その全開示が全ての目的のために参照によりその全体が本
明細書に組込まれる、２０１４年６月２６日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６２／
０１７，５８０号に記載されているように、少量の入力核酸を伴うシステム及び方法に特
に有用である。

【0092】

癌細胞分析と同様に、胎児の細胞の分析による胎児の健康または異常の分析及び診断は
、従来の技術を用いた困難な作業である。特に、胎児の細胞試料を採取する羊水穿刺など
の比較的侵襲的な処置がない場合、母体循環からのそれらの細胞の採取を用いることがで
きる。理解されるように、そのような循環胎児細胞は、その循環の全体的な細胞集団の非
常に小さな部分を構成する。その結果、母親の細胞とは対照的に、得られたデータのうち
胎児の細胞に由来する可能性が高いものを特徴付けるために、複雑な分析が行われる。し
かし、本明細書に記載の単一細胞の特徴付け、方法、及びシステムを用いることによって
、個々の細胞に遺伝的構成を帰属させ、それらの細胞を、それぞれの遺伝的構成に基づい
て母親のものまたは胎児のものとして分類することができる。さらに、胎児細胞の遺伝子
配列は、例えば、ダウン症候群、エドワーズ症候群、及びパタウ症候群のような異数性を
含む多くの遺伝的疾患のいずれかを識別するのに使用され得る。

【0093】

より多様な細胞集団から個々の細胞を特徴付ける能力は、環境試験及び法医学分析の両
方において有意な価値があり、サンプルは、サンプルが試験されている細胞、例えば、環
境及び食品安全性試験などのための環境インジケータ生物、毒性生物など、性的暴行、及
び他の暴力犯罪などの法医学分析における犠牲者及び／または加害者細胞に対して、それ
らの性質により、サンプルを「汚染する」細胞及び他の物質の多様な集団から構成され得
る。

【0094】

上記の単一細胞配列決定及び特徴付けプロセスのさらなる有用な応用は、神経科学の研
究及び診断の分野のものである。特に、神経細胞は、各ニューロンをその近傍の細胞とは
異なるものとする、ゲノムの周りを動くことができる長い散在性反復配列（ＬＩＮＥ）ま
たは「ジャンプする」遺伝子を含むことができる。研究により、ヒトの脳内のＬＩＮＥの
数は、８０～３００個の固有の挿入を有する他の組織、例えば心臓及び肝臓組織の数を超
えることが示されている（例えば、Ｃｏｕｆａｌ，Ｎ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ
４６０，１１２７－１１３１（２００９）参照）。これらの相違は、神経疾患に対する個
人の感受性に関連すると考えられており（例えば、Ｍｕｏｔｒｉ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．
Ｎａｔｕｒｅ ４６８，４４３－４４６（２０１０）参照）、または課題に応答する多様
性を脳に与える。したがって、本明細書に記載の方法は、個々の神経細胞の配列決定及び
特徴付けにおいて使用され得る。

【0095】

本明細書に記載の単一細胞分析方法は、ＲＮＡ転写物の識別及びその定量の識別の両方
の点で、上記のような遺伝子発現の分析にも有用である。特に、本明細書に記載の単一細
胞レベル分析法を使用して、個々の細胞、細胞集団、または細胞集団のサブセットに存在
するＲＮＡ転写物を単離して分析することができる。特に、いくつかの場合、バーコード
オリゴヌクレオチドは、プライミングし、複製し、結果として個々の細胞からバーコード
化されたＲＮＡ断片を得るように構成することができる。例えば、いくつかの場合、バー
コードオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ特異的プライミング配列、例えば、逆転写反応ま
たは他の標的プライミング配列においてｍＲＮＡのプライミング及び複製を可能にするポ
リＴプライマーセグメントを含み得る。代替的にまたは追加的に、バーコードオリゴヌク
レオチドのランダムＮ量体プライマーセグメントを用いてランダムＲＮＡプライミングを
実施してもよい。

【0096】

図６は、本明細書に記載の方法を用いた個々の細胞におけるＲＮＡ発現分析のための一
例示的方法の概略図を提供する。図示のように、操作６０２において、細胞を含むサンプ
ルが、生存細胞によって選別され、その後の区分化のために定量化されて希釈される。操
作６０４において、個々の細胞は、本明細書に記載のバーコードオリゴヌクレオチドを有
するゲルビーズと共に別々に区分化される。細胞を溶解し、操作６０６で、バーコード化
されたオリゴヌクレオチドを区分に放出すると、それらは、例えば、ｍＲＮＡのポリＡ尾
部に相補的なポリＴプライマー配列によって、操作６０８でｍＲＮＡと相互作用してハイ
ブリダイズする。ポリＴバーコードオリゴヌクレオチドをプライミング配列として使用し
て、操作６１０で逆転写反応を行い、バーコード配列を含むｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を
合成する。次いで、バーコード化されたｃＤＮＡ転写物は、ｃＤＮＡ配列及びその関連す
るバーコード配列（複数可）の決定のための生物学的配列決定システムに置かれる前に、
操作６１２では、例えばＰＣＲプロセスを使用してさらなる増幅されて、操作６１４では
精製される。いくつかの場合、図示のように、操作６０２～６０８は、試薬がそれらの元
の液滴または区分に残っている間に発生し得、一方操作６１２～６１６は、バルクで（例
えば、区分の外側で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、操作６１２
～６１６を完了させるためにエマルジョンを破壊し、液滴の内容物をプールすることがで
きる。いくつかの場合では、バーコードオリゴヌクレオチドは、エマルジョンが破壊され
た後にエキソヌクレアーゼで分解され得る。エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー消化
後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害され得る。いくつかの場合、操作
６１０は、逆転写混合物、例えば逆転写酵素、と関連する試薬とが共に区分化されること
に基づいて、区分内で行うことができるか、またはバルク内で行うことができる。

【0097】

本明細書の他の箇所に記載されているように、バーコードオリゴヌクレオチドの構造は
、オリゴヌクレオチドバーコード配列に加えて多くの配列要素を含むことができる。上記
のＲＮＡ分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドの一例を図７に示す。図示
のように、全体のオリゴヌクレオチド７０２は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能な
結合７０６によってビーズ７０４に結合されている。オリゴヌクレオチドは、１つまたは
複数のシーケンサー特異的フロー細胞付着配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定シス
テムのＰ５配列、及び配列決定用プライマー配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定シ
ステムのＲ１プライマーを含み得る機能配列７０８などの、後続の処理で使用される機能
配列を含んでもよい。バーコード配列７１０は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに
使用するために構造に含まれる。ポリＴ配列７１２などのｍＲＮＡ特異的プライミング配
列もオリゴヌクレオチド構造に含まれる。ポリＴ配列がｍＲＮＡの配列末端に確実にハイ
ブリダイズするように、アンカー配列セグメント７１４を含むことができる。このアンカ
ー配列は、ヌクレオチドのランダム短配列、例えば、ポリＴセグメントがｍＲＮＡのポリ
Ａ尾部の配列端部においてハイブリダイズする可能性を確実に高めることになる１量体、
２量体、３量体、またはそれ以上の配列を含むことができる。追加配列セグメント７１６
をオリゴヌクレオチド配列内に提供することができる。いくつかの場合、この追加配列は
、例えば、単一のビーズに結合する個々のオリゴヌクレオチドにわたって変化するランダ
ム配列（例えば、ランダムＮ量体配列など）として、固有の分子配列セグメントを提供す
るが、一方、バーコード配列７１０は、個々のビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドの間
で一定であることができる。この固有の配列は、元の発現されたＲＮＡの数の定量を可能
にするために、捕捉された開始ｍＲＮＡ分子の固有の識別子を提供するのに役立つ。理解
されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示され
ているが、個々のビーズは、数万～数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチ
ド分子を含むことができ、ここで、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビー
ズに対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメン
トは個々のビーズにわたって変化することになる。この固有の分子配列セグメントは、オ
リゴヌクレオチドの配列内に５～約８個またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。いく
つかの場合、固有の分子配列セグメントは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチ
ドまたはそれ以上であってよい。いくつかの場合、固有の分子配列セグメントは、長さが
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチドまたはそれ以上であってよい。いくつ
かの場合、固有の分子配列セグメントは、長さが高々２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオ
チドまたはそれ以下であってよい。

【0098】

操作において、図６及び７を参照して、細胞はバーコード担持ビーズと共に区分化され
て溶解されるが、その間、バーコード化オリゴヌクレオチドをビーズから放出される。次
いで、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴ部分は、ｍＲＮＡのポリＡ尾部
にハイブリダイズされ。次いで、ポリＴセグメントは、ｍＲＮＡの逆転写をプライミング
して、ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を生成するが、これには、バーコードオリゴヌクレオチ
ドの配列セグメント７０８～７１６のそれぞれを含まれる。さらに、オリゴヌクレオチド
７０２は、アンカー配列７１４を含むため、ｍＲＮＡのポリＡ尾部の配列末端にハイブリ
ダイズし、そこで逆転写をプライミングする可能性がより高くなる。任意の所与の区分内
で、個々のｍＲＮＡ分子の全てのｃＤＮＡ転写物は、共通のバーコード配列セグメント７
１０を含むことになる。しかし、固有のランダムＮ量体配列を含むことによって、所与の
区分内の異なるｍＲＮＡ分子から作製された転写物は、この固有の配列において変化する
ことになる。これにより、所与の区分の内容物の任意の後続の増幅の後でさえも識別可能
な定量化機能が提供され、例えば、共通のバーコードに関連する固有のセグメントの数は
、単一の区分、したがって単一の細胞から生じるｍＲＮＡの量を示すことができる。上記
のように、ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物の配列を識別し、かつバーコードセグメント及び固
有の配列セグメントを配列決定するために、転写物は増幅され、洗浄され、かつ配列決定
される。

