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特許7333579アルツハイマー疾患モデル神経細胞及びその製造方法、並びにその神経細胞を用いたアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-17
(45)【発行日】2023-08-25
(54)【発明の名称】アルツハイマー疾患モデル神経細胞及びその製造方法、並びにその神経細胞を用いたアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20230818BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230818BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230818BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
C12N5/10
C12Q1/04
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019088602
(22)【出願日】2019-05-08
(65)【公開番号】P2020182423
(43)【公開日】2020-11-12
【審査請求日】2022-05-06
(73)【特許権者】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】加納 ふみ
(72)【発明者】
【氏名】中津 大貴
(72)【発明者】
【氏名】村田 昌之
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特開２００７－３１９１２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－２０２９６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１４０９２７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１０８７６６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００ー５／２８
Ｃ１２Ｑ １／００ー１／７０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、神経上皮細胞に誘導する工程、（２）前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成する工程、及び
（３）前記工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、成熟神経細胞へ誘導する工程、
を含む、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞からアルツハイマー疾患モデルの神経細胞を製造する方法。
【請求項2】
前記工程（２）において、前記神経上皮細胞を、単細胞に分離して播種する、請求項１に記載の神経細胞製造方法。
【請求項3】
前記工程（２）において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）存在下、又はＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路若しくはＲＡＳ／ＥＲＫ経路を活性化する因子の存在下で培養する、請求項１又は２に記載の神経細胞製造方法。
【請求項4】
（Ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載の神経細胞製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する工程、及び（Ｂ）候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する工程、を含むアルツハイマー病に作用する薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アルツハイマー疾患モデル神経細胞及びその製造方法、並びにその神経細胞を用いたアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、アルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いて、アルツハイマー病に影響を与える医薬を開発することができる。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病は、脳が萎縮していく疾患であり、進行性の認知障害の症状を呈する。病変としては、神経細胞の変性消失とそれに伴う大脳萎縮が観察され、特に大脳皮質及び海馬の萎縮が見られる。
海馬では、脳の他の部位と異なり、成人になっても神経細胞の新生が継続している。アルツハイマー病では、海馬における神経細胞新生が阻害され、海馬が委縮していると考えられている（非特許文献１）。しかしながら、アルツハイマー病患者において、神経細胞新生が阻害されている機構は、解明されていない。
海馬では、脳の他の部位と異なり、成人になっても神経細胞の新生が継続している。アルツハイマー病では、海馬における神経細胞新生が阻害され、海馬が委縮していると考えられている（非特許文献１）。しかしながら、アルツハイマー病患者において、神経細胞新生が阻害されている機構は、解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】「フロンンティアーズ・イン・ニューロサイエンス（Frontiers in Neuroscience）」（スイス）２０１６年、第１０巻、１７８
【文献】「ネイチャー・プロトコールズ（NATURE PROTOCOLS）」（英国）２０１２年、第７巻、ｐ．１８３６－１８４６
【文献】「プロス・ワン（PLOS ONE）」（米国）２０１４年、第９巻、第９号、ｅ１０６９５２
【文献】「セル（Cell）」（米国）２００６年、第１２６巻、ｐ．６６３－６７６
【文献】「サイエンス（Science）」（米国）２００７年、第３１８巻、ｐ．１９１７－１９２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
最近、人工多能性幹細胞細胞（以下、ｉＰＳ細胞と称することがある）から、神経細胞を誘導する方法が報告されている（非特許文献２及び３）。
本発明者らは、アルツハイマー疾患のモデルとなる神経細胞を作製するため、前記の神経細胞誘導方法を用いて、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞及び対象として健常人由来のｉＰＳ細胞から、神経細胞の誘導を試みた。しかしながら、前記の誘導方法を用いた場合、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からも、健常人由来のｉＰＳ細胞からも正常な神経細胞が誘導され、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からアルツハイマー疾患のモデルとなる神経細胞（例えば、新生が阻害された神経細胞）を得ることができなかった。
従って、本発明の目的はアルツハイマー疾患モデル神経細胞及びその製造方法を提供することである。また、そのアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いて、アルツハイマー病に影響を与える医薬をスクリーニングすることである。
本発明者らは、アルツハイマー疾患のモデルとなる神経細胞を作製するため、前記の神経細胞誘導方法を用いて、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞及び対象として健常人由来のｉＰＳ細胞から、神経細胞の誘導を試みた。しかしながら、前記の誘導方法を用いた場合、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からも、健常人由来のｉＰＳ細胞からも正常な神経細胞が誘導され、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からアルツハイマー疾患のモデルとなる神経細胞（例えば、新生が阻害された神経細胞）を得ることができなかった。
従って、本発明の目的はアルツハイマー疾患モデル神経細胞及びその製造方法を提供することである。また、そのアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いて、アルツハイマー病に影響を与える医薬をスクリーニングすることである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ｉＰＳ細胞からの神経上皮細胞誘導工程、及び成熟神経細胞誘導工程において、細胞を単細胞に分離して播種することにより、アルツハイマー病患者の神経細胞の特徴を有する成熟神経細胞を製造できることを見いだした。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、神経上皮細胞に誘導する工程、（２）前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成する工程、及び（３）前記工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、成熟神経細胞へ誘導する工程、を含む、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞からアルツハイマー疾患モデルの神経細胞を製造する方法、
［２］前記工程（２）において、前記神経上皮細胞を、単細胞に分離して播種する、［１］に記載の神経細胞製造方法、
［３］前記工程（２）において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）存在下、又はＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路若しくはＲＡＳ／ＥＲＫ経路を活性化する因子の存在下で培養する、［１］又は［２］に記載の神経細胞製造方法、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の神経細胞の製造方法によって得られるアルツハイマー疾患モデルの神経細胞、及び
［５］（Ａ）［１］～［３］のいずれかに記載の神経細胞製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する工程、及び（Ｂ）候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する工程、を含むアルツハイマー病に作用する薬剤のスクリーニング方法、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、神経上皮細胞に誘導する工程、（２）前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成する工程、及び（３）前記工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、成熟神経細胞へ誘導する工程、を含む、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞からアルツハイマー疾患モデルの神経細胞を製造する方法、
［２］前記工程（２）において、前記神経上皮細胞を、単細胞に分離して播種する、［１］に記載の神経細胞製造方法、
［３］前記工程（２）において、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）存在下、又はＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路若しくはＲＡＳ／ＥＲＫ経路を活性化する因子の存在下で培養する、［１］又は［２］に記載の神経細胞製造方法、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の神経細胞の製造方法によって得られるアルツハイマー疾患モデルの神経細胞、及び
［５］（Ａ）［１］～［３］のいずれかに記載の神経細胞製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する工程、及び（Ｂ）候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する工程、を含むアルツハイマー病に作用する薬剤のスクリーニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【0006】
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法によれば、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からアルツハイマー病の特徴を示す神経細胞を製造することができる。更に、神経ロゼット形成工程において、細胞を単細胞に分離して播種することにより、更に優れたアルツハイマー疾患モデル神経細胞を製造することができる。
また、本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いることにより、アルツハイマー病の発症のメカニズムを研究することができる。特に、前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いたアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法により、アルツハイマー病の治療薬の候補物質を、的確にスクリーニングできる。
また、本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いることにより、アルツハイマー病の発症のメカニズムを研究することができる。特に、前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いたアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法により、アルツハイマー病の治療薬の候補物質を、的確にスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】比較例１の健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真である。
【図2】実施例１の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真である。
【図3】（Ａ）は、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から得られた成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析したグラフである。（Ｂ）は、データベースから取得して解析した、健常者とアルツハイマー患者の海馬のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現のグラフである。（Ｃ）は、データベースから取得して解析した、健常者とアルツハイマー患者の前頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現のグラフである。（Ｄ）は、データベースから取得して解析した、健常者とアルツハイマー患者の側頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現のグラフである。
【図4】工程（１）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した比較例２の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真である。
【図5】工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種し、工程（２）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した実施例２の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真である。
【図6】工程（３）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（１）及び工程（２）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した比較例３の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真である。
【図7】工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して、４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度（実施例１の８倍の細胞数）で播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した比較例４の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真及びＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析したグラフである。
【図8】工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度（実施例１の４倍の細胞数）で播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した実施例３の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０３６０）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）から誘導された成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を示した写真及びＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析したグラフである。
【図9】アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いて、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質のスクリーニングを行い、ＴＵＪ１陽性細胞、ＭＡＰ２陽性細胞及びｃＣＡＳＰ３陽性細胞を解析した写真である。
【図10】アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）を用いて、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質のスクリーニングを行い、ＴＵＪ１陽性細胞、ＭＡＰ２陽性細胞及びｃＣＡＳＰ３陽性細胞を解析した写真である。
【図11】本発明のスクリーニング方法で、ＳＡＧ、Isobavachin、及びNeuropashiazolをスクリーニングした場合の、ＭＡＰ２とＴＵＪ１の遺伝子発現量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
［１］アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法は、（１）アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、神経上皮細胞に誘導する工程、（２）前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成する工程、及び（３）前記工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、成熟神経細胞へ誘導する工程、を含む。
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法は、（１）アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、神経上皮細胞に誘導する工程、（２）前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成する工程、及び（３）前記工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することによって、成熟神経細胞へ誘導する工程、を含む。
【0009】
《従来のｉＰＳ細胞からの神経細胞の誘導方法》
非特許文献２及び３に記載の従来の健常人ｉＰＳ細胞からの成熟神経細胞の誘導方法においては、工程（１）～（３）に相当する段階において、細胞密度の高い状態又は細胞塊（細胞凝集体）の状態で、細胞が播種され、そして培養されるか、或いは工程（２）におけるロゼットが形成されたままの状態で、継代を行わずに工程（３）で培養されている。すなわち、非特許文献２及び３においては、細胞と細胞とが接触している状態で培養することによって、ｉＰＳ細胞から成熟神経細胞を誘導していると考えられる。なお、本明細書において「細胞塊」とは、細胞が培養皿に非接着の状態で多数のｉＰＳ細胞が塊になることを意味する。
非特許文献２及び３に記載の従来の健常人ｉＰＳ細胞からの成熟神経細胞の誘導方法においては、工程（１）～（３）に相当する段階において、細胞密度の高い状態又は細胞塊（細胞凝集体）の状態で、細胞が播種され、そして培養されるか、或いは工程（２）におけるロゼットが形成されたままの状態で、継代を行わずに工程（３）で培養されている。すなわち、非特許文献２及び３においては、細胞と細胞とが接触している状態で培養することによって、ｉＰＳ細胞から成熟神経細胞を誘導していると考えられる。なお、本明細書において「細胞塊」とは、細胞が培養皿に非接着の状態で多数のｉＰＳ細胞が塊になることを意味する。
【0010】
《アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞》
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法において用いるアルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞は、アルツハイマー病患者由来である限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、アルツハイマー病患者由来の線維芽細胞、歯髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、間葉系幹細胞、骨格筋芽細胞又は骨膜細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣを導入することによって、ｉＰＳ細胞を得ることができる（非特許文献４）。
