特許 7330575 モナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-14

(45)【発行日】2023-08-22

(54)【発明の名称】モナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/365 20060101AFI20230815BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230815BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230815BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20230815BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20230815BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230815BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230815BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230815BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230815BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230815BHJP

【ＦＩ】

A61K31/365

A61K9/14

A61K9/08

A61K9/20

A61K9/48

A61P3/06

A61P1/16

A61P9/00

A61P11/06

A61P3/10

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022536532

(86)(22)【出願日】2020-11-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-15

(86)【国際出願番号】 CN2020126114

(87)【国際公開番号】W WO2021129166

(87)【国際公開日】2021-07-01

【審査請求日】2022-06-14

(31)【優先権主張番号】201911340509.X

(32)【優先日】2019-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201911338798.X

(32)【優先日】2019-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】513148853

【氏名又は名称】天津科技大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095267

【弁理士】

【氏名又は名称】小島 高城郎

(74)【代理人】

【識別番号】100124176

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 典子

(74)【代理人】

【識別番号】100224269

【弁理士】

【氏名又は名称】小島 佑太

(72)【発明者】

【氏名】陳勉華

(72)【発明者】

【氏名】王玉栄

(72)【発明者】

【氏名】劉▲曾▼麗

(72)【発明者】

【氏名】王晶

(72)【発明者】

【氏名】李鵬

【審査官】鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】特開２００８－０５６６１８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｋ ９／００－９／７２

Ａ６１Ｐ ３／０６

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ １１／０６

Ａ６１Ｐ ３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

モナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用。

【請求項2】

前記脂肪減少製品は、トリグリセリドの低減に用いられる、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記脂肪減少製品は、脂肪減少機能性食品である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項4】

前記脂肪減少製品は、脂肪減少医薬品である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項5】

前記脂肪減少医薬品は、個体の脂質代謝異常に関連する疾患の予防又は治療に用いられ、
前記個体の脂質代謝異常に関連する疾患は、脂肪肝、心血管疾患、糖尿病、及び喘息のうちの一種又は複数種を含む、請求項４に記載の使用。

【請求項6】

前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝を含む、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記脂肪減少医薬品の製剤の形態は、ハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤、顆粒剤、粉末剤、経口液剤、又は注射剤である、請求項４－６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

前記脂肪減少医薬品は単位製剤である、請求項４－７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項9】

前記単位製剤に５０－２００ｍｇのモナスシノールが含まれる、請求項８に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１９年１２月２３日に中国特許庁に出願された、出願番号が２０１９１１３４０５０９．Ｘであり、出願の名称が「モナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用」である中国特許出願に基づく優先権を主張するものであり、当該中国特許出願に記載された全ての内容を本出願に援用する。本出願は、２０１９年１２月２３日に中国特許庁に出願された、出願番号が２０１９１１３３８７９８．Ｘであり、出願の名称が「モナスシノール調製用のモナスカス及びそれを使用してモナスシノールを調製する方法」である中国特許出願に基づく優先権を主張するものであり、当該中国特許出願に記載された全ての内容を本出願に援用する。

【0002】

本発明は、モナスシノールの用途に関し、特にモナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用に関するものである。

【背景技術】

【0003】

脂質は、細胞膜とリポタンパク質の組成成分の一つとして、主にコレステロールとトリグリセリドからなり、体内のステロイド物質の合成に使用されるだけでなく、人体の代謝に必要なエネルギーを提供することができる。人体に脂質が過剰に蓄積されると、高脂血症を引き起こす。高脂血症（Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ，ＨＬＰ）とは、人体の血漿中の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）及び低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルが著しく増加し、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＬＤ－Ｃ）が低い代謝性疾患であり、アテローム性動脈硬化症、脂肪肝などの心血管疾患を誘発する重要な要因である。

【0004】

コレステロールは、生体細胞膜の主成分の一つであるとともに、すべてのステロイドホルモンの前駆体でもあり、生命活動にとってとても重要である。肝臓は、コレステロール代謝の核心となる器官であり、主に複数種のアポリポタンパク質と周辺組織によって、コレステロールを輸送する。通常の場合、コレステロールの合成、吸収及び排泄は恒常性を保っているが、過剰なコレステロールの合成又は吸収は、コレステロール代謝の異常をもたらして、高脂血症を引き起こす。トリグリセリドは、グリセリンと脂肪酸とのエステル化よりなり、血中脂質の主成分であり、生体の重要なエネルギー供給物質でもある。トリグリセリドは主に、ホスファチジン酸経路及びモノグリセリド経路との二つの経路で生成される。肝細胞では、トリグリセリドは、主にホスファチジン酸経路によって合成され、そして、アポリポタンパク質及びコレステロールなどと超低密度リポタンパク質を合成し、血液循環に介して肝外組織に輸送され、貯蔵又は利用される。肝細胞におけるトリグリセリドの合成の増加、超低密度リポタンパク質の分泌の減少、及び脂肪酸の酸化力の低下は、いずれも、肝臓中でのトリグリセリドの蓄積をもたらし、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を引き起こす。ＮＡＦＬＤの流行は肥満と密接に関与する。食事制限を通じて、ＮＡＦＬＤの初期段階からの介入予防は、現在、ＮＡＦＬＤのさらなる悪化を防ぐための重要な一環である。モノグリセリド経路は、主に小腸で行われ、人体が摂取した脂肪は口と胃によって初歩的に消化され、小腸で膵リパーゼによってグリセロールと脂肪酸に加水分解され、そして、人体に吸収される。トリグリセリドを過剰に摂取すると、肥満になる。膵リパーゼ阻害剤は、小腸中の膵リパーゼの活性を阻害し、脂質の吸収をある程度に低下させることができるので、医薬品で肥満を治療する効果的な方法の一つである。

