特許7333635ｍＲＮＡを細胞に送達するための改善した脂質－ペプチドナノ複合体製剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-17
(45)【発行日】2023-08-25
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡを細胞に送達するための改善した脂質－ペプチドナノ複合体製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20230818BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230818BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230818BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20230818BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230818BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230818BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230818BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230818BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230818BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20230818BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20230818BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127 ZNA
A61K48/00
A61K47/24
A61K47/28
A61K39/00 G
A61K31/7088
A61P35/00
A61P43/00 111
A61P37/04
C12N15/88 Z
C07K14/00
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2020525977
(86)(22)【出願日】2018-11-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-01-28
(86)【国際出願番号】 GB2018053253
(87)【国際公開番号】W WO2019092437
(87)【国際公開日】2019-05-16
【審査請求日】2021-11-08
(31)【優先権主張番号】1718660.2
(32)【優先日】2017-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】507299817
【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100170900
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 渉
(72)【発明者】
【氏名】グラント－セロウク， デニア
(72)【発明者】
【氏名】ハルト， ステファン ルイス
【審査官】田澤 俊樹
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５４２５８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１５３７７９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－９／７２
４７／００－４８／００
３９／００－３９／４４
３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍＲＮＡの細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームであって、（ｉ）（ａ）カチオン性脂質ＤＴＤＴＭＡ、（ｂ）リン脂質ＤＯＰＥ、及び（ｃ）配列Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）を含むペプチド、（ｉｉ）（ａ）カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ、（ｂ）リン脂質ＤＯＰＥ、及び（ｃ）配列Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）を含むペプチド、（ｉｉｉ）（ａ）カチオン性脂質ＤＴＤＴＭＡ、（ｂ）リン脂質ＤＯＰＣ、及び（ｃ）配列Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）を含むペプチド、（ｉｖ）（ａ）カチオン性脂質ＤＴＤＴＭＡ、（ｂ）リン脂質ＤＯＰＣ、及び（ｃ）配列Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号１）を含むペプチド、又は（ｖ）（ａ）カチオン性脂質ＤＨＤＴＭＡ、（ｂ）リン脂質ＤＯＰＥ、及び（ｃ）配列Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）を含むペプチドを含み、並びにまた任意で、コレステロールを含み、配列番号２のアミノ配列におけるＸはε－アミノカプロン酸である、リポソーム。
【請求項2】
（ｉ）（ａ）ＤＴＤＴＭＡ、（ｂ）ＤＯＰＥ、及び（ｃ）Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）、（ｉｉ）（ａ）ＤＯＴＭＡ、（ｂ）ＤＯＰＥ、及び（ｃ）Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）、又は（ｖ）（ａ）ＤＨＤＴＭＡ、（ｂ）ＤＯＰＥ、及び（ｃ）Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）を含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項3】
（ｉ）（ａ）ＤＴＤＴＭＡ、（ｂ）ＤＯＰＥ、及び（ｃ）Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号２）を含む、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項4】
全脂質量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成される、請求項１～３のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項5】
全脂質量に対して２３～４０モル％のコレステロールで構成される、請求項１～４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載されるリポソームと、（ｄ）核酸、特にｍＲＮＡとを含む非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項7】
０．６～１．４重量部の核酸（ｄ）、２．６～４．４重量部の全脂質（ａ）＋（ｂ）、及び２．６～４．４重量部のペプチド（ｃ）を有する、請求項６に記載の非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項8】
（ｄ）核酸：（ａ）＋（ｂ）全脂質：（ｃ）ペプチドの成分比は、１：３：４、又は１：４：４重量部である、請求項７に記載の非ウイルス性トランスフェクション複合体。
【請求項9】
薬学的に適切な担体と混合した、又は薬学的に適切な担体と共に、請求項６、請求項７、又は請求項８に記載のトランスフェクション複合体を含む、医薬組成物。
【請求項10】
薬剤、例えばワクチンとして使用される、又は遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防に使用される、又は治療免疫付与若しくは予防免疫付与に使用される、又はＲＮＡ治療に使用される、又はがんの処置に使用される、又は嚢胞性繊維症（ＣＦ）若しくは原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の処置若しくは予防に使用される、請求項６、請求項７、又は請求項８に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項11】
遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防のための薬剤を製造するため、又は治療免疫付与若しくは予防免疫付与のための薬剤を製造するため、又はＲＮＡ治療のための薬剤を製造するため、又はがんの処置のための薬剤を製造するため、又は嚢胞性繊維症（ＣＦ）若しくは原発性線毛機能不全症（ＰＣＤ）の処置若しくは予防のための薬剤を製造するための、請求項６、請求項７、又は請求項８に記載のトランスフェクション複合体の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的活性物質、例えば核酸、特にｍＲＮＡを細胞に送達することに適する脂質及びペプチドの製剤に関する。さらに、本発明は、ｍＲＮＡなどの生物学的活性物質を細胞に送達するための非ウイルス性ベクターとして使用されるトランスフェクション複合体、並びに、例えば予防、処置、及びワクチン接種又はインビトロの実験室環境におけるそうした複合体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
治療又は他の目的のための遺伝子送達は、特に嚢胞性繊維症及び特定のがんなどの疾患の処置において周知のものである。この用語は、いくつかの欠損を修正するために遺伝子又は遺伝子の一部を細胞に送達することを指す。本明細書において、この用語はまた、核酸物質の標的細胞への任意の導入も指すように使用され、遺伝子ワクチン接種、及びいわゆる細胞工場における商業的に有用なタンパク質のインビトロでの産生を含む。
【0003】
細胞送達システムは、３つの広い分類、すなわち、裸のＤＮＡ又はＲＮＡの直接注入に関与するもの、ウイルス又は遺伝子改変ウイルスを使用するもの、及び非ウイルス性送達剤を使用するものに分類される。それぞれに利点と不利点がある。送達剤としてのウイルスは高効率及び高い細胞選択性という利点を有するが、毒性、炎症反応発生、及び大きなＤＮＡ断片を扱う際の困難性という不利点を有する。
【0004】
非ウイルス性遺伝子送達システムは、負に荷電したＤＮＡ又はＲＮＡのリン酸骨格と、カチオン性脂質、ペプチド、又は他のポリマーとの間の静電相互作用によって遺伝物質をナノメートル粒子にコンパクションすることに基づく(Dowdy, S.F.,Overcoming cellular barriers for RNA therapeutics. Nat Biotechnol, 2017. 35(3):p. 222-229; Kaczmarek, J.C., P.S. Kowalski, and D.G. Anderson, Advances in thedelivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Med,2017. 9(1): p. 60; Zylberberg, C., et al., Engineering liposomal nanoparticles for targeted gene therapy. Gene Ther, 2017. 24(8): p. 441-452; Oberli, M.A., etal., Lipid Nanoparticle Assisted mRNA Delivery for Potent Cancer Immunotherapy.Nano Lett, 2017. 17(3): p. 1326-1335; Cullis, P.R. and M.J. Hope, Lipid Nanoparticle Systems for Enabling Gene Therapies. Mol Ther, 2017. 25(7): p.1467-1475; Kauffman, K.J., M.J. Webber, and D.G. Anderson, Materials fornon-viral intracellular delivery of messenger RNA therapeutics. J Control Release, 2016. 240: p. 227-234; Dong, Y., et al., Poly(glycoamidoamine) Brushes Formulated Nanomaterials for Systemic siRNA and mRNA Delivery in Vivo. Nano Lett, 2016. 16(2): p. 842-8.)。脂質を含む非ウイルス性トランスフェクションベクターの使用は、ウイルスとは対照的に、より低い毒性、特に低い免疫原性、より高い安全性、コスト削減、適度に効果的なターゲティング、及びパッケージング能力の向上、例えば、核酸物質の大きな断片が扱えること、をもたらすことができる。残念ながら、特にｍＲＮＡにおいて、より低いトランスフェクション効率が留意される。非ウイルス性遺伝子治療ベクターは、近年の研究の主題となっている(Yin H, Kanasty RL, Eltoukhy AA, Vegas AJ, Dorkin JR, Anderson DG. Non-viral vectors forgene-based therapy. Nature Rev Genetics. 2014: 15:541-55; Schroeder A, Levins CG, Cortez C, Langer R, Anderson DG. Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery. J Intern Med. 2010: 267:9-21; Zhao Y, Huang L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Adv Genet. 2014: 88:13-36; Tatiparti,K., et al., siRNA Delivery Strategies: A Comprehensive Review of Recent Developments. Nanomaterials (Basel), 2017. 7(4); Riley, M.K. and W. Vermerris,Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery - A Review. Nanomaterials(Basel), 2017. 7(5))。