また、アルツハイマー病患者由来の線維芽細胞、歯髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、間葉系幹細胞、骨格筋芽細胞、又は骨膜細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８を導入することによって、ｉＰＳ細胞を得ることができる（非特許文献５）。
具体的には、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞として、例えば、ＨＰＳ０２５４細胞、ＨＰＳ０２５５細胞、又はＨＰＳ０２５６細胞（理化学研究所細胞バンクから提供）を挙げることができる。
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法において用いるアルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞は、アルツハイマー病患者由来である限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、アルツハイマー病患者由来の線維芽細胞、歯髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、間葉系幹細胞、骨格筋芽細胞又は骨膜細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣを導入することによって、ｉＰＳ細胞を得ることができる（非特許文献４）。
また、アルツハイマー病患者由来の線維芽細胞、歯髄細胞、末梢血細胞、臍帯血細胞、間葉系幹細胞、骨格筋芽細胞、又は骨膜細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８を導入することによって、ｉＰＳ細胞を得ることができる（非特許文献５）。
具体的には、アルツハイマー病患者由来ｉＰＳ細胞として、例えば、ＨＰＳ０２５４細胞、ＨＰＳ０２５５細胞、又はＨＰＳ０２５６細胞（理化学研究所細胞バンクから提供）を挙げることができる。
【0011】
《神経上皮細胞誘導工程（１）》
神経上皮細胞誘導工程（１）においては、アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。本工程（１）によって、神経上皮細胞シートを得ることができる。
ｉＰＳ細胞の前培養は、公知の方法によって実施することができる。例えば、ｍＴｅＳＲ１培地、ＭＥＦ培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地、又はＴｅＳＲ－Ｅ８培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で、４～７日、前培養することができる。
神経上皮細胞誘導工程（１）においては、アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、単細胞に分離して、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度で播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。本工程（１）によって、神経上皮細胞シートを得ることができる。
ｉＰＳ細胞の前培養は、公知の方法によって実施することができる。例えば、ｍＴｅＳＲ１培地、ＭＥＦ培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地、又はＴｅＳＲ－Ｅ８培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で、４～７日、前培養することができる。
【0012】
本工程（１）においては、前培養した細胞を単細胞に分離する。単細胞に分離する方法は特に限定されるものではないが、培養プレートに接着している細胞を、例えばタンパク質分解酵素で、剥離させ、単細胞に分離することができる。タンパク質分解酵素としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ又はアキュターゼ（accutase）を用いることができる。またトリプシンなどの代替品として、市販の酵素であるTrypLE（Thermo Fisher SCIENTIFIC）、又はGentle Cell Dissociation Reagent（STEMCELL Technologies）を用いることができる。
【0013】
前記細胞は、単細胞に分離した状態で播種される。播種時の細胞濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスになる細胞濃度が好ましい。４８時間以降に１００％コンフルエンスになることにより、培養初期における細胞と細胞との接触を抑制し、アルツハイマー病患者における病態を再現できると考えられる。また、播種した細胞が１００％コンフルエンスになる時期は、播種の後、より好ましくは３日（７２時間）以降であり、更に好ましくは４日（９６時間）以降であり、最も好ましくは５日（１２０時間）以降である。
【0014】
ｉＰＳ細胞の増殖速度は、ｉＰＳ細胞ごとに異なっている。従って、培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスとなる播種時の細胞濃度も、使用するｉＰＳ細胞ごとに異なる。例えば、培養開始後４８時間に１００％コンフルエンスとなる播種時の細胞濃度は、異なる細胞濃度で播種して４８時間培養し、１００％コンフルエンスとなる細胞濃度を決定することができる。また、培養開始後３日（７２時間）、４日（９６時間）、又は５日（１２０時間）に１００％コンフルエンスとなる播種時の細胞濃度も、同様の方法で決定することができる。基本的には、培養開始後３日（７２時間）、４日（９６時間）、又は５日（１２０時間）１００％コンフルエンスとなる播種時の細胞濃度は、培養開始後４８時間に１００％コンフルエンスとなる播種時の細胞濃度より、少ない細胞濃度である。
例えば、実施例で用いた健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）は、５．０×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種した場合（実施例１）、５～７日程度で１００％コンフルエンスとなる。すなわち、これらの細胞では、５．０×１０４細胞／ｃｍ２の培養開始時の播種濃度は、「培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスとなる細胞濃度」である。一方、４．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で播種した場合（比較例４）、１日で１００％コンフルエンスとなる。すなわち、これらの細胞では、４．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度の培養開始時の播種濃度は、「培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスとなる細胞濃度」ではない。
例えば、実施例で用いた健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）は、５．０×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種した場合（実施例１）、５～７日程度で１００％コンフルエンスとなる。すなわち、これらの細胞では、５．０×１０４細胞／ｃｍ２の培養開始時の播種濃度は、「培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスとなる細胞濃度」である。一方、４．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で播種した場合（比較例４）、１日で１００％コンフルエンスとなる。すなわち、これらの細胞では、４．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度の培養開始時の播種濃度は、「培養開始後４８時間以降に１００％コンフルエンスとなる細胞濃度」ではない。
【0015】
また、本明細書において「１００％コンフルエンス」とは、基本的には、培養容器の底面の細胞間の隙間が無い状態を意味する。しかしながら、細胞の播種のバラツキがあるため、５％未満の底面が細胞に覆われてない状態（９５％以上の底面が細胞で覆われている状態）も「１００％コンフルエンス」とする。
【0016】
（ＲＯＣＫ阻害剤）
本工程（１）においては、アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。
ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase：Rhoキナーゼ）は、細胞内のリン酸化酵素であり、このリン酸化酵素の働きを阻害することによって、ｉＰＳ細胞から神経上皮細胞分化を誘導することができる。
ＲＯＣＫ阻害剤としては、限定されるものではないが、Ｙ－２７６３２、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｙ－２７６３２、ＣＳ－０３４１、チアゾビビン（Thiazovivin）又はリパスジル（Ripasudil）が挙げられる。
ＲＯＣＫ阻害剤の添加濃度は、ｉＰＳ細胞の細胞死を抑制できる濃度であれば、特に限定されるものではなく、それぞれのＲＯＣＫ阻害剤の活性に応じて適宜決定することができるが、例えば０．１μＭ～１ｍＭであり、好ましくは１～１００μＭである。
本工程（１）においては、アルツハイマー病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。
ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase：Rhoキナーゼ）は、細胞内のリン酸化酵素であり、このリン酸化酵素の働きを阻害することによって、ｉＰＳ細胞から神経上皮細胞分化を誘導することができる。
ＲＯＣＫ阻害剤としては、限定されるものではないが、Ｙ－２７６３２、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｙ－２７６３２、ＣＳ－０３４１、チアゾビビン（Thiazovivin）又はリパスジル（Ripasudil）が挙げられる。
ＲＯＣＫ阻害剤の添加濃度は、ｉＰＳ細胞の細胞死を抑制できる濃度であれば、特に限定されるものではなく、それぞれのＲＯＣＫ阻害剤の活性に応じて適宜決定することができるが、例えば０．１μＭ～１ｍＭであり、好ましくは１～１００μＭである。
【0017】
Ｒｏｃｋ阻害剤は、工程（１）の全工程において添加してもよいが、工程（１）の初期の段階において添加して培養し、後期段階ではＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養してもよい。工程（１）の初期の段階でＲｏｃｋ阻害剤を添加することにより、単細胞に分離した状態で播種されるｉＰＳ細胞が死滅しやすいことを防ぐことができるからである。
ＲＯＣＫ阻害剤を添加する初期段階の時間は、特に限定されるものではないが、例えば６～４８時間でよいが、好ましくは１２～２４時間である。
ＲＯＣＫ阻害剤を添加する初期段階の時間は、特に限定されるものではないが、例えば６～４８時間でよいが、好ましくは１２～２４時間である。
【0018】
培養に用いる培養プレートは、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば細胞外マトリックスなどを被覆したプレートを用いてもよく、被覆なしのプレートを用いてもよい。被覆に用いる細胞外マトリックスは、特に限定されるものではないがラミニン、コラーゲン（例えば、IV型コラーゲン）、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ビトロネクチン又はエンタクチン／ニドゲンが挙げられる。市販されている製品としてマトリゲル（Matrigel（商標））、又はセルスタート（CELLStart）を用いることができる。
【0019】
培養の条件は、ｉＰＳ細胞が培養できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば３７℃、ＣＯ２濃度３～１５％程度で培養すればよい。培地もｉＰＳ細胞用の培地であれば、特に限定されるものではないが、例えばNeural differential basal medium、ｍＴｅＳＲ１培地、ＭＥＦ培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地、又はＴｅＳＲ－Ｅ８培地を用いることができる。
培養期間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば２～１５日であり、より好ましくは３～１０日であり、更に好ましくは５～８日である。
培養期間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば２～１５日であり、より好ましくは３～１０日であり、更に好ましくは５～８日である。
【0020】
（ＴＧＦβ阻害剤）
神経上皮細胞誘導工程（１）において、ｉＰＳ細胞は、限定されるものではないが、好ましくはＴＧＦβ阻害剤及び／又はＢＭＰ（bone morphogenetic protein）阻害剤の存在下で培養される。ＴＧＦβ阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えばＡ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、ＳＪＮ－２５１１、が挙げられる。またＢＭＰ阻害剤としては、ノギン（noggin）、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、ＬＤＮ１９３１８９、又はα－２マクログロブリンが挙げられる。
ＴＧＦβ阻害剤又はＢＭＰ阻害剤の濃度は、特に限定されるものではなく、それぞれのＴＧＦβ阻害剤又はＢＭＰ阻害剤の有効濃度に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＳＢ－４３１５４２は、１～１００μＭで使用することができ、好ましくは５～５０μＭであり、より好ましくは７～２０μＭである。また、ノギンは、２０ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬで使用することが可能であり、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００～５００ｎｇ／ｍＬである。
神経上皮細胞誘導工程（１）において、ｉＰＳ細胞は、限定されるものではないが、好ましくはＴＧＦβ阻害剤及び／又はＢＭＰ（bone morphogenetic protein）阻害剤の存在下で培養される。ＴＧＦβ阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えばＡ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、ＳＪＮ－２５１１、が挙げられる。またＢＭＰ阻害剤としては、ノギン（noggin）、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、ＤＡＮ、ＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質、スクレロスチン／ＳＯＳＴ、ＬＤＮ１９３１８９、又はα－２マクログロブリンが挙げられる。
ＴＧＦβ阻害剤又はＢＭＰ阻害剤の濃度は、特に限定されるものではなく、それぞれのＴＧＦβ阻害剤又はＢＭＰ阻害剤の有効濃度に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＳＢ－４３１５４２は、１～１００μＭで使用することができ、好ましくは５～５０μＭであり、より好ましくは７～２０μＭである。また、ノギンは、２０ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬで使用することが可能であり、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００～５００ｎｇ／ｍＬである。
【0021】
本工程（１）で得られる神経上皮細胞は、未分化な細胞であり、ニューロン、グリア細胞などに分化することができる。また、神経上皮細胞は生体内においては、お互いに密着結合する性質を有している。神経上皮細胞のマーカーとしては、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＨＥＳ１、ＨＥＳ３、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、又はＳＯＸ１０を挙げることができる。
【0022】
《神経ロゼット形成工程（２）》
神経ロゼット形成工程（２）では、前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成させる。前記神経上皮細胞は、細胞塊の状態で播種してもよいが、好ましくは単細胞に分離して播種する。また、神経ロゼット形成工程（２）では、限定されるものではないが、好ましくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）存在下、又はＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路若しくはＲＡＳ／ＥＲＫ経路を活性化する因子の存在下で培養される。
神経ロゼット形成工程（２）では、前記神経上皮細胞を、培養することによって、神経ロゼットを形成させる。前記神経上皮細胞は、細胞塊の状態で播種してもよいが、好ましくは単細胞に分離して播種する。また、神経ロゼット形成工程（２）では、限定されるものではないが、好ましくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）存在下、又はＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路若しくはＲＡＳ／ＥＲＫ経路を活性化する因子の存在下で培養される。
【0023】
細胞を細胞塊として播種する方法は、特に限定されるものではないが、例えば以下のように実施することができる。神経上皮細胞シートを、１ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（Dispase）で、３７℃、３分間処理する。細胞シートを、ゆっくりとピペッティングすることにより、細胞塊を形成させる。また、例えばＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を細胞に作用させて細胞塊を形成させることもできる。更にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅを用いて細胞塊を形成させることもできる。
細胞塊１つあたりの細胞数は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０～２０００個であり、より好ましくは５０～１０００個であり、より好ましくは１００～５００個である。
細胞塊１つあたりの細胞数は、特に限定されるものではないが、好ましくは１０～２０００個であり、より好ましくは５０～１０００個であり、より好ましくは１００～５００個である。
【0024】
また、細胞を単細胞に分離して播種する方法は、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の方法によって実施することができる。
播種時の細胞濃度は、細胞塊として播種する場合も、単細胞に分離して播種する場合も、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、工程（１）で神経上皮細胞に誘導された細胞は、ｉＰＳ細胞と比較して増殖能が低下しているため、工程（１）の細胞濃度よりも高い濃度で播種することが好ましい。例えば、細胞の濃度は、１．０×１０４～１．０×１０６細胞／ｃｍ２であり、好ましくは５．０×１０４～５．０×１０５細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは７．０×１０４～３．０×１０５細胞／ｃｍ２である。また、単細胞に分離して播種する場合は、ＲＯＣＫ阻害剤を用いることが好ましく、工程（１）と同様の条件で用いることができる。
工程（２）においては、細胞塊の播種によっても本発明の効果が得られるが、更に好ましくは、前記の細胞濃度の範囲で播種することにより、細胞と細胞との接触を抑制し、アルツハイマー病患者における病態を再現できると考えられる。
播種時の細胞濃度は、細胞塊として播種する場合も、単細胞に分離して播種する場合も、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、工程（１）で神経上皮細胞に誘導された細胞は、ｉＰＳ細胞と比較して増殖能が低下しているため、工程（１）の細胞濃度よりも高い濃度で播種することが好ましい。例えば、細胞の濃度は、１．０×１０４～１．０×１０６細胞／ｃｍ２であり、好ましくは５．０×１０４～５．０×１０５細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは７．０×１０４～３．０×１０５細胞／ｃｍ２である。また、単細胞に分離して播種する場合は、ＲＯＣＫ阻害剤を用いることが好ましく、工程（１）と同様の条件で用いることができる。
工程（２）においては、細胞塊の播種によっても本発明の効果が得られるが、更に好ましくは、前記の細胞濃度の範囲で播種することにより、細胞と細胞との接触を抑制し、アルツハイマー病患者における病態を再現できると考えられる。
【0025】
（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））
神経ロゼット形成工程（２）において、例えば神経上皮細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、ｂＦＧＦと称することがある）の存在下で培養されてもよい。ｂＦＧＦは、ＦＧＦ２とも称され、ヒトで同定されている２２種のＦＧＦのうちの１種である。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）と結合し、例えば強力な血管新生作用を示す。
