特許 7331136 ＣＣＬ２１をコードする組換えラブドウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-14

(45)【発行日】2023-08-22

(54)【発明の名称】ＣＣＬ２１をコードする組換えラブドウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/19 20060101AFI20230815BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20230815BHJP

   A61K 31/4709 20060101ALI20230815BHJP

   A61K 31/4725 20060101ALI20230815BHJP

   A61K 35/766 20150101ALI20230815BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230815BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230815BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20230815BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20230815BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230815BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230815BHJP

   C12N 15/40 20060101ALI20230815BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230815BHJP

   C12R 1/93 20060101ALN20230815BHJP

【ＦＩ】

C12N15/19 ZNA

A61K31/437

A61K31/4709

A61K31/4725

A61K35/766

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61P35/00

C07K14/08

C07K14/52

C12N5/10

C12N7/01

C12N15/40

C12N15/86

C12R1:93

【請求項の数】 41

(21)【出願番号】P 2021564905

(86)(22)【出願日】2020-01-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-15

(86)【国際出願番号】 EP2020051701

(87)【国際公開番号】W WO2020152306

(87)【国際公開日】2020-07-30

【審査請求日】2021-09-17

(31)【優先権主張番号】19153668.9

(32)【優先日】2019-01-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】503385923

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(73)【特許権者】

【識別番号】521322443

【氏名又は名称】ヴィラテラピューティクス・ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＶＩＲＡＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ミュラー，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】エルブ，クラウス

(72)【発明者】

【氏名】アールマン，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】ノルデン，トビアス

(72)【発明者】

【氏名】パーク，ジョン・エドワード

(72)【発明者】

【氏名】ヴォルマン，グイド

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１５６３４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１９７５２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Galivo, F. et al.，Interference of CD40L-mediated tumor immunotherapy by oncolytic vesicular stomatitis virus，Human Gene Therapy，2010年，２１，439-450

【文献】Li, Y. et al.，CCL21/IL21-armed oncolytic adenovirus enhances antitumor activity against TERT-positive tumor cells，Virus Research，2016年，２２０，172-178

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下：
（ｉ） 配列番号２に示すアミノ酸１‐７９、１‐８１、１‐８８、１‐９１又は１‐１０４を含む、タンパク質、
（ｉｉ） 位置８０～１１１において少なくとも１つのアミノ酸残基がさらに欠失又は変異している配列番号２の配列を含む、タンパク質、
（ｉｉｉ） 配列番号２を含むタンパク質；又は
配列番号２と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｉｖ） 配列番号３を含むタンパク質；又は
配列番号３と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｖ） 配列番号４を含むタンパク質；又は
配列番号４と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｖｉ） シグナルペプチド配列をさらに含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のタンパク質、
（ｖｉｉ） 配列番号１を含むタンパク質；又は
配列番号１と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
及び
（ｖｉｉｉ）配列番号５を含むタンパク質；又は、
配列番号５と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質
を含む群から選択される少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はそのフラグメントをそのゲノム中にコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであって、
水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換されている、及び／又は糖タンパク質Ｇが、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換されている、組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項2】

ゲノムが、（ｉ）配列番号２に示すアミノ酸１‐７９、１‐８１、１‐８８、１‐９１又は１‐１０４を含む、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項3】

ゲノムが、（ｉｉ）位置８０～１１１において少なくとも１つのアミノ酸残基がさらに欠失又は変異している配列番号２の配列を含む、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項4】

ゲノムが、（ｉｉｉ）配列番号２を含むタンパク質；又は配列番号２と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項5】

ゲノムが、（ｉｖ）配列番号３を含むタンパク質；又は配列番号３と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項6】

ゲノムが、（ｖ）配列番号４を含むタンパク質；又は配列番号４と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項7】

ゲノムが、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のタンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項8】

ゲノムが、（ｖｉｉ）配列番号１を含むタンパク質；又は配列番号１と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項9】

ゲノムが、（ｖｉｉｉ）配列番号５を含むタンパク質；又は配列番号５と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項10】

少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有するそのフラグメントをゲノム中にコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであって、
（ｉ）水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換されている、及び／又は
（ｉｉ）前記糖タンパク質Ｇが、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換されている、組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項11】

核タンパク質（Ｎ）が、配列番号７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも９８%同一の機能的変異体を含む、請求項１０に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項12】

リン酸化タンパク質（Ｐ）が、配列番号８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも９８%同一の機能的変異体を含む、請求項１０又は１１のいずれかに記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項13】

ラージタンパク質（Ｌ）が、配列番号９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも９８%同一の機能的変異体を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項14】

マトリックスタンパク質（Ｍ）が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも９８%同一の機能的変異体を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項15】

請求項１０から１４のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスであって：
－核タンパク質（Ｎ）が、配列番号７において示すアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含み、
－リン酸化タンパク質（Ｐ）が、配列番号８において示すアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含み、
－ラージタンパク質（Ｌ）が、配列番号９において示すアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含み、及び
－マトリックスタンパク質（Ｍ）が、配列番号１０において示すアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含む組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項16】

複製可能である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項17】

請求項１０から１６のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスであって、
ＣＣＬ２１タンパク質又はそのフラグメントが、以下を含む群：
（ｉ） 配列番号２に示すアミノ酸１‐７９、１‐８１、１‐８８、１‐９１又は１‐１０４を含む、タンパク質、
（ｉｉ） 位置８０～１１１において少なくとも１つのアミノ酸残基がさらに欠失又は変異している配列番号２の配列を含む、タンパク質、
（ｉｉｉ） 配列番号２を含むタンパク質；又は
配列番号２と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｉｖ） 配列番号３を含むタンパク質；又は
配列番号３と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｖ） 配列番号４を含むタンパク質；又は
配列番号４と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｖｉ） シグナルペプチド配列をさらに含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のタンパク質、
（ｖｉｉ） 配列番号１を含むタンパク質；又は
配列番号１と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
及び
（ｖｉｉｉ）配列番号５を含むタンパク質；又は、
配列番号５と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質
より選択される、請求項１０から１６のいずれかに記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項18】

水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はそのフラグメントをそのゲノム中にコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであって、：
ＣＣＬ２１タンパク質又はそのフラグメントが、以下を含む群：
（ｉ） 配列番号２に示すアミノ酸１‐７９、１‐８１、１‐８８、１‐９１又は１‐１０４を含む、タンパク質、
（ｉｉ） 位置８０～１１１において少なくとも１つのアミノ酸残基がさらに欠失又は変異している配列番号２の配列を含む、タンパク質、
（ｉｉｉ） 配列番号２を含むタンパク質；又は
配列番号２と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｉｖ） 配列番号３を含むタンパク質；又は
配列番号３と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｖ） 配列番号４を含むタンパク質；又は
配列番号４と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
（ｖｉ） シグナルペプチド配列をさらに含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のタンパク質、
（ｖｉｉ） 配列番号１を含むタンパク質；又は
配列番号１と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質、
及び
（ｖｉｉｉ）配列番号５を含むタンパク質；又は、
配列番号５と少なくとも９８%の同一性を有し、かつＴ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有する、タンパク質より選択され、
水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換されており、及び／又は前記糖タンパク質Ｇが、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換されており、ならびに
－核タンパク質（Ｎ）が、配列番号７において示すアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含み、
－リン酸化タンパク質（Ｐ）が、配列番号８において示すアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含み、
－ラージタンパク質（Ｌ）が、配列番号９において示すアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含み、及び
－マトリックスタンパク質（Ｍ）が、配列番号１０において示すアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも９８%同一である機能的変異体を含む、
組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項19】

組成物が、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含むことを特徴とする医薬的組成物。

【請求項20】

薬物としての使用のための、請求項１９に記載の医薬的組成物。

【請求項21】

癌、又は固形癌の処置における使用のための、請求項１９に記載の医薬的組成物。

【請求項22】

固形癌が、神経膠芽細胞腫、非小細胞肺癌、生殖系腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、黒色腫、呼吸器系腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び骨腫瘍からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項23】

腫瘍内又は静脈内に投与される、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項24】

少なくとも１回腫瘍内に、その後に静脈内に投与される、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項25】

その後の静脈内投与が、最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、又は３１日に与えられる、請求項２４に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項26】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス、及びさらにＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物を含む組成物。

【請求項27】

ＰＤ－１経路阻害剤が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して向けられているアンタゴニスト抗体である、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

ＳＭＡＣ模倣物が、化合物１から２６：

【表1】

のいずれか１つ、又はこれらの化合物の１つの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項２６に記載の組成物。

【請求項29】

ＰＤ－１経路阻害剤が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５からなる群より選択されるアンタゴニストである、請求項２６に記載の組成物。

【請求項30】

以下を含むキット：
ａ）請求項１～１８いずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス、又は請求項１９に記載の医薬的組成物、及び
ｂ）請求項２９において定義されるＰＤ－１経路阻害剤又は請求項２８において定義されるＳＭＡＣ模倣物。

【請求項31】

ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物と組み合わせて投与される、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項32】

ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物と同時に、連続的に、又は交互に投与される、請求項３１に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項33】

ＳＭＡＣ模倣物が、請求項２８に記載の化合物１から２６のいずれか１つ又はこれらの化合物の１つの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項３１又は３２に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項34】

ＰＤ－１経路阻害剤が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５からなる群より選択される、請求項３１又は３２に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項35】

ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物とは異なる投与経路を介して投与される、３１又は３２に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項36】

医薬的組成物が、少なくとも一回腫瘍内に投与され、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物が静脈内に投与される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の使用のための医薬的組成物。

【請求項37】

請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスに感染したウイルス産生細胞であって、前記組換え水疱性口内炎ウイルスを産生することを特徴とするウイルス産生細胞。

【請求項38】

細胞がＶｅｒｏ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞であることを特徴とする、請求項３７に記載のウイルス産生細胞。

【請求項39】

そのＲＮＡゲノム中に少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はそのフラグメントをコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであって、前記ＣＣＬ２１タンパク質又はそのフラグメントが、Ｔ細胞若しくは樹状細胞の誘引機能又は樹状細胞の活性化機能を有し、そのＲＮＡゲノムが、配列番号２４と同一、あるいは少なくとも９０%同一のコード配列を含む、又はそれからなる、組換え水疱性口内炎ウイルス。

【請求項40】

癌、又は固形癌の処置のための医薬の製造における、請求項１～１８いずれか一項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスの使用。

【請求項41】

固形癌が、神経膠芽細胞腫、非小細胞肺癌、生殖系腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、黒色腫、呼吸器系腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び骨腫瘍からなる群から選択される、請求項４０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの分野に、特に、ＣＣＬ２１タンパク質をそのゲノム中にコードする組換えラブドウイルスに関する。本発明はさらに、癌の処置における組換えラブドウイルスの使用に、及びそのようなウイルスを産生するための方法に関する。

【0002】

発明の背景
腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で選択的に複製し、それを死滅させ、腫瘍内に広がることができる新興クラスの生物製剤である。腫瘍溶解性ウイルスをさらに改善し、それらの治療的能力を増加させるための努力は、腫瘍処置におけるそれらの有効性を改善するために、それらのゲノム中に腫瘍抗原又は免疫調節導入遺伝子をコードする、いわゆる武装ウイルスの開発に導いてきた。

【0003】

多くの場合では、腫瘍においてＴ細胞の不足があるため、「免疫砂漠」として公知になっているもの・・・免疫系のＴ細胞が腫瘍に侵入し、無制御に成長する細胞を死滅させることができない、又はしない腫瘍微小環境が存在する。免疫監視を回避するために、腫瘍は、骨髄由来のサプレッサー細胞を動員する、又はＴＧＦβ（細胞外マトリックス遺伝子の発現を誘導する、ならびに腫瘍中へのＴ細胞浸潤を促進するために要求されるケモカイン及びサイトカインの発現を抑制するという二重の役割を果たす）を含む因子を分泌することにより免疫抑制的な微小環境を作ると仮定されてきた（Pickup M, Novitskiy S, Moses HL. The roles of TGFbeta in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer 2013;13:788-99）。さらに、試験によって、免疫抑制的な微小環境に対応する遺伝子の高発現を示す腫瘍は、多くの癌型（卵巣癌及び結腸直腸癌を含む）にわたる不良な転帰に関連付けられることが見出されている（Calon A, Lonardo E, Berenguer-Llergo A, Espinet E, Hernando-Momblona X, Iglesias M, et al. Stromal gene expression defines poor-prognosis subtypes in colorectal cancer. Nat Genet 2015;47:320-9；Ryner L, Guan Y, Firestein R, Xiao Y, Choi Y, Rabe C, et al. Upregulation of periostin and reactive stroma is associated with primary chemoresistance and predicts clinical outcomes in epithelial ovarian cancer. Clin Cancer Res 2015;21:2941-51；Tothill RW, Tinker AV, George J, Brown R, Fox SB, Lade S, et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clin Cancer Res 2008;14:5198-208.）

【0004】

１つの最近のアプローチによって、そのゲノム中にＩＦＮ－βタンパク質をカーゴとしてコードする腫瘍溶解性ウイルスが予見されている。さらなるアプローチでは、腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３の発現が熟慮された。適切で効果的なカーゴを同定することに加えて、ウイルス骨格からの追加のカーゴの発現は、抗腫瘍効果だけでなく、しかし、また抗ウイルス免疫も増強するリスクを常に持っている。カーゴは、治療的カーゴの発現により得られる利益が、腫瘍溶解能の喪失により打ち消される程度までウイルスの腫瘍溶解能を制限しないことに注意しなければならない。このように、当技術分野では、腫瘍の効果的な処置において使用することができる、さらに改善された武装腫瘍溶解性ウイルスについての必要性がある。さらに、当技術分野では、免疫抑制的な腫瘍微小環境中へのＴ細胞及び／又は樹状細胞の浸潤を選択的に改善する必要性がある。

【0005】

発明の概要
本発明は、そのゲノム中にＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換えラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルスなど）を提供することにより、上記の必要性に対処する。

【0006】

特定の態様に関する任意の実施形態は、その特定の態様に対するいくつかの実施形態を含む複数の層及び組み合わせにおいてさえ、その特定の態様に関する別の実施形態とも組み合わせてもよいことを理解すべきである。

【0007】

第１の態様では、本発明は、そのゲノム中に少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体をコードする組換えラブドウイルスに関する。

【0008】

第１の態様に関する一実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体は、（ｉ）プラスミン処理されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉ）ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉｉ）配列番号２を含む、又は配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖ）配列番号４を含む、又は配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに従ったタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号１を含む、又は配列番号１と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、あるいは（ｖｉｉｉ）配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質を含む群より選択する。

【0009】

第１の態様に関する一実施形態では、組換えラブドウイルスはベジクロウイルスである。

【0010】

第１の態様に関する一実施形態では、ベジクロウイルスは、水疱性口内炎アラゴアスウイルス（ＶＳＡＶ）、カラハスウイルス（ＣＪＳＶ）、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、イスファハンウイルス（ＩＳＦＶ）、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）、又はピリ（ｐｉｒｙ）ウイルス（ＰＩＲＹＶ）、好ましくは水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）又は好ましくは水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）を含む群より選択する。

【0011】

第１の態様に関する一実施形態では、組換えラブドウイルスは複製能力がある。

【0012】

第１の態様に関する一実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体はヒトＣＣＬ２１である。

【0013】

第１の態様に関する一実施形態では、組換えラブドウイルスは、糖タンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を欠く、及び／又は機能的糖タンパク質Ｇを欠く；あるいは、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置換される；あるいは、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、アレナウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、アレナウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置換される。さらに好ましい実施形態では、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、Ｄａｎｄｅｎｏｎｇウイルス又はＭｏｐｅｉａウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、Ｄａｎｄｅｎｏｎｇウイルス又はＭｏｐｅｉａウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置換される。さらにより好ましくは、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される。

【0014】

第１の態様に関する好ましい実施形態では、本発明は、そのゲノム中に、（ｉ）プラスミン処理されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉ）ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉｉ）配列番号２を含む、又は配列番号２と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖ）配列番号４を含む、又は配列番号４と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに従ったタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号１を含む、又は配列番号１と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質、あるいは（ｖｉｉｉ）配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、もしくは９９%の同一性を有するタンパク質を含む群より選択される、少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスを提供し、それにおいて、組換え水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される。

【0015】

第２の態様では、本発明は、そのゲノム中に、少なくとも水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスに関する。

【0016】

第２の態様に関する一実施形態では、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７において示すアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含む。

【0017】

第２の態様に関する一実施形態では、リン酸化タンパク質（Ｐ）は、配列番号８において示すアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含む。

【0018】

第２の態様に関する一実施形態では、ラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９において示すアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含む。

【0019】

第２の態様に関する一実施形態では、マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号１０において示すアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含む。

【0020】

第２の態様に関する好ましい実施形態では、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７において示すアミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含み、リン酸化タンパク質（Ｐ）は、配列番号８において示すアミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含み、ラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９において示すアミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含み、及びマトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号１０において示すアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一である機能的変異体を含む。

【0021】

第２の態様に関する一実施形態では、組換え水疱性口内炎ウイルスは複製能力がある。

【0022】

第２の態様に関する一実施形態では、組換え水疱性口内炎ウイルスは、糖タンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を欠く、及び／又は機能的糖タンパク質Ｇを欠く；あるいは、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置換される；あるいは、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される。

【0023】

第２の態様に関する一実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体は、（ｉ）プラスミン処理されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉ）ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉｉ）配列番号２を含む、又は配列番号２と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、（ｖ）配列番号４を含む、又は配列番号４と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに従ったタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号１を含む、又は配列番号１と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、あるいは配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質を含む群より選択する。

【0024】

第２の態様に関する好ましい実施形態では、本発明は、そのゲノム中に、水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスを提供し、それにおいてＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体は、（ｉ）プラスミン処理されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉ）ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉｉ）配列番号２を含む、又は配列番号２と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、（ｖ）配列番号４を含む、又は配列番号４と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに従ったタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号１を含む、又は配列番号１と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質、あるいは（ｖｉｉｉ）配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%の同一性を有するタンパク質を含む群より選択し、それにおいて、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される、ならびに、それにおいて核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７において示すアミノ酸、又は配列番号７と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含む、リン酸化タンパク質（Ｐ）は、配列番号８において示すアミノ酸、又は配列番号８と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含む、ラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９において示すアミノ酸、又は配列番号９と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含む、及びマトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号１０において示すアミノ酸、又は配列番号１０と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含む。