【0099】

本明細書の他の箇所で述べたように、ポリＴプライマー配列が記載されているが、他の
標的またはランダムプライミング配列も、逆転写反応のプライミングに使用することがで
きる。同様に、溶解した細胞の内容物と共にバーコード化されたオリゴヌクレオチドを区
分に放出するものと記載されているが、いくつかの例では、他の細胞内容物からＲＮＡを
容易に分離するために、ゲルビーズ結合オリゴヌクレオチドを使用してゲルビーズの固相
上のｍＲＮＡをハイブリダイズして捕捉することができることを理解されたい。

【0100】

メッセンジャーＲＮＡ（細胞から得られたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ）分析を含むＲＮＡ
分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドのさらなる例を図９Ａに示す。図示
のように、オリゴヌクレオチド９０２全体は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリ
ンカー９０６によってビーズ９０４に結合され得る。オリゴヌクレオチドは、シーケンサ
ー特異的フロー細胞結合配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＰ５配列を
含み得る機能配列９０８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列
決定システムのＲ１プライマー結合部位を含み得る機能配列９１０などの、後続の処理で
使用される機能配列を含んでもよい。バーコード配列９１２は、サンプルＲＮＡをバーコ
ード化するのに使用するために構造内に含まれる。ポリＴ配列９１４などのＲＮＡ特異的
（例えば、ｍＲＮＡ特異的）プライミング配列もオリゴヌクレオチド構造に含まれる。ｍ
ＲＮＡの配列末端でポリＴ配列を確実にハイブリダイズさせるために、アンカー配列セグ
メント（図示せず）を含むことができる。追加配列セグメント９１６をオリゴヌクレオチ
ド配列内に提供することができる。この追加配列は、例えば、単一のビーズに結合する個
々のオリゴヌクレオチドにわたって変化するランダムＮ量体配列として固有の分子配列セ
グメントを提供することができるが、一方でバーコード配列９１２は、個々のビーズに繋
がれたオリゴヌクレオチドの間で一定であることができる。本明細書の他の箇所に記載さ
れているように、この固有の配列は、元の発現されたＲＮＡの数の定量、例えば、ｍＲＮ
Ａ計数を可能にするために、捕捉された開始ｍＲＮＡ分子の固有の識別子を提供するのに
役立つことができる。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドがビーズの表面に繋が
れているものとして示されているが、個々のビーズは、数万～数十万またはさらに数百万
の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合、上記のように、バーコー
ドセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができるが、可
変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。

【0101】

細胞ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分析の例示的な方法において及び図９Ａを参照すると
、細胞は、バーコード担持ビーズ、スイッチオリゴ９２４、ならびに逆転写酵素、還元剤
、及びｄＮＴＰなどの他の試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化
される。操作９５０において、細胞が溶解される間、バーコード化されたオリゴヌクレオ
チド９０２は、（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出され、放出されたバー
コード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されたｍＲＮＡ
９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作９５２において、ポリＴセグメン
ト９１４は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長されて、ｍＲＮＡに
相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、またバーコードオリゴヌクレオチドの配列セグ
メント９０８、９１２、９１０、９１６、及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末
端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）に追加の塩基を添加す
ることができる。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物に添加された追加の
塩基とハイブリダイズして、テンプレートスイッチングを促進し得る。次いで、スイッチ
オリゴ９２４をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることに
よって、スイッチオリゴ配列に相補的な配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができ
る。任意の所定の区分内で、個々のｍＲＮＡ分子の全てのｃＤＮＡ転写物は、共通のバー
コード配列セグメント９１２を含むことになる。しかし、固有のランダムＮ量体配列９１
６を含むことによって、所与の区分内の異なるｍＲＮＡ分子から作製された転写物は、こ
の固有の配列で変化することになる。これによって、本明細書の他の箇所に記載されてい
るように、所与の区分の内容物の後続の任意の増幅の後でさえも識別可能な定量的特徴が
提供され、例えば、共通バーコードに関連する固有のセグメントの数は、単一の区分、従
って単一の細胞から生じるｍＲＮＡの量を示すことができる。操作９５２後、操作９５４
では、ｃＤＮＡ転写物９２２はプライマー９２６（例えば、ＰＣＲプライマー）で増幅さ
れる。次に、増幅された生成物は、操作９５６で、（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲ
Ｉ）によって）精製される。操作９５８において、増幅された生成物は剪断され、さらな
る機能配列に連結され、さらに（例えば、ＰＣＲを介して）増幅される。機能配列は、シ
ーケンサー特異的フロー細胞結合配列９３０、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システ
ムのＰ７配列、及び、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのＲ２プライマーに対す
る配列決定プライマー結合部位を含み得る機能配列９２８、及びサンプルインデックス、
例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのｉ７サンプルインデックス配列を含み得る
機能配列９３２を含み得る。いくつかの場合、操作９５０及び９５２は区分内で発生し得
るが、例えば、区分９５４、９５６、及び９５８は、バルク溶液で（例えば、区分外のプ
ールされた混合物において）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、操作
９５４、９５６、及び９５８を完了させるために、エマルジョンを破壊して、液滴の内容
物をプールすることができる。いくつかの場合、操作９５４は区分内で完了させることが
できる。いくつかの場合、バーコードオリゴヌクレオチドは、エマルジョンが破壊された
後にエキソヌクレアーゼで分解することができる。エキソヌクレアーゼ活性は、プライマ
ー分解後にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって阻害することができる。特定の
配列決定システム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムに使用される特定の配列参照に関
して記載されているが、これらの配列への参照は例示のみを目的とするものであり、本明
細書に記載の方法は、例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒ
ｅ、Ｇｅｎｉａ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎ
ｏｍｉｃｓなどから入手可能なシステムのようなシステムで使用される特異的プライミン
グ、結合、インデックス、及び他の操作配列を組込む他の配列システムと共に使用される
ように構成され得ることを理解されたい。

【0102】

図９Ａに示されるＲＮＡ（例えば、細胞ＲＮＡ）分析に使用するためのバーコードオリ
ゴヌクレクロチドの代替例では、機能配列９０８はＰ７配列であってよく、機能配列９１
０はＲ２プライマー結合部位であってよい。さらに、機能配列９３０はＰ５配列であって
もよく、機能配列９２８はＲ１プライマー結合部位であってもよく、機能配列９３２はＩ
ｌｌｕｍｉｎａ配列決定システムのｉ５サンプルインデックス配列であってもよい。その
ようなバーコードオレオゴクレオチドによって生成された構築物の構成は、配列決定中に
ポリＴ配列の配列決定を最小限に抑える（または回避する）のに役立つ。

【0103】

図９Ｂには、細胞ｍＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されて
いる。この方法では、スイッチオリゴ９２４は、逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなど
の試薬と一緒に、個々の細胞及びバーコード化されたビーズと共に区分（例えば、エマル
ジョン中の液滴）へ区分化される。スイッチオリゴ９２４は、追加のタグ９３４（例えば
、ビオチン）で標識化され得る。操作９５１において、細胞が溶解され、その間、バーコ
ード化されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される）が（例えば、還元
剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であ
り、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であ
り、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴヌ
クレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾
部にハイブリダイズする。次いで、操作９５３において、ポリＴセグメント９１４は、ｍ
ＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長され、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ
転写物９２２を生成し、また、バーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、
９１２、９１０、９１６及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラ
ーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる
。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレート
スイッチングを容易にし得る。次いで、スイッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用
して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることによって、スイッチオリゴ配列に相補的な
配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。次に、区分内の試薬及びオリゴヌク
レオチドから、ｃＤＮＡ転写物９２２を単離するのに、単離操作９６０を使用することが
できる。追加のタグ９３４、例えば、ビオチンを、磁性ビーズ９３８に結合し得る相互作
用タグ９３６、例えば、ストレプトアビジンと接触させることができる。操作９６０にお
いて、操作９５５での増幅（例えば、ＰＣＲによるもの）前のプルダウン操作（例えば、
磁気分離、遠心分離によるもの）、その後の操作９５７での精製（例えば、固相可逆的固
定化（ＳＰＲＩ）によるもの）、及び操作９５９でのさらなる処理（剪断、配列９２８、
９３２、及び９３０の連結、ならびにその後の増幅（例えば、ＰＣＲによるもの））によ
り、ｃＤＮＡを単離することができる。配列９０８がＰ７配列であり、配列９１０がＲ２
プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８は
Ｒ１プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配
列９０８がＰ５配列であり、配列９１０がＲ１プライマー結合部位であるいくつかの場合
、配列９３０はＰ７配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、配列９３
２はｉ７サンプルインデックス配列である。いくつかの場合、図示のように、操作９５１
及び９５３は区分で発生し得るが、操作９６０、９５５、９５７、及び９５９は、バルク
溶液（例えば、パーティシンの外部のプールされた混合物）で発生し得る。区分がエマル
ジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は操作９６０を完了
させるためにプールされ得る。次いで、処理のために転写物をプールした後、操作９６０
に続いて、操作９５５、９５７、及び９５９を実行することができる。