ｂＦＧＦの濃度は、神経ロゼットが形成される限りにおいて特に限定されるものではいが、好ましくは５～３００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬである。
神経ロゼット形成工程（２）において、例えば神経上皮細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、ｂＦＧＦと称することがある）の存在下で培養されてもよい。ｂＦＧＦは、ＦＧＦ２とも称され、ヒトで同定されている２２種のＦＧＦのうちの１種である。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）と結合し、例えば強力な血管新生作用を示す。
ｂＦＧＦの濃度は、神経ロゼットが形成される限りにおいて特に限定されるものではいが、好ましくは５～３００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬである。
【0026】
（ＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路活性化因子）
神経ロゼット形成工程（２）において、神経上皮細胞は、例えばＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路活性化因子の存在下で培養されてもよい。
ＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路とは、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）がプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、別名がＡＫＴ）をリン酸化して活性化する経路である。そして同経路の活性化は、神経細胞の増加に必要な神経幹細胞の自己複製や神経新生を促進すると報告されている。
ＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路活性化因子としては、限定されるものではないが、Akt Activator II、SC79（CAS 305834-79-1）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、７４０－ＹＰ、ＥＧＦ、又はＶＥＧＦが挙げられる。
神経ロゼット形成工程（２）において、神経上皮細胞は、例えばＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路活性化因子の存在下で培養されてもよい。
ＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路とは、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）がプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、別名がＡＫＴ）をリン酸化して活性化する経路である。そして同経路の活性化は、神経細胞の増加に必要な神経幹細胞の自己複製や神経新生を促進すると報告されている。
ＰＩ３－Ｋ／ＡＫＴ経路活性化因子としては、限定されるものではないが、Akt Activator II、SC79（CAS 305834-79-1）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、７４０－ＹＰ、ＥＧＦ、又はＶＥＧＦが挙げられる。
【0027】
（ＲＡＳ／ＥＲＫ経路活性剤活性化因子）
神経ロゼット形成工程（２）において、神経上皮細胞は、例えばＲＡＳ／ＥＲＫ経路活性剤活性化因子の存在下で培養されてもよい。
ＲＡＳ／ＥＲＫ経路とは、Ｒａｓタンパク質が（ＲＡＳ）が、ＲＡＦタンパク質キナーゼ（ＲＡＦ）、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ（ＭＥＫ）を介して、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化する経路である。そして、ＭＥＫ／ＥＲＫ Ｐａｔｈｗａｙを阻害すると、海馬の細胞の神経新生が阻害されると報告されている。上記より、ＲＡＳ／ＥＲＫ経路（より正確には、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路）の活性化は、神経細胞の増加に必要な神経新生を促進すると考えられる。
ＲＡＳ／ＥＲＫ経路活性剤活性化因子としては、限定されるものではないが、isoproterenol Hydrochloride、t-Butylhydroquinone、fisetin、ceramide C6、及びKU-0058948が挙げられる。
神経ロゼット形成工程（２）において、神経上皮細胞は、例えばＲＡＳ／ＥＲＫ経路活性剤活性化因子の存在下で培養されてもよい。
ＲＡＳ／ＥＲＫ経路とは、Ｒａｓタンパク質が（ＲＡＳ）が、ＲＡＦタンパク質キナーゼ（ＲＡＦ）、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ（ＭＥＫ）を介して、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化する経路である。そして、ＭＥＫ／ＥＲＫ Ｐａｔｈｗａｙを阻害すると、海馬の細胞の神経新生が阻害されると報告されている。上記より、ＲＡＳ／ＥＲＫ経路（より正確には、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路）の活性化は、神経細胞の増加に必要な神経新生を促進すると考えられる。
ＲＡＳ／ＥＲＫ経路活性剤活性化因子としては、限定されるものではないが、isoproterenol Hydrochloride、t-Butylhydroquinone、fisetin、ceramide C6、及びKU-0058948が挙げられる。
【0028】
培養に用いる培養プレートは、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではなく、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の培養プレートを用いることができるが、ラミニンが被覆された培養プレートを用いることが好ましい。
培養の条件（温度、ＣＯ２濃度、及び培地等）は、神経ロゼットが形成される限りにおいて特に限定されるものではなく、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の条件を用いることができる。
培養期間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば２～１０日であり、より好ましくは３～７日であり、更に好ましくは４～６日である。
培養の条件（温度、ＣＯ２濃度、及び培地等）は、神経ロゼットが形成される限りにおいて特に限定されるものではなく、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の条件を用いることができる。
培養期間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば２～１０日であり、より好ましくは３～７日であり、更に好ましくは４～６日である。
【0029】
神経ロゼット形成工程（２）において形成される神経ロゼットとは、複数の神経幹細胞がロゼット状（放射状）に集まる（配列する）ことを意味する。すなわち、「ロゼット形成」とは、細胞が培養プレートに接着する形の培養において、複数の神経幹細胞がロゼット状（放射状）に集まる（配列する）ことを意味する。
【0030】
《成熟神経細胞誘導工程（３）》
成熟神経細胞誘導工程（３）では、工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。
成熟神経細胞誘導工程（３）では、工程（２）で得られた細胞を、単細胞に分離して播種し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する。
【0031】
また、細胞を単細胞に分離して播種する方法は、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の方法によって実施することができる。
播種時の細胞濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、神経ロゼットを形成した細胞は、ｉＰＳ細胞と比較して増殖能が低下しているため、やや高い濃度で播種することが好ましい。細胞の濃度は、２．０×１０４～２．０×１０６細胞／ｃｍ２であり、好ましくは５．０×１０４～１．０×１０６細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは０．８×１０４～５．０×１０５細胞／ｃｍ２である。
播種時の細胞濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、神経ロゼットを形成した細胞は、ｉＰＳ細胞と比較して増殖能が低下しているため、やや高い濃度で播種することが好ましい。細胞の濃度は、２．０×１０４～２．０×１０６細胞／ｃｍ２であり、好ましくは５．０×１０４～１．０×１０６細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは０．８×１０４～５．０×１０５細胞／ｃｍ２である。
【0032】
成熟神経細胞誘導工程（３）で用いるＲＯＣＫ阻害剤は、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」に記載のものを用いることができる。Ｒｏｃｋ阻害剤は、工程（３）の全工程において添加してもよいが、工程（３）の初期の段階において添加して培養し、後期段階ではＲＯＣＫ阻害剤の濃度を減少させたり、又は非存在下で培養してもよい。工程（３）の初期の段階でＲｏｃｋ阻害剤を添加することにより、単細胞に分離した状態で播種される細胞が死滅しやすいことを防ぐことができるからである。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する初期段階の時間は、特に限定されるものではないが、例えば６～４８時間でよいが、好ましくは１２～２４時間である。
【0033】
（脳由来神経栄養因子）
成熟神経細胞誘導工程（３）では、限定されるものではないが、例えば脳由来神経栄養因子（以下、ＢＤＮＦと称することがある）存在下で培養してもよい。ＢＤＮＦなどを添加することによって、更に効率良く成熟神経細胞を誘導することができる。
ＢＤＮＦの濃度は、成熟神経細胞が誘導される限りにおいて特に限定されるものではいが、好ましくは１～８０ｎｇ／ｍＬである。
成熟神経細胞誘導工程（３）では、限定されるものではないが、例えば脳由来神経栄養因子（以下、ＢＤＮＦと称することがある）存在下で培養してもよい。ＢＤＮＦなどを添加することによって、更に効率良く成熟神経細胞を誘導することができる。
ＢＤＮＦの濃度は、成熟神経細胞が誘導される限りにおいて特に限定されるものではいが、好ましくは１～８０ｎｇ／ｍＬである。
【0034】
培養に用いる培養プレートは、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではなく、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の培養プレートを用いることができるが、ラミニンが被覆された培養プレートを用いることが好ましい。
培養の条件（温度、ＣＯ２濃度、及び培地等）は、成熟神経細胞が誘導される限りにおいて特に限定されるものではなく、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の条件を用いることができる。
培養期間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５～４０日であり、より好ましくは１０～３０日であり、更に好ましくは１２～２０日である。
培養の条件（温度、ＣＯ２濃度、及び培地等）は、成熟神経細胞が誘導される限りにおいて特に限定されるものではなく、前記「神経上皮細胞誘導工程（１）」の項に記載の条件を用いることができる。
培養期間は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５～４０日であり、より好ましくは１０～３０日であり、更に好ましくは１２～２０日である。
【0035】
本工程（３）で得られる成熟神経細胞は、ＴＵＪ１及びＭＡＰ２等のマーカーを有するものが好ましい。
【0036】
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法によって、健常人のｉＰＳ細胞及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から成熟神経細胞を誘導した場合、健常人のｉＰＳ細胞からは健常人の海馬の特徴を有する神経細胞が誘導され、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からは、アルツハイマー病患者の海馬の特徴を有する神経細胞が誘導される。具体的には、アルツハイマー病患者のｉＰＳ細胞から誘導された細胞においては、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の数は減少しないが、未成熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）、及び成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が抑制されていた。この特徴は、アルツハイマー病患者の海馬の特徴と一致するものである。
【0037】
［２］アルツハイマー疾患モデル神経細胞
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞は、前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法によって得ることができる。前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞においては、未成熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）、及び成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が減少している。
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いることによって、アルツハイマー病の病態に影響を与える薬物をスクリーニングできる。
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞は、前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法によって得ることができる。前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞においては、未成熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）、及び成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が減少している。
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いることによって、アルツハイマー病の病態に影響を与える薬物をスクリーニングできる。
【0038】
［３］アルツハイマー病作用薬剤のスクリーニング方法
本発明のアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法は、（Ａ）前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する工程、及び（Ｂ）候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する工程、を含む。
本発明のアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法は、（Ａ）前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する工程、及び（Ｂ）候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する工程、を含む。
【0039】
《工程（Ａ）》
工程（Ａ）においては、前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する。すなわち、神経上皮細胞誘導工程（１）、神経ロゼットを形成する工程（２）、及び成熟神経細胞誘導工程（３）のいずれか１つ以上の工程において細胞に候補物質を接触させ、候補物質が接触していない細胞と比較することによって、アルツハイマー疾患モデル神経細胞への候補物質の作用を解析することができる。
候補物質を添加する工程は、特に限定されるものではない。例えば、生体でアルツハイマーに直接効果のある薬剤をスクリーニングするためには、工程（２）又は工程（３）において候補物質を添加するとよいと考えられる。また、ｉＰＳ細胞をアルツハイマー病の治療に用いる場合において、生体内におけるｉＰＳ細胞の神経細胞への誘導を補助する薬剤をスクリーニングするためには、工程（１）において候補物質を添加するとよいと考えられる。しかしながら、これらの説明により、本発明のスクリーニング方法は限定されるものではない。
工程（Ａ）においては、前記アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法における、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）の１つ以上の工程において、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質を添加して、細胞を培養する。すなわち、神経上皮細胞誘導工程（１）、神経ロゼットを形成する工程（２）、及び成熟神経細胞誘導工程（３）のいずれか１つ以上の工程において細胞に候補物質を接触させ、候補物質が接触していない細胞と比較することによって、アルツハイマー疾患モデル神経細胞への候補物質の作用を解析することができる。
候補物質を添加する工程は、特に限定されるものではない。例えば、生体でアルツハイマーに直接効果のある薬剤をスクリーニングするためには、工程（２）又は工程（３）において候補物質を添加するとよいと考えられる。また、ｉＰＳ細胞をアルツハイマー病の治療に用いる場合において、生体内におけるｉＰＳ細胞の神経細胞への誘導を補助する薬剤をスクリーニングするためには、工程（１）において候補物質を添加するとよいと考えられる。しかしながら、これらの説明により、本発明のスクリーニング方法は限定されるものではない。
【0040】
前記工程（１）、工程（２）、及び工程（３）は、候補物質を添加することを除いては、前記「［１］アルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法」の項に記載のように実施することができる。
【0041】
（候補物質）
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる候補物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５－８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１－３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの候補物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
添加する候補物質の濃度は、特に限定されるものではないが、化合物によって、作用する濃度にばらつきがある可能性が高いため、いくつかの濃度で候補物質を添加することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる候補物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５－８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１－３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの候補物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
添加する候補物質の濃度は、特に限定されるものではないが、化合物によって、作用する濃度にばらつきがある可能性が高いため、いくつかの濃度で候補物質を添加することが好ましい。
【0042】
《工程（Ｂ）》
工程（Ｂ）においては、候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する。
細胞の分析方法は、候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞との差異が認識できる方法である限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、候補物質が神経細胞の細胞数に影響を与えるならば、細胞数を測定することによって、その候補物質の作用を分析することができる。候補物質を添加しない細胞と比較して、候補物質を添加した細胞の細胞数が増加した場合、細胞の新生に促進作用があると判断することができる。逆に、細胞数が減少した場合、細胞の新生に抑制作用があると判断することができる。また、細胞数のみでなく、細胞の外観を目視することのよって、細胞への作用を判断することもできる。
更に、未成熟神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１、又は成熟神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の発現量を、ＰＣＲなどで測定することによってその候補物質の作用を分析することができる。例えば候補物質を添加しない細胞と比較して、候補物質を添加した細胞のＴＵＪ１又はＭＡＰ２が増加した場合、アルツハイマー病の改善に促進作用があると判断することができる。逆に、ＴＵＪ１又はＭＡＰ２が減少した場合、アルツハイマー病の改善に抑制作用があると判断することができる。
工程（Ｂ）においては、候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞とを分析し、細胞に作用する候補物質を選択する。