【0005】

トリグリセリドとコレステロールは人体の脂質の重要な成分であるが、過剰な貯蔵は肥満、心血管疾患、糖尿病などを患う可能性を急速に上昇させる。肥満による血中脂質の過度増加は、動脈硬化を引き起こし、心血管疾患を患うリスクを増加する。脂肪肝は肥満の人に発生しやすい。肥満の人では、過剰な体脂肪も気道に蓄積し、呼吸器系の機能に影響を与え、喘息患者の症状を悪化させる。肥満は、心血管疾患、糖尿病、喘息、脂肪肝、変形性関節症のがんなどを引き起こす重要な要因である。

【0006】

モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）は、中国の発酵食品での使用に千年以上の歴史がある。モナスカスの発酵産物に見つかったロバスタチン（Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ）は、内因性コレステロールの合成を阻害することにより血中脂質を低減させる効果をもたらす。モナスカス色素は、モナスカスの二次代謝産物であり、現在、文献で記載された明らかな完全な構造解析データのあるモナスカス色素は６０種類以上ある。潘子明教授らの研究により、モナシン（Ｍｏｎａｓｃｉｎ：ＭＳ）とアンカフラビン（Ａｎｋａｆｌａｖｉｎ：ＡＫ）は、トリグリセリドの生成を阻害し、脂肪酸のβ－酸化を促進することで、オレイン酸に誘発されたマウスＦＬ８３Ｂ肝細胞の脂肪変性を軽減させることを発見した。方玉祥らの研究により、ＭＳとＡＫとは非競合的に膵リパーゼ活性を阻害し、潜在的な抗肥満効果を有することを発見した。呂旭聡らの研究により、モナスカス色素は、高脂肪食のＷｉｓｔａｒラットの肝臓における脂肪蓄積を改善し、脂質代謝障害を改善することができることを発見した。ＭＳとＡＫとの二種類のモナスカスイエロー色素は、生体の脂肪蓄積を予防し、血中脂質の異常を改善する生理学的活性を有する。

【0007】

２００８年、日本発明特許ＪＰ２００８－５６６１８Ａは、Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌと命名されたモナスカスイエロー色素が抗炎症と抗がんの機能を有することを初めて報告した。２０１４年、中国台湾発明特許ＴＷ１４３７００１Ｂは、Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｉｎと命名されたモナスカスイエロー色素（ＴＷ１４３７００１Ｂ）が、５α－リダクターゼの活性を阻害し、男性ホルモンであるジヒドロテストステロンの生成を減少し、男性ホルモン不均衡に関連する疾患を治療することができることを報告した。比較すると、色素ＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｉｎとＭｏｎａｓｃｉｎｏｌは同様な構造を有し、同一の化合物である。

【0008】

現在、色素ＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｉｎとＭｏｎａｓｃｉｎｏｌが血中脂質を低減させ、体重増加を制御し、体脂肪の蓄積を阻害する効果を有することがまだ発見されていない。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、モナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ）の脂肪減少製品の調製における使用を提供し、当該モナスシノールは、血中脂質の低減、体重増加の制御、体脂肪の蓄積の抑制に著しく機能する。

【0010】

本発明の技術案において、モナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ）は、色素Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｉｎ及びＭｏｎａｓｃｉｎｏｌと同様な構造を有し、同一のものであり、本発明において、出願人はそれをモナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ）と命名し、ＭＣと略し、出願人は、それが血中脂質の低減、体重増加の制御、体脂肪の蓄積の抑制に著しく機能することを発見した。

【0011】

本発明は、モナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用を提供する。

【0012】

本発明の一つの具体的な実施形態において、前記脂肪減少製品は、トリグリセリドの低減に用いられる。

【0013】

本発明の一つの具体的な実施形態において、前記脂肪減少製品は、脂肪減少機能性食品を含む。

【0014】

さらに、前記脂肪減少機能性食品は、個体の肥満に関連する亜健康状態の予防又は改善に用いられる。

【0015】

本発明のもう一つの具体的な実施形態において、前記脂肪減少製品は、脂肪減少医薬品を含む。

【0016】

さらに、前記脂肪減少医薬品は、個体の脂質代謝異常に関連する疾患の予防又は治療に用いられる。

【0017】

さらに、前記個体の脂質代謝異常に関連する疾患は、脂肪肝、心血管疾患、糖尿病、及び喘息のうちの一種又は複数種を含む。

【0018】

さらに、前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝を含む。

【0019】

さらに、前記脂肪減少医薬品の製剤の形態は、ハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤、顆粒剤、粉末剤、懸濁液、シロップ、経口液剤、又は注射剤であり得る。

【0020】

選択された製剤の形態に応じて、前記脂肪減少医薬品は、さらに薬学的に許容される賦形剤、補助剤などを含み得る。

【0021】

さらに、本発明の技術案において、前記脂肪減少医薬品は、単位製剤である。例えば、前記単位製剤には５０－２００ｍｇのモナスシノールが含まれる。もちろん、個体の脂質代謝異常に関連する疾患を予防又は治療することができれば、前記モナスシノールの量は、異なる投与対象に応じて調整することもできる。

【0022】

本発明の技術案において、単位製剤におけるモナスシノールの量は、通常の成人の体重に対して、一回で投与された薬剤における有效成分の量である。前記単位製剤は、一回の投与に必要とされる有效成分を満たす製剤であり、一般的な単位製剤は、１単位（錠）の錠剤、１単位（本）の注射剤又は粉末注射剤などのようなものがある。患者の一回の投与に必要とされる医薬品の量は、患者の体重かけるその患者の一回の投与に必要とされる単位体重あたりの用量の値を算出することで得られる。用量は、例えば、医薬品を調製する過程で、一般的に、成人の体重を５０－９０ｋｇと考え、実験動物とヒトの間の単位体重あたり用量の等価用量換算関係によって確定されることができる。例えば、ＦＤＡ、ＳＦＤＡなどの食品医薬品局が掲げたガイダンスによって、又は（黄継漢ら、「薬理試験における動物の間及び動物とヒトの間の等価用量換算」、「中国臨床薬理学と治療学」，Ｓｅｐ ２００４；９（９）：１０６９－１０７２）を参考して確定することができる。本発明の実施形態において、ヒトとハムスターの用量は、ヒトとハムスターの体表面積に応じた換算係数０．１２で換算されることができる。

