特許 7332157 アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の活性な低分子量変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-15

(45)【発行日】2023-08-23

(54)【発明の名称】アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の活性な低分子量変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/64 20060101AFI20230816BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230816BHJP

   C12N 11/02 20060101ALI20230816BHJP

   C12N 11/14 20060101ALI20230816BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20230816BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20230816BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230816BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230816BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20230816BHJP

   C07K 14/76 20060101ALN20230816BHJP

   C07K 14/315 20060101ALN20230816BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230816BHJP

【ＦＩ】

C12N9/64 Z

C07K19/00 ZNA

C12N11/02

C12N11/14

C12N15/57

A61K38/48

A61P13/12

A61P3/10

C07K16/00

C07K14/76

C07K14/315

C12N15/62 Z

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2019540076

(86)(22)【出願日】2018-01-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-05

(86)【国際出願番号】 US2018014991

(87)【国際公開番号】W WO2018140456

(87)【国際公開日】2018-08-02

【審査請求日】2021-01-25

(31)【優先権主張番号】62/449,857

(32)【優先日】2017-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500041019

【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル バトル

(72)【発明者】

【氏名】ジャン ワイソッキー

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５０８７５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５０４０４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５１９３４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】WYSOCKI, J., et al.，"Angiotensin-converting enzyme 2 amplification limited to the circulation does not protect mice from development of diabetic nephropathy."，KIDNEY INTERNATIONAL，2017年，Vol.91，pp.1336-1346，10.1016/j.kint.2016.09.032

【文献】YING, T., et al.，"Engineered soluble monomeric IgG1 CH3 domain: generation, mechanisms of function, and implications for design of biological therapeutics."，J. BIOL. CHEM.，2013年，Vol.288, No.35，pp.25154-25164，DOI: 10.1074/jbc.M113.484154

【文献】ZHAO, S., et al.，"Extending the serum half-life of G-CSF via fusion with the domain III of human serum albumin."，BIOMED RES. INT.，2013年，Vol.2013，107238 (8 pages)，DOI: 10.1155/2013/107238

【文献】NILVEBRANT, J., et al.，"The albumin-binding domain as a scaffold for protein engineering."，COMPUT. STRUCT. BIOTECHNOL. J.，2013年，Vol.6, No.7，e201303009 (6 pages)，DOI: 10.5936/csbj.201303009

【文献】ANDERSEN, J.T., et al.，"Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain."，J. BIOL. CHEM.，2011年，Vol.286, No.7，pp.5234-5241，DOI: 10.1074/jbc.M110.164848

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腎疾患の治療に使用するためのアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２；配列番号１；又は配列番号２）の切断型である変異体であって、該ＡＣＥ２の変異体は補因子結合部位を介してＺｎ^２＋に結合し、該変異体はアンジオテンシンＩＩ（１－８）をアンジオテンシン（１－７）に変換する活性を有し、該ＡＣＥ２の変異体は約７０ｋＤａ未満の分子量を有し、及び該変異体は糸球体濾過を介した送達を可能にする、ＡＣＥ２の変異体。

【請求項2】

ＡＣＥ２の変異体が、全長ＡＣＥ２（配列番号１；又は配列番号２）と比較して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、又はその両方を含む、請求項１に記載のＡＣＥ２の変異体。

【請求項3】

ＡＣＥ２の変異体がグリコシル化される、請求項２に記載のＡＣＥ２の変異体。

【請求項4】

血漿中のＡＣＥ２の変異体の半減期を増加させる異種アミノ酸配列に融合した請求項１に記載のＡＣＥ２の変異体を含む融合タンパク質。

【請求項5】

異種アミノ酸配列が、（ｉ）融合ポリペプチドの二量体化を防ぐヒンジ領域を欠損している抗体のＦｃ部分のアミノ酸配列又はその断片；（ｉｉ）ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩのアミノ酸配列又はその断片；及び（ｉｉｉ）連鎖球菌プロテインＧのＣ末端アルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

ＡＣＥ２の変異体と異種アミノ酸配列との間にリンカーアミノ酸配列をさらに含み、リンカー配列がグリシン及びセリンから選択される５～１５個のアミノ酸を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

Ｎ末端又はＣ末端ヒスチジンタグをさらに含む、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

ポリエチレングリコールポリマーに結合した請求項１に記載のＡＣＥ２の変異体を含む結合体。

【請求項9】

ナノ粒子に結合した請求項１に記載のＡＣＥ２の変異体を含む結合体。

【請求項10】

（ｉ）請求項１に記載のＡＣＥ２の変異体；及び（ｉｉ）適切な医薬用担体を含む医薬組成物。

【請求項11】

それを必要とする対象においてＡｎｇＩＩ（１－８）レベルを減少させる及び／又はＡｎｇ（１－７）レベルを増加させる方法において使用するための請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

対象が、糖尿病性腎疾患、急性腎不全、慢性腎疾患、糸球体腎炎、及び腎動脈狭窄からなる群から選択される状態を有する、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

該組成物が静脈内投与又は皮下投与用に製剤化される、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項14】

該組成物が肺投与用に製剤化される、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項15】

配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＣＥ２の変異体。

【請求項16】

配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＣＥ２の変異体。

【請求項17】

変異体とリンカーのアミノ酸配列が、配列番号１０又は配列１１のアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

変異体のアミノ酸配列が配列番号３又は配列番号４に示され、かつ、リンカーのアミノ酸配列が（Ｇ _４ Ｓ） _３ である、請求項６に記載の融合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連特許出願への相互参照
本出願は、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４４９，８５７号に対する３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）下での優先権の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

本発明の分野は、それを必要とする対象において、アンジオテンシンＩＩ（１－８）の血漿レベルを低下させるための及び／又はアンジオテンシン（１－７）の血漿レベルを増加させるためのアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）及びＡＣＥ２の変異体に関する。開示されているＡＣＥ２の変異体には、ＡｎｇＩＩ（１－８）をＡｎｇ（１－７）に変換するＡＣＥ２生物活性を持ち、通常は糸球体で濾過されない完全長ＡＣＥ２よりも低い分子量を持つＡＣＥ２の断片が含まれるより低い分子量により、ＡＣＥ２の断片を糸球体を通して濾過することができる。ＡＣＥ２の開示された変異体は、限定されないが、糖尿病及び非糖尿病の慢性腎疾患、急性腎不全及びその予防、慢性腎疾患、糸球体腎炎、重度の高血圧、強皮症及び皮膚、肺、腎臓及び高血圧の合併症、悪性高血圧、腎動脈狭窄に続発する腎血管性高血圧、特発性肺線維症、肝硬変患者などの肝線維症、大動脈瘤、心臓線維症及びリモデリング、左室肥大、及び急性脳卒中を含む状態の治療に有用であり得る。

【0003】

レニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）の活性化は、高血圧、心血管疾患、糖尿病性腎疾患、ＣＫＤからＥＳＲＤ^１－３への進行の病因に大きな役割を果たす。さらに、急性腎不全では、ＲＡＳも活性化される^４－７。主にＡｎｇ ＩＩの形成のブロック又はＡｎｇ ＩＩの作用のブロックに基づいて既存のアプローチを拡大及び改善するＲＡＳの過剰活動に対抗する新しいアプローチが必要である。我々は、Ａｎｇ ＩＩの分解を促進することを目的とした治療法の提案の最前線にある^８－１３。ＡＣＥ２の重要な生物学的効果は、ＡｎｇＩＩ（１－８）をＡｎｇ（１－７）に変換することでする。このプロセスは、ＡｎｇＩＩ（１－８）を低下させる傾向があるため、このペプチドの有害な作用を防ぐ。さらに、Ａｎｇ ＩＩ（１－８）切断の結果としてＡｎｇ（１－７）が形成され、このペプチドは、Ｍａｓ受容体を直接活性化することにより、一般的にＡｎｇＩＩ（１－８）とは反対の組織保護機能を有する。確かに、Ａｎｇ（１－７）には膨大な数の潜在的な治療用途があるという証拠が増えており、これは、Ａｎｇ ＩＩを分解し、Ａｎｇ（１－７）を形成するという二重の利点を持つ潜在的な治療標的として、Ａｎｇ（１－７）形成酵素の重要性も強調している。

【0004】

数年前、我々と他の人たちは、ＡｎｇＩＩ注入によって誘発された高血圧のマウスに与えられたヒトＡＣＥ２を初めて使用した最初の研究で観察した免疫原性を回避する方法として、マウスＡＣＥ２を精製及び生成した^１３。最近の研究では、ストレプトゾトシン誘発糖尿病性腎疾患のマウスに与えられたマウス組換えＡＣＥ２の腎臓への影響を調べた（その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれるWysocki et al., Angiotensin-converting enzyme 2 amplification limited to circulation does not protect mice from development of diabetic nephropathy," Kidney Int. 2016 Dec. 4. Pii: S0085-2538(16)30565-8を参照されたい）。この研究では、２つのアプローチが使用された：４週間の毎日の腹腔内注射及びＡＣＥ２遺伝子送達による循環ＡＣＥ２の増幅^１５。ミニサークルを使用したＡＣＥ２の送達は、血清ＡＣＥ２活性の持続的かつ大幅な増加と急性Ａｎｇ ＩＩ（１－８）負荷を代謝する能力の強化をもたらした。ミニサークルＡＣＥ２で前処理したＳＴＺ誘発糖尿病のマウスでは、血漿中のＡＣＥ２タンパク質が著しく増加し、これは血清ＡＣＥ２活性を１００倍以上増加させた。しかしながら、ミニサークルＡＣＥ２は未治療の糖尿病マウスと比較して尿中ＡＣＥ２活性の変化を引き起こさなかった。アルブミン尿、糸球体メサンギウム拡張、糸球体細胞性及び糸球体サイズはすべて、非糖尿病コントロールと比較して、ミニサークルＡＣＥ２治療及び未治療の糖尿病マウスで同程度に増加した^１０。したがって、循環に限定されたＡＣＥ２の深遠な増強は、非常に高い血漿ＡＣＥ２レベルが何ヶ月も持続したにもかかわらず、初期の糖尿病性腎疾患に特徴的な糸球体病変及び過濾過を改善できなかった。これらの発見は、糖尿病性腎疾患及び腎疾患一般の初期段階と戦うために、循環レニンアンジオテンシン系よりもむしろ腎臓を標的にすることの重要性を強調している。組換えＡＣＥ２の分子サイズが大きいため、正常な糸球体又は腎疾患の初期の形態では濾過不能となり、疾患の進行を防ぐために介入することが重要である。対照的に、より進行した糸球体腎疾患では、注入されたｒＡＣＥ２が尿中に回収できることを示すことができた^１０。進行疾患のこの後期段階では、腎臓の変化を逆転させ、線維症を逆転させることは困難である。したがって、この制限を回避するために、腎臓病の治療にはるかに適し、肺や心臓などの他の臓器への組織浸透を改善する、より短い形式のＡＣＥ２を設計した。

【0005】

我々の発見に基づいて、糸球体透過性の顕著な変化が生じる前に腎臓に送達可能で、すべての場合に腎臓によりよく送達される、より短い分子サイズのＡＣＥ２の形態を作製した。ＡＣＥ２は、典型的には、腎臓により濾過されない１１０ｋＤタンパク質として観察され、ＡＣＥ２が豊富に発現される腎臓の腎尖管膜からの排出産物として尿中に現れる^{９－１１，１６}。我々は、非常に活性のある、より小さな分子量の組換えＡＣＥ２タンパク質を開発した。これは、既存のヒト組換えインタクトＡＣＥ２が行うように、全身循環でＡＣＥ２活性を高めることを目的とする場合、完全な活性と潜在的な治療用途を保持することを意味するが、サイズが大きいため、糸球体濾過により腎臓に送達できるため、腎臓病の治療や他の臓器の組織浸透にも適している。

【0006】

ＡＣＥ２のサイズを減少させると、急性腎障害又は糖尿病性腎疾患の初期段階、すなわち微量アルブミン尿症のような糸球体透過性の軽度の増加状態で、ＡＣＥ２が糸球体バリアを通して容易に濾過できることが示された。最も重要な目標は、腎臓に容易に送達でき、したがって腎疾患と戦うことができる、より短いＡＣＥ２のフォームを開発することである。このアプローチは、現在使用されているＡＣＥ阻害剤及びＡＴ１ブロッカーとは異なり、補完的である。我々は、Ａｎｇ ＩＩの分解を促進すると、腎保護ペプチドであるＡｎｇ １－７の形成につながるという特有の利点が得られ、現在、既存の薬剤で行われるようにＡｎｇ ＩＩ又はその受容体の形成又は作用をブロックするよりも自然な生理学的アプローチであると仮定する。糸球体を通して濾過可能な短いＡＣＥ２断片の尿細管再吸収を増加させ、それにより腎臓への取り込みを促進する方法として、短いＡＣＥ２断片は低分子融合ポリペプチドに結合する。これらの融合ポリペプチドには、Ｆｃ（ヒトＩｇＧの定常断片）、ヒト血清アルブミンのＤＩＩＩドメイン、及びリゾチームが含まれるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドはすべて、受容体を介したエンドサイトーシスによって腎尿細管の先端表面に再吸収されることが示される。本出願の主題は、本明細書でさらに議論される。

【発明の概要】

【0007】

ＡＣＥ２の変異体、ＡＣＥ２の変異体を含む医薬組成物、及びそれを必要とする対象におけるアンジオテンシンＩＩ（１－８）血漿レベルを低下させる及び／又はアンジオテンシン（１－８）血漿レベルを上昇させる治療方法が開示される。ＡＣＥ２の開示された変異体は、ＡｎｇＩＩ（１－８）をＡｎｇ（１－７）に変換するためのＡＣＥ２活性を有するＡＣＥ２のポリペプチド断片を含み得る。ＡＣＥ２のポリペプチド断片は、ＡＣＥ２のポリペプチド断片が糸球体を通して濾過され、腎臓に送達されるように十分に低い分子量を有することが好ましい。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は７０ｋＤ未満の分子量を有し、我々は、６９ｋＤの分子量を有するＡ１－６１９と命名した化合物、ならびに６５ｋＤ、６０ｋＤ、５５ｋＤ、又は５０ｋＤの分子量を有する１－６０５と命名した化合物を最もよく研究した。開示された方法では、対象にＡＣＥ２の変異体又はＡＣＥ２の変異体を適切な薬学的担体に含む医薬組成物を投与する。開示された治療方法に適した対象には、糖尿病及び非糖尿病の慢性腎疾患、急性腎不全及びその予防、慢性腎疾患、糸球体腎炎、重度の高血圧、強皮症及びその皮膚、肺、腎臓を有する又は発症するリスクがある対象が含まれ得る高血圧性合併症、悪性高血圧、腎動脈狭窄に続発する腎血管性高血圧、特発性肺線維症、肝硬変患者などの肝線維症、大動脈瘤、心臓線維症及びリモデリング、左室肥大、及び急性脳卒中を有するか又はそれを発症するリスクを有する対象を含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）分解経路。Ａｎｇペプチドの代謝に関与する酵素のスキーム。Ａｎｇ ＩＩはＡＣＥ２、ＰＲＣＰ及びＰＥＰによって分解されてＡｎｇ－（１－７）を形成し、その後ＡＣＥによって分解されてＡｎｇ－（１－５）を形成する。Ａｎｇ ＩＩ分解の他の経路には、Ａｎｇ－（２－８）へのアミノペプチダーゼＡ、Ａｎｇ ＩＶへのジペプチジルアミノペプチダーゼＩ－ＩＩＩ、及び小ペプチド産物へのネプリライシンとペプチダーゼが含まれる。Batkke^３。

【図2】図２（上のパネル）ｄｂ／ｍ及びｄｂ／ｄｂマウス（各グループでｎ＝５）から収集した新鮮な全腎皮質溶解物を、約１１０ｋＤで単一の免疫反応性バンドを示すＡＣＥ２特異抗体でウエスタンブロットで調べた。（下のパネル）全腎臓溶解物を３７℃で２４時間インキュベートし、その後ウエスタンブロット分析にかけた。約７５ｋＤの２番目のＡＣＥ２免疫反応性バンドが現れましたが、約１１０ｋＤバンドは徐々に消えた。

【図3】ＷＢのＡＣＥ２特異抗体でプローブしたＷＴマウス尿の２つの濃縮限外濾過画分（パネルＡ）で、ＡＣＥ２酵素活性を測定した（パネルＢ）。７５ｋＤ ＡＣＥ２タンパク質を含む濃縮画分（青いバー）は、７５ｋＤ画分と同じ比例体積に濃縮された１１０ｋＤタンパク質を含む画分よりも高いＡＣＥ２活性を示した。

【図4】１つのＡＣＥ２ＫＯマウスからマウス組換え^１インタクトＡＣＥ２（１００－１１０ｋＤ）をＡＣＥＫＯ腎臓皮質溶解物（１０ｎＭ ｍｒＡＣＥ２／溶解物の約１ｍｇ総タンパク質）にスパイクし、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、すべてのインキュベーション時間でスパイクされたｍｒＡＣＥ２サンプルをウエスタンブロットでプローブした。ウエスタンブロット（ＷＢ）画像は、スパイクされた１００－１１０ｋＤ ｍｒＡＣＥ２バンドの消失、最初に小さな７５ｋＤ ＡＣＥ２免疫反応性バンド、次に約６０ｋＤバンドの出現を示している。下部のパネルでは、絶対ＡＣＥ２活性（検出されたバンドの統合密度に対して補正されていない）が示されており、これは、相対的なタンパク質量が弱いにもかかわらず、７５及び約６０ｋＤバンドと元の１１０ｋＤ ｍｒＡＣＥ２バンドの類似の酵素活性を示す（７５ｋＤと約６０ｋＤのバンドは、元の１００－１１０ｋＤの０時間よりも弱いバンドである）。

【図5】ＡＣＥ２／ＰＲＣＰ ｄＫＯマウスにおける尿中ＡＣＥ２活性（Ａ）及びウエスタンブロット（Ｂ）。（Ａ）尿ＡＣＥ２活性はベースラインで０と変わらず、ｉ．ｖ。ＡＣＥ２ １－６１９注入（－０．４±０．２から２１．１±４．３ ＲＦＵ／μｇ ｃｒｅａｔ／ｈｒ（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。１－６０５トランケートの注入もまた尿中ＡＣＥ２活性の明らかな増加をもたらした（－０．１±０．２から５．１±１．９ ＲＦＵ／μｇ ｃｒｅａｔ／ｈｒ ｎ＝５ ｐ＜０．０１）。１－６１９トランケートによって達成されたＡＣＥ２活性のレベルは、１－６０５トランケートで得られたものよりも高かった（それぞれ２１．１±４．３対５．１±１．９ ＲＦＵ／μｇ ｃｒｅａｔ／ｈｒ、ｐ＜０．０１）。（Ｂ）５匹のＡＣＥ２／ＰＲＣＰ ｄＫＯマウス（マウスＩＤ Ｍ３４－Ｍ３８）にＡＣＥ２ １－６１９トランケートのｉ．ｖ．ボーラスの前（ベースライン）及び後（０－２時間）の尿のＷＢ（３６μｌ／ウエル）。それは、注入後であって、注入前ではない切断型ＡＣＥ２の分子サイズと一致する約７０ｋＤの予想サイズでのＡＣＥ２免疫反応性バンドの存在を示している。

【図6】ＳＴＺ処理ＡＣＥ２ＫＯマウスの尿中ＡＣＥ２活性。（Ａ）これらの研究では、ＡＣＥ２ １－６１９（２μｇ／ｇ ＢＷ）注入後の尿ＡＣＥ２は０．３±０．１から１２．６±５．２ ＲＦＵ／μｇ ｃｒｅａｔ／ｈｒに増加した。ｐ＜０．０５。ＡＣＥ２ １－６０５（２μｇ／ｇ ＢＷ）を注入すると、尿のＡＣＥ２活性が増加した（０．１±０．２から４．５±１．４ ＲＦＵ／μｇ ｃｒｅａｔ／ｈｒ、ｐ＜０．０５）。図５の実験のように、ＡＣＥ２ １－６０５で達成された活性のレベルはＡＣＥ２ １－６１９よりも低かったが、この差は統計的有意性に達しなかった。（Ｂ）内因性のＡＣＥ２尿活性がすでに相当であるＳＴＺ誘発糖尿病の２匹のＷＴマウスでは、ＡＣＥ２ １－６１９（４μｇ／ｇ ＢＷ）の注入も尿中ＡＣＥ２活性の顕著な増加をもたらした。

【図7】腎臓の生体内画像。ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ（色）は、^９９ｍＴｃ標識精製無傷のＡＣＥ２ １－７４０（左）又はＡＣＥ２ １－６１９（右）を注射したマウスのｍｉｃｒｏＣＴ（グレースケール）上に重ねられる。ＡＣＥ２ １－７４０ではなく、ＡＣＥ２ １－６１９の腎臓への取り込みを示している。短いＡＣＥ２ １－６１９は主に腎皮質に集中している（白い矢印）（右と左を比較されたい）。両方のＡＣＥ２フォームは強い肝臓の存在を示す（赤い矢印）。

