特許 7334122 妊娠高血圧腎症に特異的な循環ＲＮＡシグネチャー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-18

(45)【発行日】2023-08-28

(54)【発明の名称】妊娠高血圧腎症に特異的な循環ＲＮＡシグネチャー

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6883 20180101AFI20230821BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20230821BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20230821BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230821BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6883 Z

C12Q1/6837 Z

C12Q1/6851 Z

C12Q1/686 Z

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019566953

(86)(22)【出願日】2019-05-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-27

(86)【国際出願番号】 US2019033964

(87)【国際公開番号】W WO2019227015

(87)【国際公開日】2019-11-28

【審査請求日】2019-12-24

(31)【優先権主張番号】62/676,436

(32)【優先日】2018-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/848,219

(32)【優先日】2019-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500358711

【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】サラ・イー・シュルツァベルガー

(72)【発明者】

【氏名】フィオナ・ケイパー

(72)【発明者】

【氏名】サラ・キニングス

(72)【発明者】

【氏名】スザンヌ・ローバック

(72)【発明者】

【氏名】カルロ・ランディーズ－ヒンチリフ

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５２４９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５１５５１７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

妊婦の妊娠高血圧腎症を検出し、及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を決定する方法であって、
前記妊婦から採取された生体試料中で、複数の循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）分子を同定する工程を含み；
ここで、複数のＣ－ＲＮＡ分子が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７０個以上、又は７５個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７５個以上、いずれか１００個以上、又はいずれか１２２個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｉ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、及びＮＥＳのうちのいずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、または８つ全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子
から選択され、
前記複数のＣ－ＲＮＡ分子が、前記妊婦の妊娠高血圧腎症及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を示す、方法。

【請求項2】

妊婦の妊娠高血圧腎症を検出し、及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を決定する方法であって、
前記妊婦から得られた生体試料から循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）分子の集団を精製する工程と；
Ｃ－ＲＮＡ分子の前記精製された集団内の前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程を含み；
ここで、前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされる前記タンパク質コード配列が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７０個以上、又は７５個全て；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全て；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７５個以上、いずれか１００個以上、又はいずれか１２２個全て；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全て；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全て；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全て；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全て；又は
（ｉ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、及びＮＥＳのうちのいずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、または８つ全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子
から選択されるタンパク質をコードし、
前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列が、前記妊婦の妊娠高血圧腎症及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を示す、方法。

【請求項3】

前記生体試料内のＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程が、ハイブリダイゼーション、逆転写ＰＣＲ、マイクロアレイチップ分析、又はシーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記生体試料内の前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程が、シーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

シーケンシングが、クローン増幅された分子の超並列シーケンシングを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

シーケンシングが、ＲＮＡシーケンシングを含む、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する前に、
前記生体試料から無傷の細胞を除去する工程；
前記生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程；
前記生体試料中のＣ－ＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程；及び／又は
エクソームエンリッチメントによって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列について前記ｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程
をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

妊婦の妊娠高血圧腎症を検出し、及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を決定する方法であって、
前記妊婦から得られた生体試料から無傷の細胞を除去する工程と；
前記生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程と；
前記生体試料中のＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程と；
タンパク質をコードするＤＮＡ配列について前記ｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程（エクソームエンリッチメント）と；
前記得られたエンリッチされたｃＤＮＡ配列をシーケンシングする工程と；
エンリッチされたＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程と
を含み；
前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７０個以上、又は７５個全て；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全て；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７５個以上、いずれか１００個以上、又はいずれか１２２個全て；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全て；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全て；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全て；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全て；又は
（ｉ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、及びＮＥＳのうちのいずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、または８つ全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子
から選択されるタンパク質をコードし、
前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列が、前記妊婦の妊娠高血圧腎症及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を示す、方法。

【請求項9】

妊婦から得られた生体試料から無傷の細胞を除去する工程と；
前記生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程と；
前記生体試料中のＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程と；
タンパク質をコードするＤＮＡ配列について前記ｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程（エクソームエンリッチメント）と；
前記得られたエンリッチされたｃＤＮＡ配列をシーケンシングする工程と；
前記エンリッチされたＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程と
を含む方法であって；
ここで、前記Ｃ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７０個以上、又は７５個全て；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全て；
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７５個以上、いずれか１００個以上、又はいずれか１２２個全て；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全て；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全て；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全て；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全て；又は
（ｉ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、及びＮＥＳのうちのいずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、または８つ全てから選択されるタンパク質をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子
から選択されるタンパク質を含む、方法。

【請求項10】

前記生体試料が血漿を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記生体試料が、妊娠１６週未満又は妊娠２０週未満の妊婦から採取される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記生体試料が、妊娠２０週を超える妊婦から採取される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

試料が血液試料であり、前記血液試料は、前記血液試料を血漿へと処理する前に、細胞及びＤＮＡ安定化特性を有する管中に、採取され、輸送され、及び／又は貯蔵されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記管が、Ｓｔｒｅｃｋ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ（登録商標）採血管を含む、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

継続出願データ
本出願は、２０１８年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６７６，４３６号、及び２０１９年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８４８，２１９号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、一般に、妊娠合併症である妊娠高血圧腎症の検出及び早期のリスク評価に使用するための方法及び材料に関する。

【背景技術】

【0003】

妊娠高血圧腎症は、妊娠中のみに発生する疾患であり、全妊娠のうち５％～８％に発症する。妊娠高血圧腎症は、母体死亡の１０％～１５％及び胎児死亡の４０％の直接の原因である。妊娠高血圧腎症の３つの主な症状としては、高血圧、手足の浮腫み、及び尿中の過剰なタンパク質（タンパク尿）が挙げられ、これらは、妊娠２０週以降に発生する。妊娠高血圧腎症の他の兆候及び症状としては、激しい頭痛、視力変化（一時的な視力低下、目のかすみ又は光に対する過敏症を含む）、吐き気又は嘔吐、尿量の減少、血小板値の減少（血小板減少症）、肝機能障害、及び肺内部の液体に起因する息切れが挙げられる。

【0004】

妊娠高血圧腎症が重症であるほど、及びそれが妊娠中の早期に発生するほど、母体及び赤ん坊のリスクが高くなる。妊娠高血圧腎症は、誘発分娩又は帝王切開による分娩を必要とし得る。治療せずに放置すると、妊娠高血圧腎症は、母体及び赤ん坊の両方に、深刻な、命にさえ関わる合併症を引き起こし得る。妊娠高血圧腎症の合併症としては、胎児発育不全、低い出生時体重、早産、胎盤早期剥離、ＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝酵素の上昇、及び低血小板数症候群）、子癇（発作を引き起こす、妊娠高血圧腎症の重症型）、臓器障害（腎臓、肝臓、肺、心臓、又は眼の障害を含む）、脳卒中又は他の脳損傷が挙げられる。例えば、ｍａｙｏｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇ／ｄｉｓｅａｓｅｓ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ／ｓｙｍｐｔｏｍｓ－ｃａｕｓｅｓ／ｓｙｃ－２０３５５７４５においてインターネット上で入手可能な（非特許文献１）を参照されたい。

【0005】

早期の検出及び治療により、大部分の女性は、妊娠高血圧腎症が早期に検出され、定期的な妊婦検診で処置される場合、健常児を産むことができる。様々なタンパク質バイオマーカーが、発症前の段階で、母体血清中で変化したレベルを示すが、これらのバイオマーカーには、個々の患者において区別して予測する能力はない（非特許文献２）。したがって、妊娠高血圧腎症の早期検出のためのバイオマーカーの同定は、妊娠高血圧腎症の早期の診断及び治療にとって重要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】“Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ－Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｃａｕｓｅｓ－Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ，”Ａｐｒｉｌ ３，２０１８

【文献】Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ ａｎｄ Ｇｒａｎｇｅｒ，２０１６，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；６７（２）：２３８－２４２

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、妊婦の妊娠高血圧腎症を検出し、及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を決定する方法であって、
妊婦から採取された生体試料中で、複数の循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）分子を同定する工程を含み；
ここで、複数のＣ－ＲＮＡ分子が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、最大で７５個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、最大で１２２個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て（いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＶＳＩＧ４の７つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の１０個；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、及びＳＫＩＬの６つ；又はＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＳＫＩＬの８つを含む）から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全てから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子
から選択され、
妊婦の妊娠高血圧腎症及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を示す、方法を含む。

【0008】

本発明は、妊婦の妊娠高血圧腎症を検出し、及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を決定する方法であって、
妊婦から生体試料を採取する工程と；
生体試料から循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）分子の集団を精製する工程と；
Ｃ－ＲＮＡ分子の精製された集団内のＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程を含み；
タンパク質の少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７０個以上、又は７５個全て；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全て；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７５個以上、いずれか１００個以上、又はいずれか１２２個全て；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全て；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全て；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全て；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て（いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＶＳＩＧ４の７つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の１０個；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、及びＳＫＩＬの６つ；又はＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＳＫＩＬの８つを含む）；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全て
から選択され、
妊婦の妊娠高血圧腎症及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を示す、方法を含む。

【0009】

いくつかの態様において、生体試料内のＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程は、ハイブリダイゼーション、逆転写ＰＣＲ、マイクロアレイチップ分析、又はシーケンシングを含む。

【0010】

いくつかの態様において、生体試料内のＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程は、例えば、クローン増幅された分子の超並列シーケンシング及び／又はＲＮＡシーケンシングを含むシーケンシングを含む。

【0011】

いくつかの態様において、本方法は、循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する前に、生体試料から無傷の細胞を除去する工程；生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程；生体試料中のＣ－ＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程；及び／又はエクソームエンリッチメントによって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列についてｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程をさらに含む。

【0012】

本発明は、妊婦の妊娠高血圧腎症を検出し、及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を決定する方法であって、
妊婦から生体試料を採取する工程と；
生体試料から無傷の細胞を除去する工程と；
生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程と；
生体試料中のＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程と；
タンパク質をコードするＤＮＡ配列についてｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程（エクソームエンリッチメント）と；
得られたエンリッチされたｃＤＮＡ配列をシーケンシングする工程と；
エンリッチされたＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程と
を含み；
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、最大で７５個全て；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全て；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、最大で１２２個全て；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全て；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全て；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全て；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て（いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＶＳＩＧ４の７つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の１０個；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、及びＳＫＩＬの６つ；又はＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＳＫＩＬの８つを含む）；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全て
から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列が、妊婦の妊娠高血圧腎症及び／又は妊娠高血圧腎症のリスクの増加を示す、方法を含む。

【0013】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加に関連する循環ＲＮＡシグネチャーを同定する方法であって、妊婦から生体試料を採取する工程と；生体試料から無傷の細胞を除去する工程と；生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程と；生体試料中のＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程と；タンパク質をコードするＤＮＡ配列についてｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程（エクソームエンリッチメント）と；得られたエンリッチされたｃＤＮＡ配列をシーケンシングする工程と；エンリッチされたＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程とを含む、方法を含む。

【0014】

本発明は、
妊婦から生体試料を採取する工程と；
生体試料から無傷の細胞を除去する工程と；
生体試料を、デオキシヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を除去する工程と；
生体試料中のＲＮＡ分子から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する工程と；
タンパク質をコードするＤＮＡ配列についてｃＤＮＡ配列をエンリッチする工程（エクソームエンリッチメント）と；
得られたエンリッチされたｃＤＮＡ配列をシーケンシングする工程と；
エンリッチされたＣ－ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質コード配列を同定する工程と
を含む方法であって；
ここで、タンパク質コード配列が、
（ａ）ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個、最大で７５個全て；又は
（ｂ）ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全て；又は
（ｃ）ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、最大で１２２個全て；又は
（ｄ）ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全て；又は
（ｅ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全て；又は
（ｆ）ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全て；又は
（ｇ）ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て（いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＶＳＩＧ４の７つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の１０個；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、及びＳＫＩＬの６つ；又はＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＳＫＩＬの８つを含む）；又は
（ｈ）ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全て
から選択されるタンパク質の少なくとも一部を含む、方法を含む。

【0015】

いくつかの態様において、生体試料は血漿を含む。

【0016】

いくつかの態様において、生体試料は、妊娠１６週未満又は妊娠２０週未満の妊婦から採取される。

【0017】

いくつかの態様において、生体試料は、妊娠２０週を超える妊婦から採取される。

【0018】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか５０個以上、いずれか７０個以上、最大で７５個全ての少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0019】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、又は２７個全ての少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0020】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、複数のＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５の少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0021】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、いずれか２６個以上、いずれか２７個以上、いずれか２８個以上、いずれか２９個以上、又は３０個全ての少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0022】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、いずれか２４個以上、いずれか２５個以上、又は２６個全ての少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0023】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、又は２２個全ての少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0024】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳのうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、又は１１個全て（いくつかの実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＶＳＩＧ４の７つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の８つ；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４の１０個；ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、及びＳＫＩＬの６つ；又はＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＳＫＩＬの８つを含む）の少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0025】

本発明は、妊娠高血圧腎症のリスクの増加についての循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）シグネチャーであって、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１のうちのいずれか１つ以上、いずれか２つ以上、いずれか３つ以上、いずれか４つ以上、いずれか５つ以上、いずれか６つ以上、いずれか７つ以上、いずれか８つ以上、いずれか９つ以上、いずれか１０個以上、いずれか１１個以上、いずれか１２個以上、いずれか１３個以上、いずれか１４個以上、いずれか１５個以上、いずれか１６個以上、いずれか１７個以上、いずれか１８個以上、いずれか１９個以上、いずれか２０個以上、いずれか２１個以上、いずれか２２個以上、いずれか２３個以上、又は２４個全ての少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡシグネチャーを含む。

【0026】

本発明は、本明細書に記載されるＣ－ＲＮＡシグネチャーに結合し、及び／又はそれを同定することが可能な複数の薬剤を含む固体担体アレイを含む。

【0027】

本発明は、本明細書に記載されるＣ－ＲＮＡシグネチャーに結合し、及び／又はそれを同定することが可能な複数のプローブを含むキットを含む。

【0028】

本発明は、本明細書に記載されるＣ－ＲＮＡシグネチャーを選択的に増幅するための複数のプライマーを含むキットを含む。

【0029】

本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、当技術分野におけるその使用と一致することが意図され、天然に存在する核酸又はその機能的類似体を含む。特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができ、又は特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体構造は、当技術分野で既知の種々の任意のものを含む、代替の骨格結合を有し得る。天然に存在する核酸は、一般に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中に見出される）又はリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）中に見出される）を有する。核酸は、当技術分野で既知のこれらの糖部分の様々な類似体のいずれかを含むことができる。核酸は、天然又は非天然塩基を含むことができる。この点に関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野で既知である。用語「鋳型」及び「標的」は、核酸に関して使用される場合、本明細書に記載される方法又は組成物の文脈における核酸の意味識別子として意図され、さもなければ明示的に示されるものを超えて核酸の構造又は機能を必ずしも限定しない。