【0023】

本発明は、前記脂肪減少医薬品を用いる、個体の脂質代謝異常に関連する疾患を予防又は治療するための方法を提供する。

【0024】

本発明の技術案におけるモナスシノールは、２０１４年中国台湾発明特許ＴＷ１４３７００１に記載されたＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｉｎを獲得する方法又はＪＰ２００８－５６６１８Ａに記載されたＭｏｎａｓｃｉｎｏｌを獲得する方法によって獲得されることができる。

【0025】

あるいは、以下のモナスシノールを調製する方法によって、獲得されることができ、当該方法は、
１）固形培地の調製：米を水に浸した後、滅菌して、前記固形培地を獲得すること；
２）種子液の調製：前記モナスカスを活性化させ、活性化されたモナスカスを種子液培地に接種して培養し、種子液を獲得すること；
３）発酵：前記種子液を前記固形発酵培地に注入し、発酵させ、発酵した米、即ち、紅麹米を得ること；及び
４）モナスシノールの抽出：前記紅麹米を乾燥し粉砕した後、エタノールで抽出し、得られた抽出液を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、前記モナスシノールを獲得すること、を含む。

【0026】

前記方法において、米の供給源は特に限定されず、前記米は例えば、一般的に市販される米であってもよい。

【0027】

使用したモナスカスは２０１４年中国台湾発明特許ＴＷ１４３７００１に記載されたモナスカスであってもよい。出願人が２０１９年９月２０日に、住所が北京市朝陽区北辰西路１号院３号であるＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（略してＣＧＭＣＣ）に寄託した、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８５７８であるモナスカスであってもよい。

【0028】

ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８５７８のモナスカスを使用して調製する場合、生産量を向上させるために、以下のステップでモナスシノールを調製することができる。
１）固形培地の調製：米を水に浸した後、滅菌して、前記固形培地を獲得する；
２）種子液の調製：前記モナスカスを活性化させ、活性化されたモナスカスを種子液培地に接種して培養し、種子液を獲得する；
３）発酵：前記種子液を１：５－１０Ｌ／ｋｇの割合で前記固形発酵培地に注入し、発酵させ、発酵した米、即ち、紅麹米を得る；
４）モナスシノールの抽出：前記紅麹米を乾燥し粉砕した後、５０％－８０％のエタノールで抽出し、抽出プロセスに、紅麹米とエタノールとの重量比が１：５－２０になるように制御し、得られた抽出液を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、前記モナスシノールを獲得する。

【0029】

本発明のもう一つの具体的な実施形態において、前記モナスシノールを調製する方法は、
１）固形培地の調製：前記米を水に浸した後に形成された湿った米を三角フラスコに広げ、滅菌して、固形発酵培地を得ること；
２）種子液の調製：前記モナスカスを活性化培地を使用して活性化された後、種子液培地に接種して培養し、モナスカスの種子液とすること；
３）発酵：前記モナスカスの種子液をろ過して菌糸体を除去し、菌糸体が除去された前記モナスカスの種子液を１：５－１０Ｌ／ｋｇの割合で前記固形発酵培地に注入し、発酵させ、発酵した米、即ち、紅麹米を得ること；
４）モナスシノールの抽出：発酵して得られた紅麹米を乾燥し粉砕した後、５０％－８０％のエタノールで抽出し、抽出プロセスに、紅麹米とエタノールとの重量比が１：５－２０になるように制御し、得られた抽出液を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、前記モナスシノールを獲得することを含む。。

【0030】

さらに、ステップ１）の浸した過程において、米と水との割合は１：１ｋｇ／Ｌであり、室温で４－２４ｈ浸す。

【0031】

さらに、ステップ２）において、前記モナスカスの活性化温度は２５－３５℃であり、２－５日活性化培養される。さらに、前記ステップ２）において、前記活性化培地は、麦汁斜面培地である。

【0032】

前記麦汁斜面培地は当分野の一般的な培地であり、購入して獲得することができる。軽く粉砕された大麦麦芽粒を２５０．０ｇ量り、水１Ｌを入れ、６０℃の恒温水浴で４ｈ保ち、ろ過した後に水を入れ、糖度を１２°Ｂｒｉｘに希釈し、寒天３．０ｇを入れ、１２１℃、０．１ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ滅菌することで調製して獲得することもできる。

【0033】

さらに、ステップ２）において、活性化されたモナスカスを種子液培地に接種して培養することは恒温振とう機で行い、恒温振とう機の温度を２５－３５℃に、恒温振とう機の回転速度を１５０－２００ｒ／ｍｉｎに、培養時間を２４－４８時間に制御する。

【0034】

前記種子液培地は当分野の一般的な培地であり、購入して獲得することができる。下記のように調製して獲得することもできる。前記種子液培地は、重量で、６．０部のグルコース、２．０部のペプトン、１．０部のＮａＮＯ_３、１．０部のＫＨ_２ＰＯ_４、０．５部のＭｇＳＯ_４、及び１００部の水を含む。例えば、６．０ｇのグルコース、２．０ｇのペプトン、１．０ｇのＮａＮＯ_３、１．０ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇのＭｇＳＯ_４を１００ｍＬの水に溶かし、２５０ｍＬの三角フラスコに仕込み、８層のガーゼとクラフト紙で封口し、１２１℃、０．１ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ滅菌することで獲得することができる。

【0035】

さらに、ステップ３）において、発酵の温度は２５－３５℃であり、発酵時間は１０－２５日である。

【0036】

前記ステップ４）において、得られた抽出液を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、前記モナスシノールを獲得するプロセスで、抽出液からモナシン（Ｍｏｎａｓｃｉｎ、略してＭＳ）を獲得することをさらに含む。出願人の検測により、ＭＳとＭＣは同時に当該抽出液に存在することを見出し、一般的な技術手段で両者を抽出液から分離することができ、例えば、ＭＳとＭＣのピーク発生時間の違いに応じて、高速液体クロマトグラフィーの分離過程中でＭＳとＭＣをそれぞれ収集することは、当業者として実現できることである。