細胞の分析方法は、候補物質を添加した細胞と、候補物質を添加しない細胞との差異が認識できる方法である限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、候補物質が神経細胞の細胞数に影響を与えるならば、細胞数を測定することによって、その候補物質の作用を分析することができる。候補物質を添加しない細胞と比較して、候補物質を添加した細胞の細胞数が増加した場合、細胞の新生に促進作用があると判断することができる。逆に、細胞数が減少した場合、細胞の新生に抑制作用があると判断することができる。また、細胞数のみでなく、細胞の外観を目視することのよって、細胞への作用を判断することもできる。
更に、未成熟神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１、又は成熟神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の発現量を、ＰＣＲなどで測定することによってその候補物質の作用を分析することができる。例えば候補物質を添加しない細胞と比較して、候補物質を添加した細胞のＴＵＪ１又はＭＡＰ２が増加した場合、アルツハイマー病の改善に促進作用があると判断することができる。逆に、ＴＵＪ１又はＭＡＰ２が減少した場合、アルツハイマー病の改善に抑制作用があると判断することができる。
【0043】
《作用》
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法において、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から製造した神経細胞が、アルツハイマー病患者の海馬の神経細胞の特徴を有する細胞に誘導できた理由は、詳細に解析されているわけではないが、以下のように推定することができる。
アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞と、健常人由来のｉＰＳ細胞とは、本質的に違いがあるものと考えられる。ここでｉＰＳ細胞から成熟神経細胞を誘導する場合、ｉＰＳ細胞同士の接触が神経細胞の誘導に効果があるものと推定される。非特許文献２及び３の成熟神経細胞の誘導方法においては、高密度状態にしたｉＰＳ細胞に対して成熟神経細胞への誘導を開始している。これらの非特許文献２及び３の成熟神経細胞の誘導方法を用いると、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞であっても、過剰な細胞の接触により、健常人と同程度の成熟神経細胞生成能力を持つ神経幹細胞が誘導されると考えられる。
すなわち、高密度のｉＰＳ細胞に対して、成熟神経誘導を開始すると（比較例１、比較例４）、健常人と同程度の成熟神経細胞生成能力を持つ神経幹細胞が誘導される。また、神経幹細胞を細胞塊で播き込む（比較例３）と、健常人と同程度の成熟神経細胞が生成された。このことは、実際のアルツハイマー病患者の海馬では、神経幹細胞の接触は起こっていないと推定される。本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法においては、ｉＰＳ細胞を単離して、低密度で播種及び培養することにより、アルツハイマー病海馬に存在すると考えられる、成熟神経細胞生成能力が低い神経幹細胞が生成できた。また、上記の幹細胞を単離して、播種及び培養することにより、アルツハイマー病患者の海馬の特徴を有する成熟神経細胞が製造できた。
なお、健常人由来のｉＰＳ細胞からは、健常人の海馬の特徴を有する成熟神経細胞が誘導されており、このことからも本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法は、生体内の海馬における細胞同士の接触に近い状態を再現できているものと考えられる。
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法において、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から製造した神経細胞が、アルツハイマー病患者の海馬の神経細胞の特徴を有する細胞に誘導できた理由は、詳細に解析されているわけではないが、以下のように推定することができる。
アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞と、健常人由来のｉＰＳ細胞とは、本質的に違いがあるものと考えられる。ここでｉＰＳ細胞から成熟神経細胞を誘導する場合、ｉＰＳ細胞同士の接触が神経細胞の誘導に効果があるものと推定される。非特許文献２及び３の成熟神経細胞の誘導方法においては、高密度状態にしたｉＰＳ細胞に対して成熟神経細胞への誘導を開始している。これらの非特許文献２及び３の成熟神経細胞の誘導方法を用いると、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞であっても、過剰な細胞の接触により、健常人と同程度の成熟神経細胞生成能力を持つ神経幹細胞が誘導されると考えられる。
すなわち、高密度のｉＰＳ細胞に対して、成熟神経誘導を開始すると（比較例１、比較例４）、健常人と同程度の成熟神経細胞生成能力を持つ神経幹細胞が誘導される。また、神経幹細胞を細胞塊で播き込む（比較例３）と、健常人と同程度の成熟神経細胞が生成された。このことは、実際のアルツハイマー病患者の海馬では、神経幹細胞の接触は起こっていないと推定される。本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法においては、ｉＰＳ細胞を単離して、低密度で播種及び培養することにより、アルツハイマー病海馬に存在すると考えられる、成熟神経細胞生成能力が低い神経幹細胞が生成できた。また、上記の幹細胞を単離して、播種及び培養することにより、アルツハイマー病患者の海馬の特徴を有する成熟神経細胞が製造できた。
なお、健常人由来のｉＰＳ細胞からは、健常人の海馬の特徴を有する成熟神経細胞が誘導されており、このことからも本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法は、生体内の海馬における細胞同士の接触に近い状態を再現できているものと考えられる。
【実施例】
【0044】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0045】
《比較例１》
本比較例では、工程（１）で高密度でｉＰＳ細胞を播種した。工程（２）では、細胞を細胞塊で播種し、工程（３）では、細胞を単細胞で播種した。３人の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及び３人のアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から成熟神経細胞を製造した。
本比較例では、工程（１）で高密度でｉＰＳ細胞を播種した。工程（２）では、細胞を細胞塊で播種し、工程（３）では、細胞を単細胞で播種した。３人の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及び３人のアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から成熟神経細胞を製造した。
【0046】
ｉＰＳ細胞の前培養は、以下の通り行った。
理化学研究所から譲渡された健常者由来ｉＰＳ細胞２株（ＨＰＳ００７６，ＨＰＳ０３６０）、アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞３株（ＨＰＳ０２５４，ＨＰＳ０２５５，ＨＰＳ０２５６）を使用した。また、タカラバイオより購入した健常者由来ｉＰＳ細胞１株（Ｐ１１０２５）も併せて使用した。前記ｉＰＳ細胞６株は、使用時まで凍結溶液と共にバイアル中で保存した。保存は液体窒素にバイアルを浸す形で実施した。
ｉＰＳ細胞は以下の流れで凍結状態から融解して使用した。細胞を保存しているバイアルを液体窒素から取り出して、３７℃の温水で満たした恒温層に浸して溶解した。常温に戻したｍＴｅＳＲＴＭ１（cGMP, feeder-free maintenance medium for human ES and iPS Cells, STEMCELL Technologies；ｍＴｅＳＲ１）とＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２，富士フイルム和光純薬株式会社）を混和した溶液（Ｙ２７６３２の濃度は１０μＭ；以下、ｍＴｅＳＲ１－Ｙ）を調製し、細胞（１ｍＬ）及びｍＴｅＳＲ１－Ｙ（６－８ｍＬ）を、１５ｍＬチューブ中で混和した。遠心（２９０Ｇ，２５℃，５分）後に上清を取り除き、ｍＴｅＳＲＴＭ１－Ｙ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）と混和して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液でコートしている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（NuncTM Cell-Culture Treated Multidishes）に播き込んだ。Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液及びＭａｔｒｉｇｅｌ溶液コートは、以下の通り調製した。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Thermo Fisher Scientific）とＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル 基底膜マトリックス（Corning）を６１：１で混和した。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液コート：１ｍＬ／ｗｅｌｌのＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液を除去して使用した。
以後、特記がなければ、細胞は全て３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
理化学研究所から譲渡された健常者由来ｉＰＳ細胞２株（ＨＰＳ００７６，ＨＰＳ０３６０）、アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞３株（ＨＰＳ０２５４，ＨＰＳ０２５５，ＨＰＳ０２５６）を使用した。また、タカラバイオより購入した健常者由来ｉＰＳ細胞１株（Ｐ１１０２５）も併せて使用した。前記ｉＰＳ細胞６株は、使用時まで凍結溶液と共にバイアル中で保存した。保存は液体窒素にバイアルを浸す形で実施した。
ｉＰＳ細胞は以下の流れで凍結状態から融解して使用した。細胞を保存しているバイアルを液体窒素から取り出して、３７℃の温水で満たした恒温層に浸して溶解した。常温に戻したｍＴｅＳＲＴＭ１（cGMP, feeder-free maintenance medium for human ES and iPS Cells, STEMCELL Technologies；ｍＴｅＳＲ１）とＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２，富士フイルム和光純薬株式会社）を混和した溶液（Ｙ２７６３２の濃度は１０μＭ；以下、ｍＴｅＳＲ１－Ｙ）を調製し、細胞（１ｍＬ）及びｍＴｅＳＲ１－Ｙ（６－８ｍＬ）を、１５ｍＬチューブ中で混和した。遠心（２９０Ｇ，２５℃，５分）後に上清を取り除き、ｍＴｅＳＲＴＭ１－Ｙ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）と混和して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液でコートしている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（NuncTM Cell-Culture Treated Multidishes）に播き込んだ。Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液及びＭａｔｒｉｇｅｌ溶液コートは、以下の通り調製した。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Thermo Fisher Scientific）とＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル 基底膜マトリックス（Corning）を６１：１で混和した。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液コート：１ｍＬ／ｗｅｌｌのＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液を除去して使用した。
以後、特記がなければ、細胞は全て３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0047】
ｉＰＳ細胞は以下の流れで前培養を行った。前記ｉＰＳ細胞を、６０－９０％程度コンフルエンスになるまで培養した。培養では、細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ翌日又は翌々日から毎日培地交換を行った。培地交換は、新規のｍＴｅＳＲＴＭ１（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にすることで行った。６０－９０％程度コンフルエンスになったらｉＰＳ細胞を継代した。継代では、はじめに、ＤＰＢＳ（Thermo Fisher Scientific）で１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳ（UltraPureTM 0.5M EDTA, pH 8.0, InvitrogenTMとＤＰＢＳを１：１０００で混和したもの。以後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳと表記する。）で５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去して、ｍＴｅＳＲＴＭ１を吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を細胞塊の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。続いて、ｉＰＳ細胞の細胞塊とｍＴｅＳＲＴＭ１の混和液を、新しいＭａｔｒｉｇｅｌ溶液でコートされた６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（播き込む細胞量は、１ｗｅｌｌの１／２－１／６量、播き込む溶液量は２－３ｍＬ／ｗｅｌｌ）。播き込み後、６０－９０％程度コンフルエンスになるまで再度培養した。
【0048】
工程（１）は、以下の通り行った。
前培養で、６０－９０％程度コンフルエンスになったｉＰＳ細胞を、ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙ（ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ（１Ｘ），ｎｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ，Ｇｉｂｃｏに１０μＭのＹ２７６３２含有；以下、Ｔｒｐ－Ｙ）で５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、単細胞にしたｉＰＳ細胞とｍＴｅＳＲ１－Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいｍＴｅＳＲ１－Ｙと混和し、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液コートした低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＣ Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播き込んだ。（１．８×１０４細胞／２００μＬ／ｗｅｌｌ）。最後に、播き込んだ低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを遠心（２００Ｇ．常温，３ｍｉｎ）した。遠心して、Ｕボトムプレートの底に細胞を集めることにより、ｉＰＳ細胞を高密度で細胞塊とし、且つ浮遊状態で培養した。Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液及びＬｉｐｉｄｕｒｅ溶液コートは、以下の通り調製した。
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液：エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）とＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油株式会社）をＬｉｐｉｄｕｒｅが０．５ｗｔ％になるように混和した。
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液コート：１００μＬ／ｗｅｌｌのＬｉｐｉｄｕｒｅ溶液を低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて常温で１２時間以上静置して、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液のエタノールを蒸発させた。
前培養で、６０－９０％程度コンフルエンスになったｉＰＳ細胞を、ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙ（ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ（１Ｘ），ｎｏ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ，Ｇｉｂｃｏに１０μＭのＹ２７６３２含有；以下、Ｔｒｐ－Ｙ）で５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、単細胞にしたｉＰＳ細胞とｍＴｅＳＲ１－Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいｍＴｅＳＲ１－Ｙと混和し、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液コートした低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＳＣ Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播き込んだ。（１．８×１０４細胞／２００μＬ／ｗｅｌｌ）。最後に、播き込んだ低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを遠心（２００Ｇ．常温，３ｍｉｎ）した。遠心して、Ｕボトムプレートの底に細胞を集めることにより、ｉＰＳ細胞を高密度で細胞塊とし、且つ浮遊状態で培養した。Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液及びＬｉｐｉｄｕｒｅ溶液コートは、以下の通り調製した。
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液：エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社）とＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油株式会社）をＬｉｐｉｄｕｒｅが０．５ｗｔ％になるように混和した。
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液コート：１００μＬ／ｗｅｌｌのＬｉｐｉｄｕｒｅ溶液を低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて常温で１２時間以上静置して、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ溶液のエタノールを蒸発させた。
【0049】
４８時間後に、細胞の培地を交換した。
低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから、培地を全量除去した。細胞の塊（Embryoid body；以後、ＥＢ）を壊さないように、先の部分３ｍｍを切除した１０００μＬチップを使って培地を除去した。ＤＦＫ５％ＤＳ溶液を低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに加えた（２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから、培地を全量除去した。細胞の塊（Embryoid body；以後、ＥＢ）を壊さないように、先の部分３ｍｍを切除した１０００μＬチップを使って培地を除去した。ＤＦＫ５％ＤＳ溶液を低吸着９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに加えた（２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
【0050】
【表1】
【0051】
工程（２）は以下の通り行った。
工程（１）の神経誘導から１０日後（Ｄａｙ１０）に、４８個のＥＢを培地ごと１５ｍＬチューブに移した後、常温に５－７ｍｉｎ静置して、その後、上清を取り除いた。上清を取り除いた後、ＤＦＮ２Ｂ＿５％ＫＳＲ溶液を４ｍＬ加えて、ＤＦＮ２Ｂプレートに播き込んだ。１ｗｅｌｌあたり、４８個のＥＢと４ｍＬのＤＦＫ５％ＤＳ溶液を目安とした。
ＤＦＮ２Ｂ＿５％ＫＳＲ溶液は、下記の表の溶液を混和して作成した。
工程（１）の神経誘導から１０日後（Ｄａｙ１０）に、４８個のＥＢを培地ごと１５ｍＬチューブに移した後、常温に５－７ｍｉｎ静置して、その後、上清を取り除いた。上清を取り除いた後、ＤＦＮ２Ｂ＿５％ＫＳＲ溶液を４ｍＬ加えて、ＤＦＮ２Ｂプレートに播き込んだ。１ｗｅｌｌあたり、４８個のＥＢと４ｍＬのＤＦＫ５％ＤＳ溶液を目安とした。
ＤＦＮ２Ｂ＿５％ＫＳＲ溶液は、下記の表の溶液を混和して作成した。
【0052】
【表2】
【0053】
ＤＦＮ２Ｂ溶液は、下記の表の溶液を混和して作成した。
【0054】
【表3】
【0055】
ＤＦＮ２Ｂプレートは、以下の通り作成した。
１ｍＬ／ｗｅｌｌの混和液（ＤＦＮ２Ｂ溶液とＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル 基底膜マトリックスを１９：１で混和）を、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置した。混和液を除去して、ＤＦＮ２Ｂプレートとして使用した。
