特許 7335081 口臭抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-21

(45)【発行日】2023-08-29

(54)【発明の名称】口臭抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/62 20060101AFI20230822BHJP

   A61K 36/48 20060101ALI20230822BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20230822BHJP

   A61Q 11/00 20060101ALI20230822BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20230822BHJP

   A61K 127/00 20060101ALN20230822BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20230822BHJP

   A61K 36/45 20060101ALN20230822BHJP

【ＦＩ】

A61K36/62

A61K36/48

A61K8/9789

A61Q11/00

A61P1/02

A61K127:00

A61K131:00

A61K36/45

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2019055033

(22)【出願日】2019-03-22

(65)【公開番号】P2020152701

(43)【公開日】2020-09-24

【審査請求日】2022-02-02

(73)【特許権者】

【識別番号】390011442

【氏名又は名称】株式会社マンダム

(74)【代理人】

【識別番号】110002239

【氏名又は名称】弁理士法人Ｇ－ｃｈｅｍｉｃａｌ

(72)【発明者】

【氏名】原 武史

【審査官】六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】特開平０２－２８６０４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０９－１１０６６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－１１７５６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０１－２４２０６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－０３５９０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－００７２９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－２１１１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－２１６４１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１３５９５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００３／０９０７０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平１０－００７５３９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ８／００－８／９９

Ａ６１Ｑ １／００－９９／００

Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジュンサイ抽出物及びルイボス抽出物を含むことを特徴とする口臭抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジュンサイ抽出物を含むことを特徴とする口臭抑制剤に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、口臭に対する意識が高まっている。口臭の主な原因は、口腔内の細菌により産生される口臭原因物質である。口臭原因物質としては、メチルメルカプタンや硫化水素等の揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）が知られており、これらの口臭原因物質の産生菌も特定されている。例えば、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（以下、「Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ」又は「Ｆｎ」と称することがある）が口臭原因物質の産生菌として知られている（特許文献１）。

【0003】

また、口腔内の常在菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（以下、「Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ」又は「Ｓｇ」と称することがある）は、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとの共培養によりバイオフィルム形成に大きな役割を果てしていることが知られている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開平０９－１１０６６２公報

【非特許文献】

【0005】

【文献】大阪大学歯学雑誌 ６１（１） Ｐ．１－４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉが口臭原因物質の産生に寄与するか否かは明らかにされていなかった。また、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの共培養が口臭原因物質の産生に寄与するか否かについても同様に明らかにされていなかった。このような機構が解明されれば、これを利用した口臭抑制成分のスクリーニング方法の開発や、新たな口臭抑制成分（口臭抑制剤）の発見に繋がることが期待されていた。

【0007】

これまでに知られている口臭原因菌を用いた口臭抑制成分のスクリーニング方法は、１種の菌が単独で口臭原因物質を産生するという機構を利用したものであった。しかし、２種以上の菌が原因となって口臭原因物質が産生されることが知られており、上記の様なスクリーニング方法は実際の口内環境に則したものではなかった。また、２種以上の菌が口臭原因物質を産生するという機構を想定したスクリーニング方法はこれまでに見出されていなかった。

【0008】

上記の様な事情に鑑み、課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとを共培養することにより、口臭原因物質の産生が顕著に増加する等の変化が生じることを見出し、この機構を利用した口臭抑制成分のスクリーニング方法を完成させるに至った。前記のスクリーニング方法により選出された物質は、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの共培養系を阻害することにより口臭原因物質の産生を低減するため、口臭抑制剤として使用されることが期待される。この様な口臭抑制剤は、一般的に経口摂取可能であることが求められ、例えば天然物やその抽出物を有効成分として含むことが安全性の観点から望ましい。

【0009】

したがって、本発明は、安全性が高く、経口摂取することが可能な口臭抑制剤の提供を目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記の様な事情に鑑み、課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの共培養機構を利用した口臭抑制成分のスクリーニング方法により、新規な口臭抑制成分を見出して本発明を完成させた。

【0011】

すなわち、本発明では、ジュンサイ抽出物を含むことを特徴とする口臭抑制剤を提供する。

【0012】

前記口臭抑制剤は、さらに、ルイボス抽出物及びリンゴンベリー抽出物からなる群より選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。

