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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-15
(45)【発行日】2023-08-23
(54)【発明の名称】ＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法
(51)【国際特許分類】
A61L 27/26 20060101AFI20230816BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20230816BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20230816BHJP
A61L 27/48 20060101ALI20230816BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20230816BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20230816BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230816BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20230816BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230816BHJP
A61F 2/08 20060101ALI20230816BHJP
C07K 14/475 20060101ALN20230816BHJP
C07K 14/435 20060101ALN20230816BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230816BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230816BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230816BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20230816BHJP
【ＦＩ】
A61L27/26
A61L27/22
A61L27/36 100
A61L27/48
A61L27/54
A61K38/18
A61P25/00
A61P25/02
A61P43/00 107
A61F2/08
C07K14/475 ZNA
C07K14/435
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12P21/02 H
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022504619
(86)(22)【出願日】2020-07-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-05
(86)【国際出願番号】 CN2020104048
(87)【国際公開番号】W WO2021227255
(87)【国際公開日】2021-11-18
【審査請求日】2022-01-24
(31)【優先権主張番号】202010396807.7
(32)【優先日】2020-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】511128206
【氏名又は名称】南通大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】劉 炎
(72)【発明者】
【氏名】劉 梅
(72)【発明者】
【氏名】顧 暁松
(72)【発明者】
【氏名】管 徒晨
【審査官】田澤 俊樹
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８１１４３１５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３７０５９７９（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ ２７／００－２７／６０
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ａ６１Ｆ ２／０８
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／１２，１５／６２，１５／６３
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
絹フィブロイン軽鎖のペプチド断片と、神経成長因子３（ＮＴ３）の活性ペプチド断片との融合タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子断片を合成してｐＥＴ－３０発現ベクターに結合し、得られた組換え発現ベクターをＢＬ２１大腸菌に形質転換して、前記融合タンパク質を得るステップと、融合タンパク質及び絹フィブロイン溶液を混合して、混合タンパク質溶液を得、絹繊維ネットを鋳型内に置き、混合タンパク質溶液を鋳型に注ぎ込んで冷凍乾燥して、神経導管を形成するステップと、最終的にＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片を得るステップと、を含む、ことを特徴とするＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項2】
前記絹繊維ネットが絹繊維用編機で編まれる、ことを特徴とする請求項１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項3】