【0025】

第３の態様では、本発明は、組成物が、第１の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換えラブドウイルス、あるいは第２の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換え水疱性口内炎ウイルスを含むことを特徴とする医薬的組成物を提供する。

【0026】

第４の態様では、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換えラブドウイルス、あるいは第２の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換え水疱性口内炎ウイルス、あるいは薬物としての使用のための第３の態様又はその実施形態のいずれかに従った医薬的組成物を提供する。

【0027】

第４の態様に関する一実施形態では、本発明は、組換えラブドウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス、又は癌、好ましくは固形癌の処置における使用のための医薬的組成物を提供する。好ましい実施形態では、固形癌は、生殖系腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、精巣腫瘍、内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、黒色腫、呼吸器系腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び骨腫瘍を含むリストより選択する。

【0028】

第４の態様に関する一実施形態では、組換えラブドウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス、又は医薬的組成物は、腫瘍内又は静脈内に投与すべきである。別の関連する実施形態では、組換えラブドウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス又は医薬的組成物は、少なくとも１回腫瘍内に、及びその後、静脈内に投与すべきである。さらに関連する実施形態では、組換えラブドウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス、又は医薬的組成物のその後の静脈内投与は、最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、又は３１日に与える。

【0029】

第５の態様では、本発明は、第１の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換えラブドウイルス、あるいは第２の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換え水疱性口内炎ウイルス、及びさらには阻害剤を含む組成物を提供し、それにおいて阻害剤はＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物である。

【0030】

第５の態様に関する一実施形態では、ＰＤ－１経路阻害剤はアンタゴニスト抗体であり、それはＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して向けられる。さらに関連する実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２からの化合物１から２６のいずれか、又はこれらの化合物の１つの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される。別の関連する実施形態では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５からなる群より選択されるアンタゴニストである（表１中に示すとおり）。

【0031】

第６の態様では、本発明は、以下を含む部品のキットを提供する：組換えラブドウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス、又は第１から第３の態様のいずれか又はそれらの実施形態のいずれかにおいて定義するような医薬的組成物、及び第５の態様に関連する実施形態のいずれかにおいて定義するようなＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物。

【0032】

第７の態様では、本発明は、以下を含む併用処置を提供する：ａ）第１の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換えラブドウイルス、あるいは第２の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換え水疱性口内炎ウイルス、あるいは第３の態様又はその実施形態のいずれかに従った医薬的組成物、及びｂ）ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物。第７の態様に関連する一実施形態では、ａ）及びｂ）は、同時に、連続的に、又は交互に投与してもよい。関連する実施形態では、ａ）及びｂ）は、異なる投与経路を介して投与する。さらに関連する実施形態では、ａ）は腫瘍内に投与し、ｂ）は静脈内に投与する。

【0033】

第７の態様に関する一実施形態では、ＰＤ－１経路阻害剤はアンタゴニスト抗体であり、それはＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して向けられる。関連する実施形態では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５からなる群より選択する（表１を参照のこと）。さらに関連する実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２に従った化合物１から２６のいずれか１つ、又はこれらの化合物の１つの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択する。

【0034】

第８の態様では、本発明は、細胞が第１の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換えラブドウイルス、あるいは第２の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換え水疱性口内炎ウイルスを産生することを特徴とするウイルス産生細胞を提供する。

【0035】

第８の態様に関する一実施形態では、ウイルス産生細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。

【0036】

第９の態様では、本発明は、細胞培養において組換えラブドウイルスを産生する方法を提供する：
（ｉ）組換えラブドウイルス、好ましくは水疱性口内炎ウイルスを用いて宿主細胞を感染させること、
（ｉｉ）組換えラブドウイルスの複製を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、
（ｉｉｉ）細胞培養から組換えラブドウイルスを回収すること、
（ｉｖ）場合により、好ましくはベンゾナーゼを用いたウイルス回収物の酵素処理、
（ｖ）陽イオン交換モノリス膜吸着剤又は樹脂上にロードし、それに続く溶出により、ラブドウイルス回収物を捕捉すること、
（ｖｉ）工程（ｖ）の溶出液をサイズ排除、マルチモーダルサイズ排除／イオン交換又はタンジェンシャルフローろ過に供することによりラブドウイルスを研磨する、
（ｖｉｉ）限外ろ過／透析ろ過による研磨ラブドウイルスの緩衝液交換、
（ｖｉｉｉ）ラブドウイルスの滅菌ろ過。

【0037】

第９の態様に関する一実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。

【0038】

第９の態様に関する一実施形態では、宿主細胞は懸濁液中で培養する。

【0039】

第９の態様に関する一実施形態では、組換えラブドウイルスは、医薬的組成物中で製剤化する。好ましい実施形態では、第１の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換えラブドウイルス、あるいは第２の態様又はその実施形態のいずれかに従った組換え水疱性口内炎ウイルスは、医薬的組成物中で製剤化する。

【0040】

さらなる態様では、組換えラブドウイルスは、そのＲＮＡゲノム中で、少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードし、それにおいて組換えラブドウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号２４と同一の又は少なくとも７５%、７６%、７７%、７８%、７９%、８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、もしくは９９%同一のコード配列を含む、又はそれからなる。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】示した遺伝子についての対照又はＶＳＶ－ＧＰ処置マウスからのＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍（全ＲＮＡ）の発現分析。

【図2】ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ担癌マウスの単一腫瘍成長曲線。（Ａ）対照マウス（模擬処置）、（Ｂ）抗ＰＤ－１で処置されたマウス、（Ｃ）ＶＳＶ－ＧＰ ｉ．ｖ．で処置されたマウス、又は（Ｄ）ＶＳＶ－ＧＰと抗ＰＤ－１の組み合わせで処置されたマウス。

【図3】ＶＳＶ－ＧＰ（図２Ｃを参照のこと）又はＶＳＶ－ＧＰと抗ＰＤ１の組み合わせ（図２Ｄを参照のこと）で前処置された治癒マウスの腫瘍（再）攻撃分析。（Ａ）ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍細胞を伴う無感作マウスを対照として使用した。腫瘍（再）攻撃のために、ＣＴ２６Ｃｌ２５ ＩＦＮＡＲ－／－細胞を、（Ｂ）図２Ｃに示す実験からのＶＳＶ－ＧＰ処置長期腫瘍フリーマウス（治癒）、又は（Ｃ）図２Ｄに示す実験からのＶＳＶ－ＧＰと抗ＰＤ－１の組み合わせで処置された長期腫瘍フリーマウス（治癒）中に注射した。

【図4】示したケモカインについての、対照又はＶＳＶ－ＧＰ処置マウスからのＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍（全ＲＮＡ）の発現分析。

【図5】（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰゲノム内のＣＣＬ２１（導入遺伝子）挿入部位を例証する図。（Ｂ）ウイルスレスキューを例証する図。

【図6】（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１（全長マウスＣＣＬ２１をコードするＶＳＶ－ＧＰ）で感染させたＨＥＫ２９３細胞の上清中のマウスＣＣＬ２１の分析。（Ｂ）Transwellセットアップ及び、組換えマウスＣＣＬ２１又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１感染ＨＥＫ２９３細胞からの上清を使用したマウスＴ細胞遊走の機能分析。

【図7】ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ担癌マウスの単一腫瘍成長分析。担癌マウスを、（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰ、（Ｂ）ＳＭＡＣｍ（ＳＭＡＣ模倣物）、又は（Ｃ）ＳＭＡＣｍ（ＳＭＡＣ模倣物）との組み合わせにおけるＶＳＶ－ＧＰで処置した。濃い黒色線は未処置の対照マウスの腫瘍容積を示すのに対し、薄い灰色線は（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰ、（Ｂ）ＳＭＡＣｍ、又は（Ｃ）ＶＳＶ－ＧＰ＋ＳＭＡＣｍのいずれかで処置したマウスの腫瘍容積を示す。

【図8】ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ担癌マウスの単一腫瘍成長分析。担癌マウスは、（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１、（Ｂ）ＳＭＡＣｍ（ＳＭＡＣ模倣物）、又は（Ｃ）ＳＭＡＣｍ（ＳＭＡＣ模倣物）との組み合わせにおけるＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１で処置した。濃い黒色線は未処置の対照マウスの腫瘍容積を示すのに対し、薄い灰色線は（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１、（Ｂ）ＳＭＡＣｍ、又は（Ｃ）ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１ ＋ ＳＭＡＣｍのいずれかで処置したマウスの腫瘍容積を示す。

【図9】図７Ａ～Ｃ及び図８Ａ～Ｃに描写する実験の生存分析。

【図10】ＣＤ３イプシロン、ＣＸＣＬ１０、及びＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１によりコードされるマウスＣＣＬ２１のコドン最適化配列についての対照、ＶＳＶ－ＧＰ、又はＶＳＶ－ＧＰｍｕＣＣＬ２１処置マウスからのＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍（全ＲＮＡ）の発現分析。

【図11】ＶＳＶ－Ｇ ＤｓＲｅｄ（神経毒性野生型ＶＳＶ）、ＶＳＶ－ＧＰ、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１、又はＰＢＳの脳内注射により誘導される神経毒性の評価。パネル（Ａ）は、それぞれの注射後の経時的なマウスにおける体重増加／減少の割合を示す。パネル（Ｂ）は、それぞれの注射後の経時的なマウスの生存率を示す。

【図12】（Ａ）ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（全長ヒトＣＣＬ２１をコードするＶＳＶ－ＧＰ）に感染させたＨＥＫ２９３細胞の上清中のヒトＣＣＬ２１の分析。（Ｂ）Transwellセットアップ及び組換えヒトＣＣＬ２１、又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１感染ＨＥＫ２９３細胞からの上清を使用したヒトＴ細胞遊走の機能分析。

【図13】種の交差反応性をテストするための、Transwellセットアップ及び組換えマウスＣＣＬ２１対ヒトＣＣＬ２１又はラットＣＣＬ２１対ヒトＣＣＬ２１をそれぞれ使用したマウス（Ａ、左パネル）及びラット（Ｂ、右パネル）のＴ細胞遊走の機能分析。

【図14】ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ担癌対照マウス又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１で処置したマウスの単一腫瘍成長分析。

【図15】短い拡散性ｎ末端フラグメントを生成するためのプラスミンによるＣＣＬ２１プロセシングを例証する漫画。

【図16】Transwellセットアップ及び組換えヒトＣＣＬ２１（ｒｅｃ． ＣＣＬ２１）又はＣＣＬ２１の示したｃ末端切断バージョンを発現するプラスミドトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からの上清を使用したヒトＴ細胞遊走の機能分析。

【図17】Transwellセットアップ及び組換えヒトＣＣＬ２１、又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１あるいはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）感染ＨＥＫ２９３細胞からの上清を使用したヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）遊走の機能分析。

【図18】ＣＣＬ２１の示した、ｃ末端切断もしくは全長バージョンを発現するプラスミドトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からの上清、又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）もしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１感染ＨＥＫ２９３細胞からの上清中のＣＣＬ２１のウエスタンブロット（ＷＢ）分析。

【図19】示した細胞の上清中のＶＳＶ－ＧＰ（ＧＰ）、ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（２１）、又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）（２１ｋ）のウイルス力価を、ウイルス感染後の示した時間点で測定してウイルス複製能力を決定した。異なるパネルは、左から右に（Ａ）Ｖｅｒｏ細胞、（Ｂ）ＢＨＫ２１細胞、及び（Ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を示す。各々のパネルで、ＶＳＶ－ＧＰ（ＧＰ）、ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（２１）、又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）（２１ｋ）の力価を０時間、２４時間、及び４８時間で測定した。

【図20】ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ担癌対照マウス又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１もしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）で処置されたマウスにおける累積腫瘍成長。

【図21】図２０からのマウスの３０日生存。

【図22】ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ担癌対照マウス又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１もしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）で処置されたマウスにおけるＴ細胞浸潤（生存可能な非壊死性腫瘍セグメント）のＩＨＣベースの定量化。

【図23】ウイルス感染腫瘍の免疫浸潤に対するＶＳＶ－ＧＰ、ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１（全長ＣＣＬ２１）、及びＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１（１－７９）（ｃ末端切断ＣＣＬ２１）の影響を例証する漫画。

【図24】ＣＴ２６．ＣＬ２５担癌対照マウス又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１で処置したマウスにおける樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性）浸潤（活性なウイルス複製を伴う腫瘍領域＝壊死縁）のＩＨＣベースの定量化。

【0042】

本発明の詳細な記載
以下の詳細な記載では、多数の特定の詳細を示して、本発明の完全な理解を提供する。しかし、主題の技術がこれらの特定の詳細の一部を伴わずに実行されうることは、当業者には明らかであろう。他の例では、周知の構造及び技術は、本発明を不明瞭にしないように詳細には示していない。見出しは、単に読む際に支援する便宜のために含まれており、本発明を特定の態様又は実施形態に限定すると理解すべきではない。

【0043】

ラブドウイルス

【0044】

ラブドウイルスの科は、約１０～１６kbのマイナス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを伴う１８属及び１３４種を含む（Walke et al., ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae, Journal of General Virology, 99:447-448（2018)）。

【0045】

ラブドウイルスの科のメンバーの特徴となる特色は、以下の１つ又は複数を含む：マトリックス層及び脂質エンベロープにより囲まれたらせん状ヌクレオカプシドで構成される、長さ１００～４３０nm及び直径４５～１００nmの弾丸形又は桿状粒子であって、それにおいて一部のラブドウイルスはエンベロープのない糸状ウイルスを有する。１０．８～１６．１kbのマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡであって、大半がセグメント化されていない。構造タンパク質である核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、及び糖タンパク質（Ｇ）をコードする少なくとも５つの遺伝子をコードするゲノム。

【0046】

本明細書中で使用するように、ラブドウイルスは、アルメンドラウイルス、キュリオウイルス、サイトラブドウイルス、ジコルハウイルス、エフェメロウイルス、ハパウイルス、レダンテウイルス、リッサウイルス、ノビルハブドウイルス、ヌクレオラブドウイルス、ペルハブドウイルス、シグマウイルス、スプリビウイルス、スリプウイルス、チブロウイルス、ツパウイルス、バリコサウイルス、又はベシキュロウイルスの属に属しうる。

【0047】

本明細書中に言及する属内で、ラブドウイルスは、列挙する種のいずれかに属することができる。アルメンドラウイルスの属は、アルボレタム・アルメンドラウイルス、バルサ・アルメンドラウイルス、クート・ベイ・アルメンドラウイルス、プエルト・アルメンドラス・アルメンドラウイルス、リオ・チコ・アルメンドラウイルスを含む；キュリオウイルスの属は、キュリオノポリス・キュリオウイルス、イリリ・キュリオウイルス、イタカイウナス・キュリオウイルス、ロシャンボー・キュリオウイルスを含む；サイトラブドウイルスの属は、アルファルファ・ドワーフ・サイトラブドウイルス、オオムギ黄色条斑モザイク・サイトラブドウイルス、ブロッコリー壊死性黄色サイトラブドウイルス、コロカシア・ボボーン病関連サイトラブドウイルス、フェスツカ葉条斑サイトラブドウイルス、フェスツカ葉条斑サイトラブドウイルス、レタス壊死性黄色サイトラブドウイルス、レタス黄色モットル・サイトラブドウイルス、ノーザン・シリアル・モザイク・サイトラブドウイルス、ソンカス・サイトラブドウイルス１、ストロベリー・クリンクル・サイトラブドウイルス、小麦アメリカン条斑モザイク・サイトラブドウイルスを含む；ジコルハウイルスの属は、コーヒー・リングスポット・ジコルハウイルス、オーキッド・フレック・ジコルハウイルスを含む；エフェメロウイルスの属は、アデレード・リバー・エフェメロウイルス、ベリマ・エフェメロウイルス、ウシ熱エフェメロウイルス、キンバリー・エフェメロウイルス、クールピニャ・エフェメロウイルス、コトンカン・エフェメロウイルス、オボディアン・エフェメロウイルス、ヤタ・エフェメロウイルスを含む；ハパウイルスの属は、フランダース・ハパウイルス、グレイ・ロッジ・ハパウイルス、ハート・パーク・ハパウイルス、ジョインジャカカ・ハパウイルス、カメセ・ハパウイルス、ラ・ジョヤ・ハパウイルス、ランドジア・ハパウイルス、マニトバ・ハパウイルス、マルコ・ハパウイルス、モスケイロ・ハパウイルス、モスリル・ハパウイルス、ンゲインガン・ハパウイルス、オード・リバー・ハパウイルス、パリー・クリーク・ハパウイルス、ウォンガベル・ハパウイルスを含む；レダンテウイルスの属は、バルル・レダンテウイルス、フィキリニ・レダンテウイルス、フクオカ・レダンテウイルス、カニャワラ・レダンテウイルス、ケーン・キャニオン・レダンテウイルス、ケウラリバ・レダンテウイルス、コレンテ・レダンテウイルス、クマシ・レダンテウイルス、レ・ダンテック・レダンテウイルス、マウント・エルゴン・バット・レダンテウイルス、ニシムロ・レダンテウイルス、ンコルビソン・レダンテウイルス、オイタ・レダンテウイルス、ウーハン・レダンテウイルス、ヨンジア・レダンテウイルスを含む；リッサウイルスの属は、アラバン・リッサウイルス、オーストラリアン・コウモリ・リッサウイルス、ボケロー・コウモリ・リッサウイルス、デュベンハージ・リッサウイルス、ヨーロピアン・コウモリ１リッサウイルス、ヨーロピアン・コウモリ２リッサウイルス、ガンノルワ・コウモリ・リッサウイルス、イコマ・リッサウイルス、イルクート・リッサウイルス、ホジェンド・リッサウイルス、ラゴス・コウモリ・リッサウイルス、ルレイダ・コウモリ・リッサウイルス、モコラ・リッサウイルス、狂犬病リッサウイルス、シモニ・コウモリ・リッサウイルス、西コーカサス・コウモリ・リッサウイルスを含む；ノビルハブドウイルスの属は、ヒラメ・ノビルハブドウイルス、ピシネ・ノビルハブドウイルス、サルモニド・ノビルハブドウイルス、スネークヘッド・ノビルハブドウイルスを含む；ヌクレオラブドウイルスの属は、チョウセンアサガオ黄色葉脈ヌクレオラブドウイルス、ナス斑点矮性ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシ・ファイン・ストリーク・ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシ・イラン・モザイク・ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシ・モザイク・ヌクレオラブドウイルス、ジャガイモ黄色矮性ヌクレオラブドウイルス、ライス・イエロー・スタント・ヌクレオラブドウイルス、ソンクス・イエロー・ネット・ヌクレオラブドウイルス、ノゲシ黄色葉脈ヌクレオラブドウイルス、タロ葉脈クロロシス・ヌクレオラブドウイルスを含む；ペルハブドウイルスの属は、アンギリッド・ペルハブドウイルス、パーチ・ペルハブドウイルス、シー・トラウト・ペルハブドウイルスを含む；シグマウイルスの属は、ショウジョウバエ・アフィニス・シグマウイルス、ショウジョウバエ・アナナサエ・シグマウイルス、ショウジョウバエ・イミグランス・シグマウイルス、キイロショウジョウバエ・シグマウイルス、ショウジョウバエ・オブスキュラ・シグマウイルス、ショウジョウバエ・トリスチス・シグマウイルス、ムスシナ・スタビュランス・シグマウイルスを含む；スプリビウイルスの属は、コイ・スプリビウイルス、パイク・フライ・スプリビウイルスを含む；スリプウイルスの属は、アルムピワール・スリプウイルス、チャコ・スリプウイルス、ニアカ・ スリプウイルス、セナ・マデュレイラ・スリプウイルス、スリプール・スリプウイルスを含む；チブロウイルスの属は、バスーコンゴ・チブロウイルス、ベアトリス・ヒル・チブロウイルス、コースタール・プレインズ・チブロウイルス、エクポマ１チブロウイルス、エクポマ ２チブロウイルス、スウィートウォーター・ブランチ・チブロウイルス、チブロガルガン・チブロウイルスを含む；トゥパウイルスの属は、ダーラム・トゥパウイルス、クラマス・トゥパウイルス、トゥパイア・トゥパウイルスを含む；バリコサウイルスの属は、レタス大葉脈関連バリコサウイルスを含む；ベシクロウイルスの属は、アラゴアス・ベシクロウイルス、アメリカン・コウモリ・ベシクロウイルス、カラハス・ベシクロウイルス、チャンディプラ・ベシクロウイルス、コカル・ベシクロウイルス、インディアナ・ベシクロウイルス、イスファハン・ベシクロウイルス、ジュロナ・ベシクロウイルス 、マルパイス・スプリング・ベシクロウイルス、マラバ・ベシクロウイルス、モレトン・ベシクロウイルス、ニュージャージー・ベシクロウイルス、ペリネット・ベシクロウイルス、ピリー・ベシクロウイルス、ラジ・ベシクロウイルス、ユグ・ボグダノバック・ベシクロウイルス、又はムッサ・ウイルスを含む。