【発明の効果】

【0013】

本発明の口臭抑制剤は、口腔内の菌叢に悪影響を与えることなく、口臭の発生を元から絶つことができ、また、安全性が高く、経口摂取することができる。

【発明を実施するための形態】

【0014】

［口臭抑制剤］
本発明の口臭抑制剤はジュンサイ抽出物を含むことを特徴とする。また、本発明の口臭抑制剤は、さらに、ルイボス抽出物及びリンゴンベリー抽出物からなる群より選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。なお、本発明の口臭抑制剤は後述のＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの共培養機構を利用した口臭抑制成分のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」と称することがある）により見出されたものである。

【0015】

ジュンサイ（Brasenia schreberi）は、ジュンサイ科に属する多年生の水生植物である。ルイボス（Aspalathus linearis）は、マメ科アスパラトゥス属の植物である。リンゴンベリー（コケモモ、Vaccinium vitis-idaea）は、ツツジ科スノキ属の植物（常緑小低木）である。

【0016】

ジュンサイ、ルイボス、リンゴンベリーの抽出物は、その植物体又は植物体の部位や器官をそのまま使用して得られるものでもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ったものを使用して得られるものであってもよい。上記植物体の部位としては、例えば、根、塊根、根茎、幹、枝、茎、葉（葉身、葉柄等）、樹皮、樹液、樹脂、花（花弁、子房等）、果実（果肉や果皮）、種子等が挙げられる。また、これらの部位を複数組み合わせて用いてもよい。

【0017】

ジュンサイは、その根、茎、枝、葉、芽等のいずれの部位も使用できるが、特に葉が好ましい。ルイボスは、その根、茎、葉等のいずれの部位も使用できるが、特に全草が好ましい。リンゴンベリーは、その根、種、葉、茎、花、果実等のいずれの部位も使用できるが、特に果実（果肉や果皮）が好ましい。

【0018】

ジュンサイ、ルイボス、リンゴンベリーの抽出に使用する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。この中でも、水、低級アルコール等の極性溶媒が好ましい。これらの溶媒は、１種又は２種以上を混合して用いてもよい。

【0019】

ジュンサイ、ルイボス、リンゴンベリーの抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよく、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理をして用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。

【0020】

ジュンサイ抽出物としては、例えば、ジュンサイエキス－ＷＳＰ（オリザ油化株式会社製）等の市販品を使用することができる。ルイボス抽出物としては、例えば、ルイボス茶エキスパウダーＭＦ（丸善製薬株式会社製）、ルイボス ハーバセク ＭＰＥ（エイチ・ホルスタイン株式会社製）、ルイボス茶エキス末（ファーマテック株式会社製）等の市販品を使用することができる。リンゴンベリー抽出物としては、例えば、リンゴンベリーエキス－Ｐ０．５（オリザ油化株式会社製）、リンゴンベリーパウダー（株式会社エコロジーヘルスラボ製）等の市販品を使用することができる。

【0021】

本発明の口臭抑制剤は、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品に用いることができる。その製剤形態は種々のものを選択でき、例えば、練歯磨き、液体歯磨き、洗口液、軟膏剤、クリーム、口腔用ゲル、マウススプレー、マウスリンス、トローチ剤等が挙げられる。さらに、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤等の通常の医薬品の形態；飲料、タブレット、飴、グミ、ガム等の食品の形態を採用することもできる。飲食品は特に限定されないが、例えば、菓子、冷菓、乳製品、肉類、魚類、野菜類、それらの加工食品、清涼飲料、酒類、水が挙げられる。さらに、上記以外にも、家畜やペットの飼料等に用いることができる。

【0022】

本発明の口臭抑制剤は、上記抽出物をそのまま使用してもよく、該抽出物の効果を損なわない範囲内において、他の成分を配合して使用することもできる。他の成分としては、例えば、研磨剤、発泡剤、湿潤剤、保湿剤、結合剤、他の薬効成分等を配合することができる。さらに、ジュンサイ、ルイボス、リンゴンベリー抽出物以外の植物抽出物、ビタミン、ミネラル、アミノ酸等の他に、乳糖、デンプン、セルロース、マルチトール、デキストリン等の賦形剤、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、ゼラチン、プルラン、シェラック、ツェイン等の被膜剤、小麦胚芽油、米胚芽油、サフラワー油等の油脂類、ミツロウ、米糠ロウ、カルナウバロウ等のワックス類、ショ糖、ブドウ糖、果糖、ステビア、サッカリン、スクラロース等の甘味料、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸等の酸味料等を適宜配合することができる。