前記絹フィブロイン溶液の調製方法は、絹繊維をチオシアン酸リチウム溶液に入れて溶解させ、溶解後の溶液を透析用袋に入れ、三重蒸留水を透析液として６０～８０時間透析し、絹フィブロイン溶液を得るものである、ことを特徴とする請求項１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項4】
前記絹繊維の製造方法は、カイコ糸を炭酸ナトリウム溶液に入れて２０分間以上煮沸し、取り出した後、三重蒸留水で十分に洗浄する、という工程を２～４回繰り返し、外部セリシンを除去した絹繊維を得るものである、ことを特徴とする請求項２又は３に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項5】
混合タンパク質溶液の濃度が５％－４０％であり、融合タンパク質及び絹フィブロインの質量割合が１：９９～５０：５０である、ことを特徴とする請求項１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項6】
前記神経導管の形成後、前記神経移植片を得る前に、６０％エタノール中の浸漬で１０～１４ｈ処理することをさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項7】
透析用袋の分画分子量が１２～１６ｋＤａである、ことを特徴とする請求項３に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項8】
冷凍乾燥の温度が－７０℃である、ことを特徴とする請求項１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【請求項9】
チオシアン酸リチウム溶液の濃度が９ｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項３に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学材料の分野に属し、具体的には、神経回復を促進できるＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片に関し、末梢神経、脊髄損傷、脳損傷の修復及び再生に応用可能である。
【背景技術】
【0002】
組織工学、生体材料学等の新興学科の発展に伴い、神経の修復に用いられる生体材料が増えている。優れた生体材料は、良好な生体適合性を有すると共に、細胞の接着、移動、細胞間の相互作用、増殖及び分化をサポートするものである必要がある。また、これらの生体材料には、適切な生分解速度、力学的性質、制限された免疫反応及び多種の加工選択肢が求められるほか、組織の特定ニーズに応じて構造及び形態を変更できることも要求される。天然組織の構成部分であるタンパク質は、組織工学応用における理性的な選択である。コラーゲン、エラスチン、弾性ペプチド、アルブミン及びフィブリンのような構造タンパク質は、縫合線、組織スキャフォールド、止血剤及び薬物送達剤として使用されている。
【0003】
神経損傷は、末梢神経損傷及び中枢神経損傷を含み、現在、長距離末梢神経損傷及び脊髄損傷の治療には、異なるタイプの移植片の適用が必要になることが多いが、自己神経又は異種移植片等は、供給源が乏しく、応用範囲が限られる等の欠点があるため、組織工学移植片の新たな代替物が考案されている。カイコフィブロインは、一般的な天然生体高分子材料であり、古くから縫合線として人体に適用されている。近年、カイコフィブロインは、一部の特性から生体材料として注目されるようになる。同種又は異種由来組織からの他のタンパク質系生体材料に比べて、絹フィブロインは良好な生体適合性、優れた機械的特性、制御可能な生分解性、簡単な加工工程等、いくつかの主要な利点を持っている。また、絹フィブロイン重合物は、加工において異なる可塑性を示し、異なる製造技術により、三次元多孔質発泡体、ナノ繊維、ハイドロゲル、チューブ及びフィルムを含む様々なマトリックス構成を実現でき、様々な組織修復に応用できる。神経栄養因子３は、ＮＴＦ３遺伝子によってコーディングされるタンパク質であり、神経成長因子ファミリーの重要なメンバーであり、末梢及び中枢神経系のニューロンに栄養を与えることができ、既存のニューロンの生存に役立つだけでなく、新生ニューロンの生存、分化及びシナプス結合を促進することもできる。
【0004】
現在、絹フィブロインのみで構築された組織工学スキャフォールドは、機能が単一であり、神経組織の回復を促進する作用が限られている。神経移植片を成長因子（例えば、ＮＧＦ）に浸漬させるか、又は絹フィブロインと混合した後に冷凍乾燥して導管を形成することで、初期段階で良好な神経成長促進作用を達成した研究があるが、その神経成長促進作用が経時的に弱くなっていき、それらの使用も栄養因子の体内での不安定性及び限られた供給源により大きく制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、従来技術の欠点に対して、神経栄養因子３（ＮＴ３）の活性ペプチド断片及び絹フィブロイン軽鎖のペプチド断片を結合して融合タンパク質を構成し、この融合タンパク質をベースとして絹フィブロインの自己組織化を行い、これにより良好な機械的支持作用を果たすと共に神経保護機能を長時間安定的に持続することができる新規な神経移植片を得る。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の技術的解決手段は以下のとおりである。
【0007】
ＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法は、
絹フィブロイン軽鎖及びＮＴ３を含む遺伝子断片を合成してｐＥＴ－３０発現ベクターに結合し、得られた組換え発現ベクターをＢＬ２１大腸菌に形質転換して、融合タンパク質を得るステップと、
融合タンパク質及び絹フィブロイン溶液を混合して、混合タンパク質溶液を得、絹繊維ネットを鋳型内に置き、混合タンパク質溶液を鋳型に注ぎ込んで冷凍乾燥して、神経導管を形成するステップと、変形処理した後、最終的にＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片を得るステップと、を含む。さらに、前記絹繊維ネットは絹繊維用編機で編まれる。
