(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-21
(45)【発行日】2023-08-29
(54)【発明の名称】照射による自己組織化ペプチドの滅菌
(51)【国際特許分類】
A61K 41/17 20200101AFI20230822BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20230822BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230822BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20230822BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230822BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230822BHJP
A61L 2/08 20060101ALN20230822BHJP
A61L 2/00 20060101ALN20230822BHJP
A61L 27/22 20060101ALN20230822BHJP
A61M 5/00 20060101ALN20230822BHJP
【ＦＩ】
A61K41/17
A61K38/00 ZNA
A61K38/10
A61P7/04
A61P17/02
A61P9/10
A61L2/08
A61L2/00
A61L27/22
A61M5/00
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2022559333
(86)(22)【出願日】2021-03-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-22
(86)【国際出願番号】 US2021024954
(87)【国際公開番号】W WO2021202577
(87)【国際公開日】2021-10-07
【審査請求日】2023-02-10
(31)【優先権主張番号】63/002,882
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】505043041
【氏名又は名称】株式会社スリー・ディー・マトリックス
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】リウー， マリカ ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ギル， ユン ソク
(72)【発明者】
【氏名】アレクシ， エルトン
(72)【発明者】
【氏名】山本 直毅
【審査官】六笠 紀子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１７２９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１５７９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３２４１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０５２９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００１８４６３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５３０８４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１６４１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１８７６１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Micromachines，2020年03月06日，11，273, page1-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ４１／１７
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）溶液を滅菌する方法であって、（ａ）自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置する工程であって、前記自己組織化ペプチドが、ＲＡＤＡ１６（配列番号１）、またはＩＥＩＫ１３（配列番号３）であり、かつ、前記自己組織化ペプチドが、ほぼ中性のｐＨで生体組織に適用したときにヒドロゲルを形成することが可能である、前記１つまたは複数の容器を前記照射機内に配置する工程、および
（ｂ）前記ペプチドの実質的な分解なしに、事前に決定された無菌性保証水準（ＳＡＬ）まで前記自己組織化ペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に前記１つまたは複数の容器を曝露する工程であって、その所望の生物学的または物理的特性が実質的に同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、照射後の前記溶液中の完全長ペプチドの分解生成物の濃度が、０．１％～５％の範囲である、前記１つまたは複数の容器を曝露する工程
を含み；
前記所望の生物学的または物理的特性が、止血性、抗接着、再出血の予防、抗狭窄、組織閉鎖、粘膜亢進、創傷治癒、貯蔵弾性率、粘度、および組織空隙充填特性からなる群より選択され、
前記自己組織化ペプチドがＲＡＤＡ１６（配列番号１）である場合に、前記所定の線量が１０～２５ｋＧｙであり、
前記自己組織化ペプチドがＩＥＩＫ１３（配列番号３）である場合に、前記所定の線量が１０～４０ｋＧｙである、方法。
【請求項2】
前記自己組織化ペプチドが約１．３ｗ／ｖのＩＥＩＫ１３（配列番号３）である場合に、前記所定の線量が１５～４０ｋＧｙである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記溶液が、電子線により照射される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ペプチド溶液が、ＲＡＤＡ１６（配列番号１）を約２．５％ｗ／ｖ含有し、前記所定の線量が、１５～２４ｋＧｙである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記照射後の分解された全ペプチドの量が、前記照射前の前記自己組織化ペプチドの量の２０重量％を超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記自己組織化ペプチド溶液の照射前生物汚染度が、生成物単位当たり９ＣＦＵまたはそれよりも少ない、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
照射線量が、少なくとも１０－６の無菌性保証水準（ＳＡＬ）を実現する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
照射前および後の前記溶液のｐＨが、約１．８～３．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記１つまたは複数の容器が、プラスチックシリンジ（複数可）である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ヒドロゲルの貯蔵弾性率が、照射後に少なくとも１０％増大している、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
ｃ）前記溶液を剪断して、その貯蔵弾性率を低減させるかまたは回復させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記自己組織化ペプチド溶液が、８３６／１６７０、１１００、および１５１３ｍ／ｚで主要Ｍｚピークを有する照射後質量分析（ＭＳ）プロファイルを示す、請求項１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権
本出願は、２０２０年３月３１日に出願された米国仮出願第６３／００２，８８２号に対する優先権を主張する。
本出願は、２０２０年３月３１日に出願された米国仮出願第６３／００２，８８２号に対する優先権を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、ある特定の医療用ゲル、より詳細には、いわゆる自己組織化ペプチドを含有するゲルの、滅菌に関する。
本発明は、ある特定の医療用ゲル、より詳細には、いわゆる自己組織化ペプチドを含有するゲルの、滅菌に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
自己組織化ペプチド（「ＳＡＰ」と省略されることもある）は、水性環境におかれたときおよび周囲条件の化学的または物理的変化が生じたとき、高度に組織化されたナノ構造に自発的に組織化するペプチドのタイプである。１つのその他の周知の構造は、天然コラーゲンにより形成されたナノ繊維バイオポリマー構造である。本発明に関係のあるクラスのＳＡＰは、ベータシートを形成することが可能な、交互になった親水性および疎水性のアミノ酸残基からなる。それらは、中性水中で、十分に秩序だったナノ構造に自律的に組織化し、一方でそれらは、高剪断力がそれらに加えられたときに個々の分子に一時的に分解し得る。ＳＡＰは、ｐＨおよび／または質量オスモル濃度などのその環境に応じてヒドロゲル（ＳＡＰゲルとしても公知である）を形成することができ；例えば、中性ｐＨ付近の体内におかれたときにヒドロゲルを形成することが可能である。ＳＡＰゲルは、様々な医療適用、例えば創傷治癒の改善、恒常性の誘発；特に外科手術の文脈での内部組織における癒着の低減；一時的な組織－空隙マトリクス充填剤としてそのような空隙への天然組織の内殖の促進のために、使用されることがこれまで記載されてきた。特定のＳＡＰは、米国特許第５，６７０，４８３号；第５，９５５，３４３号；第９，７２４，４４８号；第１０，５９６，２２５号、および国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１３６０８１；およびそれらの外国での等価物に記載されている。
自己組織化ペプチド（「ＳＡＰ」と省略されることもある）は、水性環境におかれたときおよび周囲条件の化学的または物理的変化が生じたとき、高度に組織化されたナノ構造に自発的に組織化するペプチドのタイプである。１つのその他の周知の構造は、天然コラーゲンにより形成されたナノ繊維バイオポリマー構造である。本発明に関係のあるクラスのＳＡＰは、ベータシートを形成することが可能な、交互になった親水性および疎水性のアミノ酸残基からなる。それらは、中性水中で、十分に秩序だったナノ構造に自律的に組織化し、一方でそれらは、高剪断力がそれらに加えられたときに個々の分子に一時的に分解し得る。ＳＡＰは、ｐＨおよび／または質量オスモル濃度などのその環境に応じてヒドロゲル（ＳＡＰゲルとしても公知である）を形成することができ；例えば、中性ｐＨ付近の体内におかれたときにヒドロゲルを形成することが可能である。ＳＡＰゲルは、様々な医療適用、例えば創傷治癒の改善、恒常性の誘発；特に外科手術の文脈での内部組織における癒着の低減；一時的な組織－空隙マトリクス充填剤としてそのような空隙への天然組織の内殖の促進のために、使用されることがこれまで記載されてきた。特定のＳＡＰは、米国特許第５，６７０，４８３号；第５，９５５，３４３号；第９，７２４，４４８号；第１０，５９６，２２５号、および国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１３６０８１；およびそれらの外国での等価物に記載されている。
【0004】
滅菌は、自己組織化ペプチド溶液を含むほとんどのバイオマテリアルの製造プロセスにおいて、非常に重要なステップである。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６＝Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２＝配列番号１；約２．５％）は、滅菌のため習慣的に濾過され（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／００８４００参照）；しかしながら、より高い濃度でのＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の粘度は、その濾過の主な障害であり、管材中での損失に加えて実質的なペプチド損失をもたらす。この滅菌のための方法では、平均孔径が０．２２μｍの滅菌フィルターである多孔質フィルターにＳＡＰの溶液を強制的に通す（米国特許出願第２０１５／０１９７３５号）。別の方法として、一部の熱的に安定な自己組織化ペプチド溶液を、約１２１℃で約２５分間のオートクレーブ処理によって滅菌することができる（米国特許出願第１０／３６９，２３７号）。
【0005】
さらに、追加のエチレンオキシド滅菌ステップが、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）製品の外側部分に関して必要とされる。さらにオートクレーブ処理は、その完全な熱分解により、溶液中のＲＡＤＡ１６などのいくつかのＳＡＰに使用できないことが発見された（米国特許出願公開第２０１７／０２０２９８６号）。このように、別の新しい滅菌法が、特にＲＡＤＡ１６およびその他のＳＡＰに関して損失を低減させるのに必要とされている。
【0006】