【0005】
既知の遺伝子送達のための複合体には、脂質由来核酸複合体のためのリポプレックス、ペプチド又はポリマー由来複合体のためのポリプレックス、及びハイブリッドシステムのためのリポポリプレックスが含まれる(Felgner et al., Human Gene Therapy 8, 1997, 511-512)。本明細書に使用されるとき、「ＬＰＤ」という用語は、（Ｌ）脂質、（Ｐ）インテグリン（又は他の受容体）結合ペプチド、及び（Ｄ）ＤＮＡ（又は他の核酸）を含む製剤を表すリポポリプレックスの形態である。ＬＰＤ複合体は、インテグリン媒介又は他の受容体媒介の経路によるトランスフェクションを行い、望ましくない血清相互作用を少なくすることができるように、必ずしも全体として正電荷を有する必要はない。ペプチド成分は核酸パッケージング機能を提供し、ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞内若しくは細胞外の分解、エンドソーム、又は他のものから遮蔽する。脂質成分は、膜融合または透過化により、エンドソーム脂質二重層との相互作用を媒介し、エンドソーム又はリソソーム分解を低減し、核酸輸送物の細胞質への輸送を可能にする。ペプチド成分は、細胞型特異的又は細胞表面受容体特異的であるように設計することができる。例えば、インテグリン又は他の受容体に対する特異性の程度により、ＬＰＤ複合体にある程度の細胞特異性を付与することができる。特異性は細胞表面受容体（例えば、インテグリン受容体）へのターゲティングから得られ、一部のアデノウイルスベクターと同等のトランスフェクション効率を得ることができる(Du Z, Munye MM, Tagalakis AD,Manunta MD, Hart SL. The role of the helper lipid on the DNA transfection efficiency of lipopolyplex formulations. Sci Rep. 2014: 4:7107; Welser K,Campbell F, Kudsiova L, Mohammadi A, Dawson N, Hart SL, et al. Gene delivery using ternary lipopolyplexes incorporating branched cationic peptides: the role of Peptide sequence and branching. Mol Pharm. 2013: 10:127-41; Meng QH, Irvine S, Tagalakis AD, McAnulty RJ, McEwan JR, Hart SL. Inhibition of neointimal hyperplasia in a rabbit vein graft model following non-viral transfection with human iNOS cDNA. Gene Ther. 2013: 20:979-86; Manunta MD, McAnulty RJ, McDowell A, Jin J, Ridout D, Fleming J, et al. Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored by radioimaging agents. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013: 49:471-80; Kenny GD, Bienemann AS, Tagalakis AD, Pugh JA, Welser K,Campbell F, et al. Multifunctional receptor-targeted nanocomplexes for the delivery of therapeutic nucleic acids to the Brain. Biomaterials. 2013:34:9190-200; Tagalakis AD, He L, Saraiva L, Gustafsson KT, Hart SL.Receptor-targeted liposome-peptide nanocomplexes for siRNA delivery.Biomaterials. 2011: 32:6302-15; Tagalakis AD, Grosse SM, Meng QH, Mustapa MF,Kwok A, Salehi SE, et al. Integrin-targeted nanocomplexes for tumour specific delivery and therapy by systemic administration. Biomaterials. 2011: 32:1370-6;Manunta MD, McAnulty RJ, Tagalakis AD, Bottoms SE, Campbell F, Hailes HC, et al. Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to the airway epithelium. PLoS One. 2011: 6:e26768; Grosse SM, Tagalakis AD, Mustapa MF, Elbs M, Meng QH, Mohammadi A, et al. Tumor-specific gene transfer with receptor-mediated nanocomplexes modified by polyethylene glycol shielding and endosomally cleavable lipid and peptide linkers. FASEB J. 2010: 24:2301-13)。
【0006】
ヒト気道上皮細胞を標的とするペプチドが報告されている（特許文献１）。樹状細胞を標的とするペプチドが報告されている（特許文献２）。
【0007】
脂質／ペプチドベクターは、種々の細胞株および一次細胞培養物に、高効率かつ低毒性でトランスフェクトする（上皮細胞（４０％効率）、血管平滑筋細胞（５０％効率）、内皮細胞（３０％効率）、及び造血細胞（１０％効率））。さらに、マウスの気管支上皮(ManuntaMD, McAnulty RJ, Tagalakis AD, Bottoms SE, Campbell F, Hailes HC, et al.Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to the air wayepithelium. PLoS One. 2011: 6:e26768; Tagalakis AD, McAnulty RJ, Devaney J, Bottoms SE, Wong JB, Elbs M, et al., A receptor-targeted nanocomplex vector system optimized for respiratory gene transfer. Mol Ther. 2008:16:907-15.Jenkins et al., Formation of LID vector complexes in water alters physicochemical properties and enhances pulmonary gene expression in vivo, Gene Therapy 2003, 10, 1026-34)、ラットの肺(Jenkins et al., An integrin-targeted non-viral vector for pulmonary gene therapy, Gene Therapy 2000, 7, 393-400)、及びブタの肺(Manunta MD,McAnulty RJ, McDowell A, Jin J, Ridout D, Fleming J, et al. Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored by radioimaging agents. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013: 49:471-80; Cunningham et al., Evaluation of a porcine model for pulmonary gene transfer using a novel synthetic vector, J Gene Med 2002, 4, 438-46)におけるインビボのトランスフェクションが、アデノウイルスベクターの効率(上記Jenkins et al., 2000)と同等の効率で、示されている。
【0008】
そうしたＬＰＤ複合体又は脂質／ペプチド複合体に使用されるペプチドは、細胞表面受容体（例えばインテグリン）認識配列を含む「ヘッド基」及び非共有結合的にＤＮＡに結合することができる「テイル」の２つの機能を有する必要がある。これらの２つの成分が、それらの個々の機能を妨害しないようにスペーサーを介して共有結合している既知のペプチドには、特許文献３に記載されているようなペプチド６など、「テイル」がポリカチオン性核酸結合成分であるペプチドを含む。
【0009】
そうしたペプチドを含むＬＰＤ複合体に関する初期の実験では、全身送達経路又は静脈内送達経路による不十分なトランスフェクション特性が示されている。起こり得る問題は、他のポリカチオン性ベクターについて記載されているように、不十分な溶解性と細網内皮系によるベクターの迅速なクリアランスとをもたらす、ベクターと血清タンパク質及び赤血球膜との会合である(Dash,P. R., Read, M. L., Barrett, L. B., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. (1999) Gene Therapy 6, 643-50)。全身投与によっていくらかのトランスフェクション活性を示したベクターは、主に、肝臓及び肺などの臓器の初回通過毛細血管床において有効であった(Fenske,D. B., MacLachlan, I., Cullis, P. R. (2001) Curr Opin Mol Ther 3, 153-8)。そうした非特異的トランスフェクション活性はいくつかの治療用途を有する可能性があるが、特定の用途のための安全な臨床使用には、はるかに大きな標的特異性を有するベクターを必要とする。
【0010】
ＬＰＤ複合体の脂質成分に関して、そうした使用のためのカチオン性脂質は、１９８０年代後半にＦｅｌｇｎｅｒによって開発され、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413-7417,1987及び特許文献４で報告されている。Ｆｅｌｇｎｅｒは、１：１の比で、「リポフェクチン（Lipofectin）」という商標で知られている現在市販で入手可能なカチオン性リポソームを開発した。「リポフェクチン」リポソームは、１：１の比のカチオン性脂質ＤＯＴＭＡ(2,3-ジオレイルオキシプロピル-1-トリメチルアンモニウム)、及び、中性リン脂質ＤＯＰＥ(ホスファチジルエタノールアミン又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)の脂質二重層を有する球状ベシクルである。