【0037】

さらに、ＭＳは式１のようにＭＣに変換されることができる。本発明に提供されたＭCを調製する方法は、ＭＣの生産量をさらに向上させるように、抽出液から獲得されたＭＳをＭＣに変換するステップ５）を含んでもよい。

【化1】

【0038】

当該ＭＳが式１のようにさらにＭＣに変換されることで、本発明のモナスカスの発酵によって生産されたＭＣの生産量を向上させることができる。

【0039】

本発明の技術案は以下の利点を有する。
１）モナスシノールは、血中脂質の低減、体重増加の制御、体脂肪の蓄積の抑制に著しく機能し、そして、低減された細胞毒性を有することから、脂肪減少製品としてより高い使用安全性があることを初めて発見した。
２）本発明は、モナスシノールの脂肪減少製品の調製における使用を提供し、個体の肥満に関連する亜健康状態の予防又は改善に用いられ、前記個体は、例えば、体重管理を必要とする、成人及び青年を含む亜健康な人であってもよい。
３）本発明は、さらに、モナスシノールの、脂肪減少医薬品を含む脂肪減少製品の調製における使用を提供し、脂肪肝、心血管疾患、糖尿病、及び喘息を含む、個体の脂質代謝異常に関連する疾患の予防又は治療に用いられ、さらに、例えば、糖尿病、心血管疾患、喘息、及び変形性関節症などの肥満に密接に関与する一連の疾患の予防及び治療に用いられてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0040】

本発明の実施例の技術案をより明確に説明するために、以下では本発明の実施例に用いられる図面を簡単に紹介するが、明らかなことに、以下に説明される図面は本発明のいくつかの実施例に過ぎず、当業者にとって、創造的な労働がなくても、以下の図面よりその他の図面を得ることができる。

【0041】

【図1】図１Ａは、オレイン酸添加前のＨｅｐＧ２細胞の状況を示し、図１Ｂは、オレイン酸添加後のＨｅｐＧ２細胞の脂質蓄積状況を示す。

【図2】図２は、異なる投与量のＭＣとＭＳの、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞生存率に対する影響を示す。

【図3】図３は、異なるＭＣ投与濃度の、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧの含有量に対する影響を示す。

【図4】図４は、ＭＣとＭＳの、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧの含有量に対する影響を示す。

【図5】図５Ａは、オレイン酸モデリング群のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積を示す図であり；図５Ｂは、ＭＳ群のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積を示す図であり；図５Ｃは、ＭＣ群のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積を示す図である。

【図6】図６は、ＭＣの膵リパーゼに対する阻害活性が濃度につれて変化を示す図である。

【図7】図７Ａは、ＭＳ（モナシン，Ｍｏｎａｓｃｉｎ）反応物の異なる添加順における阻害率の結果を示す図であり；図７Ｂは、ＡＫ（アンカフラビン，Ａｎｋａｆｌａｖｉｎ）反応物の異なる添加順における阻害率の結果を示す図であり；図７Ｃは、ＭＣ（モナスシノール，Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ）反応物の異なる添加順における阻害率の結果を示す図である。

【図8】図８は、ＭＣのラインウィーバー＝バークプロットを示す。

【図9】図９Ａ－図９Ｃは、各群におけるハムスターの肝臓組織切片の１００ｘ光学顕微鏡における結果を示し；図９ａ－図９ｃは、各群におけるハムスターの肝臓組織切片の４００ｘ光学顕微鏡における結果を示す。

【図10】図１０Ａ－図１０Ｃは、各群におけるハムスターの脂肪組織切片の１００ｘ光学顕微鏡における結果を示し；図１０ａ－図１０ｃは、各群におけるハムスターの脂肪組織切片の４００ｘ光学顕微鏡における結果を示す。

【図11】図１１は、ＭＣのＬＣＭＳ一次カチオンスペクトルを示す。

【図12】図１２は、ＭＣの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。

【図13】図１３は、ＭＣの^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本発明の実施例におけるＨｅｐＧ２細胞は協和細胞資源中心（資源番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００３５）から購入され、実験過程中に使用される各試薬がいずれも一般的な試薬であり、市販で獲得することができる。モナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ、略してＭＣ）は、ＪＰ２００８－５６６１８Ａ又はＴＷ１４３７００１Ｂに記載の方法で調製することができる。モナシン（Ｍｏｎａｓｃｉｎ、略してＭＳ）は、ＪＰ２００８－５６６１８Ａに記載の方法で調製することができる。モナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ、略してＭＣ）及びモナシン（Ｍｏｎａｓｃｉｎ、略してＭＳ）は、本発明に記載のモナスカス（ベニコウジカビ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐ）を使用して調製することができる。当該モナスカス（ベニコウジカビ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐ）は、２０１９年９月２０日にＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（略してＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８５７８であるモナスカスである。原料は一般的に市販される米であり、培地における各成分はいずれも当分野の一般的に市販される試薬である。

【0043】

実施例１ モナスシノールの細胞毒性
１）オレイン酸モデリングＨｅｐＧ２細胞
成長状態が良好なＨｅｐＧ２細胞を、２＊１０^５個／ｍＬ、各ウェル１ｍＬで６ウェル培養プレートに接種した。細胞付着率が８０％－９０％に達したとき、培地を廃棄した。空白群とモデリング群を設定し、空白群に完全培地を入れ、モデリング群に完全培地で希釈された０．３ｍｍｏｌ／Ｌのオレイン酸誘導液を入れ、各ウェルに２ｍＬを入れ、２４ｈ培養した後に、オイルレッドＯで染色し、細胞における脂肪滴蓄積状況を観察した。

【0044】

空白群の細胞は紡錘形であり、細胞の縁は明確であり、細胞内に脂肪滴の明らかな蓄積はない。０．３ｍｍｏｌ／Ｌのオレイン酸誘導液２ｍＬを入れる付着ＨｅｐＧ２細胞は、インキュベートして２４ｈ培養した後、明らかな増殖損傷がなく、空白群に比べて、細胞の縁では、明らかな赤い脂肪滴が細胞核の周りに回っているのが見られ、細胞の輪郭が明らかであり、モデリングが成功したことを示す。図１を参照し、図１Ａ－図１Ｂは、オレイン酸添加前後のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積状況を示す（倒立顕微鏡×４００）。