ちなみに、ＲＡＤＡ１６を含む自己組織化ペプチドのガンマ照射滅菌が先の刊行物（米国特許出願公開第２０１６／０３１７６０７号；段落［００５２］）に記載されているが；具体的な条件についても、ＲＡＤＡ１６を含む自己組織化ペプチドの構造および特性に対する照射の実際の効果についても、これまで記載されてこなかった。事実、ペプチド構造は、ガンマ線、Ｘ線および電子線などの照射によって発生した反応性ラジカル種によって変化する可能性がある。そのような構造変化は、アミノ酸組成、反応性残基の位置、およびおそらくは各高分子により獲得されたコンフォメーションを含む複数の要因によって、支配される可能性がある（Ｖｉｅｉｒａ Ｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２０１３， ３６（４） ６６４－６７５）。例えば、その文献におけるペプチドの種々の配列とは無関係に、全ての試験された９種のペプチドは、１５ｋＧｙまでのガンマ線照射により進行性の分解を示した。１５ｋＧｙよりもさらに高い照射線量が滅菌プロセスに必要とされ得ることを考慮すれば、数多くのペプチドは、実質的な分解なしにガンマ線照射によって滅菌することができない。芳香族アミノ酸（即ち、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびプロリン（Ｐ））ならびに硫黄含有アミノ酸（即ち、システイン（Ｃ））の側鎖は、反応性ラジカル種による攻撃に対して特に脆弱であることが周知である（Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２， ７９７－８２１ （１９９３）およびＶｉｅｉｒａ Ｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２０１３， ３６（４） ６６４－６７５）。背景技術によれば、下記のＳＡＰ：ＲＡＤＡ１６（Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１））、ＫＬＤ１２（Ａｃ－ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ－ＮＨ２（配列番号２））、およびＩＥＩＫ１３（Ａｃ－ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ－ＮＨ２（配列番号３））は、芳香族アミノ酸または硫黄含有アミノ酸を含まない。
【0007】
一方、照射滅菌は、自己組織化ペプチドの二次構造およびその繊維構造に影響を及ぼす可能性もある。記載されているように、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２およびＩＥＩＫ１３はベータシートコンフォメーションを有し、これらの分子は自己組織化して、秩序だったナノ繊維構造を形成する。照射滅菌プロセスは、潜在的に、二次構造およびペプチドのナノ繊維構造を変化させる可能性があり、次いでそのレオロジー特性の望ましくない変化をもたらす可能性がある。
【0008】
したがって、自己組織化ペプチドと共に有利に作用する新しい滅菌法の必要性が存在する。以上に述べた理由のため、照射による滅菌はこれまで回避されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】米国特許第５，６７０，４８３号明細書
【文献】米国特許第５，９５５，３４３号明細書
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｖｉｅｉｒａ Ｒ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２０１３， ３６（４） ６６４－６７５
【文献】Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２， ７９７－８２１ （１９９３）
【図面の簡単な説明】
【0011】
【0012】
【図2-1】図２。４０ｋＧｙでガンマ照射する前（Ａ）およびガンマ照射した後（Ｂ）、ならびに１２１℃で２０分間オートクレーブした後（Ｃ）の、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の質量スペクトル。
【図2-2】同上。
【0013】
【0014】
【0015】
【図5-1】図５。（Ａ）照射前；（Ｂ）４０ｋＧｙでガンマ照射した後；（Ｃ）２５ｋＧｙでＸ線照射した後；（Ｄ）４０ｋＧｙでＸ線照射した後；（Ｅ）２５ｋＧｙで電子線照射した後；および（Ｅ）４０ｋＧｙで電子線照射した後の、ＩＥＩＫ１３ １．３％の質量スペクトル。
【図5-2】同上。
【図5-3】同上。
【0016】
【図6-1】図６。（Ａ）照射前；（Ｂ）２３ｋＧｙでガンマ照射した後；（Ｃ）２５ｋＧｙでＸ線照射した後、（Ｄ）４０ｋＧｙでＸ線照射した後、（Ｅ）２５ｋＧｙで電子線照射した後、および（Ｆ）４０ｋＧｙで電子線照射した後の、ＱＬＥＬ１２ ０．１５％の質量スペクトル。
【図6-2】同上。
【図6-3】同上。
【図6-4】同上。
【0017】
【0018】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明の概要
本開示では、自己組織化ペプチド溶液に対する、照射による滅菌の効果を、特に下記のペプチド：ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２、ＲＡＤＡ１６（配列番号１）、ＩＥＩＫ１３（Ａｃ－ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ－ＮＨ２（配列番号３））、およびＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４））を用いて評価した。ガンマ照射滅菌は、予想された顕著な分解なしに、ある特定の自己組織化ペプチド溶液およびヒドロゲルのレオロジー特性を高め、一方、ある特定のその他のペプチドは、予測される著しい分解および粘度の降下をガンマ照射後に示し（即ち、ＲＡＤＡ１６およびＩＥＩＫ１３とは異なり）、一方、例えば別の自己組織化ペプチド、ＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４）は、照射後に著しく分解されたことを、予期せず見出した。本発明はさらに、同じ結果を、少なくともそれぞれのペプチドに関して、特にＸ線および電子線を含むその他の類似の照射滅菌法で期待できるという、予言的知見に基づく。このように、一部の実施形態では、自己組織化ペプチド溶液を滅菌する方法は：
ａ） ほぼ中性のｐＨで生体組織に適用したときにヒドロゲルを形成することが可能な自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置すること；および
ｂ） その所望の生物学的および／またはレオロジー特性（複数可）が同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、ペプチドの実質的な分解なしにペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に容器を曝露すること
を含む。
本開示では、自己組織化ペプチド溶液に対する、照射による滅菌の効果を、特に下記のペプチド：ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２、ＲＡＤＡ１６（配列番号１）、ＩＥＩＫ１３（Ａｃ－ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ－ＮＨ２（配列番号３））、およびＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４））を用いて評価した。ガンマ照射滅菌は、予想された顕著な分解なしに、ある特定の自己組織化ペプチド溶液およびヒドロゲルのレオロジー特性を高め、一方、ある特定のその他のペプチドは、予測される著しい分解および粘度の降下をガンマ照射後に示し（即ち、ＲＡＤＡ１６およびＩＥＩＫ１３とは異なり）、一方、例えば別の自己組織化ペプチド、ＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４）は、照射後に著しく分解されたことを、予期せず見出した。本発明はさらに、同じ結果を、少なくともそれぞれのペプチドに関して、特にＸ線および電子線を含むその他の類似の照射滅菌法で期待できるという、予言的知見に基づく。このように、一部の実施形態では、自己組織化ペプチド溶液を滅菌する方法は：
ａ） ほぼ中性のｐＨで生体組織に適用したときにヒドロゲルを形成することが可能な自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置すること；および
ｂ） その所望の生物学的および／またはレオロジー特性（複数可）が同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、ペプチドの実質的な分解なしにペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に容器を曝露すること
を含む。
【0022】
一部の実施形態では、ペプチドは、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３からなる群より選択される。関連する実施形態では、そのようなペプチドは、これらのペプチドの生物学的特性の実質的な劣化および／または実質的な負の変化なしに、１５～５０ｋＧｙ、好ましくは１５～４０ｋＧｙの線量、より好ましくは所望の無菌性保証水準（ＳＡＬ）をもたらす最小線量に、曝露される。一部の実施形態ではペプチド溶液は、ガンマ線、Ｘ線、または電子線によって照射される。一部の実施形態では、照射後の溶液中の総ペプチドの全体的な分解は、照射前のペプチドの量の２０％を超えず、より好ましくは１０％、最も好ましくは５％を超えない。一部の実施形態では、所望の生物学的または物理的特性（複数可）は：止血性（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ）、抗接着、再出血の予防、抗狭窄、組織閉塞、貯蔵弾性率（例えば、一部の実施形態では、照射後にゲル化溶液の貯蔵弾性率が少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％増大する）、および粘度からなる群より選択され、組織空隙充填特性は、照射後に、許容されるまたは改善されたパラメーターの範囲内で維持される。一部の実施形態では、照射線量は、少なくとも１０－５、好ましくは１０－６、またはそれよりも低い無菌性保証水準（ＳＡＬ）を実現する。他の実施形態では、以下に実施例で記載する生物汚染度試験を使用して、照射前のペプチド溶液の許容される汚染レベルは、１０００、５００、１００、１５、１０、９、５、２、１．５、１ＣＦＵ、またはそれよりも低い。一部の実施形態では、照射後の溶液中のインタクトな（「主要」または「完全長」）ペプチドの分解生成物の濃度は、０．１％～５％の範囲である。一部の実施形態では、照射後のペプチド溶液のｐＨは、約１．８～３．５の範囲である。一部の実施形態では、溶液の容器が、アダプターノズルを持つまたは持たないプラスチックシリンジである。そのような実施形態では、パッケージのプラスチックおよびゴムの部分もそれらの所望の物理的特性を維持することが確実になるように注意を払う。プラスチックシリンジのある程度の黄変が予測される可能性がありそれが普通であるが、ゴム引きされたあらゆる材料は、そのｅプラスチック特性を許容されるレベルで保存すべきである。
【0023】
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、その貯蔵弾性率が低減されるかまたは回復されるように、さらに剪断（ｓｈｅｅｒｉｎｇ）に供される。
【0024】
したがって本発明は、自己組織化ペプチドに関する滅菌法を提供する。本発明の方法によれば、一部の実施形態では、例えば外科手術中または出血を伴う外傷後に、生体組織に溶液をさらに適用する。
【0025】
本発明の詳細な説明
上述のように、本開示では、自己組織化ペプチド溶液に対する照射による滅菌の効果を、特に下記のペプチド：ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１）；ＲＡＤＡ１６）、ＩＥＩＫ１３（Ａｃ－ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ－ＮＨ２（配列番号３））、およびＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４））を用いて評価した。一部の実施形態では、自己組織化ペプチド溶液を滅菌する方法は：
ａ） ほぼ中性のｐＨで生体組織に（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕで）適用させたときにヒドロゲルを形成することが可能な自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置すること；および
ｂ） その所望の生物学的および／または物理的特性（複数可）が実質的に同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、ペプチドの実質的な分解なしに、事前に決定された無菌性保証水準（ＳＡＬ）までペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に容器を曝露すること
を含む。
上述のように、本開示では、自己組織化ペプチド溶液に対する照射による滅菌の効果を、特に下記のペプチド：ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１）；ＲＡＤＡ１６）、ＩＥＩＫ１３（Ａｃ－ＩＥＩＫＩＥＩＫＩＥＩＫＩ－ＮＨ２（配列番号３））、およびＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４））を用いて評価した。一部の実施形態では、自己組織化ペプチド溶液を滅菌する方法は：
ａ） ほぼ中性のｐＨで生体組織に（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕで）適用させたときにヒドロゲルを形成することが可能な自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置すること；および
ｂ） その所望の生物学的および／または物理的特性（複数可）が実質的に同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、ペプチドの実質的な分解なしに、事前に決定された無菌性保証水準（ＳＡＬ）までペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に容器を曝露すること
を含む。
【0026】
ガンマ照射滅菌は、いかなる顕著な分解も引き起こすことなく、ある特定の自己組織化ペプチド溶液およびヒドロゲルのレオロジー特性を高め、一方、ある特定のその他のペプチドは、著しい分解および粘度の降下をガンマ照射後に示し、即ち、ＲＡＤＡ１６およびＩＥＩＫ１３とは異なり、別の自己組織化ペプチドＱＬＥＬ１２（Ａｃ－ＱＬＥＬＱＬＥＬＱＬＥＬ－ＮＨ２（配列番号４））は、照射後に著しく分解したことを、予期せず見出した。本発明はさらに、同じ結果を、少なくともそれぞれのペプチドに関して、特にＸ線および電子線を含むその他の類似の照射滅菌法で期待できるという、予言的知見に基づく。好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、所望の生物学的特性（複数可）、例えば、止血性、抗接着、再出血の予防、抗狭窄、組織閉塞、貯蔵弾性率、粘度、および組織空隙充填特性などを維持するかまたは改善する。例えば、一部の実施形態では、貯蔵弾性率は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、またはそれよりも多く増大する。そのような増大が、ある特定の適用で望ましくない場合、ゲルは、当技術分野で公知の方法による希釈または剪断によってさらに菲薄化され、それを溶液にするか、または他の方法でその貯蔵弾性率を低減させることができる。ある特定の実施形態では、照射されたＳＡＰの溶液は、透明であり粘稠なままである。
