▶ マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリーの特許一覧 ▶ スケペンス アイ リサーチ インスティテュートの特許一覧
特許7330899ウイルスのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を改変する方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-14
(45)【発行日】2023-08-22
(54)【発明の名称】ウイルスのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を改変する方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 14/015 20060101AFI20230815BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20230815BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230815BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230815BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230815BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20230815BHJP
【ＦＩ】
C07K14/015
C12N15/35 ZNA
C12N7/01
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C12Q1/6869 Z
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2019561963
(86)(22)【出願日】2018-05-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-02
(86)【国際出願番号】 US2018032166
(87)【国際公開番号】W WO2018209154
(87)【国際公開日】2018-11-15
【審査請求日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/504,318
(32)【優先日】2017-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/669,901
(32)【優先日】2018-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】511140770
【氏名又は名称】マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー
(73)【特許権者】
【識別番号】516106623
【氏名又は名称】ザ スケペンス アイ リサーチ インスティテュート，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ヴァンデンベルゲ，ルク エイチ．
(72)【発明者】
【氏名】マウラー，アンナ クレール
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５３６０１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】AKU89600 Adeno-associated virus capsid protein，EBI[online]，2015年，URL: https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/api/embl/AKU89600.1?lineLimit=1000，[retrieved on 2022.02.18]
【文献】Maurer AC et al.，Modulating AAP Dependency on AAV Variants While Retaining In Vivo Infectivity，Molecular Therapy,，2017年05月04日，Vol. 25(5) Suppl1: Abstract 549，p. 254，ASGCT Annual Meeting Abstracts
【文献】AKU89597 capsid protein [Adeno-associated virus]，NCBI[online]，2015年，URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AKU89597.1/，[retrieved on 2022.02.17]
【文献】Zinn E et al.，In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector，Cell Rep.，2015年，Vol. 12(6)，pp. 1056-1068
【文献】Earley LF et al.，Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11，J Virol.，2016年11月16日，Vol. 91(3): e01980-16，pp. 1-21
【文献】Kollu S et al.，A Single Amino Acid in AAV Capsids Regulate the Requirement of the Assembly Activating Protein (AAP) for Assembly，Molecular Therapy，2017年05月04日，Vol. 25(5) Suppl1：Abstract: 6，p. 3，ASGCT Annual Meeting Abstracts
【文献】Adeno-associated virus isolate Anc82 capsid protein (VP1) gene, complete cds，NCBI[online]，2015年，URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KT235806.1/，[retrieved on 2022.02.17]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、低下したアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を有する、ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項2】
配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項3】
配列番号４の核酸配列によりコードされる、請求項１に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
【請求項4】
請求項１から３のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドを含む、ウイルス粒子。
【請求項5】
導入遺伝子をさらに含む、請求項４に記載のウイルス粒子。
【請求項6】
配列番号４の核酸配列からなり、かつ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする、核酸配列を含む、核酸分子であって、前記ＡＡＶカプシドポリペプチドは、低下したアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を有する、核酸分子。
【請求項7】
配列番号４の核酸配列からなる、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
配列番号３のアミノ酸配列をコードする、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項9】
請求項６から８のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項10】
請求項６から８のいずれかに記載の核酸分子または請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項11】
パッケージング細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項12】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むパッケージング細胞であって、前記ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ、低下したアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を有する、パッケージング細胞。
【請求項13】
アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を欠く、請求項１２に記載のパッケージング細胞。
【請求項14】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を低下させる方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを有するＡＡＶを提供するステップを含む、方法。
【請求項15】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を少なくとも部分的に軽減する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを前記ＡＡＶに組み込むステップを含む、方法。
【請求項16】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、そのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）に対する依存性を低下させるように操作する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを含むＡＡＶを操作するステップを含む、方法。
【請求項17】
前記アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の非存在下で前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を培養するステップをさらに含む、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を配列決定するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の前記アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶに対して比較するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶと整列させるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
配列番号１のアミノ酸配列を含み、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｋ４７８Ｒ、Ｌ４８１Ｖ、Ｖ５２０Ｍ、Ｔ５２８Ｓ、Ｌ５８６Ｈ、Ａ５９２Ｑ、Ｐ５９３Ａ、Ｎ５９８Ｑ、Ｓ５９９ＮおよびＡ６０２Ｉの置換をさらに含む、ＡＡＶカプシドポリペプチド。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§ １１９（ｅ）の下で、その両方がその全内容にわたって参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年５月１０日出願の米国出願第６２／５０４，３１８号、および２０１８年５月１０日出願の米国出願第６２／６６９，９０１号の優先権の利益を主張する。
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§ １１９（ｅ）の下で、その両方がその全内容にわたって参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年５月１０日出願の米国出願第６２／５０４，３１８号、および２０１８年５月１０日出願の米国出願第６２／６６９，９０１号の優先権の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本開示は概して、ウイルスベクター系に関する。
本開示は概して、ウイルスベクター系に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、治療用遺伝子導入における、主にｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子療法の手法のための主要なプラットフォームである。前臨床および臨床試験により、複数の疾患を緩和する安全かつ効率的な遺伝子送達のための試薬としてのＡＡＶの潜在能力が実証され続けているが、そのより広範な適用に対するボトルネックは、これらの患者集団を治療するのに十分なベクター量の産生である。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、治療用遺伝子導入における、主にｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子療法の手法のための主要なプラットフォームである。前臨床および臨床試験により、複数の疾患を緩和する安全かつ効率的な遺伝子送達のための試薬としてのＡＡＶの潜在能力が実証され続けているが、そのより広範な適用に対するボトルネックは、これらの患者集団を治療するのに十分なベクター量の産生である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
要旨
概して、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質内の、ＡＡＶのアセンブリ活性化タンパク質（assembly-activating protein）（ＡＡＰ）依存性を改変することができる特定の配列モチーフの有用性について記載および実証する。したがって、この配列モチーフを使用して、ウイルスベクターの産生に際して直面するボトルネックのうち少なくとも１つに対処し、これを緩和することができる。詳細には、本開示は、ウイルスのＡＡＰ依存性を改変するのにすることができる、新規の表現型－系統発生マッピング（phenotype-to-phylogeny mapping）法により規定される最小限のモチーフについて記載する。簡潔に言えば、開発されてきた複数の祖先ＡＡＶ（例えば、その全内容にわたって参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０１９９９４号パンフレットを参照のこと）を使用して、広範な構造上の差異にわたるＡＡＰ依存性を試験した。この分析により、ＡＡＰ依存性を決定する最小限のモチーフの特定が可能となった。
概して、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質内の、ＡＡＶのアセンブリ活性化タンパク質（assembly-activating protein）（ＡＡＰ）依存性を改変することができる特定の配列モチーフの有用性について記載および実証する。したがって、この配列モチーフを使用して、ウイルスベクターの産生に際して直面するボトルネックのうち少なくとも１つに対処し、これを緩和することができる。詳細には、本開示は、ウイルスのＡＡＰ依存性を改変するのにすることができる、新規の表現型－系統発生マッピング（phenotype-to-phylogeny mapping）法により規定される最小限のモチーフについて記載する。簡潔に言えば、開発されてきた複数の祖先ＡＡＶ（例えば、その全内容にわたって参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０１９９９４号パンフレットを参照のこと）を使用して、広範な構造上の差異にわたるＡＡＰ依存性を試験した。この分析により、ＡＡＰ依存性を決定する最小限のモチーフの特定が可能となった。
【0005】
一態様において、本開示は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドを特徴とする。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号４の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有するが、ＡＡＰに関する「非依存性」または「依存性」についての表６に示す表示される位置のアミノ酸残基を含有する。
【0006】
本開示は、本明細書に記載されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドのいずれかを含むウイルス粒子も特徴とする。このようなウイルス粒子は、導入遺伝子をさらに含んでいてもよい。
【0007】
別の態様において、本開示は、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９９％の配列同一性）を有し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を特徴とする。一部の実施形態において、核酸分子は配列番号４の核酸配列を有する。一部の実施形態において、核酸分子は配列番号３のアミノ酸配列をコードする。
【0008】
本開示は、本明細書に記載される核酸分子のいずれかを含むベクター、ならびに本明細書に記載される核酸分子および／またはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態において、宿主細胞はパッケージング細胞である。
【0009】
別の態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むパッケージング細胞であって、ＡＡＶカプシドポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、パッケージング細胞を特徴とする。一部の実施形態において、パッケージング細胞はアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を欠く。
【0010】
別の態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を低下させる方法を含む。このような方法は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを有するＡＡＶを提供するステップを含む。
【0011】
さらに別の態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を少なくとも部分的に軽減する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドをＡＡＶに組み込むステップを含む、方法を特徴とする。
【0012】
さらに別の態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、そのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）に対する依存性を低下させるように操作する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを含むＡＡＶを操作するステップを含む、方法を提供する。
【0013】