【0045】

２）モナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ、略してＭＣ）及びモナシン（Ｍｏｎａｓｃｉｎ、略してＭＳ）の、オレイン酸モデリングＨｅｐＧ２細胞に対する細胞毒性実験
ａ．成長状態が良好なＨｅｐＧ２細胞を、５＊１０^４個／ｍＬ、各ウェル１００μＬで９６ウェル培養プレートに接種した。細胞付着率が８０％－９０％に達したとき、培地を廃棄した。

【0046】

ｂ．ＭＳとＭＣをそれぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して５ｍｇ／ｍＬの母液を調製し、母液を－２０℃で保存した。５ｍｇ／ｍＬの母液を取り、各サンプルにおけるＤＭＳＯの最終濃度が０．５％になるように、オレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌを含む完全培地で実験に必要とされるＭＳサンプル濃度又はＭＣサンプル濃度（２、４、６、８、１０、１２μｇ／ｍＬ）に希釈した。

【0047】

ｃ．モデリング群と投与群の設定
１日目（培地を廃棄した後）で、モデリング群のＨｅｐＧ２細胞にオレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌを含む完全培地２００μＬを入れ、投与群のＨｅｐＧ２細胞にオレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌ及び上記の濃度が異なるＭＳ又はＭＣサンプルを含む完全培地２００μＬを入れた。
２４ｈ後、ＭＴＴ実験方法に従い、各群のＨｅｐＧ２細胞生存率を検測した。

【0048】

ｄ．結果は図２に示す通りである。ＭＳ投与濃度が１０μｇ／ｍＬ以上になるとき、細胞生存率が３６．７％のみであり、細胞毒性が出るようになり、細胞が大量に死亡した。ＭＣ投与濃度が１２μｇ／ｍＬになるとき、細胞生存率が６６．７％であり、同じ投与濃度のＭＳの細胞毒性より明らかに小さい。

【0049】

実施例２ 異なる投与量のモナスシノールの、細胞におけるトリグリセリド含有量に対する影響
以下のように実験する。
ａ．成長状態が良好なＨｅｐＧ２細胞を、２＊１０^５個／ｍＬ、各ウェル１ｍＬで６ウェル培養プレートに接種し、１２ｈ培養し、細胞が付着した後に培地を廃棄した。

【0050】

ｂ．培地を廃棄した後、空白群、モデリング群及び投与群を設定した。
空白対照群：完全培地２ｍＬを入れた；
オレイン酸モデリング群：オレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌを含む完全培地２ｍＬを入れた；
ＭＣ低用量群：オレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌ及びモナスシノール２μｇ／ｍＬを含む完全培地２ｍＬを入れた；
ＭＣ中用量群：オレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌ及びモナスシノール４μｇ／ｍＬを含む完全培地２ｍＬを入れた；
ＭＣ高用量群：オレイン酸０．３ｍｍｏｌ／Ｌ及びモナスシノール８μｇ／ｍＬを含む完全培地２ｍＬを入れた。

【0051】

投与完了後、各群の細胞を２４時間培養し、各群の細胞を収集し、トリグリセリドキット（Ａｐｐｌｙｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって、各群のＨｅｐＧ２細胞におけるトリグリセリドの含有量を測定した。

【0052】

ｃ．結果は図３に示す通りである。異なるアルファベットは空白群に比べて有意差があることを示し、Ｐ＜０．０１である。

【0053】

図３から分かるように、空白群に比べて、モデリング群におけるＴＧ（トリグリセリド、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の含有量が明らかに上昇し（Ｐ＜０．０１）、細胞におけるＴＧの含有量が正常群の３．２倍になり、モデリングが成功したことを示す。モデリング群に比べて、低、中、高用量ＭＣがいずれも明らかに（Ｐ＜０．０１）細胞におけるＴＧの含有量を減少させることができる。ＭＣ濃度が２μｇ／ｍＬと４μｇ／ｍＬである場合、細胞におけるＴＧの含有量がそれぞれ３８．９％、３４．６％減少し、濃度が８μｇ／ｍＬである場合、細胞におけるＴＧの含有量が５１．３％減少した。従って、ＭＣはＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧの含有量を効果的に減少させることができる。

【0054】

実施例３ モナスシノール（Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ、略してＭＣ）及びモナシン（Ｍｏｎａｓｃｉｎ、略してＭＳ）の、オレイン酸モデリングＨｅｐＧ２細胞におけるトリグリセリドの含有量に対する影響
以下のように実験する。
まず、正常なＨｅｐＧ２細胞を獲得し、実施例１の方法に従い、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞（オレイン酸濃度０．３ｍｍｏｌ／Ｌ）を獲得した。

【0055】

１日目、空白対照群は、ＨｅｐＧ２細胞を処理せずに正常に培養した；オレイン酸モデリング群（オレイン酸濃度０．３ｍｍｏｌ／Ｌ）は、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞を処理せずに正常に培養した；ＭＣ群は、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞にモナスシノール、即ち、ＭＣを２μｇ／ｍＬ投与した；ＭＳ群は、オレイン酸モデリング後のＨｅｐＧ２細胞にモナシン、即ち、ＭＳを２μｇ／ｍＬ投与した。

【0056】

投与完了後、続けて各群の細胞を２４時間培養し、各群の細胞を収集し、トリグリセリドキット（Ａｐｐｌｙｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって、各群のＨｅｐＧ２細胞におけるトリグリセリドの含有量を測定し、結果を図４に示す。

【0057】

図４から分かるように、オレイン酸０．３ｍｍｏｌ／ＬでＨｅｐＧ２細胞を２４ｈインキュベートした後、細胞におけるＴＧの含有量が空白群より明らかに増加した（Ｐ＜０．０１）。同じ濃度のＭＳとＭＣはいずれも細胞におけるＴＧの含有量を明らかに減少させた（Ｐ＜０．０１）。２μｇ／ｍＬのＭＳとＭＣは、細胞におけるＴＧの含有量をそれぞれ２６．３％と３３．３％減少させることができ、両者の脂質減少効果には有意差がない（Ｐ＞０．０１）。