【0027】
一部の実施形態では、ＳＡＰは、式Ｉ～ＩＶ：
（（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ＋）ｘ（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ－）ｙ）ｎ （Ｉ）
（（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ－）ｘ（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ＋）ｙ）ｎ （ＩＩ）
（（Ｘａａ＋－Ｘａａｎｅｕ）ｘ（Ｘａａ－－Ｘａａｎｅｕ）ｙ）ｎ （ＩＩＩ）
（（Ｘａａ－－Ｘａａｎｅｕ）ｘ（Ｘａａ＋－Ｘａａｎｅｕ）ｙ）ｎ （ＩＶ）
の１つまたは複数に準拠するアミノ酸残基の配列を含み、
Ｘａａｎｅｕは、中性の電荷を有するアミノ酸残基を表し；Ｘａａ＋は、正電荷を有するアミノ酸残基を表し；Ｘａａ－は、負電荷を有するアミノ酸残基を表し；ｘおよびｙは、独立して、１、２、３、または４の値を有する整数であり；およびｎは、１～５の値を有する整数である。
（（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ＋）ｘ（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ－）ｙ）ｎ （Ｉ）
（（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ－）ｘ（Ｘａａｎｅｕ－Ｘａａ＋）ｙ）ｎ （ＩＩ）
（（Ｘａａ＋－Ｘａａｎｅｕ）ｘ（Ｘａａ－－Ｘａａｎｅｕ）ｙ）ｎ （ＩＩＩ）
（（Ｘａａ－－Ｘａａｎｅｕ）ｘ（Ｘａａ＋－Ｘａａｎｅｕ）ｙ）ｎ （ＩＶ）
の１つまたは複数に準拠するアミノ酸残基の配列を含み、
Ｘａａｎｅｕは、中性の電荷を有するアミノ酸残基を表し；Ｘａａ＋は、正電荷を有するアミノ酸残基を表し；Ｘａａ－は、負電荷を有するアミノ酸残基を表し；ｘおよびｙは、独立して、１、２、３、または４の値を有する整数であり；およびｎは、１～５の値を有する整数である。
【0028】
一部の実施形態では、ＳＡＰは、細胞外マトリクスと相互作用するアミノ酸配列をさらに含み、このアミノ酸配列は、ＳＡＰを細胞外マトリクスに係留する。
【0029】
一部の実施形態では、ＳＡＰ中のアミノ酸残基は、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。天然に存在するアミノ酸は、標準遺伝子コードによりコード化されたアミノ酸残基、ならびに非標準アミノ酸（例えば、Ｌ－立体配置の代わりにＤ－立体配置を有するアミノ酸）、ならびに標準アミノ酸の修飾により形成することができるようなアミノ酸（例えば、ピロリシンまたはセレノシステイン）を含むことができる。適切な天然に存在しないアミノ酸には、限定するものではないが、Ｄ－アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、Ｌ－シクロペンチルグリシン（Ｓ）－２－アミノ－２－シクロペンチル酢酸が含まれる。
【0030】
他の実施形態では、自己組織化し得る別のクラスの材料は、ペプチド模倣体である。本明細書で使用されるペプチド模倣体は、ペプチド構造を模倣する分子を指す。ペプチド模倣体は、その親構造、ポリペプチドに類似した一般的な特徴、例えば両親媒性を有する。そのようなペプチド模倣材料の例は、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０１（１２）， ３８９３－４０１２ （２００１）に記載されている。ペプチド模倣材料は、４つのカテゴリー：α－ペプチド、β－ペプチド、γ－ペプチド、およびδ－ペプチドに分類することができる。これらのペプチドのコポリマーも使用することができる。α－ペプチドのペプチド模倣体の例には、限定するものではないが、Ｎ，Ｎ’－連結オリゴ尿素、オリゴピロリノン、オキサゾリジン－２－オン、アザチド、およびアザペプチドが含まれる。β－ペプチドの例には、限定するものではないが、β－ペプチドフォルダマー、α－アミノキシ酸（ａｍｉｎｏｘｙ ａｃｉｄ）、硫黄含有β－ペプチド類似体、およびヒドラジノペプチドが含まれる。γ－ペプチドの例には、限定するものではないが、γ－ペプチドフォルダマー、オリゴ尿素、オリゴカルバメート、およびホスホジエステルが含まれる。δ－ペプチドの例には、限定するものではないが、アルケン系δ－アミノ酸およびカルボペプトイド（ｃａｒｂｏｐｅｐｔｏｉｄ）、例えばピラノース系カルボペプトイドおよびフラノース系カルボペプトイドが含まれる。
【0031】
ある特定の実施形態では、ＳＡＰは、Ａｒｃｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．により作製された、ＡＣ５（登録商標）、ＡＣ５－Ｖ（登録商標）、ＡＣ５－Ｇ（商標）、またはＡＣ１としても公知のＴＫ４５である（ｗｗｗ．ａｒｃｈｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ｃｏｍ参照）。
【0032】
一部の実施形態では、ＳＡＰ溶液は、「貯蔵および／または薬物送達システム」、例えば本明細書に記載されるペプチド組成物に適した貯蔵および／または送達システムなど、例えばバイアル、瓶、ビーカー、バッグ、シリンジ、アンプル、カートリッジ、リザーバ、またはＬＹＯ－ＪＥＣＴＳ（登録商標）に含有される。貯蔵および／または送達システムは、上記のものの中で１つになっている必要はなく、別個のものでもよい。特定の実施形態では、ＳＡＰは、約１０ｍｌ、約７．５ｍｌ、約５、約２．５、約１、または約０．５ｍｌのＳＡＰ溶液を含有するプラスチックシリンジで提供される。ある特定の実施形態では、プラスチック（例えば、プラスチックシリンジ）は、照射後に黄色がかった色合いを獲得していてもよく、これは通常のことであり、内部に含有されるＳＡＰ溶液の生物医学特性に影響を及ぼさない。
【0033】
一部の実施形態では、そのような貯蔵および送達システムは、「ノズル」をさらに含有していてもよく、これは、しばしば狭い端部および広い端部を備え、本明細書に記載される送達デバイス上に固定するよう適合された、一般に細い円筒状の物体を指す。一部の実施形態では、「ノズル」および「カニューレ」という用語は同義で使用される。ノズルは、２つの接続点または端部、即ち送達システム（例えば、シリンジ）に接続する第１の接続点または端部と、医薬組成物の送達が投与される点としてまたは二次デバイス（例えば、カテーテル）に接続される点として働き得る第２の接続点で構成される。
【0034】
このように本発明は、自己組織化ペプチドの滅菌溶液を作製する方法を提供する。本発明は、生体組織に例えばｉｎ ｓｉｔｕで、例えば外科手術中もしくは出血を伴う外傷後に適用するそのような滅菌溶液の使用、またはそのように滅菌された溶液の、その他の疾患もしくは状態の処置もしくは予防；例えば、国際特許出願ＷＯ２０１４／１３３０２７に記載されるようにまたは米国特許出願公開第２０１１／０２１０１５４１号に記載されるように、組織損傷の閉鎖部位に関して；または米国特許出願公開第２０１６／０２８７７４４号に記載されるように、血管塞栓術に関して；または米国特許出願第１６／０８５，８０３号に記載されるように、脳脊髄液漏出の閉鎖に関して、または国際特許公開出願番号ＷＯ２０１３／１３３４１４に記載されるように、粘膜促進剤（ｍｕｃｏｓａ ｅｌｅｖａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として；または国際特許公開出願番号ＷＯ２０１４／１４１１６０に記載されるように、胆汁漏出閉鎖に関して；または米国特許出願第１６／８８５，７５３号に記載されるように、組織の抗接着に関して；または米国特許出願第１６／０８５，８０４号に記載されるように、膵フィステル閉鎖に関して；または米国特許出願第１５／１２４，６３９号に記載されるように、気管支閉塞に関して；または国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／１３８，４７８に記載されるように、肺大気胞虚脱の処置に関して；または国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／０１９，７３８に記載されるように、肺漏出の処置に関して；または国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／１９６０２０に記載されるように、歯科的骨空隙（ｄｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｖｏｉｄ）の充填に関して；または米国特許出願公開第２０１７／０１２８６２２号に記載されるように、骨空隙の充填に関して；または米国特許出願第１６／３１２，８７８号に記載されるように、内視鏡的切除後の食道構造の予防に関して、および前述の刊行物のいずれかの外国での等価物、および当技術分野で公知のその他の方法における使用も提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、前述の疾患または状態を処置するかまたは予防するための、自己組織化ペプチドの滅菌溶液の使用であって、滅菌溶液が本発明の方法によって得られる、使用を提供する。ある特定のそのような実施形態では、自己組織化ペプチド溶液は、実質的に、図２～６の対応する照射後プロファイルで示される通りのおよび／または実施例に記載される通りの照射後質量分析（ＭＳ）プロファイルを示す。例えばＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の場合、追加の主なＭｚピークは、８３６／１６７０、１１００、および１５１３ｍ／ｚで観察される。
【0035】
平均生物汚染度＜１，０００ＣＦＵは、滅菌前のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の典型的な無菌性である。この場合、１０－６の無菌性保証水準ＳＡＬを実現するために、照射線量の範囲は、２５ｋＧｙ～４０ｋＧｙの間であるべきである。ガンマおよびＸ線法により、総ペプチドの最大約２０％が滅菌プロセス中に分解し得る。電子線法では、総ペプチドの最大約１０％が滅菌プロセス中に分解し得る。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）レオロジーは、ガンマ線、Ｘ線による滅菌後に増大し、このことは、その止血有効性を正にまたは負に変化させる可能性がある。しかしながらＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）レオロジーは、電子線滅菌後に変化しない。
【0036】
ある特定の実施形態では、以下の実施例で記載される生物汚染度試験を使用して、照射前のペプチド溶液の汚染の許容可能レベルは、生成物単位当たり＜１０００、＜５００、＜１００、＜１５、＜１０、＜９、＜５、＜２、＜１．５、＜１ＣＦＵ、またはそれより低くてもよい。滅菌前の好ましい生物汚染度は＜９ＣＦＵである。このように、９ＣＦＵより下では、照射線量の範囲は、１５ｋＧｙ～２４ｋＧｙの間で選択することができる。照射線量範囲の下端は、照射前生成物の生物汚染度により決定されてもよいが、その範囲の上端は、照射機の構成および選択に基づいて選択され、所望の無菌性保証水準（ＳＡＬ）を実現するのに必要な最小の値に設定される。
【0037】
ガンマおよびＸ線法により、ペプチドの最大１０％が滅菌プロセス中に分解し得る。電子線法では、ペプチドは、滅菌プロセス中に著しく分解しないと考えられる。この場合であっても、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）レオロジーは、ガンマ線およびＸ線滅菌後に増大し、その止血有効性を正にまたは負にいくらか変化させ得る。このようにＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）レオロジーは、電子線滅菌後に変化せず、したがって、レオロジー特性およびその止血特性の変化がないまたは最小限に抑えられることが望まれる場合、好ましいと考えられる。したがって電子線照射は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）に関して特に好ましいと考えられる。
【0038】
一部の実施形態では、照射後の溶液中の、分解した完全長ペプチド（「主要ペプチド」）の濃度は、０．１％～５％、０．１％～４％、０．１％～３％、０．１％～２．５％、０．１％～２％の範囲であり、または０．１％、もしくは１．５％、もしくはそれよりも低い。一部の実施形態では、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、またはＩＥＩＫ１３の場合、溶液は、その照射前生物汚染度に依存し得るが、例えば、１５～５０ｋＧｙ、２５ｋＧｙ＋／－１５ｋＧｙ、４０ｋＧｙ～１０ｋＧｙ、３５ｋＧｙ～１０ｋＧｙ、３０ｋＧｙ～１０ｋＧｙ、１５ｋＧｙ～２４ＫＧｙ、２５ｋＧｙ～１０ｋＧｙ、２０ｋＧｙ～１０ｋＧｙ、１０ｋＧｙ～１５ｋＧｙ、および１２ｋＧｙ～１４ｋＧｙなどの総線量で照射される。１２～１４ｋＧｙ程度の線量がガンマ照射に最適であるように見えるが、ペプチド溶液は、Ｘ線または電子線と同様の線量で照射されてもよい。
【0039】
一部の実施形態では、「貯蔵および／または薬物送達システム」、例えばブリスターパックに含有されるプラスチックシリンジは、少なくとも、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００単位またはそれよりも多くのバッチで一度に照射される。一般に、照射バッチにおける任意の試料の全曝露は、本明細書に記載されるように、好ましくは１００ｋＧｙ、より好ましくは６０ｋＧｙ、最も好ましくは５０ｋＧｙを超えない、またはそれよりも少ない。
【0040】
一部の実施形態では、照射後の主要ペプチドの分解（「完全長ペプチドの分解」とも呼ばれる）は、照射前のペプチドの量の２０％を超えず、好ましくは、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、５％、３％、または１％を超えない。一部の実施形態では、総線量は、溶液の必要な無菌性を達成するのに十分な時間をかけて達成される。例えば、４０ｋＧｙの線量は、放射線強度６．３ｋＧｙ／時にて約６時間２１分で送達することができる。その他の組合せは、実施例１に見出すことができる。一部の実施形態では、一定線量を数時間にわたり、例えば約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２時間送達した。