【図8】短いｒＡＣＥ２２ １－６１９（Ａ）又は１－６０５^２（Ｂ）の注入は、ｒＡＣＥ２を注入していないそれぞれの動物（青）と比較して、Ａｎｇ ＩＩ誘発性高血圧からの回復を早める。Ｘ軸は、Ａｎｇ ＩＩボーラス（０．２μｇ／ｇ ＢＷ）からの時間（分）を示す。^＊大きな違いを反映する（実施例のセクションのテキストを参照）。

【図9】ＡＣＥ２の最短の酵素活性型を確立するための３つのステップ。無傷のＡＣＥ２の酵素的に活性な（赤色充填）細胞外ドメインは、７４０ＡＡの長さ（１－７４０）である。細胞外分泌を媒介するシグナルペプチド（ＳＰ）が含まれる。ステップＩでは、Ｃ末端からＡＣＥ２を短縮する。今のところ、ＡＣＥ２ １－６０５は私たちが生産した最短の活性断片であるが、ＡＣＥ２活性（Ｍｃａ－ＡＰＫ－Ｄｎｐ陰性）が見つからなくなるまで、Ｃ末端からＡＣＥ２ １－６０５を短くすることを進める。ステップＩＩでは、Ｎ末端から最も短いＣ末端が切断されたＡＣＥ２を短くする（一度に１０ＡＡ）。ＳＰ（ＡＡ１－１８）は常に、Ｎ末端が短縮されたＡＣＥ２に付加される。ステップＩＩＩ：ＡＣＥ２の酵素活性のＣ末端とＮ末端の境界が見つかったら、両端から切り捨てられたＡＣＥ２を操作して、Ｃ末端１０ｘを発現させる。バイオリアクターを使用した中規模生産（約１０ｍｇ）からの精製を促進するＨｉｓタグ。

【図10】短いＡＣＥ２のインビボ半減期を延長するための様々な融合戦略。ＡＣＥ２融合タンパク質の名前は左側に、予想される分子サイズは右側に示す。ＡＣＥ２－Ｆｃは、Ｆｃタグのヒンジ領域を介して二量体化し、約１７０ｋＤａの分子量をもたらす。Ｆｃ（１４ｋＤａ）の可溶性単量体ＣＨ３ドメインは、短いＡＣＥ２と融合すると分子サイズが約７４ｋＤになる。アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）が６０の短いＡＣＥ２と融合すると、推定分子サイズは約６５ｋＤａになる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書では、以下及び本出願全体に記載されるいくつかの定義を使用して本発明を説明する。

【0010】

本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数形を含む。例えば、「ポリペプチド断片」という用語は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、「１つ又は複数のポリペプチド断片」を意味すると解釈されるべきである。本明細書で使用される「複数」という用語は「２つ以上」を意味する。

【0011】

本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、及び「かなり」は、当業者によって理解され、それらが使用される状況によってある程度変化する。用語が使用される文脈を考えると、当業者には明らかでない用語の使用がある場合、「約」及び「およそ」は、特定の用語のプラス又はマイナス１０％までを意味し、「実質的に」及び「有意に」は、特定の用語のプラス又はマイナス１０％以上を意味する。

【0012】

本明細書で使用される場合、「含む（include）」及び「含んでいる」という用語は、「含む」及び「含む」という用語と同じ意味を有する。「含む（comprise）」及び「含んでいる」という用語は、特許請求の範囲に列挙されたコンポーネントにさらに追加のコンポーネントを含めることを可能にする「開かれた」移行用語であると解釈されるべきである。「なる」及び「からなる」という用語は、特許請求の範囲に列挙された構成要素以外の追加の構成要素の包含を許可しない「閉じた」移行用語として解釈されるべきである。「から本質的になる」という用語は、部分的に閉じられ、請求された主題の性質を根本的に変更しない追加のコンポーネントのみの包含を許可すると解釈されるべきである。

【0013】

本明細書で使用される「対象」という用語は、「患者」又は「個体」という用語と交換可能に使用することができ、「動物」、特に「哺乳類」を含むことができる。哺乳動物の対象には、ヒト及び他の霊長類、家畜、農場の動物、及び犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、牛などのコンパニオン動物が含まれる場合がある。

【0014】

開示された方法、組成物、及びキットは、それを必要とする対象を治療するために利用され得る。「それを必要とする対象」は、糖尿病及び非糖尿病の慢性腎疾患、急性腎不全及びその予防、慢性腎疾患、糸球体腎炎、重度の高血圧、強皮症及びその皮膚、肺、腎臓及び高血圧合併症、悪性高血圧、腎動脈狭窄に続発する腎血管性高血圧、特発性肺線維症、肝硬変患者などの肝線維症、大動脈瘤、心臓線維症及びリモデリング、左心室肥大、及び急性脳卒中などの疾患及び障害を有する又は発症するリスクのある対象を含むものとする。

【0015】

「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列（これらの用語は交換可能に使用され得る）、又はこれらのいずれかの断片、及び天然に存在する又は合成の分子を指す。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指すように記載されている場合、「アミノ酸配列」などの用語は、記載されたタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列にアミノ酸配列を限定するものではない。

【0016】

本明細書で企図されるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。例えば、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して非保存的及び／又は保存的アミノ酸置換を含み得る。「保存的アミノ酸置換」は、参照ポリペプチドの特性をほとんど妨害しないと予測される置換である。言い換えれば、保存的アミノ酸置換は、参照タンパク質の構造と機能を実質的に保存する。以下の表は、例示的な保存的アミノ酸置換のリストを提供する。

【0017】

【表1】

【0018】

保存的アミノ酸置換は、一般に、以下の１つ以上を維持する：（ａ）例えば、ベータシート又はアルファヘリックスコンフォメーションとして、置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）分子の電荷又は疎水性置換部位、及び／又は（ｃ）側鎖の大部分。非保存的アミノ酸置換は、一般に次の１つ以上を維持しない：（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、ベータシート又はアルファらせん構造、（ｂ）電荷又は疎水性置換部位の分子、及び／又は（ｃ）側鎖の大部分。

【0019】

開示されたペプチドは、例えば、血漿安定性（例えば、エキソペプチダーゼに対する耐性）を高め、及び／又は免疫原性を低下させるために、Ｎ末端エステル化（例えば、リン酸エステル修飾）又はペグ化修飾を含み得る。

【0020】

「欠失」とは、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠如をもたらす参照アミノ酸配列（例えば、配列番号１又は配列番号２）の変化を指す。決しツにより、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、又は２００個のアミノ酸残基、又はこれらの値のいずれかで区切られた一連のアミノ酸残基の範囲が削除さする（例えば、５－１０アミノ酸の欠失）。欠失には、内部欠失又は末端欠失（例えば、参照ポリペプチドのＮ末端切断又はＣ末端切断）が含まれ得る。参照ポリペプチド配列の「変異体」は、参照ポリペプチド配列に関連する欠失を含み得る。例えば、配列番号３（アミノ酸１～６１９）及び配列番号４（アミノ酸１～６０５）は、参照配列の配列番号１（アミノ酸１～８０５）と比較してＣ末端欠失を含む。

【0021】

「挿入」及び「付加」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基の付加をもたらすアミノ酸配列の変化を指す。挿入又は付加とは、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００個のアミノ酸残基又はアミノ酸の範囲を指すこれらの値のいずれかで区切られた残基（例えば、５～１０個のアミノ酸の挿入又は追加）を指す場合がある。参照ポリペプチド配列の「変異体」は、参照ポリペプチド配列に対する挿入又は付加を含み得る。

【0022】

「融合ポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、又は両方の末端に異種アミノ酸配列、例えば、血清中の融合ポリペプチドの半減期を延長する異種アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。参照ポリペプチド配列の「変異体」は、参照ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含み得る。

【0023】

「断片」は、参照配列と配列が同一であるが長さが短いアミノ酸配列の一部である（例えば、配列番号１又は配列番号２）。断片は、参照配列の全長からマイナス少なくとも１つのアミノ酸残基までを含んでもよい。例えば、断片は、参照ポリペプチドの５～１０００個の連続したアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、又は５００個の連続したアミノ酸残基を含み得る；又は、断片は、参照ポリペプチドの５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、又は５００個以下の連続したアミノ酸残基を含んでもよい；又は、断片は、これらの値のいずれかによって境界が定められた参照ポリペプチドの一連の連続したアミノ酸残基を含み得る（例えば、４０～８０の連続したアミノ酸残基）。断片は、分子の特定の領域から優先的に選択される場合がある。「少なくとも断片」という用語は、完全長のポリペプチドを包含する。参照ポリペプチド配列の「変異体」は、参照ポリペプチド配列の断片を含み得る。例えば、配列番号３（アミノ酸１～６１９）及び配列番号４（アミノ酸１～６０５）は、参照配列の配列番号１（アミノ酸１～８０５）の断片を含む。

【0024】

「相同性」とは、２つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性、又は交換可能に配列同一性を指す。相同性、配列類似性、及び配列同一性の割合は、当技術分野の方法を使用して決定され、本明細書に記載されている。

【0025】

ポリペプチド配列に適用される「パーセント同一性」及び「パーセント同一性」という語句は、標準化アルゴリズムを使用して整列された少なくとも２つのポリペプチド配列間の残基一致の割合を指す。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。いくつかのアラインメント方法では、保存的なアミノ酸置換が考慮される。上記でより詳細に説明したこのような保存的置換は、一般に置換部位の電荷と疎水性を保存し、したがってポリペプチドの構造（したがって機能）を保存する。アミノ酸配列の同一性パーセントは、当該分野で理解されるように決定され得る。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３９６，６６４号を参照）。一般的に使用され、自由に利用可能な配列比較アルゴリズムのスイートは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul, S. F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410）、ＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダを含むいくつかの情報源から入手できる。ＢＬＡＳＴソフトウェアスイートには、既知のアミノ酸配列をさまざまなデータベースのその他のアミノ酸配列と整列させるために使用される「ｂｌａｓｔｐ」などのさまざまな配列解析プログラムが含まれる。

【0026】

同一性パーセントは、例えば特定の配列番号により定義されるように、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、又は、例えば、より大きな定義されたポリペプチド配列から得られる断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、又は少なくとも７００の連続するアミノ酸残基の断片；若しくは１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は７００個以下のアミノ酸残基の断片；又は、これらの値のいずれかで区切られた範囲（例えば、５００から６００のアミノ酸残基の範囲）の長さに対してより短い長さにわたって測定され得る。このような長さは単なる例示であり、本明細書、表、図又は配列リストは、同一性の割合を測定できる長さを記述するために使用できる。

【0027】

いくつかの実施形態では、特定のポリペプチド配列の「変異体」は、National Center for Biotechnology Informationのウエブサイトで利用可能な「Ｂｌａｓｔ２ 配列」によるｂｌａｓｔを用いて、ポリペプチド配列の１つのある種の長さと比較した、特定のポリペプチド配列に対して少なくとも２０％配列同一性を有するポリペプチド配列として定義され得る。（例えば、Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences--a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250参照）。そのようなポリペプチドの対は、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％以上の配列同一性ポリペプチドのいずれかの特定の定義された長さ、又はこれらの値のいずれかによって境界付けられるパーセント同一性の範囲（例えば、８０－９９％のパーセント同一性の範囲）を示し得る。

【0028】

開示された治療方法及び医薬組成物は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）又はＡＣＥ２の断片などのその変異体を利用及び／又は含む。ヒトＡＣＥ２遺伝子のヌクレオチド配列は、国立衛生研究所の国立生物工学情報センターから入手できる。ヒトＡＣＥ２遺伝子の位置は、ＮＣ ００００２３．１１（１５４９４５２５．．．１５６０２０６９、補数）として提供されている。ＡＣＥ２、アイソフォーム１は、アミノ酸配列（配列番号１）を有する前駆体ポリペプチドとして最初に発現される膜貫通タンパク質である。ＡＣＥ２のマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ホモログは、次のアミノ酸配列（配列番号２）を有する。

【0029】

アミノ酸１～１７は、成熟ＡＣＥ２から切断されるリーダーペプチドである。アミノ酸１８－７４０は細胞外にある。アミノ酸７４１－７６１はらせん膜貫通配列を形成する。アミノ酸７６２－８０５は細胞質である。ＡＣＥ２の天然変異体が本明細書で企図されており、天然変異体Ｋ２６Ｒ及び天然変異体Ｎ６３８Ｓを含み得る。本明細書ではまた、ＡＣＥ２の天然アイソフォームは、アイソフォーム１と比較して以下の相違を有するアイソフォーム２を含むと考えられる：Ｆ５５５Ｌ及びΔ５５６－８０５。ＡＣＥ２の断片を含む、本明細書に開示されているＡＣＥ２の変異体は、ＡＣＥ２のこれらのアミノ酸配列の１つ以上を有していても欠失していてもよい。

【0030】

本明細書では、ＡＣＥ２の融合ポリペプチド又はその変異体が開示されている。ＡＣＥ２又はその変異体の融合ポリペプチドは、異種アミノ酸配列に融合されたＡＣＥ２又はその変異体のアミノ酸配列（例えば、ＡＣＥ２の断片のアミノ酸配列）を含み得る。好ましくは、異種アミノ酸配列は、血漿中の融合ポリペプチドの半減期を増加させる。

【0031】

開示された融合ポリペプチドは、異種アミノ酸配列に直接融合された、又はリンカー配列を介して融合された、ＡＣＥ２又はその変異体のアミノ酸配列（例えば、ＡＣＥ２の断片のアミノ酸配列）を含み得る。適切なリンカー配列には、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個以上のアミノ酸のアミノ酸配列、又はこれらの値のいずれかで区切られた範囲（例えば、リンカー５－１５アミノ酸の）が含まれる場合がある。一部の実施形態では、リンカー配列はグリシン及びセリン残基のみを含む。

【0032】

本明細書に開示される融合ポリペプチドは、抗体のアミノ酸配列又は抗体の１つ又は複数の断片、例えば抗体のＦｃ部分（ヒトＩｇＧの定常断片）に融合したＡＣＥ２又はその変異体のアミノ酸配列を含み、これは、好ましくは、融合ポリペプチド（例えば、配列番号６）の二量体化を防ぐためにそのヒンジ領域を欠いている。短いＡＣＥ２とＦｃ（例、配列番号６）又は単量体ＣＨ３ Ｆｃ誘導体（例、配列番号７又は配列番号８）との融合は、肺線維症の治療においてより効率的な投与のために局所的に使用できる肺において、機能的なＦｃＲｎ依存性輸送経路を介したその送達を可能にする。本明細書に開示される融合ポリペプチドには、血清アルブミン又はその断片、例えばヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩ又はその断片に融合されたＡＣＥ２又はその変異体のアミノ酸配列も含まれる（例えば、配列番号９）。本明細書で開示される融合ポリペプチドは、連鎖球菌プロテインＧのＣ末端アルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）などの連鎖球菌プロテインＧ又はその断片に融合したＡＣＥ２又はその変異体のアミノ酸配列（例えば、Ｇ１４８株又はＡＢＤ０３５誘導体（配列番号５）を含む（例えば、その内容が全体として参照により本明細書に援用されるNilvebrant et al., Comput. Struct. Biotechnol. J. 2013, Volume No:6, Issue: 7, March 2013, pages 1-8を参照されたい）。

【0033】

本明細書に開示される融合ポリペプチドは、例えば、融合ポリペプチドを精製及び又は同定するために利用され得るアミノ酸タグ配列を含み得る。適切なアミノ酸タグ配列には、５～１０個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0034】

ＡＣＥ２は、機能が未知のタンパク質であるアンジオテンシンＩからアンジオテンシンＩ－９への変換を触媒するカルボキシペプチダーゼであり、アンジオテンシンＩＩ（１－８）からアンジオテンシン（１－７）への変換を触媒する（ＥＣ：３．４．１７．２３）、これは血管拡張薬である。ＡＣＥ２は、アペリン－１３とダイノルフィン－１３の加水分解も触媒する。ＡＣＥ２は、突然の急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びヒトコロナウイルスＮＬ６３／ＨＣｏＶ－ＮＬ６３の細胞受容体でもある。ＡＣＥ２の断片を含む、本明細書に開示されているＡＣＥ２の変異体は、ＡＣＥ２のこれらの酵素活性の１つ以上を有していても、有していなくてもよい。

【0035】

アンジオテンシンＩＩ（１－８）からアンジオテンシン（１－７）への変換を触媒する際、ＡＣＥ２は以下の反応を触媒する：アンジオテンシンＩＩ（１－８）＋Ｈ_２Ｏ＝アンジオテンシン（１－７）＋Ｌ－フェニルアラニン（これはアンジオテンシンＩＩ（１－８）のＣ末端フェニルアラニンを除去する）。ＡＣＥ２にはＺｎ^２＋及びＣｌ^－の補因子結合部位がある。これらの反応のミカエリス定数（Ｋ_ｍ）は次のとおりである：アンギオテンシンＩの場合、Ｋ_ｍ＝６．９μＭ；アンギオテンシンＩＩの場合、Ｋ_ｍ＝２μＭ。アペリン－１３の場合Ｋ_ｍ＝６．８μ；ダイノルフィン－１３の場合、Ｋ_ｍ＝５．５μＭ。これらの反応の最適なｐＨは１Ｍ ＮａＣｌの存在下で６．５であるが、ＡＣＥ２はｐＨ６－９で活性である。ＡＣＥ２は、ハロゲン化物イオンの塩化物とフッ化物で活性化されるが、臭化物では活性化されない。ＡＣＥ２はＭＬＮ－４７６０、ｃＦＰ Ｌｅｕ、及びＥＤＴＡによって阻害されるが、ＡＣＥ阻害剤のリノシプリル、カプトプリル、及びエナラプリラートによっては阻害されない。ＡＣＥ２の断片を含む、本明細書に開示されているＡＣＥ２の変異体は、ＡＣＥ２のこれらの酵素活性の１つ以上を有していても又は有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２の断片を含む本明細書に開示されるＡＣＥ２の変異体は、上記の反応の１つ以上について、ＡＣＥ２についてのミカエリス定数の±５０％であるミカエリス定数を有し得る。

【0036】

ＡＣＥ２は、カルボキシペプチダーゼ活性、エンドペプチダーゼ活性、糖タンパク質結合活性、メタロカルボキシペプチダーゼ活性、ウイルス受容体結合活性、及び亜鉛イオン結合活性を含み得る分子機能を示す。ＡＣＥ２の断片を含む本明細書に開示されたＡＣＥ２の変異体は、少なくとも１つのアンジオテンシンＩＩの切断を有するが、おそらくＡＣＥ２の分子的及び酵素的機能のすべてを有する。

【0037】

ＡＣＥ２の重要な構造的特徴には、以下のうちの１つ以上が含まれ得る：アミノ酸位置１６９－塩化物結合部位；アミノ酸位置２７３－基質結合部位；アミノ酸位置３４５－の基質結合部位；アミノ酸位置３４６－カルボニル酸素を介した基質結合部位；アミノ酸位置３７１－基質結合部位；アミノ酸位置３７４－金属結合部位（例えば、Ｚｎ^２＋）；アミノ酸位置３７５－活性部位；アミノ酸位置３７８－触媒金属結合部位（例えば、Ｚｎ^２＋）；アミノ酸位置４０２－触媒金属結合部位（例えば、Ｚｎ^２＋）；アミノ酸位置４７７－塩化物結合部位；アミノ酸位置４８１－塩化物結合部位；アミノ酸位置５０５－活性部位；及びアミノ酸位置５１５－基質結合部位。ＡＣＥ２の断片を含む、本明細書に開示されているＡＣＥ２の変異体は、ＡＣＥ２のこれらの構造的特徴の１つ以上を有していても又は有していなくてもよい。