【0011】
他の様々なカチオン性リポソーム製剤が考案されており、その大部分は合成カチオン性脂質と中性リン脂質とを組み合わせている。例えば一部はグリセロール骨格（DOTMAなど）又はＤＣ－Ｃｈｏｌなどのコレステロールに基づく。新しいリポソーム製剤を開発する目的は、多種多様な細胞型に対して、及びインビボ用途のため、得られたベクターの送達特性を最適化することであるということがある。
【0012】
メッセンジャーＲＮＡ(mRNA)の細胞への非ウイルス性送達は、現在のところ効果的なベクターを欠くので限定的である。ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡに使用されている既知の非ウイルス性ビヒクルを使用してｍＲＮＡを送達するという試みは、準最適レベルのタンパク質発現をもたらしている。さらに、既知の非ウイルス性ビヒクルは、ｍＲＮＡのパッケージングの際、十分でない保存安定性を有する。ＲＮＡを細胞に送達するため脂質二重層を超えることは、広範囲のＲＮＡ治療方法の開発において未だ大きな障害である。ゆえに、高レベルのｍＲＮＡを細胞に送達するとともに良好なレベルのタンパク質発現をもたらす、ｍＲＮＡの送達のために特別に調製されたベクターが求められている。また、保存において良好な安定性を示すｍＲＮＡの送達のために調製された組成物、特に低温保存においてその構造及び機能性を保持するｍＲＮＡ送達複合体も求められている。
【0013】
特許文献５は、封入効率、ｍＲＮＡ回収率、及び粒子径を改善するため、混合前にｍＲＮＡ溶液及び／又は脂質溶液を予熱することで、ｍＲＮＡ治療(MRT)のための脂質ナノ粒子製剤を改善しようとするものである。脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、例えばリン脂質、コレステロール由来脂質、例えばコレステロール、及び／又はＰＥＧ脂質を含む。特許文献６及び特許文献７は、（ｉ）リン脂質、例えばＤＯＰＥ又はＤＳＰＣ、ＰＥＧ脂質、構造性脂質、例えばコレステロール、５個の不飽和アルキル鎖を有する脂質ＫＬ１０などの新しい脂質化合物、及び任意でカチオン性脂質を含む脂質成分、並びに（ｉｉ）ｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡを送達するための脂質ナノ粒子組成物に関する。ペプチド成分を含むＬＰＤ複合体は特許文献５、特許文献６、又は特許文献７には開示されていない。
【0014】
特許文献８は、一般式Ａ－Ｂ－Ｃのペプチド誘導体を提示し、式中、Ａはポリカチオン性核酸結合成分、Ｂは細胞内で切断しやすいスペーサーエレメントペプチド、Ｃは細胞表面受容体結合成分である。これらのペプチドは、脂質誘導体と組み合わせて、非ウイルス性遺伝子送達システムにおける使用が見いだされる。特許文献８は、非ウイルス性遺伝子送達に使用される、ペプチド配列Ｋ１６ＲＶＲＲＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ(配列番号２)と組み合わせた、ＤＯＴＭＡ(2,3-ジオレイルオキシプロピル-1-トリメチル（trimentyl）アンモニウム)、及びＤＯＰＥ(ホスファチジルエタノールアミン又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)を含むリポソームを公開している。特許文献８の図２は、マウスの神経芽細胞腫細胞、マウスの内皮細胞、及びヒト気管支上皮細胞における該リポソームを使用したトランスフェクションの結果を提示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0015】
【文献】国際公開第０２／０７２６１６号
【文献】国際公開第２００４／１０８９３８号
【文献】国際公開第９６／１５８１１号
【文献】米国特許第５，２６４，６１８号明細書
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号明細書
【文献】国際公開第２０１６／１１８７２５号
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２１０６９８号明細書
【文献】国際公開第２００７／１３８３２４号
【発明の概要】
【0016】
第１の態様において、本発明は、核酸の細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームを提供し、該リポソームは、カチオン性脂質、リン脂質、及びペプチド、並びに任意でコレステロールを含み、
ａ） カチオン性脂質は、ＤＴＤＴＭＡ(ジテトラデシルトリメチルアンモニウム)、ＤＨＤＴＭＡ(ジヘキサデシルトリメチルアンモニウム)、若しくはＤＯＴＭＡ(2,3-ジオレイルオキシプロピル-1-トリメチル（trimentyl）アンモニウム)から選ばれ、
ｂ） リン脂質は、ＤＯＰＥ(ホスファチジルエタノールアミン、若しくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)であり、
ｃ） ペプチドは、アミノ酸配列Ｋ１６ＲＶＲＲＸＳＸＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を有する、
又は、
ａ） カチオン性脂質は、ＤＴＤＴＭＡ(ジテトラデシルトリメチルアンモニウム)であり、
ｂ） リン脂質は、ＤＯＰＣ(ホスファチジルコリン、若しくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールトリメチルアミン)であり、
ｃ） ペプチドは、アミノ酸配列Ｋ１６ＲＶＲＲＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号1）若しくはＫ１６ＲＶＲＲＸＳＸＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を有する。
ａ） カチオン性脂質は、ＤＴＤＴＭＡ(ジテトラデシルトリメチルアンモニウム)、ＤＨＤＴＭＡ(ジヘキサデシルトリメチルアンモニウム)、若しくはＤＯＴＭＡ(2,3-ジオレイルオキシプロピル-1-トリメチル（trimentyl）アンモニウム)から選ばれ、
ｂ） リン脂質は、ＤＯＰＥ(ホスファチジルエタノールアミン、若しくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)であり、
ｃ） ペプチドは、アミノ酸配列Ｋ１６ＲＶＲＲＸＳＸＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を有する、
又は、
ａ） カチオン性脂質は、ＤＴＤＴＭＡ(ジテトラデシルトリメチルアンモニウム)であり、
ｂ） リン脂質は、ＤＯＰＣ(ホスファチジルコリン、若しくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールトリメチルアミン)であり、
ｃ） ペプチドは、アミノ酸配列Ｋ１６ＲＶＲＲＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号1）若しくはＫ１６ＲＶＲＲＸＳＸＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を有する。
【0017】
このように、本発明は、核酸の細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームを提供し、該リポソームは、（ｉ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｉ）ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｉｉ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＣ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｖ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＣ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号1）、又は（ｖ）ＤＨＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を含み、並びにまた任意で、コレステロールを含む。
【0018】
本発明の第１の態様のリポソームは、「背景技術」という項において上述した文献に記載されるＬＰＤ複合体などの既知のリポソームと比較して、トランスフェクション効果が大きく向上するということが、驚くべきことに分かっている。例えば、本発明のリポソームで製剤化したトランスフェクションベクターが、カチオン性脂質、リン脂質、及びペプチドの他の組合せを含む同様の製剤よりも、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるルシフェラーゼ発現を実質的に増加させたということが示された。
【0019】
第２の態様において、本発明は、核酸の細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームを提供し、該リポソームは、本発明の第１の態様に規定されるようなカチオン性脂質、リン脂質、及びペプチドを含み、全脂質（すなわちカチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成される。本発明の第１の態様のリポソームは、任意で、全脂質（すなわちカチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成され得る。リポソーム製剤における、特に本発明の第１の態様のものにおける、相当量のコレステロールの含有はタンパク質発現を向上させる、ということが分かっている。
【0020】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームと、核酸と、を含むトランスフェクション複合体を提供する。核酸は、有利にはＲＮＡ、特にｍＲＮＡである。
【0021】
第４の態様において、本発明は、薬学的に適切な担体と混合した、又は薬学的に適切な担体と共に、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を含む医薬組成物を提供する。
【0022】
第５の態様において、本発明は、治療に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【0023】
第６の態様において、本発明は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防、治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はアンチセンス若しくはＲＮＡｉ治療のための方法を提供し、該方法は、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を、ヒト又は非ヒト動物に投与することを含む。
【0024】
第７の態様において、本発明は、がんに罹患するヒト又は非ヒト動物の処置のための方法を提供し、該方法は、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を、ヒト又は非ヒト動物に投与することを含む。
【0025】
第８の態様において、本発明は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防、治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はｍＲＮＡ治療、又はヒト若しくは非ヒト動物におけるがんの処置若しくは予防のための薬剤を製造するための、本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームの使用、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体の使用を提供する。
【0026】
第９の態様において、本発明は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防、又は治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はＲＮＡ治療に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【0027】
第１０の態様において、本発明は、ヒト又は非ヒト動物におけるがんの処置又は予防に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【発明を実施するための形態】
【0029】
［カチオン性脂質（ａ）］
カチオン性脂質は、ＤＴＤＴＭＡ(ジテトラデシルトリメチルアンモニウム)、ＤＯＴＭＡ(2,3-ジオレイルオキシプロピル-1-トリメチル（trimentyl）アンモニウム)、又はＤＨＤＴＭＡ(ジヘキサデシルトリメチルアンモニウム)であり得る。カチオンに加えて、カチオン性脂質は、対アニオン、例えば無機対イオン、特に塩化物又は臭化物などの薬学的に許容されるアニオンを含むことができる。