【0041】
一部の実施形態では、試料にガンマ線を、例えば約２３、約２５、約２８もしくは約４０ｋＧｙの線量、または上記にて示されるその他の線量で、例えばＧａｍｍａｃｅｌｌ ２２０（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ Ｒａｔｅ Ｃｏ－６０ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ、ＶＰＴｒａｄ（ｗｗｗ．ｖｐｔｒａｄ．ｃｏｍ；ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）などの機器により照射する。
【0042】
他の実施形態では、試料にＸ線を、約２５ｋＧｙ～約４０ｋＧｙの線量または上記にて示される線量で、Ｍｅｖｅｘ加速器（設定：１０ＭｅＶ、２０ｋＷで）により照射する。
【0043】
一般に、Ｘ線周波数範囲は３×１０１６～３×１０１９Ｈｚであり、一方、ガンマ線周波数の周波数範囲は３×１０１９またはそれよりも高い。
【0044】
他の実施形態では、試料に、電子線を約２５～約４０ｋＧｙで、Ｍｅｖｅｘ加速器（設定：１０ＭｅＶ、２０ｋＷ）により照射する（ｍｅｖｅｘ．ｃｏｍ／ｌｉｎａｃｓ／１０ｍｅｖ－ｓｙｓｔｅｍ－ｅ－ｂｅａｍ－ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ－ｆｏｒ－ｍｅｄｉｃａｌ－ｄｅｖｉｃｅｓ／参照）。
【0045】
一部の実施形態では、所望の生物学的および物理的性質（複数可）は、止血性、抗接着、再出血の予防、抗狭窄、組織閉塞、貯蔵弾性率、粘度、および組織空隙充填特性、粘膜亢進（ｍｕｃｏｓａ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）、および創傷治癒からなる群より選択される。
好ましい実施形態では、照射線量は、少なくとも１０－５、１０－６、またはそれよりも低い無菌性保証水準（ＳＡＬ）を達成する。
好ましい実施形態では、照射線量は、少なくとも１０－５、１０－６、またはそれよりも低い無菌性保証水準（ＳＡＬ）を達成する。
【0046】
本発明は、本明細書に記載される方法によって作製された自己組織化ペプチドの滅菌溶液も提供する。例えば外科手術中または出血を伴う外傷後に、実質的に中性のｐＨの部位にそのような生体組織に溶液を適用することを含むことにより、ゲル化がもたらされる。一部の実施形態では、そのような部位は内部にあり、一方、他の実施形態では、部位は、表面縫合、切り傷または擦過などの外部とすることができる。
【0047】
本発明のその他の態様は、実施例および添付の特許請求の範囲を含めた本明細書の記載に基づき、当業者に明らかである。
【実施例】
【0048】
（実施例１：照射条件）
試料に、ガンマ線を２３、２５、２８、および４０ｋＧｙで、ＶＰＴｒａｄ Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ２２０（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ Ｒａｔｅ Ｃｏ－６０ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒにより照射した。一部の実施形態では、４０ｋＧｙ照射のための試行線量率（ｒｕｎ ｄｏｓｅ ｒａｔｅ）および持続時間は、それぞれ６．３０ｋＧｙ／時および６時間２０分５８秒であった。他の実施形態では、２８ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ４．４０ｋＧｙ／時および６時間２２分３１秒であった。他の実施形態では、２５ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ６．５８ｋＧｙ／時および３時間４７分４２秒であった。他の実施形態では、２３ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ６．５８ｋＧｙ／時および３時間２９分２９秒であった。
試料に、ガンマ線を２３、２５、２８、および４０ｋＧｙで、ＶＰＴｒａｄ Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ２２０（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ Ｒａｔｅ Ｃｏ－６０ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒにより照射した。一部の実施形態では、４０ｋＧｙ照射のための試行線量率（ｒｕｎ ｄｏｓｅ ｒａｔｅ）および持続時間は、それぞれ６．３０ｋＧｙ／時および６時間２０分５８秒であった。他の実施形態では、２８ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ４．４０ｋＧｙ／時および６時間２２分３１秒であった。他の実施形態では、２５ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ６．５８ｋＧｙ／時および３時間４７分４２秒であった。他の実施形態では、２３ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ６．５８ｋＧｙ／時および３時間２９分２９秒であった。
【0049】
他の実施形態では、試料に、２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙのＸ線を、Ｍｅｖｅｘ加速器（１０ＭｅＶ、２０ｋＷ）で照射した。
【0050】
他の実施形態では、試料に、２５および４０ｋＧｙの電子線を、Ｍｅｖｅｘ加速器（１０ＭｅＶ、２０ｋＷ）で照射した。
【0051】
（実施例２：ＨＰＬＣ条件）
ＨＰＬＣ試験を、照射試験後の主要ペプチド含量を評価するために行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、この研究に使用した。カラム温度を２５℃に保持した。
ＨＰＬＣ試験を、照射試験後の主要ペプチド含量を評価するために行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、この研究に使用した。カラム温度を２５℃に保持した。
【0052】
ＲＡＤＡ１６試料では、溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリルであった。溶媒Ｂの勾配を、２０分で１０％～４０％に、さらに５分間４０％に、２５℃で制御した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、３００Å）を、この試験で使用した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）（４０ｍｇ）を、１０μＬのＤＨ２Ｏと混合し、混合物をボルテックスした。混合物をさらに、５００μＬのギ酸と混合し、ボルテックスした。次いでこの混合物をＤＨ２Ｏ（４，４５０μＬ）と混合し、ボルテックスした。２０μＬの試料を、Ａｇｉｌｅｎｔオートサンプラーを使用して注入した。
【0053】
ＩＥＩＫ１３試料では、溶媒Ａは０．１％ＴＦＡを含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルであった。溶媒Ｂの勾配を、８分で２０％から４３％に、８～９．５分の間で４３％から７０％に、および９．５～３０分の間で７０％から９５％に、さらに５分間９５％に、２５℃で制御した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、８μｍ、３００Å）を、この試験で使用した。ＩＥＩＫ１３の１．３％溶液を、０．１％ＴＦＡを含む水で０．０７５％に希釈し、混合物をボルテックスした。３５μＬの試料を、Ａｇｉｌｅｎｔオートサンプラーを使用して注入した。
【0054】
ＱＬＥＬ１２試料では、溶媒Ａは水であり、溶媒Ｂは８０％アセトニトリルであった。溶媒Ｂの勾配は、１５分で２０％から８０％に、さらに７分間８０％に、２５℃で制御した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、８μｍ、３００Å）をこの試験に使用した。０．１５％ｗ／ｖのＱＬＥＬ１２溶液をＤＨ２Ｏで０．０１％に希釈し、ボルテックスした。５０μＬの試料を、Ａｇｉｌｅｎｔオートサンプラーを使用して注入した。
【0055】
（実施例３：質量分析条件）
質量分析試験を、照射滅菌後のペプチドの分解を調査するために実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤイオントラップ質量分析計を、この試験に使用した。試料溶液を、ＨＰＬＣ試料について説明したのと同様にして調製した。各試料を、シリンジポンプで９μＬ／分で注入した。質量スペクトルを１分間記録した。
質量分析試験を、照射滅菌後のペプチドの分解を調査するために実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤイオントラップ質量分析計を、この試験に使用した。試料溶液を、ＨＰＬＣ試料について説明したのと同様にして調製した。各試料を、シリンジポンプで９μＬ／分で注入した。質量スペクトルを１分間記録した。
【0056】
（実施例４：照射された自己組織化ペプチドのレオロジー特性）
試料のレオロジー特性を、４０ｍｍコーンおよびプレートを持つレオメーター（ＤＨＲ１、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して評価した。ペプチド溶液（７００μＬ）をレオメーターのプレートに配置し、過剰な溶液を金属のへらにより静かに除去した。測定を、３７℃で２分間の緩和時間後に行った。
試料のレオロジー特性を、４０ｍｍコーンおよびプレートを持つレオメーター（ＤＨＲ１、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して評価した。ペプチド溶液（７００μＬ）をレオメーターのプレートに配置し、過剰な溶液を金属のへらにより静かに除去した。測定を、３７℃で２分間の緩和時間後に行った。
【0057】
周波数試験を、０．１Ｈｚから１０Ｈｚまで、０．１％の歪みで行った。ゲル化後の周波数試験は、３ｍＬのＤＭＥＭをコーンおよびプレートの周りに静かに添加した後、同じ条件下で２０分間行なった。
【0058】
チキソトロピー試験を、下記の方法で実施した。剪断速度１０００秒－１を１分間適用して、全てのレオロジー特性をリセットし、次いで１Ｈｚの周波数を０．１％の歪みで６０分間適用して、チキソトロピー挙動を記録した。この手順を繰り返し、次いでチキソトロピー特性を分析した。
【0059】
（実施例５：外見およびｐＨ）
ガンマ照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の外見およびｐＨを、図１および表１（Ｎ＝３）に示す。
表１． ガンマ照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の外見およびｐＨ。
ガンマ照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の外見およびｐＨは、ごく僅かしか変化しなかった。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照のｐＨは、２．２であった。２３、２５、２８、および４０ｋＧｙでのガンマ照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のｐＨは、２．３であった。
ガンマ照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の外見およびｐＨを、図１および表１（Ｎ＝３）に示す。
表１． ガンマ照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の外見およびｐＨ。
【表1】
【0060】
ガンマ照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％の外見およびｐＨも、図１および表２に示す。
表２． ガンマ照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％、ＫＬＤ１２ １．３％、およびＱＬＥＬ１２ ０．１５％の外見およびＰＨ。（Ｎ＝３）
表２． ガンマ照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％、ＫＬＤ１２ １．３％、およびＱＬＥＬ１２ ０．１５％の外見およびＰＨ。（Ｎ＝３）
【表2-1】
【表2-2】
【0061】
ガンマ照射後のＩＥＩＫ１３（１．３％）の外見およびｐＨは、変化しなかった。ＩＥＩＫ１３対照のｐＨは、３．０であった。２８ｋＧｙおよび４０ｋＧｙでのガンマ照射後のＩＥＩＫ１３（１．３％）のｐＨは、３．０であった。
【0062】
ガンマ照射後のＫＬＤ１２（１．３％）およびＱＬＥＬ１２（０．１５％）の外見およびｐＨも、表２に示した。ガンマ照射後のＫＬＤ１２（１．３％）の外見およびｐＨは、変化しなかった。ＫＬＤ１２対照のｐＨは、２．２であった。４０ｋＧｙでガンマ照射後のＫＬＤ１２（１．３％）のｐＨは、２．２であった。
【0063】
しかしながら、ガンマ照射後のＱＬＥＬ１２の外見およびｐＨは、有意に変化した。ＱＬＥＬ１２対照のｐＨは、７．０であった。２３、２５、および４０ｋＧｙでのガンマ照射後のＱＬＥＬ１２のｐＨは、それぞれ６．７、６．５、および５．９であり、試料は、ガンマ照射後に水様になっていた。
【0064】
Ｘ線および電子線照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の外見およびｐＨも、表３に示す（Ｎ＝３）。
表３． Ｘ線および電子線照射試験後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の外見およびｐＨ。（Ｎ＝３）
表３． Ｘ線および電子線照射試験後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の外見およびｐＨ。（Ｎ＝３）
【表3】
【0065】