工程（２）の４日後（Ｄａｙ１４）、８日後（Ｄａｙ１８）、１２日後（Ｄａｙ２２）に培地交換を行った。ＤＦＮ２Ｂプレートのｗｅｌｌから、培地を除去した（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。ＤＦＮ２Ｂ溶液をＤＦＮ２Ｂプレートのｗｅｌｌに加えた（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
１ｍＬ／ｗｅｌｌの混和液（ＤＦＮ２Ｂ溶液とＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル 基底膜マトリックスを１９：１で混和）を、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置した。混和液を除去して、ＤＦＮ２Ｂプレートとして使用した。
工程（２）の４日後（Ｄａｙ１４）、８日後（Ｄａｙ１８）、１２日後（Ｄａｙ２２）に培地交換を行った。ＤＦＮ２Ｂプレートのｗｅｌｌから、培地を除去した（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。ＤＦＮ２Ｂ溶液をＤＦＮ２Ｂプレートのｗｅｌｌに加えた（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
【0056】
工程（３）は以下の通り行った。
工程（２）の１６日後（Ｄａｙ２６）に、神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。続いて、単細胞にしたｉＰＳ細胞とＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（１×１０５細胞／２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
なお、前記ＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙは、Neural differential basal medium、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、１００μｇ／ｍＬ；富士フイルム和光純薬）、及びＹ２７６３２（１０ｍＭ）を５０００：１：５で混合した。
工程（２）の１６日後（Ｄａｙ２６）に、神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＰＢＳ（－）で１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。続いて、単細胞にしたｉＰＳ細胞とＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（１×１０５細胞／２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
なお、前記ＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙは、Neural differential basal medium、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、１００μｇ／ｍＬ；富士フイルム和光純薬）、及びＹ２７６３２（１０ｍＭ）を５０００：１：５で混合した。
【0057】
工程（３）の２日目（Ｄａｙ２７）に培地交換を行った。
Neural differential basal medium（常温）とＢＤＮＦを、５０００：１の割合で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋ＢＤ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の４日目及び７日目（Ｄａｙ２９及びＤａｙ３２）に培地交換を行った。
９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の１０日目、１３日目、及び１６日目（Ｄａｙ３５、Ｄａｙ３８、Ｄａｙ４１）に培地交換を行った。
９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
Neural differential basal medium（常温）とＢＤＮＦを、５０００：１の割合で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋ＢＤ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の４日目及び７日目（Ｄａｙ２９及びＤａｙ３２）に培地交換を行った。
９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の１０日目、１３日目、及び１６日目（Ｄａｙ３５、Ｄａｙ３８、Ｄａｙ４１）に培地交換を行った。
９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
【0058】
【表4】
【0059】
得られた神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現を蛍光抗体染色によって確認した。培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ残した９６ウエルプレートの細胞に、４％ＰＦＡ ｉｎ ＰＢＳ（４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、常温で１０分間処理した。処理液を全量捨てた後、３５０μＬ／ｗｅｌｌの４％ＰＦＡ ｉｎ ＰＢＳで１５分間処理した。処理終了後、処理液を全量捨て、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、１００μＬ／ｗｅｌｌのＴＸ ｉｎ ＰＢＳ（０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳ）を加え、１５分間処理し、その後ＰＢＳで４回洗浄した。１００μＬの３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ）を添加し、３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、ブロッキング液を全量捨て、ａｎｔｉ－ｃｈｉｃｋ ＭＡＰ２抗体溶液（Ａｂｃａｍ，５０００倍）、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＴＵＪ１抗体溶液（Ａｂｃａｍ，１０００倍）、及びａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＰＡＸ６抗体（ｓｉｇｍａ，１００倍）液を含む３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳを５０μＬ添加し、４℃で１２時間から２４時間静置した。ＰＢＳで４回洗浄し、ａｎｔｉ－ｃｈｉｃｋ Ａｌｅｘａ４８８抗体溶液（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，５００倍）、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ５４６抗体溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５００倍）、及びａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ Ａｌｅｘａ６４７抗体溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５００倍）を含む３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳを５０μＬ加え、室温で１時間静置した。ＰＢＳで４回洗浄し、顕微鏡（Ａ１システム、ニコン）で、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＰＡＸ６の蛍光染色像を撮影した。図１に蛍光顕微鏡像を示す。
なお、２次抗体の添加時に、細胞を探索のためにＤＡＰＩを添加した。
なお、２次抗体の添加時に、細胞を探索のためにＤＡＰＩを添加した。
【0060】
図１に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６，ＨＰＳ０３６０，Ｐ１１０２５）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４，ＨＰＳ０２５５，ＨＰＳ０２５６）で、神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞又はＴＵＪ１陽性細胞）及び神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の数の差は見られなかった。個々の細胞株間の差は見られたが、健常者ｉＰＳ細胞グループと、アルツハイマーｉＰＳ細胞グループとの間で差は見られなかった。
【0061】
《実施例１》
本実施例では、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）において、ｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種し、３人の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及び３人のアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から成熟神経細胞を製造した。
本実施例では、工程（１）、工程（２）、及び工程（３）において、ｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種し、３人の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及び３人のアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から成熟神経細胞を製造した。
【0062】
ｉＰＳ細胞の前培養は、比較例１の操作を繰り返した。
工程（１）は、以下の通り行った。
６０－９０％程度コンフルエンスになったｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、単細胞にしたｉＰＳ細胞とｍＴｅＳＲ１－Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいｍＴｅＳＲ１－Ｙと混和し、新しいＭａｔｒｉｇｅｌ溶液コートしている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（４．８×１０５細胞／２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（１）は、以下の通り行った。
６０－９０％程度コンフルエンスになったｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、単細胞にしたｉＰＳ細胞とｍＴｅＳＲ１－Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいｍＴｅＳＲ１－Ｙと混和し、新しいＭａｔｒｉｇｅｌ溶液コートしている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（４．８×１０５細胞／２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
【0063】
２日目から６日目まで、毎日以下の操作を行った。
Neural differential basal medium（常温）とノギン（富士フイルム和光純薬，２０μｇ／ｍＬ）とＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬，１０ｍＭ）を、１０００：１０：１の割合で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋ＳＮ）。６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＳＮを６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。ｉＰＳ細胞は、Ｄａｙ４～７で１００％コンフルエンスとなった。
Neural differential basal medium（常温）とノギン（富士フイルム和光純薬，２０μｇ／ｍＬ）とＳＢ４３１５４２（富士フイルム和光純薬，１０ｍＭ）を、１０００：１０：１の割合で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋ＳＮ）。６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＳＮを６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。ｉＰＳ細胞は、Ｄａｙ４～７で１００％コンフルエンスとなった。
【0064】
工程（２）は以下の通り行った
工程（１）の７日目に神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、単細胞にした細胞とＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，以後表記がない限り同プレートを使用する）に播き込んだ（２×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
ＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙは以下の通り、作製した。Neural differential basal medium、線維芽細胞成長因子（塩基性）（富士フイルム和光純薬，１００μｇ／ｍＬ）、及びＹ２７６３２（１０ｍＭ）を５０００：１：５で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙ）。
ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートは、以下の通り行った。
ポリ－Ｌ－オルニチン溶液（ポリ－Ｌ－オルニチン（sigma、Ｐ３６５５－１０ＭＧ）を１００ｍＬの滅菌水に溶解）を、３００μＬ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置した。滅菌水（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。ラミニン溶液（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（ニッピ、８９２－０１２）と滅菌水を１：１３３で混和）を、３００μＬ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置した。静置後、ラミニン溶液を除去して使用した。
翌日（Ｄａｙ７－１１）以後、細胞の培地交換を行った。Neural differential basal medium（常温）とＦＧＦを、５０００：１の割合で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋Ｆ）。２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋Ｆを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（１）の７日目に神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、細胞を単細胞の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、単細胞にした細胞とＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，以後表記がない限り同プレートを使用する）に播き込んだ（２×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
ＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙは以下の通り、作製した。Neural differential basal medium、線維芽細胞成長因子（塩基性）（富士フイルム和光純薬，１００μｇ／ｍＬ）、及びＹ２７６３２（１０ｍＭ）を５０００：１：５で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙ）。
ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートは、以下の通り行った。
ポリ－Ｌ－オルニチン溶液（ポリ－Ｌ－オルニチン（sigma、Ｐ３６５５－１０ＭＧ）を１００ｍＬの滅菌水に溶解）を、３００μＬ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置した。滅菌水（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。ラミニン溶液（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（ニッピ、８９２－０１２）と滅菌水を１：１３３で混和）を、３００μＬ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加えて４℃で１２時間以上静置した。静置後、ラミニン溶液を除去して使用した。
翌日（Ｄａｙ７－１１）以後、細胞の培地交換を行った。Neural differential basal medium（常温）とＦＧＦを、５０００：１の割合で混和した（以後、ＮＤＢＭ＋Ｆ）。２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋Ｆを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
【0065】
工程（３）は以下の通り行った。
工程（２）の６日目（Ｄａｙ１２）に、神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、細胞を単細胞の形で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。続いて、単細胞にした細胞とＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（４×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。同様にポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コート（コート法は下に記述）している９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，１６４５８８，以後表記がない限り同プレートを使用する）に播き込んだ（播き込む細胞量は１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、播き込む溶液量は２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートは、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いて以外は、工程（２）と同様に行った。
工程（２）の６日目（Ｄａｙ１２）に、神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｐ－Ｙで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、Ｔｒｐ－Ｙを吹き付けることで、細胞を単細胞の形で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。続いて、単細胞にした細胞とＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（４×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。同様にポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コート（コート法は下に記述）している９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，１６４５８８，以後表記がない限り同プレートを使用する）に播き込んだ（播き込む細胞量は１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、播き込む溶液量は２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートは、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いて以外は、工程（２）と同様に行った。
【0066】
工程（３）の２日目（Ｄａｙ１３）に培地交換を行った。
２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を５００μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の４日目及び７日目（Ｄａｙ１５及びＤａｙ１８）に培地交換を行った。
２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を１ｍＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の１０日目、１３日目、及び１６日目（Ｄａｙ２１、Ｄａｙ２４、Ｄａｙ２７）に培地交換を行った。
２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を５００μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の４日目及び７日目（Ｄａｙ１５及びＤａｙ１８）に培地交換を行った。
２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を１ｍＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。
工程（３）の１０日目、１３日目、及び１６日目（Ｄａｙ２１、Ｄａｙ２４、Ｄａｙ２７）に培地交換を行った。