カチオン性脂質は、ＤＴＤＴＭＡ(ジテトラデシルトリメチルアンモニウム)、ＤＯＴＭＡ(2,3-ジオレイルオキシプロピル-1-トリメチル（trimentyl）アンモニウム)、又はＤＨＤＴＭＡ(ジヘキサデシルトリメチルアンモニウム)であり得る。カチオンに加えて、カチオン性脂質は、対アニオン、例えば無機対イオン、特に塩化物又は臭化物などの薬学的に許容されるアニオンを含むことができる。
【0030】
上述のカチオン及び塩化物対アニオンを含むカチオン性脂質を以下に示す。
ＤＴＤＴＭＡ（Ｃ１４）
ＤＯＴＭＡ（Ｃ１８）
ＤＨＤＴＭＡ（Ｃ１６）
ＤＴＤＴＭＡ（Ｃ１４）
【化1】
【化2】
【化3】
【0031】
［リン脂質（ｂ）］
「リン脂質」という用語は、脂肪酸鎖及びリン酸基を含む脂質を指す。リン脂質は、典型的には、正荷電であるカチオン性脂質とは異なって全体として電荷を有しないことから、中性分子である。リン脂質は、典型的には、正荷電成分及び負荷電成分の両方を含むが全体として電荷はない、双性イオン化合物である。ゆえに、リン脂質は典型的には中性脂質として分類される。
「リン脂質」という用語は、脂肪酸鎖及びリン酸基を含む脂質を指す。リン脂質は、典型的には、正荷電であるカチオン性脂質とは異なって全体として電荷を有しないことから、中性分子である。リン脂質は、典型的には、正荷電成分及び負荷電成分の両方を含むが全体として電荷はない、双性イオン化合物である。ゆえに、リン脂質は典型的には中性脂質として分類される。
【0032】
リン脂質は、以下に示されるような、ＤＯＰＥ(ホスファチジルエタノールアミン、若しくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、又はＤＯＰＣ(ホスファチジルコリン、若しくは1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールトリメチルアミン)であり得る。
ＤＯＰＥ
ＤＯＰＣ
ＤＯＰＥ
【化4】
【化5】
【0033】
［ペプチド（ｃ）］
ペプチドは、構造Ａ－Ｂ－Ｃのものであり、式中、
Ａはポリカチオン性核酸結合成分であり、
Ｂはアミノ酸配列ＲＶＲＲ（配列番号3）を含むスペーサーエレメントであり、
Ｃは細胞表面受容体結合成分である。
ペプチドは、構造Ａ－Ｂ－Ｃのものであり、式中、
Ａはポリカチオン性核酸結合成分であり、
Ｂはアミノ酸配列ＲＶＲＲ（配列番号3）を含むスペーサーエレメントであり、
Ｃは細胞表面受容体結合成分である。
【0034】
「ポリカチオン性核酸結合成分」という用語は当該技術分野で既知であり、少なくとも３つのリピートカチオン性アミノ酸残基、又は正荷電基を保持する他のカチオン性ユニットを有するポリマーを指し、そうしたポリマーは生理的条件下で核酸と複合体化可能である。核酸結合ポリカチオン性分子の例は、１つ以上のカオチン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。そうしたオリゴペプチドは、例えば、オリゴ－リジン分子、オリゴ－ヒスチジン分子、オリゴ－アルギニン分子、オリゴ－オルニチン分子、オリゴ－ジアミノプロピオン酸分子、若しくはオリゴ－ジアミノ酪酸分子、又はヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、及びジアミノ酪酸の残基の任意の組合せを含む若しくは任意の組合せで構成される組合せのオリゴマーであり得る。上述のオリゴペプチドのいずれも、例えば、全部で３～３５個、例えば５～２５個の残基、好ましくは１０～２０個の残基、例えば１４～１８個の残基、例えば１６個の残基を有することができる。
【0035】
ポリカチオン性核酸結合成分は、典型的に、例えば、３～３５個、例えば２～２５個、例えば１０～２０個のリジン残基、例えば１３～１９個、例えば１４～１８個、例えば１５～１７個の残基、例えば１６個の残基を有する、すなわち、「Ｋ」がリジンを示す［Ｋ］１６（配列番号4）を有するオリゴリジンを含む。オリゴリジンと生物学的に同等の、特にＫ１６と同等の他のポリカチオン性核酸結合成分が、本発明のリポソームに使用され得る。
【0036】
ポリカチオン性成分のさらなる例は、デンドリマー及びポリエチレンイミンを含む。ポリエチレンイミン(PEI)は、遺伝子送達の可能性を有する無毒性の架橋結合カチオン性ポリマーである(Proc.Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 7297-7301)。ポリエチレンイミンは、Ｆｌｕｋａ(800kDa)若しくはＳｉｇｍａ(50kDa)から入手することができ、又は、あるいはＰｏｌｙＰｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ(仏国イルキルシュ)からトランスフェクション用に予め希釈されて入手することができる。典型的には、ＰＥＩは、ＤＮＡに対して９倍超過して、かつｐＨ５～８で使用されると最も効果的であり、超過比は、ｐＨ５～８においてＰＥＩ窒素：ＤＮＡホスフェートとして計算される。そうしたパラメータは、当業者に周知の方法で最適化することができる。
【0037】
スペーサーエレメントペプチドＢは、有利には、細胞内で切断させやすい切断可能部分を含む。細胞内で切断させやすい切断可能部分を含むスペーサーエレメントペプチドＢは、細胞のエンドソーム、リソソーム、及び／又は細胞質内で切断させやすいものであり得る。切断させやすいとは、本明細書において、成分Ａ及び成分Ｃが正常に保たれる時間尺においてエレメントを切断させやすいことを意味すると理解される。エレメントＢは、細胞のペプチド分解経路が効果を生じるよりも速く切断される。切断可能部分は、典型的に、３～６個のアミノ酸、例えば４個のアミノ酸を含む。スペーサーエレメントＢは、切断可能部分としてアミノ酸配列ＲＶＲＲ（配列番号3）を含む。アミノ酸配列ＲＶＲＲ（配列番号3）は、エンドソームプロテアーゼのフーリンにより酵素切断させやすい。有利には、スペーサーエレメントペプチドＢの切断可能部分は、核酸結合成分Ａと結合している。
【0038】
さらに、スペーサーエレメントペプチドＢは、ＸＳＸＧＡ（配列番号5）又はＧＡから選択されるリンカーを含む。リンカーは、細胞表面受容体結合成分Ｃに結合するスペーサーエレメントペプチドＢの末端に存在する。
【0039】
スペーサーエレメントペプチドＢは、核酸結合成分Ａと結合し、細胞表面受容体結合成分Ｃに結合するリンカーである、配列ＲＶＲＲ（配列番号3）である切断可能部分、ＧＡ、及び任意でＸＳＸを含む。
【0040】
細胞表面受容体結合成分Ｃはペプチドを含む。細胞表面受容体結合成分Ｃは、細胞表面受容体に結合するアミノ酸配列を含む受容体結合部分を含む。細胞表面受容体結合成分Ｃは、有利には、ヒト気道上皮(HAE)細胞に結合可能な受容体結合部分を含む。ＨＡＥ細胞結合ペプチドの例は、国際公開第０２／０７２６１６号に記載されている。
【0041】
細胞表面受容体結合成分Ｃは、環状領域を含むペプチドを含む。環状ペプチドは、ペプチドにおいて少なくとも２個のシステイン残基を設けて、ジスルフィド結合の形成を可能にすることによって形成される。したがって、細胞表面受容体結合成分Ｃは、１つ以上のジスルフィド結合を形成可能な２個以上のシステイン残基を有するペプチドで構成される又は含む。システイン残基は一次受容体結合部分に隣接する。
【0042】
細胞表面受容体結合成分Ｃは、アミノ酸配列ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号6）を含む。
【0043】
構造Ａ－Ｂ－Ｃのペプチドは、ポリリジンなどの核酸結合ポリカチオン、核酸結合ポリカチオンは、スペーサーエレメントの切断可能部分であるＲＶＲＲ（配列番号3）に結合し、その後、アミノ酸配列ＸＳＸＧＡ（配列番号5）又はＧＡを含むリンカー部分、リンカー部分は、細胞表面受容体結合成分ＹＧＬＰＨＫＦ（配列番号7）に結合し、細胞表面受容体結合成分は２つのシステイン残基と隣接する。
【0044】
本発明のペプチドは、
ペプチド３５：Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、及び
ペプチド３２：Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号1）、から選ばれる。
ペプチド３５：Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、及び
ペプチド３２：Ｋ１６－ＲＶＲＲ－ＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号1）、から選ばれる。
【0045】
あるいは、ペプチド３２又はペプチド３５の変異体又は誘導体である、及び、これらのペプチドのいずれかと生物学的に同等である他のペプチド配列を、本発明のリポソームに含むことができる。
【0046】
［リポソーム］
本発明では、リポポリプレックス(LPD)トランスフェクションベクターの形成において本発明の第３の態様におけるトランスフェクション複合体を使用する。トランスフェクションベクターは、成分を細胞に標的化するために使用することができ、成分は、核酸、好ましくはｍＲＮＡ、又は他の分子、例えば治療的若しくは薬学的に活性な分子、若しくは検出可能な標識を含む分子である。
本発明では、リポポリプレックス(LPD)トランスフェクションベクターの形成において本発明の第３の態様におけるトランスフェクション複合体を使用する。トランスフェクションベクターは、成分を細胞に標的化するために使用することができ、成分は、核酸、好ましくはｍＲＮＡ、又は他の分子、例えば治療的若しくは薬学的に活性な分子、若しくは検出可能な標識を含む分子である。
【0047】
本発明の第１の態様の、核酸の細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームは、（ｉ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｉ）ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｉｉ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＣ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｖ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＣ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号1）、又は（ｖ）ＤＨＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を含む。一実施形態において、リポソームは、（ｉ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、（ｉｉ）ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）、又は（ｖ）ＤＨＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を含む。特に好ましい実施形態において、リポソームは、（ｉ）ＤＴＤＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＫ１６－ＲＶＲＲ－ＸＳＸＧＡ－ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ（配列番号2）を含む。
【0048】
［コレステロール］
第２の態様において、本発明は、核酸の細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームを提供し、該リポソームは、本発明の第１の態様に規定されるようなカチオン性脂質、リン脂質、及びペプチドを含み、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成される。本発明の第１の態様のリポソームは、任意で、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成され得る。本発明の第１の態様及び第２の態様のものを含む本発明のリポソームは、有利には、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２２～４５モル％のコレステロール、２３～４０モル％のコレステロールなど、特に２５～３５モル％のコレステロールで構成される。図７に示すデータにおいて表されるように、約３０モル％でプラトーに達するまでリポソーム製剤のコレステロール量を増加させると、トランスフェクション効果が向上するということが分かっている。