【0023】

本発明のジュンサイ抽出物における固形分の含有量は、その用途（例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品）により適宜選択されるものであり、特に限定されないが、例えば、０．１重量％以上であることが好ましく、より好ましくは１．０重量％、より好ましくは３．０重量％、より好ましくは５．０重量％、より好ましくは１０．０重量％である。なお、その上限は、例えば、１００重量％が好ましく、より好ましくは９０．０重量％、より好ましくは８０．０重量％である。

【0024】

［スクリーニング方法］
本発明の口臭抑制剤に含まれる有効成分は、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの共培養機構を利用した口臭抑制成分のスクリーニング方法により得られたものである。本スクリーニング方法は、下記の工程を含むことを特徴とする。
・被験物質及び口臭原因物質前駆体を含有する培地を用いて、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉとを培養する工程（以下、「培養工程」と称することがある）
・上記工程後、培養系中の口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の量を測定して、被験物質の口臭抑制効果を評価する工程（以下、「評価工程」と称することがある）

【0025】

口臭原因物質前駆体を含有する培地を用いて、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ（以下、「口臭原因菌」と称することがある）とを培養すると、口臭原因物質前駆体が前記口臭原因菌により代謝され口臭原因物質が産生する。ここで、被験物質の存在によって口臭原因物質の産生が抑制されることがある。この場合、前記被験物質が口臭抑制効果を有すると評価できる。前記スクリーニング方法はこの様な機構を利用したものである。

【0026】

（培養工程）
培養工程は、被験物質及び口臭原因物質前駆体を含有する培地を用いて、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとを培養する工程である。培養方法は特に限定されないが、例えば、培地に被験物質と口臭原因物質前駆体とを加えた後、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとを植菌して培養する方法や、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとを植菌した培地に被験物質と口臭原因物質前駆体とを加えて培養する方法などが挙げられる。なお、被験物質及び口臭原因物質前駆体は、培地に同時に加えてもよいし、別々に加えても良く、その順番は特に限定されない。また、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ及びＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉは、培地に同時に植菌してもよいし、別々に植菌してもよく、その順番は特に限定されない。

【0027】

被験物質は特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、動植物抽出物などが挙げられる。

【0028】

口臭原因物質前駆体としては、口臭原因物質の前駆体であってＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ又はＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉにより分解（代謝）されるものであれば特に限定されないが、スクリーニングの精度の観点からは、例えば、メチオニン、システイン、ホモシステイン、タウリンなどが挙げられ、好ましくは、メチオニン、システイン、ホモシステインが挙げられる。また、口臭原因物質前駆体が分解（代謝）されて生じる口臭原因物質としては、例えば、硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイド等の揮発性硫黄化合物が挙げられる。ここで、システイン及びホモシステインは主に硫化水素の前駆体となり、メチオニンは主にメチルメルカプタンの前駆体となる。

【0029】

被験物質及び口臭原因物質前駆体は、必要に応じて溶媒に溶解して用いてもよい。被験物質と口臭原因物質前駆体とは同一の溶媒に溶解して使用してもよいし、それぞれ別の溶媒に溶解して使用してもよい。前記溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、リン酸緩衝液、培地（後述の液体培地）などが挙げられる。

【0030】

培地は、一般的に口臭原因菌の培養に用いられる培地であれば特に限定されず、合成培地、天然培地のいずれであってもよいが、スクリーニングの精度の観点からは合成培地であることが好ましい。培地は固体培地及び液体培地のいずれであってもよいが、スクリーニングの精度の観点からは液体培地であることが好ましい。

【0031】

（評価工程）
評価工程は、培養工程後、培養系中の口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の量を測定して、被験物質の口臭抑制効果を評価する工程である。つまり、培養工程後の培養系中に含まれる口臭原因物質前駆体の量を測定して、被験物質の口臭抑制効果を評価する工程、培養工程後の培養系中に含まれる口臭原因物質の量を測定して、被験物質の口臭抑制効果を評価する工程、培養工程後の培養系中に含まれる口臭原因物質前駆体と口臭原因物質の双方の量を測定して、被験物質の口臭抑制効果を評価する工程の何れか１つの工程を意味する。

【0032】

「培養系中」は、培養工程後の培養器具内の固相、液相、及び気相の総称を意味する。本工程において、例えば、口臭原因物質前駆体が液相（例えば、液体培地）に含まれる場合は、液相に含まれる口臭原因物質前駆体の量を測定して被験物質の口臭抑制効果を評価する工程であってもよい。また、例えば、口臭原因物質が気相に存在する場合は、気相に含まれる口臭原因物の量を測定して被験物質の口臭抑制効果を評価する工程であってもよい。