【0048】

好ましくは、本発明の組換えラブドウイルスは、腫瘍溶解性ラブドウイルスである。この点で、腫瘍溶解性は当技術分野において公知のその通常の意味を有し、正常細胞ではなく（有意な範囲で）、癌細胞に感染し、溶解（分解）するラブドウイルスの能力を指す。好ましくは、腫瘍溶解性ラブドウイルスは、癌細胞内で複製することが可能である。腫瘍溶解活性は、当業者に公知の異なるアッセイ系においてテストしてもよい（例示的なインビトロアッセイが、Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014により記載されている）。腫瘍溶解性ラブドウイルスは、特定の種類の癌細胞だけに感染し、溶解しうることを理解すべきである。また、腫瘍溶解効果は、癌細胞の種類に依存して変動しうる。

【0049】

好ましい実施形態では、ラブドウイルスは、ベジクロウイルス属に属する。ベジクロウイルス種は、ゲノムの系統発生分析と連関された血清学的手段により主に定義されている。生物学的特性（例えば宿主範囲及び伝播の機構など）も、属内のウイルス種を区別するために使用される。そのようなものとして、ベジクロウイルス属は、完全なＬ配列から推測される最尤ツリーにより十分に支持される別個の単系統群を形成する。

【0050】

ベジクロウイルス属内の異なる種に割り当てられたウイルスは、以下の特徴の１つ又は複数を有しうる：Ａ）Ｌにおける２０%の最小アミノ酸配列相違；Ｂ）Ｎにおける１０%の最小アミノ酸配列相違；Ｃ）Ｇにおける１５%の最小アミノ酸配列相違；Ｄ）血清学的検査において区別することができる；及びＥ）宿主及び／又は媒介節足動物における違いにより証明されるように、異なる生態学的ニッチを占める。

【0051】

好ましいのは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、特にＶＳＶ－ＧＰ（ＬＣＭＶのＧＰとの組換え体）である。ＶＳＶ－ＧＰの有利な特性は、以下の１つ又は複数を含む：非常に強力で高速なキラー（＜８時間）；腫瘍溶解性ウイルス；可能な全身適用；低下したニューロトロピズム／ニューロトックス；それによって溶解的に複製し、免疫原性細胞死を誘導する；インターフェロン（ＩＦＮ）応答のため、健常なヒト細胞中では複製しない；自然免疫の強力な活性化；免疫調節カーゴ及び抗原のための約３ｋｂのスペース；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）からのアレナウイルス糖タンパク質との組換え体；野生型ＶＳＶ（ＶＳＶ－Ｇ）と比較し、低下した神経毒性ならびに中和抗体応答及び補体破壊へのより少ない感受性という点での有利な安全特色；抗ウイルス性の自然免疫応答（例、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達）を開始し、応答する能力を失った腫瘍細胞において特異的に複製する；「健常な細胞」における不全型複製は、そのように、正常組織から迅速に除外される；腫瘍細胞におけるウイルス複製は、免疫原性細胞死の誘導、腫瘍関連抗原の放出、局所炎症、及び抗腫瘍免疫の誘導に導く。

【0052】

本発明は、少なくとも水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をそのゲノム中にコードする組換え水疱性口内炎ウイルスによりさらに具体化する。

【0053】

好ましい実施形態では、組換え水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中に、少なくとも配列番号７において示すアミノ酸配列又は配列番号７と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含む水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、配列番号８において示すアミノ酸配列又は配列番号８と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含むリン酸化タンパク質（Ｐ）、配列番号９において示すアミノ酸配列又は配列番号９と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含むラージタンパク質（Ｌ）、及び配列番号１０において示すアミノ酸配列又は配列番号１０と少なくとも８０%、８５%、９０%、９２%、９４%、９６%、９８%同一の機能的変異体を含むマトリックスタンパク質（Ｍ）をコードする。

【0054】

水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、又は糖タンパク質（Ｇ）配列への修飾は、それらのタンパク質の基本的な機能を失うことなく作製することができることが当業者により理解される。本明細書中で使用されるそのような機能的変異体は、それらの基本的な機能又は活性の全て又は一部を保持する。タンパク質Ｌは、例えば、ポリメラーゼであり、ウイルスの転写及び複製の間に不可欠な機能を有する。その機能的変異体は、この能力の少なくとも一部を保持しなければならない。基本的な機能性又は活性の保持についての良い徴候は、腫瘍細胞を複製及び感染することが依然として可能であるウイルス（これらの機能的変異体を含む）の成功裏の産生である。ウイルスの産生及び腫瘍細胞における感染及び複製のテストは、当業者に公知の異なるアッセイ系においてテストしてもよい（例示的なインビトロアッセイは、Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014により記載されている）。

【0055】

好ましい実施形態では、組換え水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中に、少なくとも水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードし、それにおいてラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９の≧８０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0056】

好ましい実施形態では、組換え水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中に、少なくとも水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードし、それにおいて核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７の≧９０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0057】

さらに好ましい実施形態では、組換え水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中に、少なくとも水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードし、それにおいてラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９の８０%と等しい又はそれより大きい配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７の≧ ９０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0058】

本発明の好ましい実施形態では、本発明の組換えラブドウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号２４において示す配列を含む、又はそれからなる。さらに、本発明の組換えラブドウイルスのＲＮＡゲノムはまた、それらの配列からなりうる、又は含みうるが、それにおいてＲＮＡゲノムの核酸は、それぞれのアミノ酸配列の変化に導くことなく、遺伝子コードの縮重に従って交換される。さらに好ましい実施形態では、本発明の組換えラブドウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号２４と同一の又は少なくとも７５%、７６%、７７%、７８%、７９%、８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一のコード配列を含む、又はそれからなる。

【0059】

本発明の組換えラブドウイルスは、そのゲノム中に、さらなるカーゴ、例えば腫瘍抗原、さらなるケモカイン、サイトカイン、又は他の免疫調節エレメントなどをコードしうることを理解すべきである。

【0060】

さらなる実施形態では、本発明の組換えラブドウイルスは、そのゲノム中に、ヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質（ＮＩＳ）をさらにコードする。ＮＩＳの発現及び例えば１２５Ｉを用いた同時インキュベーションによって、イメージングレポーターとしてのＮＩＳの使用が可能になる（Carlson et al., Current Gene Therapy, 12, 33-47, 2012）。

【0061】

組換えラブドウイルス

【0062】

特定の野生型ラブドウイルス株、例えば野生型ＶＳＶ株などは、神経毒性であると見なされることが公知である。感染した個人は、主に糖タンパク質に対して向けられた高い抗体価を伴い、強力な体液性応答を迅速に開始できることも報告されている。ラブドウイルスの糖タンパク質Ｇ及びＶＳＶを標的化する中和抗体は、一般的に、ウイルスの伝播を限定させ、それにより、ウイルスの再感染からの個人の保護を媒介することができる。ウイルス中和は、しかし、癌患者へのラブドウイルスの反復適用を限定する。

【0063】

これらの欠点を排除するために、ラブドウイルス野生型糖タンパク質Ｇを、別のウイルスからの糖タンパク質で置換してもよい。この点で、糖タンパク質を置換することは、（ｉ）別のウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を用いた、野生型糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子の置換、及び／又は（ｉｉ）別のウイルスの糖タンパク質ＧＰを用いた、野生型糖タンパク質Ｇの置換を指す。

【0064】

好ましい実施形態では、ラブドウイルス糖タンパク質Ｇは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰで、好ましくはＷＥ－ＨＰＩ株で置換する。さらにより好ましい実施形態では、ラブドウイルスは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰを伴う、好ましくはＷＥ－ＨＰＩ株を伴う水疱性口内炎ウイルスである。そのようなＶＳＶは、例えば、ＷＯ２０１０／０４５０２６において記載されており、ＶＳＶ－ＧＰと名付けられている。提供される利点は、（ｉ）ＶＳＶ－Ｇ媒介性の神経毒性の喪失及び（ｉｉ）抗体によるベクター中和の欠如（マウスにおいて示されているとおり）である。

【0065】

リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰは、ＧＰ１又はＧＰ２でありうる。本発明は、異なるＬＣＭＶ株からの糖タンパク質を含む。特に、ＬＣＭＶ－ＧＰは、ＬＣＭＶ野生型又はＬＣＭＶ株ＬＣＭＶ－ＷＥ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰＩ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰｌｏｐｔから由来しうる。好ましい実施形態では、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号１１において示すアミノ酸配列又は配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５%、９８%、９９%の配列同一性を有するアミノ酸配列を伴うタンパク質をコードし、配列番号１１において示すアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含む組換えラブドウイルスの機能的特性が維持されている。

【0066】

別の実施形態では、組換えラブドウイルス糖タンパク質Ｇは、Ｄａｎｄｅｎｏｎｇウイルス（ＤＡＮＤＶ）又はＭｏｐｅｉａ（ＭＯＰＶ）ウイルスの糖タンパク質ＧＰで置換される。より好ましい実施形態では、組換えラブドウイルスは、糖タンパク質ＧがＤａｎｄｅｎｏｎｇウイルス（ＤＡＮＤＶ）又はＭｏｐｅｉａ（ＭＯＰＶ）ウイルスの糖タンパク質ＧＰで置換されている水疱性口内炎ウイルスである。提供される利点は、（ｉ）ＶＳＶ－Ｇ媒介性の神経毒性の喪失及び（ｉｉ）抗体によるベクター中和の欠如（マウスにおいて示されるとおり）である。

【0067】

Ｄａｎｄｅｎｏｎｇウイルス（ＤＡＮＤＶ）は旧世界のアレナウイルスである。今日まで、糖タンパク質ＧＰを含み、及び本発明の組換えラブドウイルス中に含まれる糖タンパク質ＧＰのドナーとして本発明内で用いてもよい、当業者に公知の単一の株だけがある。本発明の組換えラブドウイルス中に含まれるＤＡＤＶ糖タンパク質ＧＰは、６つを上回るグリコシル化部位、特に７つのグリコシル化部位を有する。例示的な、好ましい糖タンパク質ＧＰは、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＥＵ１３６０３８の下で利用できる、ＤＡＮＤＶ中に含まれる糖タンパク質ＧＰである。一実施形態では、ＤＮＡＤＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号１２において示すアミノ酸配列あるいは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、又は９５%の配列同一性を有する配列をコードし、配列番号１２において示すアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含む組換えラブドウイルスの機能的特性が維持されている。

【0068】

Ｍｏｐｅｉａウイルス（ＭＯＰＶ）は旧世界のアレナウイルスである。糖タンパク質ＧＰを含み、及び本発明の組換えラブドウイルス中に含まれる糖タンパク質ＧＰのドナーとして本発明内で用いてもよい、当業者に公知のいくつかの株がある。本発明の組換えラブドウイルス中に含まれるＭＯＰＶ糖タンパク質ＧＰは、６つを上回るグリコシル化部位、特に７つのグリコシル化部位を有する。例示的な、好ましい糖タンパク質ＧＰは、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＹ７７２１７０の下で利用できる、Ｍｏｐｅｉａウイルス中に含まれる糖タンパク質ＧＰである。一実施形態では、ＭＯＰＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号１３において示すアミノ酸配列あるいは配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５%の配列同一性を有する配列をコードし、配列番号１３において示すアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含む組換えラブドウイルスの機能的特性が維持されている。

【0069】

ＣＣＬ２１及びＣＣＬ２１の機能的変異体。

【0070】

驚くべきことに、そのゲノム中にＣＣＬ２１タンパク質をコードする組換えラブドウイルスが、腫瘍微小環境において免疫原性細胞死及び自然免疫細胞の刺激と組み合わされた腫瘍細胞溶解を誘導することができることが見出された。さらに、延長された生存率が、ＣＣＬ２１を備えたそのような組換えラブドウイルスで処置された、樹立されたマウス腫瘍モデルにおいて観察された。

【0071】

ＣＣＬ２１は、ＣＣケモカインファミリーに属し、二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）、ｅｘｏｄｕｓ－２、ｃｋｂ９、ｓｃｙａ２１、ＴＣＡ４、又は６Ｃｋｉｎｅとしても公知である。ＣＣＬ２１は、細胞外マトリックスに結合するＣ末端領域を含む。ＣＣＬ２１はまた、ＣＣＲ７細胞表面受容体に結合し、それにより、その機能、例えばＴ細胞及び樹状細胞の誘引ならびに後者の活性化などを発揮する。ＣＣＲ７は、健常な患者及び癌患者の両方における広範囲の末梢Ｔ細胞及び樹状細胞で発現される。

【0072】

このように、一態様では、そのゲノム中に少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体をコードする組換えラブドウイルスは、腫瘍環境へのＴ細胞及び樹状細胞の動員を増強することができる。

【0073】

別の態様では、高度に強力なケモカインＣＣＬ２１の局所発現によって、腫瘍微小環境中への、優先的には、Ｔリンパ球及び樹状細胞の免疫細胞動員、ならびに組換えラブドウイルスの改善された有効性がさらに増強される。

【0074】

さらに別の態様では、そのゲノム中に少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体をコードする組換えラブドウイルスは、自然免疫刺激因子として作用する。

【0075】

一態様では、そのゲノム中に少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体をコードする組換えラブドウイルスによって、低温腫瘍が高温腫瘍になる。特に、結果として生じる炎症誘発性腫瘍微小環境によって、非Ｔ細胞浸潤（「コールド」）腫瘍がＴ細胞炎症（「ホット」）腫瘍になり、腫瘍排出リンパ節における適応性抗腫瘍免疫応答の生成を伴う。

【0076】

ヒトＣＣＬ２１タンパク質は、例えば、M. Nagira et al, The Journal of Biological Chemistry, 272, 19518-19524（August 1, 1997)により記載されており、２３アミノ酸の推定シグナルペプチドを伴う、合計１３４アミノ酸の高塩基性ポリペプチドである：

【0077】

【化1】

【0078】

ＣＣＬ２１タンパク質は特に、以下の配列を含む、又はそれからなるＣＣＬ２１を含む：

【0079】

【化2】

【0080】

好ましくは、ＣＣＬ２１タンパク質は、以下の配列を有するタンパク質を含む、又はそれからなる：

【0081】

【化3】

【0082】

あるいは配列番号４と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する。

【0083】

より好ましくは、ＣＣＬ２１タンパク質は、以下の配列を有するタンパク質を含む、又はそれからなる：

【0084】

【化4】

【0085】

あるいは配列番号３と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する。

【0086】

用語「シグナルペプチド」又は「シグナルペプチド配列」によって、通常１０から３０アミノ酸の長さで、ポリペプチドを細胞の細胞膜（原核生物の原形質膜及び真核生物の小胞体膜）を横切って又はその中に向ける、新たに合成された分泌ポリペプチド又は膜ポリペプチドのＮ末端に存在するペプチド配列を記載する。それは、通常、その後に除去される。特に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞の分泌経路中に向けることが可能でありうる。