第２の態様において、本発明は、核酸の細胞への非ウイルス性送達のためのリポソームを提供し、該リポソームは、本発明の第１の態様に規定されるようなカチオン性脂質、リン脂質、及びペプチドを含み、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成される。本発明の第１の態様のリポソームは、任意で、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２０～５０モル％のコレステロールで構成され得る。本発明の第１の態様及び第２の態様のものを含む本発明のリポソームは、有利には、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して２２～４５モル％のコレステロール、２３～４０モル％のコレステロールなど、特に２５～３５モル％のコレステロールで構成される。図７に示すデータにおいて表されるように、約３０モル％でプラトーに達するまでリポソーム製剤のコレステロール量を増加させると、トランスフェクション効果が向上するということが分かっている。
【0049】
本発明の第１の態様及び第２の態様のリポソーム、及び本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体にコレステロールを含ませることにより、その保存安定性が向上することが分かっている。保存安定性は、例えば４℃で４週間の保存後にリポソーム又はトランスフェクション複合体のサイズを測定することにより判定することができる。
【0050】
［トランスフェクション複合体］
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームと、（ｄ）核酸と、を含むトランスフェクション複合体を提供する。本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、典型的には、非ウイルス性トランスフェクション複合体、例えばＬＰＤ（又はLID）複合体である。核酸は、有利にはＲＮＡ、特にｍＲＮＡである。
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームと、（ｄ）核酸と、を含むトランスフェクション複合体を提供する。本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、典型的には、非ウイルス性トランスフェクション複合体、例えばＬＰＤ（又はLID）複合体である。核酸は、有利にはＲＮＡ、特にｍＲＮＡである。
【0051】
トランスフェクション複合体における、（ｄ）核酸：（ａ）＋（ｂ）全脂質、すなわち、合わせた双方のカチオン性脂質及びリン脂質：（ｃ）ペプチドの成分比は、有利には、約１：３：３、又は１：３：４、又は１：４：４重量部である。例えば、（ｄ）：（ａ）＋（ｂ）：（ｃ）は、０．６－１．４：１．６－６．２：１．６－６．２重量部、特に０．６－１．４：２．６－４．４：２．６－４．４重量部、０．６－１．４：３．６－４．４：３．６－４．４重量部などである。任意で、トランスフェクション複合体は、全脂質（すなわち、カチオン性脂質、リン脂質、及びコレステロール）の量に対して、２０～５０モル％のコレステロール、有利には２２～４５モル％のコレステロール、２３～４０モル％のコレステロールなど、特に２５～３５モル％のコレステロールで構成され得る。一例において、（ｄ）：（ａ）＋（ｂ）：（ｃ）は、約１：３：３、又は１：３：４、又は１：４：４重量部であり、トランスフェクション複合体は２０～５０モル％のコレステロールで構成される。他の例において、（ｄ）：（ａ）＋（ｂ）：（ｃ）は、０．６－１．４：３．６－４．４：３．６－４．４重量部であり、トランスフェクション複合体は２５～３５モル％のコレステロールで構成される。有利には、本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、薬剤又はワクチンとしての使用に適する。
【0052】
［医療用途］
本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、例えば腫瘍細胞への、ｍＲＮＡ含有ベクター複合体のターゲティングを向上させるということが分かっている。
本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、例えば腫瘍細胞への、ｍＲＮＡ含有ベクター複合体のターゲティングを向上させるということが分かっている。
【0053】
このように、本発明の第１の態様及び第２の態様のリポソームは、がんの処置、治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はＲＮＡ治療における使用が見いだされる。特に、本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームは、嚢胞性繊維症(CF)又は原発性線毛機能不全症(PCD)の処置又は予防における使用が見いだされる。このように、本発明は、がんの処置、治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はＲＮＡ治療の方法を提供し、該方法は、適切な複合体における本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームを有効量で患者に投与することを含む。特に、本発明は、このように、嚢胞性繊維症(CF)又は原発性線毛機能不全症(PCD)の処置の方法を提供し、該方法は、適切な複合体における本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームを有効量で患者に投与することを含む。このように、本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、がんの処置、治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はＲＮＡ治療における使用が見いだされる。特に、本発明の第３態様のトランスフェクション複合体は、嚢胞性繊維症(CF)又は原発性線毛機能不全症(PCD)の処置における使用が見いだされる。このように、本発明は、がんの処置、治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はＲＮＡ治療の方法を提供し、該方法は、本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を有効量で患者に投与することを含む。特に、本発明は、嚢胞性繊維症(CF)又は原発性線毛機能不全症(PCD)の処置の方法を提供し、該方法は、本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を有効量で患者に投与することを含む。本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体は、薬学的に適切な担体と混合した、又は薬学的に適切な担体と共に、リポソーム又はトランスフェクション複合体を含む、本発明の第４の態様の医薬組成物として投与することができる。
【0054】
第５の態様において、本発明は、治療に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。さらに、本発明は、薬剤又はワクチンとして使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。例えば、本発明の第５の態様は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によって生じる病態の処置若しくは予防に使用される、がんの処置に使用される、治療免疫付与若しくは予防免疫付与のための、又はＲＮＡ治療のための、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。特に、本発明の第５の態様は、嚢胞性繊維症(CF)又は原発性線毛機能不全症(PCD)の処置又は予防に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【0055】
核酸成分（ｄ）は、任意の適切な核酸であり得る。核酸成分（ｄ）は、ＤＮＡ又はＲＮＡ又は化学的に修飾した核酸擬態分子、例えば、ＰＮＡ分子であり得る。核酸成分（ｄ）は、例えば、標的細胞において有用性があるタンパク質をコードし得る。有利には、核酸は、細胞メッセンジャーＲＮＡ(mRNA)である。
【0056】
また、本発明は、本発明の第１の態様及び第２の態様のトランスフェクション複合体を作製するプロセスを提供する。
【0057】
第６の態様において、本発明は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防のための方法を提供し、該方法は、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を、ヒト又は非ヒト動物に投与することを含む。
【0058】
本明細書において使用されるとき、「遺伝子における欠損及び／若しくは欠失」という用語は、遺伝子のコード領域における欠損又は欠失だけでなく、遺伝子の調節エレメント、例えばトランス若しくはシスの調節エレメントにおける欠損若しくは欠失、又は、直接的に若しくは非直接的に、遺伝子の転写若しくは翻訳に関与する任意の他のエレメントにおける欠損若しくは欠失も示す。
【0059】
第７の態様において、本発明は、ヒト又は非ヒト動物の治療免疫付与又は予防免疫付与ための方法を提供し、該方法は、ｍＲＮＡと共に本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又はｍＲＮＡを含む本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を、ヒト又は非ヒト動物に投与することを含む。
【0060】
第８の態様において、本発明は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防、又は治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はｍＲＮＡ治療、又はヒト若しくは非ヒト動物におけるがんの処置若しくは予防のための薬剤を製造するための、本発明の第１の態様又は第２の態様のリポソームの使用、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体の使用を提供する。
【0061】
第９の態様において、本発明は、遺伝子における欠損及び／若しくは欠失によってヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防、又は治療免疫付与若しくは予防免疫付与、又はＲＮＡ治療に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【0062】
第１０の態様において、本発明は、ヒト又は非ヒト動物におけるがんの処置又は予防に使用される、本発明の第１の態様若しくは第２の態様のリポソーム、又は本発明の第３の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【0063】
＜実験方法及び手法＞
［実験方法及び手法概略］
記載されない限り、合成のための溶媒及び試薬は民間の供給者から得た試薬用のものであり、さらに精製することなく使用した。Ｐａｎｇｂｏｒｎ，Ａ．Ｂ．；Ｇｉａｒｄｅｌｌｏ，Ｍ．Ａ．；Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．；Ｒｏｓｅｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｔｉｍｍｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ、１９９６、１５、１５１８-１５２０に記載の手法を用いて無水アルミナカラムを使用して、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を得た。すべての感湿反応は、窒素又はアルゴン雰囲気下、オーブン乾燥ガラス器具を使用して行った。ＴＬＣによってシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートにおいて、ＵＶ、過マンガン酸カリウム、及びリンモリブデン酸染色による検出で、反応をモニターした。シリカゲルを使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った（４０～６３μｍの粒子径）。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＡＭＸ３００ＭＨｚ、Ａｖａｎｃｅ－５００ＭＨｚ、及びＡｖａｎｃｅ－６００ＭＨｚの装置で記録した。カップリング定数はヘルツ(Hz)での尺度であり、特定されない限り、スペクトルを２９８Ｋで得た。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｅｇａｎ ＭＡＴ ９００ＸＰ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣエレクトロスプレー、及びＶＧ７０－ＳＥ質量分析計において、質量スペクトルを記録した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＦＴＩＲ－８７００分光器において、赤外スペクトルを記録した。