【0030】

本明細書で使用される場合、「増幅する」、「増幅」又は「増幅反応」及びそれらの派生語は、一般に、核酸分子の少なくとも一部が、少なくとも１つの追加の核酸分子に複製又はコピーされる、任意の作用又はプロセスを指す。追加の核酸分子は、場合により、標的核酸分子の少なくともいくつかの部分と実質的に同一又は実質的に相補的である配列を含む。標的核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得、追加の核酸分子は、独立して、一本鎖又は二本鎖であり得る。増幅は、場合により、核酸分子の線形又は指数関数的複製を含む。いくつかの実施形態では、そのような増幅は、等温条件を使用して行うことができ、別の実施形態では、そのような増幅は、熱サイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、増幅は、単一の増幅反応における複数の標的配列の同時増幅を含む多重増幅である。いくつかの実施形態では、「増幅」は、ＤＮＡ及びＲＮＡベースの核酸の少なくともいくつかの部分の単独又は組み合わせでの増幅を含む。増幅反応は、当業者に既知の増幅プロセスのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。

【0031】

本明細書で使用される場合、「増幅条件」及びその派生語は、一般に、１つ以上の核酸配列を増幅するために適切な条件を指す。このような増幅は、線形又は指数関数的であり得る。いくつかの実施形態では、増幅条件は等温条件を含むことができ、或いは、熱サイクル条件、又は等温条件と熱サイクル条件の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列を増幅するために適切な条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を含む。典型的には、増幅条件は、１つ以上の標的配列のような核酸を増幅するのに、又は１つ以上のアダプター、例えばアダプター連結増幅標的配列に連結された増幅標的配列を増幅するのに十分な反応混合物を指す。一般に、増幅条件は、増幅又は核酸合成のための触媒、例えば、ポリメラーゼ；増幅される核酸に対してある程度の相補性を有するプライマー；及び核酸にハイブリダイズした後にプライマーの伸長を促進するためのヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。増幅条件は、核酸へのプライマーのハイブリダイゼーション又はアニーリング、プライマーの伸長、及び伸長されたプライマーが増幅を受ける核酸配列から分離される変性工程を必要とし得る。典型的には、増幅条件は熱サイクルを含むことができるが、必ずしもその必要はなく、いくつかの実施形態では、増幅条件はアニーリング、伸長、及び分離の工程が繰り返される複数のサイクルを含む。典型的には、増幅状態は、Ｍｇ^＋＋又はＭｎ^＋＋などのカチオンを含み、イオン強度の様々な調整剤を含むこともできる。

【0032】

本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書の方法を指し、これらは、クローニング又は精製なしにゲノムＤＮＡの混合物中の目的のポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する。目的のポリヌクレオチドを増幅するためのこのプロセスは、目的の所望のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ混合物に大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で一連の熱サイクルを行うことからなる。２つのプライマーは、目的の二本鎖ポリヌクレオチドの各々の鎖に相補的である。混合物は、最初に、より高い温度で変性され、次いでプライマーが、目的のポリヌクレオチド分子内の相補的配列にアニーリングされる。アニーリング後、プライマーをポリメラーゼで伸長させて、相補鎖の新しい対を形成する。変性、プライマーアニーリング及びポリメラーゼ伸長の工程は、目的の所望のポリヌクレオチドの増幅セグメントの高濃度を得るために、何度も繰り返され得る（サーモサイクリングと呼ばれる）。目的の所望のポリヌクレオチドの増幅セグメント（アンプリコン）の長さは、互いに対するプライマーの相対位置によって決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメータである。このプロセスを繰り返すことにより、本方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」）と呼ばれる。目的のポリヌクレオチドの所望の増幅セグメントは、混合物中の（濃度に関して）優勢な核酸配列になるので、それらは、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。上記の方法に対する改変において、標的核酸分子は、複数の異なるプライマー対、場合によっては、目的の標的核酸分子あたり１つ以上のプライマー対を使用してＰＣＲ増幅され得、それによって、多重ＰＣＲ反応を形成する。

【0033】

本明細書で使用される場合、用語「プライマー」及びその派生語は、一般に、目的の標的配列にハイブリダイズし得る任意のポリヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは、ヌクレオチドがポリメラーゼによって重合され得る基質として機能するが、いくつかの実施形態では、プライマーは、合成された核酸鎖に組み込まれ、別のプライマーがハイブリダイズして合成核酸分子に相補的である新しい鎖をプライム合成し得る部位を提供し得る。プライマーは、ヌクレオチド又はその類似体の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、一本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。この用語は、等価物として、ＤＮＡ、又はヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡのいずれかの類似体を含み、一本鎖（例えば、センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドに適用可能であると理解されるべきである。本明細書で使用される用語はまた、例えば逆転写酵素の作用によってＲＮＡ鋳型から産生される相補的又はコピーＤＮＡであるｃＤＮＡを包含する。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、三本鎖、二本鎖及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、並びに三本鎖、二本鎖及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。

【0034】

本明細書で使用される場合、用語「ライブラリー」及び「配列決定ライブラリー」は、それらの５’末端で共通の配列及びそれらの３’末端で共通の配列を共有する、コレクション又は複数の鋳型分子を指す。３’及び５’末端に既知の共通配列を含む鋳型分子のコレクションは、３’及び５’修飾ライブラリーとも呼ばれる。

【0035】

本明細書で使用される「フローセル」という用語は、そこを横切って１つ以上の流体試薬を流すことができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用され得るフローセル並びに関連する流体システム及び検出プラットフォームの例は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号パンフレット；米国特許第７，０５７，０２６号パンフレット；国際公開第９１／０６６７８号パンフレット；国際公開第０７／１２３７４４号パンフレット；米国特許第７，３２９，４９２号明細書；米国特許第７，２１１，４１４号明細書；米国特許第７，３１５，０１９号明細書；米国特許第７，４０５，２８１号明細書；及び米国特許出願公開第２００８／０１０８２号明細書に記載されている。

【0036】

本明細書で使用される「アンプリコン」という用語は、核酸に関して使用される場合、核酸をコピーする生成物を意味し、この生成物は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同じか又は相補的であるヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、例えば、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、連結伸長、又は連結連鎖反応を含む、核酸又はそのアンプリコンを鋳型として使用する種々の増幅方法のいずれかによって産生され得る。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列の単一コピー（例えば、ＰＣＲ産物）又はヌクレオチド配列の複数コピー（例えば、ＲＣＡのコンカテマー生成物）を有する核酸分子であり得る。標的核酸の第１のアンプリコンは、典型的には、相補的コピーである。後続のアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成後に、標的核酸から、又は第１のアンプリコンから作製されるコピーである。後続のアンプリコンは、標的核酸に実質的に相補的であるか、又は標的核酸に実質的に同一である配列を有することができる。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「アレイ」は、相対的位置に従って互いに区別され得る部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイ内の部位の位置に従って互いに区別することができる。アレイの個々の部位は、特定の型の１つ以上の分子を含み得る。例えば、部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含み得るか、又は部位は、同じ配列（及び／又はその相補的配列）を有するいくつかの核酸分子を含み得る。アレイの部位は、同じ基質上に配置された異なるフィーチャとすることができる。例示的なフィーチャとしては、基質内のウェル、基質内若しくは基質上のビーズ（又は他の粒子）、基質からの突起、基質上のリッジ、又は基質内のチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。アレイの部位は、各々が異なる分子を有する別個の基質であり得る。別個の基質に付着した異なる分子は、基質が関連した表面上の基質の位置に従って、又は液体若しくはゲル中の基質の位置に従って同定することができる。別個の基質が表面上に位置する例示的なアレイには、ウェル中にビーズを有するものが含まれるが、これに限定されない。

【0038】

本明細書における「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローン増幅された分子及び単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にするシーケンシング方法を指す。ＮＧＳの非限定的な例としては、リバーシブルダイターミネーター（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を用いた合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、及びライゲーションによるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）が挙げられる。

【0039】

本明細書で使用される「感度」という用語は、真陽性の数を真陽性及び偽陰性の合計で除算した値に等しい。

【0040】

本明細書で使用される「特異度」という用語は、真陰性の数を真陰性及び偽陽性の合計で除算した値に等しい。

【0041】

本明細書における「エンリッチする」という用語は、試料の一部に含まれる核酸を増幅する方法を指す。エンリッチメントとしては、特定の配列、例えば多型配列を標的にする特異的エンリッチメント、及び試料のＤＮＡ断片の全ゲノムを増幅する非特異的エンリッチメントが挙げられる。

【0042】

本明細書で使用される場合、用語「各々」は、項目の集合体に関連して使用される場合、集合体内の個々の項目を識別することを意図するが、文脈が別段に明確に指示しない限り、必ずしも集合体内の全ての項目を指すわけではない。

【0043】

本明細書で使用される場合、組成物、物品、核酸、又は核の文脈における「提供する」は、組成物、物品、核酸、若しくは核を作製すること、組成物、物品、核酸、若しくは核を購入すること、又はそれ以外で化合物、組成物、物品、物品、若しくは核を得ることを意味する。

【0044】

「及び／又は」という用語は、列挙された要素のうちの１つ若しくは全て、又は列挙された要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

【0045】

「好ましい」及び「好ましくは」という単語は、特定の状況下で、特定の利益を与え得る本開示の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は別の状況下で、別の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、別の実施形態が有用ではないことを示唆しておらず、別の実施形態を本開示の範囲から除外することを意図していない。

【0046】

用語「含む」及びその変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有さない。

【0047】

「含む」又は「含んでいる」などの言葉で本明細書に記載される実施形態は、どこでも、「からなる」及び／又は「本質的にからなる」という用語で記載される他の点で類似の実施形態も提供されることが理解される。

【0048】

別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１つ又は複数を意味する。

【0049】

また、本明細書において、終点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

【0050】

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、又は「いくつかの実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構成、組成、又は特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な箇所におけるこのような語句の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特徴、構成、組成、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。

【0051】

別個の工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、工程は、任意の実現可能な順序で行ってもよい。また、必要に応じて、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に行ってもよい。

【0052】

本開示の上記の発明の概要は、本開示の開示された各実施形態又は全ての実施を説明することを意図したものではない。以下の記載は、具体的な実施形態をより詳細に例示するものである。本出願全体のいくつかの場所において、例のリストによりガイダンスが提供され、これらの例は、様々な組み合わせで使用され得る。各場合において、列挙されたリストは、単に代表的なグループとしての役割を果たし、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】胎盤の健康、母体応答、及び胎児応答の関係の概略図。

【図2】循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）の起源。

【図3】Ｃ－ＲＮＡのためのライブラリー作製ワークフロー。

【図4】妊娠後期の妊娠試料及び非妊娠試料を比較するＣ－ＲＮＡ手法の検証。

【図5】縦断的な（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）妊娠試料を用いたＣ－ＲＮＡ手法の検証。

【図6】臨床試験の説明。

【図7】シーケンシングデータ特性。

【図8】全データセットに依存して、遺伝子の選択を伴わないＰＥの分類。

【図9】ブートストラップ法の説明。

【図10】ブートストラップ法を用いた妊娠高血圧腎症試料の分類。

【図11】過剰な妊娠高血圧腎症遺伝子の調査。

【図12】標準的なＡｄａｂｏｏｓｔモデル。

【図13】独立したコホートが、妊娠高血圧腎症シグネチャーのさらなる検証を可能にする。

【図14】妊娠高血圧腎症の分類における標準的なａｄａｂｏｏｓｔモデルの性能。

【図15】標準的なＤＥＸ ＴＲＥＡＴ分析を用いた妊娠高血圧腎症の分類。

【図16】遺伝子の選択、及びジャックナイフ法を用いた妊娠高血圧腎症の分類。

【図17】独立したＰＥＡＲＬバイオバンクコホートにおけるＴＲＥＡＴ、ブートストラップ法、及びジャックナイフ法の検証。

【図18】ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄモデルを構築するためのバイオインフォマティクス手法の略図。

【図19】ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄモデルによって用いられる遺伝子の相対存在量及び独立したデータセットにおけるそれらの予測能力。

【図20】標準的なＴＲＥＡＴ分析及びジャックナイフ法を用いてＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘで生成したライブラリーにおける、妊娠高血圧腎症に特異的なＣ－ＲＮＡシグネチャーの同定。

【図21】Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘで生成したライブラリーにおいてＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄモデルによって用いられる遺伝子の相対存在量及びＲＧＨ１４データセットにおけるそれらの予測能力。

【図22A-22D】臨床にやさしい（ｃｌｉｎｉｃ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ）全エクソームＣ－ＲＮＡ分析方法の検証。図２２Ａは、シーケンシングライブラリー作製方法の概略図であり；採血後の全ての工程が、集中型の処理実験室において行われ得る。転写産物の経時変化が、妊娠期間を通じて改変された（図２２Ｂ）。Ｃ－ＲＮＡ妊娠進行試験において同定される遺伝子の重複（図２２Ｃ）。妊娠期間試験に特有の９１の遺伝子を発現する組織（図２２Ｄ）。

【図23A-23C】ＰＥ臨床試験のための試料採取。パネルは、ｉＰＣ試験（図２３Ａ）及びＰＥＡＲＬ試験（図２３Ｂ）における各個体についての採血の時間（三角形）及び出生時の妊娠期間（四角形）を示す。赤色の線は、正期産の閾値を示す。早産率は、早発型ＰＥコホートにおいて有意に高い（図２３Ｃ）。フィッシャーの正確確率検定による^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図24A-24G】Ｃ－ＲＮＡの差分解析により、妊娠高血圧腎症バイオマーカーが同定される。転写産物の倍率変化及び存在量が、ＰＥにおいて改変された（図２４Ａ）。片側信頼ｐ値区間を、標準的な分析方法によって検出された各遺伝子についてジャックナイフ法の後に計算した（図２４Ｂ）。（２１）遺伝子について全エクソームシーケンシング及びｑＰＣＲによって決定された転写産物存在量倍率変化（図２４Ｃ）。スチューデントＴ検定による^＊ｐ＜０．０５。疾患遺伝子の組織分布（図２４Ｄ）。ｉＰＣ試料（平均連結、平方ユークリッド距離）の階層的クラスタリング（図２４Ｅ）。ＰＥＡＲＬ試験からの早発型ＰＥ（図２４Ｆ）及び遅発型ＰＥ（図２４Ｇ）試料のクラスタリング。