本明細書に記載される方法のいずれかは、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の非存在下でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を培養するステップをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載される方法のいずれかは、操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を配列決定するステップをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載される方法のいずれかは、操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶに対して比較するステップをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載される方法のいずれかは、操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶと整列させる（アラインする（aligning））ステップをさらに含んでいてもよい。
【0014】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、方法および組成物が属する技術分野の技術者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が、方法および組成物の実施または試験において使用可能であるが、適切な方法および材料が以下に記載される。さらに、材料、方法、および例は例示のためのものに過ぎず、制限することを意図しているわけではない。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は全て、その全内容にわたって参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＡＡＰ要求がＡＡＶのクレード全てにわたって広範に及ぶことを実証するデータについての一連の模式図、ゲル、および棒グラフである。パネルＡは、ＡＡＰｓｔｏｐ６０およびＡＡＰ－ＨＡ構築物マップの概略図である。黒矢印：ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０ウイルスプロモーターの転写開始部位。灰色矢印：ｃａｐ遺伝子産物翻訳開始コドン。ＡＡＰ ＯＲＦへの部位特異的突然変異誘発約６０ａａにより早期終止コドン（early stop codon）（赤）を導入した。ＡＡＰ Ｃ末端付近の保存されたＢｓｉＷＩ部位にＨＡタグ（オレンジ）を挿入した。パネルＢは、ＡＡＶ１およびＡＡＶ３ ＡＡＰ－ＨＡ構築物が、ＷＴ ＡＡＰおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０条件の両方で生成されたことを実証するゲルの写真である。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の溶解物を３６時間後に採取し、遠心処理により清澄にし、抗ＨＡ抗体を用いるウェスタンブロットによりＡＡＰについて調べた。パネルＣは、ＷＴまたはＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐ構築物から産生されたベクターをｑＰＣＲにより力価測定して、ＤＮＡ分解酵素抵抗性粒子を定量化したことを実証するグラフである。ＡＡＰｓｔｏｐ６０力価は各ＷＴ血清型力価に対するパーセンテージとして報告され、少なくとも３回の独立な実験の平均±ＳＥＭを表す。バーの色はｙ軸上のヒートマップの色に対応する。†少なくとも１回の試行についてバックグラウンド（ｃａｐ遺伝子なし対照）レベル未満のＡＡＰｓｔｏｐ６０力価。統計については表２を参照のこと。パネルＤは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３のＷＴおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０構築物から産生されたベクターをＡ２０カプシドＥＬＩＳＡにより力価測定し、ＷＴ力価に対するパーセンテージとして報告したグラフである（２回の実験の平均；ＥＬＩＳＡおよびｑＰＣＲによる力価測定の個々のデータについては表１を参照のこと）。図１１も参照のこと。
【図2】天然の血清型におけるＶＰタンパク質レベルを示す実験データについての一連のゲルおよびグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、ヘルパーおよびレーン上方に表記されるｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをトランスフェクトした：（ｗｔ）ＷＴ ＡＡＰ；（ｓ）ＡＡＰｓｔｏｐ６０；（ｒ）ＡＡＰｓｔｏｐ６０プラスＣＭＶ作動性ＡＡＰ２。全細胞溶解物を３６時間後に採取し、遠心処理により清澄にし、Ｂ１抗体によりＶＰレベルを調べた（ＶＰ１／２／３）。ローディング対照としてアクチンを使用した。ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドの血清型を各ブロット上方に表示する、（パネルＡ）ＡＡＰｓｔｏｐ６０力価がＷＴ力価の１０％以上、および（パネルＢ）ＡＡＰｓｔｏｐ６０力価がＷＴ力価の１０％未満。パネルＣは、上記のＡＡＶ２トランスフェクションから定量化され、ＧＡＰＤＨに対して正規化され、ＡＡＶ２ ＷＴと比較して報告されたＲＮＡを示すブロットである。副および主スプライスアイソフォーム、ならびにスプライシング無しの転写物レベルを、ｘ軸に表記され右側に図示されるように試験した；プライマーは矢印で表示する。グラフは３回の独立な実験の平均±ＳＥＭを表す；群間には統計的に有意な差がない（統計については表２を参照のこと）。パネルＤは、ヘルパーおよび表示されるＡＡＶ８ ＷＴまたはＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のブロットである。２４時間時点で、ＡＡＰｓｔｏｐ６０をトランスフェクトした細胞を、レーン上方に表示される濃度のボルテゾミブ、ＭＬＮ７２４３、またはバフィロマイシンで処理し、さらに８時間インキュベートした後、全細胞溶解物を（パネルＡ）および（パネルＢ）のように採取した。Ｂ１抗体を用いるウェスタンブロットによりＶＰレベルを調べた（上）。ブロットをストリッピングし、ユビキチンについてリプローブした（下）。ローディング対照としてアクチンを使用した（中）。パネルＥは、下に列挙されるＤＭＳＯまたは１μＭボルテゾミブ、ＭＬＮ７２４３、またはバフィロマイシンで処理され、ＡＤＫ８抗体（アセンブルされたＡＡＶ８カプシドにのみ存在する立体構造エピトープを認識）を用いるドットブロットにより、アセンブルされたカプシドの存在についてアッセイされた、パネルＤ由来の溶解物を使用したドットブロットである。カプシドアセンブリに対する薬物の任意の効果の対照とするため、ＡＡＰの存在下で実験を繰り返した（右パネル）。図８も参照のこと。
【図3】ＡＡＰ要求が、仮想のＡＡＶ系統発生の状況において分枝特異性を示すことを実証する実験データを表す一連のゲル、図表、および概略図である。パネルＡは、９種の仮想の祖先ＡＡＶについてＡＡＰｓｔｏｐ６０が生成されたことを示すグラフである。ＷＴまたはＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐ構築物から産生されたベクターをｑＰＣＲにより力価測定し、ＤＮＡ分解酵素抵抗性粒子を定量化した。ＡＡＰｓｔｏｐ６０力価は各血清型のＷＴ力価に対するパーセンテージとして報告され、少なくとも３回の独立な実験の平均±ＳＥＭを表す。バーの色はｙ軸上のヒートマップの色に対応し、（パネルＤ）および（パネルＥ）でも使用される。†少なくとも１回の試行についてバックグラウンド（ｃａｐ遺伝子なし対照）未満のＡＡＰｓｔｏｐ６０力価。統計については表２を参照のこと。*Ａｎｃ１２６は、ＷＴおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０について一貫して低い力価（１ｅ９ＧＣ／ｍＬ未満）を産生する。パネルＢは、早期終止コドンをＡＡＰ ＯＲＦの約２０ａａに導入することにより、ＡＡＶ４および１０％以上のＡＡＰｓｔｏｐ６０力価を有するＡＡＶバリアント全てについてＡＡＰｓｔｏｐ２０が生成されたことを示すグラフである。ＡＡＰｓｔｏｐ２０条件（薄灰色バー）および相同なＡＡＰを発現するＡＡＰｓｔｏｐ２０プラスＣＭＶ作動性構築物（暗灰色バー）を追加して、ベクターを産生し、パネルＡのように力価測定した（２回の実験の平均；個々のＡＡＰｓｔｏｐ６０、ｓｔｏｐ２０、およびＡＡＰレスキューベクターの力価測定データについては表３を参照のこと）。†少なくとも１回の試行についてバックグラウンド（ｃａｐ遺伝子なし対照）未満の力価。‡ＡＡＰ２を用いて実施されたレスキュー。パネルＣは、ヘルパーおよびレーン上方に表記されるｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のゲルである：（ｗｔ）ＷＴ ＡＡＰ；（ｓ６０）ＡＡＰｓｔｏｐ６０；（ｓ２０）ＡＡＰｓｔｏｐ２０；（ｒ）ＡＡＰｓｔｏｐ２０プラスＣＭＶ作動性の相同なＡＡＰ。全細胞溶解物を３６時間後に採取し、ウェスタンブロットによりＶＰレベルを調べた。ローディング対照としてチューブリンを使用した。パネルＤはＡＡＰ表現型の分類である。各血清型下の箱は、ＷＴ力価に対するＡＡＰｓｔｏｐ６０のパーセンテージを示す。黒の箱はＡＡＰ非依存性であることを示す（ＡＡＰｓｔｏｐ２０力価＞＞１％）。ＡＡＰｓｔｏｐ６０力価１０％超を有する血清型（緑）は、ＡＡＰのＣ末端３分の２の非存在下でのアセンブリを示す（ＡＡＰＣ非依存性）。パネルＥは再構築されたＡＡＶ系統発生であり、分枝はパネルＤのように着色されている。分枝上の灰色の数字は、分枝セグメントに隣接する２つの血清型間で分岐したアミノ酸の数を示す。図８、９、１０、および１２も参照のこと。
【図4-1】ＡＡＰＣ非依存性の機能獲得型突然変異体である８２ＤＩの特性決定について示す実験データの一連の概略図、グラフ、およびゲルである。パネルＡは、部位特異的突然変異誘発により、Ａｎｃ８２ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドに分枝Ｉ残基独自物（Branch I residue identities）を導入することによって生成される８２ＤＩの概略図である。パネルＢは、Ａｎｃ８２、８２ＤＩ、およびそれらのＡＡＰｓｔｏｐ６０から産生され、ＤＮＡ分解酵素抵抗性粒子（ＤＲＰ）を定量化することにより力価測定されたベクターについてのグラフであり、Ａｎｃ８２ ＷＴ力価に対するパーセンテージとして報告される。グラフは４回の独立な実験の平均±ＳＥＭを表す。統計については表２を参照のこと。パネルＣは、部位特異的突然変異誘発により８２ＤＩおよび８２ＤＩＡＡＰｓｔｏｐ６０の各部位を個別にそのＡｎｃ８２独自物に戻したグラフである。ＤＲＰを定量化するベクター力価は８２ＤＩ ＷＴ力価に対するパーセンテージとして報告され、２回の試行の平均を表す（個々の８２ＤＩ単一復帰変異体ベクター力価測定データについては表４を参照のこと）。パネルＤは、ヘルパーおよびレーン上方に表記されるｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のゲルの写真である：（ＷＴ）ＷＴ ＡＡＰ；（ｓ６０）ＡＡＰｓｔｏｐ６０；（ｓ２０）ＡＡＰｓｔｏｐ２０；（ｒ）ＡＡＰｓｔｏｐ２０プラスＣＭＶ作動性ＡＡＰ２。全細胞溶解物を３６時間後に採取し、ウェスタンブロットによりＶＰレベルを調べた。ローディング対照としてチューブリンを使用した。パネルＥは、Ａｎｃ８２および８２ＤＩについて得られた、正規化されたＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ蛍光シグナルである。パネルＦは、１ｘ１０１１ｖｇ／マウスのＡｎｃ８２、８２ＤＩ、またはＡＡＶ８を全身注射した３０日後に、マウス肝臓で検出されたＧＦＰ蛍光の写真である。各画像は個々の動物を表す。図１２および１３も参照のこと。
【図4-2】ＡＡＰＣ非依存性の機能獲得型突然変異体である８２ＤＩの特性決定について示す実験データの一連の概略図、グラフ、およびゲルである。パネルＦは、１ｘ１０１１ｖｇ／マウスのＡｎｃ８２、８２ＤＩ、またはＡＡＶ８を全身注射した３０日後に、マウス肝臓で検出されたＧＦＰ蛍光の写真である。各画像は個々の動物を表す。図１２および１３も参照のこと。
【図5】目的の部位が三量体界面に位置することを実証する一連の分子レベルおよび原子レベルの概略図であり、ＡＡＰＣ非依存性血清型におけるより強いモノマー間相互作用を示唆している。パネルＡは、分枝Ｄ／分枝Ｉ多重配列整列化（multiple sequence alignment）により特定され、ＶＰ１開始コドンから付番された１０の部位（１２残基）の概要である。分枝Ｄ残基には、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、ＡＡＶ８、およびｒｈ１０が含まれ、分枝Ｉ残基には、Ａｎｃ１１０、ｒｈ８、およびＡＡＶ９が含まれる。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９における同一性の変動は括弧書きで表示され、各枝のうちこれらのメンバーにしかない。パネルＢはＡＡＶ９三量体の側面図であり、パネルＣにおける図の面を示す。各モノマーは１色で表され、目的の各部位はその色のより濃い陰で表される。付番された矢印は赤のモノマー内の各部位を示す。パネルＤ～Ｆは、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９三量体における選択部位の原子レベルの図である。
【図6】ＡＡＰがＶＰ－ＶＰ相互作用を促進することを実証する実験データについての一連の概略図およびゲルである。パネルＡは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、Ａｎｃ８２、および８２ＤＩのＡＡＰ２およびＶＰ１およびＶＰ３の発現構築物の概略図である。ＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１では、ＶＰ２およびＶＰ３開始コドンをそれらの発現をサイレンシングするように改変し、ＡＡＰｓｔｏｐ６０突然変異（赤の長方形）を含めた。パネルＢは、各レーン上方に表示される血清型のＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１およびＣＭＶ－ＶＰ３、＋／－ＣＭＶ－ＡＡＰ２をトランスフェクトし、４８時間後に溶解物を採取したＨＥＫ２９３細胞の写真である。抗ＨＡ抗体を使用して免疫沈降を実施し、Ｂ１抗体を使用するウェスタンブロットによりＶＰを検出した。パネルＣは、ＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１、ＣＭＶ－ＶＰ３、＋／－ＣＭＶ－ＡＡＰ２（全てＡＡＶ２タンパク質）をトランスフェクトし、カラムの上方に表示されるＤＭＳＯ、５ｍＭグルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、または５ｍＭスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）で処理したＨＥＫ２９３細胞由来の溶解物の写真である。ＶＰはＢ１抗体を用いるウェスタンブロットにより検出した。およその分子量を各列の右側に示す。図１３も参照のこと。
【図7】ＡＡＰ表現型にわたるカプシドアセンブリの早期のステップについての概略モデルである。血清型がＡＡＰ依存性であれ、ＡＡＰ非依存性であれ、ＡＡＰＣ非依存性であれ、カプシドアセンブリの核形成は、ＶＰタンパク質の安定性およびオリゴマー化の両方によって決まる可能性が高い。本明細書での発見から、ＡＡＰが両機能において活性であることが実証される。これらの機能が独立であるかどうかは不明であり、モデルでは疑問符で示される。
【図8】ＡＡＶ８およびＡＡＶ３ ＶＰ分解について示すゲルの一連の表示である。図２および図３に関連する。パネルＡは、ヘルパーおよび表示されるＡＡＶ８ ｗｔまたはＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の写真である。２４時間時点で、ＡＡＰｓｔｏｐ６０をトランスフェクトした細胞を５０μＭシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、時間が進行するごとに溶解物を採取した。Ｂ１抗体を用いるウェスタンブロットによりＶＰレベルを調べ、ＣＨＸ有効性についての陽性対照としてｐ６２をブロットした。ＡＡＶ８ ＶＰがＡＡＰの非存在下で検出されないことを実証するため、ＡＡＶ８ＡＡＰｓｔｏｐ６０をトランスフェクトした細胞について示される曝露は、より高感度の検出試薬による長期の曝露である。パネルＢは、ヘルパーおよび表示されるＡＡＶ３ ｗｔまたはＡＡＰｓｔｏｐ２０ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の写真である。２４時間時点で、ＡＡＰｓｔｏｐ２０をトランスフェクトした細胞をレーン上方に表示される濃度のボルテゾミブ、ＭＬＮ７２４３、またはバフィロマイシンで処理し、さらに８時間インキュベートした後、全細胞溶解物を採取した。Ｂ１抗体を用いるウェスタンブロットによりＶＰレベルを調べた（上）。ブロットをストリッピングし、ユビキチンについてリプローブした（下）。ローディング対照としてアクチンを使用した（中）。
【図9】２１種の血清型にわたるＡＡＰの保存について示す概略図である。図１、２、３、６、および７に関連する。血清型２１種全てのＡＡＰについての多重タンパク質配列整列化（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を本研究で試験した。Ａｎｃ－ＡＡＶ（および延長線で考えるとＡｎｃ－ＡＡＰ）を生成するための祖先配列の再構築については他で詳しく述べられている（Zinn et al., 2015、Cell Rep., 12:1056-68）。簡潔に言えば、ＡｎｃＡＡＶのためのＶＰコード配列をまずタンパク質レベルで決定し、次いで、利用可能な最も類似した現存のＡＡＶ配列由来のコドン表を使用して、その後の合成のためにＤＮＡに逆翻訳した。以前に特定された（Naumer et al., 2012、J. Virol., 86:13038-48）保存されたコア（黒のバー）はＡｎｃ－ＡＡＰにわたって高度な保存を保持しており、本研究でＡＡＰＮ（紫のバー）についてのデータにより示唆されるシャペロン機能を付与している可能性がある。本明細書に記載される研究により、ＡＡＰのＣ末端３分の２に大部分が含有されうる、ＡＡＰに対するスキャホールディング機能がさらに指摘される（ＡＡＰＣ、灰色のバー）。
【図10】ＡＡＶ３ ＡＡＰＮがＡＡＰ依存性ウイルス産生をレスキューしないことを実証する実験データの一連の概略図およびグラフである。図３に関連する。パネルＡは、ＡＡＶ３ゲノムのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ ＯＲＦに早期終止コドンを付加することにより生成される、ＡＡＰのみを発現する構築物であり、ＡＡＰｓｔｏｐ６０突然変異を含めて、ＡＡＰＮのみを発現する構築物を生成した。ＶＰ３早期終止コドンはＡＡＰ ＯＲＦにおけるサイレント突然変異である。パネルＢは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３におけるＡＡＰｓｔｏｐ２０ウイルス産生をトランス補完（trans-complement）するため使用された、（Ａ）における構築物（緑および赤のバー）由来のグラフであり、ウイルス力価はそのＷＴ力価に対するパーセンテージとして報告される。グラフは２回の試行の平均を表す。†少なくとも１回の試行についてバックグラウンド（ｃａｐ遺伝子なし対照）未満の力価。パネルＣは両試行についての個々のデータを示す。
【図11】ＡＡＰｓｔｏｐ６０ウイルスはｗｔ ＡＡＰウイルスと区別がつかないことを実証する実験データを示す、顕微鏡画像およびグラフの一連の表示である。図１に関連する。パネルＡは、酢酸ウラニルで染色されＴＥＭにより撮像されたＡＡＶ３およびＡＡＶ３ＡＡＰｓｔｏｐ６０．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼベクターの写真である。パネルＢおよびＣは、ｈＡｄ５（ＭＯＩ＝２０）とともに一晩インキュベートし、次いでＡＡＶ３、ＡＡＶ３ＡＡＰｓｔｏｐ６０、ＡＡＶ９またはＡＡＶ９ＡＡＰｓｔｏｐ６０．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼをパネルＣのｘ軸に表示されるＧＣ／ウェルで添加したＨＥＫ２９３細胞からの結果である。４８時間時点でＧＦＰ蛍光を撮像した（パネルＢ；画像は各ベクターについて最大の力価を表す）。４８時間時点でルシフェラーゼ活性を定量化した（パネルＣ）。パネルＤは、ＡＡＶ３およびＡＡＶ９ ＷＴおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクターについて得られた、正規化されたＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ蛍光シグナルである。