【0033】

評価工程は、培養系中の口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の量を測定する工程と、口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の測定量から被験物質の口臭抑制効果を評価する工程とに分かれていてもよい。

【0034】

口臭原因物質前駆体の存在下で口臭原因菌を培養すると、口臭原因物質前駆体が口臭原因菌により分解（代謝）され、口臭原因物質が産生する。ここで、被験物質が培地中に存在することにより口臭原因物質前駆体や口臭原因物質の量が変化し得る。例えば、被験物質の存在により口臭原因菌による口臭原因物質の代謝経路が阻害され、口臭原因物質の産生能が低下した場合、口臭原因物質前駆体の分解は抑制される。また、被験物質が殺菌効果を有することより口臭原因菌が死滅した場合は、口臭原因物質の産生量は低下し、口臭原因物質前駆体の分解も抑制される。さらに、被験物質が口臭原因物質前駆体に直接的に作用することにより、口臭原因菌が口臭原因物質前駆体を分解することができなくなり、その結果、口臭原因物質前駆体の分解が抑制されるということも考えられる。なお、口臭原因物質前駆体の挙動について、口臭原因物質前駆体の分解が抑制される場合についてのみ例を挙げて説明したが、本評価工程では、被験物質の存在により口臭原因物質前駆体の分解が促進される場合であっても評価することが可能である。上記の通り、本評価工程は、口臭原因物質前駆体や口臭原因物質の挙動を総合勘案して、被験物質の口臭抑制効果を評価する工程であるといえる。

【0035】

培養系中の口臭原因物質前駆体や口臭原因物質の量を測定する方法としては、例えば、分析機器を用いた方法や、「臭い」を官能試験により判断する方法が挙げられる。ここで、分析機器を用いた方法は、官能試験を用いた方法と比較して、絶対評価が可能であることからスクリーニングの精度が高いという点、必要とする口臭原因物質前駆体等の量が少ないことから一度に多くの被験物質について評価を行うことができるという点で有効である。一方、官能試験を用いた方法は、分析機器を用いた方法と比較して、煩雑な操作を行うことなく簡便に評価を行うことができるという点で有効である。

【0036】

分析機器を用いた方法としては、例えば、ガスクロマトグラフィー－質量分析法、ガスクロマトグラフィー－水素炎イオン検出法、ガスクロマトグラフィー－炎光光度検出法（検出器として炎光光度検出器を使用）、ガスクロマトグラフィー－電子捕獲式検出法、高速液体クロマトグラフィー－紫外可視分光法、高速液体クロマトグラフィー－質量分析法等のクロマトグラフを用いた分析法や、半導体センサを用いた検出法などが挙げられる。口臭原因物質としての揮発性硫黄化合物は、例えば、ガスクロマトグラフィー－炎光光度検出法により、培養系中の含有量を求めることができる。クロマトグラフを用いた分析法では、口臭原因物質前駆体に対応するピークの面積から培養系中の口臭原因物質前駆体の含有量を算出することができる。

【0037】

本評価工程における、被験物質の口臭抑制効果を評価する方法としては、例えば、以下の評価方法が挙げられる。
・口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の測定量と、被験物質を使用しないこと以外は同様にして得られた口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の測定量とを比較して評価する方法

【0038】

上記評価方法は、対象とする被験物質について培養工程を行うと共に、被験物質を使用しないこと以外は同様にして培養工程を実施し、それぞれの培養系中の口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の量を測定して、これらの比較から被験物質の口臭抑制効果を評価する方法である。本評価方法は、被験物質の口臭抑制効果を定量的に且つ精密に評価することが可能な点で優れる。なお、本発明の口臭抑制剤に係る有効成分は、上記評価方法を利用して選出されたものであるため、高い口臭抑制効果を備えることが実証されているといえる。

【0039】

上記評価方法を採用した場合のスクリーニング方法としては、具体的には以下の通りである。
口臭原因物質前駆体及び被験物質を含有する培地を用いて、口臭原因菌（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ及びＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）を培養する工程（「培養工程Ａ」と称する）
培養工程Ａの後、培養系中の口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の量を測定する工程（「測定工程Ａ」と称する）
口臭原因物質前駆体を含有する培地を用いて、口臭原因菌を培養する工程（「培養工程Ｂ」と称する）
培養工程Ｂ後、培養系中の口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の量を測定する工程（「測定工程Ｂ」と称する）
測定工程Ａにおける口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の測定量と、測定工程Ｂにおける口臭原因物質前駆体及び／又は口臭原因物質の測定量との比較から被験物質の口臭抑制効果を評価する工程