【図25A-25E】ＡｄａＢｏｏｓｔは、コホートにわたる妊娠高血圧腎症試料を分類する。各コホートにおける機械学習によって使用される転写産物の相対存在量を示すヒートマップ（図２５Ａ）。各ブロックの高さは、各遺伝子の重要度を反映している。各データセットについてのＲＯＣ曲線（図２５Ｂ）。ＡｄａＢｏｏｓｔスコアの分布（ＫＤＥ）。オレンジ色の線は、ＰＥ及び対照試料を区別するための最適境界を示す（図２５Ｃ）。差分解析によって同定される遺伝子と、ＡｄａＢｏｏｓｔにおいて使用されるものとの一致（図２５Ｄ）。ＡｄａＢｏｏｓｔ遺伝子の組織分布（図２５Ｅ）。

【図26A-26C】血液が異なる採血管中に貯蔵される場合のＣ－ＲＮＡデータ完全性。異なる管タイプにおいて一晩貯蔵された血液からの予め検出されたＣ－ＲＮＡ妊娠マーカーの存在量を、ＥＤＴＡ管への採取後の即座の処理と比較する（図２６Ａ）。異なる血液貯蔵期間後に同じ個体から調製されたＣ－ＲＮＡについての転写産物ＦＰＫＭ値を比較する散布図（図２６Ｂ）。ピアソンの相関係数Ｒは、ＥＤＴＡ管を用いた場合により可変である（ｃｆ、セルフリー）（図２６Ｃ）。

【図27A-27B】Ｃ－ＲＮＡデータ品質に対する血漿体積の影響。プロトコルのための適切な血漿インプットを決定するために、９つの独立した試験からのデータを用いて、メタ分析を行った。ノイズ（生物学的変動係数、ＥｄｇｅＲ）を、各試験内の生物学的複製から計算した（図２７Ａ）。ライブラリー複雑性（境界集団、Ｐｒｅｓｅｑ）を、各試料について計算した（図２７Ｂ）。試験を阻止変数として用いた、テューキーのＨＳＤ補正を用いたＡＮＯＶＡによる^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図28A-28C】妊娠マーカー組織特異度。改変された遺伝子一式（図２８Ａ）、各試験に特有の転写産物（図２８Ｂ）、又は交差遺伝子セット（図２８Ｃ）のいずれかを用いた、３つの独立した試験によって妊娠中に検出される遺伝子の組織特異度を示す円グラフ。

【図29A-29E】ジャックナイフ法は、妊娠高血圧腎症において広く改変されていない遺伝子を除外する。いかに一貫して転写産物がＰＥ試料にわたって改変されたかを決定するのに使用されるジャックナイフ法の概略図（図２９Ａ）。各差次的に豊富な遺伝子についての平均存在量及びノイズ（図２９Ｂ）。影響された各転写産物の曲線下のＲＯＣ面積値は、いかに分離したＣ－ＲＮＡ転写産物存在量分布が対照及びＰＥ試料について存在するかの指標を示す（図２９Ｃ）。マン・ホイットニーのＵ検定による^＊ｐ＜０．０５。ジャックナイフ法の後に除外された遺伝子を用いたｉＰＣ試料の階層的クラスタリング（図２９Ｄ）。除外された転写産物の組織分布（図２９Ｅ）。胎児及び胎盤の寄与の減少は、ＰＥの母体構成要素が、個体間で最も可変であることを示唆し得る。

【図30A-30D】ＡｄａＢｏｏｓｔモデル開発戦略。ＲＧＨ０１４データセットを、６つのピースに分けた（図３０Ａ）。「ホールドアウトサブセット」は、１０％の試料（ランダムに選択された）並びに差次的に豊富な遺伝子を用いた場合に不正確にクラスタリンスされた３つの試料（図２４Ｃにあるように）を含み、モデル構築から完全に除外された。残りの試料を、５つの均一なサイズの「テストサブセット」にランダムに分けた。各テストサブセットについて、トレーニングデータは、全ての非ホールドアウト及び非テスト試料から構成されていた。トレーニング及びテストデータについての遺伝子カウントを、ｅｄｇｅＲにおいてＴＭＭ正規化し、次に、各遺伝子について平均０及び標準偏差１に対して標準化した。各トレーニング／テスト試料セットについて、ＡｄａＢｏｏｓｔモデル（９０の推定量、１．６の学習率）を、トレーニングデータから１０回構築した（図３０Ｂ）。特徴プルーニングを行い、重要度閾値を徐々に増加させる以下の遺伝子を除去し、テストデータを予測するときにマシューズ相関係数によって性能を評価した。最良の性能（及び同点の場合、最も少ない遺伝子）を有するモデルを保持した。全ての５０の独立したモデルからの推定量を単一のＡｄａＢｏｏｓｔモデルに統合した（図３０Ｃ）。特徴プルーニングを、今度は、遺伝子を使用したモデルのパーセントを用いて、得られたアンサンブルに対して行って、テストサブセットにわたって平均ｌｏｇ ｌｏｓｓ値によって測定される閾値及び性能を設定した。最終的なＡｄａＢｏｏｓｔモデルをホールドアウトデータに適用した後のＲＯＣ曲線（図３０Ｄ）。全ての試料は、３つの試料のうちの２つがＨＣＡによって同様にミスクラスタリングされたことを除いて、正確に分離された。

【図31A-31E】機械学習性能に対するハイパーパラメータ選択及び特徴プルーニングの影響。ＡｄａＢｏｏｓｔのための最適なハイパーパラメータを同定するためのグリッド検索のヒートマップ（図３１Ａ）。マシューズ相関係数を、性能の指標として使用した。各ハイパーパラメータについての平坦化された図（図３１Ｂ）。矢印は、モデル構築のために選択された値を示す。図３１Ｃは、性能に対する個々のＡｄａＢｏｏｓｔモデルのプルーニングの影響を示す（図３０Ｂにあるように）。実線は、全ての１０のモデルの平均であり、網掛け領域は、標準偏差を示す。予めプルーニングされたアンサンブルにおいて観察された各遺伝子を用いたＡｄａＢｏｏｓｔモデルの数（図３１Ｄ）。組み合わされたＡｄａＢｏｏｓｔアンサンブルをプルーニングする場合のモデル性能（図３１Ｅ）。図３１Ｄ及び図３１Ｅ中のオレンジ色の線は、最終的なＡｄａＢｏｏｓｔモデルを生成するために適用される閾値を示す。

【発明を実施するための形態】

【0054】

概略図は必ずしも等尺ではない。図面で使用される同様の番号は、同様の構成要素を指すことがある。しかしながら、所定の図において構成要素を指すための番号の使用は、同じ番号で標識される別の図における構成要素を限定することを意図しないことが理解されるであろう。さらに、構成要素を指すための異なる番号の使用は、異なる番号の構成要素が他の番号の構成要素と同一又は類似であり得ないことを示すことを意図していない。

【0055】

妊娠高血圧腎症に特異的な、母体循環系に見られる循環ＲＮＡのシグネチャー、並びに及び妊娠高血圧腎症の診断及び妊娠高血圧腎症を発症するリスクのある妊婦の同定のための非侵襲的方法におけるこのようなシグネチャーの使用が、本明細書に提供される。

【0056】

体内のＤＮＡ及びＲＮＡの大部分は、細胞内に位置するが、血液中で自由に循環している細胞外核酸も見られる。本明細書において「Ｃ－ＲＮＡ」とも呼ばれる循環ＲＮＡは、血流中で見られるＲＮＡの細胞外セグメントを指す。Ｃ－ＲＮＡ分子は、主に２つの源に由来し：１つ目は、アポトーシスを起こした死細胞から循環中に放出されるもの、２つ目は、循環中に生存細胞によって出されるエクソソーム内に含まれるものである。エクソソームは、多くの細胞型から細胞外空間中に放出され、様々な体液（血清、尿、及び母乳を含む）及び運搬タンパク質、ｍＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ中で見られる、直径約３０～１５０ｎｍの小さい膜質の小胞である。エクソソームの脂質二重層構造は、中に含まれるＲＮＡをＲＮａｓｅｓによる分解から保護し、血液中での安定性を提供する。例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；１４：３１９；及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ；１６：１４５）を参照されたい。エクソソームが、特殊化された機能を有し、凝固、細胞間シグナル伝達、及び排出物管理のようなプロセスに役割を果たすというエビデンスは増加している（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ；６４（３）：６７６－７０５）。Ｓａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ；１０７５：１６５－１７３；Ｚｅｒｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ；２：ｒａ８１；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；３１：３８；及びＳａｔｏ－Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ；４６：１７－２７も参照されたい。

【0057】

本明細書に記載される方法では、母体循環系中に見られるＣ－ＲＮＡ分子は、胎児、胎盤、及び母体の健康のバイオマーカーとして機能し、妊娠の進行を知る手段を提供する。妊娠を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャー、妊娠期間と時間的に関連する母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャー、及び妊娠合併症である妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーが、本明細書に記載される。

【0058】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７、ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３から選択される複数のタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ａ）」又は「（ａ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法を用いて得られるＡｄａｂｏｏｓｔ Ｇｅｎｅｒａｌシグネチャーである。

【0059】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４から選択される複数のタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ｂ）」又は「（ｂ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法を用いて得られるブートストラップ法シグネチャーである。

【0060】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ｃ）」又は「（ｃ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法を用いて得られる標準的なＤＥＸ Ｔｒｅａｔシグネチャーである。

【0061】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、及びＨＴＲＡ４から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ｄ）」又は「（ｄ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法を用いて得られるジャックナイフ法シグネチャーである。

【0062】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ｅ）」又は「（ｅ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリー作製方法を用いて得られる標準的なＤＥＸ Ｔｒｅａｔシグネチャーである。

【0063】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、及びＶＳＩＧ４から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ｆ）」又は「（ｆ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリー作製方法を用いて得られるジャックナイフ法シグネチャーである。

【0064】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ、及びＮＥＳから選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ １」、「リスト（ｇ）」又は「（ｇ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法を用いて得られるＡｄａｂｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ＴｒｕＳｅｑシグネチャーである。

【0065】

いくつかの実施形態において、妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＶＳＩＧ４（本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ２」とも呼ばれる）、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４（本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ３」とも呼ばれる）、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４（本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ４」とも呼ばれる）、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、及びＶＳＩＧ４（本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ５」とも呼ばれる）、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、及びＳＫＩＬ（本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ６」とも呼ばれる）、又はＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、及びＳＫＩＬ（本明細書において「ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ７」とも呼ばれる）から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードするＣ－ＲＮＡ分子を含む。

【0066】

妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。このＣ－ＲＮＡシグネチャーは、本明細書において「リスト（ｈ）」又は「（ｈ）」とも呼ばれる、以下の表１に示されるＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリー作製方法を用いて得られるＡｄａｂｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘシグネチャーである。

【0067】

いくつかの実施形態において、妊娠高血圧腎症を示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、及び／又は（ｈ）のいずれかのうちのいずれか１つ以上と組み合わせた、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、及び／又は（ｈ）のいずれかのうちのいずれか１つ以上から選択されるタンパク質の少なくとも一部をコードする複数のＣ－ＲＮＡ分子を含む。

【0068】

本明細書に提供される実施例は、妊娠高血圧腎症及び対照の妊娠を区別する、上にまとめられた８つの遺伝子リストを説明する。それぞれは、様々な分析方法及び／又は異なるデータセットを用いることによって同定された。しかしながら、これらの遺伝子セットの多くの間に高度の一致がある。複数の手法を用いて妊娠高血圧腎症Ｃ－ＲＮＡにおいて改変されていると転写産物を同定することは、前記転写産物が、この疾患の分類のためのより高い予測値を有することを示す。したがって、全ての発現差異解析及び全てのＡｄａＢｏｏｓｔモデルによって同定された転写産物の重要度を組み合わせて、ランク付けした。より低いランクに割り当てられた遺伝子は、重要でなく又は情報を与えず、それらは、コホート及び試料調製にわたって妊娠高血圧腎症の分類のためにあまりロバストでない可能性がある。

【0069】

まず、両方のライブラリー作製方法（ＴｒｕＳｅｑ及びＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のために全ての発現差異解析（標準的なＤＥＸ Ｔｒｅａｔ、ブートストラップ法及びジャックナイフ法）を用いた場合に同定された転写産物を組み合わせた。以下の表２は、異なる分析方法によって同定される１２５の転写産物の全てについての相対的重要度を示す。全ての分析方法及び両方のライブラリー作製にわたって同定された転写産物は、最も強力な分類子であり、１の重要度ランキングを割り当てられる。３つ以上の分析方法によって同定され、両方のライブラリー作製で検出された転写産物は、２の重要度ランキングを与えられた。ライブラリー作製の一方のみのほかに最もストリンジェントな分析方法であるジャックナイフ法によって同定された転写産物は、３の重要度ランキングを割り当てられた。５つの分析方法のうちの２つによって同定された転写産物は、４の重要度ランキングを与えられた。最も広く且つ包括的な分析である標準的なＤＥＸ Ｔｒｅａｔ方法のみで同定された転写産物は、５の最低の重要度ランキングを与えられた。

【0070】

次に、全てのＡｄａＢｏｏｓｔモデル（ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｇｅｎｅｒａｌ及びＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ）及び両方のライブラリー作製（以下の表３）にわたって同定された９１の転写産物を組み合わせた。各ライブラリー作製について精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔモデルを生成する場合、モデルを同じデータから構築するたびに、得られる遺伝子セットにおいて、観察されるわずかな変化が、観察された。これは、大きい全エクソームＣ－ＲＮＡデータを通して検索するためにＡｄａＢｏｏｓｔによって使用される乱数性による自然な結果である。遺伝子の代表的なリストを得るために、精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔのためのモデル構築を、最小で９回別個に行い、１つ以上のモデルによって使用される全ての遺伝子を報告した。各転写産物を含んでいたモデルのパーセントが表３中に報告される（ＡｄａＢｏｏｓｔによって使用される頻度）。ＡｄａＢｏｏｓｔは、それ自身の「重要度」値を各転写産物に割り当て、これは、試料が妊娠高血圧腎症患者に由来するかどうかの決定に、その転写産物の存在量がどの程度影響を与えるかを反映する。これらのＡｄａＢｏｏｓｔ重要度値は、所与の転写産物を使用した精密化された各ＡｄａＢｏｏｓｔモデルにわたって平均された（表３、平均ＡｄａＢｏｏｓｔモデル重要度）。