【図12】以下の通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＡｎｃ８２対Ａｎｃ８２ＤＩについての実験データを示す一連のグラフである。図４に関連する。パネルＡは、ｈＡｄ５（ＭＯＩ＝２０）とともに一晩インキュベートし、次いでＡｎｃ８２またはＡｎｃ８２ＤＩ．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼベクターを、表示される通り１ｘ１０９または１ｘ１０８ＧＣ／ウェルで添加したＨＥＫ２９３細胞についてのグラフである。４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。パネルＢは、１ｘ１０１１ｖｇ／マウスのＡｎｃ８２、８２ＤＩ、またはＡＡＶ８．ＣＢ７．ＣＩ．ＥＧＦＰ．ＦＦ２Ａ．ｈＡ１ＡＴ．ＲＢＧを全身に注射されたマウスについてのグラフである。ｘ軸に表示される時点でサンプリングされた血清において、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡ１ＡＴ）レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【0016】
詳細な説明
実験または治療目的の遺伝子導入は、標的細胞に遺伝情報を往復させるのに、ベクターまたはベクター系に依存する。ベクターまたはベクター系は、遺伝子導入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理作用、および持続性の主要な決定因子と考えられる。現在、遺伝子導入を実現するための最も効率的かつ有効な方法は、複製欠損にされたウイルスに基づくベクターまたはベクター系の使用によるものである。複製欠損にされて遺伝子導入に使用される最も一般的なウイルスの１つは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
実験または治療目的の遺伝子導入は、標的細胞に遺伝情報を往復させるのに、ベクターまたはベクター系に依存する。ベクターまたはベクター系は、遺伝子導入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理作用、および持続性の主要な決定因子と考えられる。現在、遺伝子導入を実現するための最も効率的かつ有効な方法は、複製欠損にされたウイルスに基づくベクターまたはベクター系の使用によるものである。複製欠損にされて遺伝子導入に使用される最も一般的なウイルスの１つは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【0017】
ＡＡＶカプシドは、非エンベロープ型で正二十面体６０ｍｅｒの、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ＶＰ２、およびＶＰ３と呼ばれる３種の繰り返しタンパク質モノマーサブユニットである。ネステッドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するＡＡＶ ｃａｐ遺伝子から発現される単一の転写物が交互にスプライシングされ、ＶＰ３の長さにわたってＣ末端の同一性を共有する３種の別個のタンパク質産物を生じる。アセンブルされたカプシドにおけるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の１：１：１０の化学量論は各タンパク質の相対的存在量の結果と考えられ、これが、次にスプライス産物存在量およびＶＰ２の非標準のＡＣＧ翻訳開始コドンにより調節される。
【0018】
アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）は、ＡＡＶのカプシド（ｃａｐ）遺伝子内に埋め込まれた重複リーディングフレームの非標準のＣＴＧ開始コドンから発現される非構造タンパク質である。ＡＡＶ血清型は異なるＡＡＰ要求を有し、一部のＡＡＶ血清型はＡＡＰ依存性を示し（例えば、ＡＡＶ８、ｒｈ１０、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、およびＡｎｃ８４）、その他のＡＡＶ血清型はＡＡＰ非依存性を示す（例えば、ＡＡＶ９、ｒｈ８、およびＡｎｃ１１０）。
【0019】
本明細書で使用される場合、祖先スキャホールド配列は、進化確率（evolutionary probability）および進化モデリングを使用して構築され、これまでに存在したことも現在天然に存在することも知られていない配列を指す。これらのスキャホールド配列を本明細書で活用して、ＡＡＰ機能を調べ、ウイルスのＡＡＰ要求に関連するカプシド内の構造上の決定因子を描写した。
【0020】
本開示は、ＡＡＶのＡＡＰ依存性を改変する方法を提供する。例えば、ＡＡＶのパッケージング中のＡＡＰ依存性を低下させる（または、反対に、ＡＡＰ非依存を増大させる）、本明細書で特定されるモチーフを含むように、ＡＡＶカプシド配列を操作することができる。これにより、これらに限定されないが、任意のＡＡＶ産生系（例えば哺乳動物、酵母、昆虫細胞）における産生的粒子アセンブリに必要な成分の数を減少させる能力、ＡＡＰにより課される制約の減少によりＡＡＶカプシド構造を最適化する能力、最小限の成分からのＡＡＶカプシド自己アセンブリの可能性、および最終ベクター調製におけるＡＡＰ混入の懸念の低下を含む、製造中の複数の利益がもたらされる。
【0021】
改変されたＡＡＰ依存性を付与するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）核酸およびポリペプチド配列
元はＡｎｃ８２配列（配列番号１、配列番号２によりコードされる）に基づく、パッケージング中にＡＡＰ依存性を示すＡＡＶカプシド配列を、Ａｎｃ８２ＤＩ（配列番号３、配列番号４によりコードされる）を産生するように本明細書に記載される通り改変した。Ａｎｃ８２ＤＩはパッケージング中にＡＡＰ非依存性を示すが、強力な遺伝子導入ベクターとしての機能性を保持していると考えられる。ＡＡＰ依存性配列にＡＡＰ非依存性を付与する配列モチーフを表６に提供する。
元はＡｎｃ８２配列（配列番号１、配列番号２によりコードされる）に基づく、パッケージング中にＡＡＰ依存性を示すＡＡＶカプシド配列を、Ａｎｃ８２ＤＩ（配列番号３、配列番号４によりコードされる）を産生するように本明細書に記載される通り改変した。Ａｎｃ８２ＤＩはパッケージング中にＡＡＰ非依存性を示すが、強力な遺伝子導入ベクターとしての機能性を保持していると考えられる。ＡＡＰ依存性配列にＡＡＰ非依存性を付与する配列モチーフを表６に提供する。
【0022】
【表1】
【0023】
Ａｎｃ８２タンパク質（配列番号１）
【0024】
【化1】
【0025】
【化2】
【0026】
【化3】
【0027】
【化4】
【0028】
配列番号１および３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、配列番号１および３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するポリペプチドが提供される。同様に、配列番号２および４に示す核酸分子に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有する核酸分子が提供される。
【0029】
パーセント配列同一性を算出するにあたって、２つの配列を整列させ、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一マッチ数を決定する。同一マッチ数を整列させた領域の長さ（すなわち、整列させたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、１００を乗じてパーセント配列同一性値に至る。整列させた領域の長さは、最短の配列の全長サイズまでの、一方または両方の配列の一部であってもよいことが理解されよう。単一の配列を１を超えるその他の配列と整列させてもよく、したがって、整列させた各領域について異なるパーセント配列同一性値を有しうることも理解されよう。
【0030】
パーセント配列同一性を決定するための２つ以上の配列の整列化は、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて入手可能であるＢＬＡＳＴ（基本ローカル整列化検索ツール）プログラムに組み込まれている、Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:3389 3402)により記載されるアルゴリズムを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴ検索を実施して、Altschul et al.アルゴリズムを使用して整列させた配列（核酸またはアミノ酸）と任意のその他の配列またはその部分との間のパーセント配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列間の同一性を整列させ比較するのに使用されるプログラムであり、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列間の同一性を整列させ比較するのに使用されるプログラムである。配列と別の配列との間のパーセント同一性を算出するのにＢＬＡＳＴプログラムを利用する際には、各プログラムのデフォルトパラメーターが概して使用される。
【0031】
本開示は、ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクターも提供する。発現ベクターを含めたベクターは市販であっても、組換え技術によって産生されてもよい。核酸分子を含有するベクターは、このような核酸分子に作動可能に連結された、発現のための１つまたは複数のエレメントを有していてもよく、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）をコードする配列、および／またはポリペプチドの精製に使用可能な配列（例えば、６ｘＨｉｓタグ）などの配列をさらに含んでいてもよい。発現のためのエレメントには、核酸コード配列の発現を誘導および調節する核酸配列が含まれる。発現エレメントの一例はプロモーター配列である。発現エレメントには、核酸分子の発現をモジュレートするイントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または誘導性エレメントのうち１つまたは複数も含まれていてよい。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、またはウイルス起源であってもよく、ベクターは異なる起源の発現エレメントの組合せを含有していてもよい。本明細書で使用される場合、作動可能に連結されるとは、発現のためのエレメントが、コード配列の発現を誘導または調節するように、ベクターにおいてコード配列に対して位置づけられていることを意味する。
【0032】
核酸分子、例えばベクター（例えば、ウイルスベクターなどの発現ベクター）中の核酸分子は、宿主細胞に導入されうる。「宿主細胞」という語は、核酸分子が導入された特定の細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。多くの適切な宿主細胞が当業者に既知であり、宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））であっても真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）であってもよい。代表的な宿主細胞には、これらに限定されないが、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が含まれうる。核酸分子を宿主細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介性核酸導入（例えば、形質導入）を含む。
【0033】
ポリペプチドに関して、「精製された」は、ポリペプチドに天然に付随する細胞成分から分離または精製されたポリペプチド（すなわち、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。典型的には、ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、天然に伴うポリペプチドおよび天然に存在する分子不含である場合に「精製された」と考えられる。化学的に合成されたポリペプチドは本質的に天然に付随する成分から分離されているため、合成ポリペプチドは「精製された」と考えられるが、ポリペプチド（例えば、アミノ酸残基）を合成するのに使用される成分からさらに取り出されてもよい。核酸分子に関して、「単離された」は、ゲノムにおいて通常伴うその他の核酸分子から分離された核酸分子を指す。さらに、単離された核酸分子には、組換えまたは合成核酸分子などの操作された核酸分子が含まれうる。
【0034】
ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、および／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの既知の方法により、天然の供給源（例えば、生物試料）から得られる（例えば、精製されうる）。精製されたポリペプチドは、例えば、発現ベクターにおいて核酸分子を発現させること、または化学合成によっても得られる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定することができる。同様に、核酸分子は、これらに限定されないが、組換え核酸技術（例えば、制限酵素消化およびライゲーション）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995を参照のこと）などの定常的な方法を使用して得られる（例えば、単離されうる）。さらに、単離された核酸分子は化学的に合成することもできる。
【0035】
改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルス粒子を作製する方法
ウイルスまたはその部分の望ましい配列（例えば、改変されたＡＡＰ依存性を有する）が決定された後、実際の核酸分子および／またはポリペプチドが生成、例えば、合成されうる。例えばｉｎ ｓｉｌｉｃｏで得られた配列に基づいて人工の核酸分子またはポリペプチドを生成する方法が当技術分野で既知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポリペプチドを生成するさらなる方法が当技術分野で既知であり、以下でより詳細に論じられる。
ウイルスまたはその部分の望ましい配列（例えば、改変されたＡＡＰ依存性を有する）が決定された後、実際の核酸分子および／またはポリペプチドが生成、例えば、合成されうる。例えばｉｎ ｓｉｌｉｃｏで得られた配列に基づいて人工の核酸分子またはポリペプチドを生成する方法が当技術分野で既知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポリペプチドを生成するさらなる方法が当技術分野で既知であり、以下でより詳細に論じられる。
【0036】
ポリペプチドが産生されると、または核酸分子が生成および発現されてポリペプチドを産生すると、ポリペプチドは、例えばパッケージング宿主細胞を使用してウイルス粒子にアセンブルされうる。ウイルス粒子の成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列）は、本明細書に記載される１つまたは複数のベクターを使用して、パッケージング宿主細胞に一過性にまたは安定に導入されうる。
【0037】
ウイルス粒子は、定常的な方法を使用して精製されうる。本明細書で使用される場合、「精製された」ウイルス粒子は、これらに限定されないが、ウイルス成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列）、パッケージング宿主細胞、および部分的にまたは不完全にアセンブルされたウイルス粒子などの、ウイルスが作製された混合物中の成分から取り出されたウイルス粒子を指す。
【0038】
アセンブルされると、ウイルス粒子は、例えば、複製する能力；遺伝子導入特性；受容体結合能力；および／または集団（例えばヒト集団）における血清普及率（seroprevalence）についてスクリーニングされうる。ウイルス粒子が複製可能かどうかを決定することは当技術分野で定常的であり、典型的には、一定量のウイルス粒子を宿主細胞に感染させ、ウイルス粒子が数において経時的に増加するかどうかを決定することを含む。ウイルス粒子が遺伝子導入を実施することができるかどうかを決定することも当技術分野で定常的であり、典型的には、導入遺伝子（例えば、レポーター遺伝子などの検出可能な導入遺伝子、以下でより詳細に論じられる）を含むウイルス粒子を宿主細胞に感染させることを含む。ウイルスの感染およびクリアランス後、導入遺伝子の存在または非存在について宿主細胞を評価することができる。ウイルス粒子がその受容体に結合するかどうかを決定することは当技術分野で定常的であり、このような方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施可能である。
【0039】
ウイルス粒子の血清普及率を決定することは当技術分野で定常的に実施されており、典型的には、イムノアッセイを使用して、特定の個体集団由来の試料（例えば、血液試料）中の１つまたは複数の抗体の普及率を決定することを含む。血清普及率は、血清陽性である（すなわち、特定の病原体または免疫原に曝露されたことがある）、集団における対象の割合を指すと当技術分野で理解され、特定の病原体または免疫原に対する抗体を産生する、集団における対象の数を、試験を行った集団における個体の総数で割ったものとして算出される。免疫測定法は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、イムノドット（immunodot）、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または放射免疫測定法（ＲＩＡ）を含む。単に例として、そのそれぞれが所与の集団における特定の抗体の血清普及率を決定した、Xu et al. (2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6)；Paul et al. (1994, J. Infect. Dis., 169:801-6)；Sauerbrei et al. (2011, Eurosurv., 16(44):3)；Boutin et al. (2010, Hum. Gene Ther., 21:704-12)；Calcedo et al. (2009, J. Infect. Dis., 199:381-90)；およびSakhria et al. (2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429）を参照のこと。
【0040】
本明細書に記載される通り、ウイルス粒子は、人、例えば患者の免疫系により中和されうる。血清試料中の中和抗体の程度を決定するいくつかの方法が利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を有しない対照試料と比較して、５０％またはそれを超えて、感染を中和する抗体濃度を含有する力価を測定する。Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12)およびManning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85)も参照のこと。