【0104】

図９Ｃには、細胞ｍＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されて
いる。この方法では、スイッチオリゴ９２４は、逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなど
の試薬と一緒に、個々の細胞及びバーコード化されたビーズと共に区分（例えば、エマル
ジョン中の液滴）に共区分化される。操作９６１において、細胞が溶解され、その間バー
コード化されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される）が（例えば、還
元剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列で
あり、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列で
あり、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴ
ヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ
尾部にハイブリダイズする。次に、操作９６３において、ポリＴセグメント９１４は、ｍ
ＲＮＡをテンプレートとして用いる逆転写反応で伸長され、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ
転写物９２２を生成し、また、バーコードオリゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、
９１２、９１０、９１６及び９１４のそれぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラ
ーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる
。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレート
スイッチングを容易にし得る。次いで、スイッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用
して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させることにより、スイッチオリゴ配列に相補的な配
列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことができる。操作９６１及び操作９６３に続いて、
操作９６２でｍＲＮＡ９２０及びｃＤＮＡ転写物９２２が変性される。動作９６４におい
て、第２鎖は、追加のタグ９４２、例えば、ビオチンを有するプライマー９４０から伸長
され、ｃＤＮＡ転写物９２２にハイブリダイズする。また、操作９６４において、ビオチ
ン標識された第２鎖は、磁気ビーズ９３８に付着し得る相互作用タグ９３６、例えばスト
レプトアビジンと接触させることができる。操作９６５での増幅（例えば、ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）によるもの）前のプルダウン操作（例えば、磁気分離、遠心分離による
もの）、その後の操作９６７での精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるも
の）、及び操作９６９でのさらなる処理（剪断、配列９２８、９３２、及び９３０の連結
、ならびにその後の増幅（例えば、ＰＣＲによるもの））によりｃＤＮＡを単離すること
ができる。配列９０８がＰ７配列であり、かつ配列９１０がＲ２プライマー結合部位であ
るいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合部位
であり、配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５配列であ
り、かつ配列９１０がＲ１プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３０はＰ７
配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ７サンプルイ
ンデックス配列である。いくつかの場合、操作９６１及び９６３は区分で発生し得るが、
操作９６２、９６４、９６５、９６７、及び９６９は、バルク（例えば、パーティシンの
外部）で発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され
、液滴の内容物は操作９６２、９６４、９６５、９６７、及び９６９を完了させるために
プールされ得る。

【0105】

図９Ｄには、細胞ｍＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されて
いる。この方法では、スイッチオリゴ９２４は、逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなど
の試薬と一緒に、個々の細胞及びバーコード化されたビーズと共に区分化される。操作９
７１において、細胞が溶解され、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチド９０２（
例えば、図９Ａに示される）が（例えば、還元剤の作用によって）ビーズから放出される
。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であり、配列９１０はＲ２プライマー結合部位
である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であり、配列９１０はＲ１プライマー結合部位
である。次に、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメント９１４は、
細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作９７
３において、ポリＴセグメント９１４は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反
応で伸長され、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、また、バーコードオ
リゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６及び９１４のそれぞ
れも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポリ
Ｃ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９２４は、ｃＤＮ
Ａ転写物とハイブリダイズし、テンプレートスイッチングを容易にし得る。次いで、スイ
ッチオリゴ９２４をテンプレートとして使用して、ｃＤＮＡ転写物９２２を伸長させるこ
とによって、スイッチオリゴ配列に相補的な配列をｃＤＮＡ転写物９２２に組込むことが
できる。操作９６６で、ｍＲＮＡ９２０、ｃＤＮＡ転写物９２２、及びスイッチオリゴ９
２４を変性させることができ、かつｃＤＮＡ転写物９２２を追加のタグ９４６、例えばビ
オチンで標識された捕捉オリゴヌクレオチド９４４とハイブリダイズさせることができる
。この操作では、ｃＤＮＡ転写体にハイブリダイズしたビオチン標識された捕捉オリゴヌ
クレオチド９４４を、磁気ビーズ９３８に付着し得る、相互作用タグ９３６、例えば、ス
トレプトアビジンと接触させることができる。プルダウン操作（例えば、磁気分離、遠心
分離によるもの）を使用して他の種（例えば、過剰のバーコード化オリゴヌクレオチド）
から分離させた後、ｃＤＮＡ転写物を、（例えば、ＰＣＲによって）、操作９７５のプラ
イマー９２６、それに続く操作９７７での精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）
によるもの）及び操作９７９でのさらなる処理（剪断、配列９２８、９３２、及び９３０
の連結、ならびにその後の増幅（例えば、ＰＣＲによるもの））によりで増幅させること
ができる。配列９０８がＰ７配列であり、かつ配列９１０がＲ２プライマー結合部位であ
るいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合部位
であり、配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５配列であ
り、かつ配列９１０がＲ１プライマー結合部位である他の場合、配列９３０はＰ７配列で
あり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、配列９３２はｉ７サンプルインデッ
クス配列である。いくつかの場合、操作９７１及び９７３は区分で発生し得るが、操作９
６６、９７５、９７７（精製）、及び９７９は、バルク（例えば、区分の外部）で発生し
得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物
は操作９６６、９７５、９７７、及び９７９を完了させるためにプールされ得る。

【0106】

図９Ｅには、細胞ＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析のための別の例示的な方法が示されてい
る。この方法では、個々の細胞は、バーコード担持ビーズ、スイッチオリゴ９９０、なら
びに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と共に区分（例えば、エマルジョン中
の液滴）に区分化される。操作９８１において、細胞が溶解され、その間、バーコード化
されたオリゴヌクレオチド９０２（例えば、図９Ａに示される９０２）が（例えば、還元
剤の作用によって）ビーズから放出される。いくつかの場合、配列９０８はＰ７配列であ
り、配列９１０はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列９０８はＰ５配列であ
り、配列９１０はＲ１プライマー結合部位である。次に、放出されたバーコードオリゴヌ
クレオチドのポリＴセグメントは、細胞から放出されるｍＲＮＡ９２０のポリＡ尾部にハ
イブリダイズする。次に、操作９８３において、ポリＴセグメントは、次いで、逆転写反
応で伸長されて、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写物９２２を生成し、またバーコードオ
リゴヌクレオチドの配列セグメント９０８、９１２、９１０、９１６、及び９１４のそれ
ぞれも含む。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（例えば、ポ
リＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、スイッチオリゴ９９０は、ｃＤ
ＮＡ転写物とハイブリダイズし、テンプレートスイッチングを容易にし得る。スイッチオ
リゴ配列に相補的であり、かつＴ７プロモーター配列を含む配列をｃＤＮＡ転写物９２２
に組込むことができる。操作９６８では、第２鎖を合成し、操作９７０では、Ｔ７プロモ
ーター配列を、Ｔ７ポリメラーゼによって使用して、インビトロ転写においてＲＮＡ転写
物を生成することができる。操作９８５では、ＲＮＡ転写産物を（例えば、固相可逆的固
定化（ＳＰＲＩ）により）精製し、逆転写してＤＮＡ転写物を形成し、第２鎖をＤＮＡ転
写物の各々に合わせて合成することができる。いくつかの場合、精製前に、ＲＮＡ転写物
をＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮＡａｓｅ Ｉ）と接触させて、残留ＤＮＡを分解することが
できる。操作９８７において、ＤＮＡ転写物は断片化され、配列９２８、９３２、及び９
３０などの追加の機能配列に連結され、いくつかの場合、（例えば、ＰＣＲにより）さら
に増幅される。配列９０８がＰ７配列であり、かつ配列９１０がＲ２プライマー結合部位
であるいくつかの場合、配列９３０はＰ５配列であり、配列９２８はＲ１プライマー結合
部位であり、かつ配列９３２はｉ５サンプルインデックス配列である。配列９０８がＰ５
配列であり、かつ配列９１０がＲ１プライマー結合部位であるいくつかの場合、配列９３
０はＰ７配列であり、配列９２８はＲ２プライマー結合部位であり、かつ配列９３２はｉ
７サンプルインデックス配列である。いくつかの場合、ＤＮＡ転写物の一部を除去する前
に、ＤＮＡ転写物をＲＮａｓｅと接触させて残留ＲＮＡを分解することができる。いくつ
かの場合、操作９８１及び９８３は区分内で発生し得るが、操作９６８、９７０、９８５
、及び９８７はバルクで（例えば区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴で
ある場合、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物は、操作９６８、９７０、９８５、及
び９８７を完了するためにプールされ得る。