【0071】

全てのＡｄａＢｏｏｓｔ分析及びライブラリー作製にわたって同定された転写産物は、１の最高の重要度ランキングを割り当てられた。ＡｄａＢｏｏｓｔによって使用される９０％超の頻度で単一のライブラリー作製方法のために精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔモデルにおいて同定された転写産物は、２の重要度ランキングを割り当てられた。一般に、これらの転写産物は、向上された予測能力と一致する、より高いＡｄａＢｏｏｓｔモデル重要度を有する。単一のライブラリー作製方法のための精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔモデルで同定されるが、９０％未満のＡｄａＢｏｏｓｔモデルによって使用される転写産物は、３の重要度ランキングを割り当てられた。単一のライブラリー作製のための一般的なＡｄａＢｏｏｓｔモデルのみにおいて同定された転写産物は、４の最低の重要度ランキングを与えられた。

【0072】

表２は、全ての分析手法及びライブラリー作製にわたってＤＥＸ分析によって同定された全ての遺伝子を列挙している。ランク１＝全ての分析方法及びライブラリー作製方法にわたって同定された転写産物。ランク２＝両方のライブラリー作製、及び３／５分析方法において同定された転写産物。ランク３＝１つのライブラリー作製方法、最もストリンジェントな分析であるジャックナイフ法において同定された。ランク４＝２／５分析において同定された。そして、ランク５＝最も緩い分析方法である標準的なＤＥＸ Ｔｒｅａｔ方法のみで同定された。

【0073】

表３は、両方のライブラリー作製にわたってＡｄａｂｏｏｓｔ分析によって同定された全ての遺伝子を列挙している。ランク１＝両方のライブラリー作製方法及び精密化されたａｄａｂｏｏｓｔモデルにおいて同定された。ランク２＝高いモデル重要度及び頻度で精密化されたａｄａｂｏｏｓｔモデルに存在する、１つのライブラリー作製方法において同定された。ランク３＝中程度のモデル重要度及び頻度で、精密化されたａｄａｂｏｏｓｔモデルに存在する、１つのライブラリー作製方法おいて同定された。そして、ランク４＝精密化されたａｄａｂｏｏｓｔモデルに存在しない、１つのライブラリー作製において同定された。

【0074】

以下の表４は、本明細書において列挙される様々な遺伝子の全ての用語集である。この情報は、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）から入手した。

【0075】

【表1】

【0076】

【表2】

【0077】

【表3】

【0078】

【表4】

【0079】

【表5】

【0080】

【表6】

【0081】

【表7】

【0082】

【表8】

【0083】

【表9】

【0084】

【表10】

【0085】

【表11】

【0086】

【表12】

【0087】

「複数」という用語は、２つ以上の要素を指す。例えば、この用語は、妊娠高血圧腎症を示すシグネチャーとして働くいくつかのＣ－ＲＮＡ分子への言及において本明細書で使用される。

【0088】

複数は、本明細書に記載されるリストに列挙される分子のうちのいずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、いずれか６つ、いずれか７つ、いずれか８つ、いずれか９つ、いずれか１０個、いずれか１１個、いずれか１２個、いずれか１３個、いずれか１４個、いずれか１５個、いずれか１６個、いずれか１７個、いずれか１８個、いずれか１９個、いずれか２０個、いずれか２１個、いずれか２２個、いずれか２３個、いずれか２４個、いずれか２５個、いずれか２６個、いずれか２７個、いずれか２８個、いずれか２９個、いずれか３０個、いずれか３１個、いずれか３２個、いずれか３３個、いずれか３４個、いずれか３５個、いずれか３６個、いずれか３７個、いずれか３８個、いずれか３９個、いずれか４０個、いずれか４１個、いずれか４２個、いずれか４３個、いずれか４４個、いずれか４５個、いずれか４６個、いずれか４７個、いずれか４８個、いずれか４９個、いずれか５０個、いずれか５１個、いずれか５２個、いずれか５３個、いずれか５４個、いずれか５５個、いずれか５６個、いずれか５７個、いずれか５８個、いずれか５９個、いずれか６０個、いずれか６１個、いずれか６２個、いずれか６３個、いずれか６４個、いずれか６５個、いずれか６６個、いずれか６７個、いずれか６８個、いずれか６９個、いずれか７０個、いずれか７１個、いずれか７２個、いずれか７３個、いずれか７４個、いずれか７５個、いずれか７６個、いずれか７７個、いずれか７８個、いずれか７９個、いずれか８０個、いずれか８１個、いずれか８２個、いずれか８３個、いずれか８４個、いずれか８５個、いずれか８６個、いずれか８７個、いずれか８８個、いずれか８９個、いずれか９０個、いずれか９１個、いずれか９２個、いずれか９３個、いずれか９４個、いずれか９５個、いずれか９６個、いずれか９７個、いずれか９８個、いずれか９９個、いずれか１００個、いずれか１０１個、いずれか１０２個、いずれか１０３個、いずれか１０４個、いずれか１０５個、いずれか１０６個、いずれか１０７個、いずれか１０８個、いずれか１０９個、いずれか１１０個、いずれか１１１個、いずれか１１２個、いずれか１１３個、いずれか１１４個、いずれか１１５個、いずれか１１６個、いずれか１１７個、いずれか１１８個、いずれか１１９個、いずれか１２０個、いずれか１２１個、又はいずれか１２２個を含み得る。複数は、上に列挙される数値の少なくともいずれかを含み得る。複数は、上に列挙される数値のいずれかを超える数値を含み得る。複数は、上に列挙されるもののいずれかの範囲を含み得る。いくつかの実施形態において、妊娠高血圧腎症を示すＣ－ＲＮＡシグネチャーは、上に列挙されるバイオマーカーの１つのみを含む。

【0089】

対象から採取される試料中のこれらのＣ－ＲＮＡシグネチャーの１つの同定及び／又は定量を用いて、対象が、妊娠高血圧腎症に罹患しているか、又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクがあることを決定することができる。

【0090】

試料は、限定はされないが、血液、血清、血漿、汗、涙、尿、喀痰、リンパ液、唾液、羊水、組織生検、スワブ検体、又は塗抹（例えば、限定はされないが、胎盤組織試料を含む）を含む生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ又はｂｉｏｓａｍｐｌｅ）であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、生体試料は、セルフリー血漿試料である。生体試料は、妊婦対象から採取される母体試料であり得る。

【0091】

本明細書で使用される際、「対象」という用語は、ヒト対象並びに非ヒト哺乳動物対象を指す。本明細書における例は、ヒトに関し、この用語は、主にヒトの問題に関するが、本開示の概念は、任意の哺乳動物に適用可能であり、獣医学、動物科学の分野、研究所などにおいて有用である。

【0092】

対象は、任意の妊娠期間の妊婦を含む妊婦であり得る。妊娠期間は、例えば、妊娠初期、妊娠中期（妊娠中期後半を含む）、又は妊娠後期（妊娠後期前半を含む）であり得る。妊娠期間は、例えば、妊娠１６週以前、妊娠２０週以前、又は妊娠２０週以降であり得る。妊娠期間は、例えば、妊娠８～１８週、妊娠１０～１４週、妊娠１１～１４週、１１～１３週、又は妊娠１２～１３週であり得る。

【0093】

母体血漿中のセルフリー胎児核酸の発見は、非侵襲的出生前診断に新たな可能性を切り開いた。ここ数年にわたって、このような循環胎児核酸が染色体異数性の出生前検出に使用されるのを可能にするためのいくつかの手法が実証された。例えば、Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ；１８３２－４；Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ；９４５：２０７－１０；Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ；４９（５）：７２７－３１；Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．；１００（８）：４７４８－５３；Ｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ；４１（６）：４６１－７；Ｇｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ；５０（８）：１４１３－４；Ｓｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ；３６４（１－２）：２２－３２；Ｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；３３６：１２３－３４；Ｐｕｒｗｏｓｕｎｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ；５３（３）：３９９－４０４；Ｃｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ；５４（３）：４８２－９０；Ｔｓｕｉ ａｎｄ Ｌｏ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；４４４：２７５－８９；Ｌｏ，２００８，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ；１１３７：１４０－１４３；Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ；３０（９）：８４９－６１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ；４１３（５－６）：５６８－７６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ；１１０（１１）：４２５５－６０；Ｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ；６０（７）：９５４－６２；Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ；１１４（３７）：Ｅ７７８６－Ｅ７７９５、及び米国特許出願公開第２０１４／０２４３２１２号明細書に記載される方法のいずれかが、本明細書に記載される方法に使用され得る。

【0094】

妊娠高血圧腎症又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクを示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーのバイオマーカーの検出及び同定は、様々な技術のいずれかを含み得る。例えば、バイオマーカーは、ラジオイムノアッセイ法によって血清中で検出されてもよく、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が使用され得る。

【0095】

様々な実施形態において、妊娠高血圧腎症又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクを示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーのバイオマーカーの同定は、Ｃ－ＲＮＡ分子をシーケンシングすることを含み得る。限定はされないが、様々なハイスループットシーケンシング技術のいずれかを含むいくつかのシーケンシング技術のいずれかが用いられ得る。

【0096】

いくつかの実施形態において、母体生体試料中のＣ－ＲＮＡ集団は、シーケンシングの前にタンパク質コード配列を含むＲＮＡ配列のエンリッチメントに供され得る。限定はされないが、ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎプラットフォーム（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１５（７）：６２６－３３．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０８３６５９）；ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ ＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｅｘｏｍｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＳＲプラットフォーム（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１５（７）：６３４－４１．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０８４８５５）；又はｔｈｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｅｘｏｍｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプラットフォーム（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１５（７）：６４２－８．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ０８４８６３）を含む、全エクソームエンリッチメント及びシーケンシングに利用可能な様々なプラットフォームのいずれかが使用され得る。“ＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｅｘｏｍｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ”，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ＦＣ－９３０－１０１２ Ｐａｒｔ ＃ １５０１３２３０ Ｒｅｖ．Ｂ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１０及びＩｌｌｕｍｉｎａ’ｓ“ＴｒｕＳｅｑ（商標）ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ”，Ｃａｔａｌｏｇ ＃ＲＳ－１２２－９００１ＤＯＣ Ｐａｒｔ ＃ １５０２６４９５ Ｒｅｖ．Ｆ Ｍａｒｃｈ ２０１４も参照されたい。

【0097】

特定の実施形態において、妊娠高血圧腎症又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクを示す、母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーのバイオマーカーは、マイクロアレイ技術を用いて検出され、同定され得る。この方法では、対象とするポリヌクレオチド配列は、マイクロチップ基板上に配置又は配列される。次に、配列された配列は、母体生体試料、又はその精製及び／又はエンリッチされた部分とハイブリダイズされる。マイクロアレイは、限定はされないが、ビーズ、顕微鏡スライドガラス、ガラスウエハー、金、ケイ素、マイクロチップ、及び他のプラスチック、金属、セラミック、又は生体表面を含む様々な固体担体を含み得る。マイクロアレイ分析は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの技術を用いることなどによって、製造業者のプロトコルにしたがって、市販の機器によって行われ得る。

【0098】

循環ＲＮＡの調製のための血液試料の採取、輸送、貯蔵、及び／又は処理に関して、試料を安定化させ、及び／又は試料中への細胞ＲＮＡの放出をもたらす細胞膜の破壊を防ぐための措置が講じられてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、血液試料は、血漿へと処理される前に、Ｓｔｒｅｃｋ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ（登録商標）採血管などの、細胞及びＤＮＡ安定化特性を有する管中に、採取され、輸送され、及び／又は貯蔵され得る。いくつかの実施形態において、血液試料は、ＥＤＴＡに曝されない。例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＢＭＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅｓ；６：３８０及びＭｅｄｉｎａ Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＬｏＳ ＯＮＥ；１１（１１）：ｅ０１６６３５４を参照されたい。

【0099】

いくつかの実施形態において、血液試料は、採血の約２４～約７２時間以内、及びいくつかの実施形態において、採血の約２４時間以内に、血漿へと処理される。いくつかの実施形態において、血液試料は、血漿へと処理される前に、室温で維持され、貯蔵され、及び／又は輸送される。

【0100】

いくつかの実施形態において、血液試料は、血漿へと処理される前に、（例えば、氷上で）低温に曝さずに又は凍結させずに、維持され、貯蔵され、及び／又は輸送される。

【0101】

本開示は、妊娠高血圧腎症の診断及び妊娠高血圧腎症を発症するリスクのある妊婦の同定に使用するためのキットを含む。キットは、妊娠高血圧腎症又は妊娠高血圧腎症を発症するリスクを示す、本明細書に記載される母体循環系内のＣ－ＲＮＡシグネチャーを特異的に検出するための少なくとも１つの試薬、例えばプローブを含む任意の製品（例えばパッケージ又は容器）である。キットは、本開示の方法を実施するためのユニットとして、販売促進され、流通され、又は販売され得る。

【0102】

妊娠高血圧腎症の診断及び妊娠高血圧腎症を発症するリスクのある妊婦の同定のための非侵襲的方法における、妊娠高血圧腎症に特異的な、母体循環系に見られる循環ＲＮＡのシグネチャーの使用は、適切なモニタリング及び医学的管理と組み合わされ得る。例えば、さらなる検査が、指示され得る。このような検査としては、例えば、肝機能、腎機能、及び／又は血小板及び様々な凝固タンパク質を測定するための血液検査、タンパク質又はクレアチニン値を測定するための尿分析、胎児の成長、体重、及び羊水をモニター測定するための胎児超音波検査、胎児の運動による胎児心拍数がどのくらいかを測定するためのノンストレス試験が挙げられ、及び／又は胎児の呼吸、筋緊張、及び運動及び羊水の体積を測定するための超音波検査を用いた生物物理学的プロファイルが指示され得る。治療的介入は、例えば、出産前の診察の頻度の増加、血圧を低下させるための降圧薬、コルチコステロイド薬、抗けいれん薬、床上安静、入院、及び／又は早期分娩を含み得る。例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ”，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ；９：７９－９４を参照されたい。

【0103】

治療的介入は、妊娠高血圧腎症を発症するリスクがあると同定された妊婦への低用量アスピリンの投与を含み得る。最近の多施設二重盲検比較試験により、低用量アスピリンによる、早期妊娠高血圧腎症の高いリスクを有する女性の治療が、プラセボと比較してこの診断の発生を低下させたことが実証された（Ｒｏｌｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７，“Ａｓｐｉｒｉｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｐｌａｃｅｂｏ ｉｎ Ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｒｉｓｋ ｆｏｒ Ｐｒｅｔｅｒｍ Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ”，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；３７７（７）：６１３－６２２）。低用量アスピリンの投与量としては、限定はされないが、一日当たり約５０～約１５０ｍｇ、一日当たり約６０～約８０ｍｇ、一日当たり約１００ｍｇ以上、又は一日当たり約１５０ｍｇが挙げられる。投与は、例えば、妊娠１６週若しくはそれ以前又は妊娠１１～１４週に開始され得る。投与は、妊娠３６週まで継続され得る。