Ｘ線または電子線照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の外見およびｐＨは、ごく僅かしか変化しないまたは変化しないままであった。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照のｐＨは２．２であった。２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙでのＸ線照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のｐＨは、２．３であった。２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙでの電子線照射後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のｐＨは、２．２であった。
【0066】
Ｘ線または電子線照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％の外見およびｐＨも、表４に示す。
表４． Ｘ線または電子線照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％の外見およびｐＨ （Ｎ＝３）。
表４． Ｘ線または電子線照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％の外見およびｐＨ （Ｎ＝３）。
【表4】
【0067】
Ｘ線または電子線照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％の外見およびｐＨは、変化しなかった。ＩＥＩＫ１３ １．３％対照のｐＨは３．０であった。２８ｋＧｙおよび４０ｋＧｙでのＸ線または電子線照射後のＩＥＩＫ１３ １．３％のｐＨは、３．０であった。
【0068】
Ｘ線または電子線照射後のＫＬＤ１２ １．３％の外見およびｐＨも、表５に示す。
表５． Ｘ線または電子線照射後のＫＬＤ１２ １．３％の外見およびｐＨ （Ｎ＝３）。
表５． Ｘ線または電子線照射後のＫＬＤ１２ １．３％の外見およびｐＨ （Ｎ＝３）。
【表5】
【0069】
Ｘ線または電子線照射後のＫＬＤ１２ １．３％の外見およびｐＨは、変化しなかった。ＫＬＤ１２ １．３％対照のｐＨは２．２であった。２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙでＸ線または電子線照射後のＫＬＤ１２ １．３％のｐＨは、２．２であった。
【0070】
Ｘ線または電子線照射後のＱＬＥＬ１２ ０．１５％の外見およびｐＨも、表６に示す。
表６． Ｘ線および電子線照射後のＱＬＥＬ１２ ０．１５％の外見およびｐＨ （Ｎ＝３）。
表６． Ｘ線および電子線照射後のＱＬＥＬ１２ ０．１５％の外見およびｐＨ （Ｎ＝３）。
【表6-1】
【表6-2】
【0071】
ガンマ、Ｘ線、または電子線照射後のＱＬＥＬ１２の外見は、有意に変化した。ＱＬＥＬ１２対照のｐＨは、７．０であった。２５および４０ｋＧｙでガンマ照射後のＱＬＥＬ１２のｐＨはそれぞれ６．５および５．９であり、２５および４０ｋＧｙでのＸ線照射後のｐＨはそれぞれ６．３および６．５であり、２５および４０ｋＧｙで電子線照射後のｐＨはそれぞれ６．６および６．５であった。ＱＬＥＬ１２溶液は、ガンマ、Ｘ線または電子線照射後に水様になった。
【0072】
まとめると、ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２は、２５～４０ｋＧｙ付近でのガンマ、Ｘ線、および電子線照射後に変化しないままであったが、ＱＬＥＬ１２はそうではなかった。したがって、ＱＬＥＬ１２とは異なって、ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＫＬＤ１２は、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射技法を使用して滅菌することができる。
【0073】
（実施例６：ＨＰＬＣおよび質量分析による特徴付け）
ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＱＬＥＬ１２に関するＨＰＬＣ試験を、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射の前および後に行い、それらの主要ペプチド含量に関する結果を表７～１０に列挙した。
表７． ガンマ照射の前および後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
＊：ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照のデータよりも有意に低い場合を示す（ｐ＜０．０５である場合、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表８． Ｘ線および電子線照射の前および後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
＊：ＰｕｒａＳｔａｔ（商標登録）対照のデータよりも有意に低い場合を示す（ｐ＜０．０５である場合、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表９． ガンマ、Ｘ線、および電子線照射の前および後のＩＥＩＫ１３ １．３％の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
表１０． ガンマ、Ｘ線、および電子線照射の前および後のＱＬＥＬ１２ ０．１５％の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
＊：ＱＬＥＬ１２対照のデータよりも有意に低い場合を示す（ｐ＜０．０５である場合、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
ＲＡＤＡ１６、ＩＥＩＫ１３、およびＱＬＥＬ１２に関するＨＰＬＣ試験を、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射の前および後に行い、それらの主要ペプチド含量に関する結果を表７～１０に列挙した。
表７． ガンマ照射の前および後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
【表7】
＊：ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照のデータよりも有意に低い場合を示す（ｐ＜０．０５である場合、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表８． Ｘ線および電子線照射の前および後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
【表8】
＊：ＰｕｒａＳｔａｔ（商標登録）対照のデータよりも有意に低い場合を示す（ｐ＜０．０５である場合、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表９． ガンマ、Ｘ線、および電子線照射の前および後のＩＥＩＫ１３ １．３％の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
【表9-1】
【表9-2】
表１０． ガンマ、Ｘ線、および電子線照射の前および後のＱＬＥＬ１２ ０．１５％の主要ペプチド含量に関するＨＰＬＣ試験（Ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。
【表10】
＊：ＱＬＥＬ１２対照のデータよりも有意に低い場合を示す（ｐ＜０．０５である場合、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【0074】
ＲＡＤＡ１６対照の主要ペプチド含量は７８．３％であった。２３、２５、２８、および４０ｋＧｙでのガンマ照射後のＲＡＤＡ１６の主要ペプチド含量は、それぞれ７５．５、７４．６、６８．５、および６９．７％であった。２５および４０ｋＧｙでのＸ線照射後のＲＡＤＡ１６の主要ペプチド含量は、それぞれ７３．８および７１．９％であった。２５および４０ｋＧｙでの電子線照射後のＲＡＤＡ１６の主要ペプチド含量は、それぞれ７６．０および７０．０％であった。
【0075】
ＩＥＩＫ１３対照の主要ペプチド含量は、９９．６％であった。４０ｋＧｙでのガンマ照射後のＩＥＩＫ１３の主要ペプチド含量は、９９．８％であった。２５および４０ｋＧｙでのＸ線照射後のＩＥＩＫ１３の主要ペプチド含量は、それぞれ９９．８および９９．９％であった。２５および４０ｋＧｙでの電子線照射後のＩＥＩＫ１３の主要ペプチド含量は、それぞれ９９．６および９９．８％であった。
【0076】
ＱＬＥＬ１２対照の主要ペプチド含量は、９０．５％であった。しかしながらＱＬＥＬ１２は、照射滅菌後にその主要ペプチド含量に有意な減少を示した。４０ｋＧｙでのガンマ照射後のＱＬＥＬ１２の主要ペプチド含量は、４０．７％であった。２５および４０ｋＧｙでのＸ線照射後のＱＬＥＬ１２の主要ペプチド含量は、それぞれ５７．０および４７．３％であった。２５および４０ｋＧｙでの電子線照射後のＱＬＥＬ１２の主要ペプチド含量は、それぞれ５１．９および５５．６％であった。これらの結果は、ＱＬＥＬ１２と比較して、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射後にＲＡＤＡ１６およびＩＥＩＫ１３が比較的変化しないままであったことを実証する。
【0077】
ＲＡＤＡ１６の測定された分子量は１７１２であり、これはその計算された分子量に一致する（図２）。質量分析は、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射後に、ＲＡＤＡ１６が分解されなかったことを実証した（図２～４）。しかしながらＲＡＤＡ１６は、オートクレーブ処理中に完全に分解した。
【0078】
照射は、オートクレーブとは異なる低温滅菌技法である。両方の滅菌技法は、高エネルギー（即ち、放射線および熱）を、滅菌中にＲＡＤＡ１６などの自己組織化ペプチドに提供するが、照射滅菌は、ＲＡＤＡ１６分子の実質的な分解を誘発しなかった。
【0079】
しかしながら、全てのガンマ、Ｘ線、および電子線で照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の質量スペクトルは、照射前には観察されないいくつかのピークを示し、一方、それらの中で顕著な相違は観察されなかった。質量スペクトルの概要を表１１に列挙する。
表１１． 照射滅菌プロセス後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の質量分析データ。
＊：約４年間、２～８℃で貯蔵された。
＃：全てのＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料に４０ｋＧｙで照射した（ガンマ線、Ｘ線、および電子線で）
表１１． 照射滅菌プロセス後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の質量分析データ。
【表11-1】
【表11-2】
＃：全てのＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料に４０ｋＧｙで照射した（ガンマ線、Ｘ線、および電子線で）
【0080】
対照ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、５７２、８５７、および１７１３にＭｚピークを示し、これらは主要ペプチドＡｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２（配列番号１）に割り当てられる。対照ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、５０２、６６５／１３２９、９１６、１１４３、および１２２９にその他のＭｚピークも示し、これらはそれぞれＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号５）、ＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号６）、ＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号８）、ＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡ（配列番号１０）、Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤ（配列番号１１）と推定される。
【0081】
表１２は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）が２～８℃で約４年間貯蔵されたときの、Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２（配列番号１）の分解のパターンを示す。そのパターンから、本発明者らは、分解が主に～ＲＡＤとＡ～の間の点で生じることを見出した。
【0082】
一方、照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、８３６／１６７０、１１００、および１５１３に追加のＭｚピークを示し、これらはそれぞれ（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２（配列番号７）、ＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号９）、およびＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１２）と推定される。
【0083】
表１３は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）が照射により滅菌されたときの、Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２（配列番号１）の分解の追加のパターンを示す。特に、８３６および１６７０でのピークは、主要な追加のピークの１つであり、これはＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号７）を表す。これは、照射がＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の追加の分解を、アセチル基（Ａｃ）とＲＡＤ～との間の点で引き起こす可能性があることを意味する。１１００および１５１３でのピークも、主要な追加のピークの１つであり、これはＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号９）、およびＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１２）を表す。これは照射が、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の追加の分解を、～ＲとＡＤ～との間の点で引き起こす可能性があることを意味する。