【0087】

本発明については、他の（即ち、野生型以外の）シグナルペプチド配列を、ＣＣＬ２１タンパク質と一緒に使用してもよいことを理解すべきである。そのような他のシグナルペプチド配列は、本来の野生型シグナルペプチド配列を置換しうる。シグナルペプチドは、原形質膜へ又は細胞外への輸送のために、リボソーム中で新たに合成されたタンパク質を小胞体に、及び、さらにゴルジ複合体に向けるペプチドを含む。それらは一般的に、一連の疎水性アミノ酸を含み、免疫グロブリンリーダー配列ならびに当業者に公知の他のものを含む。シグナルペプチドは、特に、シグナルペプチダーゼ（小胞体の槽面に位置付けられる特定のプロテアーゼ）により作用されることが可能なペプチドを含む。シグナルペプチドは当業者により十分に理解されており、任意の公知のシグナルペプチドを含みうる。シグナルペプチドはタンパク質のＮ末端に組み入れられて、シグナルペプチダーゼによるＣＣＬ２１タンパク質のプロセシングによって、活性な生物学的形態が産生される。

【0088】

好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６において示す配列を有する。関連する好ましい実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質は、以下の配列を有するタンパク質を含む、又はそれからなる：

【0089】

【化5】

【0090】

あるいは配列番号５と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、９０%、９５%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する。

【0091】

関連する実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質は、配列番号２、３、又は４のアミノ酸を含む、又はそれからなる、あるいは配列番号２、３、又は４とそれぞれ少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する、及びシグナルペプチド配列をさらに含むタンパク質を含む。好ましい実施形態では、シグナルペプチド配列は、配列番号５のアミノ酸１～１９を含む、又はそれからなる。

【0092】

ＣＣＬ２１タンパク質はまた、配列番号２、３、又は４のアミノ酸を含む、又はそれらからなる、あるいは配列番号２、３、又は４とそれぞれ少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する、及び配列番号１のアミノ酸１～２３を含む、又はそれからなるシグナルペプチド配列をさらに含むタンパク質を含む。

【0093】

ＣＣＬ２１タンパク質は、プラスミン処理形態のＣＣＬ２１に対応するタンパク質をさらに含む。ＣＣＬ２１は、細胞外マトリックス成分、例えばヘパリン様グリコサミノグリカンなどの結合に寄与する正味の正電荷を伴う、伸長した固有のＣ末端（例、ヒトＣＣＬ２１約３０ａａ）を含む。Ｃ末端の切断／欠失によって、ヘパリンのようなグリコサミノグリカンへの結合が劇的に低下する。ＣＣＬ２１は、一部のヒトの癌において欠損しているプラスミンにより人体内で処理される。プラスミン切断の必要性は、ＣＣＬ２１のプラスミン処理形態に類似する、ＣＣＬ２１の生物活性の、即ち、生物学的に活性なＮ末端フラグメントを組換えラブドウイルス中にコード化することにより克服することができることが示された。ＣＣＬ２１のプラスミン処理形態は、Ｃ末端の切断／欠失により特徴付けられ、当業者に公知の方法により測定することができるヘパリン及び／又はヘパラン硫酸に結合する低下した能力をもたらす。この文脈において、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸に結合する低下した能力は、配列番号１又は２を有するＣＣＬ２１タンパク質との比較及び、同じアッセイにおいて同じ条件下でテストした場合に、配列番号１又は２において示す配列を伴う（それぞれシグナルペプチド配列を伴う又は伴わない）ＣＣＬ２１タンパク質の結合能力の９５%、９０%、８５%、８０%、７５%、７０%、６５%、６０%、５５%、５０%、４５%、４０%、３５%、３０%、２５%、２０%又はそれ以下まで低下した結合能力を指す。

【0094】

プラスミンは、フィブリン血餅を溶解するように作用するセリンプロテアーゼである。線維素溶解とは別に、プラスミンは種々の他の系においてタンパク質をタンパク質分解する。それによって、補体系の一部のメディエーターであるコラゲナーゼが活性化され、グラーフ卵胞の壁が弱まり、排卵に導く。それによってフィブリン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、及びフォンウィルブランド因子が切断される。プラスミンはセリンプロテアーゼのファミリーに属する。プラスミンは、プラスミノーゲンと呼ばれるプロ酵素として肝臓から全身循環中に放出される。活性プラスミンへのプラスミノーゲンの変換は、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、カリクレイン、及び第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）によるＡｒｇ－５６１とＶａｌ－５６２の間のペプチド結合の切断を含む。

【0095】

プラスミンによるＣＣＬ２１タンパク質の切断は、細胞表面に結合したＣＣＬ２１上で、又はインビボのいずれかで（いずれの場合でも、ＣＣＬ２１タンパク質をプラスミンとインキュベートすることにより）起こりうる。プラスミン処理されたＣＣＬ２１タンパク質は、従って、配列番号２のアミノ酸１～８８に対応する配列を含む、又はそれからなる、あるいは配列番号２のアミノ酸１～８８と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有するＣＣＬ２１を含む。さらに、ＣＣＬ２１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１～９１に対応する配列を含む、又はそれからなる、あるいは配列番号２のアミノ酸１～９１と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有するＣＣＬ２１を含む。ＣＣＬ２１タンパク質はまた、配列番号２のアミノ酸１～１０４に対応する配列を含む、又はそれからなる、あるいは配列番号２のアミノ酸１～１０４と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有するＣＣＬ２１を含む。

【0096】

Ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質は、ＣＣＬ２１タンパク質の伸長したｃ末端におけるアミノ酸の欠失及び／又は変異により特徴付けられる。伸長したｃ末端においてアミノ酸を欠失及び／又は変異させることにより、ヘパリンのようなグリコサミノグリカンへの結合は、それにより低下する。好ましい実施形態では、ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質は、配列番号２を含む、又はそれからなる、あるいは配列番号２のアミノ酸１～７９と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する（（タンパク質が位置８０～１１１に示す少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２のアミノ酸残基を欠く、あるいはそれにおいて前記残基の１つ又は複数が変異しているという条件で）。さらに好ましい実施形態では、ｃ末端が切断されたＣＣＬ２１は、配列番号２を含む、又はそれらからなる、あるいは配列番号２のアミノ酸１～７９と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有するＣＣＬ２１であり、それにおいて配列番号２の８０～１１１の全てのアミノ酸が欠失されている（即ち、３２の欠失）。

【0097】

各々の場合で、プラスミン処理されたＣＣＬ２１又はｃ末端が切断されたＣＣＬ２１のいずれかが、シグナルペプチド配列をさらに含みうる。特に好ましいのは、配列番号１のアミノ酸１～２３又は配列番号５のアミノ酸１～１９を含む、又はそれらからなるシグナルペプチド配列である。また、本来のシグナルペプチド配列を置換する他のシグナルペプチド配列を使用してもよい。このように、好ましい実施形態では、プラスミン処理された又はｃ末端が切断されたＣＣＬ２１タンパク質は、以下の配列を有するタンパク質を含む、又はそれからなる：

【0098】

【化6】

【0099】

あるいは配列番号５と少なくとも７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の同一性を有する。

【0100】

ＣＣＬ２１タンパク質はまた、切断されたシグナルペプチド配列を伴うＣＣＬ２１を含みうる。この文脈において、「切断された」は、本来のシグナルペプチド配列よりも短いが、しかし、依然としてシグナルペプチドとして作用するその機能性の少なくとも一部を保持するシグナルペプチド配列を指す。例えば、ヒトシグナルペプチド配列は、配列番号１のアミノ酸１～２３を含む、又はそれからなる。切断されたシグナルペプチド配列を伴うＣＣＬ２１は、配列番号１のアミノ酸１～２３の２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１を有しうる。さらなる例では、シグナルペプチドは、配列番号６において示す配列を含む、又はそれからなりうる。切断されたシグナルペプチド配列を伴うＣＣＬ２１は、配列番号６のアミノ酸１～１８の１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１を有しうる。

【0101】

切断されたシグナルペプチド配列を伴うＣＣＬ２１タンパク質はまた、配列番号２～４の配列のいずれか、及び、また、本来のシグナルペプチド配列よりも短いシグナルペプチド配列を含むタンパク質でありうる。再び、例として、シグナルペプチド配列は、配列番号１のアミノ酸１～２３の２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１を有しうる、あるいは、さらなる例では、シグナルペプチドは、配列番号６において示す配列を含む、又はそれからなりうる。切断されたシグナルペプチド配列を伴うＣＣＬ２１は、配列番号６のアミノ酸１～１８の１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１を有しうる。

【0102】

ＣＣＬ２１タンパク質は、マウス及びラットを含む任意の起源のものでありうる。好ましくは、ＣＣＬ２１タンパク質はヒト起源からである。

【0103】

ＣＣＬ２１タンパク質の機能的変異体は、先に記載するＣＣＬ２１タンパク質の生物学的に活性な変異体及び生物学的に活性なフラグメントを含む。変異体は、具体的に記載されたＣＣＬ２１タンパク質の位置において１つ又は複数の異なるアミノ酸を有しうる。変異体は、そのようなＣＣＬ２１タンパク質と少なくとも約５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、もしくは９９%又はそれ以上のアミノ酸同一性を共有することができる。フラグメントは、所与の具体的に記載されたＣＣＬ２１タンパク質と同じアミノ酸を有するが、しかし、ＣＣＬ２１タンパク質の特定の一部又は領域を欠きうる。

【0104】

本明細書中で使用するように、用語「同一」又は「パーセント同一性」は、２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、同じである、あるいは、最大の対応のために比較及び整列された場合に同じである特定のパーセンテージのヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性を決定するために、配列を、最適な比較目的のために整列させる（例、ギャップを、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列中に導入することができる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを次に比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、次に、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一の位置の数の関数である（即ち、%同一性＝同一の位置の数／位置の総数（例、重複する位置）×１００）。一部の実施形態では、比較される２つの配列は、適宜（例、比較される配列を超えて伸長する追加配列を除く）、ギャップが配列内に導入された後に同じ長さである。

【0105】

２つの配列間のパーセント同一性又はパーセント類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるように改変されている。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて実施し、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ を、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402において記載されるように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用し、分子間の離れた関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS（1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用することができる。配列分析用の追加のアルゴリズムが当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5において記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；ならびにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8において記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐは検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較されている２つの配列中の類似の領域が、整列された残基の対を調べることにより見出される；ｋｔｕｐ＝１の場合、単一の整列されたアミノ酸が検証される。ｋｔｕｐを、タンパク質配列については２又は１に、あるいはＤＮＡ配列については１から６に設定することができる。ｋｔｕｐが特定されていない場合のデフォルトは、タンパク質については２、及びＤＮＡについては６である。あるいは、タンパク質配列アラインメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402により記載されているように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行ってもよい。

【0106】

両方の場合において、機能的変異体は、生物学的に活性であるＣＣＬ２１の変異体及びフラグメントだけを含む。本発明については、組換えラブドウイルスのゲノム中にコードされているＣＣＬ２１変異体又はＣＣＬ２１フラグメントの生物学的活性を、それぞれの細胞又は腫瘍細胞中でのその発現後に決定する。これは、生物学的活性が、ＣＣＬ２１変異体又はＣＣＬ２１フラグメントをコードする組換えラブドウイルスの状況において（例、Transwellアッセイ又はインビトロ腫瘍モデルにおいて）決定されることを意味する。好ましくは、生物学的活性を、ＣＣＬ２１変異体又はＣＣＬ２１フラグメントをコードするベジクロウイルスを用いて決定する。より好ましくは、生物学的活性を、ＣＣＬ２１変異体又はＣＣＬ２１フラグメントをコードするＶＳＶ－ＧＰを用いて決定する。

【0107】

生物学的活性は、以下の能力の１つ又は複数を含みうる：化学誘引物質活性、抗腫瘍活性、サイトカイン発現の調節、例えばＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、抗原提示細胞、及び腫瘍細胞を含む同系哺乳類細胞の集団におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）ポリペプチドの発現における増加又は形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）ポリペプチドの発現における減少など。生物学的活性についてのテストは、限定しないが、例えば、実施例において示すようなプロトコルに従って行ってもよい。本発明の目的のために、ＣＣＬ２１タンパク質の機能的変異体又はフラグメントは、それが、同じアッセイにおいて及び同じ条件下でテストされた場合、配列番号１又は２において示す配列（それぞれシグナルペプチド配列を伴う、又は伴わない）を伴うＣＣＬ２１タンパク質の活性の少なくとも３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、９５%、又は９８%を示す場合、生物学的に活性である。

【0108】

理論により拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＶＳＶ－ＧＰを用いた腫瘍細胞の処置後、いくつかのケモカイン及びサイトカインが応答して上方制御されることを見出した。ＣＣＬ２１は、ＶＳＶ－ＧＰ処置後に腫瘍細胞において上方制御されないケモカインの１つである。今回のデータは、そのゲノム中にＣＣＬ２１タンパク質をコードするＶＳＶ－ＧＰが癌の処置において特に効果的であり、腫瘍溶解性ウイルスにより感染された腫瘍中への免疫細胞浸潤をさらに改善し、それにより抗腫瘍免疫をさらに増強することに向けて適合されることを示す。

【0109】

さらに驚くべきことに、配列番号３又は４、特に配列番号５の配列を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、又は含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ＣＣＬ２１タンパク質をコードする組換えラブドウイルスは、全長ＣＣＬ２１タンパク質と比較し、腫瘍処置においてさらにより強力で、より効果的であったが、タンパク質分解処理についての必要性を伴うことなく活性である。

【0110】

そのようなＣＣＬ２１タンパク質は、それらのより小さなサイズのために、全長ＣＣＬ２１タンパク質よりもさらに好ましい。より大きな又は複数の導入遺伝子が、ラブドウイルスならびに導入遺伝子自体の生存、安定性、腫瘍溶解能力、製造可能性、又は発現に負の影響を与えうる。より小さな導入遺伝子を利用することによって、また、さらなる導入遺伝子を収容するそれらの能力において限界を有しうるラブドウイルスに追加の導入遺伝子を加える可能性が提供される。

【0111】

ラブドウイルスは、それらの遺伝物質（ゲノム）としてマイナス鎖一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を有する。マイナス鎖ｓｓＲＮＡウイルスは、プラス鎖ＲＮＡを形成するためにＲＮＡポリメラーゼを必要とする。プラス鎖ＲＮＡは、ウイルスのｍＲＮＡとして作用し、それは、新たなウイルス材料の産生のためにタンパク質中に翻訳される。新たに形成されたウイルスを用いて、より多くのマイナス鎖ＲＮＡ分子が産生される。

【0112】

典型的なラブドウイルスゲノムは、３′－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５′の順番において少なくとも５つの構造タンパク質をコードする。ゲノムは、構造タンパク質間にさらに短い遺伝子間領域又は追加の遺伝子を含みうるが、従って、長さ及び組織化において変動しうる。

【0113】

本発明に従い、ＣＣＬ２１遺伝子をラブドウイルスゲノムの任意の位置中に導入することができる。挿入部位に依存して、ＣＣＬ２１遺伝子の転写効率に影響が与えられうる。一般的に、ＣＣＬ２１遺伝子の転写効率は３′挿入から５′プライム挿入まで減少する。ＣＣＬ２１遺伝子を以下のゲノム位置中に挿入してもよい：３′－ＣＣＬ２１－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５′、３′－Ｎ－ＣＣＬ２１－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５′、３′－Ｎ－Ｐ－ＣＣＬ２１－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５′、３′－Ｎ－Ｐ－Ｍ－ＣＣＬ２１－Ｇ－Ｌ－５′、３′－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－ＣＣＬ２１－Ｌ－５′、又は３′－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－ＣＣＬ２１－５′。好ましい実施形態では、ＣＣＬ２１遺伝子をＧタンパク質とＬタンパク質の間に挿入する。

【0114】

腫瘍細胞の感染後、組換えラブドウイルスのゲノム中にコードされたＣＣＬ２１遺伝子は、プラス鎖ＲＮＡ中に転写されて、次に、腫瘍細胞によりＣＣＬ２１タンパク質中に翻訳される。用語「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」又は「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」は、核酸中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指し、定義されたヌクレオチド配列（例、ＲＮＡ分子）又はアミノ酸及びそれから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとしての役割を果たす。したがって、所望のタンパク質が、ｍＲＮＡの転写及びその後の翻訳により細胞又は別の生物学的系において産生される場合、遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一である）及び非コード鎖の両方が、遺伝子の転写のための鋳型としての役割を果たしうるが、その遺伝子のタンパク質又は他の産物をコードしているとして言及することができる。タンパク質をコードする核酸及びヌクレオチド配列はイントロンを含みうる。

【0115】

ＣＣＬ２１遺伝子の転写は、好ましくは、それ自体のプロモーターの制御下にはなく、ウイルス複製に厳密に連結されるだけであり、それにより、ウイルス複製及び伝播（腫瘍）の位置へのＣＣＬ２１の標的発現を確実にする。このように、ＣＣＬ２１遺伝子の転写は、追加エレメント、例えばプロモーター又は誘導性遺伝子発現エレメントなどにより制御されない。

【0116】

核酸配列を、コードされるポリペプチドの一次配列を変化させることを伴う、又は伴わずに変動させてもよいことが理解されるであろう。タンパク質をコードする核酸は、異なるヌクレオチド配列を有するが、しかし、遺伝暗号の縮重に起因する、タンパク質の同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸を含む。ＣＣＬ２１タンパク質、特に本明細書中に開示する任意の特定のＣＣＬ２１タンパク質の発現をもたらす核酸配列を選ぶことは、当業者の知識内である。ＣＣＬ２１タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の多様な方法により調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離、又は以前に調製されたＣＣＬ２１タンパク質のオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製を含むが、これらに限定しない。

【0117】

医薬的組成物

【0118】

実際の医薬的に効果的な量又は治療的な投与量は、もちろん、当業者により公知の要因、例えば患者の年齢及び体重、投与経路、ならびに疾患の重症度などに依存するであろう。任意の場合において、組換えラブドウイルスは、医薬的に効果的な量を患者の固有の状態に基づいて送達することを可能にする投与量及び様式で投与される。

【0119】

一般的に、本明細書中で言及する疾患、障害、及び状態の処置及び／又は軽減のために、ならびに処置される特定の疾患、障害、又は状態に依存して、使用される本発明の特定の組換えラブドウイルスの効力、特定の投与経路及び使用される特定の医薬的製剤又は組成物、本発明の組換えラブドウイルスは、一般的に、例えば、週２回、毎週、又は毎月の用量で投与されるが、しかし、特に、前に言及したパラメーターに依存して有意に変動しうる。このように、一部の場合では、上に与える最小用量よりも少ない用量を使用することが十分でありうるのに対し、他の場合では、上限を超えなければならないであろう。大量に投与する場合、それらを、１日にわたり分散される、多数のより小さな用量中に分割することが得策でありうる。