【0041】
改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を使用する方法
本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、複数の研究および／または治療上の適用に使用することができる。例えば、本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、ヒトまたは獣医学において、遺伝子療法（例えば、遺伝子導入のためのベクターまたはベクター系）またはワクチン投与（例えば、抗原提示）に使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、遺伝子付加、遺伝子増強、ポリペプチド治療薬の遺伝子送達、遺伝子ワクチン投与、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子療法、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング（miRNA sponging）、遺伝子免疫化、光遺伝学的遺伝子療法、遺伝子導入（transgenesis）、ＤＮＡワクチン投与、またはＤＮＡ免疫化に使用することができる。
本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、複数の研究および／または治療上の適用に使用することができる。例えば、本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、ヒトまたは獣医学において、遺伝子療法（例えば、遺伝子導入のためのベクターまたはベクター系）またはワクチン投与（例えば、抗原提示）に使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、遺伝子付加、遺伝子増強、ポリペプチド治療薬の遺伝子送達、遺伝子ワクチン投与、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子療法、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング（miRNA sponging）、遺伝子免疫化、光遺伝学的遺伝子療法、遺伝子導入（transgenesis）、ＤＮＡワクチン投与、またはＤＮＡ免疫化に使用することができる。
【0042】
宿主細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、培養物中で増殖させる）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、対象において）で、改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を形質導入するまたは感染させることができる。改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分をｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入するまたは感染させることができる宿主細胞は本明細書に記載される。祖先ウイルスまたはその部分をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入するまたは感染させることができる宿主細胞には、これらに限定されないが、脳、肝臓、筋肉、肺、眼（例えば、網膜、網膜色素上皮）、腎臓、心臓、生殖腺（例えば、精巣、子宮、卵巣）、皮膚、鼻腔、消化器系、膵臓、膵島細胞、ニューロン、リンパ球、耳（例えば、内耳）、毛包、および／または腺（例えば、甲状腺）が含まれる。
【0043】
本明細書に記載される改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、導入遺伝子を含む（その他のウイルス配列とシスまたはトランスで）ように改変することができる。導入遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子（例えば、ベータ－ラクタマーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、またはルシフェラーゼ、または、血球凝集素もしくはＭｙｃなどの抗原タグドメインを含む融合ポリペプチド）、または治療遺伝子（例えば、ホルモンもしくはその受容体、増殖因子もしくはその受容体、分化因子もしくはその受容体、免疫系調節因子（例えば、サイトカインおよびインターロイキン）もしくはその受容体、酵素、ＲＮＡ（例えば、阻害性ＲＮＡまたは触媒ＲＮＡ）、または標的抗原（例えば、発癌性抗原、自己免疫性抗原）をコードする遺伝子）とすることができる。
【0044】
特定の導入遺伝子は、少なくとも一部は、治療される特定の疾患または欠損症によって決まる。単に例として、遺伝子導入または遺伝子療法は、血友病、網膜色素変性症、嚢胞性線維症、ｌｅｂｅｒ先天黒内障、リソソーム蓄積症、先天性代謝異常（例えば、フェニルケトン尿症を含む先天性アミノ酸代謝異常、プロピオン酸血症を含む先天性有機酸代謝異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）を含む先天性脂肪酸代謝異常）、がん、色覚異常、錐体杆体ジストロフィー、黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満、炎症性腸障害、糖尿病、うっ血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠動脈性心疾患、家族性腎アミロイドーシス、Ｍａｒｆａｎ症候群、致死性家族性不眠症、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｋｏｂ病、鎌状赤血球症、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ病、前頭側頭葉変性症、Ｕｓｈｅｒ症候群、乳糖不耐症、脂質蓄積障害（例えば、Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病、Ｃ型）、Ｂａｔｔｅｎ病、コロイデレミア、糖原病ＩＩ型（Ｐｏｍｐｅ病）、毛細血管拡張性運動失調症（Ｌｏｕｉｓ－Ｂａｒ症候群）、先天性甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、および／または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療に適用することができる。
【0045】
導入遺伝子は、例えば、対象（例えば、ヒト、動物（例えば、伴侶動物、家畜、絶滅危惧動物）を免疫化するのに有用な免疫原とすることもできる。例えば、免疫原は生物（例えば、病原性生物）またはその免疫原性部分もしくは成分（例えば、毒素ポリペプチドまたはその副産物）から得られる。例として、免疫原性ポリペプチドが得られる病原性生物には、ウイルス（例えば、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、オルソミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス）、原核生物（例えば、肺炎球菌（Pneumococci）、ブドウ球菌属（Staphylococci）、リステリア属（Listeria）、シュードモナス属（Pseudomonas））、および真核生物（例えば、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、線虫）が含まれる。本明細書に記載される方法およびこのような方法により産生される組成物が、いかなる特定の導入遺伝子によっても制限されるべきでないことが理解されるはずである。
【0046】
通常は生理学的に適合する担体で懸濁される、改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分を、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適切な担体には、様々な緩衝溶液により製剤化されうる生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、および水が含まれる。改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分は、細胞に形質導入するまたは感染させるのに十分な量、かつ十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらし、過度の副作用なしに治療上の利益をもたらすのに十分な量で投与される。従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、これらに限定されないが、例えば肝臓または肺などの器官への、経口的、経鼻的、気管内、吸入による、静脈内、筋肉内、眼内、皮下、皮内、経粘膜的、またはその他の投与経路による直接送達が含まれる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
【0047】
対象に投与される、改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分の用量は主に、治療される状態、ならびに対象の年齢、体重、および健康状態などの因子によって決まる。例えば、ヒト対象に投与される、改変されたＡＡＰ依存性を有するウイルスまたはその部分の治療上有効な投与量は概して、濃度約１ｘ１０１～１ｘ１０１２のウイルスゲノムコピー（ＧＣ）（例えば、約１ｘ１０３～１ｘ１０９ＧＣ）を含有する溶液約０．１ｍＬ～約１０ｍＬの範囲にある。形質導入および／または導入遺伝子発現は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質アッセイにより、投与後の種々の時点でモニタリングすることができる。一部の例では、導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、投薬の頻度および／または量を決定することができる。治療目的で記載されるものと同様の投薬レジメンを、免疫化に利用することもできる。
【0048】
本発明によれば、当技術分野の技術の範囲内の、従来の分子生物学、微生物学、生化学的、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。このような技術は文献において十分に説明されている。本発明は、請求項に記載される方法および組成物の範囲を制限しない以下の実施例においてさらに記載される。
【実施例】
【0049】
実施例１ ベクターおよび配列
アデノ随伴ウイルスベクターを、現存のまたは祖先のウイルスカプシドのいずれかによりシュードタイプ化した（pseudotyped）。現存のカプシドには、ＡＡＶ１（Ｇｅｎｂａｎｋ［ＧＢ］ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ２（ＧＢ ＡＡＣ０３７８０．１）、ＡＡＶ３（ＧＢ Ｕ４８７０４．１）、ＡＡＶ４（ＧＢ Ｕ８９７９０．１）、ＡＡＶ５（ＧＢ ＡＡＤ１３７５６．１）、ＡＡＶ６（ＧＢ ＡＦ０２８７０４．１）、ＡＡＶ７（ＮＣ＿００６２６０．１）Ｒｈ．１０（ｇｂ ＡＡＯ８８２０１．１）、ＡＡＶ８（ＧＢ ＡＡＮ０３８５７．１）、ＡＡＶ９（ＧＢ ＡＡＳ９９２６４．１）、およびＲｈ３２．３３（ＧＢ ＥＵ３６８９２６）が含まれる。祖先ＡＡＶカプシドには、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７（ＫＴ２３５８０４－ＫＴ２３５８１２）が含まれる。本研究では、Ａｎｃ８３は推定ＡＡＰ ＯＲＦ：Ｑ１Ｌ（８３ＡＡＰ－ＫＩ）で以下の突然変異を有する。
アデノ随伴ウイルスベクターを、現存のまたは祖先のウイルスカプシドのいずれかによりシュードタイプ化した（pseudotyped）。現存のカプシドには、ＡＡＶ１（Ｇｅｎｂａｎｋ［ＧＢ］ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ２（ＧＢ ＡＡＣ０３７８０．１）、ＡＡＶ３（ＧＢ Ｕ４８７０４．１）、ＡＡＶ４（ＧＢ Ｕ８９７９０．１）、ＡＡＶ５（ＧＢ ＡＡＤ１３７５６．１）、ＡＡＶ６（ＧＢ ＡＦ０２８７０４．１）、ＡＡＶ７（ＮＣ＿００６２６０．１）Ｒｈ．１０（ｇｂ ＡＡＯ８８２０１．１）、ＡＡＶ８（ＧＢ ＡＡＮ０３８５７．１）、ＡＡＶ９（ＧＢ ＡＡＳ９９２６４．１）、およびＲｈ３２．３３（ＧＢ ＥＵ３６８９２６）が含まれる。祖先ＡＡＶカプシドには、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、Ａｎｃ８４、Ａｎｃ１１０、Ａｎｃ１１３、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７（ＫＴ２３５８０４－ＫＴ２３５８１２）が含まれる。本研究では、Ａｎｃ８３は推定ＡＡＰ ＯＲＦ：Ｑ１Ｌ（８３ＡＡＰ－ＫＩ）で以下の突然変異を有する。
【0050】
実施例２ 部位特異的突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用し、製造業者の説明書に従って、ＡＡＰｓｔｏｐ６０、ＡＡＰｓｔｏｐ２０、および８２ＤＩ単一復帰変異体突然変異を生成した。８２ＤＩを生成するのには、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを、製造業者の説明書に従って、２相で使用した：まず、Ａｎｃ８２骨格の５つの部位を突然変異させ、次いでこの五重突然変異体骨格に残りの５つの突然変異を導入した。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用し、製造業者の説明書に従って、ＡＡＰｓｔｏｐ６０、ＡＡＰｓｔｏｐ２０、および８２ＤＩ単一復帰変異体突然変異を生成した。８２ＤＩを生成するのには、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを、製造業者の説明書に従って、２相で使用した：まず、Ａｎｃ８２骨格の５つの部位を突然変異させ、次いでこの五重突然変異体骨格に残りの５つの突然変異を導入した。
【0051】
実施例３ 粗ウイルス調製／力価測定
全ての血清型および突然変異体における産生をアッセイするためのウイルス調製物を以下の通り調製した：ＡＡＶ ｃｉｓ ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｌｕｃ－ＩＴＲ（２μｇ）、ＡＡＶ ｔｒａｎｓ ｒｅｐ－ｃａｐ（２μｇ）、およびアデノウイルスヘルパープラスミド（４μｇ）のポリエチレンイミントランスフェクションを、ＨＥＫ２９３細胞に対して６ウェルディッシュにおいて９０％培養密度で実施した。無血清培地においてＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＤＮＡ比を１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。７２時間後に、３回の凍結／解凍サイクル、その後の１５０００ｘｇでの遠心処理によりウイルスを採取した。
全ての血清型および突然変異体における産生をアッセイするためのウイルス調製物を以下の通り調製した：ＡＡＶ ｃｉｓ ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｌｕｃ－ＩＴＲ（２μｇ）、ＡＡＶ ｔｒａｎｓ ｒｅｐ－ｃａｐ（２μｇ）、およびアデノウイルスヘルパープラスミド（４μｇ）のポリエチレンイミントランスフェクションを、ＨＥＫ２９３細胞に対して６ウェルディッシュにおいて９０％培養密度で実施した。無血清培地においてＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＤＮＡ比を１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。７２時間後に、３回の凍結／解凍サイクル、その後の１５０００ｘｇでの遠心処理によりウイルスを採取した。
【0052】
ＤＲＰ力価については、粗調製物をＤＮＡ分解酵素Ｉ処理し、抵抗性の（パッケージングされた）ベクターゲノムコピーを使用して、導入遺伝子カセットのＣＭＶプロモーター領域を検出するプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により調製物を力価測定した。
【0053】
実施例４ 熱安定性アッセイ（ＡＡＶ－ＩＤ）
ＡＡＶ－ＩＤ（Pacouret et al., 2017, Mol. Ther., 25:1375-86）により、精製されたベクターの熱安定性をアッセイした。簡潔に言えば、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５０Ｘの試料５００μＬを、溶媒としてＰＢＳ２＋（２１－０３０－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を使用して調製した。９６ウェルプレートに試料４５μＬをローディングし、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ ５０Ｘ ５μＬを補充した。ＰＢＳ２＋および０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｌ６８７６、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）溶液をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。プレートを密封して３０００ｒｐｍで２分間遠心処理し、次いで、７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）に入れた。両ｑＰＣＲシステムで利用可能なＲＯＸフィルターキューブを使用してＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光をモニタリングしながら、試料を２５℃で２分間インキュベートし、その後温度勾配にかけた（２５～９９℃、約２℃／１０分間、０．４℃温度増加でステップアンドホールドモード（step and hold mode））。蛍光シグナルＦは０～１００％の間で正規化し、融解温度は数値での微分係数ｄＦ／ｄＴがその最大値に到達した温度と定義した。
ＡＡＶ－ＩＤ（Pacouret et al., 2017, Mol. Ther., 25:1375-86）により、精製されたベクターの熱安定性をアッセイした。簡潔に言えば、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５０Ｘの試料５００μＬを、溶媒としてＰＢＳ２＋（２１－０３０－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を使用して調製した。９６ウェルプレートに試料４５μＬをローディングし、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ ５０Ｘ ５μＬを補充した。ＰＢＳ２＋および０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｌ６８７６、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）溶液をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。プレートを密封して３０００ｒｐｍで２分間遠心処理し、次いで、７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）に入れた。両ｑＰＣＲシステムで利用可能なＲＯＸフィルターキューブを使用してＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素の蛍光をモニタリングしながら、試料を２５℃で２分間インキュベートし、その後温度勾配にかけた（２５～９９℃、約２℃／１０分間、０．４℃温度増加でステップアンドホールドモード（step and hold mode））。蛍光シグナルＦは０～１００％の間で正規化し、融解温度は数値での微分係数ｄＦ／ｄＴがその最大値に到達した温度と定義した。