絹フィブロイン軽鎖及びＮＴ３を含む遺伝子断片を合成してｐＥＴ－３０発現ベクターに結合し、得られた組換え発現ベクターをＢＬ２１大腸菌に形質転換して、融合タンパク質を得るステップと、
融合タンパク質及び絹フィブロイン溶液を混合して、混合タンパク質溶液を得、絹繊維ネットを鋳型内に置き、混合タンパク質溶液を鋳型に注ぎ込んで冷凍乾燥して、神経導管を形成するステップと、変形処理した後、最終的にＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片を得るステップと、を含む。さらに、前記絹繊維ネットは絹繊維用編機で編まれる。
【0008】
さらに、前記絹フィブロイン溶液の調製方法は、絹繊維をチオシアン酸リチウム溶液に入れて溶解させ、溶解後の溶液を透析用袋に入れ、三重蒸留水を透析液として６０～８０時間透析し、絹フィブロイン溶液を得るものである。
【0009】
さらに、前記絹繊維の製造方法は、カイコ糸を炭酸ナトリウム溶液に入れて２０分間以上煮沸し、取り出した後、三重蒸留水で十分に洗浄する、という工程を２～４回繰り返し、外部セリシンを除去した絹繊維を得るものである。
【0010】
さらに、融合タンパク質及び絹フィブロイン溶液の濃度は５％－４０％であり、融合タンパク質及び絹フィブロインの質量割合は１：９９～５０：５０である。
【0011】
さらに、変形処理は、６０％エタノール中の浸漬で１０～１４ｈ処理するものである。
【0012】
さらに、透析用袋の分画分子量は１２～１６ｋＤａである。
【0013】
さらに、冷凍乾燥の温度は－７０℃である。
【0014】
さらに、チオシアン酸リチウム溶液の濃度は９ｍｏｌ／Ｌである。
【0015】
本発明は、上記製造方法によって製造されるＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片をさらに提供する。
【発明の効果】
【0016】
従来技術は、主に神経栄養因子をスキャフォールドに吸着させるか又は共有結合する結合方法を使用しているが、本発明では、ＮＴ３の生物活性断片及び軽鎖絹フィブロインは融合タンパク質において同時発現され、該融合タンパク質は、絹フィブロインを主体としてＮＴ３の有効成分を融合したものであり、絹フィブロインと共に絹フィブロイン導管に固定化可能である。本発明により、絹フィブロインの成分を変更せずに、神経保護及び神経再生促進の作用を長時間持続することが可能になる。
【0017】
本発明では、絹フィブロインを主材、ＮＴ３活性ペプチド断片を融合した絹フィブロイン軽鎖を副材として使用し、加工プロセスにおいて、架橋剤、界面活性剤等のような有毒・有害な物質は一切添加しないため、良好な生体適合性を有する。
【0018】
本発明に記載の絹フィブロイン融合タンパク質は、神経組織細胞とインビトロで共培養する場合、形態学的観察及びＮＴ３関連因子の発現分析において、いずれも顕著な成長促進作用を示しており、そのうちＦＩＢＬ－ＮＴ３－Ｌ－ＮＴ３の活性が最も高い。
【0019】
本発明に記載の絹フィブロイン導管は、絹フィブロインの結晶化前にＮＴ３機能性ペプチド断片を融合した絹フィブロイン軽鎖が導入されるため、絹フィブロインの自己組織化プロセスにおいて、ＮＴ３活性ポリペプチドは、絹フィブロイン軽鎖と共に絹フィブロイン導管内に固定化され、機械的支持作用を果たすと共に神経保護及び神経再生促進の作用を長時間持続することができ、また、実際の状況に応じて神経導管におけるＮＴ３活性ペプチドの割合を調整することもでき、神経損傷の修復に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】インビトロで培養した背側根神経節の神経突起成長に対する異なる設計のＮＴ３含有融合タンパク質の影響である。
【図2】インビトロで培養した背側根神経節の神経突起成長に対する異なる設計のＮＴ３含有融合タンパク質の影響である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
（実施例１）
ＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法であって、以下のステップを含む。
ＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法であって、以下のステップを含む。
【0022】
ステップ１で、絹フィブロイン融合タンパク質の発現及び精製を行い、具体的には、組換え発現ベクターを構築し、目的タンパク質を発現してから精製する。
【0023】
ステップ２で、カイコ絹繊維を取得し、具体的には、カイコ生糸を取り、セリシンを除去し、カイコ絹繊維を得る。
【0024】
ステップ３で、絹フィブロイン溶液を調製する。
【0025】
ステップ４で、絹繊維ネットを製造する。
【0026】
ステップ５で、絹繊維ネットを鋳型内に置き、ステップ１及び３で得られたタンパク質溶液を混合してから鋳型に注ぎ込み、冷凍乾燥して絹フィブロインを自己組織化させて、神経導管を形成する。
【0027】
（実施例２）
ＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法であって、以下のステップを含む。
ＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法であって、以下のステップを含む。
【0028】
ステップ１で、組換え発現ベクターを構築し、具体的には、絹フィブロイン軽鎖及びＮＴ３を含む遺伝子断片を合成してｐＥＴ－３０発現ベクターに結合し、組換え発現ベクターの構築を完了させる。タグ（ｔａｇ）及びｌｉｎｋｅｒを含む異なる融合タンパク質の配列を以下に示す。
【0029】
融合タンパク質の配列（Ｎ端Ｈｉｓタグ及びフレキシブルＬｉｎｋｅｒを含む）
ＦＩＢＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝２５３ ＭＷ＝２６８９８．８ ｐＩ＝６．１０