２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを２４ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅの培地を全量除いた後、ＮＤＢＭ＋ＢＤを９６ｗｅｌｌ ｐａｌｔｅのｗｅｌｌに加えた（２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
【0067】
ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の発現は、比較例１と同じ蛍光抗体染色によって確認した。
図２に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）とで、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の新生は大きく変化しなかったが、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が、アルツハイマーｉＰＳ細胞において、抑制された。すなわち、本発明の製造方法においては、アルツハイマーｉＰＳ細胞からの成熟神経細胞の誘導は、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映していた。
図２に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）とで、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の新生は大きく変化しなかったが、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が、アルツハイマーｉＰＳ細胞において、抑制された。すなわち、本発明の製造方法においては、アルツハイマーｉＰＳ細胞からの成熟神経細胞の誘導は、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映していた。
【0068】
《解析例》
実施例１で、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から得られた成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現を、以下のように解析した。
工程（１）の播種から２８日目の細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ溶液（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴに、２－メルカプトエタノール（９９％；富士フイルム和光純薬）を１００：１の割合で混和）を３５０μＬ／ｗｅｌｌ穏やかに加えた。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔのプロトコールに従って、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに基づいて、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの測定は、Fast SYBRTM Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用い、RT-PCR法で行った。RT-PCR反応は、StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて、プロトコールに従って実施した。ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６のプライマーは、以下のとおりである。
MAP2 forward primer: CCGTGTGGACCATGGGGCTG
MAP2 Reverse primer: GTCGTCGGGGTGATGCCACG
TUJ1 forward primer: CCTGGAACCCGGAACCAT
TUJ1 Reverse primer: AGGCCTGAAGAGATGTCCAAAG
PAX6 forward primer: TTACGAGACTGGCTCCATCA
PAX6 Reverse primer: CCGCTTATACTGGGCTATTT
GAPDH forward primer: GTCAACGGATTTGGTCGTATTG
GAPDH Reverse primer: CATGGGTGGAATCATATTGGAA
測定されたｃＤＮＡ量をｍＲＮＡ量に対応するとしてＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＰＡＸ６のｍＲＮＡ量を計算した。ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６の、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＰＡＸ６のｍＲＮＡ量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で補正した。ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６のｍＲＮＡ量は、４サンプルの平均値と標準誤差で表記した。ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６の有意差検定は、４サンプルの値に基づいて、行った。有意差検定では、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。
実施例１で、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及びアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）から得られた成熟神経細胞のＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現を、以下のように解析した。
工程（１）の播種から２８日目の細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ溶液（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴに、２－メルカプトエタノール（９９％；富士フイルム和光純薬）を１００：１の割合で混和）を３５０μＬ／ｗｅｌｌ穏やかに加えた。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔのプロトコールに従って、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）のプロトコールに基づいて、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの測定は、Fast SYBRTM Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用い、RT-PCR法で行った。RT-PCR反応は、StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて、プロトコールに従って実施した。ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６のプライマーは、以下のとおりである。
MAP2 forward primer: CCGTGTGGACCATGGGGCTG
MAP2 Reverse primer: GTCGTCGGGGTGATGCCACG
TUJ1 forward primer: CCTGGAACCCGGAACCAT
TUJ1 Reverse primer: AGGCCTGAAGAGATGTCCAAAG
PAX6 forward primer: TTACGAGACTGGCTCCATCA
PAX6 Reverse primer: CCGCTTATACTGGGCTATTT
GAPDH forward primer: GTCAACGGATTTGGTCGTATTG
GAPDH Reverse primer: CATGGGTGGAATCATATTGGAA
測定されたｃＤＮＡ量をｍＲＮＡ量に対応するとしてＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＰＡＸ６のｍＲＮＡ量を計算した。ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６の、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＰＡＸ６のｍＲＮＡ量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で補正した。ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６のｍＲＮＡ量は、４サンプルの平均値と標準誤差で表記した。ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６の有意差検定は、４サンプルの値に基づいて、行った。有意差検定では、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。
【0069】
図３の上から１段目の図に示したように、健常者細胞群（健常者由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６（図では０７６と表記）、ＨＰＳ０３６０（図では３６０と表記）、Ｐ１１０２５を、実施例の方法でＤａｙ２８まで神経誘導した細胞群）と、疾患細胞群（アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４（図では２５４と表記）、ＨＰＳ０２５５（図では２５５と表記）、ＨＰＳ０２５６（図では２５６と表記）を、実施例の方法でＤａｙ２８まで神経誘導した細胞群）のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量（遺伝子発現量）を比較した。ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＰＡＸ６のｍＲＮＡ量は実施例の方法で測定・正規化（ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量で補正した）した。［１］ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５又はＨＰＳ０２５６の、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５の対応するｍＲＮＡの全てに対して、有意差水準５％で有意であること、及び［２］ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５又はＨＰＳ０２５６の、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５の対応するｍＲＮＡの全てに対して共通で増加又は減少していること、の２点を満たす場合、ＨＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６の棒グラフの上に＊を記述した。まとめると、ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５の全ての測定値に対して有意に増加又は減少している場合、＊を記述した。データはＨＰＳ００７６の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。有意差の検定は、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。データの正規性や等分散の有無に関わらず、高い確度と信頼性で有意差を検出できることを採用の理由とした。各サンプルは４ずつとした。図３の上から２段目の図に示したように、健常者の海馬と、アルツハイマー患者の海馬のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量を比較した。健常者の海馬と、アルツハイマー患者の海馬のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量のデータは、公開データベースであるGene Expression Omnibusから取得した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36980）。健常者の海馬は１０サンプル、アルツハイマー患者の海馬は７サンプルのデータを比較した。データの測定・正規化（各サンプル間のｍＲＮＡ量の補正）は、データベース登録時に行われているため、申請者らは実施しなかった。アルツハイマー患者の海馬のＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、健常者の海馬の対応するｍＲＮＡに対して、有意に増加又は減少した場合、グラフの上に＊を記述した。データは健常者の海馬の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。図３の上から３段目の図に示したように、健常者の前頭皮質と、アルツハイマー患者の前頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量を比較した。健常者の前頭皮質と、アルツハイマー患者の前頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量のデータは、公開データベースであるGene Expression Omnibusから取得した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36980）。健常者の前頭皮質は１８サンプル、アルツハイマー患者の前頭皮質は１５サンプルのデータを比較した。データの測定・正規化（各サンプル間のｍＲＮＡ量の補正）は、データベース登録時に行われているため、申請者らは実施しなかった。アルツハイマー患者の前頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、健常者の前頭皮質の対応するｍＲＮＡに対して、有意に増加又は減少した場合、グラフの上に＊を記述した。データは健常者の前頭皮質の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。図３の上から４段目の図に示したように、健常者の側頭皮質と、アルツハイマー患者の側頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量を比較した。健常者の側頭皮質と、アルツハイマー患者の側頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量のデータは、公開データベースであるGene Expression Omnibusから取得した（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36980）。健常者の側頭皮質は１９サンプル、アルツハイマー患者の側頭皮質は１０サンプルのデータを比較した。データの測定・正規化（各サンプル間のｍＲＮＡ量の補正）は、データベース登録時に行われているため、申請者らは実施しなかった。アルツハイマー患者の側頭皮質のＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、健常者の側頭皮質の対応するｍＲＮＡに対して、有意に増加又は減少した場合、グラフの上に＊を記述した。データは健常者の側頭皮質の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。
【0070】
健常者の海馬データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907861
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907862
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907863
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907864
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907865
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907866
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907867
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907868
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907869
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907870
アルツハイマー患者の海馬データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907854
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907855
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907856
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907857
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907858
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907859
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907860
健常者の前頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907807
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907808
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907809
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907810
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907811
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907812
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907813
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907816
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907819
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907820
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907821
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907822
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907823
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907824
アルツハイマー患者の前頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907792
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907793
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907794
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907795
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907796
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907797
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907798
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907799
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907800
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907801
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907802
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907803
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907804
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907805
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907806
健常者の側頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907825
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907826
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907827
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907828
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907829
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907830