【0107】

メッセンジャーＲＮＡ（細胞から得たｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ）分析を含む、ＲＮＡ分
析に使用するバーコードオリゴヌクレオチドの別の例を図１０に示す。図示のように、全
体的なオリゴヌクレオチド１００２は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリンケー
ジ１００６によってビーズ１００４に結合される。オリゴヌクレオチドは、後続の処理に
おいて使用される機能配列、例えば、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えばＰ
７配列を含み得る機能配列１００８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ２プライ
マー結合部位を含み得る機能配列１０１０を含み得る。バーコード配列１０１２は、サン
プルＲＮＡをバーコード化するのに使用するための構造内に含まれる。ポリＴ配列１０１
４などのＲＮＡ特異的（例えば、ｍＲＮＡ特異的）プライミング配列は、オリゴヌクレオ
チド構造に含まれ得る。ポリＴ配列がｍＲＮＡの配列末端で確実にハイブリダイズするよ
うに、アンカー配列セグメント（図示せず）が含まれ得る。追加配列セグメント１０１６
が、オリゴヌクレオチド配列内に提供されてもよい。この追加配列は、本明細書の他の箇
所に記載されているように、固有の分子配列セグメントを提供することができる。さらな
る機能配列１０２０、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、インビトロ転
写のために含まれ得る。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋
がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万～数十万またはさらに数百
万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができるが、この場合、上記のように、バ
ーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができる
が、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。

【0108】

細胞ＲＮＡ分析の例示的な方法において、図１０を参照すると、細胞は、バーコード担
持ビーズ、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの試薬と共に、区分（例えば
、エマルジョン中の液滴）に区分化される。操作１０５０において、細胞が溶解されるが
、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチド１００２が（例えば、還元剤の作用によ
り）ビーズから放出され、放出されたバーコードオリゴヌクレオチドのポリＴセグメント
１０１４がｍＲＮＡ１０２０のポリＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作１０５２に
おいて、ポリＴセグメントは、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長さ
せてｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物１０２２を生成し、またバーコードオリゴヌクレオチドの
配列セグメント１０２０、１００８、１０１２、１０１０、１０１６、及び、１０１４の
それぞれも含む。任意の所与の区分内で、個々のｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写物の全ては
、共通のバーコード配列セグメント１０１２を含むことになる。しかし、固有のランダム
Ｎ量体配列を含むことにより、所与の区分内の異なるｍＲＮＡ分子から作製された転写物
は、この固有の配列で変化することになる。これは、本明細書の他の箇所に記載されてい
るように、所与の区分の内容物のその後の任意の増幅の後でさえも識別可能な定量的特徴
を提供し、例えば、共通バーコードに関連する固有のセグメントの数は、単一の区分、従
って単一の細胞から生じるｍＲＮＡの量を示すことができる。操作１０５４において、第
２鎖が合成され、操作１０５６において、Ｔ７ポリメラーゼによってＴ７プロモーター配
列が使用されて、インビトロ転写においてＲＮＡ転写物を生成することができる。操作１
０５８において、転写物は断片化され（例えば、剪断され）、さらなる機能配列に連結さ
れて、逆転写される。機能配列は、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列１０３０、例
えばＰ５配列、及び配列決定プライマー、例えば、Ｒ１プライマー結合配列を含み得る機
能配列１０２８、及びサンプルインデックス、例えば、ｉ５サンプルインデックス配列を
含み得る機能配列１０３２を含み得る。操作１０６０では、ＲＮＡ転写物はＤＮＡに逆転
写され、そのＤＮＡは（例えば、ＰＣＲにより）増幅され、配列決定されて、ｍＲＮＡの
ｃＤＮＡ転写物の配列を識別し、かつバーコードセグメント及び固有の配列セグメントを
配列決定することができる。いくつかの場合、操作１０５０及び１０５２は区分内で発生
し得るが、操作１０５４、１０５６、１０５８、及び１０６０はバルクで（例えば、区分
外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合、エマルジョンは破壊され、
液滴の内容物は、操作１０５４、１０５６、１０５８、及び１０６０を完了するためにプ
ールされ得る。

【0109】

図１０に示すＲＮＡ（例えば、細胞ＲＮＡ）分析に使用するためのバーコードオリゴヌ
クレオチドの代替例では、機能的配列１００８はＰ５配列であってもよく、機能的配列１
０１０はＲ１プライマー結合部位あってもよい。さらに、機能配列１０３０はＰ７配列で
あってもよく、機能配列１０２８はＲ２プライマー結合部位であってもよく、機能配列１
０３２はｉ７サンプルインデックス配列であってもよい。

【0110】

メッセンジャーＲＮＡ（細胞から得たｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ）分析を含む、ＲＮＡ分
析に使用するバーコードオリゴヌクレオチドのさらなる例を図１１に示す。図示のように
、全体的なオリゴヌクレオチド１１０２は、ジスルフィドリンカーなどの放出可能なリン
ケージ１１０６によってビーズ１１０４に結合される。オリゴヌクレオチドは、後続の処
理において使用される機能配列、例えば、シーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例え
ばＰ５配列を含み得る機能配列１１０８、及び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ１プ
ライマー結合部位を含み得る機能配列１１１０を含み得る。いくつかの場合、配列１１０
８はＰ７配列であり、配列１１１０はＲ２プライマー結合部位である。バーコード配列１
１１２は、サンプルＲＮＡをバーコード化するのに使用するための構造内に含まれる。追
加配列セグメント１１１６は、オリゴヌクレオチド配列内に提供されてもよい。いくつか
の場合、この追加配列は、本明細書の他の箇所に記載されているように、固有の分子配列
セグメントを提供することができる。さらなる配列１１１４、例えばポリＧが、テンプレ
ートスイッチングを促すために含まれてもよい。理解されるように、単一オリゴヌクレオ
チドはビーズの表面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万～
数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合
上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定で
あることができるが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化す
ることになる。

【0111】

細胞ＲＮＡ分析の例示的な方法において、図１１を参照すると、細胞は、バーコード担
持ビーズ、ポリＴ配列、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどの他の試薬と共
に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。操作１１５０において、細
胞が溶解され、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作
用により）ビーズから放出され、ポリＴ配列が細胞から放出されたｍＲＮＡ１１２０のポ
リＡ尾部にハイブリダイズする。次に、操作１１５２において、ポリＴ配列は、ｍＲＮＡ
をテンプレートとして用いた逆転写反応で伸長されて、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ転写
物１１２２を生成する。逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性は、ｃＤＮＡ転写物（
例えば、ポリＣ）にさらなる塩基を添加することができる。次いで、ｃＤＮＡ転写体に添
加された追加の塩基、例えばポリＣは、バーコード化されたオリゴヌクレオチドの１１１
４とハイブリダイズすることができる。これによって、テンプレートスイッチングを容易
にすることができ、バーコードオリゴヌクレオチドに相補的な配列をｃＤＮＡ転写物に組
込むことができる。転写物は、さらに処理され（例えば、増幅され、部分除去され、追加
配列が追加されるなど）、本明細書の他の箇所に記載されているように、例えば、配列決
定によって特徴付けされ得る。そのような方法によって生成された構築物の構成は、配列
決定中のポリＴ配列の配列決定を最小限にする（または回避する）のに役立つ。

【0112】

細胞ＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析で使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドのさ
らなる例を図１２Ａに示す。図示のように、オリゴヌクレオチド１２０２全体は、ジスル
フィドリンカーなどの放出可能なリンケージ１２０６によってビーズ１２０４に結合され
ている。オリオゴヌクレオチドは、その後の処理で使用される機能配列、例えば、シーケ
ンサー特異的フロー細胞結合配列、例えば、Ｐ５配列を含み得る機能配列１２０８、及び
配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ１プライマー結合部位を含み得る機能配列１２１０
を含み得る。いくつかの場合、配列１２０８はＰ７配列であり、配列１２１０はＲ２プラ
イマー結合部位である。バーコード配列１２１２は、サンプルＲＮＡをバーコード化する
のに使用するための構造内に含まれる。追加配列セグメント１２１６は、オリゴヌクレオ
チド配列内に提供されてもよい。いくつかの場合、この追加配列は、本明細書の他の箇所
に記載されているように、固有の分子配列セグメントを提供することができる。理解され
るように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表面に繋がれているものとして示されてい
るが、個々のビーズは、数万～数十万またはさらに数百万の個々のオリゴヌクレオチド分
子を含むことができ、この場合、上記のように、バーコードセグメントは、所与のビーズ
に対して一定または比較的一定であることができるが、可変または固有の配列セグメント
は個々のビーズにわたって変化することになる。このバーコードを用いた例示的細胞ＲＮ
Ａ分析法では、細胞は、バーコード担持ビーズならびにＲＮＡリガーゼ及び還元剤などの
他の試薬と共に区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。細胞が溶解され
、その間バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用によって）ビ
ーズから放出される。次いで、バーコード化オリゴヌクレオチドは、区分中にある間に、
ＲＮＡリガーゼによってｍＲＮＡ転写物の５’末端に連結され得る。後続の操作には、精
製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）及びさらなる処理（剪断、機能
配列の連結、及び続く増幅（例えばＰＣＲによるもの））を含んでもよく、これらの操作
は、バルクで（例えば、区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴である場合
、エマルジョンは破壊され、液滴の内容物はさらなる操作のためにプールされ得る。