【0120】

治療において使用されるために、本発明の組換えラブドウイルスは、動物又はヒトへの投与を促進するために適切な医薬的組成物中に製剤化される。典型的な製剤は、水溶液又は水性もしくは非水性懸濁液の形態において、組換えウイルスを、生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより調製することができる。担体、賦形剤、修飾剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で無毒である。それらは、緩衝系、例えばリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ならびに他の無機酸又は有機酸及びそれらの塩など；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤、例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウムなど；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなど；単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖、及び他の糖（グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリン、又はデキストランを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はイオン性又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）（ポリソルベート）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又は脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル又は糖エステルなどを含む。賦形剤はまた、放出修飾機能又は吸収修飾機能を有しうる。

【0121】

一実施形態では、本発明の組換えラブドウイルスを、トリス、アルギニン、及び、場合により、クエン酸塩を含む医薬的組成物中に製剤化する。トリスは、好ましくは、約１mMから約１００mMの濃度で使用される。アルギニンは、好ましくは、約１mMから約１００mMの濃度で使用される。クエン酸塩は１００mMまでの濃度で存在しうる。好ましい製剤は、約５０mMのトリス及び５０mMのアルギニンを含む。

【0122】

医薬的組成物は、液体、凍結液として、又は凍結乾燥形態で提供されうる。凍結液は、約０℃と約－８５℃の間の温度（－７０℃と－８５℃の間、及び約－１５℃、－１６℃、－１７℃、－１８℃、－１９℃、－２０℃、－２１℃、－２２℃、－２３℃、－２４℃、又は約－２５℃の温度を含む）で保存してもよい。

【0123】

本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物は、必要ではないが、しかし、場合により、問題の障害を防止又は処置するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と製剤化される。そのような他の薬剤の効果的な量は、製剤中に存在する組換え抗体の量、障害又は処置の種類、及び上に記載する他の要因に依存する。これらは一般的に、本明細書中に記載する同じ投与量において及び投与経路を用いて、又は本明細書中に記載する投与量の約１から９９%で、又は任意の投与量において及び経験的／臨床的に適切であると決定される任意の経路により使用される。

【0124】

疾患の防止又は処置のために、本発明の組換えラボドウイルス又は医薬的組成物の適切な投与量（単独で、あるいは１つ又は複数の他の追加の治療的薬剤との組み合わせにおいて使用される場合）は、処置される疾患の種類、組換えラブドウイルスの種類、疾患の重症度及び経過、組換えラブドウイルスが防止的又は治療的な目的のために投与されるか否か、以前の治療、患者の病歴及び組換えラブドウイルスへの応答、及び主治医の判断に依存する。本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物は、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。

【0125】

疾患の種類及び重症度に依存して、組換えラブドウイルスのＴＣＩＤ_５０により測定される約１０^８から１０^１３の感染性粒子は、例えば、１つ又は複数の別々の投与による、又は継続的な注入によるかを問わず、患者への投与のための最初の候補投与量でありうる。数日又はそれ以上にわたる反復投与については、状態に依存するが、処置は一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。組換えラブドウイルスの１つの例示的な投与量は、ＴＣＩＤ_５０により測定される約１０^８から１０^１３の感染性粒子の範囲中にありうる。このように、ＴＣＩＤ_５０により測定される約１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、又は１０^１３の感染性粒子の１つ又は複数の用量（又はそれらの任意の組み合わせ）を患者に投与してもよい。そのような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間毎（例、患者が約２から約２０、又は、例えば、約６用量の組換えラブドウイルスを受けるようにする）に投与されうる。最初のより高い負荷用量、それに続く１つ又は複数のより低い用量、あるいはその逆を投与してもよい。しかし、他の投与計画が有用でありうる。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより簡単にモニターされる。

【0126】

本発明の組換えラブドウイルス、及びそれを含む組成物の有効性は、含まれる特定の疾患に依存して、任意の適したインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、及び／又はそれ自体が公知の動物モデル、あるいはそれらの任意の組み合わせを使用してテストすることができる。適したアッセイ及び動物モデルは当業者には明らかであり、例えば、以下の実施例において使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。

【0127】

実際の医薬的に効果的な量又は治療的な投与量は、言うまでもなく、当業者により公知の要因、例えば患者の年齢及び体重、投与経路、ならびに疾患の重症度などに依存しうる。いずれの場合でも、本発明の組換えラブドウイルスは、医薬的に効果的な量を、患者の固有の状態に基づいて送達することを可能にする投薬量で、及び様式において投与されるであろう。

【0128】

あるいは、本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物は、処置される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路、及び方法の望ましい効果に依存して、約５０μlから約１００ml（範囲内の全ての数を含む）の容量中で送達されうる。

【0129】

腫瘍内投与のために、容量は、好ましくは約５０μlから約５mlの間（約１００μl、２００μl、３００μl、４００μl、５００μl、６００μl、７００μl、８００μl、９００μl、１０００μl、１１００μl、１２００μl、１３００μl、１４００μl、１５００μl、１６００μl、１７００μl、１８００μl、１９００μl、２０００μl、２５００μl、３０００μl、３５００μl、４０００μl、又は約４５００μlの容量を含む）である。好ましい実施形態では、容量は約１０００μlである。

【0130】

全身投与（例、組換えラブドウイルスの注入による）のために、容量は自然に高くなりうる。あるいは、組換えラブドウイルスの濃縮溶液は、注入の直前に、より大きな容量の注入溶液中で希釈することができる。

【0131】

特に静脈内投与のために、容量は、好ましくは１mlから１００mlの間（約２ml、３ml、４ml、５ml、６ml、７ml、８ml、９ml、１０ml、１１ml、１２ml、１３ml、１４ml、１５ml、１６ml、１７ml、１８ml、１９ml、２０ml、２５ml、３０ml、３５ml、４０ml、４５ml、５０ml、５５ml、６０ml、７０ml、７５ml、８０ml、８５ml、９０ml、９５ml、又は約１００mlの容量を含む）である。好ましい実施形態では、容量は約５mlから１５mlの間であり、より好ましくは、容量は約６ml、７ml、８ml、９ml、１０ml、１１ml、１２ml、１３ml、又は約１４mlである。

【0132】

好ましくは、同じ製剤を腫瘍内投与及び静脈内投与のために使用する。腫瘍内投与と静脈内投与の間の用量及び／又は容量の比率は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、又は約１：２０でありうる。例えば、１：１の用量及び／又は容量の比率は、同じ用量及び／又は容量が腫瘍内ならびに静脈内に投与されることを意味するのに対し、例えば、約１：２０の用量及び／又は容量の比率は、腫瘍内投与用量及び／又は容量よりも２０倍高い静脈内投与用量及び／又は容量を意味する。好ましくは、腫瘍内投与と静脈内投与の間の用量及び／又は容量の比率は、約１：９である。

【0133】

組換えラブドウイルスの効果的な濃度は、望ましくは、１ミリリットル当たり約１０^８と１０^１４の間のベクターゲノム（vg/mL）の範囲である。感染単位は、McLaughlin et al., J Virol.;62(6):1963-73（1988)において記載されているように測定してもよい。好ましくは、濃度は、約１．５×１０^９から約１．５×１０^１３であり、より好ましくは、約１．５×１０^９から約１．５×１０^１１である。一実施形態では、効果的な濃度は、約１．５×１０^９である。別の実施形態では、効果的な濃度は約１．５×１０^１０である。別の実施形態では、効果的な濃度は約１．５×１０^１１である。さらに別の実施形態では、効果的な濃度は約１．５×１０^１２である。別の実施形態では、効果的な濃度は約１．５×１０^１３である。別の実施形態では、効果的な濃度は約１．５×１０^１４である。望ましくない効果のリスクを低下させるために、最も低い効果的な濃度を使用することが望ましいことがある。これらの範囲中のさらに他の投与量は、処置されている被験者、好ましくはヒトの身体的状態、被験者の年齢、特定の種類の癌、及び癌（進行性の場合）が発生した程度を考慮に入れて、主治医により選択されうる。

【0134】

組換えラブドウイルスの効果的な標的濃度は、ＴＣＩＤ_５０で表現してもよい。ＴＣＩＤ_５０は、例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋaｒｂｅｒの方法を使用することにより決定することができる。望ましくは、範囲は、１×１０^８/mlと１×１０^１４/mlの間のＴＣＩＤ_５０の効果的な標的濃度を含む。好ましくは、効果的な標的濃度は約１×１０９から約１×１０^１２/mlであり、より好ましくは、約１×１０^９から約１×１０^１１/mlである。一実施形態では、効果的な標的濃度は約１×１０^１０/mlである。好ましい実施形態では、標的濃度は５×１０^１０/mlである。別の実施形態では、効果的な標的濃度は約１．５×１０^１１/mlである。一実施形態では、効果的な標的濃度は約１×１０^１２/mlである。別の実施形態では、効果的な標的濃度は約１．５×１０^１３/mlである。

【0135】

組換えラブドウイルスの効果的な標的用量はまた、ＴＣＩＤ_５０で表現してもよい。望ましくは、範囲は、１×１０^８と１×１０^１４の間のＴＣＩＤ_５０の標的用量を含む。好ましくは、標的用量は、約１×１０^９から約１×１０^１３であり、より好ましくは、約１×１０^９から約１×１０^１２である。一実施形態では、効果的な濃度は約１×１０^１０である。好ましい実施形態では、効果的な濃度は約１×１０^１１である。一実施形態では、効果的な濃度は約１×１０^１２である。別の実施形態では、効果的な濃度は約１×１０^１３である。

【0136】

別の態様では、本明細書中に記載する障害の処置、防止、及び／又は診断のために有用な材料を含むキット又はキット部品を提供する。キット又はキット部品は、容器及び、容器上の又はそれに関連付けられるラベル又は添付文書を含む。適した容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器は、多様な材料、例えばガラス又はプラスチックなどから形成されうる。容器は、それ自体による、あるいは障害を処置、防止、及び／又は診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選ばれた状態を処置するために使用されることを示す。

【0137】

さらに、キット又はキット部品は、（ａ）その中に含まれる組成物を伴う第１の容器（それにおいて、組成物は、本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物を含む）；及び（ｂ）その中に含まれる組成物を伴う第２の容器（それにおいて、組成物は、さらなる細胞傷害性薬剤又は他の治療的薬剤、例えばＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物などを含む）を含みうる。本発明のこの実施形態におけるキット又はキット部品は、組成物が、特定の状態、特に癌を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含みうる。あるいは、又は加えて、キット又はキット部品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液などを含む第２（又は第３）の容器をさらに含みうる。それは、商業的な及びユーザーの観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及び注射器を含む）をさらに含みうる。

【0138】

さらなる態様では、本発明の組換えラブドウイルスは、組換えラブドウイルスの投与のために有用なデバイス、例えば注射器、インジェクターペン、マイクロポンプ、又は他のデバイスなどとの組み合わせにおいて使用する。好ましくは、本発明の組換えラブドウイルスは、キット部品（例えば、組換えラブドウイルスの使用のための説明書を伴う添付文書も含む）中に含まれる。

【0139】

医学的使用

【0140】

本発明のさらなる態様は、そのゲノム中に、医薬における使用のための少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体をコードする組換えラブドウイルスを提供する。

【0141】

本発明の組換えラブドウイルスは、腫瘍微小環境において免疫原性細胞死及び自然免疫細胞の刺激と組み合わされた腫瘍細胞溶解を効率的に誘導する。したがって、本発明の組換えラブドウイルスは、癌の処置及び／又は防止のために有用である。

【0142】

さらなる態様では、本発明の組換えラブドウイルスは、癌を患う個体に治療的に効果的な量の組換えラブドウイルスを投与することを含み、それにより、癌の１つ又は複数の症状を寛解することを含む、癌を処置及び／又は防止するための方法において使用することができる。

【0143】

さらに別の態様では、本発明は、癌の処置及び／又は防止のための薬物の製造のための、本発明に従った組換えラブドウイルスの使用をさらに提供する。

【0144】

さらに別の態様では、本発明の組換えラブドウイルスは、治療的に効果的な量の組換えラブドウイルスを胃腸癌、肺癌、又は頭頸部癌を患う個人に投与し、それにより、胃腸癌、肺癌、又は頭頸部癌の１つ又は複数の症状を寛解させることを含む、胃腸癌、肺癌、又は頭頸部癌を処置及び／又は防止するための方法において使用することができる。

【0145】

疾患の予防又は治療のために、組換えラブドウイルスの適切な投与量は、上に定義するように、多様な要因、例えば処置される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、組換えラブドウイルスが予防的又は治療的な目的のために投与されるのか否か、以前の治療、患者の病歴及び組換えラブドウイルスへの応答、及び主治医の判断などに依存しうる。組換えラブドウイルスは、一度で又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。

【0146】

一態様では、癌は固形癌である。固形癌は、脳癌、結腸直腸癌、口腔咽頭扁平上皮癌、胃癌、胃食道接合部腺癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓腺癌、胆管癌、膀胱尿路上皮癌、転移性黒色腫、前立腺癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠芽細胞腫、非小細胞肺癌、脳腫瘍、又は小細胞肺癌でありうる。好ましいのは、胃腸癌、肺癌、及び頭頸部癌の処置である。

【0147】

組換えラブドウイルスは、任意の適した手段（経口、非経口、皮下、腫瘍内、静脈内、皮内、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む）により投与される。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与を含む。また、組換えラブドウイルスは、パルス注入により適切に投与される。一態様では、投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性であるかに部分的に依存し、注射、最も好ましくは静脈内注射又は皮下注射により与えられる。

【0148】

本発明の特定の組換えラブドウイルスならびにその特定の薬物動態学的特性及び他の特性に依存し、それは、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、又は６日毎、毎週、毎月などに投与されうる。投与計画は、長期の毎週の処置を含みうる。「長期」により、少なくとも２週間、好ましくは数ヶ月、又は数年の期間を意味する。

【0149】

処置スケジュールは、種々の計画を含みうるが、典型的には、１、２、３、又は４週間の期間にわたり患者に投与される複数の用量、場合により、その後に１つ又は複数のさらなる処置回数が要求される。一態様では、本発明の組換えラブドウイルスは、所与の期間内に最大１、２、３、４、５、又は６用量で患者に投与される。好ましくは、処置の最初の回は３週間以内に終わる。３週間の処置の経過の間に、組換えラブドウイルスを、以下のスキームに記載されているように患者に投与してもよい：（ｉ）０日目（ｉｉ）０日目及び３日目；（ｉｉｉ）０日目、３日目、及び６日目；（ｉｖ）０日目、３日目、６日目、及び９日目；（ｖ）０日目及び５日目；（ｖｉ）０日目、５日目、及び１０日目；（ｖｉｉ）０日目、５日目、１０日目、及び１５日目に１回。これらの計画を反復し、２回目又は３回目の処置が、１回目の処置の転帰に依存して必要になりうる。１回目の処置に基づいて計算すると、２回目の処置は、好ましくは、２１日目、４２日目、及び６３日目にさらなる処置を含む。好ましい実施形態では、本発明の組換えラブドウイルスは、以下のスキームに従って患者に投与する：０日目、３日目、２１日目、４２日目、６３日目。

【0150】

用語「抑制」は、本明細書中では、「寛解」及び「軽減」と同じ文脈において使用し、疾患の１つ又は複数の特性の緩和又は減少を意味する。本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化され、投薬され、及び投与される。この文脈における考慮すべき要因は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を含む。投与される組換えラブドウイルスの「治療的に効果的な量」は、そのような考慮事項により左右され、癌の臨床症状を防止、寛解、又は処置するために必要な最小量、特にこれらの障害に効果的である最小量である。

【0151】

別の態様では、本発明の組換えラブドウイルスは、複数回で及びいくつかの用量において投与してもよい。一態様では、組換えラブドウイルスの最初の用量は腫瘍内に投与し、組換えラブドウイルスのその後の用量は静脈内に投与する。さらなる態様では、組換えラブドウイルスの最初の用量及び少なくとも１つ又は複数のその後の用量は、腫瘍内に投与し、組換えラブドウイルスのその後の用量は、静脈内に投与する。その後の投与は、最初の腫瘍内投与後の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、又は３１日に投与してもよい。

【0152】

別の態様では、組換えラブドウイルスの最初の用量は、静脈内に投与し、組換えラブドウイルスのその後の用量は、腫瘍内に投与する。その後の投与は、最初の静脈内投与後の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、又は３１日に投与してもよい。

【0153】

別の態様では、組換えラブドウイルスは静脈内投与し、組換えラブドウイルスのその後の用量は腫瘍内投与する。

【0154】

別の態様では、組換えラブドウイルスは、各々の時間点で静脈内及び腫瘍内に投与する。

【0155】

上記のように、本発明の組換えラブドウイルスは、癌細胞に対する免疫応答を刺激するための多くの有用性を有する。強力な免疫活性化能は、腫瘍の微小環境に制限されることが観察された。このように、好ましい態様では、本発明の組換えラブドウイルスは、患者に全身的に投与してもよい。全身適用性は重要な属性である。なぜなら、多くの癌が高度に転移しており、到達が困難な腫瘍病変ならびに到達不可能な腫瘍病変の処置が可能になるためである。この固有の免疫刺激特性のために、本発明に従った組換えラブドウイルスは、転移性腫瘍の処置のために特に有用である。

【0156】

一部の患者は、チェックポイント阻害剤治療に耐性を発生し、そのような患者は、ＩＦＮ経路において変異を蓄積するように思われることが観察された。従って、一態様では、本発明の組換えラブドウイルス、特に本発明の組換え水疱性口内炎ウイルスは、チェックポイント阻害剤治療に耐性を発生した患者の処置のために有用である。組換えラブドウイルス、及び特に本発明の組換え水疱性口内炎ウイルスの固有の免疫促進特性のために、そのような処置された患者は、チェックポイント阻害剤治療の継続について適格となりうる。

【0157】

好ましい実施形態では、本発明の組換えラブドウイルス、特に本発明の組換え水疱性口内炎ウイルスは、ＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤（例、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１へのアンタゴニス抗体）のいずれかを用いたチェックポイント阻害剤治療を完了した非小細胞肺癌を伴う患者の処置のために有用である。

