特許 7333928 電気化学式非標識核酸検出の測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-18

(45)【発行日】2023-08-28

(54)【発明の名称】電気化学式非標識核酸検出の測定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6816 20180101AFI20230821BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230821BHJP

   C12Q 1/6825 20180101ALI20230821BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6816 Z

G01N33/53 M

C12Q1/6825 Z

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2018190002

(22)【出願日】2018-10-05

(65)【公開番号】P2020058244

(43)【公開日】2020-04-16

【審査請求日】2021-09-21

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２５年度よりの、国立研究法人科学技術振興機構の研究成果展開事業 センター・オブ・イノベーション（ＣＯＩ）プログラム ＣＯＩ拠点「フロンテア有機システムイノベーション拠点」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願。

(73)【特許権者】

【識別番号】304036754

【氏名又は名称】国立大学法人山形大学

(74)【代理人】

【識別番号】100101878

【弁理士】

【氏名又は名称】木下 茂

(74)【代理人】

【識別番号】100187506

【弁理士】

【氏名又は名称】澤田 優子

(72)【発明者】

【氏名】古澤 宏幸

(72)【発明者】

【氏名】吉嶺 浩司

(72)【発明者】

【氏名】時任 静士

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】特開２００３－０９０８１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０６－００００９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５１２８１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－０９７１７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２－２２３７５５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

Ｇ０１Ｎ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標識物質を用いない核酸検出法であって、
核酸のリン酸アニオンの静電反発を抑えるため、検出対象となる核酸よりも大きさの小さい有機多価カチオン分子を使用して、前記核酸と塩基配列既知の核酸とで二本鎖核酸を形成し、
前記塩基配列既知の核酸をセンサ表面に末端で固定するとともに、電位差計を用いる核酸検出の測定方法。

【請求項2】

前記塩基配列既知の核酸をセンサ表面から距離１ｎｍ以下に末端で固定する請求項１に記載の核酸検出の測定方法。

【請求項3】

前記核酸が固定されていない部分を水酸基で覆う請求項２に記載の核酸検出の測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電気的化学的に核酸を検出する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸と呼ばれるＤＮＡやＲＮＡは、生体の遺伝情報を含むことから遺伝子診断や細菌叢の同定などに利用されている。また最近では、血清や尿、唾液に存在するＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）が、がん診断の指標として利用できる可能性が示され、ヘルスケア用途での在宅で利用できるセンサとして核酸検出技術の実用化が望まれている。

【0003】

これまで核酸を検出する技術としては検出対象となるターゲット核酸と相互作用する捕捉核酸を溶液中で混合、またはターゲット核酸を捕捉核酸を固定した基板上で作用させ、相互作用した二本鎖核酸に特異的に作用する蛍光標識物質または相互作用に伴って蛍光が変化する予め核酸に標識された蛍光物質を光学装置を用いて検出する方法が用いられてきた。検出感度が優れている一方で大型・高価で精密な光学装置を必要とする点で、在宅利用を想定したセンサとしては不向きであった。

【0004】

また、ターゲット核酸と捕捉核酸が相互作用した二本鎖核酸に特異的に作用する電子メディエーター標識物質を電気化学装置で検出する原理のセンサ開発も報告されているが（特許文献１、２を参照のこと）、電気化学式は装置の小型化に有利である一方、核酸特異的試薬や標識が依然として必要という問題点がある。二本鎖核酸に特異的に作用する蛍光および電子メディエーター試薬や標識物質は発がん性を有する潜在的な危険性を否定できず、取り扱いや廃棄も含めて在宅での利用では安全性の確保が問題となる。

【0005】

非標識で核酸を検出する技術としてインピーダンスを測定（特許文献３、４）やＦＥＴの伝達特性変化を測定（非特許文献１）する方法がある。しかしインピーダンス測定やＦＥＴの伝達特性変化の測定には電流と電圧を同時に制御かつ測定が高精度に可能な大型な装置が必要であり、在宅での利用を想定した小型の装置化は困難である。

【0006】

これまで在宅で利用できる核酸センサが実現しないのは、上記の問題点があったためである。

【0007】

核酸はリン酸基に負電荷イオンを持っており、その負電荷を電気化学的に測定することができれば標識物質を用いることなく核酸の検出が可能である。しかしターゲット核酸をセンサ基板上の捕捉核酸と相互作用させて二本鎖核酸として検出する場合には、核酸のリン酸基の負電荷イオンによる核酸同士の静電反発を抑えて結合させるために一般的には生理食塩水と同程度の１００から２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在下で実施する必要がある。

【0008】

電気化学においてイオン溶液中で電極の溶液界面での電荷密度変化を測定する場合には溶液内のイオンが動いて電場を遮蔽するデバイ遮蔽が生じ、遮蔽が有効となる電極からの距離であるデバイ長は溶液中のイオン強度に依存する。デバイ長は数式１で表される。δがデバイ長、εは比誘電率、ε_０は真空の誘電率、ｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ｑは電荷、Ｉはイオン強度である。