【0113】

細胞ＲＮＡ分析を含むＲＮＡ分析に使用するためのバーコードオリゴヌクレオチドのさ
らなる例を図１２Ｂに示す。図示のように、オリゴヌクレオチド１２２２全体は、ジスル
フィドリンカーなどの放出可能なリンケージ１２２６によってビーズ１２２４に結合され
ている。オリオゴヌクレオチドは、後続の処理において使用される機能配列、例えば、シ
ーケンサー特異的フロー細胞結合配列、例えばＰ５配列を含み得る機能配列１２２８、及
び配列決定プライマー配列、例えば、Ｒ１プライマー結合部位を含み得る機能配列１２３
０などを含み得る。いくつかの場合、配列１２２８はＰ７配列であり、配列１２３０はＲ
２プライマー結合部位である。バーコード配列１２３２は、サンプルＲＮＡをバーコード
化するのに使用するために構造内に含まれる。プライミング配列１２３４（例えば、ラン
ダムプライミング配列）もオリゴヌクレオチド構造、例えば、ランダム六量体に含まれ得
る。さらなる配列セグメント１２３６は、オリゴヌクレオチド配列内に提供され得る。い
くつかの場合、この追加配列は、本明細書の他の箇所に記載されているように、固有の分
子配列セグメントを提供する。理解されるように、単一オリゴヌクレオチドはビーズの表
面に繋がれているものとして示されているが、個々のビーズは、数万～数十万またはさら
に数百万の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むことができ、この場合、上記のように、
バーコードセグメントは、所与のビーズに対して一定または比較的一定であることができ
るが、可変または固有の配列セグメントは個々のビーズにわたって変化することになる。
図１２Ｂのバーコードオリゴヌクレオチドを用いた例示的な細胞 ｍＲＮＡ分析法では、
細胞は、バーコード担持ビーズ、ならびに逆転写酵素、還元剤、及びｄＮＴＰなどのさら
なる試薬と共に、区分（例えば、エマルジョン中の液滴）に区分化される。細胞が溶解さ
れ、その間、バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用により）
ビーズから放出される。いくつかの場合、配列１２２８はＰ７配列であり、配列１２３０
はＲ２プライマー結合部位である。他の場合、配列１２２８はＰ５配列であり、配列１２
３０はＲ１プライマー結合部位である。ランダム六量体のプライミング配列１２３４は、
細胞のｍＲＮＡをランダムにハイブリダイズすることができる。ランダム六量体配列は、
細胞からのｍＲＮＡをテンプレートとして用いて逆転写反応で伸長させて、ｍＲＮＡに相
補的なｃＤＮＡ転写物を生成することができ、またバーコードオリゴヌクレオチドの配列
セグメント１２２８、１２３２、１２３０、１２３６、及び１２３４のそれぞれも含む。
その後の操作には、精製（例えば、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）によるもの）、さらな
る処理（剪断、機能配列の連結、及び続く増幅（例えばＰＣＲによるもの））を含み、こ
れらの操作は、バルクで（例えば、区分外で）発生し得る。区分がエマルジョン中の液滴
である場合、エマルジョンは破壊されて、液滴の内容物はさらなる操作のためにプールさ
れる。バーコード担持ビーズと共に区分化され得る追加の試薬には、細胞由来のゲノムＤ
ＮＡ及びｃＤＮＡを分解するためにリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びヌクレアーゼをブ
ロックするオリゴヌクレオチドが含まれ得る。代替として、さらなる処理操作中にｒＲＮ
Ａ除去剤を適用してもよい。そのような方法によって生成された構築物の構成は、配列決
定中のポリＴ配列の配列決定を最小限にする（または回避する）のに役立つ。

【0114】

本明細書に記載の単一細胞分析法は、トランスクリプトーム全体の分析にも有用であり
得る。図１２Ｂのバーコードを再び参照すると、プライミング配列１２３４は、ランダム
Ｎ量体であり得る。いくつかの場合、配列１２２８はＰ７配列であり、配列１２３０はＲ
２プライマー結合部位である。他の場合、配列１２２８はＰ５配列であり、配列１２３０
はＲ１プライマー結合部位である。このバーコードを用いた全トランスクリプトーム解析
の例示的方法では、個々の細胞は、バーコード担持ビーズ、ポリＴ配列、ならびに逆転写
酵素、ポリメラーゼ、還元剤、及びｄＮＴＰなどの他の試薬と共に、区分（例えば、エマ
ルジョン中の液滴）に共区分化される。この方法の操作では、細胞が溶解され、その間、
バーコード化されたオリゴヌクレオチドが（例えば、還元剤の作用により）ビーズから放
出され、ポリＴ配列は細胞ｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。テンプレートと
してｍＲＮＡを用いた逆転写反応では、細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を生成することが
できる。次いでＲＮＡをＲＮａｓｅで分解することができる。次いで、バーコード化され
たオリゴヌクレオチドのプライミング配列１２３４は、ｃＤＮＡ転写物にランダムにハイ
ブリダイズすることができる。オリオゴヌクレオチドは、図３に示したものと同様のビー
ズ及び細胞と共に区分化されたポリメラーゼ酵素及び他の伸長試薬を用いて伸長させて、
図３（パネルＦ）に示した例示的な増幅生成物と同様の増幅生成物（例えば、バーコード
化された断片）を生成することができる。バーコード化された核酸断片では、いくつかの
場合、例えば、配列分析により、特徴付けされるさらなる処理（例えば、本明細書の他の
箇所に記載された増幅、さらなる配列の添加、洗浄処理など）を行ってもよい。この操作
では、シーケンシングシグナルは完全長ＲＮＡに由来し得る。

【0115】

様々なバーコードデザインの操作が個別に検討されているが、個々のビーズは、同時に
使用することができる様々なデザインのバーコードオリゴヌクレオチドを含むことができ
る。

【0116】

より大きな集団からの個々の細胞または細胞サブ集団を特徴付けることに加えて、本明
細書に記載のプロセス及びシステムは、細胞または他の生物集団の全体的なプロファイル
を提供する方法として個々の細胞を特徴付けるのにも使用され得る。様々な用途では、例
えば、マイクロバイオーム分析及び特徴付け、環境試験、食品安全性試験、例えば、汚染
の追跡における疫学的分析などを含む、細胞集団内の異なる細胞または生物型の存在及び
定量の評価が必要とされる。特に、上記の分析プロセスは、集団内の多数の個々の細胞を
個別に特徴付する、配列決定する、かつ／または識別するのに使用され得る。次いで、こ
の特徴付けを使用して、元の集団の全体的なプロファイルをアセンブルし、それによって
重要な予後及び診断情報を提供することができる。

【0117】

例えば、腸、頬、表皮マイクロバイオームなどを含むヒトのマイクロバイオームのシフ
トは、異なる病態または健康状態の診断及び予後の両方として識別されている。本明細書
に記載の単一細胞分析方法及びシステムを使用して、全体の集団における個々の細胞をさ
らに特徴付けし、配列決定し、かつ識別して、診断集団関連因子を示し得るその集団内の
シフトを識別することができる。例として、バクテリアの分類学的分類のための非常に正
確な方法として、細菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定が用いられてきた。上記
の標的化された増幅及び配列決定プロセスを使用して、細胞の集団内の個々の細胞の識別
を提供することができる。ある集団内の異なる細胞の数をさらに定量化して、現在の状態
または経時的な状態の変化を識別することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ．ａｌ
，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２，８
（１２）：ｅ１００２８０８、及びＲａｍ ｅｔ ａｌ，Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒ
ｏｄ．Ｍｅｄ．，Ｊｕｎｅ ２０１１，５７（３）：１６２－１７０（それぞれが、全て
の目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい。同様に、
感染または潜在的な感染の識別及び診断も、本明細書に記載の単一細胞分析の利益を享受
して、例えば、上記の環境、及び任意の他の診断上関連する環境、例えば、脳脊髄液、血
液、糞便または腸サンプルなどを含む、他の細胞または他の生物学的物質、細胞及び／ま
たは核酸の大きな混合物中に存在する微生物種を識別するものであってよい。

【0118】

前述の分析は、所与のサンプルの細胞集団にわたる異なる耐性マーカー／変異の分布及
びプロファイリングの分析による、異なる細胞、例えば、癌細胞、細菌病原体などの潜在
的薬物耐性の特徴付けにも特に有用であり得る。さらに、これらのマーカー／変異の経時
的変化を特徴付けることによって、そのような薬物耐性の問題によって特徴付けされる様
々な疾患の進行、改変、予防、及び治療についての貴重な洞察を得ることができる。