【0040】

（生菌数測定工程）
本スクリーニング方法は培養工程の後に、さらに生菌数測定工程を含んでいてもよい。生菌数測定工程は、培地中の口臭原因菌の生菌数を測定する工程であって、評価工程の前後のいずれにおいて実施してもよく、評価工程と同時に実施してもよい。

【0041】

被験物質が口臭原因菌による口臭原因物質の産生を抑制（阻害）する効果（口臭抑制効果）を評価する場合、その効果は口臭原因菌を殺菌すること（死滅させること）により、口臭原因物質の産生を抑制する効果（「殺菌効果」と称することがある）と、口臭原因菌による代謝を阻害することにより、口臭原因物質の産生を抑制する効果（「代謝阻害効果」と称することがある）とに分類されるが、スクリーニング方法に生菌数測定工程が含まれる場合は口臭原因菌の生死を判断することができるため、被験物質の殺菌効果及び代謝阻害効果のそれぞれについて評価することが可能となる。つまり、口臭抑制効果が存在し、口臭原因菌が死滅している場合は、被験物質が殺菌効果を有すると判断でき、口臭抑制効果が存在し、口臭原因菌が生存している場合は、被験物質が代謝阻害効果を有すると判断できる。

【0042】

生菌数の測定方法は特に限定されないが、例えば、培養液の一部を寒天培地に塗布し、一定時間培養後に生成したコロニーの数を計測するコロニーカウント法、顕微鏡観察によって培養液中の生菌数を測定する方法、生菌に含まれているＡＴＰ量を測定して生菌数を算出する生物発光法、培養液の透過率を分光光度計で測定して生菌数を算出する濁度測定法などが挙げられる。

【実施例】

【0043】

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

【0044】

［前培養］
（Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍの前培養）
Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ＡＴＣＣ２５５８６を用いて前培養を行った。具体的な方法としては以下の通りである。
１ｇ／ｍＬトリプチケースペプトン、１ｍｇ／ｍＬ酵母エキス、１ｇ／ｍＬバイオセートペプトン、１．９２ｇ／ｍＬブレインハートインヒュージョン、５μｇ／ｍＬヘミン、１μｇ／ｍＬメナジオン、０．２ｍＭリン酸水素二カリウム、０．３ｍＭリン酸二水素カリウム、４．８ｍＭ炭酸水素ナトリウム、７２μＭ塩化カルシウム、１．４ｍＭ塩化ナトリウム及び６６μＭ硫酸マグネシウムを添加した培地１５ｍＬにＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍのコロニーを添加し、３７°Ｃで２３時間嫌気培養した。この菌液１ｍＬを前記培地２０ｍＬに添加し、３７°Ｃで２０時間嫌気培養した。

【0045】

（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉの前培養）
Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ ＤＬ１ Ｃｈａｌｌｉｓを用いて前培養を行った。具体的な方法としては以下の通りである。
トッドヘヴィット（ＴＨＢ）平板培地でＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉを２４時間、３７°Ｃで培養し、コロニーを作製した。ＴＨＢ液体培地２０ｍＬにコロニーを懸濁し、３７°Ｃで２３時間好気培養した。この菌液１０μＬをＴＨＢ液体培地３０ｍＬに添加し、３７°Ｃで２０時間好気培養した。

【0046】

［ｍＣＤＭの調製］
表１で示す構成を有する培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ、ｍＣＤＭ）を調製した。具体的な方法としては以下の通りである。
リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、及び塩化マンガン・４水和物を純水（ＭｉｌｌｉＱ水）で溶解後、オートクレーブ滅菌した。また、それ以外の試薬は、純水（ＭｉｌｌｉＱ水）で溶解後、０．２μｍフィルターでろ過滅菌した。これらの溶液を混合し、ｐＨを６．５に調整した後、０．２μｍフィルターでろ過滅菌して調製した。

【0047】

【表1】

【0048】

［ＧＣ－ＦＰＤの分析条件］
実施例におけるＧＣ－ＦＰＤの分析条件は以下の通りである。
Ａｐｐａｒａｔｕｓ：ＧＣ－１４Ｂ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＺＯ－１Ｈ ３．１ｍ×３．２ｍｍ ｉ．ｄ． （Ｓｈｉｎｗａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｌｔｄ．）
Ｃｏｌｕｍｎ Ｔｅｍｐ．：７０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ （１８０℃）
Ｃａｒｒｉｅｒ Ｇａｓ：Ｎｉｔｒｏｇｅｎ （ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ５０ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｅｍｐ．：１５０℃
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｔｅｍｐ．：１８０℃