表１２． Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２ （配列番号１）の分解のパターン（ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、２～８℃で約４年間貯蔵した）
表１３． ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）が照射により滅菌されたときのＡｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２の分解の追加のパターン
表１２． Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２ （配列番号１）の分解のパターン（ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、２～８℃で約４年間貯蔵した）
【表12-1】
【表12-2】
【表13】
【0084】
また、ＩＥＩＫ１３の分子量は１６２２で測定され、これはその計算された分子量に一致する（図５）。質量スペクトル分析は、ＩＥＩＫ１３が、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射後にわずかに分解しただけであったことを実証した。
【0085】
さらに、ＱＬＥＬ１２のモル質量は１５０６で測定され、これはその計算されたモル質量に一致する（図６）。しかしながら質量スペクトル分析は、ガンマ、Ｘ線、および電子線照射後に、ＱＬＥＬ１２が著しく分解したことを実証した。
【0086】
（実施例７：レオロジー特性）
ＩＳＯ １１１３７（ヘルスケア製品の滅菌－放射線）に基づき、放射線滅菌方法は、１０－６の無菌性保証水準ＳＡＬを実現するための滅菌線量として、２５ｋＧｙまたは１５ｋＧｙ照射で使用することができる。
ＩＳＯ １１１３７（ヘルスケア製品の滅菌－放射線）に基づき、放射線滅菌方法は、１０－６の無菌性保証水準ＳＡＬを実現するための滅菌線量として、２５ｋＧｙまたは１５ｋＧｙ照射で使用することができる。
【0087】
ゲル化の前および後それぞれの、ガンマ照射滅菌したＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）に関して、レオロジーの結果を図７および８に示す。決定されたレオロジーの結果を表１４～１５に列挙する。
表１４． ４０ｍｍコーン・プレートを用いた歪み０．１％での、ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果
＊：対照と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
＄：その他と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表１４． ４０ｍｍコーン・プレートを用いた歪み０．１％での、ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果
【表14】
＄：その他と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【0088】
２３ｋＧｙ、２５ｋＧｙ、および４０ｋＧｙでガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照よりも高い貯蔵弾性率を示した（図７および表１４）。４０ｋＧｙでガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、２３および２５ｋＧｙでガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）よりも有意に高い貯蔵弾性率を示した。また、２５ｋＧｙでガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、２３ｋＧｙでガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）よりも僅かに高い貯蔵弾性率を示した。このことは、ガンマ照射がＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のレオロジー特性に正の影響を及ぼしたことを示す。２３ｋＧｙ（４７１．１±３７．２Ｐａ）、２５ｋＧｙ（５０１．０±４０．６Ｐａ）、および４０ｋＧｙ（５９２．４±３６．２Ｐａ）でガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照（３２２．９±２１．０Ｐａ）と比較して、それぞれそれらの貯蔵弾性率の４６％、５５％、および８３％増大を示した。
表１５． ゲル化後の、ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。試料を、４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みで２０分間、ＤＭＥＭで処理した。
＊：対照と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
＄：その他と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表１５． ゲル化後の、ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。試料を、４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みで２０分間、ＤＭＥＭで処理した。
【表15】
＄：その他と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【0089】
さらに、模擬体液（即ち、ＤＭＥＭ緩衝液）により誘発されたゲル化後２０分間、２３ｋＧｙ（８７１１±１３５Ｐａ）、２５ｋＧｙ（９１４３±１９５９Ｐａ）、および４０ｋＧｙ（１２３３０±２１４８Ｐａ）でガンマ照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照（４９７２±４５１Ｐａ）と比較して、それぞれ７５％、８４％、および１４８％の、それらの貯蔵弾性率の増大を示した（図８および表１１）。
【0090】
ゲル化の前および後それぞれの、Ｘ線照射滅菌したＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）に関して、レオロジーの結果を表１６および１７に示す。
表１６． ４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みでの、Ｘ線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果
＊：対照と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
＄：その他と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表１６． ４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みでの、Ｘ線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果
【表16】
＄：その他と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【0091】
２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙでＸ線照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）も、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照よりも高い貯蔵弾性率を示した。４０ｋＧｙでＸ線照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、２５ｋＧｙでＸ線照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）よりも有意に高い貯蔵弾性率を示した。このことは、Ｘ線照射がＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のレオロジー特性に正の影響を及ぼしたことを示す。２５ｋＧｙ（４４９．８±２１．２）および４０ｋＧｙ（６０７．２±２７．０Ｐａ）で照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、それぞれ、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照（３２２．９±２１．０Ｐａ）と比較して、それらの貯蔵弾性率の３９％および８８％増大を示した（表１７）。
表１７． ゲル化後のＸ線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標） （ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。試料を、４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みで２０分間、ＤＭＥＭで処理した。
＊：対照と比較してｐ＜０．０５である場合を示す（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
表１７． ゲル化後のＸ線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標） （ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。試料を、４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みで２０分間、ＤＭＥＭで処理した。
【表17】
【0092】
さらに、模擬体液（即ち、ＤＭＥＭ緩衝液）により２０分間、ゲル化を誘発した後、２５ｋＧｙ（８４９７±１８１２Ｐａ）および４０ｋＧｙ（１１２４６±１３８３Ｐａ）でＸ線照射したＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、それぞれ、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照（４９７２±４５１Ｐａ）と比較して、その貯蔵弾性率の７１％および１２６％増大を示した（表１７）。
【0093】
ゲル化の前および後それぞれの、電子線照射滅菌したＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）に関して、レオロジーの結果を表１８および１９に示す。
表１８． ４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みでの、電子線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標） （ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。
表１８． ４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みでの、電子線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標） （ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。
【表18】
【0094】
しかしながら、２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙで電子線照射したＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照と比較して貯蔵弾性率の有意な変化を示さなかった。このことは、電子線照射滅菌が、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のレオロジー特性に大きな影響を及ぼさないことを示す。しかしながら、ｐ値は統計的有意性を示さなかった（即ち、ｐ＞０．０５）が、２５ｋＧｙ（３４２．７±１６．７Ｐａ）および４０ｋＧｙ（３５３．２±１６．８Ｐａ）で電子線照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、それぞれ、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照（３２２．９±２１．０Ｐａ）と比較して、それらの貯蔵弾性率の６％および９％増大を示した（表１８）。
表１９． ゲル化後の、電子線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標） （ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。試料を、４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みで２０分間、ＤＭＥＭで処理した。
表１９． ゲル化後の、電子線照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標） （ＲＡＤＡ１６ ２．５％）の周波数試験からの結果。試料を、４０ｍｍコーン・プレートを用いた０．１％の歪みで２０分間、ＤＭＥＭで処理した。
【表19】
【0095】
模擬体液（即ち、ＤＭＥＭ緩衝液）により２０分間、ゲル化を誘発した後、２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙで電子線照射したＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照と比較して、その貯蔵弾性率に有意差を示さなかった（即ち、ｐ値は０．０５よりも高かった）（表１９）。
【0096】
ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、高剪断速度でのずり減粘特性およびチキソトロピー挙動を実証し、高剪断が停止したときに、ゆっくりとしたレオロジー特性の回復を示唆している（図９）。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のこれらの特性から、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の剛性を、患者への適用中のより容易な取扱いのために低下させることができ、次いで剛性は、適用後に初期値までゆっくりと回復することができる。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のこれら固有のチキソトロピー特性は、２３および２５ｋＧｙでのガンマ照射後であっても変化せず、一方、照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照よりも高い貯蔵弾性率を示した。
【0097】
ペプチドの分子構造は、ＨＰＬＣおよび質量分析の結果を考慮すると実質的に変化しなかったので、ペプチドの組織化されたナノ繊維構造は、そのレオロジー特性を増大させる因子であった可能性がある。自己組織化ペプチド溶液のレオロジー特性は、自己組織化ペプチド構造がより組織化されたときに増大し得る。拘束されない理論によれば、照射からの高エネルギーは、より組織化されたナノ繊維構造を有するようにペプチド分子を僅かに移動させ、その結果、改善されたレオロジー特性が得られる。
【0098】
増大したレオロジー特性は、繰り返される高剪断によって少なくとも部分的に逆転され、元のレベル近くまで戻った。それらを２回、１０００秒－１で１分間、徹底的に剪断した後、２３ｋＧｙおよび２５ｋＧｙで照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料は、それぞれ、４８４．５Ｐａから４１０．９Ｐａまで、および５１４．３Ｐａから４２６．５Ｐａまで、それらの貯蔵弾性率が徐々に低下したことを示し、一方、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照は、その貯蔵弾性率の有意な変化を示さなかった（図９）。照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のレオロジー特性は、より多くの剪断でＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照により近くなると予測することができた。したがってガンマ照射は、自己組織化ナノ繊維の構造を強化して、ペプチド分子構造の分解または架橋の検出可能な変化なしにそれらのレオロジー特性を増大させる。
【0099】
（実施例８：生物汚染度試験）
Ａ． 試料の収集。照射時に、５０個の試料を下記の通り収集した：パッケージ内部の、生物汚染度試験用の１０個の試料（パッケージ操作の開始時に４個、中間および終わりに各３個を収集）；シリンジ内の充填液体の、生物汚染度試験用の１０個の試料（パッケージ操作の開始時に４個、中間および終わりに各３個を収集）；予備の試料、例えば３０個の試料を、追加の試験が必要となり得る場合に収集してもよい。
Ａ． 試料の収集。照射時に、５０個の試料を下記の通り収集した：パッケージ内部の、生物汚染度試験用の１０個の試料（パッケージ操作の開始時に４個、中間および終わりに各３個を収集）；シリンジ内の充填液体の、生物汚染度試験用の１０個の試料（パッケージ操作の開始時に４個、中間および終わりに各３個を収集）；予備の試料、例えば３０個の試料を、追加の試験が必要となり得る場合に収集してもよい。
【0100】
Ｂ． 滅菌検証用の生菌カウント試験。クリーンベンチで、試料を無菌状態で調製し、使用されることになる全ての機器および溶媒を滅菌した。
【0101】
ブリスター包装製品の場合、１つの密封パッケージで合計１００ｍＬの試料溶液を作製する下記の手順を２回繰り返した。シリンジを使用して、５０ｍＬの滅菌試験用の濯ぎ流体（ＵＳＰ流体Ｄ）をパッケージの内部に注入した。試料を徹底的に振盪させ、静置して、泡を低減させた。次いでパッケージの外側開口部を、内容物を加熱することなくその開口部を炎の中に軽く通すことによって滅菌した。次いでシリンジまたは別の適切な方法を使用して、全ての注入された溶液をパッケージから抽出し、次いでこれを耐熱ボトルに収集した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ３１３４）などの標準株から精製された約１００ＣＰＵの胞子を含有する密封ブリスターパッケージを用い、回復率および回復率に基づく補正係数を、上記と同じ手法で調製された試料からの生菌カウントおよび添加された細菌カウントから、予め計算した。補正係数は、１／回復率（％）×１００として計算した。この補正係数は、試料調製手順を変更したときに再度計算した。
【0102】
内容物の流体を試験するために、１ｍＬの内容物溶液を９ｍＬのソイビーン・カゼインダイジェスト培地寒天培地（ＳＣＤ寒天培地）と混合し、ゲルを微細に分散させて、１０ｍＬの試料溶液を作製した。
【0103】
ブリスターパッケージ製品では、培地当たり１００ｍＬの試料溶液を使用し、試験は、日本薬局方微生物限度試験の膜フィルター法を使用して実行した。
【0104】
内容物流体を試験するために、培養培地当たり１ｍＬの試料溶液が添加され、および日本薬局方微生物限度試験の寒天プレート希釈法を使用して、試験を実行する。この試験を１０回繰り返して、１０ｍＬの試料溶液に相当する１０個の培養培地プレートを得た。
【0105】
培養物を３０℃～３５℃で３～５日間（またはそれよりも長く）、ＳＣＤ寒天培地上で維持した。原則として、培養期間中、操作日毎および最終測定日に、少なくとも１回、培養物を観察した。
【0106】
培養の終了後、ＳＣＤ寒天培地のコロニーの実測値を、下記の計算により変換した：
（１）ブリスターパッケージ製品の場合
ブリスターパッケージ内の生菌カウント＝試料液体１００ｍＬ中の生菌カウント×補正係数
（２）内容物流体の場合
内容物流体１ｍＬ中の生菌カウント＝試料溶液と同等な１０ｍＬ（１０個の培地プレート）中の全生菌カウント
注釈：内容物流体に関する試験法の中で、計算に使用されるＳＩＰ（アリコート）の値は１／５＝０．２と決定し、これは、１ｍＬの内容物流体と同等な試験法により５ｍＬの生成物で試験をするときは全量ではない。＊ＳＩＰ（試料項目部分（Ｓａｍｐｌｅ Ｉｔｅｍ Ｐｏｒｔｉｏｎ））は、アリコート（試験に使用されるヘルスケア製品の、規定された部分）に等しい。
（１）ブリスターパッケージ製品の場合
ブリスターパッケージ内の生菌カウント＝試料液体１００ｍＬ中の生菌カウント×補正係数
（２）内容物流体の場合
内容物流体１ｍＬ中の生菌カウント＝試料溶液と同等な１０ｍＬ（１０個の培地プレート）中の全生菌カウント
注釈：内容物流体に関する試験法の中で、計算に使用されるＳＩＰ（アリコート）の値は１／５＝０．２と決定し、これは、１ｍＬの内容物流体と同等な試験法により５ｍＬの生成物で試験をするときは全量ではない。＊ＳＩＰ（試料項目部分（Ｓａｍｐｌｅ Ｉｔｅｍ Ｐｏｒｔｉｏｎ））は、アリコート（試験に使用されるヘルスケア製品の、規定された部分）に等しい。
【0107】
（実施例９：ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）滅菌の実験設計）
照射条件－－ ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料（ロット番号１７Ｃ０９Ａ３０）に、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ２２０（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ Ｒａｔｅ Ｃｏ－６０ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）で、ガンマ線を２５、２８、および４０ｋＧｙで照射した。４０ｋＧｙ照射に関する試行線量率および持続時間は、それぞれ６．３０ｋＧｙ／時および６時間２０分５８秒であった。２８ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ４．４０ｋＧｙ／時および６時間２２分３１秒であった。２５ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ６．５８ｋＧｙ／時および３時間４７分４２秒であった。
照射条件－－ ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料（ロット番号１７Ｃ０９Ａ３０）に、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ２２０（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ Ｒａｔｅ Ｃｏ－６０ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）で、ガンマ線を２５、２８、および４０ｋＧｙで照射した。４０ｋＧｙ照射に関する試行線量率および持続時間は、それぞれ６．３０ｋＧｙ／時および６時間２０分５８秒であった。２８ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ４．４０ｋＧｙ／時および６時間２２分３１秒であった。２５ｋＧｙ照射のための試行線量率および持続時間は、それぞれ６．５８ｋＧｙ／時および３時間４７分４２秒であった。
【0108】
方法および試験結果： ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の外見を、各試験後に観察した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のｐＨは、Ａｃｃｕｍｅｔ ＡＢ１５ ｐＨメーター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して試験した。ＨＰＬＣ試験を行って、照射試験後の主要ペプチド含量を評価した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をこの研究で使用した。カラム温度を２５℃に保持した。
【0109】
溶媒Ａは、０．１％ＴＦＡを含む水であり、溶媒Ｂは、０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリルであった。溶媒Ｂの勾配を、２０分で１０％から４０％に、さらに５分間４０％に、２５℃で制御した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、３００Å）を、この試験で使用した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（ＲＡＤＡ１６ ２．５％）（４０ｍｇ）を、１０μＬのＤＨ２Ｏおよび５００μＬのギ酸と混合し、ボルテックスした。さらに混合物をＤＨ２Ｏ（４，４５０μＬ）と混合し、ボルテックスした。２０μＬの試料を、Ａｇｉｌｅｎｔオートサンプラーを使用して注入した。
【0110】
質量分析試験を実施して、照射滅菌後のペプチドの分解を調査した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤイオントラップ質量分析計を、この研究で使用した。試料溶液を、ＨＰＬＣ試料に関して上述のように調製した。各試料を、シリンジポンプで９μＬ／分で注入した。質量スペクトルを１分間記録した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２）（配列番号１）の分子量は１７１２であり、これは対照および照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料の全てのスペクトルにおいて、ｍ／３＝５７２、ｍ／２＝８５７、およびｍ＝１７１３の主な３つのピークから計算されたその分子量に一致する。
Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１）に割り当てられたピークは、
Ｍ／ｚ＝５７２＝（Ｍｗ＋３）／３、したがって計算されたＭｗ＝１７１３
Ｍ／ｚ＝８５７＝（Ｍｗ＋２）／２、したがって計算されたＭｗ＝１７１２
Ｍ／ｚ＝１７１３＝Ｍｗ＋１、したがって計算されたＭｗ＝１７１２
である。
Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＮＨ２（配列番号１）に割り当てられたピークは、
Ｍ／ｚ＝５７２＝（Ｍｗ＋３）／３、したがって計算されたＭｗ＝１７１３
Ｍ／ｚ＝８５７＝（Ｍｗ＋２）／２、したがって計算されたＭｗ＝１７１２
Ｍ／ｚ＝１７１３＝Ｍｗ＋１、したがって計算されたＭｗ＝１７１２
である。
【0111】
ガンマ滅菌の前および後のＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料のレオロジー特性を、３７℃で、レオメーター（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ １、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して評価した。流動試験を、２０ｍｍのプレート－プレートジオメトリーおよび８００μｍの間隙距離で、０．００１ １／秒～３，０００ １／秒の剪断速度範囲で、３７℃で実施した。試料溶液（３５０μＬ）をレオメータープレート上に配置し、過剰な溶液を静かに除去し；測定を、３７℃で、２分の緩和時間後に行った。粘度（ｈ）を、非常に低い剪断速度（０．００１ １／秒）から高剪断速度（３０００ １／秒）まで記録した。
【0112】
Ｌ９２９ニュートラルレッド取込み試験を行って、照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の細胞毒性を調査した。これらの試験は、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ、ＵＳＡにあるＴｏｘｉｋｏｎにより行われた。研究は、ＩＳＯ １０９９３－５， ２００９， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ － Ｐａｒｔ ５： Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙおよびＩＳＯ １０９９３－１２， ２０１２， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ － Ｐａｒｔ １２： Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓに基づき行った。試験物品の抽出物に応答した、哺乳動物細胞単層、Ｌ９２９マウス線維芽細胞の生物学的反応性を、決定した。試験物品の抽出物は、血清を追加補充した最小必須培地（ＭＥＭ）で、ｍＬ当たり試験物品０．２ｇの比で得られた。抽出は、２４±２時間にわたり、３７±１℃で行った。陽性対照（天然ゴム）および陰性対照（陰性対照プラスチック）物品および未処理の対照（ブランク）を調製して、試験システムの適正な機能を検証した。試験物品および対照物品の抽出物を使用して、細胞培養の維持培地を置き換えた。試験物品の抽出物を、１００％（ニート）濃度で試験した。全ての培養物を、少なくとも６つの複製で、２４～２６時間インキュベートした。３７±１℃で、５±１％の二酸化炭素（ＣＯ２）を含有する加湿雰囲気であった。抽出物に曝露された後の細胞の生存率は、それらが生体染色色素（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ）ニュートラルレッドを取り込む能力を介して測定した。この色素は、生存細胞に能動的に組み込まれるように細胞に添加した。生存細胞の数は、抽出後の５４０ｎｍでの光度測定により決定された色強度に相関する。