【0104】

本発明は、以下の実施例によって例示される。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載される発明の範囲及び趣旨に従って広く解釈されるべきであることを理解するべきである。

【実施例】

【0105】

実施例１
妊娠に特有のＣ－ＲＮＡシグネチャー
母体血漿中の循環核酸の存在は、胎児及び胎盤の進行及び健康を知る手段を提供する（図１）。循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）は、母体循環系中で検出され、２つの主な源に由来する。Ｃ－ＲＮＡのかなりの割合が、Ｃ－ＲＮＡを含有する小胞を血流中に放出するアポトーシス細胞に由来する。Ｃ－ＲＮＡはまた、様々な細胞型からのエクソソーム及び微小胞などの活性なシグナル伝達小胞の放出によって母体循環系に入る。図２に示されるように、したがって、Ｃ－ＲＮＡは、細胞死の副産物並びに活性なシグナル伝達産物から構成される。Ｃ－ＲＮＡの特性は、共通のプロセスによる産生、全身にわたる細胞からの放出、及び安定しており、小胞に含まれることが挙げられる。それは、遺伝子発現、シグナル伝達、及び細胞死における組織特異的な変化を反映する循環トランスクリプトームを表す。

【0106】

Ｃ－ＲＮＡは、少なくとも以下の理由のために、優れたバイオマーカーである可能性を有する：
１）全てのＣ－ＲＮＡは、分解からＣ－ＲＮＡを保護する膜結合小胞内に含まれるため、血液中でかなり安定している。
２）Ｃ－ＲＮＡは、全ての細胞型に由来する。例えば、Ｃ－ＲＮＡは、胎盤及び発育中の胎児の両方からの転写産物を含むことが示されている。Ｃ－ＲＮＡの多様な起源は、胎児及び全体的な母体の健康の両方についての情報を得るための宝庫である可能性をＣ－ＲＮＡに与える。

【0107】

Ｃ－ＲＮＡライブラリーを、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー作製及び全エクソームエンリッチメント技術を用いて、血漿試料から作製した。これが、図３に示される。具体的には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ（商標）ライブラリー作製及びＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを使用した。この手法を用いて、ヒトコード領域にアライメントする９０％のリードを有するライブラリーを作製した（図３及び図７）。試料を、５０Ｍのリードにダウンサンプリングし、４０Ｍ以上のマッピングされたリードを、下流の分析に使用した。試料を、図３に示されるＣ－ＲＮＡワークフローを用いて処理した。デュアルインデックス付きライブラリー。Ｈｉｓｅｑ２０００において５０×５０でシーケンシングした。

【0108】

図４に示されるように、妊娠後期妊婦からの血漿試料による結果を、非妊婦からの血漿試料と比較することにより、妊娠に特有の明らかなシグネチャーが示される。このシグネチャーの上位２０の差次的存在量遺伝子は、ＣＳＨＬ１、ＣＳＨ２、ＫＩＳＳ１、ＣＧＡ、ＰＬＡＣ４、ＰＳＧ１、ＧＨ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ７、ＰＳＧ１１、ＣＳＨ１、ＰＳＧ２、ＨＳＤ３Ｂ１、ＧＲＨＬ２、ＬＧＡＬＳ１４、ＦＣＧＲ１Ｃ、ＰＳＧ５、ＬＧＡＬＳ１３、及びＧＣＭ１である。妊娠シグネチャー中で同定される遺伝子の大部分は、胎盤で発現され、公開されたデータとも相関している。これらの結果はまた、胎盤ＲＮＡが母体循環系中で入手され得ることを確認する。

【0109】

実施例２
妊娠期間にわたるＣ－ＲＮＡシグネチャー
この実施例は、妊娠を通して異なる妊娠期間にわたるＣ－ＲＮＡシグネチャーを特徴付けた。妊娠にわたる縦断的に異なる時点でのＣ－ＲＮＡシグネチャーの変化が、実施例１において示される妊娠及び非妊娠試料のＣ－ＲＮＡシグネチャー間の差よりわずかであることが予測される。図５に示されるように、シグネチャー遺伝子のＣ－ＲＮＡプロファイルの明らかな経時変化が、妊娠初期に上方制御される遺伝子の明らかな群及び妊娠後期に増加する遺伝子の明らかな群と共に、妊娠が進行するにつれて観察された。

【0110】

これらの遺伝子は、図５に列挙されるように、ＣＧＢ８、ＣＧＢ５、ＺＳＣＡＮ２３、ＨＳＰＡ１Ａ、ＰＭＡＩＰ１、Ｃ８ｏｒｆ４、ＩＴＭ２Ｂ、ＩＦＩＴ２、ＣＤ７４、ＨＳＰＡ６、ＴＦＡＰ２Ａ、ＴＲＰＶ６、ＥＸＰＨ５、ＣＡＰＮ６、ＡＬＤＨ３Ｂ２、ＲＡＢ３Ｂ、ＭＵＣ１５、ＧＳＴＡ３、ＧＲＨＬ２、及びＣＳＨＬ１を含む。

【0111】

これらの遺伝子は、ＣＳＨＬ１、ＣＳＨ２、ＫＩＳＳ１、ＣＧＡ、ＰＬＡＣ４、ＰＳＧ１、ＧＨ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ７、ＰＳＧ１１、ＣＳＨ１、ＰＳＧ２、ＨＳＤ３Ｂ１、ＧＲＨＬ２、ＬＧＡＬＳ１４、ＦＣＧＲ１Ｃ、ＰＳＧ５、ＬＧＡＬＳ１３、及びＧＣＭ１も含み得る。

【0112】

妊娠期間を通じたこれらの変化は、Ｓｔｅｖｅ Ｑｕａｋｅ及びＤｅｎｎｉｓ Ｌｏの両方から公開されたデータと相関している。例えば、Ｍａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，“Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｆａｎｔｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｕｎｉｑｕｅ ｆｅｔａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｔｈａｔ ｃｉｒｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ”，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ；１１７（１０）：３００７－３０１９；Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ；１１１（２０）：７３６１－６；及びＮｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｆｅｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ａｇｅ ａｎｄ ｐｒｅｔｅｒｍ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３６０（６３９３）：１１３３－１１３６を参照されたい。胎盤の遺伝子発現のパターンと相関するＣ－ＲＮＡシグネチャーが見られた。したがって、この手法は、妊娠中のわずかな変化を検出することができ、胎盤の健康をモニターするための非侵襲的手段を提供する。

【0113】

実施例３
妊娠高血圧腎症のＣ－ＲＮＡシグネチャー
この実施例では、妊娠高血圧腎症に特有のＣ－ＲＮＡシグネチャーを同定した。Ｃ－ＲＮＡシグネチャーを、２つの試験、ＲＧＨ１４試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ａｓ ＮＣＴ０２０８４９４に登録されている）及びＰｅａｒｌ試験（本明細書においてＰｅａｒｌ Ｂｉｏｂａｎｋとも呼ばれる；ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ａｓ ＮＣＴ０２３７９８３２に登録されている））から妊娠高血圧腎症であると診断された妊婦から採取された試料において決定し、アッセイした（図６）。２つの管の血液を、妊娠高血圧腎症の診断時に採取した。妊娠高血圧腎症の病態に関連しない転写変動性を最小限に抑え、Ｃ－ＲＮＡシグネチャーにおける妊娠期間の差を制御するために、妊娠期間を適合させた８０の対照試料を採取した。ＲＧＨ１４試験からの試料を用いて、一連の生物学的に関連する遺伝子を同定し、これらのバイオマーカーの予測値を、Ｐｅａｒｌ Ｂｉｏｂａｎｋからの試料の独立したコホートにおいて検証した。

【0114】

ＲＧＨ１４データの分析において、妊娠高血圧腎症（ＰＥ）に特有のＣ－ＲＮＡシグネチャーを、４つの異なる方法、ＴＲＥＡＴ方法、ブートストラップ法、ジャックナイフ法、及びＡｄａｂｏｏｓｔ方法を用いて同定した。実施例３は、最初の３つの分析方法に焦点を合わせ、実施例４は、Ａｄａｂｏｏｓｔ方法に焦点を合わせている。

【0115】

ＥＤＧＲプログラムを用いる閾値に対するｔ検定（ｔ－ｔｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＴＲＥＡＴ）統計方法は、研究者が、マイクロアレイ実験における発現差が所与の（生物学的に有意な）閾値より大きいかどうかを（関連するｐ値を用いて）正式に試験することを可能にする。ＴＲＥＡＴ統計方法のより詳細な説明については、ＭｃＣａｒｔｈｙ ａｎｄ Ｓｍｙｔｈ，２００９“Ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ａ ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｉｓ ａ ＴＲＥＡＴ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；２５（６）：７６５－７１を参照し、ＥＤＧＲプログラムのより詳細な説明については、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，“ｅｄｇｅＲ：ａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；２６：１３９－１４０を参照されたい。Ａｄａｂｏｏｓｔ方法のより詳細な説明については、Ｆｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｓｃｈａｐｉｒｅ，１９９７，“Ａ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ－Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｎ－Ｌｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｏｏｓｔｉｎｇ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；５５（１）：１１９－１３９及びＰｅｄｒｅｇｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，“Ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ：Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｉｎ Ｐｙｔｈｏｎ”，ＪＭＬＲ；１２：２８２５－２８３０を参照されたい。Ａｄａｂｏｏｓｔ方法は、実施例４において説明される。

【0116】

第１の方法では、標準的な統計試験（ＴＲＥＡＴ方法）を用いて、適合対照のサブセット（４０人の患者）と比較して４０人の患者のＲＧＨ１４妊娠高血圧腎症コホートにおいて統計的に異なる遺伝子を同定した。１２２の遺伝子が、適合対照のサブセット（４０人の患者）と比較して妊娠高血圧腎症コホート（４０人の患者）において統計的に異なると同定された（図８、右側パネル）。これらの遺伝子は、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＩＲＦ６、ＭＹＨ１４、ＰＯＤＸＬ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＨ３ＲＦ２、ＴＭＣ７、ＺＮＦ３６６、ＡＤＣＹ１、Ｃ６、ＦＡＭ２１９Ａ、ＨＡＯ２、ＩＧＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＮＴＲＫ２、ＳＨ３ＰＸＤ２Ａ、ＳＳＵＨ２、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＦＭＯ３、ＦＳＴＬ３、ＧＡＴＡ５、ＨＴＲＡ１、Ｃ８Ｂ、Ｈ１９、ＭＮ１、ＮＦＥ２Ｌ１、ＰＲＤＭ１６、ＡＰ３Ｂ２、ＥＭＰ１、ＦＬＮＣ、ＳＴＡＧ３、ＣＰＢ２、ＴＥＮＣ１、ＲＰ１Ｌ１、Ａ１ＣＦ、ＮＰＲ１、ＴＥＫ、ＥＲＲＦＩ１、ＡＲＨＧＥＦ１５、ＣＤ３４、ＲＳＰＯ３、ＡＬＰＫ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＺＣＣＨＣ２４、ＬＥＡＰ２、ＭＹＬ２、ＮＲＧ３、ＺＢＴＢ１６、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＱＰ７、ＳＲＰＸ、ＵＡＣＡ、ＡＮＯ１、ＦＫＢＰ５、ＳＣＮ５Ａ、ＰＴＰＮ２１、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＥＲＧ、ＳＯＸ１７、ＷＷＴＲ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＣＡ３、ＨＲＧ、ＴＡＴ、ＡＱＰ７Ｐ１、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＳＹＮＰＯ、ＦＮ１、ＧＰＲ１１６、ＫＲＴ１７、ＡＺＧＰ１、ＢＣＬ６Ｂ、ＫＩＦ１Ｃ、ＣＬＩＣ５、ＧＰＲ４、ＧＪＡ５、ＯＬＡＨ、Ｃ１４ｏｒｆ３７、ＺＥＢ１、ＪＡＧ２、ＫＩＦ２６Ａ、ＡＰＯＬＤ１、ＰＮＭＴ、ＭＹＯＭ３、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＶＳＩＧ４、ＨＢＧ２、ＣＡＤＭ２、ＬＡＭＰ５、ＰＴＧＤＲ２、ＮＯＭＯ１、ＮＸＦ３、ＰＬＤ４、ＢＰＩＦＢ３、ＰＡＣＳＩＮ１、ＣＵＸ２、ＦＬＧ、ＣＬＥＣ４Ｃ、及びＫＲＴ５を含む。

【0117】

ＴＲＥＡＴ方法は、妊娠高血圧腎症患者を別個の群へと１００％正確に分類する一連の遺伝子を同定しなかった（図１５）。しかしながら、これらの同定された遺伝子に焦点を合わせることは、全ての測定される遺伝子の全データセットを用いるのと比較して分類を向上させた（図８、左側パネル）。これは、予測のための遺伝子のサブセットに焦点を合わせることの価値を強調している。しかしながら、ＴＲＥＡＴ方法では、対照の選択に応じて、かなりの量の変動が同定された遺伝子において観察された。この生物学的変動性に対処し、本発明者らの遺伝子リストの予測値をさらに向上させるために、第２のブートストラップ法を開発した。

【0118】

ＲＧＨ１４試験では、妊娠高血圧腎症患者試料（４０）より多い対照試料（８０）が利用可能である。したがって、４０の妊娠高血圧腎症患者試料のＲＧＨ１４コホートを、ランダムに選択した４０の対照試料（やはり妊娠期間を適合させた）と比較し、妊娠高血圧腎症コホートにおいて統計的に異なる遺伝子リストを同定した。図９に示されるように、次に、これを１，０００回繰り返して、一連の遺伝子を同定した頻度を同定した。かなりの遺伝子サブセットが、１，０００の反復のうち１０回未満（１，０００の反復のうちの１％未満）現れるに過ぎない。これらの低頻度の遺伝子は、生物学的ノイズに起因する可能性が最も高く、広く妊娠高血圧腎症に特異的な遺伝子を反映しないことがある。そのため、行われる１，０００の反復のうちの５０％において同定される場合のみ、遺伝子が妊娠高血圧腎症コホートにおいて統計的に異なると見なされることを必要とすることによって、遺伝子リストの選択範囲をさらに狭めた（図９、右側パネル）。図１０に示されるように、さらなるブートストラップ選択による差次的な転写産物存在量が、妊娠高血圧腎症試料を健康な対照と区別する。このさらなる要件を用いることは、生物学的変動性に対処するのに役立ち、妊娠高血圧腎症試料を正確に分類する能力をさらに向上させた。