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧ ＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶ
ＦＩＢＬ－ＮＴ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝３７２ ＭＷ＝４０５０３．７ ｐＩ＝７．３９
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧＲＴ
ＦＩＢＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＮＴ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝３８２ ＭＷ＝４１１３４．１ ｐＩ＝７．３９
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳ ＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧ ＲＴ
ＦＩＢＬ－（ＮＴ３）２ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝５０１ ＭＷ＝５４７３９．０ ｐＩ＝８．２８
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡ ＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧＲＴ
ＦＩＢＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝２５３ ＭＷ＝２６８９８．８ ｐＩ＝６．１０
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧ ＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶ
ＦＩＢＬ－ＮＴ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝３７２ ＭＷ＝４０５０３．７ ｐＩ＝７．３９
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧＲＴ
ＦＩＢＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＮＴ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝３８２ ＭＷ＝４１１３４．１ ｐＩ＝７．３９
ＭＨＨＨＨＨＨＡＰＳＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲＤＩＤＤＧＫＡＳＳＶＩＳＲＡＷＤＹＶＤＤＴＤＫＳＩＡＩＬＮＶＱＥＩＬＫＤＭＡＳＱＧＤＹＡＳＱＡＳＡＶＡＱＴＡＧＩＩＡＨＬＳＡＧＩＰＧＤＡＣＡＡＡＮＶＩＮＳＹＴＤＧＶＲＳＧＮＦＡＧＦＲＱＳＬＧＰＦＦＧＨＶＧＱＮＬＮＬＩＮＱＬＶＩＮＰＧＱＬＲＹＳＶＧＰＡＬＧＣＡＧＧＧＲＩＹＤＦＥＡＡＷＤＡＩＬＡＳＳＤＳＳＦＬＮＥＥＹＣＩＶＫＲＬＹＮＳＲＮＳＱＳＮＮＩＡＡＹＩＴＡＨＬＬＰＰＶＡＱＶＦＨＱＳＡＧＳＩＴＤＬＬＲＧＶＧＮＧＮＤＡＴＧＬＶＡＮＡＱＲＹＩＡＱＡＡＳＱＶＨＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳ ＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧ ＲＴ
ＦＩＢＬ－（ＮＴ３）２ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｎｇｔｈ＝５０１ ＭＷ＝５４７３９．０ ｐＩ＝８．２８
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【0030】
ステップ２で、融合タンパク質の発現及び精製を行い、具体的には、ステップ１で得られた組換え発現ベクターをＢＬ２１大腸菌に形質転換し、３７℃で誘導発現した後、超音波粉砕し、Ｎｉ－ＮＴＡで融合タンパク質を精製して同定を行い、融合タンパク質を得る。
【0031】
ステップ３で、適量のカイコ糸を０．２％の炭酸ナトリウム溶液に入れて３０分間煮沸し、取り出した後、三重蒸留水で十分に洗浄する、という工程を３回繰り返し、外部セリシンを除去した絹繊維を得て、クリーンベンチに置いて乾かし、使用に備える。
【0032】
ステップ４で、絹繊維を９Ｍのチオシアン酸リチウム溶液に入れて溶解させ、溶解後の溶液を透析用袋（分画分子量は約１４ｋＤａ）に入れ、三重蒸留水を透析液として７２時間透析し、絹フィブロイン溶液を得る。
【0033】
ステップ５で、ステップ３で得られた絹繊維を編機で絹繊維ネットとして編む。
【0034】
ステップ６で、ステップ２で得られた融合タンパク質及びステップ４で得られた絹フィブロイン溶液を所定の割合で混合し、混合タンパク質溶液を得、混合タンパク質溶液の濃度を５％－４０％にし、融合タンパク質及び絹フィブロインの質量割合を１：９９～５０：５０にし、ステップ５で得られた絹繊維ネットを鋳型内に置き、混合タンパク質溶液を鋳型に注ぎ込んで－７０℃で冷凍乾燥し、絹フィブロイン、融合タンパク質及び絹繊維ネットを架橋させて神経導管を形成する。
【0035】
ステップ７で、６０％エタノール中の浸漬で１２ｈ変形処理し、三重蒸留水で洗浄してから乾かし、最終的にＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片を得る。
【0036】
図１は、ＮＴ３、ＦＩＢＬ、ＦＩＢＬ－ＮＴ３、ＦＩＢＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＮＴ３、ＦＩＢＬ－（ＮＴ３）２を融合した絹フィブロインによるＤＲＧ軸索の成長促進を示す図であり、図２はその統計図であり、統計図のデータは、各グループの３０個のニューロン軸索の長さを計数した平均値によるものである。図から分かるように、ブランクグループに比べて、ＮＴ３は細胞の軸索成長を促進することができ、ＦＩＢＬ－ＮＴ３、ＦＩＢＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＮＴ３、ＦＩＢＬ－（ＮＴ３）は軸索の成長をさらに効果的に促進することができる。