【0058】

オイルレッドＯで染色してさらに形態学的観察を行い、結果は図５Ａ－５Ｃ（倒立顕微鏡×４００）に示す通りである。図５Ａはオレイン酸モデリング群のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積図であり、図５ＢはＭＳ群のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積図であり、図５ＣはＭＣ群のＨｅｐＧ２細胞における脂質蓄積図である。これで分かるように、オレイン酸モデリング群に比べて、２μｇ／ｍＬのＭＳ群とＭＣ群はいずれも細胞における脂肪滴を減少させ、色を浅くすることができる。それはＴＧの検測結果と一致している。

【0059】

実施例４ ＭＣの膵リパーゼに対する阻害活性及び阻害様式
実験では、オレイン酸4-メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＯ）を基質として使用し、蛍光検出法でＭＣの膵リパーゼ（ＩＩ型、ブタ膵臓由来）に対する阻害活性を評価した。

【0060】

以下の群を設定した（表１を参照してもよい）。
空白群：ＭＣサンプルを含まず、基質、膵リパーゼ、及びＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液のみある；
空白背景群：ＭＣサンプル及び膵リパーゼを含まず、基質及びＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液のみある；
サンプル背景群：膵リパーゼを含まず、ＭＣサンプル、基質、及びＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液のみある；
サンプル群：Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液を含まず、ＭＣサンプル、基質、及び膵リパーゼのみある。

【0061】

【表1】

【0062】

以下の公式で阻害率を算出した：
阻害率（％）＝［（Ａ_１－Ａ_２）－（Ａ_３－Ａ_４）］／（Ａ_１－Ａ_２）×１００
Ａ_１：空白群の蛍光値；Ａ_２：空白背景群の蛍光値
Ａ_３：サンプル群の蛍光値；Ａ_４：サンプル背景群の蛍光値

【0063】

各群に含まれる物質を表１に示された割合で黒色の９６ウェル培養プレートのウェル中に入れ、各群の実験に三個の重複実験を設け、ここで、４－ＭＵＯの濃度は０．１ｍＭであり、ＭＣサンプルをＤＭＳＯで溶解させ（５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬと６個の異なる濃度を設定する）、リパーゼ溶液の濃度は１ｍｇ／ｍＬであり、２５℃の条件下で３０ｍｉｎ反応させた後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液１００μＬを入れ、反応を停止させた。リパーゼは基質であるオレイン酸4-メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＯ）を触媒して、生成物である４－メチルウンベリフェロンを生成し、４－メチルウンベリフェロンは、励起波長３４０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍで蛍光強度を示す。蛍光値の大きさを検出することにより、リパーゼ活性を間接的に判断することができる（即ち、リパーゼ活性が高いほど、より多くの４－メチルウンベリフェロンが触媒、生成され、蛍光シグナルが強くなる）。従って、励起波長３６０±４０ｎｍ、発光波長４６０±４０ｎｍの条件下で生成物である４－メチルウンベリフェロンを測定した。

【0064】

上記のＭＣの６個の濃度を対数濃度に変換した後、対数濃度を横軸として、阻害率を縦軸として、図６に示すＳ字型の曲線が描かれ、これで分かるように、ＭＣの膵リパーゼに対する阻害率は濃度の増加につれて増加する。さらに、当該Ｓ字型の曲線に基づいた後、当分野の既知のソフトウェアによってＩＣ５０値を算出したところ、ＩＣ５０値が７５．８μｇ／ｍＬであった。この結果から、ＭＣは、膵リパーゼに対して一定の阻害活性を有し、モノグリセリドの吸収経路を阻害することにより、トリグリセリドの腸内摂取量を減少させ、潜在的な抗肥満効果を有することが示されている。

【0065】

阻害剤と酵素の異なる結合方法と特性に応じて、阻害様式は、可逆的阻害と不可逆的阻害の２つの様式に分けられる。不可逆的阻害は、通常比較的に強固な共有結合で酵素タンパク質における基に結合し、酵素を不活性化させる。可逆的阻害は、競合的阻害、非競合的阻害、及び不競合的阻害に分けられる。研究によると、ＭＳとＡＫの膵リパーゼに対する阻害様式は非競合的阻害である。本部分の実験は、ＭＳ及びＡＫを対照として、反応物の添加順を変更することでＭＣの阻害様式を判定し、三種類の色素阻害剤の介入濃度はいずれも８０μｇ／ｍＬである。結果は図７Ａ－７Ｃに示す通りである。図７Ａは、ＭＳ（モナシン，Ｍｏｎａｓｃｉｎ）反応物の異なる添加順における阻害率の結果を示す図であり、図７Ｂは、ＡＫ（アンカフラビン，Ａｎｋａｆｌａｖｉｎ）反応物の異なる添加順における阻害率の結果を示す図であり、図７Ｃは、ＭＣ（モナスシノール，Ｍｏｎａｓｃｉｎｏｌ）反応物の異なる添加順における阻害率の結果を示す図である。ＭＣの阻害様式がＭＳ及びＡＫの阻害様式と異なることが分かる。図７Ａ－７Ｃにおいて、Ｓ：基質、Ｉ：阻害剤，Ｅ：酵素。

【0066】

以下、ラインウィーバー＝バーク二重逆数プロット法の結果により、ＭＣの膵リパーゼに対する阻害様式を確定する。当分野で既知されたように、２本の直線が１／Ｓ軸で交差する場合、阻害様式は非競合的阻害であり、２本の直線が１／Ｖ軸で交差する場合、阻害様式は競合的阻害であり、２本の直線が平行である場合、阻害様式は不競合的阻害である。