【0119】

細胞の観点で記載されているが、例えば、細胞、ウイルス、細胞小器官、細胞内封入体
、小胞、小胞体などを含む様々な個々の生物学的生物または生物の構成要素のいずれかは
、本記載に包含されることが理解される。さらに、細胞を参照する場合、そのような参照
には、単細胞に由来するかまたは多細胞生物に由来するかにかかわらず、原核細胞、真核
細胞、細菌、真菌、植物、哺乳類、または他の動物細胞タイプ、マイコプラズマ、正常組
織細胞、腫瘍細胞、もしくは任意の他の細胞タイプを含むがこれらに限定されない、任意
のタイプの細胞が含まれることが理解される。

【0120】

同様に、微生物、ウイルス、またはそのようなサンプル中に存在する他の生物学的汚染
物質をプロファイリングするための異なる環境のサンプルの分析は、疾患の疫学に関する
重要な情報を提供し、疾患の発生、流行及びパンデミックの予測に役立つ可能性がある。

【0121】

上記のように、本明細書に記載の方法、システム、及び組成物は、個々の細胞または細
胞集団の他の態様の分析及び特徴付けにも使用することができる。一例示的プロセスでは
、それらの細胞表面タンパク質に関して分析されて特徴付けされる細胞を含むサンプルが
提供される。また、細胞が特徴付けされる細胞表面タンパク質または抗原(または他の細
胞の特徴)(本明細書では細胞表面特徴結合基とも呼ばれる)に対する結合親和性を有する
抗体、抗体断片、または他の分子のライブラリーも提供される。考察を容易にするために
、これらの親和性基を本明細書では結合基と呼ぶ。結合基は、結合基が結合する細胞表面
の特徴を示すレポーター分子を含むことができる。特に、１つのタイプの細胞表面特徴に
特異的な結合基タイプは第１のレポーター分子を含むことになり、異なる細胞表面特徴に
特異的な結合基タイプはそれと関連する異なるレポーター分子を有することになる。いく
つかの態様では、これらのレポーター分子は、オリゴヌクレオチド配列を含むことになる
。オリゴヌクレオチドベースのレポーター分子は、配列に関する有意な多様性をもたらし
ながら、ほとんどの生体分子、例えば、抗体などに容易に結合することができ、かつ例え
ば、配列決定技術またはアレイ技術を用いて容易に検出することができるという利点を提
供する。例示的プロセスでは、結合基は、それらに結合したオリゴヌクレオチドを含む。
したがって、第１の結合基タイプ、例えば、第１のタイプの細胞表面特徴に対する抗体は
、それと結合する、第１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを有することに
なる。異なる結合基タイプ、例えば、他の異なる細胞表面特徴に対する結合親和性を有す
る抗体は、それと結合する、異なるヌクレオチド配列、例えば、部分的にまたは完全に異
なるヌクレオチド配列を含むレポーターオリオゴヌクレオチドを有することになる。いく
つかの場合、各タイプの細胞表面特徴結合基、例えば、抗体または抗体断片に関して、レ
ポーターオリオゴヌクレオチド配列は公知のものであり、公知の細胞表面特徴結合基と結
合していると容易に識別することができるものである。これらのオリゴヌクレオチドは、
結合基に直接結合していても、ビーズ、分子格子、例えば、直鎖状、球状、架橋型、また
は他のポリマー、または複数のレポーターオリゴヌクレオチドを単一の結合基と付着させ
る結合基に付着しているかもしくはさもなければそれと結合している他のフレームワーク
に付着していてもよい。

【0122】

単一の結合基に結合した複数のレポーター分子の場合、そのようなレポーター分子は同
じ配列を含むことができるか、または特定の結合基はレポーターオリゴヌクレオチド配列
の公知のセットを含むことになる。例えば、異なる結合基間では異なる細胞表面特徴に特
異的であるため、レポーター分子は異なるものであってよく、かつ特定の結合基に帰属可
能なものであってよい。

【0123】

レポーター基の結合基への結合は、様々な直接的または間接的な、共有結合性または非
共有結合性の結合または付着のいずれかによって達成され得る。例えば、抗体ベースの結
合基に結合したオリゴヌクレオチドレポーター基の場合、そのようなオリゴヌクレオチド
は、化学的コンジュゲーション技術（例えば、Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓか
らから入手可能なＬｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ（登録商標）抗体標識化キット）、なら
びに例えば、アビジンまたはストレプトアビジンリンカーによるビオチン化抗体及びオリ
ゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドに結合した、１つまたは複数のビオチン化リ
ンカーを含むビーズ）を使用した他の非共有結合機構を使用して抗体または抗体断片の一
部に共有結合させてもよい。抗体及びオリゴヌクレオチドビオチニル化技術が利用可能で
ある（例えば、Ｆａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｌｕｏｒｉｄｅ－Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｂｉ
ｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｆｏｒ ５’－ｅｎｄ－Ｌ
ａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．Ｊａｎ １５，２００３；３１（２）：７０８－７１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃから入手可能なＤＮＡ ３’ Ｅｎｄ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（これらの全開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる）
を参照されたい）。同様に、タンパク質及びペプチドのビオチン化技術が開発されており
、容易に利用可能である（例えば、米国特許第６，２６５，５５２号（この全開示は、全
ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組込まれる）を参照されたい）。

【0124】

所望のレポーター分子または所与の分析の多様性、使用される配列検出スキームなどに
応じて任意の範囲の異なる長さを有するレポーターオリゴヌクレオチドが提供され得る。
いくつかの場合、これらのレポーター配列は、長さが約５ヌクレオチド超、長さが約１０
ヌクレオチド超、長さが約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、
１２０、１５０、またはさらに２００ヌクレオチド超であってよい。いくつかの場合、こ
れらのレポーターヌクレオチドは、長さが約２５０ヌクレオチド未満、約２００、１８０
、１５０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、またはさらに３０ヌ
クレオチド未満であってもよい。多くの場合、レポーターオリゴヌクレオチドは、既にサ
イズ決定されており、かつさもなければ配列決定システムで分析されるように構成された
バーコード化生成物を提供するように選択することができる。例えば、これらの配列は、
理想的には、特定の配列決定システムに対して所望の長さの配列決定可能な生成物を生成
する長さで提供され得る。同様に、これらのレポーターオリゴヌクレオチドは、レポータ
ー配列に加えて、シーケンサー結合配列、シーケンシングプライマー配列、増幅プライマ
ー配列、またはこれらのいずれかに対する相補体などのさらなる配列要素を含み得る。

【0125】

操作中、所望される細胞表面特徴のいずれかを分析するために、細胞含有サンプルを、
結合分子及びその関連するレポーターオリゴヌクレオチドと共にインキュベートする。イ
ンキュベーション後、細胞を洗浄して結合していない結合基を除去する。洗浄後、細胞は
、上述のバーコード担持ビーズとともに、別個の区分、例えば、液滴に区分化されるが、
この場合、それぞれの区分は、限られた数の細胞、例えば、くつかの場合、単一細胞を含
む。ビーズからバーコードを解放すると、それらはレポーターオリゴヌクレオチドの増幅
及びバーコード化をプライミングすることになる。上記のように、レポーター分子のバー
コード化複製物は、プライマー配列、結合配列などの機能配列をさらに含み得る。

【0126】

次いで、バーコード化レポーターオリゴヌクレオチドで、配列分析を行い、どのレポー
ターオリゴヌクレオチドが区分内の細胞に結合しているかを識別する。さらに、関連する
バーコード配列を配列決定することによっても、所与の細胞表面特徴が、そのレポーター
配列が同じバーコード配列を含む、すなわち、同じ区分由来である他の異なる細胞表面特
徴と同じ細胞に由来した可能性が高いことを識別することができる。

【0127】

次いで、バーコード配列の存在に基づく個々の区分から生じるレポーター分子に基づい
て、細胞集団からの個々の細胞の細胞表面プロファイルを作製することができる。個々の
細胞または細胞集団のプロファイルは、診断上関連性のある情報を提供し得る細胞表面特
徴の変化を識別するために、他の細胞、例えば「正常な」細胞からのプロファイルと比較
され得る。特に、これらのプロファイルは、癌及び他の障害などの細胞表面受容体の変化
によって特徴付けされる様々な疾患の診断に特に有用であり得る。