【0054】
実施例５ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＰＲＯＧＥＮ ＡＡＶ ２ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡキット（ｒｅｆ＃ＰＲＡＴＶ）を用い、製造業者の説明書に従って、粗ウイルス調製物に対してＡ２０カプシドＥＬＩＳＡを実施した。
ＰＲＯＧＥＮ ＡＡＶ ２ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡキット（ｒｅｆ＃ＰＲＡＴＶ）を用い、製造業者の説明書に従って、粗ウイルス調製物に対してＡ２０カプシドＥＬＩＳＡを実施した。
【0055】
α－１アンチトリプシン用Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ ＥＬＩＳＡキット（ＳＥＢ６９７Ｈｕ、９６テスト）を用い、製造業者の説明書に従って、マウス血清の１：１２５０～１：１００００段階希釈物に対してｈＡ１ＡＴ ＥＬＩＳＡを実施した。
【0056】
実施例６ 動物研究
Ｃ５７ＢＬ／６オスマウス（６～８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。実験手順は全て、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコールに従って実施した。
Ｃ５７ＢＬ／６オスマウス（６～８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。実験手順は全て、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコールに従って実施した。
【0057】
腹腔内へのケタミン／キシラジンでマウスを麻酔した。各動物に、１．００Ｅ＋１１ＶＧ／マウスの以下のベクター：Ａｎｃ８２．ＣＢ７．ＣＩ．ＥＧＦＰ．ＦＦ２Ａ．ｈＡ１ＡＴ．ＲＢＧおよびＡｎｃ８２ＤＩ．ＣＢ７．ＣＩ．ＥＧＦＰ．ＦＦ２Ａ．ｈＡ１ＡＴ．ＲＢＧを後眼窩注射した（１００μｌ）。注射前、ならびに注射３、７、１５および２８日後に、ＧｏｌｄｅｎＲｏｄアニマルランセット（ＭＥＤＩｐｏｉｎｔ、Ｉｎｃ．）を使用して顎下放血により血液を収集した。試料を８，０００ｒｐｍで７．５分間遠心処理し、血清を収集した。
【0058】
動物を安楽死させ、肝臓を収集して４％パラホルムアルデヒド溶液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間浸漬させ、次いで３０％スクロース中に一晩配置した。翌日、肝臓をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）に載せ、低温のイソペンタンで急速凍結させた。
【0059】
実施例７ 組織の組織学
肝臓におけるｅＧＦＰ発現を可視化するため、ＤＡＰＩ含有ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）Ｈａｒｄ Ｓｅｔ（商標）封入剤（Ｈ－１５００）を用いて１５μｍの切片を載せ、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２を用いて、全ての切片にわたって同じゲインおよび強度で撮像した。
肝臓におけるｅＧＦＰ発現を可視化するため、ＤＡＰＩ含有ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）Ｈａｒｄ Ｓｅｔ（商標）封入剤（Ｈ－１５００）を用いて１５μｍの切片を載せ、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２を用いて、全ての切片にわたって同じゲインおよび強度で撮像した。
【0060】
実施例８ 分子表示
本研究における分子の表示は全て、ＰｙＭＯＬならびに蛋白質構造データバンクファイル２ＱＡ０（ＡＡＶ８）および３ＵＸ１（ＡＡＶ９）を使用して生成した。
本研究における分子の表示は全て、ＰｙＭＯＬならびに蛋白質構造データバンクファイル２ＱＡ０（ＡＡＶ８）および３ＵＸ１（ＡＡＶ９）を使用して生成した。
【0061】
実施例９ ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｓ、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９ｓの産生および精製
ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（２５－４１１２－１１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ＡＡＶ３およびＡＡＶ３ｓ）、または製造業者の説明書に準拠して、ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９アフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（ＡＡＶ９およびＡＡＶ９ｓ）のいずれかを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、ベクターを精製した。
ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（２５－４１１２－１１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ＡＡＶ３およびＡＡＶ３ｓ）、または製造業者の説明書に準拠して、ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９アフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（ＡＡＶ９およびＡＡＶ９ｓ）のいずれかを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、ベクターを精製した。
【0062】
大規模粗調製物をベンゾナーゼ処理し（２５０Ｕ／ｍＬ、１時間、３７℃）その後遠心処理ステップ（１時間、１０，０００ｒｐｍ、２０℃）を行い、次いで０．２μｍ Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗフィルターを使用して濾過した。ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（２５－４１１２－１１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍＬで予め充填されたＨｉＴｒａｐカラム（ＡＡＶ３およびＡＡＶ３ｓ）、または製造業者の説明書に準拠して、ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９アフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１ｍＬで充填された５ｘ１２５ｍｍ Ｅｃｏｎｏｌｉｎｅカラム（ＴＡＣ０５／１２５ＰＥ０－ＡＢ－３、ｅｓｓｅｎｔｉａｌＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（ＡＡＶ９およびＡＡＶ９ｓ）のいずれかを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、ベクターを精製した。カラムを５カラム体積（ＣＶ）の０．１Ｍ Ｈ３ＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２（１ｍＬ／分）で衛生化し、５ＣＶのＰＢＳ（２１－０３０－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）（１ｍＬ／分）で平衡化した。清澄にされた溶解物を１ｍＬ／分で注入した。カラムを１０ＣＶのＰＢＳ（１ｍＬ／分）でさらに洗浄した。０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５ ３ｍＬ（１ｍＬ／分）でベクター粒子を溶出し、１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ１０ ４００μＬで直ちに中和した。試料をさらにＰＢＳで緩衝液交換し、製造業者の説明書に準拠してＡｍｉｃｏｎ濾過（ＵＦＣ９１００２４、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮した。試料純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、ＤＮＡ分解酵素Ｉ抵抗性ベクターゲノムは、ＳＶ４０またはｅＧＦＰを標的とするプライマーおよびプローブとともにＴａｑＭａｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）システムを使用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により定量化した。
【0063】
実施例１０ 統計方法
データは全てＲを使用して分析し、その後図で報告するため正規化した（別途示されない限り）。Ｐ値は表２で報告する。ウイルス力価は対応のある片側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較し、ＲＮＡレベルは対応のある両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較した。
データは全てＲを使用して分析し、その後図で報告するため正規化した（別途示されない限り）。Ｐ値は表２で報告する。ウイルス力価は対応のある片側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較し、ＲＮＡレベルは対応のある両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較した。
【0064】
表２は、図１、２、３、および４に関連する統計解析を示す。統計解析は全てＲで実施し、その後データについて、表の左側に表示される主要な図において報告するため正規化した。パネルＡは、バックグラウンドを差し引いた後（ｃａｐ遺伝子なしの対照）、ｑＰＣＲにより測定されるＷＴおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０ウイルス力価を比較する。Ｐ値は対応のある片側ｔ検定から得られた。ＮＤ＝「未決定」；測定されたバックグラウンドの３標準偏差以内の１回または複数の試行を有する血清型に対してはｔ検定を実施することができなかった。パネルＢは、ＡＡＰｓｔｏｐ６０またはレスキューをＷＴのＲＮＡレベルに対して比較する（全てＧＡＰＤＨに対して正規化）。Ｐ値は対応のある両側ｔ検定から得られた。
【0065】
実施例１１ 発現構築物
ＡＡＰ－ＨＡ：ＢｓｉＷＩオーバーハング（５’ＧＴＡＣ、３’ＣＡＴＧ）を有し血球凝集素（ＨＡ）タグをコードする相補的オリゴヌクレオチドを、５°／分で９５℃～２５℃の勾配をなすＴ４リガーゼ緩衝液中でアニーリングさせ、ＰＮＫ処理し、ＢｓｉＷＩで消化されＣＩＰ処理されたＡＡＶ１およびＡＡＶ３ ｗｔおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドにライゲーションした。
ＡＡＰ－ＨＡ：ＢｓｉＷＩオーバーハング（５’ＧＴＡＣ、３’ＣＡＴＧ）を有し血球凝集素（ＨＡ）タグをコードする相補的オリゴヌクレオチドを、５°／分で９５℃～２５℃の勾配をなすＴ４リガーゼ緩衝液中でアニーリングさせ、ＰＮＫ処理し、ＢｓｉＷＩで消化されＣＩＰ処理されたＡＡＶ１およびＡＡＶ３ ｗｔおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドにライゲーションした。
【0066】
ＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１およびＣＭＶ－ＶＰ３：以下の改変：５’末端に付加されたＥｃｏＲＩ部位、開始コドン、およびＨＡ配列、ＶＰ２開始コドンのＡＣＧからＡＣＣへの突然変異、ならびにＶＰ３開始コドンのＡＴＧからＣＴＧへの突然変異、を有する、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、Ａｎｃ８２、および８２ＤＩ用のＶＰ１のｂｐ＃４－６９６のｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＩＤＴ）を得た。ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）はｃａｐにおいて保存されたＢｓｒＤＩ制限部位を含む；ｇＢｌｏｃｋｓをＥｃｏＲＩおよびＢｓｒＤＩで消化した。ＶＰ３配列を、５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込むプライマーにより、適切なＡＡＰｓｔｏｐ６０ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドからＰＣＲ増幅させ、次いでＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＣＭＶ－ＶＰ３用）またはＢｓｒＤＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１用）のいずれかで消化した。断片を適切な組合せでｐＣＤＮＡ３．１（－）にライゲーションした。ＣＭＶ－ＡＡＰ２については、ＡＡＰをＡＡＶ２ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドから増幅させ、ｐＣＤＮＡ３．１（－）にライゲーションした。
【0067】
実施例１２ タンパク質溶解物調製および分解／代謝回転研究
粗ウイルス調製と同様にトランスフェクションを実施した。３６時間時点で、上清を吸引し、溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（商標）プロテアーゼ阻害剤を追加）１００μＬ（図２）または１５０μＬ（図３および４）で細胞をプレートにおいて溶解させた。溶解物を１５，０００ｘｇの遠心処理により清澄にし、アクチンについては溶解緩衝液で１：５０に、またはチューブリンローディング対照ブロットについては１：１００に希釈し、４ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液＋０．５％βＭＥで９０℃で変性させた。１ウェルあたりに総タンパク質（またはローディング対照ブロットについてはその希釈物）１００μｇ（図２）または５０μｇ（図３および４）をローディングし、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％ビス－トリスゲルで電気泳動した。プロテアソームおよびリソソーム阻害実験に関しては、トランスフェクション２４時間後に培地を除去し、適切な濃度のボルテゾミブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ＰＳ－３４１）、ＭＬＮ７２４３（Ｃｈｅｍｇｏｏｄ Ｃ－１２３３）、バフィロマイシン（Ｅｎｚｏ ＢＭＬ－ＣＭ１１０－０１００）、またはＤＭＳＯ（ｗｔおよびＡＡＰｓｔｏｐ未処理試料用）を含む培地に交換し、さらに８時間インキュベートした。１ウェルあたりに総タンパク質２５μｇをローディングした（ローディング対照については１：１０に希釈）。タンパク質合成を遮断することによるタンパク質代謝回転実験については、トランスフェクション２４時間後に培地を除去し、５０μｇ／ｍＬ ＣＨＸ（Ｓｉｇｍａ Ｃ７６９８）を含有する培地に交換し、溶解物を１、２、４、６、および８時間時点で上記のように採取し、０時間時点では培地は交換しないが溶解物を採取した。ここで記載されるトランスフェクションおよび薬物インキュベーション全てを通して１０％ＦＢＳを維持した。
粗ウイルス調製と同様にトランスフェクションを実施した。３６時間時点で、上清を吸引し、溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（商標）プロテアーゼ阻害剤を追加）１００μＬ（図２）または１５０μＬ（図３および４）で細胞をプレートにおいて溶解させた。溶解物を１５，０００ｘｇの遠心処理により清澄にし、アクチンについては溶解緩衝液で１：５０に、またはチューブリンローディング対照ブロットについては１：１００に希釈し、４ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液＋０．５％βＭＥで９０℃で変性させた。１ウェルあたりに総タンパク質（またはローディング対照ブロットについてはその希釈物）１００μｇ（図２）または５０μｇ（図３および４）をローディングし、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％ビス－トリスゲルで電気泳動した。プロテアソームおよびリソソーム阻害実験に関しては、トランスフェクション２４時間後に培地を除去し、適切な濃度のボルテゾミブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ＰＳ－３４１）、ＭＬＮ７２４３（Ｃｈｅｍｇｏｏｄ Ｃ－１２３３）、バフィロマイシン（Ｅｎｚｏ ＢＭＬ－ＣＭ１１０－０１００）、またはＤＭＳＯ（ｗｔおよびＡＡＰｓｔｏｐ未処理試料用）を含む培地に交換し、さらに８時間インキュベートした。１ウェルあたりに総タンパク質２５μｇをローディングした（ローディング対照については１：１０に希釈）。タンパク質合成を遮断することによるタンパク質代謝回転実験については、トランスフェクション２４時間後に培地を除去し、５０μｇ／ｍＬ ＣＨＸ（Ｓｉｇｍａ Ｃ７６９８）を含有する培地に交換し、溶解物を１、２、４、６、および８時間時点で上記のように採取し、０時間時点では培地は交換しないが溶解物を採取した。ここで記載されるトランスフェクションおよび薬物インキュベーション全てを通して１０％ＦＢＳを維持した。
【0068】
実施例１３ ウェスタン／ドットブロッティング
電気泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、一次抗体（Ｂ１、１：２５０、ＡＲＰ＃０３－６５１５８；アクチン、１：２００００、Ａｂｃａｍ ８２２７；チューブリン、１：２００００、Ａｂｃａｍ ７２９１；ＨＡ、１：５０００、Ａｂｃａｍ ９１１０；ｐ６２、１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ５１１４）とともに一晩インキュベートし、抗マウス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬＮＸＡ９３１／ＡＥ）または抗ウサギ（Ｓｉｇｍａ Ａ０５４５）ＨＲＰコンジュゲート二次抗体、およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ ＰｉｃｏまたはＦｅｍｔｏで検出した。
電気泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、一次抗体（Ｂ１、１：２５０、ＡＲＰ＃０３－６５１５８；アクチン、１：２００００、Ａｂｃａｍ ８２２７；チューブリン、１：２００００、Ａｂｃａｍ ７２９１；ＨＡ、１：５０００、Ａｂｃａｍ ９１１０；ｐ６２、１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ５１１４）とともに一晩インキュベートし、抗マウス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬＮＸＡ９３１／ＡＥ）または抗ウサギ（Ｓｉｇｍａ Ａ０５４５）ＨＲＰコンジュゲート二次抗体、およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ ＰｉｃｏまたはＦｅｍｔｏで検出した。
【0069】
ドットブロットでは、タンパク質溶解物を１：１００に希釈し、２μＬをニトロセルロース膜にスポットし、乾燥させ、５％乳でブロッキングし、ＡＤＫ８（ＡＲＰ＃０３－６５１１６０）とともに一晩インキュベートした。
【0070】