［実験方法及び手法概略］
記載されない限り、合成のための溶媒及び試薬は民間の供給者から得た試薬用のものであり、さらに精製することなく使用した。Ｐａｎｇｂｏｒｎ，Ａ．Ｂ．；Ｇｉａｒｄｅｌｌｏ，Ｍ．Ａ．；Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．；Ｒｏｓｅｎ，Ｒ．Ｋ．；Ｔｉｍｍｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ、１９９６、１５、１５１８-１５２０に記載の手法を用いて無水アルミナカラムを使用して、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２を得た。すべての感湿反応は、窒素又はアルゴン雰囲気下、オーブン乾燥ガラス器具を使用して行った。ＴＬＣによってシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートにおいて、ＵＶ、過マンガン酸カリウム、及びリンモリブデン酸染色による検出で、反応をモニターした。シリカゲルを使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った（４０～６３μｍの粒子径）。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＡＭＸ３００ＭＨｚ、Ａｖａｎｃｅ－５００ＭＨｚ、及びＡｖａｎｃｅ－６００ＭＨｚの装置で記録した。カップリング定数はヘルツ(Hz)での尺度であり、特定されない限り、スペクトルを２９８Ｋで得た。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｅｇａｎ ＭＡＴ ９００ＸＰ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣエレクトロスプレー、及びＶＧ７０－ＳＥ質量分析計において、質量スペクトルを記録した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＦＴＩＲ－８７００分光器において、赤外スペクトルを記録した。
【0064】
以下の実施例において、リポソームは省略形「Ｃｎｎ ＤＸＸＸ ｎｎ」を使用して示され、Ｃｎｎはカチオン性脂質、例えば、Ｃ１４(DTDTMA)、Ｃ１８(DOTMA)、又はＣ１６(DHDTMA)であり、ＤＸＸＸはリン脂質、例えばＤＯＰＥ(ホスファチジルエタノールアミン、又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、ＤＯＰＣ(ホスファチジルコリン、又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールトリメチルアミン)、又はＤＳＰＣ(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)であり、ｎｎはペプチド、例えばＭＥ２７(27)、ペプチド３５(35)、Ｙ(Y)、又はペプチド３２(32)である。
【0065】
［脂質］
・ Ｈｕｒｌｅｙ ＣＡ，Ｗｏｎｇ ＪＢ，Ｈａｉｌｅｓ ＨＣ、及びＴａｂｏｒ ＡＢ、Ａｓｓｙｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｉａｌｋｙｌｏｘｙ－３－ａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００４、６９：９８０－９８３に記載の方法に従って、ＤＴＤＴＭＡ(C14)、ＤＯＴＭＡ(C18)、及びＤＨＤＴＭＡ(C16)を準備した。
・ ＤＯＰＥは、米国アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能である。
・ ＤＳＰＣは、米国アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能である。
・ ＤＯＰＣは、米国アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能である。
・ Ｈｕｒｌｅｙ ＣＡ，Ｗｏｎｇ ＪＢ，Ｈａｉｌｅｓ ＨＣ、及びＴａｂｏｒ ＡＢ、Ａｓｓｙｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｉａｌｋｙｌｏｘｙ－３－ａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００４、６９：９８０－９８３に記載の方法に従って、ＤＴＤＴＭＡ(C14)、ＤＯＴＭＡ(C18)、及びＤＨＤＴＭＡ(C16)を準備した。
・ ＤＯＰＥは、米国アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能である。
・ ＤＳＰＣは、米国アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能である。
・ ＤＯＰＣは、米国アラバマ州アラバスターのＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから入手可能である。
【0066】
［ペプチド合成］
記載されるペプチド（表１）は、標準的な機器及び技術を使用して合成した。
表１はペプチド配列を示す。
* ペプチド３５では、X＝ε-Ahx
表２はペプチド質量を示す。
ＭＥ２７は、ＳＹＲＯ自動ペプチド合成装置にて合成した。
記載されるペプチド（表１）は、標準的な機器及び技術を使用して合成した。
表１はペプチド配列を示す。
【表1】
表２はペプチド質量を示す。
【表2】
【0067】
直鎖ペプチド配列：ペプチドは、テフロンフリット付きの２ｍｌシリンジと５００μｌのカップリング体積を使用して、２０μｍｏｌスケールで合成した。これらの配列にはＦｍｏｃ－ＧｌｙプレロードＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴレジン又はＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－２－Ｃｌ－Ｔｒｔ－レジンを使用した。Ｆｍｏｃ－Ｐｅｇ４－ＣＯＯＨを既報の手法に従って合成した（国際公開第2005/117985号の82頁にあるFmoc-Haa4-COOHの合成を参照のこと、Fmoc-Haa4-COOHはその明細書においてFmoc-Peg4-COOHに与えられた名称である）。ＴＧＴレジンは最初に１０分間膨潤させたが、２－Ｃｌ－ＴｒｔレジンはＤＭＦ内で長時間にわたる初期膨潤時間（数時間）を必要とした。通常のカップリングを、ＨＢＴＵ（DMF内）及びＤＩＰＥＡ（NMP内）により、４倍超過量の試薬を使用して行った。Ｆｍｏｃを、ＤＭＦ内の４０％ピペリジン溶液で３分間及び２０％溶液で１０分間切断した。合成サイクルは、４０分のカップリング時間、４０％ピペリジンによるＦｍｏｃ脱保護に３分、２０％ピペリジンによるＦｍｏｃ脱保護にさらに１０分、及び洗浄ステップで構成された。合成及びＤＭＦによる最後の洗浄サイクル後に、Ｓｙｒｏの「マニュアル（manual）」／「エンプティ（empty）」機能を使用して、ペプチドをＤＣＭ、メタノール、及びジエチルエーテルで洗浄した（各３回）。エーテルの蒸発を促すために、さらにしばらくの間、吸引をかけた。
【0068】
オン－レジンのジスルフィド結合形成：レジン上でジスルフィド架橋を形成させるために、レジンをＰＥフリット付きのシリンジに入れ、ＤＭＦ内で膨潤させた。過剰のＤＭＦを除去した後、新しく調製した最少量のＤＭＦ内のヨウ素の溶液（例えば2mlシリンジの場合、500μl、レジンロード量に対して１０等量のヨウ素）を加え、シリンジを４時間の間、４分毎に２０秒間ボルテックスにかけた。試薬溶液を除去し、レジンをＤＭＦで１０～２０回、ＤＣＭ、メタノール、及びエーテルでそれぞれ３回洗浄した。
【0069】
切断及び脱保護：切断のためにシリンジをヒュームフードに移した。切断は９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、及び２．５％Ｈ２Ｏのカクテルで行った。最少量の新しく調製したカクテルを加えてレジンを覆った（例えば2mlシリンジに＜500μl）。４時間後にプランジャーを使って切断溶液をポリプロピレン(PP)チューブに通し、レジンを新たな少量の切断カクテルで洗浄した（例えば2mlシリンジに200μl）。そして、ペプチドをエーテルで沈殿させた(例えば2mlシリンジの合わせたフラクションに4mlのジエチルエーテルを加えた）。ＰＰチューブを少なくとも１５分間はフリーザーに入れてから、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、溶液をペプチドペレットからデカントした。遠心分離とデカントを約２ｍｌのエーテルを使って２回繰り返した。最後にペプチドを水又はｔＢｕＯＨ／水(4:1)に溶解し、凍結乾燥した。一部のペプチド配列は、極めて低い溶解性を示し、綿毛状のペプチドを得るには、異なる溶媒混合物（水、tBuOH又はアセトニトリル）を使った数回の凍結乾燥／溶解プロセスが必要な場合もあった。
【0070】
ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分析し、逆相ＨＰＬＣで純度＞９０％まで精製した。質量スペクトルはＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＥＳ－ＭＳ（ソフトウェア：Masslynx）を使用して記録し、それらの質量を表２に記録する。
【0071】
ペプチド３５、Ｋ１６Ｙ、及びペプチド３２は、英国バーミンガムのＡＭＳ Ｂｉｏ Ｌｔｄ．から購入し、半自動ペプチド合成化学反応を使用して合成した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分析し、必要な場合、逆相ＨＰＬＣで純度８５％まで精製した。相対分子質量を表２に示す。
【0072】
Ｋ１６は上述のように購入した(Hart et al., Lipid-mediated enhancement of transfection by a nonviral integrin-targeting vector. Hum Gene Ther., 1998,9, 575-585)。相対分子質量を表２に示す。
【0073】
これらすべての凍結乾燥ペプチドを、水中において１０ｍｇ／ｍｌで希釈し、－２０℃で数か月間保管した。一度解凍すると、ペプチドのアリコートを４℃で数週保管した。
【0074】
［ｍＲＮＡ］
ホタルのルシフェラーゼ(CleanCap FLuc mRNA)をコードするｍＲＮＡを、カリフォルニア州サンディエゴのＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。修飾を有しない及びシュードウリジン修飾を有する両方のｍＲＮＡを使用した。
ホタルのルシフェラーゼ(CleanCap FLuc mRNA)をコードするｍＲＮＡを、カリフォルニア州サンディエゴのＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。修飾を有しない及びシュードウリジン修飾を有する両方のｍＲＮＡを使用した。
【0075】
［トランスフェクションのためのナノ複合体調製］
特に記載のない限り、ｍＲＮＡをまず加え、その後リポソーム、最後にペプチドを、１：３：４の比でそれぞれ加えて、複合体を２μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ最終濃度に調製した。これらの成分をＯｐｔｉＭＥＭ内で混合し、室温で３０分間インキュベートしてから、トランスフェクション実験に使用した。
特に記載のない限り、ｍＲＮＡをまず加え、その後リポソーム、最後にペプチドを、１：３：４の比でそれぞれ加えて、複合体を２μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ最終濃度に調製した。これらの成分をＯｐｔｉＭＥＭ内で混合し、室温で３０分間インキュベートしてから、トランスフェクション実験に使用した。
【0076】
［粒子径及び電荷測定のための粒子イメージング］
脂質と共にペプチドを含むＲＬＰナノ粒子径を、ＮａｎｏＺＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ(Malvern)を使用して、動的光散乱法によって、種々の重量比のｍＲＮＡに対するリポソーム(w/w)において測定した。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭではなくヌクレアーゼフリー水内で配合されることを除いて、上述のように調製した。１ｍＬのサンプル（1.5μgのｍＲＮＡを含む）を分析して、その粒子径及びゼータ電位を測定した。粒子径は、粒子の強度ベース分布の平均として記録した。
脂質と共にペプチドを含むＲＬＰナノ粒子径を、ＮａｎｏＺＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ(Malvern)を使用して、動的光散乱法によって、種々の重量比のｍＲＮＡに対するリポソーム(w/w)において測定した。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭではなくヌクレアーゼフリー水内で配合されることを除いて、上述のように調製した。１ｍＬのサンプル（1.5μgのｍＲＮＡを含む）を分析して、その粒子径及びゼータ電位を測定した。粒子径は、粒子の強度ベース分布の平均として記録した。