【0038】

ＡＣＥ２の主要な構造の特徴には、以下の１つ以上が含まれる。アミノ酸位置２３－５２－ヘリックス；アミノ酸位置５６－７７；アミノ酸位置７８－８２－ターン；アミノ酸位置８５－８７－ヘリックス；アミノ酸位置９１－１００－ヘリックス；アミノ酸位置１０４－１０７－ヘリックス；アミノ酸位置１１０－１２９－ヘリックス；アミノ酸位置１３１－１３４－ベータ鎖；アミノ酸位置１３７－１４３－β鎖；アミノ酸位置１４４－１４６－ターン；アミノ酸位置１４８－１５４－ヘリックス；アミノ酸位置１５８－１７１－ヘリックス；アミノ酸位置１７３－１９３－ヘリックス；アミノ酸位置１９６－１９８－ベータ鎖；アミノ酸位置１９９－２０４－ヘリックス；アミノ酸位置２０５－２０７－ターン；アミノ酸位置２１３－２１５－ターン；アミノ酸位置２２０－２５１－ヘリックス；アミノ酸位置２５３－２５５－ターン；アミノ酸位置２５８－２６０－ベータ鎖；アミノ酸位置２６４－２６６－ヘリックス；アミノ酸位置２６７－２７１－ベータ鎖；アミノ酸位置２７９－２８２－ヘリックス；アミノ酸位置２８４－２８７－ターン；アミノ酸位置２９４－２９７－ターン；アミノ酸位置２９８－３００－ヘリックス；アミノ酸位置３０４－３１６－ヘリックス；アミノ酸位置３１７－３１９－ターン；アミノ酸位置３２７－３３０－ヘリックス；アミノ酸位置３３８－３４０－ベータ鎖；アミノ酸位置３４７－３５２－ベータ鎖；アミノ酸位置３５５－３５９－ベータ鎖；アミノ酸位置３６６－３８４－ヘリックス；アミノ酸位置３８５－３８７－回転；アミノ酸位置３９０－３９２－ヘリックス；アミノ酸位置４００－４１３－ヘリックス；アミノ酸位置４１５－４２０－ヘリックス；アミノ酸位置４２２－４２６－ターン；アミノ酸位置４３２－４４６－ヘリックス；アミノ酸位置４４９－４６５－ヘリックス；アミノ酸位置４６６－４６８－ベータ鎖；アミノ酸位置４７３－４８３－ヘリックス；アミノ酸位置４８６－４８８－ベータ鎖；アミノ酸位置４９９－５０２－ヘリックス；アミノ酸位置５０４－５０７－ヘリックス；アミノ酸位置５１４－５３１－ヘリックス；アミノ酸位置５３２－５３４－ターン；アミノ酸位置５３９－５４１－ヘリックス；アミノ酸位置５４８－５５８－ヘリックス；アミノ酸位置５５９－５６２－ターン；アミノ酸位置５６６－５７４－ヘリックス；アミノ酸位置５７５－５７８－ベータ鎖；アミノ酸位置５８２－５９８－ヘリックス；アミノ酸位置６００－６０２－ベータ鎖；及びアミノ酸位置６０７－６０９－β鎖。ＡＣＥ２の断片を含む、本明細書に開示されているＡＣＥ２の変異体は、ＡＣＥ２のこれらの構造的特徴の１つ以上を有していても、又は有していなくてもよい。

【0039】

ＡＣＥ２は、以下のアミノ酸修飾の１つ以上を含み得る：アミノ酸位置５３－Ｎ結合グリコシル化；アミノ酸位置９０－Ｎ－結合型グリコシル化；アミノ酸位置１０３－Ｎ－結合型グリコシル化；アミノ酸位置１３３．ｒｅｖｒｅａｃｔｉｏｎ．１４１－ジスルフィド結合；アミノ酸位置３２２－Ｎ結合型グリコシル化；アミノ酸位置３４４．ｒｅｖｒｅａｃｔｉｏｎ．３６１－ジスルフィド結合；アミノ酸位置４３２－Ｎ－結合型グリコシル化；アミノ酸位置５３０．ｒｅｖｒｅａｃｔｉｏｎ．５４２；アミノ酸位置５４６－Ｎ－結合型グリコシル化；及びアミノ酸位置６９０－Ｎ－結合型グリコシル化。ＡＣＥ２の断片を含む、本明細書に開示されたＡＣＥ２の変異体は、ＡＣＥ２のこれらのアミノ酸修飾の１つ以上を有していても欠如していてもよく、及び／又はこうして修飾されたアミノ酸を欠如していてもよい。

【0040】

ＡＣＥ２は、血液中のアンジオテンシン異化プロセス、アンジオテンシン成熟プロセス、アンジオテンシン媒介飲酒行動プロセス、心筋収縮プロセスの正の制御、ギャップ結合アセンブリプロセスの正の制御、活性酸素種代謝プロセスの正の制御を含む生物学的プロセス、受容体生合成プロセス、受容体媒介ビリオン付着プロセス（コロナウイルスなど）、心臓伝導プロセスの調節、細胞増殖プロセスの調節、サイトカイン産生プロセスの調節、炎症反応プロセスの調節、レニンアンジオテンシンによる全身動脈血圧の調節プロセス、血管収縮プロセスの調節、血管拡張プロセスの調節、トリプトファン輸送プロセス、及び宿主細胞プロセスへのウイルス侵入（例、コロナウイルス）を制御する。ＡＣＥ２の断片を含む本明細書に開示されたＡＣＥ２の変異体は、これらの生物学的プロセスの１つ以上を調節するか、又は調節し損ねる可能性がある。

【0041】

開示されたＡＣＥ２変異体は、ＡＣＥ２の天然アミノ酸には天然に存在しないＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。例えば、本明細書で企図されるＡＣＥ２変異体のアミノ酸配列は、全長ＡＣＥ２のアミノ酸配列と比較してＮ末端欠失を含んでもよく、さらに、全長ＡＣＥ２のアミノ酸配列に存在しないＮ末端メチオニン残基を含むように修飾されてもよい。

【0042】

開示されたＡＣＥ２変異体は、開示されたＡＣＥ２変異体が天然に存在するとは言えないように、アミノ酸配列、又は修飾アミノ酸、又は非天然に存在するアミノ酸を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態において、開示されたＡＣＥ２変異体は修飾され、修飾は、アシル化、アセチル化、ホルミル化、リポ化、ミリストイル化、パルミトイル化、アルキル化、イソプレニル化、プレニル化、及びアミド化からなる群から選択される。したがって、開示されたポリペプチド中のアミノ酸は、修飾され得るが、特に、修飾は、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に存在し得る（例えば、Ｎ末端アシル化又はアセチル化、及び／又はＣ－末端アミド化）。修飾は、ポリペプチドの安定性を高め、及び／又はポリペプチドをタンパク質分解に耐性にすることができる。

【0043】

開示されたＡＣＥ２変異体は、天然のアミノ酸残基を非天然のアミノ酸で置き換えるために修飾されてもよい。非天然アミノ酸には、Ｄ－配置、Ｎ－メチル－α－アミノ酸、非タンパク新生拘束アミノ酸、又はβ－アミノ酸を含むが、これらに限定されない。

【0044】

血漿中のＡＣＥ２変異体の安定性を高めるために、開示されたＡＣＥ２変異体を改変してもよい。例えば、開示されたペプチドは、ペプチドをペプチダーゼに耐性にするために修飾されてもよい。開示されたペプチドは、２つのアミノ酸間のアミド結合を非アミド結合で置き換えるために修飾されてもよい。例えば、アミド結合のカルボニル部分は、ＣＨ２で置き換えることができる（すなわち、アミノ結合の減少：－ＣＨ_２－ＮＨ－を提供するため）。アミド結合に適した他の非アミド置換結合には、限定されないが、エンドチオペプチド、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ、ホスホンアミド、－Ｐ（Ｏ）ＯＨ－ＮＨ－であり得、ＮＨアミド結合は、Ｏ（デプシペプチド、－ＣＯ’Ｏ－）、Ｓ（チオエステル、－ＣＯ－Ｓ－）又はＣＨ_２（ケトメチレン、－ＣＯ－ＣＨ_２－）で交換し得る。ペプチド結合は、次のように修飾することもできる：レトロ－インベルソ結合（－ＮＨ－ＣＯ－）、メチレン－オキシ結合（－ＣＨ_２－）、チオメチレン結合（－ＣＨ_２－Ｓ－）、カルバボンド（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－）、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－）など、ペプチド配列の血漿安定性を高めるためである（特にエンドペプチダーゼに対して）。

【0045】

開示されたＡＣＥ２変異体は、天然に存在しないＮ末端及び／又はＣ末端修飾を含み得る。例えば、開示されたペプチドのＮ末端は、Ｎ－アシル化又はＮ－ピログルタメート修飾（例えば、ブロッキング修飾として）を含むように修飾され得る。開示されたペプチドのＣ末端は、Ｃアミド化を含むように修飾されてもよい。開示されたペプチドは、例えば、血漿安定性（特に、エキソペプチダーゼに対する耐性）を高めるために、炭水化物鎖に結合されてもよい（例えば、グルコース、キシロース、ヘキソースへのグリコシル化を介して）。

【0046】

本明細書に開示されるＡＣＥ２の変異体は、さらに改変され得る。例えば、ＡＣＥ２のポリペプチド断片をさらに修飾して、血漿中の半減期を延長し、かつ／又は標的（例えば、腎臓、肺、心臓など）への送達を増強することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片はポリエチレングリコールポリマーに共有結合している。他の実施形態において、ポリペプチド断片は、ナノ粒子（例えば、バイオゲルナノ粒子、ポリマー被覆ナノビンナノ粒子、及び金ナノ粒子）に結合され得る。好ましくは、開示された治療方法及び医薬組成物のポリペプチド断片は、血漿中で少なくとも６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上の半減期を有する。ペプチド及びタンパク質薬の血漿半減期を改善する戦略は、当技術分野で知られている（その内容が全体として参照により本明細書に援用されるWerle et al., "Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs," Amino Acids 2006 June; 30(4):351-67を参照されたい）。

【0047】

医薬組成物
明細書に開示される組成物は、本開示の細菌毒素を含み、それを必要とする対象への投与のために製剤化された医薬組成物を含み得る。そのような組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、及び状態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者に周知の用量で及び技術により製剤化及び／又は投与することができる。

【0048】

組成物は、当該分野で公知のように、担体、希釈剤、賦形剤、及び界面活性剤を含む薬学的溶液を含み得る。さらに、組成物は防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムなどの抗菌剤又は抗菌剤）を含んでもよい。組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい（例えば、組成物のｐＨを６．５と７．５の間に維持するため）。

【0049】

医薬組成物は治療的に投与されてもよい。治療用途において、組成物は、治療効果を誘発するのに十分な量で患者に投与される（例えば、疾患の症状及び／又は合併症を治癒又は少なくとも部分的に阻止又は遅延させる応答（すなわち、「治療有効用量」）である）。

【0050】

新規の活性なショートＡＣＥ２断片
本発明者らは、非常に高い酵素活性を有するはるかに短い分子量（７０ｋＤ未満）を有する分子量約１１０ｋＤの完全長ＡＣＥ２の新規断片を発見した。ＡＣＥ２の開示された断片は、治療方法及び医薬組成物で利用され得る。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象のＡｎｇＩＩ（１－８）レベルを低下させるために、開示された方法を実施することができる。また、アンジオテンシンＩＩ以外の基質もあり、これらは新規ＡＣＥ２断片によっても切断される。この方法において、対象は、適切な医薬担体中にアンギオテンシン変換酵素２のポリペプチド断片（ＡＣＥ２、配列番号１）を含む医薬組成物であり得る。開示された治療方法に適した対象には、糖尿病及び非糖尿病の慢性腎疾患、急性腎不全及びその予防、慢性腎疾患、重度の高血圧、強皮症、皮膚、肺、腎臓及び高血圧の合併症、悪性高血圧、腎動脈狭窄に続発する腎血管性高血圧、特発性肺線維症、大動脈瘤、心線維症及びリモデリング、左心室肥大、及び急性脳卒中を有する及びその発症のリスクがある患者が含まれるが、これらに限定されない。開示された医薬組成物は、静脈内注入及び患者が自宅で自分で注射できる皮下注射を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって投与されてもよい。開示された医薬組成物は、特発性肺線維症及び他の状態を治療するための使用に非常に実用的であり得る別の投与経路として吸入により投与され得る。

【0051】

開示された治療方法及び医薬組成物におけるＡＣＥ２のポリペプチド断片は、ＡｎｇＩＩ（１－８）をＡｎｇ（１－７）に変換するＡＣＥ２活性を有する。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２のポリペプチド断片は、腎臓に効率的に送達され得、腎臓に容易に送達され得ない全長ＡＣＥ２よりも高いＡＣＥ２活性を有し得る。

【0052】

典型的には、ＡＣＥ２のポリペプチド断片は、ＡＣＥ２のポリペプチド断片が糸球体を通して濾過され、腎臓に送達されるように十分に低い分子量を有する。いくつかの態様において、ポリペプチド断片は、約７０ｋＤ、６５ｋＤ、６０ｋＤ、５５ｋＤ、又は５０ｋＤ未満の分子量を有する。

【0053】

ＡＣＥ２の開示されたポリペプチド断片は、全長ＡＣＥ２（配列番号１）と比較して欠失を含み得る。開示されたポリペプチド断片は、全長ＡＣＥ２（配列番号１）と比較して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、及びその両方から選択される欠失を含み得る。さらに、いくつかの実施形態では、開示されたポリペプチド断片は内部欠失を含み得る。欠失は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００アミノ酸以上の完全長ＡＣＥを除去し得る。いくつかの態様において、欠失は１つ又は複数のグリコシル化部位を除去し、そのため、ＡＣＥ２のポリペプチド断片は完全長ＡＣＥ２よりもグリコシル化されていない可能性があり、完全長ＡＣＥ２と比較してＡＣＥ２のポリペプチド断片の分子量をさらに低下させる。

【0054】

例示的な実施形態
例示的な実施形態以下の実施形態は例示であり、特許請求される主題の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0055】

実施形態１。アンジオテンシン変換酵素２の変異体（ＡＣＥ２、配列番号１）、ＡＣＥ２活性を有し、約７０ｋＤ未満の分子量を有するＡＣＥ２の変異体。

【0056】

実施形態２。ＡＣＥ２の変異体は、全長ＡＣＥ２（配列番号１）に対して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、又はその両方を含む、実施形態１のＡＣＥ２の変異体。例えば、配列番号３又は配列番号４。

【0057】

実施形態３。欠失が完全長ＡＣＥ２に存在するグリコシル化部位を除去する、実施形態２のＡＣＥ２の変異体。

【0058】

実施形態４。ＡＣＥ２の変異体が約６０ｋＤ未満の分子量を有する、前述の実施形態のいずれかのＡＣＥ２の変異体。

【0059】

実施形態５。ＡｎｇＩＩ（１－８）をＡｎｇ（１－７）に変換するために、ＡＣＥ２の変異体が全長ＡＣＥ２（配列番号１）よりも高いＡＣＥ２活性を有する、前述の実施形態のいずれかのＡＣＥ２の変異体。

【0060】

実施形態６．変異体が、少なくとも６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上の血漿中半減期を有するＡＣＥ２の切断型である、前述の実施形態のいずれかのＡＣＥ２の変異体。

【0061】

実施形態７。血漿中のＡＣＥ２の変異体の半減期を増加させる異種アミノ酸配列に融合された切断型などの前述の実施形態のいずれかのＡＣＥ２の変異体を含む融合タンパク質。

【0062】

実施形態８実施形態７の融合タンパク質であって、融合タンパク質が少なくとも６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上間の血漿中半減期を有する、融合タンパク質。

【0063】

実施形態９．実施形態７又は８の融合タンパク質であって、異種アミノ酸配列が、（ｉ）好ましくは融合ポリペプチドの二量体化を防ぐために、好ましくはそのヒンジ領域を欠く抗体又はその断片のＦｃ部分のアミノ酸配列（例えば、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８）；（ｉｉ）血清アルブミン又はその断片のアミノ酸配列、例えば、ヒト血清アルブミン又はその断片のドメインＩＩＩのアミノ酸配列（例えば、配列番号９）；及び（ｉｉｉ）連鎖球菌プロテインＧのアミノ酸配列又は連鎖球菌プロテインＧのＣ末端アルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）のアミノ酸配列などのその断片（例えば、配列番号５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７又は８の実施形態。

【0064】

実施形態１０．ＡＣＥ２の変異体と異種アミノ酸配列との間にリンカーアミノ酸配列（例えば、グリシン及びセリンから選択される５～１５アミノ酸のリンカー配列）をさらに含む、実施形態７～９のいずれかの融合タンパク質。

【0065】

実施形態１１．５～１０個のヒスチジン残基を含むアミノ酸配列などのアミノ酸タグ配列をさらに含む、実施形態７～１０のいずれかの融合タンパク質。

【0066】

実施形態１２．実施形態１～６のいずれかのＡＣＥ２の変異体（例えば、ＡＣＥ２の切断型）又は実施形態７～１１のいずれかの融合タンパク質を含む結合体。ここで、ＡＣＥ２の変異体又は融合タンパク質ポリエチレングリコールポリマーに共有結合する。

【0067】

実施形態１３。実施形態１～６のいずれかのＡＣＥ２の変異体又は実施形態７～１１のいずれかの融合タンパク質を含む結合体であって、ＡＣＥ２の変異体又は融合タンパク質は、ナノ粒子、例えばバイオゲル、ポリマー被覆ナノビン、及び金ナノ粒子に結合する。

【0068】

実施形態１４．結合体が、少なくとも６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上の血漿中半減期を有する、請求項１２又は１３に記載の結合体。

【0069】

実施形態１５：（ｉ）ＡＣＥ２の変異体、融合タンパク質、又はその結合体を列挙する前述の実施形態のいずれか；及び（ｉｉ）適切な医薬用担体を含む医薬組成物。

【0070】

実施形態１６．実施形態１５の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＡｎｇＩＩ（１－８）レベルを低減及び／又はＡｎｇ（１－７）レベルを増大させる方法。

【0071】

実施形態１７対象が、糖尿病及び非糖尿病の慢性腎疾患、急性腎不全及びその予防、慢性腎疾患、糸球体腎炎、重度高血圧、強皮症及びその皮膚、肺、腎臓及び高血圧の合併症、悪性高血圧、腎動脈狭窄に続発する腎血管性高血圧、特発性肺線維症、肝硬変患者などの肝線維症、大動脈瘤、心臓線維症及びリモデリング、左心室肥大、及び急性脳卒中からなる群より選択される状態を有する、実施形態１６の方法。

【0072】

実施形態１８．実施形態１６又は１７の方法であって、医薬組成物が静脈内投与、皮下投与、又は肺投与される（例えば、吸入器又はネブライザーによる吸入を介して）、実施形態１６又は１７の方法。

【実施例】

【0073】

以下の実施例は例示であり、特許請求される主題の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【0074】

実施例１－新規のアクティブＡＣＥ２断片
序論及び目的
レニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）の活性化は、糖尿病性腎疾患（ＤＫＤ）の病因及びＣＫＤへのその進行において主要な役割を果たす。糖尿病性腎疾患の全身性強皮症、悪性高血圧症、特発性肺線維症、心肥大のように、ＲＡＳが全身的又は局所的に、又はその両方で過活性状態になるいくつかの状態がある。アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、アンジオテンシンＩＩ（１－８）（ＡｎｇＩＩ）をアンジオテンシン（１－７）（Ａｎｇ（１－７））に変換する膜貫通モノカルボキシペプチダーゼである。ＡＣＥ２によるＡｎｇＩＩレベルの低下は、このペプチドの過剰な有害作用を防止又は軽減するべきである。さらに、ＡｎｇＩＩ切断の結果として形成され、それ自身の受容体に作用するＡｎｇ（１－７）は、ＡｎｇＩＩの組織保護機能と一般的に反対の組織保護機能を持ち、ＡｎｇＩＩの低下を補完する。過去の資金提供期間中、我々の研究室は、マウスに与えられたときにヒトＡＣＥ２の免疫原性を回避する方法として、マウス組換えＡＣＥ２（ｍｒＡＣＥ２）を精製及び生産することができた。我々は、ｍｒＡＣＥ２の毎日の注射又はＤＮＡミニサークル送達により全身投与されたｍｒＡＣＥ２の腎臓への影響を調べた。これにより、血漿ＡＣＥ２活性が持続的かつ大幅に増加し、急性のＡｎｇＩＩ負荷を代謝する能力が強化された。しかし、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）ミニサークル遺伝子ＡＣＥ２デリバリー又はｒＡＣＥ２投与によって誘発されたＤＫＤのマウスでは、尿中ＡＣＥ２活性を増加させることができず、アルブミン尿、糸球体メサンギウム拡張、糸球体細胞性及び糸球体肥大の改善はなかった。したがって、循環に限定されたＡＣＥ２の深遠な増大は、糸球体病変及び初期ＳＴＺ誘発ＤＫＤに特徴的な過濾過を改善することができなかった。顕著なＡＣＥ２増幅で循環ＲＡＳをターゲットにすることがＤＫＤの改善に効果的でない理由は、全身ＲＡＳが過剰に活動せず、ＳＴＺモデルで血圧が上昇しないという事実に起因する（公開のために提出）。対照的に、ＲＡＳの過活性に対抗するためのｒＡＣＥ２の治療的使用は、全身のＡｎｇＩＩ過剰のマウスレニントランスジェニックモデルの予備データによってサポートされる。この場合、マウスｒＡＣＥ２はＦｃタグと融合して作用期間を延長し、血漿ＡｎｇＩＩレベルの上昇を著しく低下させ、アルブミン尿及び高血圧を改善する（公開のために提出）。