【0158】

上の医薬的製剤又は治療的方法のいずれかを、本発明の組換えラブドウイルス又は医薬的組成物のいずれか１つを使用して行ってもよいことが理解される。

【0159】

組み合わせ

【0160】

本発明はまた、現在使用されている及び／又は先行技術において公知である処理／方法と比較し、特定の利点を提供する組み合わせ処理／方法を提供する。これらの利点は、インビボでの有効性（例、改善された臨床応答、応答の延長、応答速度の増加、反応の持続時間、疾患の安定化率、安定化の持続時間、疾患進行までの時間、無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び／又は全生存期間（ＯＳ）、その後の耐性の発生など）、安全かつ十分な耐容性を示す投与、ならびに有害事象の頻度及び重症度の低下を含みうる。

【0161】

本発明の組換えラブドウイルスは、他の薬理学的に活性な成分、例えば、最先端の又は標準治療の化合物（例えば、例、細胞分裂停止物質又は細胞毒性物質、細胞増殖阻害剤、抗血管新生物質、ステロイド、免疫調節剤／チェックポイント阻害剤など）との組み合わせにおいて使用してもよい。

【0162】

本発明の組換えラブドウイルスとの組み合わせにおいて投与してもよい細胞分裂停止及び／又は細胞傷害性活性物質は、ホルモン、ホルモン類似体及び抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害剤、ＬＨＲＨアゴニスト及びアンタゴニスト、成長因子（成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ヒト表皮成長因子（ＨＥＲ 、例、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）など）の阻害剤を含むが、これらに制限せず、阻害剤は、例えば、（抗）成長因子抗体、（抗）成長因子受容体抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、セツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブ、及びトラスツズマブなど；代謝拮抗剤（例、葉酸拮抗剤、例えばメトトレキサート、ラルチトレキサート、ピリミジン類似体、例えば５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、ＴＡＳ－１０２、カペシタビン及びゲムシタビン、プリン及びアデノシン類似体、例えばメルカプトプリン、チオグアンなど、クラドリビン及びペントスタチン、シタラビン（ａｒａ Ｃ）；抗腫瘍抗生物質（例、アントラサイクリン）；白金誘導体（例、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、ニトロソウレア、例えばカルムスチン及びロムスチンなど、チオテパ）；有糸分裂阻害剤（例、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンクリスチンなど；及びタキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセルなど）；血管新生阻害剤（ベバシズマブ、ラムシルマブ、及びアフリベルセプトを含む）、チューブリン阻害剤；ＤＮＡ合成阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びエトポフォスなど、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン）、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤（例、ＰＤＫ１阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ａ－Ｒａｆ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、Ｃ－Ｒａｆ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋα阻害剤、デュアルｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＫ３３阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＬＫ１阻害剤（例えばボラセルチブなど）、ＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫ９阻害剤を含む）、オーロラキナーゼ阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（例、ＰＴＫ２／ＦＡＫ阻害剤）、タンパク質タンパク質相互作用阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、ＩＧＦ－１Ｒ阻害剤、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、Ｂｃｌ－２／Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、ＥｒｂＢ受容体阻害剤、ＢＣＲ－ＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ラパマイシン類似体（例、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、シロリムス）、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲン受容体阻害剤、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＡＮＧ１／２阻害剤、ＣＹＰ１７阻害剤、放射性医薬品、免疫療法剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤（例、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３結合分子／免疫グロブリン、例えばイピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブなど）及び種々の化学療法剤、例えばアミフォスチン、アナグレリド、クロドロナート、フィルグラスチン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミゾール、メスナ、ミトタン、パミドロネート、及びポルフィマー；プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブなど）；Ｓｍａｃ及びＢＨ３模倣物；ｐ５３機能性を回復する薬剤（ｍｄｍ２－ｐ５３アンタゴニストを含む）；Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路の阻害剤；及び／又はサイクリン依存性キナーゼ９阻害剤である。

【0163】

本発明の組換えラブドウイルスは、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストのいずれかとの組み合わせ処置において使用することができる。そのような組み合わせ処置は、物質の非固定（例、遊離）の組み合わせとして、又は固定された組み合わせ（例、キット部品）の形態で与えてもよい。

【0164】

この文脈において、本発明の意味内での「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」又は「組み合わせた（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）」は、限定しないが、１を上回る活性剤の混合又は組み合わせからもたらされ、固定及び非固定（例、遊離）の両方の組み合わせ（キットを含む）及び使用（例えば、例、成分又は薬剤の同時、併用、逐次、連続、代替、又は別々の使用を含む。用語「固定された組み合わせ」は、活性剤が両方とも、単一の実体又は投薬量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。用語「非固定の組み合わせ」は、活性剤が両方とも、特定の時間制限を伴わずに、同時に、併用で、又は連続的に別々の実体として患者に投与されることを意味し、そのような投与によって、患者の身体において２つの化合物の治療的に効果的なレベルが提供される。後者はまた、カクテル治療（例、３つ又はそれ以上の活性剤の投与）に適用される。

【0165】

本発明は、本明細書中に記載する癌の処置における、好ましくは固形癌の処置のための使用のための、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストとの組み合わせにおける組換えラブドウイルスを提供する。

【0166】

本発明はまた、本明細書中に記載する癌の処置及び／又は防止のための、好ましくは、固形癌の処置のための薬物の製造のための、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストとの組み合わせにおける組換えラブドウイルスの使用を提供する。

【0167】

本発明はさらに、治療的に効果的な量の本発明の組換えラブドウイルス、及びＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストを、癌を患っている個体に投与し、それにより、癌の１つ又は複数の症状を寛解させることを含む、癌を処置及び／又は防止するための方法を提供する。本発明の組換えラブドウイルス及びＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは、同時に、連続的に、又は交互に投与してもよい。

【0168】

本発明の組換えラブドウイルス及びＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは、同じ投与経路により、又は異なる投与経路を介して投与してもよい。好ましくは、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは静脈内投与し、本発明の組換えラブドウイルスは腫瘍内投与する。別の実施形態では、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは静脈内投与し、本発明の組換えラブドウイルスは少なくとも１回腫瘍内投与し、組換えラブドウイルスのその後の用量は静脈内投与する。その後の用量は、最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、又は３１日に投与してもよい。好ましい実施形態では、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは、最初の腫瘍内投与後２１日に投与する。

【0169】

特に好ましいのは、以下との組み合わせにおける本発明の組換えラブドウイルスを用いた処置である：

【0170】

（ｉ）ＳＭＡＣ模倣物（ＳＭＡＣｍ）／ＩＡＰアンタゴニスト、

【0171】

（ｉｉ）免疫療法薬剤（抗ＰＤ－１薬剤及び抗ＰＤ－Ｌ１薬剤を含む）、ならびに抗ＬＡＧ３薬剤（例えばペムブロリズマブ及びニボルマブなど）、ならびにＷＯ２０１７／１９８７４１において開示されている抗体。

【0172】

本明細書中で提供する組み合わせは、（ｉ）本発明の組換えラブドウイルス、及び（ｉｉａ）ＰＤ－１経路阻害剤、好ましくはＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して向けられたアンタゴニスト抗体、又は（ｉｉｂ）ＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニスを含む。さらに提供するのは、本明細書中に記載する癌の処置のための、（ｉ）及び（ｉｉａ）又は（ｉ）及び（ｉｉｂ）を含むそのような組み合わせの使用である。

【0173】

別の態様では、（ｉ）本発明の組換えラブドウイルス及び（ｉｉａ）ＰＤ－１経路阻害剤又は（ｉｉｂ）ＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの使用を含む組み合わせ処置を提供する。そのような組み合わせ処置において、本発明の組換えラブドウイルスは、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストと同時に、連続的に、又は交互に投与してもよい。

【0174】

例えば、「併用」投与は、同じ一般的な時間期間内に、例えば、同じ日に、しかし、必ずしも同時にではなく、活性剤を投与することを含む。交互投与は、時間期間、例えば、数日又は１週間の経過にわたる１つの薬剤の投与、それに続く、その後の時間の期間、例えば、数日又は１週間の経過にわたる他の薬剤の投与を含み、次に１つ又は複数のサイクルについてパターンを繰り返す。逐次又は連続投与は、１つ又は複数の用量を使用した第１の時間期間（例えば、数日又は１週間の経過にわたる）の間での１つの薬剤の投与、それに続く、１つ又は複数の用量を使用した第２の時間期間（例えば、数日又は１週間の経過にわたる）の間での他の薬剤の投与を含む。重複するスケジュールも用いてもよく、それは、必ずしも規則的な順序に従わない、処置期間にわたる異なる日での活性剤の投与を含む。これらの一般的なガイドラインに関するバリエーションも、使用する薬剤及び被験者の状態に従って用いてもよい。

【0175】

連続的な処置スケジュールは、本発明の組換えラブドウイルスの投与、それに続くＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの投与を含む。連続的な処置スケジュールはまた、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの投与、それに続く本発明の組換えラブドウイルスの投与を含む。連続的な処置スケジュールは、互いの後の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、又は３１日の投与を含みうる。

【0176】

本発明及びその実施形態の全ての意味におけるＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１とその受容体との相互作用を阻害する化合物である。ＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１経路のシグナル伝達を損なうことが可能であり、好ましくはＰＤ－１受容体により媒介される。ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１経路のシグナル伝達に拮抗することが可能なＰＤ－１経路の任意のメンバーに対して向けられた任意の阻害剤でありうる。阻害剤は、ＰＤ－１経路の任意のメンバーを標的化するアンタゴニスト抗体でありうるが、好ましくはＰＤ－１受容体、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２に対して向けられている。また、ＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１受容体又はＰＤ－１リガンドの活性を遮断するＰＤ－１受容体のフラグメントでありうる。

【0177】

ＰＤ－１アンタゴニストは当技術分野において周知であり、例えば、Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151（参照により本明細書中に組み入れる）により概説されている。任意のＰＤ－１アンタゴニスト、特に抗体（例えばＬｉらにより開示された抗体など）、ならびに本明細書中で以下に開示するさらなる抗体は、本発明に従って使用することができる。好ましくは、本発明及び全てのその実施形態のＰＤ－１アンタゴニストは、以下の抗体からなる群より選択する：
・ペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１抗体）；
・ニボルマブ（抗ＰＤ－１抗体）；
・ピジリズマブ（抗ＰＤ－１抗体）；
・ＰＤＲ－００１（抗ＰＤ－１抗体）；
・本明細書中で以下に開示するＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５（抗ＰＤ－１抗体）
・アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）；
・アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）；
・デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）。

【0178】

例えば、Hamid, O. et al.（2013）New England Journal of Medicine 369(2):134-44において開示されているペムブロリズマブ（以前はランブロリズマブとしても公知；商品名キートルーダ；ＭＫ－３４７５としても公知）は、ＰＤ－１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である；それは、Ｆｃ媒介性の細胞毒性を防止するように設計されたＣ２２８Ｐで変異を含む。ペムブロリズマブは、例えば、ＵＳ ８，３５４，５０９及びＷＯ２００９／１１４３３５において開示されている。それは、切除不能な又は転移性の黒色腫を患う患者及び転移性ＮＳＣＬＣを伴う患者の処置のためにＦＤＡにより承認されている。

【0179】

ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４；ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６ｂ）は、ＰＤ－１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であり、検出可能な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を欠いている。ニボルマブは、例えば、ＵＳ ８，００８，４４９及びＷＯ２００６／１２１１６８において開示されている。それは、切除不能な又は転移性の黒色腫、転移性ＮＳＣＬＣ、及び進行性腎細胞癌を患う患者の処置のためにＦＤＡにより承認されている。

【0180】

ピジリズマブ（ＣＴ－０１１；Cure Tech）は、ＰＤ－１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブは、例えば、ＷＯ２００９／１０１６１１において開示されている。

【0181】

ＰＤＲ－００１又はＰＤＲ００１は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の結合を遮断する、高親和性、リガンド遮断、ヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体である。ＰＤＲ－００１はＷＯ２０１５／１１２９００及びＷＯ２０１７／０１９８９６において開示されている。

【0182】

抗体ＰＤ１－１からＰＤ１－５は、表１において示す配列により定義される抗体分子であり、それにおいてＨＣは（全長）重鎖を表示し、ＬＣは（全長）軽鎖を表示する：

【0183】

【表1】

【0184】

具体的には、本明細書中で上に記載する抗ＰＤ－１抗体分子は、以下を有する：
（ＰＤ１－１：）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－２：）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－３：）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－４：）配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－５：）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖。

【0185】

アテゾリズマブ（テセントリク、ＭＰＤＬ３２８０Ａとしても公知）は、ＰＤ－Ｌ１を標的化するファージ由来のヒトＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、例えば、Deng et al. mAbs 2016;8:593-603において記載されている。それは、尿路上皮癌を患う患者の処置のためにＦＤＡにより承認されている。

【0186】

アベルマブは完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ１モノクローナル抗体であり、例えば、Boyerinas et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1148-1157において記載されている。

【0187】

デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）は、ＰＤ－Ｌ１に対して高い特異性を伴うヒトＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、例えば、Stewart et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1052-1062において、又はIbrahim et al. Semin. Oncol. 2015;42:474-483において記載されている。

【0188】

Ｌｉら（上記）により開示されている、又は臨床治験中にあることが公知である、さらなるＰＤ－１アンタゴニスト、例えばＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＪＳ００１－ＰＤ－１、ＳＨＲ－１２１０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＴＳＲ－０４２、ＪＮＪ－６３７２３２８３、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃなどは、上に言及するアンタゴニストの代替物として、又はそれに加えて使用してもよい。

【0189】

本明細書中で使用するＩＮＮは、オリジネーター抗体と同じ、又は実質的に同じアミノ酸配列を有する全てのバイオシミラー抗体（米国における４２ＵＳＣ§２６２サブセクション（ｋ）及び他の法域における等価の規制の下で認可されたそれらのバイオシミラー抗体を含むが、それらに限定しない）も包含することを意味する。

【0190】

上に列挙するＰＤ－１アンタゴニストは、それらのそれぞれの製造、治療的使用、及び特性を伴い、当技術分野において公知である。

【0191】

一実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはペムブロリズマブである。

【0192】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはニボルマブである。

【0193】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはピジリズマブである。

【0194】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはアテゾリズマブである。

【0195】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはアベルマブである。

【0196】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはデュルバルマブである。

【0197】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはＰＤＲ－００１である。

【0198】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはＰＤ１－１である。

【0199】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはＰＤ１－２である。

【0200】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはＰＤ１－３である。

【0201】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはＰＤ１－４である。

【0202】

別の実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストはＰＤ１－５である。

【0203】

本発明及び全てのその実施形態の意味におけるＳＭＡＣ模倣物は、ＩＡＰタンパク質に結合し、それらの分解を誘導する化合物である。好ましくは、本発明及び全てのその実施形態におけるＳＭＡＣ模倣物は、以下（Ａ０）からなる群より選択する：
・ＷＯ２０１３／１２７７２９において（一般的及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（即ち、化合物）、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＷＯ２０１５／０２５０１８において（一般的及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（即ち、化合物）、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＷＯ２０１５／０２５０１９において（一般的及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（即ち、化合物）、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＷＯ２０１６／０２３８５８において（一般的及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（即ち、化合物）、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＷＯ２００８／００１６８９３において（一般的及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（即ち、化合物）、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＬＣＬ１６１、即ち、ＷＯ ２００８／０１６８９３（２８／２９ページ；［１２２］）の実施例１における化合物Ａ、又はその医薬的に許容可能な塩；
・Ｄｅｂｉｏ－１１４３として公知のＳＭＡＣ模倣物、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ビリナパントとして公知のＳＭＡＣ模倣物、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＡＳＴＸ－６６０として公知のＳＭＡＣ模倣物、又はその医薬的に許容可能な塩；
・ＣＵＤＣ－４２７として公知のＳＭＡＣ模倣物、又はその医薬的に許容可能な塩
・表２におけるＳＭＡＣ模倣物１から２６のいずれか１つ、又はその医薬的に許容可能な塩：

【0204】

【表2】

【0205】

表２における化合物１から１０の例は、ＷＯ２０１３／１２７７２９において開示されている。表２における化合物１１から２６の例は、ＷＯ２０１６／０２３８５８において開示されている。

【0206】

本明細書中で使用する用語「ＳＭＡＣ模倣物／ＩＡＰアンタゴニスト」はまた、互変異性体の、医薬的に許容可能な塩の、水和物の、又は溶媒和物（医薬的に許容可能な塩を含む）の形態における、上に列挙するＳＭＡＣ模倣物を含む。それはまた、全てのその固体、好ましくは結晶形態、ならびにその医薬的に許容可能な塩、水和物及び溶媒和物（医薬的に許容可能な塩の水和物及び溶媒和物を含む）の全ての結晶形態におけるＳＭＡＣ模倣物を含む。

【0207】

上に列挙する全てのＳＭＡＣ模倣物は、それぞれの合成及び特性を伴い、当技術分野において公知である。上に言及する全ての特許出願を、参照によりその全体において組み入れる。

【0208】

一実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、ＬＣＬ１６１又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１）。

【0209】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２）。

【0210】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ３）。

【0211】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物３又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ４）。

【0212】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物４又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ５）。

【0213】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物５又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ６）。

【0214】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物６又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ７）。

【0215】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物７又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ８）。

【0216】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物８又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ９）。

【0217】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物９又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１０）。

【0218】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１０又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１１）。

【0219】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１１又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１２）。

【0220】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１２又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１３）。

【0221】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１３又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１４）。

【0222】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１４又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１５）。

【0223】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１５又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１６）。

【0224】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１６又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１７）。

【0225】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１７又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１８）。

【0226】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１８又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ１９）。

【0227】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物１９又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２０）。

【0228】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２０又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２１）。

【0229】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２１又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２２）。

【0230】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２２又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２３）。

【0231】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２３又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２４）。

【0232】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２４又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２５）。

【0233】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２５又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２６）。

【0234】

別の実施形態では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２における化合物２６又はその医薬的に許容可能な塩である（Ａ２７）。