【0077】
［リポソーム又はトランスフェクション複合体の保存安定性］
保存安定性は、動的光散乱法を使用して、例えば４℃で４週間の保存後のリポソーム又はトランスフェクション複合体(RLP)の粒子径を測定することにより判定することができる。保存後の粒子径の変化は粒子の安定性を示す。複合体を画像分析に関して配合し、室温(25℃)又は４℃のいずれかで保存した。１ｍＬのサンプル(1.5μgのｍＲＮＡを含む)を、４週にわたって特定の時点で測定して、ＮａｎｏＺＳ(Malvern Instruments, Malvern)を用いてその粒子径を判定した。
保存安定性は、動的光散乱法を使用して、例えば４℃で４週間の保存後のリポソーム又はトランスフェクション複合体(RLP)の粒子径を測定することにより判定することができる。保存後の粒子径の変化は粒子の安定性を示す。複合体を画像分析に関して配合し、室温(25℃)又は４℃のいずれかで保存した。１ｍＬのサンプル(1.5μgのｍＲＮＡを含む)を、４週にわたって特定の時点で測定して、ＮａｎｏＺＳ(Malvern Instruments, Malvern)を用いてその粒子径を判定した。
【0078】
［ナノ複合体内のｍＲＮＡ封入効率］
ナノ複合体内のｍＲＮＡ封入効率を測定するため、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ(Invitrogen,Molecular Probes)を行った。水又はＯｐｔｉＭＥＭの代わりにＴＥバッファーを使用することを除いて、ＲＬＰ複合体を上述のように形成した。複合体は、ウェルあたり１００ｎｇのｍＲＮＡを用いて１：３：４の比で９６ウェルプレートにプレーティングした。サンプルをＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬と共にインキュベートし、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー(BMG Labtech、英国アイルズベリー)を使用して標準的なフルオレセイン波長(励起約480nm、発光約520nm)で蛍光性を測定した。測定値を非複合体化ｍＲＮＡの蛍光測定値と比較し、以下の式にしたがって、封入効率を計算した。
ナノ複合体内のｍＲＮＡ封入効率を測定するため、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ(Invitrogen,Molecular Probes)を行った。水又はＯｐｔｉＭＥＭの代わりにＴＥバッファーを使用することを除いて、ＲＬＰ複合体を上述のように形成した。複合体は、ウェルあたり１００ｎｇのｍＲＮＡを用いて１：３：４の比で９６ウェルプレートにプレーティングした。サンプルをＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬と共にインキュベートし、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー(BMG Labtech、英国アイルズベリー)を使用して標準的なフルオレセイン波長(励起約480nm、発光約520nm)で蛍光性を測定した。測定値を非複合体化ｍＲＮＡの蛍光測定値と比較し、以下の式にしたがって、封入効率を計算した。
【数1】
【0079】
［インビトロのトランスフェクション］
テストした細胞は、ＣＴ２６マウス結腸がん細胞、Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫細胞、及び患者由来の筋芽細胞を含むものであった。細胞を、ウェルあたり約２×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種した後、完全増殖培地内において、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、成分を、それぞれ１：４：４の重量比に相当するＯｐｔｉＭＥＭ内の６０μｌのｍＲＮＡ(R)、ＯｐｔｉＭＥＭ内の６０μｌのリポソーム(L)、及びＯｐｔｉＭＥＭ内の８０μｌのペプチド脂質(P)の順序で混合することによって、ＲＬＰ製剤を調製した。複合体はすべて、手短にピペッティングすることによって混合し、室温で３０分保管した後、最終体積が１．４ｍｌになるようにＯｐｔｉＭＥＭに希釈した。完全増殖培地を除去した後、０．１μｇのｍＲＮＡに相当する２００μｌの複合体を、各培養ウェルに加えた。トランスフェクションはすべて、それぞれ６ウェルで行った。複合体の沈降及び細胞接触を促進するため、遠心分離（1500rpm，5分間）を行った。細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートしてから、新しい培地に交換して２４時間インキュベートし、その後、レポーター遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイ（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）で分析した。
テストした細胞は、ＣＴ２６マウス結腸がん細胞、Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫細胞、及び患者由来の筋芽細胞を含むものであった。細胞を、ウェルあたり約２×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種した後、完全増殖培地内において、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、成分を、それぞれ１：４：４の重量比に相当するＯｐｔｉＭＥＭ内の６０μｌのｍＲＮＡ(R)、ＯｐｔｉＭＥＭ内の６０μｌのリポソーム(L)、及びＯｐｔｉＭＥＭ内の８０μｌのペプチド脂質(P)の順序で混合することによって、ＲＬＰ製剤を調製した。複合体はすべて、手短にピペッティングすることによって混合し、室温で３０分保管した後、最終体積が１．４ｍｌになるようにＯｐｔｉＭＥＭに希釈した。完全増殖培地を除去した後、０．１μｇのｍＲＮＡに相当する２００μｌの複合体を、各培養ウェルに加えた。トランスフェクションはすべて、それぞれ６ウェルで行った。複合体の沈降及び細胞接触を促進するため、遠心分離（1500rpm，5分間）を行った。細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートしてから、新しい培地に交換して２４時間インキュベートし、その後、レポーター遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイ（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）で分析した。
【0080】
［インビボのトランスフェクション］
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをチャールスリバー社(UK)から購入した。マウスに、５０：５０のＲＰＭＩ及びマトリゲルを含む懸濁液内の１０，０００個のＢ１６ Ｆ１０細胞を注射し、腫瘍を発生させた。ナノ複合体を、０．２ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度で上述のように調製した。５０μＬのナノ複合体懸濁液を腫瘍内に注射した。コントロールのマウスは注射をしなかった。注射の２４時間後、マウスを選別して、腫瘍を取り出した。腫瘍をレポーター遺伝子アッセイ溶解バッファーに浸漬し、組織ホモジナイザーでホモジナイズし、１４，１７０ｘｇで１０分間４℃において遠心分離した後、上清を除去して、さらに１０分間４℃で遠心分離してから、ルシフェラーゼアッセイに使用した。
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスをチャールスリバー社(UK)から購入した。マウスに、５０：５０のＲＰＭＩ及びマトリゲルを含む懸濁液内の１０，０００個のＢ１６ Ｆ１０細胞を注射し、腫瘍を発生させた。ナノ複合体を、０．２ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度で上述のように調製した。５０μＬのナノ複合体懸濁液を腫瘍内に注射した。コントロールのマウスは注射をしなかった。注射の２４時間後、マウスを選別して、腫瘍を取り出した。腫瘍をレポーター遺伝子アッセイ溶解バッファーに浸漬し、組織ホモジナイザーでホモジナイズし、１４，１７０ｘｇで１０分間４℃において遠心分離した後、上清を除去して、さらに１０分間４℃で遠心分離してから、ルシフェラーゼアッセイに使用した。
【0081】
［ルシフェラーゼ及びタンパク質アッセイ］
細胞をＰＢＳで１回洗浄してから、２０μｌの１×レポーター溶解バッファー（Reporter Lysis Buffer）（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を４℃で２０分間、細胞に加え、次に－８０℃で少なくとも４０分間凍結してから、室温で解凍した。次に、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)及びＯｐｔｉｍａ Ｆｌｕｏｓｔａｒプレートリーダー(BMG Labtech)を使用して、ルシフェラーゼ活性を１０秒間測定した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ(米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)タンパク質アッセイ試薬を使用し、製造者の説明書に従って、ルシフェラーゼ試験液２０μｌを５分の１に希釈した試薬１８０μｌに加え、室温で１０分間インキュベートしてから、そのＯＤ５９０を一連のＢＳＡ標準と比較することにより、各トランスフェクション溶解物内に存在するタンパク質の量を測定した。ルシフェラーゼ活性をタンパク質１ミリグラムあたりの相対発光量(RLU)として表した(RLU/mg)。
細胞をＰＢＳで１回洗浄してから、２０μｌの１×レポーター溶解バッファー（Reporter Lysis Buffer）（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を４℃で２０分間、細胞に加え、次に－８０℃で少なくとも４０分間凍結してから、室温で解凍した。次に、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)及びＯｐｔｉｍａ Ｆｌｕｏｓｔａｒプレートリーダー(BMG Labtech)を使用して、ルシフェラーゼ活性を１０秒間測定した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ(米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)タンパク質アッセイ試薬を使用し、製造者の説明書に従って、ルシフェラーゼ試験液２０μｌを５分の１に希釈した試薬１８０μｌに加え、室温で１０分間インキュベートしてから、そのＯＤ５９０を一連のＢＳＡ標準と比較することにより、各トランスフェクション溶解物内に存在するタンパク質の量を測定した。ルシフェラーゼ活性をタンパク質１ミリグラムあたりの相対発光量(RLU)として表した(RLU/mg)。
【0082】
＜結果の検討＞
［種々の脂質－ペプチド－ｍＲＮＡ粒子(RLP)でのルシフェラーゼ発現アッセイの結果の検討］
Ｂ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクションにおけるナノ複合体製剤をスクリーニングするため、種々の本発明のリポソームの成分(カチオン性脂質、リン脂質、及びペプチド)を使用した。リポソーム及びペプチドの各組合せを、ルシフェラーゼｍＲＮＡと共に、１：３：４のｍＲＮＡ：リポソーム：ペプチドの一定の重量比で、ナノ複合体に製剤化し、ナノ複合体をそのサイズ、電荷、及びｍＲＮＡ複合体形成率について分析した。
［種々の脂質－ペプチド－ｍＲＮＡ粒子(RLP)でのルシフェラーゼ発現アッセイの結果の検討］
Ｂ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクションにおけるナノ複合体製剤をスクリーニングするため、種々の本発明のリポソームの成分(カチオン性脂質、リン脂質、及びペプチド)を使用した。リポソーム及びペプチドの各組合せを、ルシフェラーゼｍＲＮＡと共に、１：３：４のｍＲＮＡ：リポソーム：ペプチドの一定の重量比で、ナノ複合体に製剤化し、ナノ複合体をそのサイズ、電荷、及びｍＲＮＡ複合体形成率について分析した。
【0083】