【0075】

ＡＣＥ２の大きな分子サイズ（約１１０ｋＤａ）は、正常な糸球体又はＤＫＤの初期の形態ではフィルターできないようにする。これは、ＤＫＤのＳＴＺモデルで観察された有意な治療上の利点の欠如を説明する。ＡＣＥ阻害剤はこのモデルで有効であり、ＤＫＤの他のモデルは、これらの小分子が容易に濾過され、したがって局所腎臓ＡＣＥを抑制し、ＡｎｇＩＩ形成を抑制することができるという事実に帰することができる。アルポート病とＣＫＤのｃｏｌ４Ａ３－／－マウスモデルで見られるように、糸球体透過性の著しい増加により、注入されたｒＡＣＥ２は尿中に容易に回収されるため濾過できることを示すことができた。しかし、この後期段階では、腎臓の変化を完全に逆転させ、線維症を逆転させることは困難である。したがって、我々は、分子サイズを小さくした組換えＡＣＥ２の新しいフォームをエンジニアリング及びテストして、正常又はわずかに障害のある腎糸球体濾過バリアを通過できるようにすることに関心がある。提案されている新しいＡＣＥ２生物製剤の設計は、マウス及びヒトの尿に自然に見られる特定のＡＣＥ２種の観察に基づいている。７５ｋＤのＡＣＥ２のより短い形で、完全な１１０ｋＤａタンパク質よりも酵素的に活性が高いことが分かった。ＤＫＤで腎臓のＲＡＳ過活性を治療することを主な目的として、ＡＣＥ２の分子サイズを縮小し、糸球体濾過による腎臓送達を促進した。より低分子量のＡＣＥ２トランケート、１－６１９（７１ｋＤ）、及び１－６０５（６９ｋＤ）を生成した。これらは、糸球体濾過を介した腎送達にも適している。さらに、生物学的半減期を延長して慢性的な使用を促進するための高い酵素活性を保持する最短のＡＣＥ２タンパク質にキャリアタグを追加することを目指している。ｒＡＣＥ２を使用してＡｎｇＩＩの分解を促進すると、腎保護ペプチドであるＡｎｇ １－７の同時形成という特有の利点が得られ、ＡｎｇＩＩの形成又は作用をブロックするよりも自然な生理学的アプローチである。さらに、ＡＣＥ２阻害剤と組み合わせて使用すると、ＡｎｇＩＩ形成を継続的に分解することにより、ＡＣＥ２がＡｎｇＩＩエスケープを効果的に防止し、従来のＲＡＳブロッカーの有効性が低下すると仮定する。本明細書で開示される研究の目的は次のとおりである：（１）糸球体濾過を介して腎臓に高い酵素活性を保持する最短のマウス及びヒトＡＣＥ２タンパク質断片を生成するために、インビボでのアンジオテンシンＩＩ分解に対する効果を評価し、血圧への影響と、慢性的な使用に十分な量でそれらを浄化及び生成すること；これは、１－６１９及び１－６０５と呼ばれる短いａｃｅ２トランケートですでに大部分が達成されていえる；（２）初期ＤＫＤのマウスモデルにおける短いｒＡＣＥ２トランケートの腎保護効果を評価すること；（３）タンパク質融合技術を使用して最短ＡＣＥ２トランケートの作用持続時間を延長し、ＤＫＤ単独及びＡＣＥ阻害剤と組み合わせたマウスモデルでの腎保護作用を調べること。我々の最大の目標は、既存のＲＡＳブロッカーに有利な方法でＤＫＤと戦うのに効果的な、半減期が延長された酵素的に活性なより短いＡＣＥ２タンパク質を開発することである。さらに、これらのより短いＡＣＥ２タンパク質は、特に全身性強皮症、悪性高血圧症、心臓肥大、特発性肺線維症など、ＲＡＳが過活性している他の状態についてテストされる。

【0076】

これまでの研究の概要
これまでの我々の研究は、腎疾患を治療するためにＡｎｇ ＩＩ分解を増加させる方法としてＡＣＥ２増幅を達成することに焦点を合わせてきた３。概念実証として、共同研究者であるケビン・バーンズ博士と彼のグループによって生成された足細胞特異的トランスジェニックマウスを使用して、ＳＴＺ誘導性ＤＫＤ ４に対する糸球体ＡＣＥ２過剰発現の効果を調べた。このポドサイト特異的トランスジェニックマウスでは、糸球体内のＡＣＥ２発現がわずかに増加（２～５倍）した。それにもかかわらず、糸球体に制限されたＡＣＥ２活性のこの比較的小さな増加は、ＤＫＤ ４のＳＴＺモデルにおけるアルブミン尿及びメサンギウム拡大の減少に基づいて有意な腎保護を付与するのに十分であった^４。内因性ＡＣＥ２を増幅する方法として、小分子化合物（１－［（２－ジメチルアミノ）エチルアミン］－４－（ヒドロキシエチル）－７－［（４－メチルフェニル）スルホニルオキシ］－９Ｈ－キサンテン－９－オン）（ＸＮＴ）を使用した研究を実施した。これは、最初はＡＣＥ２アクティベーターであると説明されていた。しかし、驚いたことに、ＸＮＴはＡＣＥ２ＫＯマウスのＡｎｇＩＩ誘発高血圧に効果を発揮し、ＡＣＥ２とは独立したメカニズムで機能することを示した^５。さらに、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの結果は、ＸＮＴが血漿Ａｎｇ ＩＩ、Ａｎｇ（１－７）又はＡｎｇ（１－５）レベルを変化させなかったのに対し、Ａｎｇ ＩＩ分解の増強の結果として、陽性対照として使用されるｒＡＣＥ２は、Ａｎｇ（１－７）及びＡｎｇ（１～５）レベルを著しく増加させた。

【0077】

堅牢で明確なＡＣＥ２増幅、及びこれらの化合物の毒性の性質のために、別の推定ＡＣＥ２活性化因子であるＸＮＴ又はＤＩＺＥを使用できなかったので、我々は独自のマウス組換えＡＣＥ２を開発した^６，７。エクスビボ研究では、１０のアンジオテンシンペプチドの同時測定のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、血漿の生理的環境におけるアンジオテンシンペプチドの動態に対するマウス（ｍｒＡＣＥ２）の作用を調べた^７，８。次に、マウスｒＡＣＥ２を、毎日のｉ．ｐ注射又はミニサークルテクノロジーを使用したＡＣＥ２デリバリーによって、急性及び慢性のマウスをコントロール及び糖尿病に投与した^９，１０。ミニウイルスＤＮＡデリバリーは、レンチウイルスデリバリーとは異なり、遺伝子サイレンシングに耐性があるため、インビボでの遺伝子置換戦略の魅力的なプラットフォームである。無傷のマウスＡＣＥ２のｃＤＮＡを円形発現カセットにクローニングし、得られたＡＣＥ２ミニサークルをｉ．ｖ流体力学アプローチを使用してＦＶＢマウスに注射した^１０。ミニサークルによってＡＣＥ２を投与されたマウスは、血圧、血清ＡＣＥ２活性及び血漿Ａｎｇ ＩＩレベルをモニターするために数週間追跡された。数ヶ月のフォローアップの後、Ａｎｇ ＩＩが急激に注入された。ＡＣＥ２で処理したマウスの血漿Ａｎｇ ＩＩの増加は、ビヒクルで処理したマウスと比較して有意に減少した。次に、ミニサークル送達によりＡＣＥ２で前処理したマウスにＳＴＺで糖尿病を誘発した。２６週間のフォローアップで維持された血清ＡＣＥ２活性の予想される増加にもかかわらず、尿及び腎臓のＡＣＥ２活性の検出可能な増加はなく、ＳＴＺによって誘発されるアルブミン尿及び糸球体病変の発生は予防されなかった。

【0078】

尿中のＡＣＥ２活性が循環起源か腎起源かをさらに調べるため、マウスｒＡＣＥ２を注入して、ｄｂ／ｄｂマウス及びＣｏｌ４Ａ３－／－マウス、ＣＫＤに関連するＡｌｐｏｒｔ症候群のモデルを制御した^{１０、１１}。ｄｂ／ｍ及びｄｂ／ｄｂマウスに無傷のｒＡＣＥ２を注入すると、血清ＡＣＥ２活性の著しい増加が観察されたが、尿中ＡＣＥ２活性はまったく増加しなかった^１０。したがって、血漿中のＡＣＥ２レベルの増加は、投与された無傷のｒＡＣＥ２の腎臓への送達の欠如のため、最小限のアルブミン尿^１０を有するＳＴＺ又はｄｂ／ｄｂモデルでＤＫＤを改善するのに十分ではないと結論付けた。ＳＴＺ及びＤＫＤの他のげっ歯類モデル及びヒトＤＫＤでは、ＲＡＳは腎臓で局所的に過剰に活性化されるが、循環ではなく、いわゆるレニンパラドックスである。実際、血漿レニン活性レベル、及び外挿Ａｎｇ ＩＩレベルは、糖尿病及びＤＫＤ １２－１６の患者でしばしば減少する。

【0079】

したがって、ＡＣＥ２を腎臓レベルで増加させることができない限り、ＡｎｇＩＩレベルが血漿で増加しない限り、血漿単独でのＡＣＥ２の増幅は限られた治療的役割を有する。そのため、腎臓内でのＡＣＥ２増幅の新しい戦略の設計に取り組んできた。

【0080】

意義
レニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）は、ＤＫＤの病因に広く関与している。循環ＡｎｇＩＩ及び特に局所的に産生されたＡｎｇＩＩは、一連の血行動態及び非血行動態効果を通じて腎疾患を媒介することができる。１６－１６－２３２４－２６。ＤＫＤ患者の腎疾患の進行を遅らせ、タンパク尿を減少させるＡＣＥ阻害剤と他のＲＡＳブロッカーの相対的な有効性は、ＤＫＤの発生と進行にＲＡＳの過剰活動が関与していることのさらなる証拠である。ＡｎｇＩＩ産生を含むグルコースによる腎臓内での局所的なＲＡＳの活性化は、培養された足細胞及び尿細管細胞の細胞レベルでよく実証されている^{２４－２６}。追加の直接的な証拠は、腎臓及びＤＫＤのｅｎｔ歯類モデルからの尿及びＤＫＤ の患者からの尿バイオサンプルにおけるＲＡＳ成分の増加の発見から得られる^{２２、２３、２７－３１}。現在使用されているＲＡＳブロッカーは、重要であるが不完全な保護と可変応答率を提供する^{３２－３５}。したがって、Ａｎｇ ＩＩの形成又は作用の遮断に基づいて既存のアプローチを拡大及び改善するＲＡＳの過剰活動に対抗するための新しいアプローチが必要である。ＡｎｇＩＩの散逸には、いくつかの経路が含まれる（図１）。特に興味深いのは、Ａｎｇ（１－７）の形成をもたらすＡＣＥ２などの酵素によって駆動されるものである^{３６－４３}。また、Ａｎｇ ＩＩからＡｎｇ（１－７）を形成できるＰＲＣＰやＰＥＰなどの他の酵素があるが、一般に、ＡＣＥ２は最高の効率でＡｎｇＩＩをＡｎｇ（１－７）に分解すると考えられている^{６，３６，３７、４２、４３}。したがって、ＡＣＥ２のＡｎｇＩＩの低下とＡｎｇの増加（１～７）の二重効果は、治療上非常に効果的であり、過剰なＡｎｇＩＩを処理する自然な経路を複製する。

【0081】

ヒトの無傷のｒＡＣＥ２は、すでに第１相臨床試験に合格し^４４、米国及びカナダの多施設第ＩＩ相試験で肺損傷に対するｈｒＡＣＥ２の可能性のある利点を調べる臨床試験が進行中であるため、ヒトの環境では安全に見える。しかし、ｒＡＣＥ２のこの形式は、サイズが大きく、半減期が比較的短いため、ＤＫＤなどの慢性疾患の長期治療には適していない。さらに、ＤＫＤにおいて、循環ＲＡＳは通常、過活性ではない^{１３、１５}。我々は、糸球体濾過を介した腎臓への送達を可能にし、臓器組織への浸透を高め、半減期を著しく延長するために、低分子サイズのＡＣＥ２のマウス及びヒト型を開発し、さらなる開発を提案した。ＲＡＳブロッカーよりも有利であり得るｒＡＣＥ２投与の顕著な特徴には、循環及び／又は局所的に腎臓内のレベルが増加した場合のＡｎｇＩＩの継続的な消失が含まれる。注目すべきは、ＡＣＥ阻害剤による治療の開始後、持続的かつ顕著なＡＣＥ抑制にもかかわらず、血漿ＡｎｇＩＩレベルは正常に戻るか、通常よりもさらに増加することである。これは、ＡＣＥ又はＡｎｇ ＩＩエスケープ現象と呼ばれる^{４５～６４}。ＡＲＢ遮断薬を用いると、ＡＴ１受容体の遮断の結果として、この治療の開始からＡｎｇＩＩのレベルが反応的に増加し、上昇したままである^６５。ｒＡＣＥ２投与の特徴的な特徴は、ＡｎｇＩＩレベルの低下と同時に、臓器保護ペプチドであるＡｎｇ（１－７）が形成されることである^{６６－７０}。継続的なＡｎｇＩＩ分解によりＡｎｇＩＩレベルの増加を完全に防ぐ必要があるため、ＡＣＥ２投与に基づく療法は既存のＲＡＳブロッカーよりも生理学的であり、おそらくより効果的であると仮定する。短いｒＡＣＥ２は、単独で、又はＡＣＥ阻害剤又はＡＲＢと組み合わせて使用できる。上記のＤＫＤ、ＣＫＤ、肺線維症、及びその他の状態で過活性している腎臓ＲＡＳ経路のダウンレギュレーションに向けられた新しいｒＡＣＥ２生物学的製剤は、臨床使用のために迅速に試験することができ、治療の「迂回力」を構成するべきである。

【0082】

革新
無傷のＡＣＥ２は、１００～１１０ｋＤａの比較的大きなサイズを有しており、我々の実験研究及び理論的考察によれば、糸球体濾過を介した通過による腎臓へのその送達が妨げられる。これは、糸球体の透過性が大きく変化していない場合に、早期にＳＴＺ誘導性のＤＫＤを治療するための潜在的な使用のための無傷のＡＣＥ２の重要な制限であることを示した。ここでは、糸球体濾過により腎臓に送達可能であるため、局所ＲＡＳ過活性を直接制御するために管状内腔にアクセスできるＡＣＥ２の短いフォームを開発及び試験することを提案する。腎臓の近位遠位及び集合尿細管の先端境界に豊富なＲＡＳがあり、これはＡｎｇ ＩＩの腎作用の多くを媒介する^{７１－７８}。化合物の糸球体濾過には、いくつかの障壁が含まれる：最初に内皮層、糸球体基底膜、最後に有足細胞の足の突起^７９。最近の研究では、アルブミン尿への定量的寄与における近位尿細管の役割が再検討された^８０。アルブミンの濾過は、以前に信じられていたよりも大きく、これは、その再吸収によりアルブミン尿を減少させる近位尿細管の役割の増加を決定することが示された^{８０－８５}。明らかに、分子量６６ｋＤ（５８５アミノ酸）のアルブミンは負に帯電しているにもかかわらず、生理学的条件下で糸球体透過性の穏やかな変化でさえもある程度濾過される^{８０－８３}。

【0083】

外挿により、分子量が７０ＫＤａ以下の短いＡＣＥ２トランケートもフィルター処理できるべきである。この仮定に従って、サイズが６９－７１ｋＤａの２つの最近生成された短いＡＣＥ２タンパク質（すでに配列決定、生成、精製された２つのプロトタイプコンストラクト）が、ＡＣＥ２遺伝子欠損マウス及びＳＴＺ－初期ＤＫＤのモデルにおいて濾過可能である。血漿中の融合タンパク質の半減期を延長する異種タンパク質のアミノ酸配列に融合したアミノ酸配列を含む融合タンパク質を作成することにより、血漿中の半減期を延長する。異種タンパク質のアミノ酸配列は、特に腎尿細管細胞によるタンパク質異化を回避する際に、短いＡＣＥ２アミノ酸配列のインビボでの安定性を促進するために利用される^{８６～９１}。融合タンパク質の設計は、腎尿細管の再吸収が別々の受容体活性を通る２つの異なる経路に従うという原理に基づいている。メガリン及びキュビリンに親和性を有するこれらのタンパク質は、典型的にはリソソーム分解に向けられている^{９２－９５}。対照的に、アルブミン及び免疫グロブリンなどの特定の血漿タンパク質は、ＦｃＲｎ として知られるリサイクルのための代替受容体に対する自然な親和性により、腎異化作用から大部分は免れている^{７９、９３、９６－１００}。これらの受容体は、腎尿細管上皮、有足細胞及び内皮細胞の頂端表面に豊富に発現している^７９。ＡＣＥ２トランケートに融合したＦｃＲｎに対する高親和性タグを有する融合タンパク質を作成することにより、ＡＣＥ２トランケートの半減期を延長することができる。融合タグは、組織の浸透／組織への取り込みを促進し、インビボでの安定性を促進し、そのため半減期を延長するため、貧血の人が自分で注射するのとほぼ同じ方法で、毎週又は隔週のスケジュールで患者の皮下又は毎週隔週投与に適している。腎臓に加えて、Ｆｃ融合後、短いＡＣＥ２の吸入による送達のポータルとして肺をターゲティングできる。実際、肺の上皮におけるＦｃＲｎの発現のために、Ｆｃタグ付きタンパク質がこの目的に興味深いことが知られている^１４８。例えば、Ｆｃと融合したＥＰＯなどの大きなタンパク質の肺の上皮バリアを介した、ＦｃＲｎ経路であるアクティブなキャリアシステムを活用する送達が報告されている^１４９。

【0084】

腎臓近位尿細管における豊富なＲＡＳ成分及びそれらの受容体の存在、及び一般にこのシステムの過剰活性は、ＤＫＤの発達及びＣＫＤへの進行に寄与することが知られている^１７。しかし、提案された腎臓ＲＡＳへの標的アプローチは、他の腎外組織及び循環全体が短いＡＣＥ２の投与の恩恵を受けないという意味ではない。血漿中のＡｎｇ ＩＩが上昇している状況では、短いＡＣＥ２はそれを消散させ、Ａｎｇ １－７を形成し、血圧を下げるのに役立つ。Ｆｃと結合した無傷のＡＣＥ２を使用した予備研究では、急性Ａｎｇ ＩＩ誘発性高血圧後の血圧低下効果が持続することで示されるように、作用期間が少なくとも７日間まで印象的な増加を示す（公開用に提出）。しかし、血圧と血漿Ａｎｇ ＩＩが増加しない状況では、安全上の理由から、ＡＣＥ２を増加しても血圧が低下しないか、血圧が最小限に低下するだけであることが利点となる。生物製剤の「バイオベター」形態は、創薬分子を取得し、その中に特定の変更を加えてそのパラメーターを改善することにより治療効果を改善し、より効果的で、投与頻度を少なくし、及び／又は耐容性を向上させることを含む^８７。要約すると、腎臓内のＡｎｇ ＩＩからＡｎｇ（１－７）への変換を増加させる方法として、糸球体濾過を介して腎臓にアクセスし、インビボ半減期を延長したｒＡＣＥ２の短い形態を構築することを提案する。私たちの知る限り、これはＤＫＤを治療するためにＲＡＳを直接標的とするために大きな分子が投与されるということである。この新規バイオロインは、進行性ＤＫＤで効果的であるが、糸球体透過性に中程度の変化のみが存在し、ＲＡＳが腎臓レベルで過活性であるが循環ではない場合、大部分のげっ歯類モデル及びヒトＤＫＤにおいてしばしば生じる状況では、ＤＫＤの初期段階でも有効である必要がある^{２３－２５、２７－３０、１０１}。前述のように、短いＡＣＥ２トランケートは、糖尿病及び非糖尿病の慢性腎疾患、急性腎不全及びその予防、慢性腎臓病、糸球体腎炎、重度の高血圧、強皮症及びその皮膚、肺、腎臓及び高血圧の合併症、悪性高血圧、腎動脈狭窄に続発する腎血管性高血圧、特発性肺線維症、肝硬変患者などの肝線維症、大動脈瘤、心臓の線維化とリモデリング、左心室肥大、及び急性脳卒中を含む状態の治療においてクオカ的であることが期待される。

【0085】

アプローチ
目的１．高い酵素活性を保持し、糸球体濾過を介して腎臓に送達可能な最短のマウス及びヒトＡＣＥ２タンパク質フラグメントを生成し、アンジオテンシンＩＩ分解に対する影響を評価し、慢性的な使用のために、比較的大量に精製及び生産することである。