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907831
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907832
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907833
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907834
アルツハイマー患者の側頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907835
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907836
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907837
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907838
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907839
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907840
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907841
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907842
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907843
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907844
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907845
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907846
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907847
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907848
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907849
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907850
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907851
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907852
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907853
データの基になる論文のURLは下記に示す。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4128707/
図３の結果は、アルツハイマー患者細胞群では、健常者細胞群と比較して、ＭＡＰ２及びＴＵＪ１のｍＲＮＡ量が有意に低下すること、及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量に有意差がないことを示した（図３Ａ）。この特徴は、アルツハイマーと健常者のヒトの海馬のｍＲＮＡ量を比較した場合でも確認された（図３Ｂ）。一方、アルツハイマーと健常者の前頭皮質及び側頭皮質のｍＲＮＡ量を比較してもこの特徴は確認されなかった（図３Ｃ、図３Ｄ）。これらの結果は、アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞から誘導された細胞群が、アルツハイマー患者の海馬で確認される神経細胞数減少の特徴（Ｐａｄｕｒａｒｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１２）を模倣していることを示唆した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907861
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907862
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907863
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907864
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907865
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907866
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907867
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907868
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907869
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907870
アルツハイマー患者の海馬データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907854
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907855
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907856
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907857
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907859
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907860
健常者の前頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907807
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907808
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907810
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907811
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907814
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907816
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アルツハイマー患者の前頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907792
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907793
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健常者の側頭皮質データは以下から取得した。
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アルツハイマー患者の側頭皮質データは以下から取得した。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907835
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907847
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907851
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907852
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM907853
データの基になる論文のURLは下記に示す。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4128707/
図３の結果は、アルツハイマー患者細胞群では、健常者細胞群と比較して、ＭＡＰ２及びＴＵＪ１のｍＲＮＡ量が有意に低下すること、及びＰＡＸ６のｍＲＮＡ量に有意差がないことを示した（図３Ａ）。この特徴は、アルツハイマーと健常者のヒトの海馬のｍＲＮＡ量を比較した場合でも確認された（図３Ｂ）。一方、アルツハイマーと健常者の前頭皮質及び側頭皮質のｍＲＮＡ量を比較してもこの特徴は確認されなかった（図３Ｃ、図３Ｄ）。これらの結果は、アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞から誘導された細胞群が、アルツハイマー患者の海馬で確認される神経細胞数減少の特徴（Ｐａｄｕｒａｒｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１２）を模倣していることを示唆した。
【0071】
《比較例２》
本比較例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
本比較例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
【0072】
工程（１）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した以外は、実施例１の操作を繰り返した。工程（１）は、以下の通り行った。
６０－９０％程度コンフルエンスになったｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去し、ｍＴｅＳＲ１－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を細胞塊の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、細胞塊にしたｉＰＳ細胞とｍＴｅＳＲ１－Ｙの混和物を遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいｍＴｅＳＲ１－Ｙと混和し、新しいＭａｔｒｉｇｅｌ溶液コートしている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞塊を維持したまま播き込んだ（４．８×１０５細胞／２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
図４に示すように、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）と、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）の、ＭＡＰ２陽性細胞、ＴＵＪ１陽性細胞、及びＰＡＸ６陽性細胞の細胞数の差が見られなかった。
従って、工程（１）において、ｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した場合、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映できないと考えられた。
６０－９０％程度コンフルエンスになったｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳで５－１５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去し、ｍＴｅＳＲ１－Ｙを吹き付けることで、ｉＰＳ細胞を細胞塊の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、細胞塊にしたｉＰＳ細胞とｍＴｅＳＲ１－Ｙの混和物を遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいｍＴｅＳＲ１－Ｙと混和し、新しいＭａｔｒｉｇｅｌ溶液コートしている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞塊を維持したまま播き込んだ（４．８×１０５細胞／２ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
図４に示すように、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）と、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）の、ＭＡＰ２陽性細胞、ＴＵＪ１陽性細胞、及びＰＡＸ６陽性細胞の細胞数の差が見られなかった。
従って、工程（１）において、ｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した場合、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映できないと考えられた。
【0073】
《実施例２》
本実施例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種し、工程（２）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
本実施例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種し、工程（２）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
【0074】
工程（２）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した以外は、実施例１の操作を繰り返した。工程（２）は、以下の通り行った。
工程（１）の７日目に神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳで５－２５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去し、ＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙを吹き付けることで、細胞を細胞塊の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、細胞塊にした細胞とＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞塊を維持したまま播き込んだ（２×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
図５に示すように、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）では、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の新生は大きく変化しなかったが、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が抑制された。従って、工程（２）において、ｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した場合でも、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映できると考えられた。
工程（１）の７日目に神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳで５－２５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去し、ＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙを吹き付けることで、細胞を細胞塊の形で６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、細胞塊にした細胞とＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋Ｆ＋Ｙと混和し、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コートしている２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞塊を維持したまま播き込んだ（２×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
図５に示すように、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）では、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の新生は大きく変化しなかったが、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が抑制された。従って、工程（２）において、ｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した場合でも、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映できると考えられた。
【0075】
《比較例３》
本比較例では、工程（３）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（１）及び工程（２）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
本比較例では、工程（３）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種し、工程（１）及び工程（２）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
【0076】
工程（３）においてｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した以外は、実施例１の操作を繰り返した。工程（３）は、以下の通り行った。
工程（２）の６日目（Ｄａｙ１２）に、神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳで５－２５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去し、ＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを吹き付けることで、細胞を細胞塊の形で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、細胞塊にした細胞とＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙと混和し、細胞塊を維持したままポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コート（コート法は下に記述）している９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（播き込む細胞量は１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、播き込む溶液量は２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
図６に示すように、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）と、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）の、ＭＡＰ２陽性細胞、ＴＵＪ１陽性細胞、及びＰＡＸ６陽性細胞の細胞数の差が見られなかった。
従って、工程（３）において、ｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した場合、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映できないと考えられた。
工程（２）の６日目（Ｄａｙ１２）に、神経誘導中のｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳで５－２５ｍｉｎ処理した。処理終了後、ＥＤＴＡ ｉｎ ＤＰＢＳを除去し、ＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを吹き付けることで、細胞を細胞塊の形で２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅから剥離した。剥離後、細胞塊にした細胞とＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙを混和して遠心（２９０Ｇ．常温，５ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。その後、新しいＮＤＢＭ＋ＢＤ＋Ｙと混和し、細胞塊を維持したままポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン溶液コート（コート法は下に記述）している９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播き込んだ（播き込む細胞量は１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、播き込む溶液量は２００μＬ／ｗｅｌｌ）。
図６に示すように、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）と、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６）の、ＭＡＰ２陽性細胞、ＴＵＪ１陽性細胞、及びＰＡＸ６陽性細胞の細胞数の差が見られなかった。
従って、工程（３）において、ｉＰＳ細胞を細胞塊として播種した場合、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映できないと考えられた。