【0235】

全ての実施形態（Ａ１）から（Ａ２７）は、ＳＭＡＣ模倣物の性質に関して、実施形態（Ａ０）の好ましい実施形態である。

【0236】

組み合わせ処置に関する好ましい実施形態では、組換えラブドウイルスは、そのゲノム中に、以下を含む群より選択される、少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスである：（ｉ）プラスミン処理ＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉ）ｃ末端切断ＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉｉ）配列番号２を含む、又は配列番号２と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖ）配列番号４を含む、又は配列番号４と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに従ったタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号１を含む、又は配列番号１と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、あるいは（ｖｉｉｉ）配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、それにおいて組換え水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換され、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される。

【0237】

組み合わせ処置に関するさらに好ましい実施形態では、組換えラブドウイルスは、そのゲノム中に、水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、及び少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであり、それにおいてＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体は、以下を含む群より選択される：（ｉ）プラスミン処理ＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉ）ｃ末端切断ＣＣＬ２１タンパク質、（ｉｉｉ）配列番号２を含む、又は配列番号２と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖ）配列番号４を含む、又は配列番号４と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列をさらに含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに従ったタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号１を含む、又は配列番号１と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、あるいは（ｖｉｉｉ）配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するタンパク質、それにおいて水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換され、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換され、それにおいて核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７において示すアミノ酸又は配列番号７と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含み、リンタンパク質（Ｐ）は、配列番号８において示すアミノ酸又は配列番号８と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含み、ラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９において示すアミノ酸又は配列番号９と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含み、マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号１０において示すアミノ酸又は配列番号１０と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含む。

【0238】

組み合わせ処置に関するより好ましい実施形態では、組換えラブドウイルスは、そのゲノム中に少なくとも１つのＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体、好ましくはヒトＣＣＬ２１をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであり、それにおいてＣＣＬ２１タンパク質又はその機能的変異体は、配列番号５を含む、又は配列番号５と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３% 、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、それにおいて組換え水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換され、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される。

【0239】

本発明の組換えラブドウイルス、特に本発明の水疱性口内炎ウイルスとＰＤ－１阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストとの組み合わせは、癌の処置において例外的に効果的であったが、追加のカーゴをコードしない、即ち、ＣＣＬ２１タンパク質をコードしない水疱性口内炎ウイルスの組み合わせも、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストと組み合わせた場合に効果的であることが本発明者らにより見出された。特に、ＶＳＶ－ＧＰ（水疱性口内炎ウイルスとＬＣＭＶの糖タンパク質）とＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの組み合わせ処置は、両方とも本明細書中に記載するように、癌、好ましくは固形癌の処置のために効率的であった。従って、また、本明細書中で提供するのは、ＣＣＬ２１タンパク質をコードしないＶＳＶ－ＧＰ及びＰＤ－１経路阻害剤、好ましくは、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して向けられるアンタゴニスト抗体又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストを含む組み合わせである。さらに提供するのは、本明細書中に記載するような癌の処置のためのそのような組み合わせの使用である。さらに提供するのは、ＣＣＬ２１タンパク質をコードしないＶＳＶ－ＧＰ及びＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの使用を含む組み合わせ処置である。

【0240】

ＣＣＬ２１タンパク質をコードしないＶＳＶ－ＧＰの組み合わせ処置に関連して、組換えラブドウイルスは、組換え水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換されている、及び／又は糖タンパク質Ｇが、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換されている組換え水疱性口内炎ウイルスであることが好ましい。

【0241】

ＣＣＬ２１タンパク質をコードしないＶＳＶ－ＧＰの組み合わせ処置にさらに関連して、組換えラブドウイルスは、そのゲノム中に水疱性口内炎ウイルス核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）をコードする組換え水疱性口内炎ウイルスであることが好ましく、それにおいて、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置換される、及び／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置換される、ならびに、それにおいて核タンパク質（Ｎ）は、配列番号７において示すアミノ酸、あるいは配列番号７と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含む、リン酸化タンパク質（Ｐ）は、配列番号８において示すアミノ酸、あるいは配列番号８と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含む、ラージタンパク質（Ｌ）は、配列番号９において示すアミノ酸、あるいは配列番号９と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含む、及びマトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号１０において示すアミノ酸、あるいは配列番号１０と少なくとも８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%同一の機能的変異体を含む。

【0242】

ウイルスの生成、産生、及びウイルス産生細胞

【0243】

本発明はまた、細胞が、本発明に従った組換えラブドウイルス又は組換え水疱性口内炎ウイルスを産生することを特徴とするウイルス産生細胞を提供する。

【0244】

細胞は、任意の起源のものでありうるが、単離された細胞として、又は細胞集団中に含まれる細胞として存在しうる。組換えラブドウイルス又は組換え水疱性口内炎ウイルスを産生する細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。より好ましい実施形態では、本発明のウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞が多能性成人前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ細胞、任意のＨＥＫ２９３細胞（例、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、又はＶｅｒｏ細胞もしくは骨髄由来腫瘍浸潤細胞（ＢＭ－ＴＩＣ）であることを特徴とする。

【0245】

あるいは、ウイルス産生細胞は、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、又はハムスター細胞でありうる。当業者は、所与の細胞がウイルスを産生するか否か、及び、このように、特定の細胞が本発明の範囲内に入るか否かをテストする際での使用のために適した方法を知っている。この点で、本発明の細胞により産生されるウイルスの量は特に限定しない。好ましいウイルス力価は、感染後、さらなる下流のプロセシングを伴わず、所与の細胞培養物の粗上清中で≧１×１０^７ ＴＣＩＤ_５０／ml又は≧１×１０^８ゲノムコピー/mlである。

【0246】

特定の実施形態では、本発明のウイルス産生細胞は、細胞が、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、Ｐ、及びＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐ、及びｍならびにＬＣＭＶ－ＧＰ、Ｄａｎｄｅｎｏｎｇ－ＧＰ、又はＭｏｐｅｉａ－ＧＰ糖タンパク質をコードする遺伝子ｇｐからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの発現のための１つ又は複数の発現カセットを含むことを特徴とする。

【0247】

本発明の意味におけるウイルス産生細胞は、複製不可能なベクターからの組換えラブドウイルスの産生のための古典的なパッケージング細胞、ならびに複製可能なベクターからの組換えラブドウイルスの産生のための産生細胞を含む。パッケージング細胞は通常、パッケージングされるそれぞれのベクターを欠く、及び／又はウイルスの産生のために必要である必須遺伝子の発現のための１つ又は複数のプラスミドを含む。そのような細胞は、所望の目的のために適した適切な細胞株を選択することができる当業者には公知である。

【0248】

本発明の組換えラブドウイルスは、当業者に公知の方法に従って産生することができ、（１）細胞中にトランスフェクトされたｃＤＮＡの使用又は（２）ヘルパー細胞中にトランスフェクトされたｃＤＮＡの組み合わせ、あるいは（３）細胞中にトランスフェクトされたｃＤＮＡ（細胞をヘルパー／ミニウイルスにさらに感染させて、感染性又は非感染性のいずれかの組換えラブドウイルスを産生するために必要な残りの成分又は活性をトランスで提供する）を含むが、これらに限定しない。これらの方法のいずれか（例、ヘルパー／ミニウイルス、ヘルパー細胞株、又はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）を使用する場合、要求される最小成分は、（１）ラブドウイルスＮタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質によるゲノム（又はアンチゲノム）ＲＮＡのキャプシド形成、ならびに（２）ゲノム又はアンチゲノム（複製中間体）ＲＮＡ等価物の複製のためのシス作用シグナルを含むＤＮＡ分子である。

【0249】

複製エレメント又はレプリコンは、５′及び３′末端にラブドウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列を最小限に含むＲＮＡの鎖である。ゲノムセンス中では、リーダーは３′末端にあり、トレーラーは５′末端にある。これら２つの複製シグナルの間に配置された任意のＲＮＡは順に複製される。リーダー領域及びトレーラー領域はさらに、転写及び複製を開始するために必要である、Ｎタンパク質によるキャプシド形成及びポリメラーゼ結合の目的のために最小限のシス作用エレメントを含まなければならない。組換えラブドウイルスを調製するために、Ｇ遺伝子を含むミニウイルスはまた、リーダー領域、トレーラー領域、及びＧタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始シグナル及び終結シグナルを伴うＧ遺伝子を含みうる。ミニウイルスがＭ遺伝子をさらに含む場合、Ｍタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始シグナル及び終結シグナルも存在しなければならない。

【0250】

組換えラブドウイルスゲノム内に含まれる任意の遺伝子について、その遺伝子は、それらの遺伝子の発現及びタンパク質産物の産生を可能にする適切な転写開始シグナル及び終結シグナルにより隣接されうる（Schnell et al., Journal of Virology, p.2318-2323, 1996）。「非感染性」組換えラブドウイルスを産生するために、組換えラブドウイルスは最小限のレプリコンエレメントならびにＮ、Ｐ、及びＬタンパク質を有さなければならず、それはＭ遺伝子を含まなければならない。これによって、細胞から出芽するウイルス粒子が産生されるが、しかし、非感染性粒子である。「感染性」粒子を産生するために、ウイルス粒子は、例えば付着タンパク質又は受容体リガンドの使用を通じて、など、ウイルス粒子の結合及び融合を媒介することができるタンパク質を追加で含まなければならない。ラブドウイルスの天然の受容体リガンドはＧタンパク質である。

【0251】

組換えラブドウイルスの構築を可能にする任意の細胞を使用することができる。感染性ウイルス粒子を調製するための１つの方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は他の適切なバクテリオファージポリメラーゼ、例えばＴ３又はＳＰ６ポリメラーゼなどをコードするプラスミドで感染させた適切な細胞株を含む。細胞を次に、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びＭラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む個々のｃＤＮＡでトランスフェクトしてもよい。これらのｃＤＮＡは、組換えラブドウイルス粒子を構築するためのタンパク質を提供する。細胞は、当技術分野において公知の任意の方法によりトランスフェクトすることができる。

【0252】

また、細胞株中にトランスフェクトされるのは、ラブドウイルスゲノムＲＮＡ等価物を含む「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」である。感染性の組換えラブドウイルス粒子が感染細胞中で溶解性であることを意図している場合、次に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、及びＬタンパク質をコードする遺伝子、ならびに異種核酸セグメントが存在しなければならない。感染性の組換えラブドウイルス粒子が溶解性であることを意図していない場合、次に、Ｍタンパク質をコードする遺伝子はポリシストロン性ＤＮＡ中に含まれない。「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」により、それは、Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも含む転写ユニットを含むｃＤＮＡを意味する。組換えラブドウイルスポリシストロン性ＤＮＡはまた、タンパク質変異体又はそのポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子、あるいは治療的核酸又はタンパク質を含みうる。あるいは、最初に産生されたウイルス粒子又はそのフラグメントと最初に会合する任意のタンパク質がトランスで供給されうる。

【0253】

また、熟慮するのは、ＣＣＬ２１をコードする遺伝子を含むポリシストロン性ｃＤＮＡである。熟慮されるポリシストロン性ｃＤＮＡは、タンパク質変異体をコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、治療的核酸、及び／又はＮ－Ｐ－Ｌ遺伝子又はＮ－Ｐ－Ｌ－Ｍ遺伝子のいずれかを含みうる。組換えラブドウイルスを生成する際での最初の工程は、ｃＤＮＡからゲノム等価物又はアンチゲノム等価物であるＲＮＡの発現である。次に、そのＲＮＡはＮタンパク質によりパッケージ化され、Ｐ／Ｌタンパク質により複製される。そのようにして産生された組換えウイルスを回収することができる。Ｇタンパク質が組換えＲＮＡゲノムに存在しない場合、次にそれは、典型的には、トランスで供給される。Ｇタンパク質及びＭタンパク質の両方が存在しない場合、次に両方がトランスで供給される。「非感染性ラブドウイルス」粒子を調製するために、手順は、細胞中にトランスフェクトされたポリシストロン性ｃＤＮＡがラブドウイルスのＮ、Ｐ、及びＬ遺伝子だけを含むことを除き、上記と同じでよい。非感染性ラブドウイルス粒子のポリシストロン性ｃＤＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子を追加で含みうる。

【0254】

トランスフェクトされた細胞を、通常、所望の温度、通常は約３７度で少なくとも２４時間にわたりインキュベートする。非感染性ウイルス粒子について、上清を収集し、ウイルス粒子を単離する。感染性ウイルス粒子については、ウイルスを含む上清を回収し、新鮮な細胞に移す。新鮮な細胞を約４８時間にわたりインキュベートし、上清を回収する。

【0255】

本発明の他の特色及び利点は、例として本発明の原理を例証する以下のより詳細な実施例から明らかになるであろう。

【0256】

実施例

【0257】

実施例１

【0258】

ＶＳＶ－ＧＰ感染腫瘍における免疫浸潤／活性化及び免疫チェックポイント発現の誘導。

【0259】

発現分析／ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（図１）

【0260】

ＶＳＶ－ＧＰプラットフォーム免疫細胞浸潤（Ｔ細胞：ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４及びＣＤ８）を用いた治療的介入の影響をよりよく理解するために、活性化（ＣＤ６９、グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）及びパーフォリン（Ｐｒｆ１））ならびに免疫チェックポイント（ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＰＤ－１（Ｐｄｃｄ１）、Ｃｔｌａ－４、Ｔｉｇｉｔ、Ｌａｇ３）発現を対照又はＶＳＶ－ＧＰ感染腫瘍において分析した。この目的のために、樹立されたＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ（インターフェロンアルファ受容体について欠失されたＬＬＣ１腫瘍細胞）腫瘍を伴うＣ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用した、又は１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰの単一の静脈内注射で処置した。処置後７日目に腫瘍を切除した；全ＲＮＡを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇからの「Pan Cancer Immune Profiling Panel」を使用し、製造元の指示に従って抽出し、分析した。図１において描写するように、ＶＳＶ－ＧＰ処置によって、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＰＤ－１遺伝子を含む、分析された遺伝子の発現の強力な上方調節がもたらされた。

【0261】

実施例２

【0262】

有効性：抗ＰＤ－１を伴うＶＳＶ－ＧＰコンボ

【0263】

腫瘍成長（図２Ａ～Ｄ）

【0264】

癌患者におけるＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１遮断抗体の臨床的な成功及びＶＳＶ－ＧＰプラットフォームを用いた処置が免疫チェックポイント、例えばＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１などの上方調節と密接に関連して腫瘍浸潤Ｔ細胞の活性化をもたらしたことを例証する本発明者ら自身のデータ（図１を参照のこと）に基づき構築し、ＶＳＶ－ＧＰ由来の治療薬とＰＤ－１遮断抗体を組み合わせることの治療的な可能性を、ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデル（インターフェロンアルファ受容体について欠失されたＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍細胞）を使用して分析した。

【0265】

皮下注射されたＣＴ２６Ｃｌ２５ＩＦＮＡＲ－／－腫瘍細胞の生着率は１００%（５０／５０匹マウス）であった。８日目（ウイルス適用日）、腫瘍サイズの中央値は０．０５cm3であった。腫瘍成長を６０日間隔にわたり追跡した。偽（＝未処置）対照は１０%（１／１０匹）の自然寛解を呈し、１つの腫瘍はずっと遅く成長した。ＶＳＶ－ＧＰ単独で静脈内処置されたマウスでは、３０%（３／１０匹マウス）の完全寛解が観察された。生着後１１日目から開始したＰＤ－１処置単独は、腫瘍成長に対する効果は有さなかった。ＶＳＶ－ＧＰと抗ＰＤ－１の組み合わせによって、高い腫瘍寛解率がもたらされた。抗ＰＤ－１をＶＳＶ－ＧＰ処置後に適用した場合、完全寛解が７０%（７／１０マウス）で見られた。マウスは少なくとも６０日間にわたり腫瘍がないままであった。全体として、高い生存率は組み合わせ群において達成された（示さず）。

【0266】

実施例３

【0267】

記憶形成：ＶＳＶ－ＧＰ＆ＶＳＶ－ＧＰ／抗ＰＤ－１コンボ。

【0268】

腫瘍成長／再攻撃（図３Ａ～Ｃ）

【0269】

ＶＳＶ－ＧＰ／抗ＰＤ－１組み合わせ実験からの治癒マウスは、再攻撃から保護される。ＶＳＶ－ＧＰ／抗ＰＤ－１組み合わせ群（ｎ＝７）又はＶＳＶ－ＧＰ単独（低用量、ｎ＝３）群からのマウスを再攻撃した。簡単には、ＣＴ２６Ｃｌ２５ＩＦＮＡＲ－／－細胞をマウスの左側腹部中に皮下注射し、腫瘍成長を経時的にモニターした。陽性対照として、年齢及び性別を一致させた無感作マウス（ｎ＝１０）にＣＴ２６Ｃｌ２５ＩＦＮＡＲ－／－を皮下移植し、腫瘍は、以前に観察されたように、一貫して成長し、１回の自然寛解を伴った。腫瘍成長は、ＶＳＶ－ＧＰ／抗ＰＤ－１組み合わせ群（ｎ＝７）又はＶＳＶ－ＧＰ単独（低用量、ｎ＝３）群において観察されず、治癒マウスが特定の免疫学的記憶を発生したことを示している。

【0270】

実施例４

【0271】

腫瘍におけるＣＣＬ２１カーゴ及びＶＳＶ－ＧＰ誘導性ケモカイン発現の選択。

【0272】

ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）発現分析（図４）。

【0273】

前臨床腫瘍モデルにおけるＶＳＶ－ＧＰプラットフォームを用いた治療的介入の影響を、複数のケモカインの発現を測定することにより分析した（図４）。ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及び他のケモカイン発現が、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰを用いた単一の静脈内処置後の３もしくは７日目に、ＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍において強力に上方調節された。他方で、ＣＣＲ７リガンドＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１の発現は、ＶＳＶ－ＧＰ感染により上方調節されなかった。

【0274】

実施例５

【0275】

ＶＳＶ－ＣＣＬ２１組換え体の生成。

【0276】

ウイルスレスキュー（図５）。

【0277】

実施例４において記載する知見を基に構築し、腫瘍溶解性ウイルスＶＳＶ－ＧＰのゲノムを、ＣＣＬ２１遺伝子をコードし（図５を参照のこと）、ウイルス複製の間に腫瘍部位でＣＣＬ２１ケモカインを局所的に発現し、ＶＳＶ－ＧＰの「免疫治療ギャップ」を満たし（ＶＳＶ－ＧＰはＣＣＲ７リガンドＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１を上方調節できなかった）、免疫細胞浸潤ならびに腫瘍溶解性ウイルスＶＳＶ－ＧＰの治療的な有効性をさらに改善するように操作した。