【0113】
陰性対照物品および陽性対照物品の抽出物に曝露された細胞の生存率は、アッセイの有効性を確認するために、それぞれ未処理の対照よりも７０％よりも大きくまたは等しくかつ７０％未満である必要がある。試験物品は、生存率％が未処理の対照の７０％よりも大きくまたは等しい場合、試験の要件を満たす。
【0114】
本発明者らは、最高線量（即ち、４０ｋＧｙ）で照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）試料が全ての照射された試料を代表することを考慮して、それらのみ試験した。なぜなら、もしそうならば、より低い線量で照射されたものよりも、さらに大きな影響を細胞毒性に及ぼすはずであるためである。
表２０． 照射滅菌試験をまとめた表
表２０． 照射滅菌試験をまとめた表
【表20】
【0115】
照射前のペプチドの量。２５ｋＧｙまでの照射後、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の分解は、照射前のペプチドの量の５％を超えなかった。
【0116】
対照ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の分解のパターンから、本発明者らは、分解が主に～ＲＡＤとＡ～との間の点で生じることを見出した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商用）が照射により滅菌されたときのＡｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２（配列番号１）の分解の追加のパターンから、本発明者らは、照射が、～ＲとＡＤ～との間の点で追加の分解を引き起こし得ることを見出した。
【0117】
全体として、ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のレオロジー特性は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照と同等であった。全ての照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）およびＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照試料は、試験の要件を満たし、細胞毒性の可能性がないと見なされた。
表２１． ２つの製品形態に関するＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳ分析
下記の表２１は、ガンマ照射の前（対照）および後の主要ペプチド含量を評価するために行われたＨＰＬＣ試験の結果を示す。
表２１． ２つの製品形態に関するＨＰＬＣおよびＬＣ－ＭＳ分析
【表21】
【0118】
Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、この研究で使用した。カラム温度を２５℃に保持した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５ｍｍ、３００Å）をこの試験で使用した。溶媒Ａは、０．１％ＴＦＡを含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリルであった。溶媒Ｂの勾配を、２０分で１０％から４０％に、さらに５分にわたり４０％に、２５℃で制御した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）（４０ｍｇ）を、１０μＬのＤＨ２Ｏおよび５００μＬのギ酸と混合し、ボルテックスした。さらに混合物をＤＨ２Ｏ（４，４５０μＬ）と混合し、ボルテックスした。２０ｍＬの試料を、Ａｇｉｌｅｎｔオートサンプラーを使用して注入した。結果を、下記の表２３に示す。
表２３．
表２３．
【表23】
【0119】
知見
【0120】
全体として、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の主要ペプチド含量は、ガンマ照射法により減少し、減少の程度は、より高い線量でより有意であった。最大４０ｋＧｙの照射後、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の分解は、照射前のペプチドの量の１５％を超えていなかった。最大２５ｋＧｙの照射後、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の分解は、照射前のペプチドの量の５％を超えていなかった。
【0121】
対照ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の分解のパターンから、本発明者らは、分解が主に～ＲＡＤとＡ～との間の点で生じることを見出した。ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）が照射で滅菌されたとき、Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＮＨ２の分解の追加のパターンから、本発明者らは、照射が、～ＲとＡＤ～との間の点で追加の分解を引き起こし得ることを見出した。
【0122】
全体として、ガンマ照射によるＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）のレオロジー特性は、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照に等しかった。全ての照射されたＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）およびＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）対照は、試験の要件を満たし、細胞毒性の可能性がないと見なされた。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）溶液を滅菌する方法であって、
ａ）ほぼ中性のｐＨで生体組織に適用したときにヒドロゲルを形成することが可能な自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置すること、および
（ｂ）その所望の生物学的または物理的特性（複数可）が実質的に同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、前記ペプチドの実質的な分解なしに、事前に決定された無菌性保証水準（ＳＡＬ）まで前記ペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に前記容器を曝露すること
を含む、方法。
(項目２)
前記ペプチドが、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記線量が、１５～５０ｋＧｙである、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記溶液が、Ｘ線または電子線により照射される、項目１から３に記載の方法。
(項目５)
前記ペプチド溶液が、ＲＡＤＡ１６を約２．５％含有し、前記線量が、１５～２４ｋＧｙである、項目２から４に記載の方法。
(項目６)
前記照射後の分解された全（「総」）ペプチドの量が、前記照射前の前記ペプチドの量の２０％を超えない、項目１から５に記載の方法。
(項目７)
前記所望の生物学的および物理的性質（複数可）が、止血性、抗接着、再出血の予防、抗狭窄、組織閉鎖、粘膜亢進、創傷治癒、貯蔵弾性率、粘度、および組織空隙充填特性からなる群より選択される、項目１から６に記載の方法。
(項目８)
前記自己組織化ペプチド溶液の照射前生物汚染度が、生成物単位当たり９ＣＦＵまたはそれよりも少ない、項目７に記載の方法。
(項目９)
照射線量が、少なくとも１０ －６ の無菌性保証水準（ＳＡＬ）を実現する、項目１から８に記載の方法。
(項目１０)
照射後の前記溶液中の完全長ペプチド（「主要ペプチド」）の分解生成物の濃度が、０．１％～５％の範囲である、項目１から９に記載の方法。
(項目１１)
照射前および後の前記溶液のｐＨが、約１．８～３．５の範囲である、項目１から１０に記載の方法。
(項目１２)
前記溶液の容器が、プラスチックシリンジである、項目１から１１に記載の方法。
(項目１３)
ゲル化溶液の貯蔵弾性率が、照射後に少なくとも１０％増大している、項目１から１２に記載の方法。
(項目１４)
前記溶液を剪断して、その貯蔵弾性率を低減させるかまたは回復させることをさらに含む、項目１から１３に記載の方法。
(項目１５)
項目１から１４のいずれか一項に記載の方法によって作製された自己組織化ペプチドの滅菌溶液。
(項目１６)
前記溶液を生体組織に適用することを含む、項目１５に記載の滅菌溶液を使用する方法。
(項目１７)
前記滅菌溶液を、外科手術中または出血を伴う外傷後に適用する、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記滅菌溶液を、ヒト対象の内部部位に適用する、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記自己組織化ペプチド溶液が、実質的に、図２～６の対応する照射後プロファイルで示される通りのおよび／または実施例に記載される通りの照射後質量分析（ＭＳ）プロファイル（例えば、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の場合、追加の主要Ｍ ｚ ピークは８３６／１６７０、１１００、および１５１３ｍ／ｚで観察される）を示す、項目１に記載の方法。
(項目２０)
疾患または状態を処置または予防するための、自己組織化ペプチドの滅菌溶液の使用であって、前記滅菌溶液が、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、使用。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
自己組織化ペプチド（ＳＡＰ）溶液を滅菌する方法であって、
ａ）ほぼ中性のｐＨで生体組織に適用したときにヒドロゲルを形成することが可能な自己組織化ペプチドの溶液を含む１つまたは複数の容器を照射機内に配置すること、および
（ｂ）その所望の生物学的または物理的特性（複数可）が実質的に同じレベルで維持されるかまたは改善されながら、前記ペプチドの実質的な分解なしに、事前に決定された無菌性保証水準（ＳＡＬ）まで前記ペプチド溶液が滅菌されるように、所定の線量でガンマ線、Ｘ線および／または電子線照射に前記容器を曝露すること
を含む、方法。
(項目２)
前記ペプチドが、ＲＡＤＡ１６、ＫＬＤ１２、およびＩＥＩＫ１３からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記線量が、１５～５０ｋＧｙである、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記溶液が、Ｘ線または電子線により照射される、項目１から３に記載の方法。
(項目５)
前記ペプチド溶液が、ＲＡＤＡ１６を約２．５％含有し、前記線量が、１５～２４ｋＧｙである、項目２から４に記載の方法。
(項目６)
前記照射後の分解された全（「総」）ペプチドの量が、前記照射前の前記ペプチドの量の２０％を超えない、項目１から５に記載の方法。
(項目７)
前記所望の生物学的および物理的性質（複数可）が、止血性、抗接着、再出血の予防、抗狭窄、組織閉鎖、粘膜亢進、創傷治癒、貯蔵弾性率、粘度、および組織空隙充填特性からなる群より選択される、項目１から６に記載の方法。
(項目８)
前記自己組織化ペプチド溶液の照射前生物汚染度が、生成物単位当たり９ＣＦＵまたはそれよりも少ない、項目７に記載の方法。
(項目９)
照射線量が、少なくとも１０ －６ の無菌性保証水準（ＳＡＬ）を実現する、項目１から８に記載の方法。
(項目１０)
照射後の前記溶液中の完全長ペプチド（「主要ペプチド」）の分解生成物の濃度が、０．１％～５％の範囲である、項目１から９に記載の方法。
(項目１１)
照射前および後の前記溶液のｐＨが、約１．８～３．５の範囲である、項目１から１０に記載の方法。
(項目１２)
前記溶液の容器が、プラスチックシリンジである、項目１から１１に記載の方法。
(項目１３)
ゲル化溶液の貯蔵弾性率が、照射後に少なくとも１０％増大している、項目１から１２に記載の方法。
(項目１４)
前記溶液を剪断して、その貯蔵弾性率を低減させるかまたは回復させることをさらに含む、項目１から１３に記載の方法。
(項目１５)
項目１から１４のいずれか一項に記載の方法によって作製された自己組織化ペプチドの滅菌溶液。
(項目１６)
前記溶液を生体組織に適用することを含む、項目１５に記載の滅菌溶液を使用する方法。
(項目１７)
前記滅菌溶液を、外科手術中または出血を伴う外傷後に適用する、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記滅菌溶液を、ヒト対象の内部部位に適用する、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記自己組織化ペプチド溶液が、実質的に、図２～６の対応する照射後プロファイルで示される通りのおよび／または実施例に記載される通りの照射後質量分析（ＭＳ）プロファイル（例えば、ＰｕｒａＳｔａｔ（登録商標）の場合、追加の主要Ｍ ｚ ピークは８３６／１６７０、１１００、および１５１３ｍ／ｚで観察される）を示す、項目１に記載の方法。
(項目２０)
疾患または状態を処置または予防するための、自己組織化ペプチドの滅菌溶液の使用であって、前記滅菌溶液が、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、使用。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】