【0077】
《比較例４》
本比較例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して、４．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度（実施例１の８倍の細胞数）で播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、３人の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及び３人のアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）を用いた。
工程（１）において、播種する細胞濃度を５．０×１０４細胞／ｃｍ２に代えて４．０×１０５細胞／ｃｍ２としてことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。ｉＰＳ細胞は、Ｄａｙ１で１００％コンフルエンスとなった。また、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析した。
図７の上から１段目に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６，ＨＰＳ０３６０，Ｐ１１０２５）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４，ＨＰＳ０２５５，ＨＰＳ０２５６）で、神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞又はＴＵＪ１陽性細胞）及び神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の数の差は見られなかった。また、図７の上から２段目に示すように、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６遺伝子の発現も、健常者ｉＰＳ細胞とアルツハイマーｉＰＳ細胞のグループで共通する、有意差は見られなかった。データはＨＰＳ００７６の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。
本比較例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して、４．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度（実施例１の８倍の細胞数）で播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、３人の健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）及び３人のアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＰＳ０２５４、ＨＰＳ０２５５、ＨＰＳ０２５６）を用いた。
工程（１）において、播種する細胞濃度を５．０×１０４細胞／ｃｍ２に代えて４．０×１０５細胞／ｃｍ２としてことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。ｉＰＳ細胞は、Ｄａｙ１で１００％コンフルエンスとなった。また、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析した。
図７の上から１段目に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６，ＨＰＳ０３６０，Ｐ１１０２５）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４，ＨＰＳ０２５５，ＨＰＳ０２５６）で、神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞又はＴＵＪ１陽性細胞）及び神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の数の差は見られなかった。また、図７の上から２段目に示すように、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６遺伝子の発現も、健常者ｉＰＳ細胞とアルツハイマーｉＰＳ細胞のグループで共通する、有意差は見られなかった。データはＨＰＳ００７６の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。
【0078】
《実施例３》
本比較例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して、２．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度（実施例１の４倍の細胞数）で播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０３６０）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
工程（１）において、播種する細胞濃度を５．０×１０４細胞／ｃｍ２に代えて２．０×１０５細胞／ｃｍ２としたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。ｉＰＳ細胞は、Ｄａｙ３で１００％コンフルエンスとなった。また、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析した。
図８に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０３６０）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）とで、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の新生は大きく変化しなかったが、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数又はｍＲＮＡの発現が、アルツハイマーｉＰＳ細胞において、抑制された。図８下のｍＲＮＡの発現データはＨＰＳ０３６０の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。ＨＰＳ０２５６のＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、ＨＰＳ０３６０の対応するｍＲＮＡに対して、有意に増加又は減少した場合、グラフの上に＊を記述した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。すなわち、本発明の製造方法においては、アルツハイマーｉＰＳ細胞からの成熟神経細胞の誘導は、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映していた。
本比較例では、工程（１）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して、２．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度（実施例１の４倍の細胞数）で播種し、工程（２）及び工程（３）においてｉＰＳ細胞を単細胞に単離して播種した。ｉＰＳ細胞として、健常人のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０３６０）及びアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いた。
工程（１）において、播種する細胞濃度を５．０×１０４細胞／ｃｍ２に代えて２．０×１０５細胞／ｃｍ２としたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。ｉＰＳ細胞は、Ｄａｙ３で１００％コンフルエンスとなった。また、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、及びＰＡＸ６の遺伝子の発現をＰＣＲで解析した。
図８に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０３６０）とアルツハイマーｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）とで、神経幹細胞（ＰＡＸ６陽性細胞）の新生は大きく変化しなかったが、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数又はｍＲＮＡの発現が、アルツハイマーｉＰＳ細胞において、抑制された。図８下のｍＲＮＡの発現データはＨＰＳ０３６０の平均値を１として平均±標準誤差で表記した。ＨＰＳ０２５６のＭＡＰ２、ＴＵＪ１又はＰＡＸ６のｍＲＮＡ量が、ＨＰＳ０３６０の対応するｍＲＮＡに対して、有意に増加又は減少した場合、グラフの上に＊を記述した。有意差の検定は、前述と同様の理由で、ｗｅｌｃｈのＴ検定を使用した。すなわち、本発明の製造方法においては、アルツハイマーｉＰＳ細胞からの成熟神経細胞の誘導は、アルツハイマー患者の海馬の特徴を反映していた。
【0079】
《実施例４》
本実施例では、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いて、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質のスクリーニングを行った。
実施例１の操作を繰り返し、神経誘導時のDay8-Day11とDay13-Day28の培養において、候補物質ＳＡＧ（１μＭ）、Isobavachin（１００ｎＭ）、及びNeuropashiazol（１０μＭ）を添加して、培養した。
本実施例では、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）を用いて、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質のスクリーニングを行った。
実施例１の操作を繰り返し、神経誘導時のDay8-Day11とDay13-Day28の培養において、候補物質ＳＡＧ（１μＭ）、Isobavachin（１００ｎＭ）、及びNeuropashiazol（１０μＭ）を添加して、培養した。
【0080】
ＭＡＰ２陽性細胞、及びＴＵＪ１陽性細胞の染色は、比較例１の方法に従って行った。また、細胞死を解析するために、ｃＣＡＳＰ３陽性細胞を以下のように染色した。
１次抗体として、anti-rabbit PAX6抗体（Sigma，１００倍）の変わりに、anti-rabbit Cleaved CASP3（cCASP3）抗体（Cell signaling，１００倍）を用いたことを除いては、比較例１の「蛍光抗体染色」の操作を繰り返して、ｃＣＡＳＰ３陽性の細胞を染色した。
図９（Ａ）に示すように、ＳＡＧを添加することによって、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が回復した。また、細胞死（ｃＣＡＳＰ３陽性細胞）が増加したが、これは、ＳＡＧ添加による、アルツハイマー患者ｉＰＳ由来細胞の、未熟神経細胞数及び成熟神経細胞数の回復が、アポトーシスなどによる細胞死の抑制ではなく、神経細胞新生不全の改善によることを意味している。また、図９（Ｂ）に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）では、アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）と比較して、細胞死（ｃＣＡＳＰ３陽性細胞）が増加した。これらの結果は、（１）ＳＡＧ添加による、アルツハイマー患者ｉＰＳ由来細胞の、未熟神経細胞数及び成熟神経細胞数の回復が、神経細胞死抑制でなく、神経新生促進によること、及び（２）アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）では、神経細胞死の増加でなく、神経新生の阻害により、未熟神経細胞数及び成熟神経細胞数の減少が起きていること、の２点を指し示した。
図９（Ｂ）に健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）と、アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）をＳＡＧで処理した場合の比較写真を示す（ＨＰＳ０２５６は、無処理、水を添加したもの、及びＤＭＳＯを添加したものも示す）。
ＳＡＧを添加することにより、ＨＰＳ０２５６の細胞は、健常者のｉＰＳ細胞と同様の特徴を示した。従って、ＳＡＧが神経細胞死抑制ではなく、神経新生の促進を介して、アルツハイマー患者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）の神経ネットワークを回復していると考えられる。
以上の通り、本発明のスクリーニング方法により、アルツハイマー病に作用する薬剤がスクリーニングできることが示された。
１次抗体として、anti-rabbit PAX6抗体（Sigma，１００倍）の変わりに、anti-rabbit Cleaved CASP3（cCASP3）抗体（Cell signaling，１００倍）を用いたことを除いては、比較例１の「蛍光抗体染色」の操作を繰り返して、ｃＣＡＳＰ３陽性の細胞を染色した。
図９（Ａ）に示すように、ＳＡＧを添加することによって、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が回復した。また、細胞死（ｃＣＡＳＰ３陽性細胞）が増加したが、これは、ＳＡＧ添加による、アルツハイマー患者ｉＰＳ由来細胞の、未熟神経細胞数及び成熟神経細胞数の回復が、アポトーシスなどによる細胞死の抑制ではなく、神経細胞新生不全の改善によることを意味している。また、図９（Ｂ）に示すように、健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）では、アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）と比較して、細胞死（ｃＣＡＳＰ３陽性細胞）が増加した。これらの結果は、（１）ＳＡＧ添加による、アルツハイマー患者ｉＰＳ由来細胞の、未熟神経細胞数及び成熟神経細胞数の回復が、神経細胞死抑制でなく、神経新生促進によること、及び（２）アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）では、神経細胞死の増加でなく、神経新生の阻害により、未熟神経細胞数及び成熟神経細胞数の減少が起きていること、の２点を指し示した。
図９（Ｂ）に健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）と、アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）をＳＡＧで処理した場合の比較写真を示す（ＨＰＳ０２５６は、無処理、水を添加したもの、及びＤＭＳＯを添加したものも示す）。
ＳＡＧを添加することにより、ＨＰＳ０２５６の細胞は、健常者のｉＰＳ細胞と同様の特徴を示した。従って、ＳＡＧが神経細胞死抑制ではなく、神経新生の促進を介して、アルツハイマー患者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５６）の神経ネットワークを回復していると考えられる。
以上の通り、本発明のスクリーニング方法により、アルツハイマー病に作用する薬剤がスクリーニングできることが示された。
【0081】
《実施例５》
本実施例では、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）を用いて、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質のスクリーニングを行った。
ｉＰＳ細胞として、ＨＰＳ０２５６に代えて、ＨＰＳ０２５４を用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
本実施例では、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）を用いて、アルツハイマー病に作用する薬剤の候補物質のスクリーニングを行った。
ｉＰＳ細胞として、ＨＰＳ０２５６に代えて、ＨＰＳ０２５４を用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。
【0082】
図１０（Ａ）に示すように、ＳＡＧを添加することによって、未熟神経細胞（ＴＵＪ１陽性細胞）と成熟神経細胞（ＭＡＰ２陽性細胞）の数が回復した。また、細胞死（ｃＣＡＳＰ３陽性細胞）が増加した。
図１０（Ｂ）に健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）と、アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）をＳＡＧで処理した場合の比較写真を示す。
ＳＡＧを添加することにより、ＨＰＳ０２５４の細胞は、健常者のｉＰＳ細胞と同様の特徴を示した。従って、ＳＡＧが神経細胞死抑制ではなく、神経新生の促進を介して、アルツハイマー患者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）の神経ネットワークを回復していると考えられる。
以上の通り、本発明のスクリーニング方法により、アルツハイマー病に作用する薬剤がスクリーニングできることが示された。
図１０（Ｂ）に健常者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ００７６、ＨＰＳ０３６０、Ｐ１１０２５）と、アルツハイマー由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）をＳＡＧで処理した場合の比較写真を示す。
ＳＡＧを添加することにより、ＨＰＳ０２５４の細胞は、健常者のｉＰＳ細胞と同様の特徴を示した。従って、ＳＡＧが神経細胞死抑制ではなく、神経新生の促進を介して、アルツハイマー患者ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４）の神経ネットワークを回復していると考えられる。
以上の通り、本発明のスクリーニング方法により、アルツハイマー病に作用する薬剤がスクリーニングできることが示された。
【0083】
《実施例６》
アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４とＨＰＳ０２５６）を実施例１と同様の方法で神経誘導した。また、神経誘導時のDay8-Day11とDay13-Day28にＳＡＧ、Isobavachin、及びNeuropashiazol又は薬剤のネガティブコントロールとなる溶液（ＤＭＳＯ又は滅菌水）を添加した細胞も作成した。添加時の薬剤の濃度は、実施例４の培養液添加時の試薬の最終濃度”とした。ＤＭＳＯの添加量は培養液の１５０分の１量とした。滅菌水の添加量は培養液の２００分の１量とした。そして、実施例と同様の方法で成熟神経マーカー（ＭＡＰ２）と未熟神経マーカー（ＴＵＪ１）のｍＲＮＡ量（遺伝子発現量）を測定した。その結果、健常者由来ｉＰＳ細胞と同様に、神経新生が確認された、ＳＡＧ処理したＨＰＳ０２５４由来細胞群（図中の黒色の丸）とＨＰＳ０２５６由来細胞群（図中の濃い灰色の丸）では、下記の傾向が確認された。（１）神経新生が低調な、無処理、Isobavachin、Neuropashiazol、ＤＭＳＯ、滅菌水で処理された、ＨＰＳ０２５４由来細胞群（図中の薄い灰色の丸）やＨＰＳ０２５６由来細胞群（図中の白色の丸）と比較すると、ＭＡＰ２とＴＵＪ１の遺伝子発現量が増加する傾向が確認された。これらの結果は、ＳＡＧ処理が、アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４とＨＰＳ０２５６）の神経新生を回復させ、健常者由来ｉＰＳ細胞と同様の神経新生を持たせたことを数値的にも裏付けた。これは、ＳＡＧ処理が、アルツハイマー患者の脳の海馬の神経新生を誘導することで、アルツハイマー由来の認知機能障害の原因となる海馬の神経細胞減少を、回復させる可能性を示した。ＭＡＰ２とＴＵＪ１の遺伝子発現量は無処理を１として正規化した。遺伝子発現量は各サンプル共に、３－４回の測定の平均値を使用した。
アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４とＨＰＳ０２５６）を実施例１と同様の方法で神経誘導した。また、神経誘導時のDay8-Day11とDay13-Day28にＳＡＧ、Isobavachin、及びNeuropashiazol又は薬剤のネガティブコントロールとなる溶液（ＤＭＳＯ又は滅菌水）を添加した細胞も作成した。添加時の薬剤の濃度は、実施例４の培養液添加時の試薬の最終濃度”とした。ＤＭＳＯの添加量は培養液の１５０分の１量とした。滅菌水の添加量は培養液の２００分の１量とした。そして、実施例と同様の方法で成熟神経マーカー（ＭＡＰ２）と未熟神経マーカー（ＴＵＪ１）のｍＲＮＡ量（遺伝子発現量）を測定した。その結果、健常者由来ｉＰＳ細胞と同様に、神経新生が確認された、ＳＡＧ処理したＨＰＳ０２５４由来細胞群（図中の黒色の丸）とＨＰＳ０２５６由来細胞群（図中の濃い灰色の丸）では、下記の傾向が確認された。（１）神経新生が低調な、無処理、Isobavachin、Neuropashiazol、ＤＭＳＯ、滅菌水で処理された、ＨＰＳ０２５４由来細胞群（図中の薄い灰色の丸）やＨＰＳ０２５６由来細胞群（図中の白色の丸）と比較すると、ＭＡＰ２とＴＵＪ１の遺伝子発現量が増加する傾向が確認された。これらの結果は、ＳＡＧ処理が、アルツハイマー患者由来ｉＰＳ細胞（ＨＰＳ０２５４とＨＰＳ０２５６）の神経新生を回復させ、健常者由来ｉＰＳ細胞と同様の神経新生を持たせたことを数値的にも裏付けた。これは、ＳＡＧ処理が、アルツハイマー患者の脳の海馬の神経新生を誘導することで、アルツハイマー由来の認知機能障害の原因となる海馬の神経細胞減少を、回復させる可能性を示した。ＭＡＰ２とＴＵＪ１の遺伝子発現量は無処理を１として正規化した。遺伝子発現量は各サンプル共に、３－４回の測定の平均値を使用した。
【産業上の利用可能性】
【0084】
本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞の製造方法により、アルツハイマー病のメカニズムを探索することのできるアルツハイマー疾患モデル神経細胞を得ることができる。また、本発明のアルツハイマー疾患モデル神経細胞を用いたアルツハイマー病作用薬物のスクリーニング方法により、アルツハイマー病の治療薬などを探索することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