【0086】

背景及び予備データ：マウスに与えられた無傷のｍｒＡＣＥ２は、外因性Ａｎｇ ＩＩを効果的に分解し、Ａｎｇ（１～７）を形成し、数ヶ月間マウスに与えられたとき免疫原性ではないことを示している。また、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ及びＳＴＺ処理マウス）では、尿ＡＣＥ２が増加することも発見した^９。尿中のＡＣＥ２活性の増加が、部分的には循環の起源であるかどうかを調べるために、無傷のｒＡＣＥ２（１－７４０ＡＡ）を注入して糖尿病マウスを制御した^９。循環（血清）ＡＣＥ２活性の著しい増加にもかかわらず、尿中ＡＣＥ２活性の増加はなかった。したがって、我々及び他の者は、尿ＡＣＥ２の供給源は尿細管由来であり、近位尿細管の頂端膜からの脱落に起因する可能性が高いと結論付けた^９１０８。糸球体毛細血管壁の主な機能は、濾過が行われている間、アルブミン及び他の血漿タンパク質の糸球体通過を選択的に制限することである^１０２。約７０ｋＤａより小さいタンパク質及びペプチドは、より大きいタンパク質よりも濾過される可能性が高い^{１０３、１０４}。一般に、全体的な負の変化を伴うタンパク質は、腎臓の負に帯電した基底膜による反発のため、中性ポリペプチドよりも濾過されにくい^{１０５－１０７}。上記のように、正常なマウス及びＳＴＺ誘発ＤＫＤを有するマウスへの無傷のＡＣＥ２の注入は、これが通常濾過できない大きなタンパク質（＞１００ｋＤａ）であるため、尿ＡＣＥ２活性を増加させることができなかった^１０。Ｃｏｌ４Ａ３－／－マウス、大きな糸球体透過性欠損を伴うアルポート症候群のモデルでは、尿中ＡＣＥ２活性が著しく増加した^１０。以下では、げっ歯類７のＳＴＺ及びＤＫＤの他のモデルで通常見られるＡＥＲの軽度の上昇を伴うマウスの糸球体濾過を介して腎臓に送達できるＡＣＥ２の短い形態の生成を示す^７。

【0087】

この全体的な目標に向けた我々の探求は、ウエスタンブロットによる、ＡＣＥ２欠損マウスには存在しないため、ＡＣＥ２特異的である２つの尿中ＡＣＥ２免疫反応性バンドの同定から始まった^９。約１１０ｋＤの１つのバンドは、無傷のＡＣＥ２の分子量に対応し、ＡＣＥ２が豊富に発現している腎臓の頂端尿細管膜からの脱落生成物である可能性が高い^{９、７１、７２}。７５ｋＤのバンドの尿の存在は、このバンドが１１０ｋＤａのＡＣＥ２バンドの分解産物であることを示唆した（図２）。１１０ｋＤａバンドのみが検出された新鮮な全腎臓ライセートを３７℃で２４時間インキュベートすると、この概念と一致し、７５ｋＤａバンドが現れたが、ＡＣＥ２ １１０ｋＤバンドは徐々に減少した（図２）。

【0088】

尿中の２つの自然発生バンドを分離する限外濾過実験により、タンパク質量の補正後、７５ｋＤａバンドのＡＣＥ２活性レベルが１１０ｋＤバンドのレベルよりも高いことがさらに明らかになった（図３）。次に、ＡＣＥ２ＫＯ腎臓ライセートにおける無傷のｒＡＣＥ２のインキュベーション時間を延長し（腎臓自身のＡＣＥ２からの影響を排除する方法として）、これにより７５ｋＤバンドの形成だけでなく、より短い約６０ｋＤ ＡＣＥ２の形成がもたらされました有意なＡＣＥ２活性を有するバンドのインキュベーション時間も延長した（図４）。これらの発見から、無傷のｒＡＣＥ２は、元の１００－１１０ｋＤａの無傷のｒＡＣＥ２タンパク質よりもさらに高い比酵素活性を保持又は有する約６０ｋＤａの断片に短縮できると結論付けた（図４）。このプロセスは、ＡＣＥ２を短くして酵素的に活性な断片に短縮できるプロテアーゼによって媒介される必要がある。

【0089】

提案された研究で説明されたアプローチを使用して、我々はすでに、活性である、様々なバージョンのＡＣＥ２欠失変異体、特に「１－６１９」及び「１－６０５」と呼ばれるＡＣＥ２ Ｃ末端欠失変異体を生成及び試験した。一方、より短い「１－５２２」ＡＣＥ２欠失変異体は活性を欠損している。ＡＣＥ２ １－６０５の理論分子量は６９ｋＤａ（Ｅｘｐａｓｙ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによる）であり、酵素活性は無傷のＡＣＥ２とほぼ同じ（無傷のｒＡＣＥ２の１０６±５％）であるのに対し、１－６１９は無傷のＡＣＥ２（１－７４０ＡＡ）よりもさらに活性が高い（１４４±７％、ｐ＜０．０１）。急性注入のために、これらの２つのトランケート（１～６１９及び１～６０５）を少量生成し、高度に精製することができました（図５Ａ）。１－６１９及び１－６０５のｉ．ｖ．注入により、遺伝的ＡＣＥ２欠損マウスの尿中ＡＣＥ２活性が著しく増加した。これらのＡＣＥ２欠損動物では、１－６０５の注入後、血漿ＡＣＥ２活性が著しく増加した（９０６±９４ ＲＦＵ／ｕｌ／ｈｒ）。Ａ６１９を注入したＡＣＥ２ＫＯからの尿のウエスタンブロットは、約７０ｋＤのＡＣＥ２免疫反応性バンドを明らかにした（図５Ｂ）。

【0090】

ＳＴＺで糖尿病にされ、１２～１５週間後に研究されたＡＣＥ２ ＫＯマウスで追加の研究が行われた。両方のＡＣＥ２トランケートを注入して、このモデルの尿でも活性を回復できることをさらに実証した。どちらのトレンケートも、尿ＡＣＥ２活性の明らかな増加をもたらした（図６Ａ）。前の実験のように、１－６１９で見つかった活性は１－６０５で観測されたものよりも高かったが、おそらく観測数が少ないために統計的有意性を達成できなかった。ＳＴＺで糖尿病にされたＷＴマウスでは、尿ＡＣＥ２はすでにかなりのものであった（図６Ｂのスケールを６Ａと比較）。ＡＣＥ２の存在は、管状脱落の結果である^{９，１０８}。内因性ＡＣＥ２の存在のために、我々はより高い用量のＡ１－６１９（４μｇ／ｇ ＢＷ）を使用し、尿に通常存在するものを超える増加を示した（図６Ｂ）。

【0091】

さらに、新しいＡＣＥ２トランケートが糸球体濾過と腎臓への取り込みに適しているのに対し、無傷のＡＣＥ２はそうではないことを実証するために、高度な放射性核種イメージングを使用した。図７に示されるように、ｉ．ｖ．注入後１時間で、Ａ６１９の注入後、同じ用量の無傷のｒＡＣＥ２の注入後ではなく、両方の腎臓の皮質領域に顕著な取り込みを伴う腎造影図がある。

【0092】

活性に関して、本発明者らは、ＡＣＥ２（１－６０５）にＡｎｇＩＩボーラスを注入することによりＡｎｇＩＩを代謝するＡＣＥ２（１－６０５）の能力も評価し、このペプチドの急速な急増をもたらした。注入後５分で、Ａｎｇ ＩＩのレベルは、非注入マウスよりも１－６０５注入マウスで著しく低かった（１０４±３３対３９９±４５ｆｍｏｌ／ｍＬ、ｐ＝０．００７）。このＡｎｇ ＩＩ低下効果は、無傷のＡＣＥ２を使用して我々が以前に示したＡｎｇ ＩＩ低下効果に類似している^{６，７，１０}。別の実験では、Ａｎｇ ＩＩボーラスと一緒にＡＣＥ２トランケートを注入した後、インビボＡＣＥ２活性のマーカーとして血圧回復を評価した。図８に示されるように、２つのＡＣＥ２トランケートの投与は、Ａｎｇ ＩＩ誘発性高血圧からの初期回復を強化した。ＢＰ回復に対する１－６１９の効果は、１－６０５の効果よりも持続しているように見える（ＡからＢを比較）が、両方のトランケートには有意な効果があって（それぞれｐ値＜０．０２及び＜０．０４）。要約すると、新しいＡＣＥ２トランケートは、注入されたＡｎｇ ＩＩを低下させ、Ａｎｇ ＩＩのボーラス投与後の血圧回復を高めるという点でインビボで有効である。さらに、ＡＣＥ２トランケートは十分に小さいため、糸球体濾過を介して腎臓に送達できる。

【0093】

提案された研究。我々の主な目的は、治療目的に使用できる高レベルのＡＣＥ２活性を有する短いＡＣＥ２断片を構築することである。その全長形態では、ＡＣＥ２タンパク質は、細胞外^１０９ドメイン（ＡＡ １－７３９）、膜貫通領域（ＡＡ ７４０－７６８）、及び細胞内尾部（７６９－８０５）を含む８０５アミノ酸（ＡＡ）Ｉ型膜貫通タンパク質（１１０－１２０ｋＤａ）である^{１１０、１１１}。無傷のＡＣＥ２の細胞外部分（１－７４０ＡＡ）は触媒ドメインを含む。タンパク質分解によって得られたアクティブな短いＡＣＥ２タンパク質のサイズを複製するために、Ｃ末端とＮ末端の切断により、様々な長さの一連のＡＣＥ２欠失変異体を生成する。これらの変異体は、ＨＥＫ２９３細胞によって培地に発現され、ＡＣＥ２活性は比色基質Ｍｃａ－ＡＰＫ－Ｄｐｎを使用して測定される^７。完全な細胞外ドメイン（１－７４０ＡＡ）を含む無傷のｒＡＣＥ２が陽性対照となる。短いＡＣＥ２変異体を生成し、Ｃ末端とＮ末端のトランケーションにより、ＡＣＥ２のサイズを縮小し、酵素活性を保持する１－６１９及び１－６０５より小さいトランケートを特定できると予想する。手順の目標は、酵素活性を保持している最短のＡＣＥ２断片の境界を決定することである。腎臓溶解物の研究からの我々の結果は、約６０ｋＤａのｒＡＣＥ２の短縮型がまだ活性であることを示唆している（図４）。短いａｃｅ２のｃＤＮＡは、そのままの可溶性マウスＡＣＥ２（７４０ＡＡ）のｃＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲ増幅によって生成される。ＡＣＥ２を徐々に短くするために（一度に１０ＡＡ、図９）、増幅する短いａｃｅ２ ｃＤＮＡの長さを決定し、発現ベクター（つまりｐｃＤＮＡ３．１）と互換性のある特定のプライマーを使用する。増幅されたｃＤＮＡの配列は、変異がないことを確認するために配列決定によって検証される。

【0094】

本発明者らは、Ｃ末端の最初の一連の欠失を完了し、活性酵素の境界を同定した（図９）。Ｎ末端に焦点を当てた２番目のシリーズの開始テンプレートとして、まだ活性を保持しているシリーズの最も短い構成が使用される。ここでは、Ｎ末端ＡＣＥ２にはＡＣＥ２の分泌のためのシグナルペプチド（ＳＰ）配列（ａａ １－１８）があり、その間に酵素もグリコシル化されるため、触媒活性に重要な自然な折り畳みに適応する。したがって、Ｎ末端のＳＰセグメントは、Ｎ末端の２番目の一連の欠失で保持される。それを行うために、部位特異的変異誘発によりＳＰ配列の後に新しいＮｏｔＩ制限酵素部位が導入され、Ｎ末端のその後の欠失のためのプライマーはすべて、意図された構築物のクローニングを促進するＮｏｔＩ適合性「オーバーハング」を有する（図９）。予備研究では、ｐｃＤＮＡベクターを介したトランスジーントランスフェクションシステムを使用して、ＨＥＫ２９３細胞から排出用のＳＰをすべて含むＡＣＥ２断片を発現させた。ＡＣＥ２活性は、培地から直接測定される。さらに、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン全体に対して作成されたポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより、導入遺伝子が検出され、分子サイズが確認される。

【0095】

過剰発現した短いＡＣＥ２タンパク質の酵素活性を検証するために、ａ）合成蛍光発生ＡＣＥ２基質であるＭｃａ－ＡＰＫ－（Ｄｎｐ）^７及びｂ）その主要な天然基質であるＡｎｇ ＩＩ（１－８）Ａｎｇ（１－７）を形成する（それぞれのＥＬＩＳＡ^７により測定）。短いｒＡＣＥ２断片の相対的な酵素効力は、同等のピコモル量の無傷のｒＡＣＥ２（７４０ＡＡの長さ）と比較して決定され、ベンチマークとして使用される。短いＡＣＥ２断片は、自分で作成した１０－Ｈｉｓタグを使用して、Ｃ末端のｐｏｌｙ－Ｈｉｓタグを発現するように設計される。Ｈｉｓタグにより、先に行ったように、Ｎｉ^２＋セファロースでのアフィニティー精製とそれに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ ３００でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＡＣＥ２断片の迅速かつ効率的な精製が可能になる。短いＡＣＥ２断片は、いくつかの組換えタンパク質をすでに過剰発現している哺乳類細胞株（ＨＥＫ２９３）で安定して発現する。このアプローチを使用して、数週間から数ヶ月以内に、十分な量の２つのトランケート（１～６１９及び１～６０５）（約１０ｍｇ）を生成及び精製し、上記のマウスでインビボ試験を実行できた。

【0096】

短いトランケートの糸球体濾過による腎臓送達は、尿ＡＣＥ２活性の測定のための急性注入により、及び１－６１９の予備データに記載されている放射化学研究により実証される。新しい活性なマウス「ショートＡＣＥ２」の配列がわかったら、次に対応するヒトショートＡＣＥ２タンパク質を生成する。

【0097】

ヒトの短いＡＣＥ２タンパク質の生成のために、我々はすでに完全な長さのヒトインタクトＡＣＥ２ ｃＤＮＡを有する。タンパク質は、以前にマウス無傷の１１０ｋＤａ ｒＡＣＥ２で行ったように、組換え発現及び精製される^７。短い形式のヒトＡＣＥ２の酵素活性は、インビトロ及びインビボで次のように試験される：過剰発現したヒトＡＣＥ２トランケートのＡＣＥ２活性は、（Ｍｃａ－ＡＰＫ－（Ｄｎｐ）基質^７とＡｎｇ ＩＩ（１－８）^７を用いて）培地から直接測定される。ウエスタンブロット分析を使用して、分子サイズを検証する。アペリン１３のような他の既知のＡＣＥ２基質を切断する短いＡＣＥ２の能力は、実験室で日常的に行われているアッセイを使用して、インビトロ及び血漿ならびに腎臓溶解物でも試験される^１１２。インビボでのＡｎｇ ＩＩ分解及びＡｎｇ ＩＩ誘発性高血圧に対する影響を調べるために、Ａｎｇ ＩＩボーラス（０．２μｇ／ｇ ＢＷ）の前にマウスに短いｒＡＣＥ２（１μｇ／ｇ ＢＷ）を投与し、我々によって以前に説明されたプロトコルを使用する^６，７。短いｈｒＡＣＥ２トランケートの相対的な効力は、標準として無傷のｈｒＡＣＥ２（７４０ＡＡ）の同等物との比較によって決定される。

【0098】

予想される発見：ＡＣＥ２の結晶構造は、酵素の触媒コアがＡＡ残基１４７－５５５に及ぶことを示唆しているため^{１１０、１１１}、酵素活性の最小長さ要件には少なくとも１４７－５５５ＡＡが含まれると考えられる。６１９トランケートは非常に活性であり、そのままのＡＣＥ２よりもさらに活性である。これまでに生成した最短のＡＣＥ２タンパク質は６０５ＡＡの長さで、酵素的には無傷のＡＣＥ２と同じくらい活性があります。（上記のデータを参照されたい）。したがって、これらの短いＡＣＥ２の分子サイズは切断されます：１－６１９（７１ｋＤ）及び１－６０５（６９ｋＤ）は、それらの腎保護能を調べるのに十分な低さである。両方のＡＣＥ２トランケートは、糸球体濾過の影響を受けやすく（図５ａ、６ａ、６ｂ、７）、インビボで活性であり（図８）、したがって、以下の目的２に記載の研究で使用される。しかし、ＡＣＥ２トランケートの半減期を延ばすことを目的としたタグとの融合には、低分子量のＡＣＥ２トランケートでさえも好ましく、その結果、融合タンパク質は糸球体濾過に十分な分子サイズを有する。これは、目的３で提案されている研究に関連している。ＡＣＥ２を短縮する主な目標は糸球体濾過を可能にすることであるが、血液凝固酵素などの他のシステムに関与するプロテアーゼ及びペプチダーゼから、それらの配列における「余分な長さ」は、活性を最適化するには、それらの配列を削除する必要があることは公知である。同様に、予備的なタンパク質分解切断の研究に基づいて、酵素活性を保持する６０５ＡＡ（約６０ｋＤａ）よりも短いＡＣＥ２の形態を生成できると予想される。

【0099】

マウスのｒＡＣＥ２と同様に、ヒトの短いｒＡＣＥ２については、活性が高くないとしても、天然の１１０ｋＤａのＡＣＥ２よりも活性が高いと予想される。短いＡＣＥ２のヒトとマウスの両方が、Ａｎｇ ＩＩを切断してインビトロ及びエクスビボでＡｎｇ（１－７）を形成するのに同様の効力を持つと予想される。低分子量のヒトＡＣＥ２が究極の治療目標である。しかし、マウスｒＡＣＥ２投与時に以前に示されたマウス抗ヒトＡＣＥ２抗体を中和する問題を回避するために、マウスの短いＡＣＥ２の治療効果を調べるために、ＤＫＤのマウスモデルで慢性試験を実施する（以下の目的２及び３を参照）。

【0100】

目的２．初期ＤＫＤ及び他の適応症のマウスモデルにおける短いｒＡＣＥ２トランケートの保護効果を評価することである。

【0101】

背景及び予備データ。ミニサークル送達によるＡＣＥ２増幅又は毎日のｉ．ｐ．注射による無傷のｒＡＣＥ２の投与は、ＤＫＤ １０のＳＴＺモデルにおいて、血圧、アルブミン尿又は腎臓組織に対して検出可能な影響を及ぼさなかった。初期のＤＫＤのこのモデルでは、血漿Ａｎｇ ＩＩレベルとＢＰは増加しなかった。対照的に、高血圧症とＡｎｇ ＩＩ過剰のトランスジェニックレニンモデルでは、Ｆｃと融合した修飾ｒＡＣＥ２の投与が血漿Ａｎｇ ＩＩ、血圧及びアルブミン尿に顕著な効果があることを発見した（Liu et al. ASN abstract SA-PO521, 2016）。

【0102】

両方のモデルで無傷のＡＣＥ２を投与した後、腎臓／尿中ＡＣＥ２の増加がない場合、これら２つのモデルの差は、１つのモデルでは循環ＲＡＳが著しく過剰に作用する（レニントランスジェニック）とう事実に起因し得て、ＳＴＺモデルではない。これは、血漿Ａｎｇ ＩＩレベルの違いによって証明される（レニンモデルで増加し、ＳＴＺモデルで正常）。レニントランスジェニックにおけるＡＣＥ２－Ｆｃ投与によるＡＣＥ２の血漿レベルの増加は、ベースラインで上昇した血漿Ａｎｇ ＩＩレベルを著しく低下させた。対照的に、無傷のＡＣＥ２は、ベースラインでＳＴＺモデルで上昇しなかったＡｎｇ ＩＩをわずかに低下させただけであった^１０。他の重要な考慮事項は、ＤＫＤのさまざまなモデルにおける糸球体透過性の変化の程度である。無傷のＡＣＥ２をＳＴＺ又はｄｂ／ｄｂマウスに投与しても、尿中ＡＣＥ２活性及びＡＣＥ２タンパク質はまったく増加しない^１０。さらに、無傷のｒＡＣＥ２又は無傷のｒＡＣＥ２－Ｆｃの注入はＷＴマウスでは尿ＡＣＥ２を増加させないが、Ｃｏｌ４ａ３－／－マウスでは尿ＡＣＥ２を顕著に増加させる。ＡＣＥ２腎臓送達の糸球体透過性の変化の重要性と一致して、最近の研究では、過活性ＲＡＳ及び重タンパク尿を伴うＡｌｐｏｒｔ症候群のモデルであるＣｏｌ４ａ３－／－マウスへのミニポンプによって与えられた無傷のｒＡＣＥ２による腎損傷の減衰が示された^{１１３－１１５}。

【0103】

この目的において、我々は、短いＡＣＥ２タンパク質、１－６１９及び１－６０５、及びＡｉｍ １研究中に生成された最も短いものが、全身ＲＡＳが存在する初期ＤＫＤの様々なモデルにおいて無傷のＡＣＥ２よりも良好に機能することを実証する予定である。全身ＲＡＳは過剰活性ではない。短いｒＡＣＥ２を使用して腎臓内のＡｎｇ ＩＩの分解を強化すると、Ａｎｇ ＩＩの蓄積を局所的に防ぎながらＡｎｇ １－７の形成を促進するという特有の利点が得られると予測する。これは、糸球体濾過を介して腎臓に送達可能な短いＡＣＥ２トランケートの腎保護の提案されたメカニズムである。この見解では、ＡＣＥ２はＡｎｇ ＩＩを消散させるが、その形成は相反することなく続くが、過剰な蓄積の防止、したがってその受容体、すなわち糸球体及び尿細管細胞の活性化の減衰が防止される^{７７，１１６－１１８}。したがって、炎症性及び線維化促進性経路の付随する刺激、ならびにＡｎｇ ＩＩ駆動型の先端ＮＨ３トランスポーターによるナトリウム保持は、注入された短いＡＣＥ２によって弱められる傾向がある。実際、腎尿細管細胞の先端境界に多くのＲＡＳ成分が存在し、ＡＮＧ ＩＩの局所的な形成は、ＤＫＤにおける過活性腎臓ＲＡＳの主な原因である^１１９。また、注目すべきは、高血糖環境で過活性である既知の炎症誘発性経路及び線維化促進経路の多くは、過剰なＡｎｇ ＩＩ及び高血糖によって増幅され、ひいてはＲＡＳ １２０－１２６を活性化するように見える。したがって、腎臓ＲＡＳをダウンレギュレートする療法としてＡＣＥ２の理論的根拠を導き出す。