【0067】

図８は、ＭＣのラインウィーバー＝バークプロットを示し、ここで、１／Ｓは基質濃度の逆数であり、１／Ｖは反応速度の逆数であり、反応速度は反応前後の蛍光値の差を時間の差で除したものである。ラインウィーバー＝バーク曲線を描く実験の基本的な流れとして、以下の通りである。リパーゼ濃度（１ｍｇ／ｍＬ）が一定である条件下で、一連の異なる基質濃度で酵素触媒反応の速度を測定した。空白群は阻害剤ＭＣを含まず（ＭＣサンプルを含まず、異なる濃度の基質、膵リパーゼ、及びＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液のみある）、ＭＣ群は、１６０μｇ／ｍＬのＭＣ、異なる濃度の基質、膵リパーゼ、及びＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液が入れられるものである。図８から分かるように、二重逆数プロット法より、２本の直線が平行になる傾向があることを示し、可逆的阻害における不競合的阻害に属する。それは、ＭＣは酵素に直接結合せず、酵素－基質複合体に結合することにより膵リパーゼの触媒反応速度を低下させることを表している。

【0068】

実施例５ ＭＣ動物実験データ
動物実験では、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入された、体重が１１０－１２０グラムであり、年齢が８週であるオスのゴルデンシリアンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ、略してハムスター）２４匹が使用された。

【0069】

一定期間飼育した後、ランダムに３群に分け、各群に８匹があり、以下のように群分けと実験を行う。
１日目から毎日：
正常群（ＮＯＲ）：自由に基本飼料を摂取させ、胃内投与でＭＣ群と同量なＣＭＣ－Ｎａ溶液を与えた；
高脂肪群（ＨＦＤ）：自由に高脂肪成分を有するチュアブル飼料を摂取させ、胃内投与でＭＣ群と同量なＣＭＣ－Ｎａ溶液を与えた；
ＭＣ群：自由に高脂肪成分を有するチュアブル飼料を摂取させ、２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で胃内投与でＭＣ（ＣＭＣ－Ｎａ溶液に溶解させた）を与えた。

【0070】

毎週でハムスターの体重及び摂食量を測定した。１０周後、組織サンプル又は血清サンプルを採取し、以下のように分析した。

【0071】

５．１ ＭＣのハムスターの体重、肝臓重量、腎臓重量及び脂肪組織重量に対する影響
表２は、ハムスターの肝臓、腎臓、脂肪などの脂質代謝に関与する臓器重量指標を記録する。以上の実験データから分かるように、ＨＦＤ群に比べて、ＭＣ群は、ハムスターの高脂肪食による体重、肝臓重量の増加及び周囲脂肪の蓄積を著しく阻害することができる（ｐ＜０．０５）。

【0072】

【表2】

【0073】

５．２ ＭＣのハムスターの肝臓、血清におけるＴＧ（トリグリセリド、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）とＴＣ（総コレステロール，Ｔｏｔａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）に対する影響
Ｆｏｌｃｈ法に従い、肝臓中のＴＣとＴＧを抽出し、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｉｔｕｔｅにより製造されたＴＣとＴＧの検出キットを使用し、取扱説明書に提供された方法で肝臓組織のＴＣとＴＧの含有量を測定した。

【0074】

採取された血清サンプルに対して、Ｃｏｂａｓ８０００ Ｅ６０２全自動生化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって血清におけるＴＣとＴＧを測定した。結果を表３に記録する。

【0075】

表３のデータから分かるように、ＨＦＤ群のハムスターの肝臓と血清におけるＴＧとＴＣの含有量は、ＮＯＲ群に比べて、著しく増加した（ｐ＜０．０５）。ＭＣ群のハムスターの肝臓と血清におけるＴＧとＴＣの含有量は、ＨＦＤ群のハムスターに比べて、著しく減少し（ｐ＜０．０５）、特に、ＭＣが介入された高脂肪食のハムスターの肝臓におけるＴＧの平均含有量はＮＯＲ群と同じであった。ＭＣは高脂肪食による血清と肝臓における脂質蓄積に対して顕著な阻害効果があり、特に肝臓と血清におけるＴＧ蓄積に対する阻害効果がより優れたことを示し、それは、ＭＣがＨｅｐＧ２細胞におけるＴＧの蓄積を阻害する細胞実験の結果と一致している。

【0076】

【表3】

【0077】

５．３ ハムスターの肝臓、脂肪組織の病理学的切片分析
図９Ａ－図９Ｃは、各群におけるハムスターの肝臓組織切片の１００ｘ光学顕微鏡における結果を示し、図９ａ－図９ｃは、各群におけるハムスターの肝臓組織切片の４００ｘ光学顕微鏡における結果を示し、ここで、図９Ａと図９ａはＮＯＲ群の結果であり、図９Ｂと図９ｂはＨＦＤ群の結果であり、図９Ｃと図９ｃはＭＣ群の結果である。これで分かるように、脂質蓄積によるＨＦＤ群の肝臓細胞の増大に比べて、ＭＣ群の細胞における脂質蓄積は著しく減少し、肝細胞索は正常になる傾向があった。

【0078】

図１０Ａ－図１０Ｃは、各群におけるハムスターの脂肪組織切片の１００ｘ光学顕微鏡における結果を示し、図１０ａ－図１０ｃは、各群におけるハムスターの脂肪組織切片の４００ｘ光学顕微鏡における結果を示し、ここで、図１０Ａと図１０ａはＮＯＲ群の結果であり、図１０Ｂと図１０ｂはＨＦＤ群の結果であり、図１０Ｃと図１０ｃはＭＣ群の結果である。これで分かるように、ＨＦＤ群の精巣上体周囲脂肪組織細胞と腎周囲脂肪組織細胞はＮＯＲ群より体積が明らかに増大し、ＭＣ群の細胞はＨＦＤ群より体積が明らかに減少し、細胞の体積がＮＯＲ群とＨＦＤ群の細胞体積の間にあった。

【0079】

以上の細胞実験、生体外酵素実験及び動物実験により、ＭＣは高脂肪食による体重増加、周囲脂肪の蓄積、血液と肝臓におけるＴＣとＴＧの蓄積を効果的に予防することができることが分かっていた。肥満による脂質代謝異常及びそれに関与するメタボリックシンドローム（例えば、脂肪肝、糖尿病、喘息、変形性関節症など）を予防及び治療するに用いられる。本発明に提供された、モナスカスの発酵による、当該ＭＣに富む紅麹米、或いは当該紅麹米より抽出し分離して得られたＭＣ又はＭＳは、脂質代謝異常の調節に関与する機能性食品及び医薬品としての医薬品原薬の開発に用いられることができる。