実施例１４ 免疫沈降
培養密度約８０％のＨＥＫ２９３細胞の１０ｃｍディッシュにおいて、適切な血清型のＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１、ＣＭＶ－ＶＰ３、およびＣＭＶ－ＡＡＰ２プラスミド各１０μｇを用いてＰＥＩトランスフェクションを実施した（表示される箇所のみＣＭＶ－ＡＡＰ２添加）。無血清培地においてＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＤＮＡ比を１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。トランスフェクション後２４時間時点で、細胞をペレットにし、溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（商標）プロテアーゼ阻害剤を追加）１ｍＬに再懸濁させた。ｒｂ抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ ９１１０）およびＰｉｅｒｃｅプロテインＡ／Ｇ Ｐｌｕｓアガロースビーズを用いて免疫沈降を実施した。沈降させたタンパク質を、４ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液＋０．５％βＭＥで、９０℃で１０分間溶出させた。１０μＬ（ＩＰ）または３０μＬ（インプット）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％ビス－トリスゲルにローディングして電気泳動し、上記のウェスタンブロッティングにおいて検出した。全長ビリオンの検出（図６Ｃ）では、ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｌｕｃ－ＩＴＲおよびｐＲｅｐプラスミドを、ＡＡＶ２による上記のトランスフェクションに添加した。ＡＡＶ２カプシドの熱変性を回避するため、代わりに複合体を０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．８で溶出し、溶出液を等しい体積のトリスｐＨ８．５で中和した。精製されたＡＡＶ２調製物を溶出および中和緩衝液で並行して処理し、これらの条件でカプシドが変性しないようにした。対照、ＩＰ、インプット、および上清画分をＤＮＡ分解酵素Ｉ処理し、抵抗性の（パッケージングされた）ベクターゲノムコピーを、導入遺伝子カセットのＣＭＶプロモーター領域を検出するプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により定量化した。
培養密度約８０％のＨＥＫ２９３細胞の１０ｃｍディッシュにおいて、適切な血清型のＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１、ＣＭＶ－ＶＰ３、およびＣＭＶ－ＡＡＰ２プラスミド各１０μｇを用いてＰＥＩトランスフェクションを実施した（表示される箇所のみＣＭＶ－ＡＡＰ２添加）。無血清培地においてＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＤＮＡ比を１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。トランスフェクション後２４時間時点で、細胞をペレットにし、溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８、ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（商標）プロテアーゼ阻害剤を追加）１ｍＬに再懸濁させた。ｒｂ抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ ９１１０）およびＰｉｅｒｃｅプロテインＡ／Ｇ Ｐｌｕｓアガロースビーズを用いて免疫沈降を実施した。沈降させたタンパク質を、４ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液＋０．５％βＭＥで、９０℃で１０分間溶出させた。１０μＬ（ＩＰ）または３０μＬ（インプット）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％ビス－トリスゲルにローディングして電気泳動し、上記のウェスタンブロッティングにおいて検出した。全長ビリオンの検出（図６Ｃ）では、ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｌｕｃ－ＩＴＲおよびｐＲｅｐプラスミドを、ＡＡＶ２による上記のトランスフェクションに添加した。ＡＡＶ２カプシドの熱変性を回避するため、代わりに複合体を０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．８で溶出し、溶出液を等しい体積のトリスｐＨ８．５で中和した。精製されたＡＡＶ２調製物を溶出および中和緩衝液で並行して処理し、これらの条件でカプシドが変性しないようにした。対照、ＩＰ、インプット、および上清画分をＤＮＡ分解酵素Ｉ処理し、抵抗性の（パッケージングされた）ベクターゲノムコピーを、導入遺伝子カセットのＣＭＶプロモーター領域を検出するプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ増幅（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により定量化した。
【0071】
実施例１５ 架橋
培養密度約８０％のＨＥＫ２９３細胞の６ウェルプレートにおいて、適切な血清型のＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１、ＣＭＶ－ＶＰ３、およびＣＭＶ－ＡＡＰ２プラスミド各２μｇを用いてＰＥＩトランスフェクションを実施した（表示される箇所のみＣＭＶ－ＡＡＰ２添加）。無血清培地においてＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＤＮＡ比を１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。３６時間後、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤を補充したＭ－ＰＥＲ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）緩衝液を用いてプレートでの溶解を実施した。溶解物を３つに分け、最終濃度５ｍＭのグルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ、Ｔｈｅｒｍｏ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ）、またはモック処理として等しい体積のＤＭＳＯで処理した。反応物を氷上で１時間インキュベートし、定期的に混合し、次いで１Ｍトリスでクエンチした。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ＋２－メルカプトエタノールを添加して、試料を１０分間煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、Ｂ１抗体を用いるウェスタンブロットにより調べた。
培養密度約８０％のＨＥＫ２９３細胞の６ウェルプレートにおいて、適切な血清型のＣＭＶ－ＨＡ－ＶＰ１、ＣＭＶ－ＶＰ３、およびＣＭＶ－ＡＡＰ２プラスミド各２μｇを用いてＰＥＩトランスフェクションを実施した（表示される箇所のみＣＭＶ－ＡＡＰ２添加）。無血清培地においてＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＤＮＡ比を１．３７５：１（ｗ／ｗ）に維持した。３６時間後、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤を補充したＭ－ＰＥＲ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）緩衝液を用いてプレートでの溶解を実施した。溶解物を３つに分け、最終濃度５ｍＭのグルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ、Ｔｈｅｒｍｏ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ）、またはモック処理として等しい体積のＤＭＳＯで処理した。反応物を氷上で１時間インキュベートし、定期的に混合し、次いで１Ｍトリスでクエンチした。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ＋２－メルカプトエタノールを添加して、試料を１０分間煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングし、Ｂ１抗体を用いるウェスタンブロットにより調べた。
【0072】
実施例１６ ＲＮＡ定量化
粗ウイルス調製／力価測定に記載される通りトランスフェクションを実施した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ（登録商標）キットを用いて、製造業者の説明書に従って３６時間後にＲＮＡを採取した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書（厳密なＤＮＡ分解酵素処理プロトコール）に従って使用し、混入しているＤＮＡを試料から除去した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）キット（ＢｉｏＲａｄ）を用い、各試料由来の総ＲＮＡ２５０ｎｇを使用してｃＤＮＡ合成を実施した。次いで反応物を１０倍に希釈し、希釈されたｃＤＮＡ５μＬを、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびイントロンの、イントロンをまたがる、またはＧＡＰＤＨのプライマーとともに調製された各ｑＰＣＲ反応に使用し、スプライシング無しの、スプライシングされた、またはハウスキーピング遺伝子産物を検出した。
粗ウイルス調製／力価測定に記載される通りトランスフェクションを実施した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ（登録商標）キットを用いて、製造業者の説明書に従って３６時間後にＲＮＡを採取した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書（厳密なＤＮＡ分解酵素処理プロトコール）に従って使用し、混入しているＤＮＡを試料から除去した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）キット（ＢｉｏＲａｄ）を用い、各試料由来の総ＲＮＡ２５０ｎｇを使用してｃＤＮＡ合成を実施した。次いで反応物を１０倍に希釈し、希釈されたｃＤＮＡ５μＬを、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびイントロンの、イントロンをまたがる、またはＧＡＰＤＨのプライマーとともに調製された各ｑＰＣＲ反応に使用し、スプライシング無しの、スプライシングされた、またはハウスキーピング遺伝子産物を検出した。
【0073】
実施例１７ 透過型電子顕微鏡
クロマトグラフィー精製されたＡＡＶ３およびＡＡＶ３ｓｔｏｐに対するネガティブ染色では、ベクター試料（５μＬまたは５０μＬ液滴）およびブランク緩衝液対照を、２００メッシュ炭素およびホルムバールでコーティングされたニッケルグリッドに吸着させ、すすぎ、２％酢酸ウラニル水溶液で３０秒間染色し、次いで濾紙に吸収させて除き、風乾させた。デジタルＴＩＦＦファイル画像取得のためＡＭＴ ＸＲ４１デジタルＣＣＤカメラ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と接続されたＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、Ｏｒｅｇｏｎ）を加速電圧１００ｋＶで使用して、全てのグリッドを撮像した。ＡＡＶ試料のＴＥＭイメージングを評価し、デジタル画像を２ｋｘ２ｋピクセル、１６ビットの解像度で取得した。
クロマトグラフィー精製されたＡＡＶ３およびＡＡＶ３ｓｔｏｐに対するネガティブ染色では、ベクター試料（５μＬまたは５０μＬ液滴）およびブランク緩衝液対照を、２００メッシュ炭素およびホルムバールでコーティングされたニッケルグリッドに吸着させ、すすぎ、２％酢酸ウラニル水溶液で３０秒間染色し、次いで濾紙に吸収させて除き、風乾させた。デジタルＴＩＦＦファイル画像取得のためＡＭＴ ＸＲ４１デジタルＣＣＤカメラ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）と接続されたＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、Ｏｒｅｇｏｎ）を加速電圧１００ｋＶで使用して、全てのグリッドを撮像した。ＡＡＶ試料のＴＥＭイメージングを評価し、デジタル画像を２ｋｘ２ｋピクセル、１６ビットの解像度で取得した。
【0074】
実施例１８ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入
ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｌｕｃの適切な血清型およびＧＣ粒子を、２４時間前に感染多重度２０粒子／細胞のヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）を予め感染させた、９６ウェルプレート上のＨＥＫ－２９３細胞に添加した。２４および４８時間時点で細胞をＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍにより撮像し、その後緩衝液を含有するＤ－ルシフェリンを添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して発光を測定した。
ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－Ｔ２Ａ－Ｌｕｃの適切な血清型およびＧＣ粒子を、２４時間前に感染多重度２０粒子／細胞のヒトアデノウイルス５（ｈＡｄ５）を予め感染させた、９６ウェルプレート上のＨＥＫ－２９３細胞に添加した。２４および４８時間時点で細胞をＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍにより撮像し、その後緩衝液を含有するＤ－ルシフェリンを添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して発光を測定した。
【0075】
実施例１９ 表
【0076】
【表2】
【0077】
【表3】
【0078】
【表4】
【0079】
【表5】
【0080】
実施例２０ ＡＡＰ要求は全てのＡＡＶクレードにわたって広範に及ぶ
ＶＰタンパク質の全数（すなわち、ＶＰ１、２、および３）からカプシドをアセンブルするのにＡＡＰが必要かどうかを試験するため、ＡＡＰリーディングフレームにおける早期終止コドン、ＶＰにおけるサイレント突然変異により、ｒｅｐ－ｃａｐトランスプラスミドからＡＡＰ発現を失わせた（図１Ａ、ＡＡＰｓｔｏｐ６０）。哺乳動物ＡＡＶ血清型にわたるＡＡＰ要求の包括的な評価を目的として、各ＡＡＶクレードの少なくとも１つのメンバーを含む１２の血清型についてＡＡＰｓｔｏｐ６０を生成した。ＡＡＰの非標準のＣＴＧ開始コドンを考慮して、ＡＡＰｓｔｏｐ６０突然変異を、潜在的な代替開始コドンの十分に下流、ただしＡＡＰ２機能に必須であることが示されている（Naumer et al., 2012, J. Virol., 86:13038-48）領域の上流に来るように位置づけた。ＡＡＰタンパク質が失われたことを検証するため、２つの代表的な血清型のＡＡＰ ＯＲＦのＣ末端領域に血球凝集素タグを挿入した（図１Ａ、ＡＡＰ－ＨＡ）。これらの構築物をトランスフェクトした全細胞溶解物をウェスタンブロットにより分析し（図１Ｂ）、ＡＡＰｓｔｏｐ６０が、代替開始コドンから翻訳される全長ＡＡＰまたは任意のより短いタンパク質産物の喪失をもたらすことを確認した。ＡＡＰ－ＨＡレーンの二重のバンドはさらなる下流の開始コドンの可能性を支持し、終止コドンがその後ろに配置されていることを裏付けている（図１Ｂ）。
ＶＰタンパク質の全数（すなわち、ＶＰ１、２、および３）からカプシドをアセンブルするのにＡＡＰが必要かどうかを試験するため、ＡＡＰリーディングフレームにおける早期終止コドン、ＶＰにおけるサイレント突然変異により、ｒｅｐ－ｃａｐトランスプラスミドからＡＡＰ発現を失わせた（図１Ａ、ＡＡＰｓｔｏｐ６０）。哺乳動物ＡＡＶ血清型にわたるＡＡＰ要求の包括的な評価を目的として、各ＡＡＶクレードの少なくとも１つのメンバーを含む１２の血清型についてＡＡＰｓｔｏｐ６０を生成した。ＡＡＰの非標準のＣＴＧ開始コドンを考慮して、ＡＡＰｓｔｏｐ６０突然変異を、潜在的な代替開始コドンの十分に下流、ただしＡＡＰ２機能に必須であることが示されている（Naumer et al., 2012, J. Virol., 86:13038-48）領域の上流に来るように位置づけた。ＡＡＰタンパク質が失われたことを検証するため、２つの代表的な血清型のＡＡＰ ＯＲＦのＣ末端領域に血球凝集素タグを挿入した（図１Ａ、ＡＡＰ－ＨＡ）。これらの構築物をトランスフェクトした全細胞溶解物をウェスタンブロットにより分析し（図１Ｂ）、ＡＡＰｓｔｏｐ６０が、代替開始コドンから翻訳される全長ＡＡＰまたは任意のより短いタンパク質産物の喪失をもたらすことを確認した。ＡＡＰ－ＨＡレーンの二重のバンドはさらなる下流の開始コドンの可能性を支持し、終止コドンがその後ろに配置されていることを裏付けている（図１Ｂ）。
【0081】
ＡＡＰｓｔｏｐ６０および野生型ＡＡＰ（ＷＴ）プラスミドから組換えＡＡＶベクターを産生し、ＤＮＡ分解酵素抵抗性粒子（ＤＲＰ）を定量化するｑＰＣＲにより力価測定した。ＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクター力価から、３つのＶＰタンパク質全てが存在すれば、ＡＡＰはいくつかの血清型ではビリオンをアセンブルするのに厳密には必要でないことが明らかである（図１Ｃ）。むしろ、血清型全体でＡＡＰ要求は広範に及び、ＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクターはｒｈ３２．３３ではＷＴ力価の３９％も産生し、ＡＡＶ８ではＷＴ力価の０．０３５％しか産生しない。この観察は、ＶＰ３単独のカプシド、特にＡＡＶ９およびＡＡＶ１をアセンブルするのにＡＡＰが絶対的に必要であることを実証した以前の発見と対照的である（Sonntag et al., 2011, J. Virol., 85:12686-97）。
【0082】
ＤＲＰ力価測定の利点は、測定値の差異による偏りが存在しない、同じベクターゲノムを有する任意のカプシド血清型のウイルスを定量化する能力である。しかしＤＲＰは、カプシドアセンブリの下流で発生するプロセスであるウイルスゲノムパッケージングも受けた、アセンブルされた粒子の量を測定する。さらに、ＤＲＰはパッケージングされていない空のＡＡＶビリオンを評価しない。カプシドアセンブリを直接アッセイし、低いＡＡＰｓｔｏｐ６０力価を有する血清型がパッケージング欠損によるものである可能性を除外するため、アセンブルされたＡＡＶ２カプシドにのみ存在する立体構造エピトープを認識するＡ２０カプシドＥＬＩＳＡを実施した。Ａ２０はＡＡＶ３と交差反応し、ＡＡＰが必要なＡＡＶ（ＡＡＶ２）およびＡＡＰｓｔｏｐ６０条件においてアセンブリを実現するＡＡＶ（ＡＡＶ３）について直接アセンブリをアッセイすることが可能である。両血清型についてのＡ２０ ＥＬＩＳＡデータにより、アセンブリのＤＲＰ間接的な測定が裏付けられた（図１Ｄ）。
【0083】
実施例２１ ＶＰタンパク質安定性におけるＡＡＰの役割