そして、すべての製剤のトランスフェクション効率を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して比較した。結果を図１ａのまとめにて報告し、表３及び図１ｂにてより詳しく報告する。リン脂質ＤＯＰＥ及びペプチド３５の双方を含む製剤は、他のリン脂質／ペプチドの組合せよりも良好に作用し、上位５つの製剤のうち３つはこの成分の混合物を含む。特に、上位５つの製剤は、上述の特許文献８に公開されている先行技術の製剤Ｃ１８ＤＯＰＥ３２より非常に良好に作用した。
【0084】
このスクリーニングにおける最適な製剤は、Ｃ１８ＤＯＰＥ３５を除くすべての他の製剤よりも有意に高い発現率をもたらすことから(p<0.01)、Ｃ１４ＤＯＰＥ３５であった。上位５つの製剤(C14 DOPE 35, C18 DOPE 35, C14 DOPE 35, C14 DOPE 32 及びC16 DOPE 35)は、テストした他のいずれの製剤よりも非常に良好に作用した。
表３は、種々の脂質－ペプチド－ｍＲＮＡ粒子(RLP)でのルシフェラーゼ発現アッセイの結果を示す。
表３は、種々の脂質－ペプチド－ｍＲＮＡ粒子(RLP)でのルシフェラーゼ発現アッセイの結果を示す。
【表3】
【0085】
切断可能リンカー(27, 32 及び35)を含むペプチドは、リンカーなし(28)のもの又は疎水性リンカー(31)を含むものよりも概ね良好に作用した。理論に縛られることを望むものではないが、いったん内在化すると核酸結合ドメインがペプチドのターゲティング部分から急速に解離することは、ｍＲＮＡトランスフェクションにおいて有益であるということを、これは示唆するものである(Mustapa et al. 2009)。炭化水素鎖長と、トランスフェクション効率又は粒子の流体力学的直径との関連は見られない。
【0086】
［製剤へのコレステロール取り込みの結果検討］
コレステロールをＣ１４ＤＯＰＥ２７製剤に取り込んで、ルシフェラーゼ発現のレベルを、Ｂ１６Ｆ１０細胞において２４時間後に検出した。この実験の結果を図７に示す。コレステロール量の増加により、タンパク質発現が向上したが、この作用は３０％モルのコレステロールでプラトーに達した。
コレステロールをＣ１４ＤＯＰＥ２７製剤に取り込んで、ルシフェラーゼ発現のレベルを、Ｂ１６Ｆ１０細胞において２４時間後に検出した。この実験の結果を図７に示す。コレステロール量の増加により、タンパク質発現が向上したが、この作用は３０％モルのコレステロールでプラトーに達した。
【0087】
Ｃ１４ＤＯＰＥ３５、Ｃ１８ＤＯＰＥ３５、Ｃ１４ＤＯＰＥ３５、Ｃ１４ＤＯＰＥ３２、及びＣ１６ＤＯＰＥ３５について、最大３０％までのコレステロールモル濃度をテストし、その結果を図２、図３、図４、図５、及び図６にそれぞれ示す。これらのグラフは、製剤に３０モル％のコレステロールを含むことでトランスフェクションが有意に向上したことを示す。
【0088】
［トランスフェクション複合体の保存安定性の検討］
本発明の粒子は、４℃での４週間の保存において２０％未満のサイズ変化を伴う、サイズ及び電荷特性を保持することが分かった。また、これらの粒子は、この同じ期間においてｍＲＮＡ封入における変化を示さず、約９５％のｍＲＮＡが保存から２８日目において複合体に結合する。ところが、コレステロールなしの粒子は、４週間でｍＲＮＡを徐々に放出し、２８日目までには約７５％のｍＲＮＡのみが粒子に結合する。
本発明の粒子は、４℃での４週間の保存において２０％未満のサイズ変化を伴う、サイズ及び電荷特性を保持することが分かった。また、これらの粒子は、この同じ期間においてｍＲＮＡ封入における変化を示さず、約９５％のｍＲＮＡが保存から２８日目において複合体に結合する。ところが、コレステロールなしの粒子は、４週間でｍＲＮＡを徐々に放出し、２８日目までには約７５％のｍＲＮＡのみが粒子に結合する。
【0089】
［ｍＲＮＡ：脂質：ペプチドの比の変化の結果検討］
また、トランスフェクション複合体における、（ｄ）核酸：（ａ）＋（ｂ）全脂質、すなわち、合わせた双方のカチオン性脂質及びリン脂質：（ｃ）ペプチドの成分比も検討した。最適な製剤である３０モル％のコレステロールを伴うＣ１４ＤＯＰＥ３５のトランスフェクション後に、Ｂ１６Ｆ１０細胞においてルシフェラーゼ活性を測定した。種々の比の全脂質(2-4)及びペプチド(3-5)をテストした。結果が図８に示されており、一元配置分散分析テストに基づいて、同じ文字を有する製剤は有意に異ならないが、同じ文字を有しない製剤は有意に異なる(P≦0.05)と考えられる。図８のデータは、平均値＋標準誤差として示し、ｎ＝６である。図８に示す結果は、トランスフェクションに最も効果的な比が１：４：４であることを示す。最適なトランスフェクションは１：４：４で見られるが、細胞増殖における負の作用がリポソーム及び／又はペプチドのより高い重量比において見られた。このように、最適な比は、５つの最も効果的な製剤について、約１：３：４又は１：４：４であると考えられた。Ｃ１４ＤＯＰＥ３５では、最適な比は１：４：４であると分かった。
また、トランスフェクション複合体における、（ｄ）核酸：（ａ）＋（ｂ）全脂質、すなわち、合わせた双方のカチオン性脂質及びリン脂質：（ｃ）ペプチドの成分比も検討した。最適な製剤である３０モル％のコレステロールを伴うＣ１４ＤＯＰＥ３５のトランスフェクション後に、Ｂ１６Ｆ１０細胞においてルシフェラーゼ活性を測定した。種々の比の全脂質(2-4)及びペプチド(3-5)をテストした。結果が図８に示されており、一元配置分散分析テストに基づいて、同じ文字を有する製剤は有意に異ならないが、同じ文字を有しない製剤は有意に異なる(P≦0.05)と考えられる。図８のデータは、平均値＋標準誤差として示し、ｎ＝６である。図８に示す結果は、トランスフェクションに最も効果的な比が１：４：４であることを示す。最適なトランスフェクションは１：４：４で見られるが、細胞増殖における負の作用がリポソーム及び／又はペプチドのより高い重量比において見られた。このように、最適な比は、５つの最も効果的な製剤について、約１：３：４又は１：４：４であると考えられた。Ｃ１４ＤＯＰＥ３５では、最適な比は１：４：４であると分かった。
【0090】
［他の細胞株におけるトランスフェクションの結果検討］
ベクターが複数の細胞株にトランスフェクトできるということは、製剤開発において大きな課題である。最適な製剤(コレステロール無しのC14 DOPE 35及び３０モル％のコレステロールを伴うC14 DOPE 35)がｍＲＮＡを他のがん細胞に効果的に送達できるかを評価するため、これらの最適な製剤のトランスフェクション効率を、マウス結腸がんのＣＴ２６及びヒト細気管支肺胞上皮がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８である他の２つの細胞株において、Ｃ１４ＤＯＰＥ２７のものと比較した。図９ａ、図９ｂ、及び図９ｃに示す結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞に見られる傾向を裏付け、最適な製剤を使用してトランスフェクトした細胞において、Ｃ１４ＤＯＰＥ２７と比較して、顕著に向上したトランスフェクションが測定された。コレステロールを含む最適な製剤(３０モル％のコレステロールを伴うC14 DOPE 35)はさらに、テストしたすべての細胞株においてトランスフェクションを向上させたが、向上の程度は細胞特異的であるとみられた。コレステロール無しのＣ１４ＤＯＰＥ３５と比較した際の違いは、Ｂ１６Ｆ１０及びＣＴ２６細胞においてのみ統計的に有意であった。
ベクターが複数の細胞株にトランスフェクトできるということは、製剤開発において大きな課題である。最適な製剤(コレステロール無しのC14 DOPE 35及び３０モル％のコレステロールを伴うC14 DOPE 35)がｍＲＮＡを他のがん細胞に効果的に送達できるかを評価するため、これらの最適な製剤のトランスフェクション効率を、マウス結腸がんのＣＴ２６及びヒト細気管支肺胞上皮がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８である他の２つの細胞株において、Ｃ１４ＤＯＰＥ２７のものと比較した。図９ａ、図９ｂ、及び図９ｃに示す結果は、Ｂ１６Ｆ１０細胞に見られる傾向を裏付け、最適な製剤を使用してトランスフェクトした細胞において、Ｃ１４ＤＯＰＥ２７と比較して、顕著に向上したトランスフェクションが測定された。コレステロールを含む最適な製剤(３０モル％のコレステロールを伴うC14 DOPE 35)はさらに、テストしたすべての細胞株においてトランスフェクションを向上させたが、向上の程度は細胞特異的であるとみられた。コレステロール無しのＣ１４ＤＯＰＥ３５と比較した際の違いは、Ｂ１６Ｆ１０及びＣＴ２６細胞においてのみ統計的に有意であった。
【0091】
図９ａ、図９ｂ、及び図９ｃにおいて、一元配置分散分析テストに基づいて、同じ文字を有する製剤は有意に異ならないが、同じ文字を有しない製剤は有意に異なる(P≦0.05)と考えられる。データは、平均値＋標準誤差として示し、ｎ＝６である。
【0092】
［インビボのｍＲＮＡ送達結果の検討］
理想的なｍＲＮＡ送達システムは、血液や細胞外環境に存在するタンパク質やエンドヌクレアーゼに暴露したとき、その輸送物をパッケージングすることができて、インビボでｍＲＮＡを細胞に効率的に送達するために非特異的相互作用を避ける必要がある。さらに、ベクターは、良好な安全性プロファイルを有する必要があり、生体において免疫反応を誘発するべきでない。
理想的なｍＲＮＡ送達システムは、血液や細胞外環境に存在するタンパク質やエンドヌクレアーゼに暴露したとき、その輸送物をパッケージングすることができて、インビボでｍＲＮＡを細胞に効率的に送達するために非特異的相互作用を避ける必要がある。さらに、ベクターは、良好な安全性プロファイルを有する必要があり、生体において免疫反応を誘発するべきでない。
【0093】
マウスにおいてインビボでｍＲＮＡを送達できることを評価するため、最適なナノ複合体(３０モル％のコレステロールを伴うC14DOPE 35)を、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に腫瘍内送達した。インビボにおけるコレステロールの作用を評価するため、３０モル％のコレステロールを伴うＣ１４ＤＯＰＥ３５を、コレステロールなしのＣ１４ＤＯＰＥ３５に対して比較した。未処置の腫瘍をネガティブコントロールとして使用した。２４時間後に腫瘍を採取し、ルシフェラーゼ発現を定量化した。
【0094】
図１０に示す結果は、（１０μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡを含む、コレステロール有り無しの）Ｃ１４ＤＯＰＥ３５のインビボにおけるトランスフェクション効率を調べるため、雌のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＢ１６Ｆ１０腫瘍に（１０μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡを含む、コレステロール有り無しの）Ｃ１４ＤＯＰＥ３５を注射することに関連する。ルシフェラーゼ発現を腫瘍質量に対してノーマライズした。図１０のデータは、平均値±標準誤差として示す。
【0095】
図１０は、最適なコレステロール製剤が、コレステロールなしの製剤よりも有意に高いレベルのタンパク質発現を生じることを示す。これらの結果は、本発明の脂質－ペプチドナノ粒子が、血清タンパク質及び他の生物学的な問題による実質的な干渉なくインビボでｍＲＮＡを送達可能であることを示唆する。
【0096】
［結果のまとめ］
表３、並びに図１ａ及び図１ｂに結果を示す、本明細書に記載のルシフェラーゼアッセイは、Ｃ１４ＤＯＰＥ３５、Ｃ１８ＤＯＰＥ３５、Ｃ１４ＤＯＰＥ３５、Ｃ１４ＤＯＰＥ３２、及びＣ１６ＤＯＰＥ３５を、トランスフェクション効率に関して最も有効な製剤であるとして示す。これらのうち最も有効なものはＣ１４ＤＯＰＥ３５である。
表３、並びに図１ａ及び図１ｂに結果を示す、本明細書に記載のルシフェラーゼアッセイは、Ｃ１４ＤＯＰＥ３５、Ｃ１８ＤＯＰＥ３５、Ｃ１４ＤＯＰＥ３５、Ｃ１４ＤＯＰＥ３２、及びＣ１６ＤＯＰＥ３５を、トランスフェクション効率に関して最も有効な製剤であるとして示す。これらのうち最も有効なものはＣ１４ＤＯＰＥ３５である。
【0097】
さらに、図２～図７に結果を示す、本明細書に記載のコレステロールの検討は、これらの製剤に３０モル％コレステロールを加えることで、そのトランスフェクション効率を増加させることを示唆する。最も有効なコレステロール含有製剤は、３０モル％コレステロールを伴うＣ１４ＤＯＰＥ３５である。
【0098】
３０％モルのコレステロールを伴うＣ１４ＤＯＰＥ３５のｍＲＮＡ：脂質：ペプチドの比に関する上述の実験（図８に裏付けられる）は、この製剤の最適な比が１：３：４又は１：４：４、特に１：４：４であることを示す。
【0099】
Ｂ１６Ｆ１０以外の細胞株における上述の結果の検討（図９ａ、図９ｂ、及び図９ｃに結果を示す）は、インビボのｍＲＮＡ送達の結果を考慮するとき（図１０を参照）、医薬組成物、ヒト若しくは非ヒト動物に生じる病態の処置若しくは予防の方法、又は薬剤などの、インビボの用途における本発明の使用をサポートする。
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図10】
【配列表】