【0119】

このブートストラップ法を用いて、２７の遺伝子を、妊娠高血圧腎症と統計的に関連すると同定した。これらの遺伝子は、ＴＩＭＰ４、ＦＬＧ、ＨＴＲＡ４、ＡＭＰＨ、ＬＣＮ６、ＣＲＨ、ＴＥＡＤ４、ＡＲＭＳ２、ＰＡＰＰＡ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＫＲＴ５、ＰＲＧ２、ＰＲＸ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、及びＶＳＩＧ４を含む。このブートストラップ法で同定された遺伝子は、公開されたデータとの優れた一致を有していた。これらの遺伝子の約７５％が、胎盤によって発現される。図１１に示されるように、ＰＡＰＰＡ及びＣＲＨを含む、妊娠高血圧腎症の公知のマーカーとの重複がある。そして、かなりの数のこれらの遺伝子が、胚発生、細胞外基質再構築、免疫調節、及び心血管機能、妊娠高血圧腎症において無調節であることが知られている全ての経路に関与している。

【0120】

第３のジャックナイフ法も、最も高い予測値を有する遺伝子のサブセットを捕捉するために開発された。この手法は、ブートストラップ法と類似している。妊娠高血圧腎症及び対照群の両方からの患者を、ランダムにサブサンプリングし、差次的に豊富な遺伝子を１，０００回同定した。遺伝子が統計的に異なると同定される頻度を用いる代わりに、ジャックナイフ法は、各転写産物のｐ値について信頼区間（９５％、片側）を計算した。この信頼区間が０．０５を超えた遺伝子を除外した。（図１６、左側パネル）。

【0121】

ジャックナイフ法を用いて、３０の遺伝子を、妊娠高血圧腎症の予測として同定した：ＶＳＩＧ４、ＡＤＡＭＴＳ２、ＮＥＳ、ＦＡＭ１０７Ａ、ＬＥＰ、ＤＡＡＭ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＴＩＭＰ３、ＰＲＸ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＫＲＴ５、ＡＭＰＨ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＴＥＡＤ４、ＣＲＨ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＴＩＭＰ４、ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＡＰＯＬＤ１、ＰＬＤ４、ＣＵＸ２、ＨＴＲＡ４。

【0122】

図１６の右側パネルに示されるように、この手法は、ＲＧＨ１４データセットにおける妊娠高血圧腎症患者の良好な分類を与えた（図１５（ＴＲＥＡＴ）、図１０（ブートストラップ法）及び図１６（ジャックナイフ法）を比較する）。各同定された遺伝子リストを、独立したＰｅａｒｌ Ｂｉｏｂａｎｋデータセットにおいて妊娠高血圧腎症試料を分類するのにも使用した。図１７に示されるように、各遺伝子リストは、妊娠高血圧腎症試料を分類することができた。

【0123】

ブートストラップ法及びジャックナイフ法によって同定された全ての遺伝子が、１２２のＴＲＥＡＴ方法遺伝子（表２、ＤＥＸ分析、ＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法）に示される。ブートストラップ法及びジャックナイフ法遺伝子リストは、非常に一致しており、７０％超の遺伝子が共通である。いずれかの手法によって同定された約９０％の転写産物が、妊娠高血圧腎症患者において増加した転写産物存在量を示し、これは、この疾患における増加したシグナル伝達及び／又は細胞死と一致する。

【0124】

実施例４
Ａｄａｂｏｏｓｔを用いたＣ－ＲＮＡシグネチャーの同定
この実施例では、代替的な手法である、ａｄａｂｏｏｓｔと呼ばれる公表された機械学習アルゴリズムを用いて、妊娠高血圧腎症に関連する特異的なＣ－ＲＮＡシグネチャーを同定した。図１２に示されるように、この手法は、妊娠高血圧腎症（ＰＥ）又は正常であると試料を分類するのに最も高い予測能力を有する一連の遺伝子を同定する。この遺伝子リストを用いて、健康な対照からの妊娠高血圧腎症コホートの最も明らかな分離が観察された。しかしながら、この手法はまた、モデルを構築するのに使用される試料に対する過学習を非常に起こしやすいことがある。したがって、ＰＥＡＲＬ試験からの完全に独立したデータセットを用いて、予測モデルを検証した（図１３）。このＡｄａｂｏｏｓｔ遺伝子リストを用いて、８５％の妊娠高血圧腎症試料を、８５％の特異度で正確に分類した（図１４）。全体的に、Ａｄａｂｏｏｓｔ機械学習手法は、妊娠高血圧腎症についての最も正確な予測モデルを構築する。

【0125】

Ａｄａｂｏｏｓｔ方法を用いて、７５の遺伝子を、妊娠高血圧腎症と統計的に関連すると同定した（表３、ＡｄａＢｏｏｓｔ分析、ＴｒｕＳｅｑライブラリー作製方法）。これらの遺伝子は、ＡＲＲＤＣ２、ＪＵＮ、ＳＫＩＬ、ＡＴＰ１３Ａ３、ＰＤＥ８Ｂ、ＧＳＴＡ３、ＰＡＰＰＡ２、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＥＰ、ＲＧＰ１、ＵＳＰ５４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＭＲＰＳ３５、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＵＸ２、ＨＥＡＴＲ９、ＦＳＴＬ３、ＤＤＩ２、ＺＭＹＭ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ３、ＧＢＰ２、ＮＥＳ、ＥＴＶ３、ＡＤＡＭ１７，ＡＴＯＨ８、ＳＬＣ４Ａ３、ＴＲＡＦ３ＩＰ１、ＴＴＣ２１Ａ、ＨＥＧ１、ＡＳＴＥ１、ＴＭＥＭ１０８、ＥＮＣ１、ＳＣＡＭＰ１、ＡＲＲＤＣ３、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＩＴ３、ＣＬＩＣ５、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１７、ＴＰＳＴ１、ＧＡＴＳＬ２、ＳＰＤＹＥ５、ＨＩＰＫ２、ＭＴＲＮＲ２Ｌ６、ＣＬＣＮ１、ＧＩＮＳ４、ＣＲＨ、Ｃ１０ｏｒｆ２、ＴＲＵＢ１、ＰＲＧ２、ＡＣＹ３、ＦＡＲ２、ＣＤ６３、ＣＫＡＰ４、ＴＰＣＮ１、ＲＮＦ６、ＴＨＴＰＡ、ＦＯＳ、ＰＡＲＮ、ＯＲＡＩ３、ＥＬＭＯ３、ＳＭＰＤ３、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＴＭＥＭ１１、ＰＳＭＤ１１、ＥＢＩ３、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＣＣＤＣ１５１、ＣＰＡＭＤ８、ＣＮＦＮ、ＬＩＬＲＡ４、ＡＤＡ、Ｃ２２ｏｒｆ３９、ＰＩ４ＫＡＰ１、及びＡＲＦＧＡＰ３を含む。

【0126】

精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔモデルも、ＰＥ試料のロバストな分類のために開発された。新たな試料を正確に予測し得る一般化機械学習モデルを生成するために、本発明者らは、単一のデータセットとの過剰適合を回避する厳密な手法を使用し、モデル構築に使用されない試料を用いて最終的な分類子を検証した。図１８に示されるように、ＲＧＨ１４データセットを、ランダムな選択によって６つのピースに分けた：モデル構築から除外された１２％の試料を含むホールドアウトサブセット、及び５つの均一なサイズのテストサブセット。各反復について、サブセットを、トレーニングデータ又はテスト試料と示した。ＡｄａＢｏｏｓｔモデルを構築することから開始するこのプロセスを、このデータサブセットについて最小で１０回繰り返した。５０の高性能モデルを、５つのテスト－トレーニングサブセットについて構築した後、全てのモデルからの推定量を、単一のＡｄａＢｏｏｓｔモデルに統合した。

【0127】

精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔモデルを用いて、１１の遺伝子を、妊娠高血圧腎症と統計的に関連すると同定した。これらの遺伝子は、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＬＥＰ、ＡＲＲＤＣ２、ＳＫＩＬ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４、ＡＲＲＤＣ４、ＣＲＨ及びＮＥＳを含む。この予測モデルの性能を、ＲＧＨ１４からの並びに完全に独立したＰｅａｒｌ Ｂｉｏｂａｎｋコホートにおけるホールドアウトデータセットを用いて検証した（図１９）。

【0128】

ＡｄａＢｏｏｓｔモデル生成の説明。図１８にも示される以下の手法によって、ＡｄａＢｏｏｓｔ分類手法を、より特異的な遺伝子セットを得るために精密化した（ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ １～７）。ＲＧＨ１４データセットを、ランダムな選択によって６つのピースに分けた：モデル構築から除外された１２％の試料を含むホールドアウトサブセット、及び５つの均一なサイズのテストサブセット。

【0129】

テストサブセットのそれぞれについて、トレーニングデータを、ホールドアウト又はテスト試料のいずれでもない全ての試料として割り当てた。テスト及びトレーニング試料についての遺伝子カウントを、ｅｄｇｅＲにおいてＴＭＭ正規化し、次に、トレーニングデータが、各遺伝子について０の平均及び１の標準偏差を有するように標準化した。次に、９０の推定量及び１．６の学習率を有するＡｄａＢｏｏｓｔモデルを、トレーニングデータにフィットさせた。次に、モデルにおける各遺伝子の特徴重要度を決定し、閾値未満の重要度を有する遺伝子を用いて推定量を除外する影響を試験することによって、特徴プルーニングを行った。最も少ない遺伝子で最良の性能（テストデータ分類についてマシューズ相関係数によって測定した際に）をもたらす閾値を選択し、そのモデルを保持した。ＡｄａＢｏｏｓｔモデルを構築することから開始するこのプロセスを、このデータサブセットについて最小で１０回繰り返した。

【0130】

全ての５０プラスモデルを、５つのテスト－トレーニングサブセットについて構築した後、全てのモデルからの推定量を、単一のＡｄａＢｏｏｓｔモデルに統合した。特徴プルーニングを再度行い、今度は、閾値のために遺伝子を組み込んだモデルのパーセントを使用し、各テストサブセットの分類のために平均陰性ｌｏｇ ｌｏｓｓ値を用いて性能を評価した。最も少ない遺伝子で最大陰性ｌｏｇ ｌｏｓｓ値を得たモデルを、最終的なＡｄａＢｏｏｓｔモデルとして選択した。

【0131】

ＡｄａＢｏｏｓｔ遺伝子リスト。このプロセスの反復により、わずかな変動が、ＡｄａＢｏｏｓｔアルゴリズム実装における固有のランダム化のため、最終的なモデルのために選択された遺伝子において観察されたが、テストデータ、ホールドアウトデータ、及び独立した（Ｐｅａｒｌ）データセットを予測するための性能は高いままであった。

【0132】

合計で１１の遺伝子が、生成された１４のＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄモデル：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４（ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ １）の少なくとも１つにおいて観察されたが、全てを同時に含むモデルは生成されなかった。

【0133】

２つの観察された遺伝子セットが、独立したデータの分類について最も高い性能を与えた。これらは、ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ２：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＶＳＩＧ４及びＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ３：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４である。

【0134】

４つのさらなる遺伝子セットが、ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ２～３とほぼ同程度に高い性能を示した。これらは、ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ４：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＮＥＳ、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４；ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ５：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬ、ＶＳＩＧ４；ＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ６：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＳＫＩＬ；及びＡｄａＢｏｏｓｔ Ｒｅｆｉｎｅｄ ７：ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＲＲＤＣ２、ＡＲＲＤＣ４、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＫＩＬである。

【0135】

実施例５
トランスポソームに基づくライブラリー作製を用いたＣ－ＲＮＡシグネチャーの同定
ＲＧＨ１４試料がまた、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコルによって処理され、全エクソームについてエンリッチされ、４０００万を超えるリードまでシーケンシングされた。この手法は、低いインプットでより高感度で且つロバストであり、したがって、妊娠高血圧腎症を予測するさらなる遺伝子を同定する可能性が高い。このデータセットを、３つの分析方法、標準的な発現差異解析（ＴＲＥＡＴ）、ジャックナイフ法、及び精密化されたＡｄａｂｏｏｓｔモデルによって実行した。これらの分析方法の詳細な説明については、実施例３及び実施例４を参照されたい。

【0136】

ライブラリーを作製するための方法を変更することにより、全ての３つの分析方法において検出される遺伝子が変化した。ＴＲＥＡＴ方法については、２６の遺伝子を、妊娠高血圧腎症において差次的に豊富であると同定し、その大部分が、妊娠高血圧腎症において増加された存在量も示す（表２、ＤＥＸ分析、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリー作製方法を参照）。これらの遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＭＰＨ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＡＣＳＩＮ１、ＰＡＰＰＡ２、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＶＳＩＧ４を含む。図２０は、この遺伝子リスト内のＲＧＨ１４試料の分類を示す。

【0137】

ジャックナイフ分析方法を適用することにより、ＴＲＥＡＴリストの選択範囲を、妊娠高血圧腎症において差次的に豊富であると同定された２２の遺伝子へと狭めた。これらの遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＣＥＬＦ４、ＤＡＡＭ２、ＦＡＭ１０７Ａ、ＨＴＲＡ４、ＩＧＦＢＰ５、ＫＣＮＡ５、ＫＲＴ５、ＬＣＮ６、ＬＥＰ、ＬＲＲＣ２６、ＮＥＳ、ＯＬＡＨ、ＰＲＸ、ＰＴＧＤＲ２、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ３、ＶＳＩＧ４を含んでいた。このリストの向上した性能が、図２０に示される。

【0138】

精密化されたＡｄａＢｏｏｓｔモデル手法を、実施例４に記載されるように、このデータに適用した。この方法を用いて、２４の遺伝子を、妊娠高血圧腎症と統計的に関連すると同定する（表３、ＡｄａＢｏｏｓｔ分析、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔライブラリー作製方法）。これらの遺伝子は、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＫＣＮＡ５、ＡＤＡＭＴＳ２、ＭＹＯＭ３、ＡＴＰ１３Ａ３、ＡＲＨＧＥＦ２５、ＡＤＡ、ＨＴＲＡ４、ＮＥＳ、ＣＲＨ、ＡＣＹ３、ＰＬＤ４、ＳＣＴ、ＮＯＸ４、ＰＡＣＳＩＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＫＩＬ、ＳＥＭＡＧ３、ＴＩＰＡＲＰ、ＬＲＲＣ２６、ＰＨＥＸ、ＬＩＬＲＡ４、及びＰＥＲ１を含む。この予測モデルの性能が、図２１に示される。