【数1】

【0009】

センサ基板からの距離について、バイオセンサで一般的に生体分子を基板に固定化する方法であるアビジン－ビオチン結合法で、センサ基板１の表面にアビジンタンパク質２を介して捕捉核酸として１０塩基ビオチン化核酸３を固定しターゲット核酸として１０塩基核酸４を作用させた場合のそれぞれの分子の大きさとデバイ長δとのおおよその関係を図１に示す。

【0010】

アビジンタンパク質はおよそ６ｎｍ×３ｎｍの楕円状球体であり二本鎖核酸の１０塩基当たりの長さは３．４ｎｍである。測定にはセンサ基板から６．４ｎｍあるいは９．４ｎｍの範囲内での検出が必要である。それに対して１００から２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中でのデバイ長δは数式１より０．７ｎｍから１ｎｍと算出される。二本の核酸の相互作用はデバイ遮蔽の外側で起こっていて二本鎖形成に伴う核酸のリン酸基の負電荷イオンの増加を電荷密度の増加として検出することはできない。また捕捉核酸として１０塩基核酸５をセンサ基板上に直接固定できたとしても３分の２以上はデバイ遮蔽の外に出るため正しく測定することができない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】特開２０００－１２５８６５号公報

【文献】特許第４０１８６７２号公報

【文献】国際公開第２００３／０２４９５４号

【文献】国際公開第２０１８／０７５０８５号

【非特許文献】

【0012】

【文献】「バイオセンサーの先端科学技術と応用」、２１３－２２６ページ、ＣＭＣ出版

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

上記のように、核酸を検出する方法として二本鎖核酸形成を検出する場合、核酸同士の負電荷による静電反発を緩和するため高濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中で相互作用させる必要があるが、電気化学的には電荷を検出できる電極からの距離、デバイ長が分子サイズ以下に短くなってしまい、核酸本来のリン酸基の負電荷に基づく電荷密度の変化として核酸を検出することができない二律背反の問題が生じる。

【0014】

本発明の目的は、核酸同士の静電反発を抑えて二本鎖核酸を形成させつつ核酸が検出可能なデバイ長を確保できる方法を提供することで、電気化学式において核酸特異的標識試薬を用いることなく汎用的な電位差測定で核酸を検出可能にすることである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明における核酸の二本鎖形成を検出する測定方法は、核酸が本来持つリン酸基の負電荷イオンを使って電荷密度の変化として核酸を標識試薬を用いることなく測定する方法であって、核酸同士の静電反発を抑えるために塩化ナトリウムの代わりに生体由来の有機多価カチオン分子、例えば、スペルミジンを用いたこと、電極からの距離を短くするために捕捉核酸を電極から約１ｎｍの距離で直接固定したことである。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、生体由来の有機多価カチオン分子を用いることで１ｍＭ程度の低濃度の陽電荷イオンであっても多点相互作用により核酸のリン酸アニオンと作用し核酸のリン酸アニオンの静電反発を抑制し、かつ、溶液中のイオン強度を低下させてデバイ長を分子サイズと同程度にまで確保したことと合わせて捕捉核酸を電極から約１ｎＭの距離で直接固定したことで、ターゲット核酸の結合を標識試薬を用いずに核酸本来の負電荷イオンに基づく電極上の電荷密度変化として汎用的な電位差計で経時的に測定できるようになった。

【0017】

また用いる試薬の安全性が高いため、研究・開発の現場だけでなく、病院や一般家庭での日常診断用の核酸センサ用途として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】アビジン－ビオチン結合法を使ってＤＮＡを電極に固定しそれに相互作用するＤＮＡの結合を観察する際の各分子の大きさとデバイ長δの関係を示す図。

【図2】本発明の実施の形態のＤＮＡセンサの表面設計を示す模式図。

【図3】本発明の測定方法で使用した実験装置の接続を示す図。

【図4】本発明の測定方法によるＤＮＡの検出および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡの検出をそれぞれ実施した際に観察された結果を比較した図。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の実施の形態について説明する。
図２は、電極６上に捕捉核酸として任意の配列をもつ１０塩基ＤＮＡ７を固定した核酸センサの表面設計を示す模式図である。電極の表面素材には金を使用する。ＤＮＡ７は５’末端にアミノ基をもつものを用いてＤＮＡ７をアミド結合を介して炭素鎖長２の末端にカルボキシル基を持つアルキルチオール８で金電極６の表面に固定する。金とアルキルチオールは金－チオール吸着で固定される。アルキルチオールと捕捉ＤＮＡのアミド結合は水溶性の縮合剤を用いたアミンカップリング反応により生成させた。ＤＮＡ７が固定されていない金電極の隙間は炭素鎖長２の末端に水酸基を持つアルキルチオール９を固定する。電極表面からＤＮＡの末端までの距離はおよそ４．４ｎｍほどである。