【0104】

表１に、様々な程度のアルブミン尿によっておよそ推定される糸球体透過性の差のスペクトルを持つＤＫＤの選択モデルを示す。これらのモデルで、循環中のＲＡＳが活性であるかどうかに関する情報もリストされている。これらのすべてのモデルで腎臓レベルでの活性的ＲＡＳの証拠があるが、レニンＡｋｉｔａマウスのみが過活性循環ＲＡＳを有する^１２７。

【0105】

【表2】

【0106】

提案された研究。ＤＫＤの以下のモデルは、オスとメスの両方のマウスと、年齢と性別が一致したコントロール（ｎ＝１０／グループ）で研究される（初期研究は、糖尿病誘発のためにＳＴＺで処理されたマウス^１２８及びｄｂ／ｄｂマウス^{９、７１、１２９}で行われる）。これらのモデルではアルブミン尿は最小限である（表１）。より高度なＤＫＤ及びより重いタンパク尿を伴うＤＫＤの他のモデルを調べるために、レニンＡｋｉｔａマウス^１２７及び（ｅＮＯＳ（－／－）ｄｂ／ｄｂマウス^{１３０，１３１}で研究が行われる。後者のモデルは、内皮特異的ＮＯＳ－３アイソフォーム（ｅＮＯＳ）を欠いている^{１３０，１３２}。重要なことに、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるｅＮＯＳの欠失は、ｄｂ／ｄｂマウスと比較して腎障害の加速を誘発し、ヒト糖尿病性腎症をより想起させる^１３０。ヒト２型糖尿病でよく見られるように、ｅＮＯＳ（－／－）ｄｂ／ｄｂマウスでは、血圧が上昇し^{１３０、１３１}、進行性ＮＯ調節不全がある^１３３。興味深いことに、「トリプルセラピー」（ヒドララジン、レセルピン、ヒドロクロロチアジド）による血圧コントロールは、糖尿病性病変の進行を遅くさせるが、カプトプリルによるＲＡＳ遮断は、アルブミン尿、糸球体硬化症、尿細管間質性損傷のマーカー、及びマクロファージ浸潤のより深い減少につながる追加の利点を提供した^１３１。したがって、このモデルは、短いＡＣＥ２タンパク質の有益な効果の推定と、ＲＡＳを介した疾患の進行の有害な影響の結果を改善する能力を確立／反証するために特に有用である。このモデルでは、レニン及びアンギオテンシンＩＩのレベルによって決定されるように、循環ＲＡＳは過活性ではない^１３０。したがって、このモデルでの短いＡＣＥ２トランケートの腎保護効果は、腎臓内でのＲＡＳのダウンレギュレーションと、発生する可能性のあるＢＰ低下の影響に大きく起因するべきである（予想される結果を参照）。

【0107】

ＤＫＤ（ｎ＝１０／群）を有するマウスにおける短縮ＡＣＥ２の長期腎効果は、２つのアプローチを使用して検査される：１）ミニサークル（ＭＣ）ＤＮＡ送達を使用する短いＡＣＥ２の増幅；２）浸透圧ミニポンプを使用した短いｒＡＣＥ２タンパク質送達。これらの治療法は、糖尿病（ＳＴＺ）の誘発前又は糖尿病の自然発症マウスの最も早い時点（８週齢）で始まる：ｄｂ／ｄｂマウス、（ｅＮＯＳ（－／－）ｄｂ／ｄｂ及びレニンＡＶＶ Ａｋｉｔａ。短いマウスＡＣＥ２（１－６１９及び１－６０５）のＰＣＲ生成ｃＤＮＡは、以前の無傷のＡＣＥ２－Ｍｃで行われたように、ヒトユビキチンプロモーターとウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下でｐＭＣ ＢＥＳＰＸベクターにクローニングされる^１０。環状発現カセット及び結果として生じる短いＡＣＥ２ミニサークルは、以前に報告されたように、無傷なＡＣＥ２を用いて、マウスに投与される（３０μｇ／マウス）（ＰＢＳの大ボーラス（２ｍＬ）のＰＢＳの尾静脈への単回注射）^１０。その後、２週間後、糖尿病は以前に我々によって説明されたプロトコルを使用してＳＴＺによって誘発される^１０。マウスへの単一のミニサークル投与により、目的の遺伝子の長期発現が持続する。したがって、ＤＫＤに対する短いＡＣＥ２タンパク質の効果を研究するのに完全に適している。この開発は、繰り返し投与する必要なく十分に頑強になるために約３か月かかることがよくある。これは、一度に１０匹の動物を簡単に注射できるため、効率的なアプローチである。代替的かつ補完的なアプローチとして、ｒＡＣＥ２ １－６１９は、ＳＴＺによる糖尿病誘発の１週間前又は他のモデルでは８週齢のマウスに移植された浸透圧ミニポンプによって与えられる。これらの研究は、選択されたモデルで行われ、ミニサークル研究の結果によって導かれる最も腎保護的なＡＣＥ２トランケートで行われる。短いｒＡＣＥ２の管理は、１２～１６週間続く（４週間ごとに交換する２８ｄミニポンプ（Ａｌｚｅｔモデル１００４））。この比較的長い暴露は、腎臓のＡｎｇ ＩＩ過剰を予防し、Ａｎｇ１－７を促進することにより、ＤＫＤが慢性的に予防／減弱することを示す。したがって、両方のペプチドは、以前に記載されているように、血漿、腎臓溶解物、及び尿でＥＬＩＳＡによって測定される^{７、９、１０、１３４}。

【0108】

短いＡＣＥ２が、ＤＫＤと軽度のアルブミン尿の２つのモデル（ＳＴＺ処理マウス及びｄｂ／ｄｂマウス）で腎障害を予防／軽減することを実証しようとする。対照として、ミニサークルに組み込まれた無傷のＡＣＥ２を以前に我々が行ったように投与し、短いＡＣＥ２と比較して有効ではない、又は有効性が著しく低下していることを示す^１０。ＡＣＥ２の両方の形態は、非常に高いレベルの血漿ＡＣＥ２活性を有すると予想されるが、尿ａｃｅ２活性は、短いが完全ではないＡＣＥ２で著しく増加すると予想される。予想される腎保護効果は、以下のパラメーターによって評価される：ａ）光学顕微鏡検査（メサンギウム拡大、細胞充実性を評価するため）^１３５及び糸球体サイズ^１３６；ｂ）ｍＲＮＡ及び免疫染色によるフィブロネクチン及びコラーゲンα１（ＩＶ）^１３７；ｃ）ネフリン免疫染色及び有足細胞数^１３６；ｄ）基底膜１３８の肥厚を評価するための電子顕微鏡検査；ｅ）ＧＦＲ^１０；ｆ）分子炎症マーカー^{８５、１１３、１３６}。一般的なスキームは、１０週齢のＳＴＺによる糖尿病の誘発の２週間後にＭＣ送達により実験生物製剤を投与することからなる。同様に、ｄｂ／ｄｂマウス及びレニンＡＡＶ Ａｋｉｔａマウスでは、１０週齢で注射が開始され、ＡＣＥ２生物製剤は１２週間のフォローアップで同じ間隔で投与される。これらの研究は、ＡＣＥ２増幅が糖尿病による明白な腎障害の前に早期に達成されるため、大部分は予防的である。血圧は、ラジオテレメトリーを使用して研究終了の２週間前に測定される。２２～２４週齢のマウスを犠牲にすることを計画している。この時期には、糸球体肥大と光学顕微鏡によるメサンギウム拡大があり、ＥＭによる基底膜の肥厚を増加させる^{１２７、１３０、１３１、１３９}。フィブロネクチンは、この年齢のＳＴＺ及びｄｂ／ｄｂマウスでもその時に見られる。レニンＡＶＶ Ａｋｉｔａモデルは、強いタンパク尿（表１）及び重度の高血圧（２４週齢で収縮期血圧が１８０ｍｍＨｇより高い）を伴う重度の糸球体病変^１２７を発症する。このモデルの説明はちょうど公開された^１２７。

【0109】

予想される結果及び代替アプローチ：すべてのモデルで短いＡＣＥ２のすべての形態が腎保護的であるのに対し、無傷のｒＡＣＥ２は全身性ＡｎｇＩＩ過剰を伴うレニンＡＡＶ Ａｋｉｔａモデルでのみ有効であると予想される（表２）。

【0110】

【表3】

【0111】

ｅＮＯＳ ｄｂ／ｄｂモデルでは、このモデルでは血漿レニンとＡｎｇ ＩＩのレベルが増加しないため、ＢＰを低下させると、そのままのＡＣＥ２にある程度の保護効果がある場合がある^１３０。治療反応のマーカーには、ＵＡＥ率の低下、糸球体の減弱、メサンギウム拡大による有足細胞数、ＥＭによる糸球体基底膜の厚さ、糸球体コラーゲン及びフィブロネクチン沈着コアの改善（コンピューター化された分析による）^５９、ならびに分子炎症マーカーの減少を含む。腎臓内の尿及びＡＣＥ２活性の増加に効果的な各介入により、腎皮質のＡｎｇＩＩレベルと尿中ＡｎｇＩＩが減少するべきである。後者は、ＤＫＤのＳＴＺ及びｄｂ／ｄｂモデルなど、循環Ａｎｇ ＩＩが増加しない状況での腎内アンジオテンシンＩＩ増加の非侵襲的マーカーである^３１。ＡＣＥ２活性の増加、Ａｎｇ ＩＩの減少が期待される短いＡＣＥ２で処理された動物からの腎臓溶解物のＡＮＧ １－７が増加したが、無傷のＡＣＥ２では処理されなかった。最良の結果を提供し、最短のＡＣＥ２の形式は、目的３の研究に使用される。

【0112】

目的３．タンパク質融合技術を使用して最短のＡＣＥ２トランケートの作用持続時間を増強し、ＤＫＤ単独又はＡＣＥ阻害剤を用いてそれらの腎保護作用を調べることである。

【0113】

背景及び予備データ：非血液常駐タンパク質としてのＡＣＥ２は、数時間の半減期が限られている。（例得た、ｉ．ｖ．注射後のタグなしの短いＡＣＥ２ １－６０５のＴ１／２は約１．３９時間（ｎ＝２））。したがって、目的２の研究では、ＡＣＥ２ １－６０５はミニポンプとＭＣによって継続的に投与された。血中のＡＣＥ２変異体の限られた半減期を回避するために、融合タンパク質アプローチを使用してＡＣＥ２変異体の半減期を延長し、ＡＣＥ２変異体を慢性使用により適したものにする。無傷のＡＣＥ２で非常にうまく機能するアプローチは、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域との融合である（Liu et al. ASN abstract SA-PO521, 2016）。薬物動態研究により、この改変ｒＡＣＥ２（ｒｍＡＣＥ２－Ｆｃ）は、Ｆｃタグを所有するマウスでの作用時間が非常に長く、非タグ付きＡＣＥ２の１時間未満からＡＣＥ２－Ｆｃの７－９日であることが確認された。融合は、ｒＡＣＥ２－Ｆｃと比較してＡＣＥ２の酵素活性を保持した。マウスへの注射後、ｒＡＣＥ２－Ｆｃは長時間作用する血液滞留時間を示し、ｒｍＡＣＥ２と比較してＡＵＣが約１００倍改善された。

【0114】

さらに、ＡＣＥ２とＦｃのこの融合形態は、トランスジェニックモデル又はレニン依存性高血圧における、高血圧の制御と腎障害の改善に非常に効果的である。しかし、サイズが大きいと、完全なＡＣＥ２（分子量、２５０ｋＤａ）よりもはるかに大きいため、糸球体濾過バリアを通過して濾過できなくなる。ｒＡＣＥ２－Ｆｃの単回ｉ．ｖ注射は、１週間以上にわたって、ＡｎｇＩＩによる高血圧のボーラス予防に長期的な効果を示した（Liu et al. ASN abstract SA-PO521, 2016）。

【0115】

ＡＣＥ２－Ｆｃ構築物は非常に大きく（約２５０ｋＤ）、頑強なアルブミン尿のモデル（１７５１±１７２μｇ／ｍｇ）であるレニン－ＴＧマウスの糸球体濾過障壁を通過しない）（表１を参照）。これは、ベースライン及び無傷のＡＣＥ２－Ｆｃ注入後のレニン－ＴＧマウスにおける尿中ＡＣＥ２活性の変化によって実証された（２４．６±４．７対２５．９±６．２ ＲＦＵ／ｕｇ ｃｒｅａｔ／ｈｒ、ｐ＝ＮＳ、ｎ＝５／グループ）。したがって、我々は、半減期を延ばし、さらに濾過可能であり、したがって完全な腎保護作用を発揮できるように、最短のＡＣＥ２トランケートの開発に努める。

【0116】

提案される研究：既に配列された「短いＡＣＥ２」トランケート、１－６１９及び１－６０５は、それらを長時間作用させ、さらに腎臓により濾過可能にするタグと融合するのに十分小さい。我々はすでに１－６０５を連鎖球菌Ｇタンパク質（ＡＢＤ）のアルブミン結合ドメインと融合させた（下記参照）。しかし、融合タンパク質の半減期を延長する異種ドメインを含む融合タンパク質を調製するには、さらに短いＡＣＥ２トランケートが望ましい。したがって、３つの異なるアプローチ（Ｆｃ、単量体ＣＨ３、アルブミン結合ドメインタグとの融合）を使用して、半減期を延長するために、高い酵素活性と最小分子サイズ（目的１で特定）を持つ最短のＡＣＥ２タンパク質を選択する（図１０）。

【0117】

我々はすでにＦｃタグを付けたインタクトＡＣＥ２を作成し、マウスへの注射後の生体内での活性を実証した（上記参照）。しかしながら、Ｆｃ部分（約２５ｋＤａ）は、二量体として自然に存在し、これはＡＣＥ２－Ｆｃの総分子量を約２５０ｋＤａにする。これは、６０ｋＤの短いＡＣＥ２にＦｃタグを追加すると、ＡＣＥ２の予想サイズが約１７０ｋＤに増加し（図１０）、濾過できないことを意味する。短いＡＣＥ２の半減期を大幅に延長し、融合タンパク質の分子サイズをはるかに低いレベルに維持するために、最短のＡＣＥ２トランケートを２つのかなり小さなポリペプチドに融合する：ａ）単量体可溶性ＣＨ３ Ｆｃドメイン、及びｂ）連鎖球菌Ｇタンパク質（ＡＢＤ）のアルブミン結合ドメイン（図１０）。Ｆｃ断片には、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用する２つの機能ドメインＣＨ２及びＣＨ３がある。より小さなサイズ（約１４ｋＤ）の最近設計された可溶性単量体（ｍ）ＣＨ３ドメインが、フルサイズのＦｃを機能的に模倣できることが示されている^１４０。治療用タンパク質融合パートナーとしてのより短いが機能的に機能するｍＣＨ３タグは、Ｆｃ自体よりも潜在的に良好な組織浸透、立体障害の減少、及び治療効果の増加という利点を提供し得る^１４０。ＦｃＲｎを結合する既知の能力により、可溶性ｍＣＨ３はＡＣＥ２－Ｆｃの代替アプローチとして使用され、半減期が延長されたＡＣＥ２－ｍＣＨ３タンパク質を生成する。可溶性ｍＣＨ３は、ヒトＦｃＲｎへのｐＨ依存的結合に不可欠な４つの突然変異の特定の組み合わせでＣＨ３を生成することにより達成される^１４０。ｍＣＨ３はＧＳ４リンカーを介して最短ＡＣＥ２トランケートのｃ末端に結合される。１－６０５ ＡＣＥ２（約６９ｋＤ）を可溶性単量体ＣＨ３（約１４ｋＤａ）に融合すると、分子量が約８３ｋＤａに増加する。これは、短いＡＣＥ２とＦｃ（約１７０ｋＤａ）の融合よりも著しく改善されるが、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）を使用するとさらに短いＡＣＥ２コンストラクトを実現できると考えられる。

【0118】

アルブミンの半減期は非常に長く（１９～２１日）、アルブミン又はその構造ドメインとの融合は、多くのタンパク質のインビボ半減期を延長するために使用された^{８６，８７}。アルブミンの長いＴ１／２は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介したそのリサイクルに起因すると考えられている。アルブミンのＦｃＲｎ結合部位はドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）に存在する^１４１。血清アルブミンは、アルブミンと非共有結合及び逆相互作用する能力を持つ分子を介して間接的に半減期の延長に関与できる。そのような小分子の１つは、連鎖球菌タンパク質Ｇ１４２に由来するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である^１４２。ＡＢＤは４６ＡＡの小分子であるため、最短のＡＣＥ２と融合するという利点を有する。これは、分子量のわずか約５ｋＤの増加に変換される（すなわち、ＡＣＥ２のＭＷが６０ｋＤａである場合、ＡＣＥ２－ＡＢＤ融合タンパク質は６５ｋＤａになる）（図１０）。これまでに、ＡＢＤ０３５、高度に改善されたアルブミン結合親和性（ｆＭ範囲）及び好ましい生物物理学的特性を有するＡＢＤの変異体をコードする人工遺伝子をすでに合成している^１４３。さらに、ＡＢＤ０３５ ｃＤＮＡのＮ末端に柔軟なリンカー（Ｇ４Ｓ３）を挿入した。これは、短いＡＣＥ２ ｃＤＮＡのＣ末端に遺伝的に融合され、ＡＢＤ融合の短いＡＣＥ２タンパク質（ＡＣＥ２－ＡＢＤ）を生成する。Ｇ４Ｓ３－ＡＢＤ ｃＤＮＡとＡＣＥ２ １－６０５のｃＤＮＡの「縫製」ＰＣＲが行われる、ＡＣＥ２ １－６０５－ＡＢＤキメラの生成プロセスが現在完了している。ＡＣＥ２－ＡＢＤをコードする遺伝子を合成し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位でｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニングし、Ａｉｍ １に記載されているようにコンストラクトの発現と検証を行う。ＡＣＥ２－ＡＢＤ（又はＡＣＥ２－ｍＣＨ３）哺乳類細胞株で過剰発現し、Ｑ－セファロースを使用して精製し（ＡＣＥ２ １－６０５及び１－６１９の精製と同様）、必要に応じてＦＰＬＣ及びタンジェンシャルフロー濾過を行う。得られた精製キメラの薬物動態は、ＡＣＥ２－Ｆｃ（Liu et al. ASN abstract SA-PO521, 2016）で説明されているように、ｉ．ｐ及びｉ．ｖ注射が行われる時系列実験で評価される。非融合の短いｒＡＣＥ２タンパク質のスキャンについては、最初のアプローチは、放射性同位体として^９９ｍＴｃ（６時間Ｔ１／２）を使用する経時的な全身分布の急性研究を含む。^９９ｍＴｃは、物理化学的半減期が比較的短く、放射化学が十分に確立されており、急性造影研究に適している^１４４。腎臓及び他の臓器内の放射性標識薬剤の薬物動態は、各臓器の関心領域^５３分析を時間をかけて別々に使用して決定される。短いｒＡＣＥ２融合タンパク質（ｍＣＨ３及びＡＢＤを含む）の生体内分布及び薬物動態をイメージングするために、タンパク質はより長い物理的半減期（^１１１Ｉｎ、Ｔ１／２＝２．８日）の核種を使用して標識される）長期（２～７日）の監視を可能にする^１４５。最後に、腎細胞特異的分布を得るための免疫染色に使用される腎臓採取のためにマウスを犠牲にする（Ｈｉｓタグ抗体により、内因性ＡＣＥ２と外因性ＡＣＥ２を区別できる）。

【0119】

腎臓によるＡＣＥ２の短い排泄と腎臓への取り込みの実証のために、ＳＴＺ治療に加えて、ＳＴＺで治療されたＡＣＥ２ＫＯと、実験室で生成されたｄｂ／ｄｂとＡＣＥ２－ＫＯのクロスを使用する。これにより、外因性ＡＣＥ２と内因性ＡＣＥ２の区別が容易になる。完全なｒＡＣＥ２は比較目的で使用される（グループあたりｎ＝８）。３つのエンドポイントが評価される：１）糸球体濾過のマーカーとして尿ＡＣＥ２を増加させる２）急性注入の終了時に採取した臓器のＡＣＥ２の免疫染色と３）腎臓濾過のマーカーとしての薬剤分布のインビボ可視化のための放射性核種イメージング尿細管取り込み（保持腎造影図）（図７を参照）。これらの研究は、最適なタグと融合した短いＡＣＥ２がインビボで完全な酵素活性を保持し、腎臓に送達されるのに対し、無傷のｒＡＣＥ２はそうではないことを実証する必要がある。治療の可能性は、半減期が延長された最短のＡＣＥ２形式を使用して最初に調べられる。この融合された短いＡＣＥ２の半減期は少なくとも７～１４日と予想され、目的２に記載されている基準を使用して腎保護のテストが行われると予想される。投与は、目的１と同様に、インビボ活性及びアンジオテンシンＩＩ分解の強化の観点から、作用の持続時間に応じて、毎週又は隔週になる。