アセンブリにおけるＡＡＰ依存性について観察された範囲が、ＡＡＰｓｔｏｐ６０突然変異体に代替コドンを使用することで課されるＶＰ翻訳効率の変動によるものではないことを確実にするため、ＷＴおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０構築物により産生されるＶＰタンパク質レベルを調べた。Ｂ１モノクローナル抗体は、ＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３を除き、本研究で試験されたＡＡＶ全てにわたって、変性条件でＶＰタンパク質の保存された直線状エピトープを検出し、ほぼ全ての血清型をアッセイすることを可能にする。各ＷＴ力価の１０％またはそれ超を産生するＡＡＰｓｔｏｐ６０については、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質レベルではほとんど差が観察されず、ＶＰ１レベルではわずかな低下が観察され（図２Ａ）、一方、この閾値未満の力価を有するＡＡＰｓｔｏｐ６０はＶＰタンパク質レベルの劇的な低下を示す（図２Ｂ）。観察されたＶＰレベルの低下が潜在的な翻訳の欠損によるものかどうかを試験するため、ＡＡＰ２をＡＡＰｓｔｏｐ６０とともにトランスで共発現させた（レスキュー；図２Ｂ）。影響を受けた血清型全てについて、ＶＰタンパク質の相当の回復が観察された。さらに、ＷＴ、ＡＡＰｓｔｏｐ６０、またはレスキューの転写物レベル間では差が観察されず（図２Ｃ）、ＡＡＰの非存在下でのＶＰタンパク質の喪失が、翻訳後に（または翻訳と同時に）発生する可能性が最も高いことを示した。
アセンブリにおけるＡＡＰ依存性について観察された範囲が、ＡＡＰｓｔｏｐ６０突然変異体に代替コドンを使用することで課されるＶＰ翻訳効率の変動によるものではないことを確実にするため、ＷＴおよびＡＡＰｓｔｏｐ６０構築物により産生されるＶＰタンパク質レベルを調べた。Ｂ１モノクローナル抗体は、ＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３を除き、本研究で試験されたＡＡＶ全てにわたって、変性条件でＶＰタンパク質の保存された直線状エピトープを検出し、ほぼ全ての血清型をアッセイすることを可能にする。各ＷＴ力価の１０％またはそれ超を産生するＡＡＰｓｔｏｐ６０については、ＶＰ２またはＶＰ３タンパク質レベルではほとんど差が観察されず、ＶＰ１レベルではわずかな低下が観察され（図２Ａ）、一方、この閾値未満の力価を有するＡＡＰｓｔｏｐ６０はＶＰタンパク質レベルの劇的な低下を示す（図２Ｂ）。観察されたＶＰレベルの低下が潜在的な翻訳の欠損によるものかどうかを試験するため、ＡＡＰ２をＡＡＰｓｔｏｐ６０とともにトランスで共発現させた（レスキュー；図２Ｂ）。影響を受けた血清型全てについて、ＶＰタンパク質の相当の回復が観察された。さらに、ＷＴ、ＡＡＰｓｔｏｐ６０、またはレスキューの転写物レベル間では差が観察されず（図２Ｃ）、ＡＡＰの非存在下でのＶＰタンパク質の喪失が、翻訳後に（または翻訳と同時に）発生する可能性が最も高いことを示した。
【0084】
不安定性の機構として分解について調べるため、ＡＡＶ８ ＡＡＰｓｔｏｐ６０をトランスフェクトした細胞を、漸増濃度のプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ、Ｅ１阻害剤ＭＬＮ７２４３、または液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰ分解酵素阻害剤バフィロマイシンで処理した（図２Ｄ）。これにより、必要な酸性化を阻害することで、ユビキチン－プロテアソーム経路の最初期および最終期のステップ、ならびにリソソーム分解またはオートファジーの後期のステップの試験が可能となった。リソソームでの酸性化を阻害すると、ＡＡＶ８ ＶＰ３タンパク質の軽度だが用量依存性のレスキューがもたらされた。プロテアソームの阻害には、用量依存的にＡＡＶ８ ＶＰタンパク質における強力なレスキューが付随するが、これはアセンブルされたカプシドのレスキューを伴わなかった（図２Ｅ）。Ｅ１阻害により、薬物濃度とは独立な等しく軽度～中度のＶＰレスキューがもたらされた。まとめると、これらの結果は、ＡＡＰの非存在下でＶＰタンパク質が不安定であることは主にプロテアソーム分解に起因する可能性があり、これは部分的にユビキチンとは独立でありうることを示唆している。リソソーム分解またはオートファゴソーム分解も、ＶＰタンパク質の一部を分解しうる。
【0085】
ＡＡＶ８ ＶＰ分解の速度を試験しようと、タンパク質合成をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）により遮断し、時間が進行するごとにタンパク質溶解物を採取した（図８Ａ）。ＡＡＰｓｔｏｐ６０溶解物で予期されるように、ＣＨＸ処理なしでも、かつ感受性の高い検出試薬による長い曝露時間にもかかわらず、検出するにはＶＰタンパク質レベルがあまりに小さかった。しかし、ＡＡＰの存在下では、ＣＨＸ処理の全ての時点でＶＰタンパク質レベルが一定のままである。これは、ＡＡＰの存在下ではカプシドが迅速にアセンブルされるため、かつ、アセンブルされたＶＰタンパク質は分解されにくく、ＶＰバンドが持続するためである可能性が高い。
【0086】
主要なクレードにわたって観察されたＡＡＰ表現型のスペクトルを前提として、ＶＰ構造のどのエレメントが、観察されたＡＡＰ要求を課すのか、またはこれらの機能を独立して実施する能力をいくつかのＶＰに付与するのかについての見識を得るため、主要なＡＡＶ血清型に対する仮想の進化上の中間体（ＡｎｃＡＡＶ）９種についても試験した（Zinn et al., 2015, Cell Rep., 12:1056-68）。天然血清型と同様に、ＡＡＰｓｔｏｐ６０ ＡｎｃＡＡＶでも広範なＡＡＰ要求が観察された（図３Ａ）。
【0087】
ＡＡＰｓｔｏｐ６０の早期終止コドンは、ＡＡＰ２機能に必要であることが示されているドメインの上流に配置されているが、ＡＡＰの高度に保存された領域（残基５２～５７）の下流にある（図９、保存されたコア）。このドメインは、欠失分析によりＡＡＰ２機能にとって重要であることが示されたが、存在するＡＡＰのさらなるＣ末端部分なしにＶＰ３単独カプシドをアセンブルするのには十分でなかった（Naumer et al., 2012, J. Virol., 86:13038-48）。その他の血清型におけるＡＡＰは未だ欠失分析により試験されておらず、またＡｎｃＡＡＶを生成したアルゴリズムはＶＰ ＯＲＦのみに適用されており、ＡＡＰに対して予測されない結果を有しうるため（Zinn et al., 2015、Cell Rep., 12:1056-68）、我々は、部分的に機能性のＮ末端ＡＡＰ（ＡＡＰＮ）がいくつかのＡＡＰｓｔｏｐ６０構築物から発現され、試験を行った２１のＡＡＶにわたって観察された様々なＡＡＰ要求に寄与するかどうかを試験したかった。そのＡＡＰｓｔｏｐ６０がＷＴ力価の少なくとも１０％を産生する６種のＡＡＶ、およびＡＡＰなしにＶＰ３単独カプシドをアセンブルすることが最近実証されたＡＡＶ４（Earley et al., 2017, J. Virol., 91:e01980-16）について、早期終止コドンをＡＡＰ ＯＲＦの残基約２３に配置した（ＶＰにおけるサイレント突然変異）さらに上流の停止構築物（ＡＡＰｓｔｏｐ２０）を生成した。これらのうち、ＡＡＶ５、ｒｈ３２．３３、およびＡＡＶ４ ＡＡＰｓｔｏｐ２０はウイルスを産生し、ＡＡＶ３、ＡＡＶ９、Ａｎｃ１１０、およびＡｎｃ１１３は産生しない（図３Ｂ）。Ｂ１抗体はＡＡＶ４およびｒｈ３２．３３を検出しないが、残りのＡＡＰｓｔｏｐ２０構築物から産生されたＶＰタンパク質レベルは力価を反映している（図３Ｃ）。図２とまとめると、これらの結果は、安定性が、３つのカテゴリーのうち１つに入るＶＰタンパク質の血清型特異的な特性であることを実証している：（ｉ）独立して安定、（ｉｉ）安定性にはＡＡＰＮのみが必要、または（ｉｉｉ）全長ＡＡＰが必要。これらの結果は、ＶＰ安定性におけるＡＡＰの役割を明確に示し、広範なＡＡＰ要求に対する説明をもたらす。特にＡＡＰＮのみが必要な血清型におけるＡＡＰｓｔｏｐ６０とＷＴ力価との間の不一致から、ＡＡＰが埋め合わせるいくつかの血清型のＶＰにおけるさらなる短所、およびＡＡＰのＣ末端３分の２（ＡＡＰＣ）に対し主にＡＡＰＮに含有する潜在的に別個の機能が指摘される。ＶＰ安定性、ＡＡＰｓｔｏｐ６０力価、およびＡＡＰｓｔｏｐ２０力価を考慮して、明確にするため、ＡＡＰ表現型を（ｉ）ＡＡＰ非依存性、（ｉｉ）ＡＡＰＣ非依存性、および（ｉｉｉ）ＡＡＰ依存性として分類した（図３Ｄ）。さらに、ＡＡＰＣ非依存性血清型のＡＡＰＮがＡＡＰ依存性血清型のウイルス産生をレスキューすることができないことを実証することにより、ＡＡＰＣ非依存性の表現型がＶＰタンパク質の特性であり、十分に機能性のＡＡＰＮの結果ではないことが示された（図１０）。
【0088】
異なるＡＡＰ表現型のＶＰを有する血清型が同じ分解機構を受けるかどうかを試験するため、ＡＡＶ８について事前に実施されたのと同じようにＡＡＶ３タンパク質の分解を遮断した（図８Ｂ）。ボルテゾミブによるプロテアソーム阻害では、ＡＡＶ８と同様に用量反応性の強力なレスキューがもたらされ、ＭＬＮ７２４３によるＥ１阻害では最大用量でＶＰがレスキューされた。ＡＡＶ８とは異なり、バフィロマイシンによりリソソームでの酸性化を阻害すると、用量に依存した形でＡＡＶ３ ＶＰレベルが強力にレスキューされ、ＡＡＰＣ非依存性の血清型（または少なくともＡＡＶ３）が、リソソーム分解またはオートファジーをより受けやすい可能性があることを示した。これらの結果は、ＡＡＰＮはＡＡＶ８ ＡＡＰｓｔｏｐ６０溶解物には存在するがＡＡＶ３ ＡＡＰｓｔｏｐ２０溶解物には存在しないことから、ＡＡＰＮが、リソソーム分解を遮断するかその他の手段によって、分解の一次手段としてのプロテアソームをどうにかして促進することも示唆しうる。
【0089】
実施例２２ ＡＡＰＣはビリオン形態、感染性、または安定性に影響を及ぼさない
多くの血清型で、ＡＡＰＮは単独で相当量のウイルス産生を容易にするが、ＡＡＰＮによりアセンブルされた粒子が適切な形態および感染機能を保持するかどうかについて次に取り組んだ。ＡＡＶ３ ＷＴおよびＡＡＶ３ＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクターのＴＥＭイメージングにより、同一の肉眼粒子形態が示される（図１１Ａ）。ＡＡＰＣ喪失が感染能力に作用するかどうかを試験するため、ＡＡＶ９、ＡＡＶ３、およびそれらのＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクターを、培養物中でＨＥＫ２９３細胞に対して試験し（図１１Ｂ、Ｃ）、ＡＡＰＣなしでアセンブルされたウイルスが感染能力を保持していることを実証した。さらに、これらの粒子の融解温度を試験し、ほとんど差が観察されなかった（図１１Ｄ）。
多くの血清型で、ＡＡＰＮは単独で相当量のウイルス産生を容易にするが、ＡＡＰＮによりアセンブルされた粒子が適切な形態および感染機能を保持するかどうかについて次に取り組んだ。ＡＡＶ３ ＷＴおよびＡＡＶ３ＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクターのＴＥＭイメージングにより、同一の肉眼粒子形態が示される（図１１Ａ）。ＡＡＰＣ喪失が感染能力に作用するかどうかを試験するため、ＡＡＶ９、ＡＡＶ３、およびそれらのＡＡＰｓｔｏｐ６０ベクターを、培養物中でＨＥＫ２９３細胞に対して試験し（図１１Ｂ、Ｃ）、ＡＡＰＣなしでアセンブルされたウイルスが感染能力を保持していることを実証した。さらに、これらの粒子の融解温度を試験し、ほとんど差が観察されなかった（図１１Ｄ）。
【0090】
実施例２３ ＡＡＰ要求は仮想ＡＡＶ系統発生の状況において分枝特異性を示す
アセンブリ機能に関与するＶＰ構造を特定するための次のステップとして、わずかな遺伝子距離にわたる表現型の差を特定することを目標として、試験された広い遺伝子範囲のＡＡＶカプシドにわたってＡＡＰ表現型がどのように分岐しているかについての概要を探った。天然血清型１２種および祖先バリアント９種のＡＡＰ表現型を、再構築された系統発生に相関させた（図３Ｅ）。これにより、分枝特異的なＡＡＰ依存性プロファイルが明らかとなり、系統発生学的分岐点によりＡＡＰ表現型の明らかな分岐が説明された。その他の明らかな傾向の中で、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、およびＡｎｃ８４は、ＡＡＶ８およびｒｈ．１０で終結する十分に依存性の系統を含み、したがって分枝Ｄと呼ばれることになる（図３Ｅ、赤い矢印）。Ａｎｃ８２分岐点では、その後継であるＡｎｃ１１０においてＡＡＰ依存性からＡＡＰＣ非依存性への表現型スイッチ（phenotypic switch）が観察される。Ａｎｃ１１０から分岐する血清型、ｒｈ８およびＡＡＶ９もＡＡＰＣ非依存性であり、この分枝を分枝Ｉと命名した（図３Ｅ、緑の矢印）。
アセンブリ機能に関与するＶＰ構造を特定するための次のステップとして、わずかな遺伝子距離にわたる表現型の差を特定することを目標として、試験された広い遺伝子範囲のＡＡＶカプシドにわたってＡＡＰ表現型がどのように分岐しているかについての概要を探った。天然血清型１２種および祖先バリアント９種のＡＡＰ表現型を、再構築された系統発生に相関させた（図３Ｅ）。これにより、分枝特異的なＡＡＰ依存性プロファイルが明らかとなり、系統発生学的分岐点によりＡＡＰ表現型の明らかな分岐が説明された。その他の明らかな傾向の中で、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８１、Ａｎｃ８２、Ａｎｃ８３、およびＡｎｃ８４は、ＡＡＶ８およびｒｈ．１０で終結する十分に依存性の系統を含み、したがって分枝Ｄと呼ばれることになる（図３Ｅ、赤い矢印）。Ａｎｃ８２分岐点では、その後継であるＡｎｃ１１０においてＡＡＰ依存性からＡＡＰＣ非依存性への表現型スイッチ（phenotypic switch）が観察される。Ａｎｃ１１０から分岐する血清型、ｒｈ８およびＡＡＶ９もＡＡＰＣ非依存性であり、この分枝を分枝Ｉと命名した（図３Ｅ、緑の矢印）。
【0091】
実施例２４ 表現型－系統発生マッピング分析により、ＡＡＰＣ非依存性アセンブリにおいて機能する一連の残基が明らかとなる
ＡＡＰ表現型が系統発生内で分枝特異的な傾向を有するという観察により、アセンブリ機能に不可欠なＶＰ構造のエレメントを特定する容易な方法の機会が提示された。ＶＰ配列がこれらの分枝のそれぞれに沿ってわずかな差で分岐することを前提として、各分枝のメンバー内のみで相同な一連の残基がカプシドアセンブリに機能的に寄与する可能性が高いと仮定した。この目的のため、分枝Ｄおよび分枝Ｉメンバーで多重配列整列化を生成した。整列化内で合計１４９の位置が変動したが、１２の位置のみで、残基が分枝Ｉ内で保存され、分枝Ｄでは同一性が異なるが共有される。これらの１２個のうち、８個の独立した残基および２対の隣接する残基がＶＰにおいて１０の部位を含む。これらの部位のうちいくつかでは、分枝Ｉメンバー内で残基同一性が分岐している。しかし、これらは分枝Ｄと対照をなす化学的特性を共有している。例えば部位１は、分枝ＩのＡｎｃ１１０およびｒｈ８ではスレオニン、ＡＡＶ９ではセリンと、ともにヒドロキシル残基であるのと比較して、分枝Ｄ血清型では塩基性リジンである。原因となる構造上の決定因子をマッピングするため、再構築された系統発生に沿って表現型スイッチを特定し、次いで目的の表現型について分岐している２つの系統にわたって保存された差を調べる手法を表現型－系統発生マッピングと命名した。
ＡＡＰ表現型が系統発生内で分枝特異的な傾向を有するという観察により、アセンブリ機能に不可欠なＶＰ構造のエレメントを特定する容易な方法の機会が提示された。ＶＰ配列がこれらの分枝のそれぞれに沿ってわずかな差で分岐することを前提として、各分枝のメンバー内のみで相同な一連の残基がカプシドアセンブリに機能的に寄与する可能性が高いと仮定した。この目的のため、分枝Ｄおよび分枝Ｉメンバーで多重配列整列化を生成した。整列化内で合計１４９の位置が変動したが、１２の位置のみで、残基が分枝Ｉ内で保存され、分枝Ｄでは同一性が異なるが共有される。これらの１２個のうち、８個の独立した残基および２対の隣接する残基がＶＰにおいて１０の部位を含む。これらの部位のうちいくつかでは、分枝Ｉメンバー内で残基同一性が分岐している。しかし、これらは分枝Ｄと対照をなす化学的特性を共有している。例えば部位１は、分枝ＩのＡｎｃ１１０およびｒｈ８ではスレオニン、ＡＡＶ９ではセリンと、ともにヒドロキシル残基であるのと比較して、分枝Ｄ血清型では塩基性リジンである。原因となる構造上の決定因子をマッピングするため、再構築された系統発生に沿って表現型スイッチを特定し、次いで目的の表現型について分岐している２つの系統にわたって保存された差を調べる手法を表現型－系統発生マッピングと命名した。
【0092】
実施例２５ ＡＡＰＣ非依存性アセンブリおよびＶＰタンパク質安定性を付与する機能性モチーフは、異種のカプシドに導入可能である
１０の部位が、カプシドアセンブリにおいて機能するモチーフを構成するかどうかを試験するため、分枝Ｉ独自物を分枝Ｄのメンバーに移植し、試験して、生じたハイブリッドがＡＡＰＣ非依存性アセンブリ機能を獲得するかどうかを決定した。分枝Ｉがそこから分岐する分岐点であるＡｎｃ８２を、これらの突然変異におけるバックグラウンドとして選択した。分枝Ｉ血清型に対して最も近い類縁物（relative）として、Ａｎｃ８２は、いくつかの標的とされる突然変異を許容し、機能性を保持する可能性がより遠位の類縁物よりも高い。Ａｎｃ８２の１０の部位を全て、部位特異的突然変異誘発によりまとめて分枝Ｉ独自物に突然変異させ、８２ＤＩと命名されるバリアントを作り出した（図４Ａ）。８２ＤＩＡＡＰｓｔｏｐ６０はＡＡＰＣ非依存性アセンブリ機能を獲得した（図４Ｂ）。この表現型を付与するのに必要な最小限のモチーフを決定するため、各部位を個別にその分枝Ｄ独自物に復帰させた。復帰変異体は全てＡＡＰ依存性であり（図４Ｃ）、表現型－系統発生マッピングを使用して特定された１０の部位が、カプシドアセンブリに不可欠な機能性モチーフを構成するだけでなく、血清型のこのサブセットにおいてＡＡＰＣ非依存性アセンブリに必要な最小限のモチーフを含むことを裏付けている。
１０の部位が、カプシドアセンブリにおいて機能するモチーフを構成するかどうかを試験するため、分枝Ｉ独自物を分枝Ｄのメンバーに移植し、試験して、生じたハイブリッドがＡＡＰＣ非依存性アセンブリ機能を獲得するかどうかを決定した。分枝Ｉがそこから分岐する分岐点であるＡｎｃ８２を、これらの突然変異におけるバックグラウンドとして選択した。分枝Ｉ血清型に対して最も近い類縁物（relative）として、Ａｎｃ８２は、いくつかの標的とされる突然変異を許容し、機能性を保持する可能性がより遠位の類縁物よりも高い。Ａｎｃ８２の１０の部位を全て、部位特異的突然変異誘発によりまとめて分枝Ｉ独自物に突然変異させ、８２ＤＩと命名されるバリアントを作り出した（図４Ａ）。８２ＤＩＡＡＰｓｔｏｐ６０はＡＡＰＣ非依存性アセンブリ機能を獲得した（図４Ｂ）。この表現型を付与するのに必要な最小限のモチーフを決定するため、各部位を個別にその分枝Ｄ独自物に復帰させた。復帰変異体は全てＡＡＰ依存性であり（図４Ｃ）、表現型－系統発生マッピングを使用して特定された１０の部位が、カプシドアセンブリに不可欠な機能性モチーフを構成するだけでなく、血清型のこのサブセットにおいてＡＡＰＣ非依存性アセンブリに必要な最小限のモチーフを含むことを裏付けている。
【0093】
このＤＩモチーフがＶＰタンパク質安定性に作用するかどうかを次に評価した。その他のＡＡＰ依存性血清型と一致して（図２Ｂ）、Ａｎｃ８２はＡＡＰｓｔｏｐ６０条件ではＶＰレベルの劇的な低下を示すが、８２ＤＩＡＡＰｓｔｏｐ６０は示さない（図４Ｄ）。８２ＤＩのＡＡＰ表現型を適切に分類するため、Ａｎｃ８２およびＤＩについてＡＡＰｓｔｏｐ２０を生成し、８２ＤＩｓｔｏｐ２０におけるタンパク質喪失を観察し、８２ＤＩがＡＡＰＣ非依存性であることを示した（図４Ｄ）。
【0094】
カプシド全体に対するＡＡＰＣ非依存性アセンブリのより広範な影響を評価するため、８２ＤＩの生物物理学的特性および形質導入能力を、その親株であるＡｎｃ８２と比較してさらに特徴付けた。８２ＤＩのＴｍはＡｎｃ８２より５℃低く（図４Ｅ）、生物物理学的に別個の実体である主要な兆候である（Pacouret et al., 2017, Mol. Ther., 25:1375-86）。Ａｎｃ８２対８２ＤＩのＴｍおよびＡＡＰ表現型の著しい変化を考慮して、両バリアントの感染性を試験した。８２ＤＩは感染性を保持しており、形質導入はｉｎ ｖｉｔｒｏ（図１２Ａ）およびｉｎ ｖｉｖｏ（図４Ｆおよび１２Ｂ）の両方で、Ａｎｃ８２と比較して適度に増大しうる。