【0128】

ＩＶ．装置とシステム
本明細書では、上記のように細胞を区分化するのに使用されるマイクロ流体装置も提供
される。このようなマイクロ流体装置は、図１及び２に示されるような区分化プロセスを
実行するためのチャンネルネットワークを含むことができる。特に有用なマイクロ流体装
置の例は、２０１４年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／９７７，８０４号に
記載されており、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。簡潔
には、これらのマイクロ流体装置は、細胞を別個の細胞に区分化させるために、かつその
ような細胞を、例えば、ビーズ上に配置されたオリゴヌクレオチドバーコードライブラリ
ーメンバーと共に区分化させるために、本明細書に記載されているものなどのチャンネル
ネットワークを備えることができる。これらのチャンネルネットワークは、固体ボディ、
例えば、チャンネルが画定されるガラス、半導体またはポリマーのボディ構造内に配置す
ることができるが、この場合、それらのチャンネルは、その端部で、例えば、チャンネル
ネットワークの出力から、様々な入力流体を受容するために、かつ区分化された細胞を最
終的に堆積させるために、端部で容器と連通する。例として、図２を参照すると、チャン
ネル２０２と流体連結する容器には、細胞２１４の水性懸濁液が提供されてもよく、チャ
ンネル２０４に連結する容器には、オリゴヌクレオチドを担持するビーズ２１６の水性懸
濁液が提供されてもよい。チャンネルセグメント２０６及び２０８には、非水性溶液、例
えば油が供給されてもよく、この中に水性流体がチャンネル接合部２１２において液滴と
して区分化される。最終的に、排出容器を、チャンネル２１０に流体連結させて、そこに
区分化された細胞及びビーズを送達することができ、かつそこからそれらを採取してもよ
い。理解されるように、容器として記載されているが、チャンネルセグメントは、他のシ
ステムの配管、マニホールド、または流体構成要素を含む様々な異なる流体源または受容
構成要素のいずれかに連結され得ることが理解されるであろう。

【0129】

チャンネルネットワークを介して、例えば、加えられた圧力差、遠心力、動電ポンピン
グ、毛細管、または重力流などによって、これらの流体の流れを制御するシステムも提供
される。

【0130】

Ｖ．キット
本明細書では、個々の細胞または細胞の小さな集団を分析するためのキットも提供され
る。キットには、水性緩衝液及び非水性区分化流体または油の両方を含む、最大１つ、２
つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の全ての区分化流体、本明細書に記載のようにビ
ーズと放出可能に結合している核酸バーコードライブラリー、マイクロ流体装置、細胞を
破壊し、核酸を増幅させ、かつ細胞の核酸の断片またまたはその複製物にさらなる機能配
列を提供するための試薬、ならびに本明細書に記載の方法で上述のいずれかのものを使用
するための説明書が含まれ得る。

【0131】

ＶＩ．コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされているコンピュータ制御シス
テムを提供する。図１７は、核酸配列決定方法、核酸配列データの解釈及び細胞核酸、Ｒ
ＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）などの分析、ならびに配列データから細胞を特徴付けることを
含む、本開示の方法を実施するようにプログラムされているかまたはさもなければ構成さ
れている、コンピュータシステム１７０１を示す。コンピュータシステム１７０１は、電
子デバイスに対して遠隔に配置されたユーザーまたはコンピュータシステムの電子デバイ
スであってよい。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであってよい。

【0132】

コンピュータシステム１７０１は、単一コアもしくはマルチコアプロセッサー、または
並列処理のための複数のプロセッサーであってよい中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では
「プロセッサー」及び「コンピュータプロセッサー」とも記載される）１７０５を備える
。コンピュータシステム１７０１は、メモリまたはメモリ場所１７１０（例えば、ランダ
ムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１７１５
（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信イン
ターフェース１７２０（例えば、ネットワークアダプター）、ならびにキャッシュ、他の
メモリ、データ記憶装置、及び／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺装置１７
２５を備える。メモリ１７１０、記憶装置１７１５、インターフェース１７２０、及び周
辺装置１７２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１７０５と通信
する。記憶装置１７１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポ
ジトリ）であってよい。コンピュータシステム１７０１は、通信インターフェース１７２
０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１７３０に動作可能に連結す
ることができる。ネットワーク１７３０は、インターネット、インターネット及び／もし
くはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネット及び／もし
くはエクストラネットであってよい。ネットワーク１７３０は、いくつかの場合、電気通
信及び／またはデータネットワークである。ネットワーク１７３０は、クラウドコンピュ
ーティングなどの分散コンピューティングを有効にすることができる１つまたは複数のコ
ンピュータサーバーを備えることができる。ネットワーク１７３０は、コンピュータシス
テム１７０１を用いるいくつかの場合、コンピュータシステム１７０１に連結するデバイ
スがクライアントまたはサーバーとして動作することを可能にするピアツーピアネットワ
ークを実装することができる。

【0133】

ＣＰＵ１７０５は、プログラムまたはソフトウェアで具現化され得る、機械可読命令の
シーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１７１０などのメモリ場所に記憶す
ることができる。命令は、ＣＰＵ１７０５を対象として、本開示の方法を実施するように
ＣＰＵ１７０５をプログラムするか、さもなければそれを構成することができる。ＣＰＵ
１７０５によって実行される動作例には、フェッチ、デコード、実行、及びライトバック
が含まれ得る。

【0134】

ＣＰＵ１７０５は、集積回路などの回路の一部であってよい。システム１７０１の１つ
または複数の他の構成要素を回路に含むことができる。いくつかの場合、回路は特定用途
向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

【0135】

記憶装置１７１５は、ドライバー、ライブラリー、及び保存されたプログラムなどのフ
ァイルを格納することができる。記憶装置１７１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザ
ー選択及びユーザープログラムを格納することができる。コンピュータシステム１７０１
は、いくつかの場合、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステ
ム１７０１と通信するリモートサーバーに位置するような、コンピュータシステム１７０
１の外部にある１つまたは複数の追加データ記憶装置を含むことができる。

【0136】

コンピュータシステム１７０１は、ネットワーク１７３０を介して１つまたは複数のリ
モートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１
７０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモート
コンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、
スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）
、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話機、スマートフォン（例え
ば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、
Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げら
れる。ユーザーは、ネットワーク１７３０を介してコンピュータシステム１７０１にアク
セスすることができる。

【0137】

本明細書に記載の方法は、例えばメモリ１７１０または電子記憶装置１７１５などのコ
ンピュータシステム１７０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コンピュータプ
ロセッサー）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能コードまたは
機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用中、コードは、プロセッサ
ー１７０５によって実行することができる。いくつかの場合、コードは、記憶装置１７１
５から取り出され、プロセッサー１７０５によって即座にアクセスされるようにメモリ１
７１０に記憶することができる。いくつかの状況では、電子記憶装置１７１５を排除する
ことができ、機械実行可能命令がメモリ１７１０に記憶される。

【0138】

コードを実行するように適合させたプロセッサーを有する機械と共に使用するようにコ
ードをプレコンパイルして構成することができるか、または実行時にコンパイルすること
ができる。コードは、プレコンパイルまたはコンパイルされた方法でコードを実行させる
ように選択することができるプログラミング言語で提供され得る。

【0139】

コンピュータシステム１７０１などの本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は
、プログラミングで具現化され得る。本技術の様々な態様は、典型的には、あるタイプの
機械可読媒体に搭載またはそこで具現化された、機械（またはプロセッサー）実行可能コ
ード及び／または関連データの形式の「製品」または「製造品」と考えることができる。
機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモ
リ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に格納することができ
る。「記憶」タイプの媒体は、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ
などのコンピュータ、プロセッサーなどの有形のメモリ、またはそれに関連するモジュー
ルのいずれかまたは全てを含むことができ、これによって、随時、ソフトウェアプログラ
ミングに持続性格納を提供することができる。ソフトウェアの全部または一部は、時々、
インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して通信され得る。そのよう
な通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のものへと、例えば、
管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプ
ラットフォームへとソフトウェアを読み込むことを可能にすることができる。したがって
、ソフトウェア要素を担うことができる別のタイプの媒体には、有線及び光陸線ネットワ
ークならびに様々なエアリンクを介して、ローカルデバイス間のインターフェースにわた
って使用される光波、電波、及び電磁波が含まれる。有線または無線リンク、光リンクな
どのそのような波を搬送する物理的要素も、ソフトウェアを担う媒体と考えることができ
る。本明細書で使用される場合、持続的な有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コン
ピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行する命令をプロセッサーへ提供する
ことに関与する任意の媒体を指す。

【0140】

したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送
波媒体、または物理的伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態をとり得る。
不揮発性記憶媒体には、例えば、図面に示されたデータベースなどを実装するために使用
されるものなど、任意のコンピュータ（複数可）などの記憶装置のいずれかなどの光学デ
ィスクまたは磁気ディスクが含まれる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプ
ラットフォームのメインメモリなどの動的メモリが含まれる。有形の伝送媒体には、同軸
ケーブルと、コンピュータシステム内でバスを備えるワイヤを含む銅線及び光ファイバー
と、が含まれる。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）
及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音響波もしくは光波の形態をと
り得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピー（
登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の
磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチ
カード紙テープ、孔のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、Ｐ
ＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカート
リッジ、データもしくは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブルも
しくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコード及び／もしくはデータを読み
取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の
多くは、実行のために１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスをプロセッサ
ーに搬送することに関与し得る。

【0141】

コンピュータシステム１７０１は、例えば、核酸配列決定、核酸配列決定データの分析
、核酸配列決定サンプルの特徴付け、細胞特徴付けの結果などを提供するためのユーザー
インターフェース（ＵＩ）１７４０を備える電子ディスプレイ１７３５を備えるか、また
はそれと通信することができる。ＵＩの例には、グラフィカルユーザーインターフェース
（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが含まれるが、これらに限定さ
れない。