【0120】

同期間に与えられるラミプリル（飲料水中１ｍｇ／Ｋｇ／ｄ）の研究は、目的２に概説されている腎臓パラメーターの改善に関して、このＡＣＥ阻害剤単独と比較した短いｒＡＣＥ２－ＡＢＤ（又は代替としてｍＣＨ３）の相対的な有効性を評価するための比較に使用される。脱出現象を文書化するために、試験開始時、２週間後、及び試験終了時に、レベルからＡｎｇ ＩＩの値は、未処理のマウスの値よりも低くならない（又は、より高いレベルにリバウンドする）。ラミプリル投与後の血漿中のＡｎｇ ＩＩレベルのリバウンド増加は、２週間の投与後に十分に報告されている^１４６。３番目のグループは、最初からラミプリルと短いｒＡＣＥ２－ＡＢＤの両方を受け取り、この組み合わせにより血漿と腎臓のＡｎｇ ＩＩのレベルが低くなり、ラミプリル単独よりも有益な添加物があるかどうかを調べる。これらの調査は、ｄｂ／ｄｂマウスとｄｂ ｍコントロール、及びｅＮＯＳ ｄｂ／ｄｂモデルでのみ行われます。これは、オスとメスの糖尿病マウスの別々のグループに表示される（各ｎ＝１０）。

【0121】

期待される結果と代替案。これらの融合ＡＣＥ２タンパク質は、糸球体を通して濾過可能であると予想される。注入されたＡＣＥ２の腎への効果的な取り込みの実証は、放射性核種スキャンによる腎造影図の持続と腎臓ＡＣＥ２染色の実証に依存する。これは、ＡＣＥ２－ＫＯモデルであり、おそらく、Ｈｉｓタグ抗体が外因性ＡＣＥ２と内因性ＡＣＥ２を区別するＷＴでより明白になるべきである。足細胞、内皮細胞及び近位尿細管腎細胞に存在するＦｃＲｎ受容体との結合のため、ＡＢＤ（又は代替ｍＣＨ３タグ）と融合したｒＡＣＥ２の方が取り込みが強くなると予想される^{７９、１４７}。より短いＡＣＥ２融合タンパク質（ＡＣＥ２－ＡＢＤ及び／又はＡＣＥ２－ｍＣＨ３）がアルブミンと同等の速度でフィルターされると予想する。重要なことに、アルブミン上のＦｃＲｎ結合部位はドメインＩＩＩ及びＩに位置し、ＡＢＤ８４、１４２への結合と重複又は干渉しない。上記のように、ｍＣＨ３はＦｃＲｎにも効果的に結合する。これを利用して、ＡＢＤと融合した短いＡＣＥ２（及びＡＣＥ２－ｍＣＨ３の腎臓）の腎臓への取り込みを促進する。予想される特性がリストされる（表４）。

【0122】

【表4】

【0123】

それらの特性に基づいて、各修飾ＡＣＥ２タンパク質の治療能力は、無傷の未修飾ＡＣＥ２の治療能力を超える。長時間作用型の短いｒＡＣＥ２は血漿ＡｎｇＩＩレベルのリバウンド上昇を防ぎ、ＡＣＥ阻害薬で見られるアルドステロンも防ぐと予想され、これは改善された腎保護を伴う。ラミプリル単独と比較して、Ａｎｇ ＩＩの持続的な減少とＡｎｇ １－７形成の強化により、長時間作用型の短いＡＣＥ２が腎保護の点で優れていると予想される。

【0124】

統計分析：２つの独立したグループの正規分布データの不対ｔ検定又は他の分布パターンのマン＆ホイットニー検定を使用して実行される。３つ以上の独立したグループを比較する場合、ＡＮＯＶＡが使用され、その後にボンフェローニ補正が行われる。経時変化は、反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続く事後分析によって分析さるす。実験のサンプルサイズは、２５％の平均の差と０．８のべき乗を使用した計算に基づいて、グループごとに１０個のマウスになる。

【0125】

厳密性及び透明性：実験はランダム化された様式で行われる。すべての読み取りは複製で行われる。性差の影響は、両性の動物を使用し、グループを性別ごとに分析することにより考慮される。

【0126】

目録及び参考文献
1. Andersen J T, Dalhus B, Cameron J, Daba M B, Plumridge A, Evans L, Brennan S O, Gunnarsen K S, Bjoras M, Sleep D and Sandlie I. Structure-based mutagenesis reveals the albumin-binding site of the neonatal Fc receptor. Nature communications. 2012; 3:610.
2. Batlle D, Soler M J, and Wysocki, New aspects of the renin-angiotensin system: angiontensin-converting enzyme 2--a potential target for treatment of hypertension and diabetic nephropathy, Curr. Opin Nephrol. Hypertens. 2008 May; 17(3):250-7.
3. Batlle D, Wysocki J, Soler M J and Ranganath K. Angiotensin-converting enzyme 2: enhancing the degradation of angiotensin II as a potential therapy for diabetic nephropathy. Kidney Int. 2012; 81:520-8.
4. Nadarajah R, Milagres R, Dilauro M, Gutsol A, Xiao F, Zimpelmann J, Kennedy C, Wysocki J, Batlle D and Burns K D. Podocyte-specific overexpression of human angiotensin-converting enzyme 2 attenuates diabetic nephropathy in mice. Kidney Int. 2012; 82:292-303.
5. Haber P K, Ye M, Wysocki J, Maier C, Haque S K and Batlle D. Angiotensin-converting enzyme 2-independent action of presumed angiotensin-converting enzyme 2 activators: studies in vivo, ex vivo, and in vitro. Hypertension. 2014; 63:774-82.
6. Wysocki J, Ye M, Rodriguez E, Gonzalez-Pacheco F R, Barrios C, Evora K, Schuster M, Loibner H, Brosnihan K B, Ferrario C M, Penninger J M and Batlle D. Targeting the degradation of angiotensin II with recombinant angiotensin-converting enzyme 2: prevention of angiotensin II-dependent hypertension. Hypertension. 2010; 55:90-8.
7. Ye M, Wysocki J, Gonzalez-Pacheco F R, Salem M, Evora K, Garcia-Halpin L, Poglitsch M, Schuster M and Batlle D. Murine recombinant angiotensin-converting enzyme 2: effect on angiotensin II-dependent hypertension and distinctive angiotensin-converting enzyme 2 inhibitor characteristics on rodent and human angiotensin-converting enzyme 2. Hypertension. 2012; 60:730-40.
8. Wysocki J, Ye M and Baffle D. Plasma and Kidney Angiotensin Peptides: Importance of the Aminopeptidase A/Angiotensin III Axis. Am J Hypertens. 2015; 28:1418-26.
9. Wysocki J, Garcia-Halpin L, Ye M, Maier C, Sowers K, Burns K D and Batlle D. Regulation of urinary ACE2 in diabetic mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2013; 305:F600-11.
10. Wysocki J, Ye M, Khattab A M, Fogo A, Martin A, David N V, Kanwar Y, Osborn M and Batlle D. Angiotensin-converting enzyme 2 amplification limited to the circulation does not protect mice from development of diabetic nephropathy. Kidney Int. 2017; 91:1336-1346.

【0127】

11. Cosgrove D, Meehan D T, Grunkemeyer J A, Kornak J M, Sayers R, Hunter W J and Samuelson G C. Collagen COL4A3 knockout: a mouse model for autosomal Alport syndrome. Genes & development. 1996; 10:2981-92.
12. Fisher N D, Price D A, Litchfield W R, Williams G H and Hollenberg N K. Renal response to captopril reflects state of local renin system in healthy humans. Kidney Int. 1999; 56:635-41.
13. Price D A, Porter L E, Gordon M, Fisher N D, De'Oliveira J M, Laffel L M, Passan D R, Williams G H and Hollenberg N K. The paradox of the low-renin state in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 1999; 10:2382-91.
14. Christlieb A R, Kaldany A and D'Elia J A. Plasma renin activity and hypertension in diabetes mellitus. Diabetes. 1976; 25:969-74.
15. Rosenberg M E, Smith L J, Correa-Rotter R and Hostetter T H. The paradox of the renin-angiotensin system in chronic renal disease. Kidney Int. 1994; 45:403-10.
16. Peti-Peterdi J, Kang J J and Toma I. Activation of the renal renin-angiotensin system in diabetes--new concepts. Nephrology Dialysis Transplantation. 2008; 23:3047-3049.
17. Gurley S B and Coffman T M. The renin-angiotensin system and diabetic nephropathy. Seminars in nephrology. 2007; 27:144-52.
18. Zatz R, Dunn B R, Meyer T W, Anderson S, Rennke H G and Brenner B M. Prevention of diabetic glomerulopathy by pharmacological amelioration of glomerular capillary hypertension. The Journal of clinical investigation. 1986; 77:1925-30.
19. Anderson S, Jung F F and Ingelfinger J R. Renal renin-angiotensin system in diabetes: functional, immunohistochemical, and molecular biological correlations. Am J Physiol. 1993; 265:F477-86.
20. Raij L. The pathophysiologic basis for blocking the renin-angiotensin system in hypertensive patients with renal disease. Am J Hypertens. 2005; 18:95s-99s.

【0128】

21. Anderson S, Rennke H G and Brenner B M. Therapeutic advantage of converting enzyme inhibitors in arresting progressive renal disease associated with systemic hypertension in the rat. Journal of Clinical Investigation. 1986; 77:1993-2000.
22. Kobori H, Harrison-Bernard L M and Navar L G. Urinary excretion of angiotensinogen reflects intrarenal angiotensinogen production. Kidney international. 2002; 61:579-585.
23. Lo C-S, Chang S-Y, Chenier I, Filep J G, Ingelfinger J R, Zhang S L and Chan J S D. Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein F Suppresses Angiotensinogen Gene Expression and Attenuates Hypertension and Kidney Injury in Diabetic Mice. Diabetes. 2012; 61:2597-2608.
24. Durvasula R V, Petermann A T, Hiromura K, Blonski M, Pippin J, Mundel P, Pichler R, Griffin S, Couser W G and Shankland S J. Activation of a local tissue angiotensin system in podocytes by mechanical strain. Kidney Int. 2004; 65:30-9.
25. Durvasula R V and Shankland S J. Activation of a local renin angiotensin system in podocytes by glucose. Am J Physiol Renal Physiol. 2008; 294:F830-9.
26. Ingelfinger J R, Zuo W M, Fon E A, Ellison K E and Dzau V J. In situ hybridization evidence for angiotensinogen messenger RNA in the rat proximal tubule. An hypothesis for the intrarenal renin angiotensin system. The Journal of clinical investigation. 1990; 85:417-23.
27. Mills K T, Kobori H, Hamm L L, Alper A B, Khan I E, Rahman M, Navar L G, Liu Y, Browne G M, Batuman V, He J and Chen J. Increased urinary excretion of angiotensinogen is associated with risk of chronic kidney disease. Nephrology Dialysis Transplantation. 2012; 27:3176-3181.
28. Kamiyama M, Zsombok A and Kobori H. Urinary angiotensinogen as a novel early biomarker of intrarenal renin-angiotensin system activation in experimental type 1 diabetes. Journal of pharmacological sciences. 2012; 119:314-23.
29. Ye M W J, Khattab A, Issa H, Gutterman M, Molitch M, Batlle D. Urinary Angiotensinogen (AOG) is Increased in Type I Diabetes with Microalbuminuria. 2016.
30. Afkarian M, Hirsch I B, Tuttle K R, Greenbaum C, Himmelfarb J and de Boer I H. Urinary excretion of RAS, BMP, and WNT pathway components in diabetic kidney disease. Physiological reports. 2014; 2:e12010.

【0129】

31. Wysocki J, Goodling A, Burgaya M, Whitlock K, Ruzinski J, Batlle D and Afkarian M. Urine RAS components in mice and people with type 1 diabetes and chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 2017: ajprenal 00074 2017.
32. Brenner B M, Cooper M E, de Zeeuw D, Keane W F, Mitch W E, Parving H H, Remuzzi G, Snapinn S M, Zhang Z and Shahinfar S. Effects of losartan on renal and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes and nephropathy. The New England journal of medicine. 2001; 345:861-9.
33. Fogo A B. Renal fibrosis and the renin-angiotensin system. Advances in nephrology from the Necker Hospital. 2001; 31:69-87.
34. Lewis E J, Hunsicker L G, Bain R P and Rohde R D. The effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group. The New England journal of medicine. 1993; 329:1456-62.
35. Lewis E J, Hunsicker L G, Clarke W R, Berl T, Pohl M A, Lewis J B, Ritz E, Atkins R C, Rohde R and Raz I. Renoprotective effect of the angiotensin-receptor antagonist irbesartan in patients with nephropathy due to type 2 diabetes. The New England journal of medicine. 2001; 345:851-60.
36. Yamada K, Iyer S N, Chappell M C, Ganten D and Ferrario C M. Converting enzyme determines plasma clearance of angiotensin-(1-7). Hypertension. 1998; 32:496-502.
37. Santos R A, Ferreira A J, Verano-Braga T and Bader M. Angiotensin-converting enzyme 2, angiotensin-(1-7) and Mas: new players of the renin-angiotensin system. The Journal of endocrinology. 2013; 216:R1-r17.
38. Welches W R, Santos R A, Chappell M C, Brosnihan K B, Greene L J and Ferrario C M. Evidence that prolyl endopeptidase participates in the processing of brain angiotensin. Journal of hypertension. 1991; 9:631-8.
39. Grobe N, Weir N M, Leiva O, Ong F S, Bernstein K E, Schmaier A H, Morris M and Elased K M. Identification of prolyl carboxypeptidase as an alternative enzyme for processing of renal angiotensin II using mass spectrometry. American journal of physiology Cell physiology. 2013; 304:C945-53.
40. Shariat-Madar Z, Mandi F and Schmaier A H. Identification and characterization of prolylcarboxypeptidase as an endothelial cell prekallikrein activator. J Biol Chem. 2002; 277:17962-9.

【0130】

41. Velez J C. Prolyl carboxypeptidase: a forgotten kidney angiotensinase. Focus on "Identification of prolyl carboxypeptidase as an alternative enzyme for processing of renal angiotensin II using mass spectrometry". American journal of physiology Cell physiology. 2013; 304:C939-40.
42. Maier C, Schadock I, Haber P K, Wysocki J, Ye M, Kanwar Y, Flask C A, Yu X, Hoit B D, Adams G N, Schmaier A H, Bader M and Batlle D. Prolylcarboxypeptidase deficiency is associated with increased blood pressure, glomerular lesions, and cardiac dysfunction independent of altered circulating and cardiac angiotensin II. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 2017.
43. Vickers C, Hales P, Kaushik V, Dick L, Gavin J, Tang J, Godbout K, Parsons T, Baronas E, Hsieh F, Acton S, Patane M, Nichols A and Tummino P. Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase. J Biol Chem. 2002; 277:14838-43.
44. Haschke M, Schuster M, Poglitsch M, Loibner H, Salzberg M, Bruggisser M, Penninger J and Krahenbuhl S. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant human angiotensin-converting enzyme 2 in healthy human subjects. Clinical pharmacokinetics. 2013; 52:783-92.
45. Campbell D J. The site of angiotensin production. Journal of hypertension. 1985; 3:199-207.
46. Lorenz J N. Chymase: the other ACE? Am J Physiol Renal Physiol. 2010; 298:F35-6.
47. Li M, Liu K, Michalicek J, Angus J A, Hunt J E, Dell'Italia L J, Feneley M P, Graham R M and Husain A. Involvement of chymase-mediated angiotensin II generation in blood pressure regulation. The Journal of clinical investigation. 2004; 114:112-20.
48. Park S, Bivona B J, Kobori H, Seth D M, Chappell M C, Lazartigues E and Harrison-Bernard L M. Major role for ACE-independent intrarenal ANG II formation in type II diabetes. Am J Physiol Renal Physiol. 2010; 298:F37-48.
49. Sharman D C, Morris A D and Struthers A D. Gradual reactivation of vascular angiotensin I to angiotensin II conversion during chronic ACE inhibitor therapy in patients with diabetes mellitus. Diabetologia. 2007; 50:2061-6.
50. van de Wal R M, Plokker H W, Lok D J, Boomsma F, van der Horst F A, van Veldhuisen D J, van Gilst W H and Voors A A. Determinants of increased angiotensin II levels in severe chronic heart failure patients despite ACE inhibition. International journal of cardiology. 2006; 106:367-72.

【0131】

51. Berry C. Clinical implications of increased plasma angiotensin II concentrations despite ACE inhibitor therapy in patients with congestive heart failure: the issue of non-compliance with therapy. European heart journal. 2000; 21:1484-5.
52. Urata H, Healy B, Stewart R W, Bumpus F M and Husain A. Angiotensin II-forming pathways in normal and failing human hearts. Circ Res. 1990; 66:883-90.
53. Roig E, Perez-Villa F, Morales M, Jimenez W, Orus J, Heras M and Sanz G. Clinical implications of increased plasma angiotensin II despite ACE inhibitor therapy in patients with congestive heart failure. European heart journal. 2000; 21:53-7.
54. Shiigai T and Shichiri M. Late escape from the antiproteinuric effect of ace inhibitors in nondiabetic renal disease. American journal of kidney diseases: the official journal of the National Kidney Foundation. 2001; 37:477-83.
55. Athyros V G, Mikhailidis D P, Kakafika A I, Tziomalos K and Karagiannis A. Angiotensin II reactivation and aldosterone escape phenomena in renin-angiotensin-aldosterone system blockade: is oral renin inhibition the solution? Expert opinion on pharmacotherapy. 2007; 8:529-35.
56. Urata H, Kinoshita A, Misono K S, Bumpus F M and Husain A. Identification of a highly specific chymase as the major angiotensin II-forming enzyme in the human heart. J Biol Chem. 1990; 265:22348-57.
57. Wei C C, Hase N, Inoue Y, Bradley E W, Yahiro E, Li M, Naqvi N, Powell P C, Shi K, Takahashi Y, Saku K, Urata H, Dell'italia L J and Husain A. Mast cell chymase limits the cardiac efficacy of Ang I-converting enzyme inhibitor therapy in rodents. The Journal of clinical investigation. 2010; 120:1229-39.
58. Tom B, Garrelds I M, Scalbert E, Stegmann A P, Boomsma F, Saxena P R and Danser A H. ACE-versus chymase-dependent angiotensin II generation in human coronary arteries: a matter of efficiency? Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2003; 23:251-6.
59. Urata H, Boehm K D, Philip A, Kinoshita A, Gabrovsek J, Bumpus F M and Husain A. Cellular localization and regional distribution of an angiotensin II-forming chymase in the heart. The Journal of clinical investigation. 1993; 91:1269-81.
60. Grima M, Ingert C, Michel B, Barthelmebs M and Imbs J L. Renal tissue angiotensins during converting enzyme inhibition in the spontaneously hypertensive rat. Clinical and experimental hypertension (New York, N.Y.: 1993). 1997; 19:671-85.

【0132】

61. Biollaz J, Schelling J L, Jacot Des Combes B, Brunner D B, Desponds G, Brunner H R, Ulm E H, Hichens M and Gomez H J. Enalapril maleate and a lysine analogue (MK-521) in normal volunteers; relationship between plasma drug levels and the renin angiotensin system. British journal of clinical pharmacology. 1982; 14:363-8.
62. Giani J F, Janjulia T, Kamat N, Seth D M, Blackwell W L, Shah K H, Shen X Z, Fuchs S, Delpire E, Toblli J E, Bernstein K E, McDonough A A and Gonzalez-Villalobos R A. Renal angiotensin-converting enzyme is essential for the hypertension induced by nitric oxide synthesis inhibition. J Am Soc Nephrol. 2014; 25:2752-63.
63. Ferrario C M, Jessup J, Chappell M C, Averill D B, Brosnihan K B, Tallant E A, Diz D I and Gallagher P E. Effect of angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II receptor blockers on cardiac angiotensin-converting enzyme 2. Circulation. 2005; 111:2605-10.
64. van den Meiracker A H, Man in't Veld A J, Admiraal P J, Ritsema van Eck H J, Boomsma F, Derkx F H and Schalekamp M A. Partial escape of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibition during prolonged ACE inhibitor treatment: does it exist and does it affect the antihypertensive response? Journal of hypertension. 1992; 10:803-12.
65. Komine N, Khang S, Wead L M, Blantz R C and Gabbai F B. Effect of combining an ACE inhibitor and an angiotensin II receptor blocker on plasma and kidney tissue angiotensin II levels. American journal of kidney diseases: the official journal of the National Kidney Foundation. 2002; 39:159-64.
66. Grobe J L, Mecca A P, Lingis M, Shenoy V, Bolton T A, Machado J M, Speth R C, Raizada M K and Katovich M J. Prevention of angiotensin II-induced cardiac remodeling by angiotensin-(1-7). American journal of physiology Heart and circulatory physiology. 2007; 292:H736-42.
67. Carney E F. Diabetic nephropathy: Renoprotective effects of angiotensin 1-7. Nature reviews Nephrology. 2014; 10:240.
68. Mori J, Patel V B, Ramprasath T, Alrob O A, DesAulniers J, Scholey J W, Lopaschuk G D and Oudit G Y. Angiotensin 1-7 mediates renoprotection against diabetic nephropathy by reducing oxidative stress, inflammation, and lipotoxicity. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306:F812-21.
69. Simoes e Silva A C, Silveira K D, Ferreira A J and Teixeira M M. ACE2, angiotensin-(1-7) and Mas receptor axis in inflammation and fibrosis. British journal of pharmacology. 2013; 169:477-92.
70. Simoes e Silva A C and Teixeira M M. ACE inhibition, ACE2 and angiotensin-(1?7) axis in kidney and cardiac inflammation and fibrosis. Pharmacological Research. 2016; 107:154-162.