【0095】
実施例２６ ＡＡＰ非依存性アセンブリに寄与する候補残基はＶＰ三量体界面に存在する
このモチーフが粒子アセンブリにどのように影響を与えるかを試験するため、これらの残基がＶＰの３次元フォールド（3-dimensional fold）内、およびアセンブルされたカプシド内のどこに存在するかをマッピングした。ＡｎｃＡＡＶの結晶構造は入手不可能だが、末端の分枝Ｄ（ＡＡＶ８）および分枝Ｉ血清型（ＡＡＶ９）は解明されており（DiMattia et al., 2012, J. Virol., 86:6947-58；Nam et al., 2007, J. Virol., 81:12260-71）、これをＤＩモチーフをマッピングするための代用として使用した。１０の部位のうち２つはＶＰ Ｎ末端の非構造領域に存在するが、部位１のみがＶＰ３の外部にある。ＶＰの構造領域内の８つの部位のうち７つがＶＰ三量体の３フォールド界面に位置し、近隣のモノマーに接触している（図５Ａ～Ｃ）。ＡＡＶ８（ＡＡＰ依存性）三量体をＡＡＶ９（ＡＡＰＣ非依存性）三量体と原子レベルで比較すると、これらの部位の大部分が、ＡＡＰＣ非依存性三量体内ではＡＡＰ依存性三量体よりも強くモノマー間で相互作用しているという強力な証拠を示す（図５Ｄ～Ｆ）。例えば、保存されたグルタミン酸は、ＡＡＶ９三量体の部位７では隣接するモノマーのヒスチジンと塩橋を形成するが、ＡＡＶ８の部位７のロイシンとは塩橋を形成できない（図５Ｄ）。ＡＡＶ９では、隣接するＶＰモノマーの部位８において、保存されたアスパラギンとグルタミンの間で水素結合が生じる。ＡＡＶ８では、ＧｌｎからＡｌａへの置換のためこの結合が実現不可能である（図５Ｅ）。部位１０は３フォールド軸に存在し、保存されたフェニルアラニンの下で、ＡＡＶ９のバリン残基が、ＡＡＶ８のアラニンよりもはるかに大きい疎水性相互作用ネットワークを作り出す（図５Ｆ）。さらに、三量体の３つのモノマー全ての間で同時に部位１０の相互作用が存在する。これらの観察結果は、ＡＡＰＣ非依存性血清型において、このモチーフが三量体安定化の一助となり、おそらくは全長ＡＡＰの非存在下でカプシドアセンブリの核となることを示唆している。
このモチーフが粒子アセンブリにどのように影響を与えるかを試験するため、これらの残基がＶＰの３次元フォールド（3-dimensional fold）内、およびアセンブルされたカプシド内のどこに存在するかをマッピングした。ＡｎｃＡＡＶの結晶構造は入手不可能だが、末端の分枝Ｄ（ＡＡＶ８）および分枝Ｉ血清型（ＡＡＶ９）は解明されており（DiMattia et al., 2012, J. Virol., 86:6947-58；Nam et al., 2007, J. Virol., 81:12260-71）、これをＤＩモチーフをマッピングするための代用として使用した。１０の部位のうち２つはＶＰ Ｎ末端の非構造領域に存在するが、部位１のみがＶＰ３の外部にある。ＶＰの構造領域内の８つの部位のうち７つがＶＰ三量体の３フォールド界面に位置し、近隣のモノマーに接触している（図５Ａ～Ｃ）。ＡＡＶ８（ＡＡＰ依存性）三量体をＡＡＶ９（ＡＡＰＣ非依存性）三量体と原子レベルで比較すると、これらの部位の大部分が、ＡＡＰＣ非依存性三量体内ではＡＡＰ依存性三量体よりも強くモノマー間で相互作用しているという強力な証拠を示す（図５Ｄ～Ｆ）。例えば、保存されたグルタミン酸は、ＡＡＶ９三量体の部位７では隣接するモノマーのヒスチジンと塩橋を形成するが、ＡＡＶ８の部位７のロイシンとは塩橋を形成できない（図５Ｄ）。ＡＡＶ９では、隣接するＶＰモノマーの部位８において、保存されたアスパラギンとグルタミンの間で水素結合が生じる。ＡＡＶ８では、ＧｌｎからＡｌａへの置換のためこの結合が実現不可能である（図５Ｅ）。部位１０は３フォールド軸に存在し、保存されたフェニルアラニンの下で、ＡＡＶ９のバリン残基が、ＡＡＶ８のアラニンよりもはるかに大きい疎水性相互作用ネットワークを作り出す（図５Ｆ）。さらに、三量体の３つのモノマー全ての間で同時に部位１０の相互作用が存在する。これらの観察結果は、ＡＡＰＣ非依存性血清型において、このモチーフが三量体安定化の一助となり、おそらくは全長ＡＡＰの非存在下でカプシドアセンブリの核となることを示唆している。
【0096】
実施例２７ ＡＡＰＣ非依存性カプソマー核形成
次に、ＡＡＰＣ非依存性ＡＡＶのＶＰはＡＡＰＣの非存在下で会合してオリゴマーになることができるが、ＡＡＰ依存性血清型のＶＰは全長ＡＡＰが存在しない限り強く会合しないと仮定した。この理論を試験するため、ＡＡＰ依存性およびＡＡＰＣ非依存性ＡＡＶのＶＰ－ＶＰ相互作用を、ＶＰ３を、ベイトとしてのＨＡ－タグ付きＶＰ１とともに共免疫沈降させることにより評価した（図６Ａ～Ｂ）。試験されたＡＡＰＣ非依存性ＶＰ１、ＡＡＶ３および８２ＤＩは、インプットにおけるＶＰ３レベルが小さいにもかかわらず、全長ＡＡＰの非存在下でＶＰ３を共沈させることができた。反対に、ＡＡＰ依存性のＡＡＶ２およびＡｎｃ８２ ＶＰ１はいずれも、相当のインプットレベルにもかかわらずほとんどＶＰ３を共沈させなかった（図６Ｂ）。ＡＡＰ２を付加すると、ＡＡＰ依存性血清型でもＶＰ３共沈が可能となり、ＡＡＰＣ非依存性血清型ではＶＰ２およびＶＰ３の予測分子量の間の未知のＶＰ種が共沈した（＊印、図６Ｂ）。これらは代替開始コドンから翻訳されたＶＰ２様タンパク質、またはＡＡＰにより安定化したＶＰ１ Ｎ末端切断／分解産物である可能性がある。＋ＡＡＰ条件においてＡｎｃ８２およびＡＡＶ３ ＶＰ３インプットレベルを相当に増大させたにもかかわらず、これらのデータは上記の仮説を支持する。
次に、ＡＡＰＣ非依存性ＡＡＶのＶＰはＡＡＰＣの非存在下で会合してオリゴマーになることができるが、ＡＡＰ依存性血清型のＶＰは全長ＡＡＰが存在しない限り強く会合しないと仮定した。この理論を試験するため、ＡＡＰ依存性およびＡＡＰＣ非依存性ＡＡＶのＶＰ－ＶＰ相互作用を、ＶＰ３を、ベイトとしてのＨＡ－タグ付きＶＰ１とともに共免疫沈降させることにより評価した（図６Ａ～Ｂ）。試験されたＡＡＰＣ非依存性ＶＰ１、ＡＡＶ３および８２ＤＩは、インプットにおけるＶＰ３レベルが小さいにもかかわらず、全長ＡＡＰの非存在下でＶＰ３を共沈させることができた。反対に、ＡＡＰ依存性のＡＡＶ２およびＡｎｃ８２ ＶＰ１はいずれも、相当のインプットレベルにもかかわらずほとんどＶＰ３を共沈させなかった（図６Ｂ）。ＡＡＰ２を付加すると、ＡＡＰ依存性血清型でもＶＰ３共沈が可能となり、ＡＡＰＣ非依存性血清型ではＶＰ２およびＶＰ３の予測分子量の間の未知のＶＰ種が共沈した（＊印、図６Ｂ）。これらは代替開始コドンから翻訳されたＶＰ２様タンパク質、またはＡＡＰにより安定化したＶＰ１ Ｎ末端切断／分解産物である可能性がある。＋ＡＡＰ条件においてＡｎｃ８２およびＡＡＶ３ ＶＰ３インプットレベルを相当に増大させたにもかかわらず、これらのデータは上記の仮説を支持する。
【0097】
三量体もしくは五量体などの規定される形状の種へのオリゴマー化をＡＡＰが促進しているかどうか、またはｃｏ－ＩＰにより観察されたＶＰ－ＶＰ相互作用の増大がよりランダム化された会合であるかどうかの試験を開始するため、トランスフェクトされた細胞溶解物に架橋剤を添加し、ウェスタンブロットによりＶＰ種を調べた（図６Ｃ）。ＡＡＰの存在下で、ＤＳＧ（７オングストローム架橋アーム）を添加すると、スーパーシフトした単一のＶＰバンドが９７ｋＤａ付近に現れ、ＤＳＳ（１１オングストローム架橋アーム）を添加すると、それよりわずかに大きいスーパーシフトした二重線が現れる。予測されない泳動パターンのため架橋種の分子量を決定するのは困難であるが、別個のバンド形成は、ＡＡＰが、規定される形状またはモノマー数のＶＰ－ＶＰ相互作用を促進することを示唆しており、しかしカプシドアセンブリ、ＡＡＰにより促進される会合に関与する宿主タンパク質とＶＰの会合増大も示す可能性がある。
【0098】
ＶＰオリゴマー化プロセスが全長カプシドへのアセンブリとは別々に調べられていたことをさらに確実にするため、ｒｅｐ、ａａｐ２、ヘルパー、およびＩＴＲ隣接レポーターゲノムプラスミドをトランスで付加して、ＡＡＶ２ ＶＰを用いてＩＰ実験を繰り返し、アセンブルされたＤＲＰを定量化した（図１３Ａ）。インプットおよび上清画分でのみ相当量のゲノムが検出されたが、ＩＰ画分には存在しなかった。完全にアセンブルされたカプシドを定量化するＥＬＩＳＡがこれらの結果を反映しており（図１３Ｂ）、オリゴマー化されたＶＰのみが沈殿したことを示した。まとめると、これらのデータは、ＶＰタンパク質安定性におけるＡＡＰの役割に加えて、ＡＡＰがＶＰタンパク質のオリゴマー化も促進して正二十面体のアセンブリの核となり、これによりカプシドアセンブリプロセスの効率が潜在的に増大しうることを支持している。
【0099】
他の実施形態
方法および組成物が複数の異なる態様と併せて本明細書に記載されているが、種々の態様についての上記の記載は、方法および組成物の範囲を例示することを意図し、制限する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は以下の請求項の範囲内である。
方法および組成物が複数の異なる態様と併せて本明細書に記載されているが、種々の態様についての上記の記載は、方法および組成物の範囲を例示することを意図し、制限する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は以下の請求項の範囲内である。
【0100】
開示される方法、組成物、およびその他の材料は、本明細書に記載の通り開示されるが、これらの方法、組成物、およびその他の材料の組合せ、サブセット、相互作用、群なども開示されることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法についての各種々の個別のおよび集合的な組合せおよび順列への特定の言及は明確に開示されない可能性があるが、それぞれが本明細書において明確に企図および記載される。例えば、特定の組成物または特定の方法が開示されかつ論じられ、複数の組成物または方法が論じられる場合、そうではないと明確に示されない限り、組成物および方法のあらゆる組合せおよび順列が明確に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも明確に企図および開示される。
本願明細書に記載の発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
［２］
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記［１］に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
［３］
配列番号３のアミノ酸配列を有する、上記［１］に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
［４］
配列番号４の核酸配列によりコードされる、上記［１］に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
［５］
上記［１］から［４］のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドを含む、ウイルス粒子。
［６］
導入遺伝子をさらに含む、上記［５］に記載のウイルス粒子。
［７］
配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
［８］
配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記［７］に記載の核酸分子。
［９］
配列番号４の核酸配列を有する、上記［７］に記載の核酸分子。
［１０］
配列番号３のアミノ酸配列をコードする、上記［７］に記載の核酸分子。
［１１］
上記［７］から［１０］のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
［１２］
上記［７］から［１０］のいずれかに記載の核酸分子または上記［１１］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［１３］
パッケージング細胞である、上記［１２］に記載の宿主細胞。
［１４］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むパッケージング細胞であって、前記ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、パッケージング細胞。
［１５］
アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を欠く、上記［１４］に記載のパッケージング細胞。
［１６］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を低下させる方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを有するＡＡＶを提供するステップを含む、方法。
［１７］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を少なくとも部分的に軽減する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを前記ＡＡＶに組み込むステップを含む、方法。
［１８］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、そのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）に対する依存性を低下させるように操作する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを含むＡＡＶを操作するステップを含む、方法。
［１９］
前記アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の非存在下で前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を培養するステップをさらに含む、上記［１６］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を配列決定するステップをさらに含む、上記［１８］に記載の方法。
［２１］
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の前記アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶに対して比較するステップをさらに含む、上記［１８］に記載の方法。
［２２］
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶと整列させるステップをさらに含む、上記［１８］に記載の方法。
［２３］
配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＡＡＰ依存性についての表６に示す表示される位置のアミノ酸残基をさらに含む、ＡＡＶカプシドポリペプチド。
本願明細書に記載の発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
［２］
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記［１］に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
［３］
配列番号３のアミノ酸配列を有する、上記［１］に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
［４］
配列番号４の核酸配列によりコードされる、上記［１］に記載のＡＡＶカプシドポリペプチド。
［５］
上記［１］から［４］のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドを含む、ウイルス粒子。
［６］
導入遺伝子をさらに含む、上記［５］に記載のウイルス粒子。
［７］
配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
［８］
配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、上記［７］に記載の核酸分子。
［９］
配列番号４の核酸配列を有する、上記［７］に記載の核酸分子。
［１０］
配列番号３のアミノ酸配列をコードする、上記［７］に記載の核酸分子。
［１１］
上記［７］から［１０］のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
［１２］
上記［７］から［１０］のいずれかに記載の核酸分子または上記［１１］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［１３］
パッケージング細胞である、上記［１２］に記載の宿主細胞。
［１４］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドをコードする核酸分子を含むパッケージング細胞であって、前記ＡＡＶカプシドポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、パッケージング細胞。
［１５］
アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を欠く、上記［１４］に記載のパッケージング細胞。
［１６］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を低下させる方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを有するＡＡＶを提供するステップを含む、方法。
［１７］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を少なくとも部分的に軽減する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを前記ＡＡＶに組み込むステップを含む、方法。
［１８］
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、そのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）に対する依存性を低下させるように操作する方法であって、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するカプシドポリペプチドを含むＡＡＶを操作するステップを含む、方法。
［１９］
前記アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の非存在下で前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を培養するステップをさらに含む、上記［１６］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を配列決定するステップをさらに含む、上記［１８］に記載の方法。
［２１］
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の前記アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）依存性を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶに対して比較するステップをさらに含む、上記［１８］に記載の方法。
［２２］
前記操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、操作されていないまたは野生型ＡＡＶと整列させるステップをさらに含む、上記［１８］に記載の方法。
［２３］
配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＡＡＰ依存性についての表６に示す表示される位置のアミノ酸残基をさらに含む、ＡＡＶカプシドポリペプチド。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】