【0278】

複製能力のあるＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１ウイルス変異体を、ＶＳＶ－ＧＰ及びマウス又はヒトＣＣＬ２１のバージョンの完全なウイルスゲノムについてのｃＤＮＡを含む細菌プラスミドからの逆遺伝学（目的の遺伝子（ＧＯＩ）のクローニング、ウイルスレスキュー、及び反復プラーク精製）によって生成した。ｐＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１プラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下にあるＶＳＶインディアナ血清型の完全なｃＤＮＡゲノムを含むプラスミドｐＶＳＶ－ＸＮ１（Schnell et al.]に基づいた。ｐＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１変異体を生成するために、ＶＳＶ Ｇエンベロープタンパク質についての全配列を、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ、ＷＥ－ＨＰＩ株）からのＧＰエンベロープタンパク質のコドン最適化配列により置換した。加えて、ＣＣＬ２１遺伝子をコードする合成核酸を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリにより糖タンパク質ＧＰとウイルスポリメラーゼＬの間に挿入した。ウイルス感染の状況におけるＣＣＬ２１遺伝子の転写は、ＣＣＬ２１オープンリーディングフレームの３′末端の余分のＶＳＶ開始シグナル配列により、及び５′末端の追加の停止シグナル配列により確実になる（図５Ａ）。

【0279】

感染性ウイルスを、標準的なトランスフェクション方法（例、ＣａＰＯ４沈殿、リポソームＤＮＡ送達）によるＨＥＫ２９３Ｔ又は任意の他のＶＳＶ許容細胞株のトランスフェクションにより、プラスミドｃＤＮＡから回収（又はレスキュー）した。簡単には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＶＳＶタンパク質Ｎ、Ｐ、及びＬならびにコドン最適化Ｔ７ポリメラーゼをコードするｐＳＦ－ＣＡＧ－ａｍｐベースの発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。加えて、ＶＳＶ－ＧＰ、ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１、又はそれらの変異体のウイルスゲノムｃＤＮＡをコードするプラスミドを同時トランスフェクトした（図５Ｂ）。レスキュー過程の第一の工程では、Ｔ７ポリメラーゼがプラスミドにコードされたウイルスｃＤＮＡからウイルスＲＮＡゲノムを転写する。第二の工程では、ＶＳＶ－Ｌタンパク質及びＰタンパク質が、同時トランスフェクトされたプラスミドから外因的に発現され、ウイルスＲＮＡゲノムをさらに増幅する。ウイルスＲＮＡゲノムは、ＶＳＶ－Ｎタンパク質により同時転写的にキャプシド形成される。加えて、Ｐ／Ｌポリメラーゼ複合体によって、ウイルス遺伝子産物Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＧＰ、及びＬの一式、ならびに挿入されたＣＣＬ２１変異体の転写が可能になる。ウイルスＲＮＡゲノムは、その後、リボ核タンパク質、マトリックスタンパク質、及びウイルスエンベロープＧＰを含む感染性ＶＳＶ粒子中にパッケージ化される。ウイルス粒子は、出芽により細胞から放出される。

【0280】

レスキューされたウイルスを、最初に、許容細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３、又はＶＥＲＯなどで継代させた。数回のプラーク精製を、標準的な方法によるウイルスシードストックの生成前に実施した。簡単には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞、又はＶＥＲＯ細胞を、レスキューされたプレシードの連続１０倍希釈液で感染させた。約２時間後、細胞単層を２回洗浄し、０．８%の低融点アガロースを含む培地で覆った。感染後２４時間から４８時間に、プラークを採取し、ウイルスを、追加の回数のプラーク精製のために使用する、又はウイルスシードストックを生成した。

【0281】

実施例５．１

【0282】

インビトロでのウイルス適応度の検証。

【0283】

ＴＣＩＤ_５０（図１９Ａ～Ｃ）

【0284】

感染前１日目に、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ２１細胞、及びＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレート中に播種した。対応する培養培地は：（ａ）Ｖｅｒｏ細胞：ＤＭＥＭ（Gibco、＃３１９６６－０２１）＋５%熱不活化ＦＢＳ（Gibco、＃１０５００－０６４）、（ｂ）ＢＨＫ２１細胞：ＧＭＥＭ（Life Technologies、＃２１７１０－０８２／０２５）＋１０%熱不活化ＦＢＳ（Gibco、＃１０５００－０６４）＋５%ＴＰＢトリプトースホスフェートブロス（Life Technologies、＃１８０５０－０３９）、（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞：Freestyle（商標）２９３発現培地（ThermoFisher Scientific、＃１２３３８０１８）である。

【0285】

感染の日に、全ての細胞株が、６０～７０%の集密度を有した。細胞株当たり１つのウェルを、０．００５ ＭＯＩのウイルス構築物ＶＳＶ－ＧＰ（ＧＰ）、ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（２１）、又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）（２１ｋ）の１つで他のウェルに感染させる前にカウントした（Countess（商標）セルカウンター、Invitrogen）。

【0286】

培養上清（総量３ｍＬ）を感染後０時間、２４時間、又は４８時間に回収し、ＴＣＩＤ_５０/mLを測定することによりウイルス複製能力を決定した。

【0287】

ＴＣＩＤ_５０（組織培養感染量の中央値）を、感染前の１日目に播種したＶＥＲＯ細胞の９６ウェルプレート上で決定した。全ての上清のうち、２２の連続半対数希釈液（１Ｅ－１．０から１Ｅ－１１．５の範囲）を調製し、４通りに滴定した。感染後の６日目、細胞変性効果（ＣＰＥ）をプレートの顕微鏡検査により読み取った。

【0288】

ＴＣＩＤ_５０/mLを、スピアマン・カーバーの式Ｍ＝ｘ＋ｄ［０．５－（１／ｎ）（ｒ）］に従って算出した。ｘ：テストされた最も高い希釈での正の指数；ｄ＝希釈間の間隔；ｎ＝希釈当たりのウェル；ｒ＝負の応答の数の合計。

【0289】

実施例５．２

【0290】

インビトロでのカーゴ発現。

【0291】

ＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット（図６Ａ－Ｂ＆図１２Ａ－Ｂ＆図１８）

【0292】

ウイルスＣＣＬ２１カーゴ（導入遺伝子）の発現を確認及び定量化するため、ならびに異なるＣＣＬ２１変異体をより良く特徴付けるために、ＣＣＬ２１特異的ＥＬＩＳＡならびにウエスタンブロット分析を実施した。図６Ａ及び図１２Ａにおいて描写するように、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１（図６Ａ；全長マウスＣＣＬ２１を発現するＶＳＶ－ＧＰ）感染ＨＥＫ２９３細胞又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（図１２Ａ；全長ヒトＣＣＬ２１を発現するＶＳＶ－ＧＰ）からの上清をそれぞれ、マウスあるいはヒト特異的ＥＬＩＳＡを使用し、ウイルス感染後の異なる時間点で分析した。また、ヒトＣＣＬ２１変異体、すなわち、全長ヒトＣＣＬ２１及びヒトＣＣＬ２１＝ＣＣＬ２１（１－７９）の最初の７９のアミノ酸（シグナル配列を伴わない）に類似したｃ末端切断バージョンを、ヒトＣＣＬ２１特異的ウエスタンブロットを使用して特徴付けた。図１８（左から）において描写するように、ＣＣＬ２１（１－７９）又は全長ＣＣＬ２１タンパク質をコードするプラスミドトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からの上清、ならびに示したウイルスで感染されたＨＥＫ２９３細胞からの上清を分析した。ケモカイン変異体は、両方の系（プラスミド及びウイルス）において十分に発現していた。全長ＣＣＬ２１サンプルは複数のＣＣＬ２１種あるいは分解／切断産物を含んでいたが、ＣＣＬ２１（１－７９）タンパク質はきれいな単一バンドとして提示された。

【0293】

実施例５．３

【0294】

インビトロでのカーゴ活性

【0295】

Transwell（Ｔ細胞／ＤＣ）（図６Ａ＆１２Ａ＆１６＆１７）

【0296】

ウイルスＣＣＬ２１カーゴ（導入遺伝子）の生物学的機能性を確認し、さらに特徴付けるために、Transwell遊走アッセイにおいてＴ細胞又は単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を誘引するそれらの能力を分析した。この目的のために、実施例５．２（図６Ａ及び１２Ａ）においてそれぞれ記載する上清、遊走培地だけ（バックグラウンド対照）、組換えＣＣＬ２１（陽性対照）、又はＶＳＶ－ＧＰ感染ＨＥＫ２９３細胞からの対応する上清（ＶＳＶ－ＧＰバックグラウンド対照）を含むマウス及びヒトＣＣＬ２１を、Transwell遊走アッセイ設定の下部ウェルに加え、ＣＤ３／２８刺激マウス（図６；右部位）又はヒト（図１２；右部位）のＴ細胞を上部チャンバー（Transwellインサート）に加えた。インキュベーション後、下部ウェルの細胞を、Promega（登録商標）CellTiter-Glo（登録商標）細胞生存アッセイを使用して定量した。結果を、遊走培地だけの対照と比べた「倍増」として描写する。さらなる実験は、ＣＣＬ２１の短いカーゴバージョン、ＣＣＬ２１（１－７９）（ヒトＣＣＬ２１のａａ １－７９）、及びプラスミン媒介性プロセシングから生じる最短の天然に生じるＣＣＬ２１フラグメント；上に記載するアッセイを使用したＣＣＬ２１（１－８１）（ヒトＣＣＬ２１のａａ １－８１）（図１５を参照のこと）を含んだ。この目的のために、発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上清を生成して分析した（図１６を参照のこと）。最後の工程では、ＶＳＶ－ＧＰ、ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（全長）、及びＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）感染ＨＥＫ２９３細胞からの上清を、上に記載するTranswell遊走アッセイ及び応答細胞としてのｍｏＤＣを使用することにより比較した。このアッセイでは、全長ヒトＣＣＬ２１及びＣＣＬ２１（１－７９）の両方によって同程度のｍｏＤＣ遊走がもたらされた（図１７を参照のこと）。

【0297】

実施例５．４

【0298】

インビトロでの種の交差反応性（ヒト対マウス＆ラット）

【0299】

Transwell（Ｔ細胞）（図１３）

【0300】

マウス及びラットＣＣＬ２１受容体（ＣＣＲ７）に対するヒトＣＣＬ２１の異種間反応性を確認するために、上に記載するTranswell遊走アッセイを、レスポンダーとしてマウス（左）又はラット（右）Ｔ細胞と使用した（図１３を参照のこと）。遊走アッセイを、示した濃度（下部ウェル）でヒト対マウス（左）及びヒト対ラット（右）の組換えケモカインを使用して実施した。結論として、ヒトＣＣＬ２１は、対応するマウス及びラットのケモカインの様に、マウス及びラットの系でそれぞれ活性であり、ヒト分子を前臨床げっ歯類（マウス／ラット）モデルでテストすることができることを示している。

【0301】

実施例６：

【0302】

インビボでのカーゴＣＣＬ２１発現

【0303】

ＲＮＡｓｅｑ（図１０）

【0304】

ウイルスによりコードされるＣＣＬ２１の発現を、対照におけるげっ歯類腫瘍、又はＶＳＶ－ＧＰもしくはＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１感染腫瘍において分析／確認した。この目的のために、樹立されたＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍を伴うＣ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用した、あるいは１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１の単一の静脈内注射で処置した。治療後７日目に腫瘍を切除した；全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｓｅｑを使用して分析した。ＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ及びＣＸＣＬ１０を対照薬として使用した。ウイルスによりコードされるＣＣＬ２１は、コドン最適化されたＤＮＡ配列を読み出しとして使用し、特異的に検出された（図１０を参照のこと）。

【0305】

実施例６．１：

【0306】

ＶＳＶ－ＧＰ及びＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１の神経毒性の欠如。

【0307】

生存率（図１１）

【0308】

野生型ＶＳＶ感染は、ウイルスが脳に接近する場合に神経学的症状を起こしうる。これらの神経学的合併症は、感染した被験者の死亡に導きうる重度脳炎を含む。キメラＶＳＶ－ＧＰを使用する利点は、神経感染がほぼ完全に存在せず、ＶＳＶ骨格を安全な腫瘍溶解剤にすることである。減弱した表現型についての理由は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質を介して促進される、変化したウイルス指向性に起因していると考えられている。神経感染及び脳中でのＶＳＶ－ＧＰの伝播は見られないが、他の細胞型、例えばグリア細胞又は星状細胞などにおけるウイルス遺伝子発現が完全に欠如しているか否かは明らかではない。ＶＳＶ ＧＰによるＣＣＬ２１導入遺伝子の偶発的な発現は、免疫細胞を誘引し、脳内に有害効果を起こしうるため、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１の神経毒性評価を行った。

【0309】

スイスＣＤ－１マウスは、右線条体中への定位注射を介して、１×１０^６ ＴＣＩＤ_５０を含む３μlの単一の頭蓋内注射を受けた。ＰＢＳを対照群において心臓内投与した。動物を、神経毒性の徴候及び全身の健康について毎日モニターした。ＰＢＳ（点）、ＶＳＶ－Ｇ ＤｓＲｅｄ（ひし形）、ＶＳＶ－ＧＰ（四角）、及びＶＳＶ－ＧＰ ｍｕＣＣＬ２１の実験群でのマウス生存率を、カプランマイヤー曲線としてプロットした（図１１Ｂ）。カプランマイヤー分析は、テストしたウイルス変異体のいずれも、マウスにおいて神経毒性を示さなかったことを示す。ウイルス表面に野生型ＶＳＶ糖タンパク質を含むＶＳＶ－ＧＤｓＲｅｄ対照群だけが、増加した体重減少を示し（図１１Ａ）、心臓感染後の最初の１週間以内に安楽死に導く神経学的徴候を発生した。

【0310】

実施例６．２

【0311】

ＶＳＶ－ＧＰ及びＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１のインビボ有効性。

【0312】

腫瘍成長（図１４）。

【0313】

ＶＳＶ－ＧＰ及びＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１の治療的な可能性を、ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデルを使用して評価／比較した。この目的のために、樹立された腫瘍を、２×１０^７ ＴＣＩＤ_５０ ＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１の２つの静脈内注射（０日目及び３日目）で処置した。示すように処置されたマウスの生存率を図１において描写する。

【0314】

実施例６．３

【0315】

ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１及びＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１（１－７９）のインビボ有効性。

【0316】

腫瘍成長／生存率（図２０／２１）。

【0317】

ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１及びＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）の治療的な可能性を、ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデルを使用して評価／比較した。この目的のために、樹立された腫瘍を、２×１０^７ ＴＣＩＤ_５０ ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１又はＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）の２つの静脈内注射（０日目及び３日目）で処置した。示すように処置されたマウスの累積腫瘍成長及び３０日生存率を図２０／２１において描写する。完全にプラスミン処理された（より少ないａａ ８０／８１）及び自由に拡散性の形態のヒトＣＣＬ２１に対応する短いＣＣＬ２１変異体（ＣＣＬ２１（１－７９））での処置によって、ＶＳＶ－ＧＰ変異体を持つ全長ＣＣＬ２１と比較し、腫瘍成長をより良く制御し、生存率が改善することができた。

【0318】

実施例６．４

【0319】

ＭｏＡ：ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１及びＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＣＬ２１（１－７９）により誘導されるＴ細胞浸潤。

【0320】

ＩＨＣ（ＦＩＧ．２２／２３）

【0321】

実施例６．３の下で処置された腫瘍を、Ｔ細胞浸潤について分析した。ＦＦＰＥ腫瘍切片を、ＣＤ４及びＣＤ８ならびにＶＳＶ－Ｎ及び切断されたカスパーゼ３について染色した。生存可能な（非壊死性）腫瘍領域中の全Ｔ細胞（ＣＤ４＋＆ＣＤ８＋細胞）を定量化した。図２２において描写するように、完全にプラスミン処理された（少ないａａ ８０／８１）及び自由に拡散性の形態のヒトＣＣＬ２１に対応する短いＣＣＬ２１変異体（ＣＣＬ２１（１－７９））によって、腫瘍中により多くのＴ細胞を誘引することができたが、観察された有効性における増加についての説明を提供する（実施例６．３）。

【0322】

加えて、ウイルスで発現されたＣＣＬ２１によって、感染されたＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍中に樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性）を誘引することができた。樹立されたＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍に、０日目及び３日目に２×１０^７ ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１を局所（髄腔内）注射した。それぞれの腫瘍のＦＦＰＥ切片を、樹状細胞浸潤（活性なウイルス複製を伴う腫瘍領域＝壊死周縁部）について分析した（図２４を参照のこと）。

【0323】

実施例７

【0324】

有効性：ＳＭＡＣｍを伴うＶＳＶ－ＧＰ及びＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１コンボ。

【0325】

腫瘍成長／生存率（図７－９）。

【0326】

ＶＳＶ－ＧＰ及びＰＤ－１遮断抗体（実施例２）の組み合わせからの有望なデータに基づき、ＳＭＡＣ模倣物（ＳＭＡＣｍ）（腫瘍細胞を、細胞死を誘導する刺激／薬剤に対してより感受性にする細胞死経路のモジュレーター）を伴うＶＳＶ－ＧＰ（図７／９）及びＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１（図８／９）のさらなる組み合わせをテストした。化合物の治療的な相互作用を、ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデルを使用して分析した。この目的のために、樹立されたＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍を伴うＢａｌｂ／ｃマウスを、４×１０^６ ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰあるいはＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１を用いた単一の静脈内処置及び／又は１００mg/kgのＳＭＡＣｍの１日１回経口（ｐ．ｏ．）投与を、ＶＳＶ－ＧＰあるいはＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１処置と同じ日に開始して２週間の期間にわたり受けた。ＶＳＶ－ＧＰ及びＳＭＡＣｍの組み合わせによって、対応する単剤療法と比較し、改善された有効性がもたらされた。ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＣＬ２１をＳＭＡＣｍと組み合わせた場合、組み合わせ効果がさらに顕著になり、全ての処置動物の治癒がもたらされた。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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