【0139】

実施例６
母体血液からの循環トランスクリプトーム測定が、早発型妊娠高血圧腎症シグネチャーを検出する
受胎から出産まで妊婦の健康を非侵襲的にモニターするための分子ツールは、有害転帰のリスクがある妊婦の正確な検出を可能にするであろう。循環ＲＮＡ（Ｃ－ＲＮＡ）は、全ての組織によって、血流中に放出されて、胎盤、胎児及び母体の健康の利用しやすい包括的な測定を提供する（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１１１：７３６１－７３６６；及びＴｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；６０：９５４－９６２）。一般的な、命に関わる可能性のある妊娠合併症である妊娠高血圧腎症（ＰＥ）は、胎盤が起源であるが、疾患が進行するにつれてかなりの母体構成要素に広がる（Ｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；６１：９３２－９４２；及びＣｈａｉｗｏｒａｐｏｎｇｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ；１０，４６６－４８０）。未だに、バイオマーカーは、限られた臨床的有用性を示したとされている（Ｐｏｏｎ ａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，２０１４，Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；２０１４：１－１１；Ｚｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；３７４：１３－２２；及びＤｕｈｉｇ ｅｔａｌ．，２０１８，Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ；７：２４２）。循環トランスクリプトームの特徴付けがより良好なバイオマーカーを同定し得ると仮定して、Ｃ－ＲＮＡを、１１３人の妊婦から（４０は早発型ＰＥ診断の時点で）分析した。新規なワークフローを用いて、ＰＥの生物学と一致し、胎盤、胎児、及び母体寄与を表す、３０の転写産物の存在量の差を同定した。さらに、機械学習モデルを開発し、７つのみのＣ－ＲＮＡ転写産物が、２つの独立したコホートにおいてＰＥを分類するのに必要とされることを実証した（９２～９８％の正確性）。この実施例に開示されるＣ－ＲＮＡの全体的な測定は、母体及び胎児健康の両方をモニターする際の有用性を強調し、リスクのある妊娠の診断及び予測にかなり有望である。

【0140】

いくつかの試験が、様々な妊娠合併症のための、Ｃ－ＲＮＡにおける潜在的なバイオマーカーを調査及び同定するために開始されている（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；６３：１６９５－１７０４；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；３６：９９７－１００８；Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１１４：Ｅ７７８６－Ｅ７７９５；及びＮｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｓｃｉｅｎｃｅ；３６０：１１３３－１１３６）。しかしながら、これらの試験は、ごくわずかな患者に関与しており、少数の遺伝子－ほぼ胎盤及び胎児由来の転写産物のみのモニターに限られている。全循環トランスクリプトームの測定は、変動性及び細胞溶解からの汚染を最小限に抑えるために、特定の予めの試料採取及び処理を必要とするため、行うのが難しい（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；４７：１６０７－１６１３；及びＰａｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ ＯＮＥ；８：ｅ７７９６３）。この複雑なワークフローは、大規模な臨床的試料採取を行うのを困難にするが、その理由は、血液試料の即座の処理に必要とされる作業を、多くの診療所において実行できないためである（Ｍａｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，２０１３，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；２０１３：８９１３９１）。したがって、この実施例では、試料調製の全ての工程を制御された環境で行う処理実験室への血液の一晩の輸送を可能にする方法が確立され、臨床試験レベル評価に拡張可能なプラットフォームを提供する（図２２Ａ）。

【0141】

この方法の柱は、血液を処理実験室に一晩で輸送する能力である。Ｃ－ＲＮＡ妊娠シグナルを、いくつかの管タイプにおける一晩の室温での輸送の後に評価した（図２６Ａ～２６Ｃ）。以前のＣ－ＲＮＡ試験によって使用される代表的存在であるＥＤＴＡ管中で貯蔵された血液は、妊娠に関連する転写産物の存在量の減少及び転写学プロファイルの全体的な不安定性を示した（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＢＭＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅｓ；６：３８０）。対照的に、非侵襲的出生前診断（Ｎｏｎ－Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＮＩＰＴ）に使用される主要な管タイプであるＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ）は、胎盤転写産物からのシグナルを保持し、向上した技術的再現性を有していた（図２６Ｂ）（Ｍｅｄｉｎａ Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＬｏＳ ＯＮＥ；１１：ｅ０１６６３５４）。

【0142】

血液の輸送は、単一の管の血液から患者当たり平均で５ｍＬの血漿を容易に採取することを可能にした。Ｃ－ＲＮＡデータ品質の差を、可変の血漿体積を用いる場合に評価し、２ｍＬ未満の血漿の使用が、ノイズを有意に増加させ、ライブラリー複雑性を減少させたことを決定した（図２７Ａ及び２７Ｂ）。したがって、４ｍＬの血漿を、データ品質の信頼性を最大にするためにこの実施例の試験に使用した。

【0143】

この新規なワークフローを、妊娠初期から妊娠後期までの健康な妊婦当たり１０，０００を超える転写産物のＣ－ＲＮＡ動態をモニターする過去の研究を反復することによって実証した。４５人の健康な妊婦から連続して採取された１５２の試料（Ｐｒｅ－Ｅｃｌａｍｐｓｉａ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｈｏｒｔ－ＰＥＡＲＬ；ＮＣＴ０２３７９８３２；表５）を用いて、１５６の有意に改変された転写産物を同定し、その大部分が、妊娠が進行するにつれて存在量が増加した（図２２Ｂ）。改変された遺伝子の４２％が、以前のＣ－ＲＮＡ試験（図２２Ｃ）（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；１１１：７３６１－７３６６；及びＴｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；６０：９５４－９６２）において同定された。この試験のみで同定された９１の転写産物のうち、６４％が、胎盤及び／又は胎児組織によって発現される（図２２Ｄ及び２８Ａ～２８Ｃ）。おそらく、残りの遺伝子が、妊娠に対する母体応答を反映する。

【0144】

試験設計
調査の次の段階では、ワークフローを、臨床試料に適用して、ＰＥにおけるＣ－ＲＮＡ変化を測定した（ｉＰＣ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ妊娠高血圧腎症コホート）。ＰＥは、異質性疾患であり、様々な重症度に関連し、患者の転帰は、ＰＥが妊娠３４週以前（早発型）に現れるか又は妊娠３４週以降（遅発型）に現れるかに基づいている（Ｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；６１：９３２－９４２；Ｃｈａｉｗｏｒａｐｏｎｇｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ；１０，４６６－４８０３；及びＤａｄｅｌｓｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ；２２：１４３－１４８）。この試験は、より重症のＰＥの早発型に焦点を合わせ、クリーンなコホートを得るために、明確な選択及び除外要件（慢性高血圧歴のある個体を最も厳密に除外する）で厳しい診断基準を定義した（表６）（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；７：３９－４３；及びＨｉｌｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＰＬｏＳ ＯＮＥ；１２：ｅ０１８７７２９）。母体特性、妊娠結果、及び使用する薬剤を、試験を通して記録した（表７）。１１３の試料を、８つの場所にわたって採取し（表８）、４０はＰＥ診断の時点で採取し、妊娠期間を適合させた７３の対照を１週間以内に採取した（図２３Ａ）。対照の９．５％に対して、一人を除く全てのＰＥの女性が、早産し、これらの診断基準が、この疾患によって深刻な影響を受ける個体を同定するものであると確認した（図２３Ｃ）。

【0145】

全ての試料を、複数の処理バッチにわたってランダムに分配し、次に、４０Ｍ以上のリードにシーケンシングした。全コホートを用いた標準的な発現差異解析は、４２の改変された転写産物を同定し、３７がＰＥにおいて増加された図２４Ａ、青色及びオレンジ色）。しかしながら、対照の様々なサブセットを分析のために選択した場合、改変されていることが検出された遺伝子において観察される高い変動性が懸念される。

【0146】

この相違に対処するために、最も一貫して改変される遺伝子の同定を可能にするジャックナイフ法を組み込んだ（図２４Ａ及び２４Ｂ、オレンジ色）。ランダムに選択された試料サブセットによる差分解析の１，０００回の反復を行い、これは、改変されたと推定される各転写産物に関連するｐ値の信頼区間の構築を可能にした（図２９Ａ）。信頼区間が０．０５を超えた１２の遺伝子を除外した（図２４Ｂ）。これらの遺伝子は、ベースライン存在量又は生物学的変動の閾値を単に設定することによって除外されなかったが（図２９Ｂ）、これらの転写産物がより低い予測値を有することが観察された（図２９Ｃ）。階層的クラスタリングは、これらの遺伝子が、ＰＥコホートにおいて広く改変されていないこと、ひいてはこの条件の正確な分類のための感度を欠いている（７３％）ことを示す（図２９Ｄ）。

【0147】

次に、分析は、精密化された３０の遺伝子セットに焦点を合わせ、そのうちの６０％が、以前にＰＥに関連しているとされていた（Ｎａｍｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ；３７：９－１７；Ｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；９：１６６１；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｐｌａｃｅｎｔａ；３７：１９－２５；Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１５０：４５２－４６２；及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ；１８：２９３７－２９４４）。ｑＰＣＲ分析は、２０のうち１９の遺伝子がＰＥにおいて有意に改変されていることを確認した（図２４Ｃ、表９）。著しくは、これらの遺伝子の４０％は、細胞外又は分泌されたタンパク質産物をコードする。さらに、ほぼ全ての遺伝子が、細胞外基質（ＥＣＭ）再構築、妊娠期間、胎盤／胎児発達、血管新生、及び低酸素応答を含むＰＥ関連過程に関与している（表１０）。これらの転写産物の６７％が、胎盤及び／又は胎児によって発現された（図２４Ｄ）。残りの母体で発現した転写産物において、心血管及び免疫機能がよく表された（表１０）。これらの遺伝子の階層的クラスタリングは、９８％の感度及び９７％の特異度で、ＰＥ及び対照試料を効果的に分離した（図２４Ｅ）。興味深いことに、２つの誤同定された対照についての臨床データは、これらの対照による高血圧の薬の使用によって示唆されるように、潜在的に交絡する健康問題を示した（表７）。

【0148】

ｉＰＣにおいて同定された遺伝子を用いて、独立したバイオバンクから入手された試料のコホートをクラスタリングする能力を評価した－Ｐｒｅ－Ｅｃｌａｍｐｓｉａ及びＧｒｏｗｔｈ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｓｔｕｄｙ（ＰＥＡＲＬ；ＮＣＴ０２３７９８３２；図２３Ｂ及び２３Ｃ、表１１）。このコホートは、妊娠期間を適合させた対照と共に、早発型ＰＥ（３４週未満で診断された）；及び遅発型ＰＥからなっていた。早発型ＰＥ試料は、８３％の感度及び９２％の特異度で、適合対照から別々にクラスタリングされ、これらの転写産物の関連性をさらに検証した（図２４Ｆ）。対照的に、遅発型ＰＥ及び適合対照試料についてのクラスタリングは観察されなかった（図２４Ｇ）。

【0149】

次に、ｉＰＣデータを用いて、ＰＥ試料のロバストな分類のためのＡｄａＢｏｏｓｔモデルを構築した。新たな試料を正確に予測し得る一般化機械学習モデルを生成するために、単一のデータセットとの過剰適合を回避する厳密な手法を使用し、モデル構築に使用されない試料を用いて最終的な分類子を検証した（図３０Ａ～３０Ｄ及び図３１Ａ～３１Ｅ）。意外にも、最終的なモデルは、７つの遺伝子のみを用い、そのうちの３つは、以前に報告されていない（図２５Ａ）。全ｉＰＣコホートについて、このモデルは、極めて高い正確性で試料を分類した（ＡＵＣ＝０．９９、感度＝９８％、特異度＝９９％；図２５Ｂ及び２５Ｃ、青色）。早発型ＰＥ ＰＥＡＲＬ試料も正確に分類された（ＡＵＣ＝０．８８、感度＝１００％、特異度＝８３％；図２５Ｂ及び２５Ｃ、ピンク色）。予想外にも、遅発型ＰＥ ＰＥＡＲＬ試料も、妥当な正確性で分類された（ＡＵＣ＝０．７４、感度＝７５％、特異度＝６７％；図２５Ｂ及び２５Ｃ、緑色）。

【0150】

この遺伝子セットは、差次的存在量分析によって同定された転写産物と非常に一致していた（図２５Ｄ；表１０）。分類子は、胎盤で及び母体で発現した転写産物の両方に依存していた（図２５Ｅ）。モデルによって使用される全ての遺伝子は、細胞外又は膜結合性のいずれかであるタンパク質産物を形成する。ＡｄａＢｏｏｓｔによって選択される少数の遺伝子にもかかわらず、多様なＰＥ関連機能、特に、心血管機能及び血管新生、免疫調節、胎児発達、及びＥＣＭ再構築が観察された。

【0151】

方法
前向き臨床試料採取。良き臨床上の基準（Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）についての医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）に準拠して、Ｉｌｌｕｍｉｎａが後援する臨床試験プロトコルにおいて、妊娠患者を採用した。インフォームド・コンセントの後、ＡＣＯＧガイドラインにしたがって定義される重度の特徴を有する妊娠３４週以前に妊娠高血圧腎症の診断を受けた４０人の妊婦から、２０ｍＬの全血試料を採取した（表６）。７６人の健康な妊婦からの試料も採取し、妊娠高血圧腎症群に妊娠期間を適合させた。３つの対照試料が、採血後に後期妊娠高血圧腎症を発症し、データ分析から除外された。詳細な選択及び除外基準については、表６を参照されたい。患者病歴、治療及び出産結果情報も記録した（表７）。

【0152】

テキサス大学医学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ）（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）、タフツ医療センター（Ｔｕｆｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、コロンビア大学アービングメディカルセンター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｒｖｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ウィンスロップ大学病院（Ｗｉｎｔｈｒｏｐ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｍｉｎｅｏｌａ，ＮＹ）、セントピーターズ大学病院（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒ’ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）、クリスティアナケア（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎａ Ｃａｒｅ）（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）、ラトガーズ大学ロバートウッドジョンソンメディカルスクール（Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｗｏｏｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）及びニューヨーク長老派教会病院／クイーンズ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ／Ｑｕｅｅｎｓ）（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含む８つの異なる臨床場所にわたって患者を採用した。臨床プロトコル及びインフォームド・コンセントは、各臨床場所の治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）によって承認された。臨床場所にわたる患者分布については表８を参照されたい。