【0020】

図３に電気化学測定を行うための実験装置の模式図を示す。汎用的な電位差計１０に捕捉ＤＮＡを固定したセンサ電極１１およびガラス参照電極１２を接続する。水溶液を満たしたビーカー１３にセンサ電極１１およびガラス参照電極１２を浸し水溶液は撹拌子１４で撹拌する。水溶液としてターゲットＤＮＡの検出実験では塩化ナトリウムの代わりに有機多価カチオン分子としてスペルミジン２００μＭを含む溶液中において実施する。

【0021】

捕捉ＤＮＡと配列が相補的なターゲットＤＮＡまたは１塩基のみ相補的でないミスマッチＤＮＡとの相互作用による電荷密度の変化をそれぞれ参照電極との電位差変化として電位差計で測定する。それぞれの測定結果の比較において核酸中の１塩基のミスマッチに起因する結合挙動の差異から配列の違いを検出する。

【0022】

［実施例１］
以下、本発明の測定法を用いた非標識核酸検出の方法の実施例を示す。
核酸には以下の配列の１０塩基のＤＮＡ（ユーロフィンジェノミクス社製）を使用した。
捕捉ＤＮＡ ＮＨ_２－５’－ＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡ－３’
ターゲットＤＮＡ ３’－ＴＣＧＡＡＣＣＣＴＴ－５’
ミスマッチＤＮＡ ３’－ＴＣＧＡＣＣＣＣＴＴ－５’

【0023】

金電極の表面の洗浄のためにＰｉｒａｎｈａ溶液（硫酸：過酸化水素水＝３：１）を滴下して５分間放置した後に超純水で洗い流した。さらにこの操作を２回繰り返した。４ｍＭの３，３’－Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄと４０ｍＭのＢｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｄｉｓｕｌｆｉｄｅを含む混合水溶液を調製し、混合水溶液を洗浄した金電極に滴下して３０分間室温で放置した。その後、金電極を超純水で洗浄した。０．５２Ｍの（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液と０．８７ＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド水溶液を等量混合し、混合溶液を金表面に滴下し３０分間室温で放置した。反応後、超純水で洗浄した。１μＭの捕捉ＤＮＡを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）緩衝液を滴下し６０分間のアミンカップリング反応を行った。その反応溶液に反応後５ｍＭのエタノールアミンを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）緩衝液を等量添加し１０分間放置した。超純水でセンサ表面を洗浄後、参照電極（ＢＡＳ社製、ＲＥ－１Ｂ）とともに電位差計（Ａｇｉｌｅｎｔ社製３４４０５Ａ）にセットした。ビーカーには２００μＭのスペルミジンを含む水溶液を５ｍＬ入れた。水溶液の温度を２０℃に調節して、終濃度（ｆ．ｃ．）が５０ｎＭになるようにターゲットＤＮＡを測定ビーカーへ添加した。測定後、金電極を超純水で洗浄し、再びビーカー１３に２００μＭのスペルミジンを含む水溶液に入れ換えて、ミスマッチＤＮＡを添加した。

【0024】

測定結果を図４に示す。
ターゲットＤＮＡを添加した場合には結合に伴う負電荷密度の増加による電極電位の減少１５が観察された。一方、ミスマッチＤＮＡの添加では電極電位が変化しない様子１６が観察された。従って検出対象である核酸を標識物質を用いることなく汎用的な電位差測定装置で経時的に捕捉ＤＮＡに結合する様子を測定でき、一塩基のみ配列が異なる核酸を識別できる核酸センサとなることが示された。
以上、説明した電気化学的に非標識で核酸を検出することのできる核酸センサは、潜在的に発がん性を有する危険な標識物質を用いることなく汎用的な安価でシンプルな電位差系で核酸の一塩基ミスマッチの違いを検出できることから、安全、小型で安価な核酸センサが実現でき、専用の施設での利用に限らず在宅でのヘルスケア用途向けの核酸センサの手法として用いることができる。

【符号の説明】

【0025】

１ センサ基板
２ アビジンタンパク質
３ 捕捉用１０塩基ビオチン化核酸
４ ターゲット１０塩基核酸
５ 捕捉用１０塩基核酸
６ 金電極
７ １０塩基核酸
８ アミンカップリングでＤＮＡと結合した炭素鎖長２のアルキルチオール
９ 末端が水酸基の炭素鎖長２のアルキルチオール
１０ 電位差計
１１ センサ電極
１２ ガラス参照電極
１３ ビーカー
１４ 撹拌子
１５ 捕捉用ＤＮＡへのターゲットＤＮＡ添加による電位差応答
１６ 捕捉用ＤＮＡへの一塩基ミスマッチＤＮＡ添加による電位差応答

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】