【0037】
（付記）
（付記１）
絹フィブロイン軽鎖及びＮＴ３を含む遺伝子断片を合成してｐＥＴ－３０発現ベクターに結合し、得られた組換え発現ベクターをＢＬ２１大腸菌に形質転換して、融合タンパク質を得るステップと、
融合タンパク質及び絹フィブロイン溶液を混合して、混合タンパク質溶液を得、絹繊維ネットを鋳型内に置き、混合タンパク質溶液を鋳型に注ぎ込んで冷凍乾燥して、神経導管を形成するステップと、変形処理した後、最終的にＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片を得るステップと、を含む、ことを特徴とするＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
（付記１）
絹フィブロイン軽鎖及びＮＴ３を含む遺伝子断片を合成してｐＥＴ－３０発現ベクターに結合し、得られた組換え発現ベクターをＢＬ２１大腸菌に形質転換して、融合タンパク質を得るステップと、
融合タンパク質及び絹フィブロイン溶液を混合して、混合タンパク質溶液を得、絹繊維ネットを鋳型内に置き、混合タンパク質溶液を鋳型に注ぎ込んで冷凍乾燥して、神経導管を形成するステップと、変形処理した後、最終的にＮＴ３活性を有する絹フィブロイン神経移植片を得るステップと、を含む、ことを特徴とするＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0038】
（付記２）
前記絹繊維ネットが絹繊維用編機で編まれる、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
前記絹繊維ネットが絹繊維用編機で編まれる、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0039】
（付記３）
前記絹フィブロイン溶液の調製方法は、絹繊維をチオシアン酸リチウム溶液に入れて溶解させ、溶解後の溶液を透析用袋に入れ、三重蒸留水を透析液として６０～８０時間透析し、絹フィブロイン溶液を得るものである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
前記絹フィブロイン溶液の調製方法は、絹繊維をチオシアン酸リチウム溶液に入れて溶解させ、溶解後の溶液を透析用袋に入れ、三重蒸留水を透析液として６０～８０時間透析し、絹フィブロイン溶液を得るものである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0040】
（付記４）
前記絹繊維の製造方法は、カイコ糸を炭酸ナトリウム溶液に入れて２０分間以上煮沸し、取り出した後、三重蒸留水で十分に洗浄する、という工程を２～４回繰り返し、外部セリシンを除去した絹繊維を得るものである、ことを特徴とする付記２又は３に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
前記絹繊維の製造方法は、カイコ糸を炭酸ナトリウム溶液に入れて２０分間以上煮沸し、取り出した後、三重蒸留水で十分に洗浄する、という工程を２～４回繰り返し、外部セリシンを除去した絹繊維を得るものである、ことを特徴とする付記２又は３に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0041】
（付記５）
混合タンパク質溶液の濃度が５％－４０％であり、融合タンパク質及び絹フィブロインの質量割合が１：９９～５０：５０である、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
混合タンパク質溶液の濃度が５％－４０％であり、融合タンパク質及び絹フィブロインの質量割合が１：９９～５０：５０である、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0042】
（付記６）
変形処理は、６０％エタノール中の浸漬で１０～１４ｈ処理するものである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
変形処理は、６０％エタノール中の浸漬で１０～１４ｈ処理するものである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0043】
（付記７）
透析用袋の分画分子量が１２～１６ｋＤａである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
透析用袋の分画分子量が１２～１６ｋＤａである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0044】
（付記８）
冷凍乾燥の温度が－７０℃である、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
冷凍乾燥の温度が－７０℃である、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0045】
（付記９）
チオシアン酸リチウム溶液の濃度が９ｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
チオシアン酸リチウム溶液の濃度が９ｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする付記１に記載のＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片の製造方法。
【0046】
（付記１０）
付記１から９のいずれか１つに記載の製造方法で製造される、ことを特徴とするＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片。
付記１から９のいずれか１つに記載の製造方法で製造される、ことを特徴とするＮＴ３を融合した絹フィブロイン神経移植片。
【図1】
【図2】
【配列表】