【0142】

本開示の方法及びシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実装することが
できる。アルゴリズムは、中央処理装置１７０５による実行時にソフトウェアによって実
施することができる。アルゴリズムは、例えば、核酸配列決定の開始、核酸配列決定デー
タの処理、核酸配列決定結果の解釈、核酸サンプルの特徴付け、及び細胞の特徴付けなど
を行うことができる。

【実施例】

【0143】

ＶＩＩ．実施例
実施例Ｉ エマルジョンを用いた細胞ＲＮＡ分析
一例では、図９Ａに示す操作で、エマルジョン液滴中で、テンプレートスイッチングに
よる逆転写及びｃＤＮＡ増幅（ＰＣＲによるもの）を行う。逆転写及びｃＤＮＡ増幅（Ｐ
ＣＲによるもの）のために区分化された反応混合物は、１，０００の細胞もしくは１０，
０００の細胞または１０ｎｇのＲＮＡ、バーコード化オリゴヌクレオチド／０．２％Ｔｘ
－１００／５倍のＫａｐａ緩衝液を含むビーズ、２倍のＫａｐａ ＨＳ ＨｉＦｉ Ｒｅ
ａｄｙ Ｍｉｘ、４μＭのスイッチオリゴ、ならびにＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。細
胞が存在する場合、混合物は、大部分または全ての液滴が単一細胞及び単一ビーズを含む
ように区分化される。操作９５０のように、細胞が溶解され、その間バーコード化オリゴ
ヌクレオチドがビーズから放出され、バーコード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメン
トが、細胞から放出されたｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。ポリＴセグメン
トは、操作９５２のように逆転写反応で伸長され、ｃＤＮＡ転写物は操作９５４のように
増幅される。熱サイクル条件は４２℃で１３０分間、９８℃で２分間、ならびに９８℃で
１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で６分間の３５サイクルである。熱サイクル後
、エマルジョンは破壊され、操作９５６と同様に転写物はＤｙｎａｂｅａｄｓ及び０．６
倍のＳＰＲＩで精製される。

【0144】

図１３Ａの１，０００の細胞、図１３Ｃの１０，０００細胞、図１３Ｂの１０ｎｇのＲ
ＮＡに対する、エマルジョン中のテンプレートスイッチ逆転写及びＰＣＲからの収率が示
されている（Ｓｍａｒｔｓｃｒｉｂｅ線）。１０ｎｇのＲＮＡのエマルジョン中で実施さ
れたＲＴ及びＰＣＲからのｃＤＮＡ転写物は、操作９５８と同様に、剪断されて機能配列
に連結され、０．８倍のＳＰＲＩで洗浄され、ＰＣＲによりさらに増幅される。増幅生成
物は０．８倍のＳＰＲＩで洗浄される。この処理からの収率を図１３Ｂ（ＳＳＩＩ線）に
示す。

【0145】

実施例ＩＩ エマルジョンを用いた細胞ＲＮＡ分析
別の例では、図９Ａに示す操作で、エマルジョン液滴中で、テンプレートスイッチング
による逆転写及びｃＤＮＡ増幅（ＰＣＲによるもの）を行う。逆転写及びｃＤＮＡ増幅（
ＰＣＲによるもの）のために区分化された反応混合物は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、バーコード
化オリゴヌクレオチド／０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／５倍のＫａｐａ緩衝液を含
むビーズ、２倍のＫａｐａ ＨＳ ＨｉＦｉ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ、４μＭのスイッチオ
リゴ、及びＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。混合物は、大部分または全ての液滴が単一細
胞及び単一ビーズを含むように区分化される。操作９５０のように、細胞が溶解され、そ
の間バーコード化されたオリゴヌクレオチドがビーズから放出され、バーコード化された
オリゴヌクレオチドのポリＴセグメントが、細胞から放出されたｍＲＮＡのポリＡ尾部に
ハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作９５２のように逆転写反応で伸長され、
ｃＤＮＡ転写物は操作９５４のように増幅される。熱サイクル条件は４２℃で１３０分間
、９８℃で２分間、ならびに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で６分間
の３５サイクル、である。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、操作９５６と同様に
転写物はＤｙｎａｂｅａｄｓ及び０．６倍のＳＰＲＩで洗浄される。様々な細胞数（６２
５の細胞、１，２５０の細胞、２，５００の細胞、５，０００の細胞、１０，０００の細
胞）との反応からの収率を図１４Ａに示す。これらの収率は、図１４Ｂに示されるＧＡＤ
ＰＨ ｑＰＣＲアッセイ結果で確認される。

【0146】

実施例ＩＩＩ エマルジョンを用いたＲＮＡ分析
別の例では、図９Ｃに示されるのと同様の方法で、エマルジョン液滴中で逆転写を行い
、バルクでｃＤＮＡ増幅を行う。逆転写反応のために区分化される反応混合物は、バーコ
ード化されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、１０ｎｇのＪｕｒｋａｔ ＲＮＡ（例
えばＪｕｒｋａｔ ｍＲＮＡ）、５倍のＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、及びＳｍａｒ
ｔｓｃｒｉｂｅを含む。バーコード化オリゴヌクレオチドはビーズから放出され、バーコ
ード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメントは、操作９６１のようにＲＮＡのポリＡ尾
部にハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作９６３のように逆転写反応において
伸長される。逆転写の熱サイクル条件は、４２℃で２時間の１サイクル、及び７０℃で１
０分間の１サイクルである。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、操作９６２のよう
にＲＮＡ及びｃＤＮＡ転写物は変性される。次いで、第２鎖は、操作９６４のようにビオ
チンタグを有するプライマーでプライマー伸長により合成する。このプライマー伸長の反
応条件は、第１鎖としてのｃＤＮＡ転写物、及び０．５～３．０μＭの濃度範囲のビオチ
ン化伸長プライマーを含む。熱サイクル条件は、９８℃で３分間の１サイクル、ならびに
９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で３０分間の１サイクルである。プラ
イマーの伸長後、第２鎖をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ
Ｃ１及びＴ１でプルダウンし、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ緩衝液で
洗浄する。第２鎖は、以下のサイクル条件、すなわち９８℃で３分間の１サイクル、なら
びに９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で３０分間の１サイクルで、操作
９６５のようにＰＣＲにより事前に増幅される。様々な濃度のビオチン化プライマー（０
．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ及び３．０μＭ）の収率を図１５に示す。

【0147】

実施例ＩＶ エマルジョンを用いたＲＮＡ分析
別の例では、図１０に示すように、Ｔ７ポリメラーゼによるインビトロ転写がＲＮＡ転
写物を生成するのに使用される。逆転写反応のために区分化される反応混合物は、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼプロモーター配列も含むバーコード化されたオリゴヌクレオチドを有す
るビーズ、１０ｎｇのヒトＲＮＡ（例えば、ヒトｍＲＮＡ）、５倍のＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒ
ａｎｄ緩衝液、及びＳｍａｒｔｓｃｒｉｂｅを含む。混合物は、液滴の大部分または全部
が単一のビーズを含むように区分化される。バーコード化オリゴヌクレオチドはビーズか
ら放出され、バーコード化オリゴヌクレオチドのポリＴセグメントは、操作１０５０のよ
うにＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズする。ポリＴセグメントは、操作１０５２のよ
うに逆転写反応において伸長される。熱サイクル条件は、４２℃で２時間の１サイクル及
び７０℃１０分間で１サイクルである。熱サイクル後、エマルジョンは破壊され、残りの
操作はバルクで行われる。次いで、第２鎖が、操作１０５４のようにプライマー伸長によ
って合成される。このプライマー伸長の反応条件は、テンプレートとしてのｃＤＮＡ転写
物及び伸長プライマーを含む。熱サイクル条件は、９８℃で３分間の１サイクル、ならび
に９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃３０分間の１サイクルである。この
プライマー伸長後、第２鎖を０．６倍のＳＰＲＩで精製する。次いで、操作１０５６のよ
うに、ＲＮＡ転写物を生成するためにインビトロ転写が行われる。インビトロ転写を一晩
行い、転写物を０．６倍のＳＰＲＩで精製する。インビトロ転写からのＲＮＡ収率を図１
６に示す。

【0148】

本発明のいくつかの実施形態が本明細書に示されて説明されているが、当業者には、そ
のような実施形態は例示のためにのみ提供されていることが明らかであろう。本発明は、
本明細書中に提供された特定の例によって限定されないことが意図されている。本発明を
上述の明細書を参照して説明したが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、限定的な意
味で解釈されることを意図するものではない。ここで、当業者は、本発明から逸脱するこ
となく、多くの変形形態、変更形態、及び置換形態に想到するであろう。さらに、本発明
の全ての態様は、様々な条件及び変数によって決定される、本明細書に記載の特定の描写
、構成、または相対的な比率に限定されないことを理解されるであろう。本明細書に記載
された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において使用され得るこ
とが理解されるべきである。したがって、本発明は、任意のそのような代替、改変、変形
、または等価物も網羅するものと考えられる。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定
義し、かつこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物はそれによ
って網羅されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】