【0153】

ＰＥＡＲＬ検証コホート試験設計。Ｉｌｌｕｍｉｎａは、妊娠高血圧腎症からの血漿試料を採取し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ試験（ＰＥＡＲＬ；ＮＣＴ０２３７９８３２）を、独立した検証コホートとして使用した。血漿試料を、試験が完了した後に採取した。ＰＥＡＲＬ試料を、主任研究員Ｅｍｍａｎｕａｌ Ｂｕｊｏｌｄ、ＭＤ、ＭＳｃと共に、ユニヴェルシテール・ド・ケベック総合病院（Ｃｅｎｔｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ ｄｅ Ｑｕｅｂｅｃ）（ＣＨＵ ｄｅ Ｑｕｅｂｅｃ）において採取した。４５人の対照妊婦及び４５人の症例妊婦の群を、この試験に採用し、書面によるインフォームド・コンセントを、全ての患者について得た。１８歳を超える参加者のみが適格であり、全ての妊婦は単胎妊娠であった。

【0154】

妊娠高血圧腎症群。妊娠高血圧腎症の基準は、２０～４１週の妊娠期間の採用を含め、妊娠高血圧腎症のためのＳｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ ｏｆ Ｃａｎａｄａ（ＳＯＧＣ）Ｊｕｎｅ ２０１４基準に基づいて定義された。血液試料を、診断時に１回採取した。

【0155】

対照群。妊娠期間１１～１３週の、正常な妊娠を有すると予測された４５人の妊婦を採用した。各登録患者を、出産まで妊娠中を通じて４つの時点で採取される血液により縦断的に追跡した。対照女性を、３つのサブグループに分け、その後のフォローアップ採血は、妊娠中を通じて妊娠期間の全体範囲をカバーするように時間をずらした（表５）。

【0156】

ＰＥＡＲＬ対照試料を、２つの目的のために使用した。４５人の個体女性からの１５３の縦断的な試料を用いて、妊娠中を通じて胎盤動態をモニターした。さらに、対照試料を、妊娠高血圧腎症コホートとの比較のために選択し、対照試料は、妊娠期間について適合され、モデルを検証するのに使用される。

【0157】

試験試料処理。Ｉｌｌｕｍｉｎａ前向き採取からの全ての試料及びＰＥＡＲＬ試料を、病態を知らされていない調査者によって同様に処理した。患者当たり２つの管の血液を、製造業者の指示にしたがって、Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ管（Ｓｔｒｅｃｋ）中に採取した。血液試料を貯蔵し、室温で一晩輸送し、７２時間以内に処理した。血液を、室温で２０分間にわたって１，６００×ｇで遠心分離し、血漿を新しい管に移し、１６，０００×ｇでさらに１０分間遠心分離して、残存細胞を除去した。血漿を、使用するまで約８０℃で貯蔵した。循環ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがって、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、続いてＤＮＡｓｅ Ｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、４．５ｍＬの血漿から抽出した。

【0158】

ｃＤＮＡ合成及びライブラリー作製。循環ＲＮＡを、９４℃で８分間断片化した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｔｕｍｏｒ １７０ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ランダム六量体プライミングｃＤＮＡ合成を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリー作製を、ＲＮＡのためのＴＳＴ１７０ Ｔｕｍｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔにしたがって行い、低いＲＮＡインプットに対応するように以下の変更を加えた。全ての反応を、元の体積の２５％まで減少させ、ライゲーションアダプターを、１０分の１の希釈で使用した。ライブラリー品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｚｙｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）において高感度ＤＮＡ分析キットを用いて評価した。

【0159】

全エクソームエンリッチメント。シーケンシングライブラリーを、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量し、２００ｎｇのインプットに対して正規化し、エンリッチメント反応当たり４つの試料にプールした。全エクソームエンリッチメントを、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｇｕｉｄｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にしたがって行った。ヘモグロビン遺伝子ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、及びＨＢＢに対して設計された５’ビオチンを欠くさらなるブロッキングオリゴが、シーケンシングライブラリーにおけるこれらの遺伝子のエンリッチメントを低減するために、エンリッチメント反応に含まれていた。最終的なエンリッチメントライブラリーを、Ｑｕａｎｔ－ＩＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量し、正規化し、試料当たり４０００万のリードの最小深度のために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００プラットフォームにおけるペアエンド５０×５０シーケンシングのためにプールした。

【0160】

データ分析。特に断りのない限り、全ての統計試験は、両側であった。データが正規分布していない場合、ノンパラメトリック検定を使用した。シーケンシングリードを、ｔｏｐｈａｔ（ｖ２．０．１３）によりヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）にマッピングし、転写産物存在量を、ＲｅｆＧｅｎｅ座標（１０／２７／２０１４に取得した）に対してｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（サブリード－１．４．６）により定量した。組織発現データを、Ｂｏｄｙ Ａｔｌａｓ（ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅ，ＢａｓｅＳｐａｃｅ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ）から入手した（Ｋｕｐｅｒｓｈｍｉｄｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５；１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１３０６６）。胎盤又は胎児組織（脳、肝臓、肺、及び甲状腺）のいずれかにおける全ての組織にわたる中央発現より２倍以上高い発現を有するｖ遺伝子を、該当する群に割り当てた。細胞内局在性を、ＵｎｉＰｒｏｔから得た。

【0161】

２５％未満の試料においてＣＰＭ≦０．５を有する遺伝子の除外の後、発現差異解析を、ｅｄｇｅＲ（ｖ３．２０．９）を用いてＲ（ｖ３．４．２）において行った。データセットを、ＴＭＭ方法によって正規化し、差次的に豊富な遺伝子を、ｌｏｇ倍率変化≧１についてｇｌｍＴｒｅａｔ試験、続いてボンフェローニ－ホルムｐ値補正によって同定した。置換なしでランダムサンプリングによって選択された各群における試料の９０％を用いて、同じプロセスを各ジャックナイフ法反復に使用した。１，０００回のジャックナイフ法の反復の後、遺伝子ワイズｐ値のための片側９５％信頼区間を、ｓｔａｔｓｍｏｄｅｌｓ（ｖ０．８．０）により計算した。階層的クラスタリング分析を、平方ユークリッド距離及び平均連結を用いて行った。

【0162】

ＡｄａＢｏｏｓｔを、ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ（ｖ０．１９．１、ｓｋｌｅａｒｎ．ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ＡｄａＢｏｏｓｔＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ）と共にｐｙｔｈｏｎにおいて行った。最適ハイパーパラメータ値（９０の推定量、１．６の学習率）を、マシューズ相関係数を用いて、グリッド検索によって決定して、性能を定量した。全体的なＡｄａＢｏｏｓｔモデル開発戦略は、図３１Ａ～３１Ｅに示される。データセット（２５％未満の試料においてＣＰＭ≦０．５を有する遺伝子のＴＭＭ正規化されたｌｏｇ ＣＰＭ値）を、分類子をフィットさせる前に、標準化した（ｓｋｌｅａｒｎ．ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＳｔａｎｄａｒｄＳｃａｌｅｒ）。トレーニングデータにおける同じスケーラーフィットを、対応するテストデータセットに適用し；５つのトレーニングデータセットのための全ての５つのスケーラーを、最終的なモデルでの使用のために平均した。ｄｅｃｉｓｉｏｎ＿ｆｕｎｃｔｉｏｎスコアを用いて、ＲＯＣ曲線を構築し、試料分類を決定した。

【0163】

ＲＴ－ｑＰＣＲ検証アッセイ及び分析。Ｃ－ＲＮＡを単離し、ランダムに選択された、１９の妊娠高血圧腎症（ＰＥ）及び１９の適合対照試料からの２ｍｌの血漿からｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを、１６サイクルにわたってＴａｑＭａｎ Ｐｒｅａｍｐ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ｃａｔ：４４８８５９３）を用いて前増幅し、５００μＬの最終体積になるまで１０倍に希釈した。ｑＰＣＲについては、製造業者の指示を用いて、反応混合物は、５μＬの希釈された前増幅されたｃＤＮＡ、１０μＬのＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ｃａｔ：４３６９５４２）、１μＬのＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ、及び４μＬの水を含有していた。各ＴａｑＭａｎプローブ（表９）については、希釈されたｃＤＮＡ試料当たり３つのｑＰＣＲ反応を行い、Ｃｑ値を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャソフトウェアを用いて決定した。各標的遺伝子についての遺伝子存在量を決定するために、ΔΔＣｑ＝２＾－（標的Ｃｑ－ｒｅｆ Ｃｑ_ａｖｇ）を、５つの基準遺伝子プローブ（ｒｅｆ Ｃｑ_ａｖｇ）の間の平均Ｃｑ値を用いて計算した。各プローブについての倍率変化（ＰＥ／ＣＴＲＬ）を決定するために、各試料についてのΔΔＣｑ値を、適合対照群についての平均ΔΔＣｑ値で除算した。

【0164】

管タイプ試験。循環ＲＮＡ品質に対する管タイプ及び一晩の輸送の影響を評価するために、以下の管タイプ：Ｋ２ ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＡＣＤ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＲＮＡ ＢＣＴ管（Ｓｔｒｅｃｋ）、及び１つのＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ管（Ｓｔｒｅｃｋ）において妊婦及び非妊婦から血液を採取した。８ｍＬの血液を各管に採取し、氷嚢上で一晩輸送するか（ＥＤＴＡ及びＡＣＤ）又は室温で輸送する（Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＲＮＡ及びＤＮＡ ＢＣＴ管）。全ての輸送される血液管を、採血の２４時間以内に血漿へと処理した。対照として、８ｍＬの血液を、Ｋ２ ＥＤＴＡ管中に採取し、その場で４時間以内に血漿へと処理し、ドライアイス上で血漿として輸送した。全ての血漿処理及び循環ＲＮＡ抽出を、方法の節に記載されるように行った。条件当たり３ｍＬの血漿を用いて、記載されるようなＩｌｌｕｍｉｎａプロトコルを用いて、エンリッチメントのためのシーケンシングライブラリーを作製した。

【0165】

再現性試験。血漿を、１０人の個体から採取し、各体積について３つの複製を伴い、４ｍＬ、１ｍＬ、及び０．５ｍＬの体積に分割した。循環ＲＮＡ抽出（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ）及びランダムプライミングｃＤＮＡ合成を、上述される全て試料において行った。４．５ｍＬの血漿インプットを用いたライブラリーについては、シーケンシングライブラリーを、上述されるＴＳＴ１７０ Ｔｕｍｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて作製した。１ｍＬ及び０．５ｍＬのインプットについて、Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ １Ｓ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ライブラリーを作製した。全エクソームエンリッチメント及びシーケンシングを、上述されるように用いて全ての試料において行った。

【0166】

説明
この試験は、早発型ＰＥに広く存在する差の同定に焦点を合わせ、これは、臨床的に実施可能なバイオマーカー発見の最終的な目標を補助する。これは、データにおいて観察される変動性を説明するために分析方法を調整することを必要とした。この変動は、Ｃ－ＲＮＡ測定におけるかなりの生物学的ノイズ並びにＰＥの表現型多様性の両方に由来する。Ｃ－ＲＮＡは、本質的に、単一の組織転写学より可変であり、これは、Ｃ－ＲＮＡが、全ての器官にわたる細胞死、シグナル伝達、及び遺伝子発現の組合せを表すためである。さらに、ＰＥは、様々な根底にある分子の原因に関連し得る広範囲の母体及び胎児結果を示す。除去される遺伝子が、ＰＥにおいて生物学的に関連し得る一方、それらは、コホートにおいて広く存在していない。興味深いことに、除外された転写産物が、ＰＥの分子サブセットを表し得る特定の女性において増加された。より大きいコホートは、Ｃ－ＲＮＡがＰＥサブタイプを明らかにし得るかどうかを解明するのに役立ち、これは、この条件の多様な病態生理学の理解にとって重要である。

【0167】

転写産物の最も広いセットを、ＡｄａＢｏｏｓｔによって同定した。この方法の成功は、独立した早発型ＰＥコホートの非常に正確な分類（ＰＥＡＲＬ）によって理解された。例えば慢性高血圧、妊娠糖尿病、又はアルポート症候群を有していた対照群（そのうちのいずれもＰＥを有すると誤同定されなかった）の女性を含む、かなり緩い選択及び除外基準で、様々な集団からこれらの試料を採取した。階層的クラスタリングと対照的に、遅発型ＰＥコホートからの２４人のうち１７人の個体を、この実施例の機械学習モデルによって適切に分類し、これは、早発型及び遅発型ＰＥが異なる条件であるという示唆を考えると意外であった。この実施例の知見は、全てのＰＥにおいて広く改変されるいくつかの経路が存在し得ることを示唆している。

【0168】

全ての評価において、Ｃ－ＲＮＡは、胎盤、胎児、及び母体で発現した転写産物の変化を示した。ＰＥ試料において観察された最も著しい傾向の１つは、機能不全の絨毛外栄養膜浸潤及びこの疾患における母体血管特性の再構築を伴う、無数のＥＣＭ再構築及び細胞移動／浸潤タンパク質（ＦＡＭ１０７Ａ、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＴＩＭＰ４、ＡＤＡＭＴＳ１、ＰＲＧ２、ＴＩＭＰ３、ＬＥＰ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＺＥＢ１、ＨＳＰＡ１２Ｂ）の増加した存在量である。早発型ＰＥの母方が心血管機能障害、炎症、及び早産（ＰＮＭＴ、ＺＥＢ１、ＣＲＨ）として現れ、これらは全て、この実施例のデータにおける異常な挙動の分子的兆候を示す。

【0169】

【表13】

【0170】

【表14】

【0171】

【表15】

【0172】

【表16】

【0173】

【表17】

【0174】

【表18】

【0175】

【表19】

【0176】

本明細書に引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物、及び電子的に利用可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。刊行物で参照される補足資料（補足表、補足図、補足材料及び方法、並びに／又は補足実験データなど）も同様に、それらの全体が参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示との間に何らかの不一致が存在する場合、本出願の開示が適用されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にするためにのみ与えられたものである。不必要な限定は、それらから理解されるべきではない。本開示は、図示され、説明された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形例が特許請求の範囲によって定義される開示内に含まれる。

【0177】

特に断らない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、特に断らない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に均等論を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数字を考慮して、通常の四捨五入技法を適用することによって解釈されるべきである。

【0178】

本開示の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、全ての数値は、本質的に、各々の試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる範囲を含む。

【0179】

全ての見出しは読者の便宜のためであり、そのように指定されない限り、見出しに続く文章の意味を限定するために使用されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】