【0080】

実施例６ 本発明に提供されたモナスカスによるモナスシノールの調製
モナスカスは、２０１９年９月２０日にＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（略してＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８５７８であるモナスカスである。原料は一般的に市販される米であり、培地における各成分はいずれも当分野の一般的に市販される試薬である。

【0081】

一、モナスカスＣＧＭＣＣＮｏ．１８５７８によってモナスシノールを調製し、以下のステップを含む。
１）米と水を１：１の質量体積比（ｋｇ／Ｌ）で室温で４－２４ｈ浸し、水を切った後、培養瓶に入れ、１２１℃、０．１ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ滅菌し、固形発酵培地を獲得した；
２）４℃の冷蔵庫に保存されたモナスカスＣＧＭＣＣＮｏ．１８５７８を新鮮な麦汁斜面培地に移し、当該モナスカスを活性化するように３０℃で４８ｈ培養し；滅菌後の無菌水を無菌操作で活性化された菌種斜面に注ぎ、胞子を白金耳からこすり取って胞子懸濁液を作り、種子液培地に移し、３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎの恒温振とう機で３６ｈ培養し、モナスカスの種子液を獲得した。

【0082】

ここで、活性化用の斜面培地は、軽く粉砕された大麦麦芽粒を２５０．０ｇ量り、水１Ｌを入れ、６０℃の恒温水浴で４ｈ保ち、ろ過した後に水を入れ、糖度を１２°Ｂｒｉｘに希釈し、寒天３．０ｇを入れ、１２１℃、０．１ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ滅菌することで調製して獲得した。

【0083】

種子液培地は、６．０ｇのグルコース、２．０ｇのペプトン、１．０ｇのＮａＮＯ_３、１．０ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇのＭｇＳＯ_４を１００ｍＬの水に溶かし、２５０ｍＬの三角フラスコに仕込み、８層のガーゼとクラフト紙で封口し、１２１℃、０．１ＭＰａの条件下で２０ｍｉｎ滅菌することで獲得した。

【0084】

３）二層のガーゼで前記モナスカスの種子液をろ過して、菌糸体を除去し、菌糸体が除去された前記モナスカスの種子液を１：５－１０Ｌ／ｋｇの体積重量比で前記固形発酵培地に注入し、３０℃で２０日間発酵させ、発酵した米、即ち、紅麹米を得た。
４）発酵して得られた紅麹米をオーブンにて６０℃で乾燥し粉砕した後、７０％のエタノールで抽出し、紅麹米とエタノールとの重量比は１：５－２０であり、得られた抽出液を高速液体クロマトグラフィーによって分離し、前記モナスシノールを獲得した。

【0085】

二、モナスカスＣＧＭＣＣＮｏ．１８５７８によって調製されたＭＣの構造解析
ＥＳＩ－ＭＳで獲得されたモナスシノールの結果は図１１に示す通りである。その一次カチオンピークのｍ／ｚは３６１．２０００［Ｍ＋Ｈ］^＋であり、当該化合物の分子式はＣ_２１Ｈ_２８Ｏ_５である。モナスシノールの^１Ｈ－ＮＭＲの結果は図１２に示す通りであり、モナスシノールの^１３Ｃ－ＮＭＲの結果は図１３に示す通りであり、当該結果は文献ＪＰ２００８－５６６１８Ａに記載されたＭｏｎａｓｃｉｎｏｌの構造特性評価の情報と同じである。

【0086】

三、モナスカスＣＧＭＣＣＮｏ．１８５７８によって調製されたＭＣの含有量の測定
ＭＣ検量線の描画：
調製し精製したＭＣ（ＨＰＬＣ純度＞９５％）を７０％のエタノールに溶解させ、４ｍｇ／ｍｌの母液を調製し、勾配で希釈して、濃度がそれぞれ４００、２００、１００、５０、２５μｇ／ｍｌであるＭＣ標準溶液が得られ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０型ＨＰＬＣで検量線を測定し描画する。ＨＰＬＣ条件：カラム ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）；移動相 アセトニトリル－０．１％ギ酸水６０：４０（Ｖ／Ｖ）、定組成溶離；ダイオードアレイ検出器；検出波長３９０ｎｍ；カラム温度２５℃；流速１ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル体積２０μＬ。濃度Ｘをピーク面積Ｙで線形回帰し、得られたＭＣ回帰方程式はＹ＝３１．６３ｘ＋１２２、Ｒ^２＝０．９９８である。

【0087】

紅麹発酵生成物におけるＭＣの含有量の測定
６０℃で発酵生成物（即ち、発酵した後の紅麹米）を乾燥させ、粉砕して篩い分け（２００メッシュ）した後、０．５０ｇを精秤し、１０ｍＬの遠沈管に入れ、試料と溶液の比率が１：２０である７０％のエタノール溶液で３０ｍｉｎ超音波抽出し、３５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心し、上澄みを適宜に希釈した後、０．２２μｍの有機フィルターでろ過し、得られた抽出液をＨＰＬＣ用バイアルに入れ、ＨＰＬＣで検測した。サンプルから検測されたＭＣのピーク面積及びサンプル希釈倍数、ならびにＭＣ検量線によって算出して得られた発酵生成物におけるＭＣの含有量が８ｍｇ／ｇであった。当該含有量は中国台湾発明特許ＴＷ１４３７００１Ｂに使用されたモナスカスによって発酵された紅麹米におけるＭＣの含有量（０．３１ｍｇ／ｇ）より遥かに高い。当該モナスカスＣＧＭＣＣＮｏ．１８５７８によって発酵された、ＭＣに富む紅麹生成物、例えば発酵した後の紅麹米は、脂質代謝異常の調節に関与する機能性食品及び医薬品としての医薬品原薬の開発に用いられることができる。

【図1A-1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A-5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A-9C】

【図9a-9c】

【図10A-10C】

【図10a-10c】

【図11】

【図12】

【図13】