【0133】

71. Ye M, Wysocki J, William J, Soler M J, Cokic I and Batlle D. Glomerular localization and expression of Angiotensin-converting enzyme 2 and Angiotensin-converting enzyme: implications for albuminuria in diabetes. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:3067-75.
72. Ye M, Wysocki J, Naaz P, Salabat M R, LaPointe M S and Batlle D. Increased ACE 2 and decreased ACE protein in renal tubules from diabetic mice: a renoprotective combination? Hypertension. 2004; 43:1120-5.
73. Brasen J C, Burford J L, McDonough A A, Holstein-Rathlou N H and Peti-Peterdi J. Local pH domains regulate NHE3-mediated Na(+) reabsorption in the renal proximal tubule. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 307:F1249-62.
74. Crowley S D, Gurley S B, Herrera M J, Ruiz P, Griffiths R, Kumar A P, Kim H S, Smithies O, Le T H and Coffman T M. Angiotensin II causes hypertension and cardiac hypertrophy through its receptors in the kidney. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006; 103:17985-90.
75. Gonzalez A A, Green T, Luffman C, Bourgeois C R T, Gabriel Navar L and Prieto M C. Renal medullary cyclooxygenase-2 and (pro)renin receptor expression during angiotensin II-dependent hypertension. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 307:F962-70.
76. Gonzalez-Villalobos R A, Janjoulia T, Fletcher N K, Giani J F, Nguyen M T, Riquier-Brison A D, Seth D M, Fuchs S, Eladari D, Picard N, Bachmann S, Delpire E, Peti-Peterdi J, Navar L G, Bernstein K E and McDonough A A. The absence of intrarenal ACE protects against hypertension. The Journal of clinical investigation. 2013; 123:2011-23.
77. Gurley S B, Riquier A D M, Schnermann J, Sparks M A, Allen A M, Haase V H, Snouwaert J N, Le T H, McDonough A A, Koller B H and Coffman T M. AT(1A) Angiotensin Receptors in the Renal Proximal Tubule Regulate Blood Pressure. Cell metabolism. 2011; 13:469-75.
78. Nguyen M T, Han J, Ralph D L, Veiras L C and McDonough A A. Short-term nonpressor angiotensin II infusion stimulates sodium transporters in proximal tubule and distal nephron. Physiological reports. 2015; 3.
79. Akilesh S, Huber T B, Wu H, Wang G, Hartleben B, Kopp J B, Miner J H, Roopenian D C, Unanue E R and Shaw A S. Podocytes use FcRn to clear IgG from the glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008; 105:967-72.
80. Dickson L E, Wagner M C, Sandoval R M and Molitoris B A. The proximal tubule and albuminuria: really! J Am Soc Nephrol. 2014; 25:443-53.

【0134】

81. Park C H and Maack T. Albumin absorption and catabolism by isolated perfused proximal convoluted tubules of the rabbit. The Journal of clinical investigation. 1984; 73:767-77.
82. Russo L M, Sandoval R M, McKee M, Osicka T M, Collins A B, Brown D, Molitoris B A and Comper W D. The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states. Kidney Int. 2007; 71:504-13.
83. Sandoval R M, Wagner M C, Patel M, Campos-Bilderback S B, Rhodes G J, Wang E, Wean S E, Clendenon S S and Molitoris B A. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. J Am Soc Nephrol. 2012; 23:447-57.
84. Chaudhury C, Brooks C L, Carter D C, Robinson J M and Anderson C L. Albumin binding to FcRn: distinct from the FcRn-IgG interaction. Biochemistry. 2006; 45:4983-90.
85. Haymann J P, Levraud J P, Bouet S, Kappes V, Hagege J, Nguyen G, Xu Y, Rondeau E and Sraer J D. Characterization and localization of the neonatal Fc receptor in adult human kidney. J Am Soc Nephrol. 2000; 11:632-9.
86. Kontermann R E. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics. Current opinion in biotechnology. 2011; 22:868-76.
87. Strohl W R. Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters. BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy. 2015; 29:215-39.
88. Suzuki T, Ishii-Watabe A, Tada M, Kobayashi T, Kanayasu-Toyoda T, Kawanishi T and Yamaguchi T. Importance of neonatal FcR in regulating the serum half-life of therapeutic proteins containing the Fc domain of human IgG1: a comparative study of the affinity of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins to human neonatal FcR. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 2010; 184:1968-76.
89. Schulte S. Half-life extension through albumin fusion technologies. Thrombosis research. 2009; 124 Suppl 2:S6-8.
90. Macdougall I C, Gray S J, Elston O, Breen C, Jenkins B, Browne J and Egrie J. Pharmacokinetics of novel erythropoiesis stimulating protein compared with epoetin alfa in dialysis patients. J Am Soc Nephrol. 1999; 10:2392-5.

【0135】

91. Schellenberger V, Wang C W, Geething N C, Spink B J, Campbell A, To W, Scholle M D, Yin Y, Yao Y, Bogin O, Cleland J L, Silverman J and Stemmer W P. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009; 27:1186-90.
92. Christensen E I and Birn H. Megalin and cubilin: multifunctional endocytic receptors. Nature reviews Molecular cell biology. 2002; 3:256-66.
93. Dolman M E, Harmsen S, Storm G, Hennink W E and Kok R J. Drug targeting to the kidney: Advances in the active targeting of therapeutics to proximal tubular cells. Advanced drug delivery reviews. 2010; 62:1344-57.
94. Moestrup S K and Verroust P J. Megalin- and cubilin-mediated endocytosis of protein-bound vitamins, lipids, and hormones in polarized epithelia. Annual review of nutrition. 2001; 21:407-28.
95. Saito A, Sato H, lino N and Takeda T. Molecular mechanisms of receptor-mediated endocytosis in the renal proximal tubular epithelium. Journal of biomedicine & biotechnology. 2010; 2010:403272.
96. Franssen E J, Koiter J, Kuipers C A, Bruins A P, Moolenaar F, de Zeeuw D, Kruizinga W H, Kellogg R M and Meijer D K. Low molecular weight proteins as carriers for renal drug targeting. Preparation of drug-protein conjugates and drug-spacer derivatives and their catabolism in renal cortex homogenates and lysosomal lysates. J Med Chem. 1992; 35:1246-59.
97. Franssen E J, van Amsterdam R G, Visser J, Moolenaar F, de Zeeuw D and Meijer D K. Low molecular weight proteins as carriers for renal drug targeting: naproxen-lysozyme. Pharmaceutical research. 1991; 8:1223-30.
98. Haas M, Moolenaar F, Meijer D K and de Zeeuw D. Specific drug delivery to the kidney. Cardiovascular drugs and therapy. 2002; 16:489-96.
99. Kok R J, Grijpstra F, Walthuis R B, Moolenaar F, de Zeeuw D and Meijer D K. Specific delivery of captopril to the kidney with the prodrug captopril-lysozyme. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1999; 288:281-5.
100. Zhou P, Sun X and Zhang Z. Kidney-targeted drug delivery systems. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2014; 4:37-42.

【0136】

101. Wysocki J R J, Afkarian M, Batlle D. Urinary prorenin is increased in patients with type 1 diabetes and nephropathy. ASN. 2016; Kidney Week.
102. Comper W D and Glasgow E F. Charge selectivity in kidney ultrafiltration. Kidney Int. 1995; 47:1242-51.
103. Caliceti P and Veronese F M. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Advanced drug delivery reviews. 2003; 55:1261-77.
104. Jevsevar S, Kunstelj M and Porekar V G. PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnology journal. 2010; 5:113-28.
105. Kanwar Y S and Farquhar M G. Anionic sites in the glomerular basement membrane. In vivo and in vitro localization to the laminae rarae by cationic probes. The Journal of cell biology. 1979; 81:137-53.
106. Rennke H G, Cotran R S and Venkatachalam M A. Role of molecular charge in glomerular permeability. Tracer studies with cationized ferritins. The Journal of cell biology. 1975; 67:638-46.
107. Kanwar Y S and Farquhar M G. Presence of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1979; 76:1303-7.
108. Salem E S, Grobe N and Elased K M. Insulin treatment attenuates renal ADAM17 and ACE2 shedding in diabetic Akita mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306:F629-39.
109. Goorno W E, Rector F C, Jr. and Seldin D W. Relation of renal gluconeogenesis to ammonia production in the dog and rat. The American journal of physiology. 1967; 213:969-74.
110. Jiang F, Yang J, Zhang Y, Dong M, Wang S, Zhang Q, Liu F F, Zhang K and Zhang C. Angiotensin-converting enzyme 2 and angiotensin 1-7: novel therapeutic targets. Nature reviews Cardiology. 2014; 11:413-26.

【0137】

111. Towler P, Staker B, Prasad S G, Menon S, Tang J, Parsons T, Ryan D, Fisher M, Williams D, Dales N A, Patane M A and Pantoliano M W. ACE2 X-ray structures reveal a large hinge-bending motion important for inhibitor binding and catalysis. J Biol Chem. 2004; 279:17996-8007.
112. Liu P, Wysocki J, Serfozo P, Ye M, Souma T, D B and J. J. A Fluorometric Method of Measuring Carboxypeptidase Activities for Angiotensin II and Apelin 13. Scientific Reports. 2017.
113. Bae E H, Fang F, Williams V R, Konvalinka A, Zhou X, Patel V B, Song X, John R, Oudit G Y, Pei Y and Scholey J W. Murine recombinant angiotensin-converting enzyme 2 attenuates kidney injury in experimental Alport syndrome. Kidney Int. 2017.
114. Ross M J and Nangaku M. ACE2 as therapy for glomerular disease: the devil is in the detail. Kidney International. 2017; 91:1269-1271.
115. Ross M J and Nangaku M. ACE2 as therapy for glomerular disease: the devil is in the detail. Kidney Int. 2017; 91:1269-1271.
116. Cheng H F, Becker B N, Burns K D and Harris R C. Angiotensin II upregulates type-1 angiotensin II receptors in renal proximal tubule. Journal of Clinical Investigation. 1995; 95:2012-2019.
117. Schelling J R, Hanson A S, Marzec R and Linas S L. Cytoskeleton-dependent endocytosis is required for apical type 1 angiotensin II receptor-mediated phospholipase C activation in cultured rat proximal tubule cells. J Clin Invest. 1992; 90:2472-80.
118. Becker B N, Cheng H-f, Hammond T G and Harris R C. The Type 1 Angiotensin II Receptor Tail Affects Receptor Targeting, Internalization, and Membrane Fusion Properties. Molecular Pharmacology. 2004; 65:362.
119. Culver S, Li C and Siragy H M. Intrarenal Angiotensin-Converting Enzyme: the Old and the New. Current hypertension reports. 2017; 19:80.
120. Border W A and Noble N A. Interactions of Transforming Growth Factor-B and Angiotensin II in Renal Fibrosis. Hypertension. 1998; 31:181-188.

【0138】

121. Mezzano S A, Ruiz-Ortega M and Egido J. Angiotensin II and Renal Fibrosis. Hypertension. 2001; 38:635-638.
122. Suzuki Y, Ruiz-Ortega M, Lorenzo O, Ruperez M, Esteban V and Egido J. Inflammation and angiotensin II. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2003; 35:881-900.
123. Benigni A, Cassis P and Remuzzi G. Angiotensin II revisited: new roles in inflammation, immunology and aging. EMBO Molecular Medicine. 2010; 2:247-57.
124. Sun L, Xiao L, Nie J, Liu F, Ling G, Zhu X, Tang W, Chen W, Xia Y, Zhan M, Ma M, Peng Y, Liu H, Liu Y and Kanwar Y S. p66Shc mediates high-glucose and angiotensin II-induced oxidative stress renal tubular injury via mitochondrial-dependent apoptotic pathway. Am J Physiol Renal Physiol. 2010; 299:F1014-25.
125. Chen J, Chen J K, Nagai K, Plieth D, Tan M, Lee T C, Threadgill D W, Neilson E G and Harris R C. EGFR Signaling Promotes TGF.beta.-Dependent Renal Fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2012; 23:215-24.
126. Okada H. A Look at Transactivation of the EGF Receptor by Angiotensin II. J Am Soc Nephrol. 2012; 23:183-5.
127. Harlan S M, Heinz-Taheny K M, Sullivan J M, Wei T, Baker H E, Jaqua D L, Qi Z, Cramer M S, Shiyanova T L, Breyer M D and Heuer J G. Progressive Renal Disease Established by Renin-Coding Adeno-Associated Virus-Driven Hypertension in Diverse Diabetic Models. J Am Soc Nephrol. 2017.
128. Soler M J, Wysocki J, Ye M, Lloveras J, Kanwar Y and Batlle D. ACE2 inhibition worsens glomerular injury in association with increased ACE expression in streptozotocin-induced diabetic mice. Kidney Int. 2007; 72:614-23.
129. Wysocki J, Ye M, Soler M J, Gurley S B, Xiao H D, Bernstein K E, Coffman T M, Chen S and Batlle D. ACE and ACE2 activity in diabetic mice. Diabetes. 2006; 55:2132-9.
130. Zhao H J, Wang S, Cheng H, Zhang M Z, Takahashi T, Fogo A B, Breyer M D and Harris R C. Endothelial nitric oxide synthase deficiency produces accelerated nephropathy in diabetic mice. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:2664-9.

【0139】

131. Zhang M Z, Wang S, Yang S, Yang H, Fan X, Takahashi T and Harris R C. Role of blood pressure and the renin-angiotensin system in development of diabetic nephropathy (DN) in eNOS-/- db/db mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2012; 302:F433-8.
132. Nakagawa T, Sato W, Glushakova O, Heinig M, Clarke T, Campbell-Thompson M, Yuzawa Y, Atkinson M A, Johnson R J and Croker B. Diabetic endothelial nitric oxide synthase knockout mice develop advanced diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2007; 18:539-50.
133. Quaggin S E and Coffman T M. Toward a mouse model of diabetic nephropathy: is endothelial nitric oxide synthase the missing link? Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2007; 18:364-6.
134. Maier C, Schadock I, Haber P K, Wysocki J, Ye M, Kanwar Y, Flask C A, Yu X, Hoit B D, Adams G N, Schmaier A H, Bader M and Batlle D. Prolylcarboxypeptidase deficiency is associated with increased blood pressure, glomerular lesions, and cardiac dysfunction independent of altered circulating and cardiac angiotensin II. J Mol Med (Berl). 2017; 95:473-486.
135. Nagasu H, Satoh M, Kiyokage E, Kidokoro K, Toida K, Channon K M, Kanwar Y S, Sasaki T and Kashihara N. Activation of endothelial NAD(P)H oxidase accelerates early glomerular injury in diabetic mice. Lab Invest. 2016; 96:25-36.
136. Hudkins K L, Pichaiwong W, Wietecha T, Kowalewska J, Banas M C, Spencer M W, Muhlfeld A, Koelling M, Pippin J W, Shankland S J, Askari B, Rabaglia M E, Keller M P, Attie A D and Alpers C E. BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2010; 21:1533-42.
137. Oudit G Y, Herzenberg A M, Kassiri Z, Wong D, Reich H, Khokha R, Crackower M A, Backx P H, Penninger J M and Scholey J W. Loss of angiotensin-converting enzyme-2 leads to the late development of angiotensin II-dependent glomerulosclerosis. The American journal of pathology. 2006; 168:1808-20.
138. Sung S H, Ziyadeh F N, Wang A, Pyagay P E, Kanwar Y S and Chen S. Blockade of vascular endothelial growth factor signaling ameliorates diabetic albuminuria in mice. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:3093-104.
139. Brosius F C, 3rd, Alpers C E, Bottinger E P, Breyer M D, Coffman T M, Gurley S B, Harris R C, Kakoki M, Kretzler M, Leiter E H, Levi M, McIndoe R A, Sharma K, Smithies O, Susztak K, Takahashi N and Takahashi T. Mouse models of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2009; 20:2503-12.
140. Ying T, Chen W, Feng Y, Wang Y, Gong R and Dimitrov D S. Engineered soluble monomeric IgG1 CH3 domain: generation, mechanisms of function, and implications for design of biological therapeutics. J Biol Chem. 2013; 288:25154-64.

【0140】

141. Sand K M K, Dalhus B, Christianson G J, Bern M, Foss S, Cameron J, Sleep D, Bjoras M, Roopenian D C, Sandlie I and Andersen J T. Dissection of the Neonatal Fc Receptor (FcRn)-Albumin Interface Using Mutagenesis and Anti-FcRn Albumin-blocking Antibodies. The Journal of biological chemistry. 2014; 289:17228-17239.
142. Levy O E, Jodka C M, Ren S S, Mamedova L, Sharma A, Samant M, D'Souza L J, Soares C J, Yuskin D R, Jin U, Parkes D G, Tatarkiewicz K and Ghosh S S. Novel exenatide analogs with peptidic albumin binding domains: potent anti-diabetic agents with extended duration of action. PloS one. 2014; 9:e87704.
143. Nilvebrant J and Hober S. The albumin-binding domain as a scaffold for protein engineering. Computational and structural biotechnology journal. 2013; 6:e201303009.
144. Baggish A L and Boucher C A. Radiopharmaceutical agents for myocardial perfusion imaging. Circulation. 2008; 118:1668-74.
145. Guo Y, Yuan H, Claudio N M, Kura S, Shakerdge N, Mempel T R, Bacskai B J and Josephson L. PEG-like nanoprobes: multimodal, pharmacokinetically and optically tunable nanomaterials. PloS one. 2014; 9:e95406.
146. Ingert C, Grima M, Michel B, Barthelmebs M and Imbs J L. [Renal tissue angiotensins during converting enzyme inhibition of angiotensin I in spontaneously hypertensive rat]. Archives des maladies du coeur et des vaisseaux. 1997; 90:1135-41.
147. Sarav M, Wang Y, Hack B K, Chang A, Jensen M, Bao L and Quigg R J. Renal FcRn reclaims albumin but facilitates elimination of IgG. J Am Soc Nephrol. 2009; 20:1941-52.
148. Spiekermann et al., Receptor-mediated immunoglobulin G transport across mucosal barriers in adult life: functional expression of FcRn in the mammalian lung. J. Exp. Med. 2002 Aug. 5; 196(3)-10.
149. Bitonti et al., Pulmonary delivery of an erythropoietin Fc fusion protein in non-human primates through an immunoglobulin transport pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004 Jun. 29; 101(26):9763-8.
150. Palazzo V, Provenzano A, Becherucci F, Sansavini G, Mazzinghi B, Orlandini V, Giunti L, Roperto R M, Pantaleo M, Artuso R, Andreucci E, Bargiacchi S, Traficante G, Stagi S, Murer L, Benetti E, Emma F, Giordano M, Rivieri F, Colussi G, Penco S, Manfredini E, Caruso M R, Garavelli L, Andrulli S, Vergine G, Miglietti N, Mancini E, Malaventura C, Percesepe A, Grosso E, Materassi M, Romagnani P and Giglio S. The genetic and clinical spectrum of a large cohort of patients with distal renal tubular acidosis. Kidney international. 2017.

【0141】

本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置換及び変更を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例示的に説明される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素、制限がない場合に適切に実施することができる。採用された用語と表現は説明の用語として使用され、限定するものではない。そのような用語と表現の使用には、表示及び説明される機能の同等物又はその一部を除外する意図はありませんが、本発明の範囲内で様々な修正が可能である。したがって、本発明は特定の実施形態及び任意の特徴によって例示されているが、本明細書に開示された概念の修正及び／又は変形は当業者に頼ることができ、そのような修正及び変形が考慮されることを理解されたい。本発明の範囲内である。

【0142】

多数の特許及び非特許文献への引用が本明細書でなされ得る。引用された参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。引用文献の用語の定義と比較して、仕様の用語の定義に矛盾がある場合、用語は仕様の定義に基づいて解釈する必要がある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【配列表】

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