【0049】

［実施例１（被験物質のスクリーニング）］
最終濃度が０．５ｍＭになるようにメチオニン（Ｍｅｔ）をｍＣＤＭに添加し、ｐＨを６．５に調整してｍＣＤＭ＋Ｍｅｔとした。前培養したＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ及びＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉのそれぞれをＰＢＳで洗浄後、ＯＤ６００が１．０になるようにｍＣＤＭ＋Ｍｅｔで懸濁することで菌液Ｆｎ＋Ｍｅｔ及び菌液Ｓｇ＋Ｍｅｔを得た。２０ｍＬのｍＣＤＭ＋Ｍｅｔと、１０ｍＬの菌液Ｆｎ＋Ｍｅｔと、１０ｍＬの菌液Ｓｇ＋Ｍｅｔとを培養器具に入れて混合し、嫌気ジャーで３７°Ｃ、１６時間培養した。前記培養器具は、ガラス製の２００ｍＬ三角フラスコに、培養容器外に位置する先端にゴム管（長さ：１０ｃｍ、内径：０．３ｍｍ）を備えたステンレス製の通気管（長さ：１０ｃｍ、内径：０．３ｍｍ）を有するシリコン栓をしたのち、フラスコの密閉部から通気管とゴム管との接合部までをアルミホイルで被覆したものを用いた。培養後のフラスコ内のヘッドスペースガスを１０ｍＬ採取し、１ｍＬをＧＣ－ＦＰＤへ供することにより、ＣＨ₃ＳＨの含有量を測定した。得られたＣＨ₃ＳＨの含有量をコントロールとして用いた。なお、下記の式（１）における「Ｃ」に相当する。

【0050】

２０ｍＬのｍＣＤＭ＋Ｍｅｔと、１０ｍＬの菌液Ｆｎ＋Ｍｅｔと、１０ｍＬの菌液Ｓｇ＋Ｍｅｔとの混合液を使用する代わりに、終濃度が１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、又は１００ｐｐｍとなるようにサンプルを配合した、２０ｍＬのｍＣＤＭ＋Ｍｅｔと、１０ｍＬの菌液Ｆｎ＋Ｍｅｔと、１０ｍＬの菌液Ｓｇ＋Ｍｅｔとの混合液を用いたこと以外は実施例１と同様にして、嫌気ジャーで３７°Ｃ、１６時間培養し、ＣＨ₃ＳＨの含有量を測定した。得られたＣＨ₃ＳＨの含有量は、下記の式（１）における「Ｓ」に相当する。

【0051】

下記式（１）にしたがって、サンプルのＣＨ₃ＳＨの産生抑制率を評価した。その結果を表２に示す。
ＣＨ₃ＳＨ産生抑制率（％）＝［（Ｃ－Ｓ）／Ｃ］×１００ 式（１）
Ｃ：コントロールのＣＨ₃ＳＨ含有量
Ｓ：サンプル配合時のＣＨ₃ＳＨ含有量

【0052】

【表2】

【0053】

表２の通り、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍとＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉとの共培養機構に対し、ＣＨ₃ＳＨの産生抑制率が高い物質として、ジュンサイ抽出物、ルイボス抽出物、リンゴンベリー抽出物を得た。この中でも、ジュンサイ抽出物とルイボス抽出物とが、極めて高い抑制効果があることが明らかとなった。

【0054】

実施例１にて見出されたサンプルを以下に説明する。
ジュンサイ抽出物：ジュンサイエキス－ＷＳＰ（オリザ油化株式会社製）
ルイボス抽出物：ルイボス茶エキスパウダーＭＦ（丸善製薬株式会社製）
リンゴンベリー抽出物：リンゴンベリーエキス－Ｐ０．５（オリザ油化株式会社製）

【0055】

［実施例２（臭気強度の測定）］
上記のジュンサイ抽出物、ルイボス抽出物、リンゴンベリー抽出物が実際に口臭抑制剤としての機能を有するか否かを確認するため、以下の評価を行った。
被験者３名に対し、１分間、口を閉じた後の口気を、２００ｍＬのテドラーバッグ（近江オドエアーサービス社製）に採取した後、専門パネル１名により官能評価（６段階臭気強度表示法に準拠）を下記に示す口臭判定基準に従って実施した。得られた結果（数値）の平均値を算出し、表３の「ブランク」の欄に記載した。
（６段階臭気強度表示法）
０点：無臭
１点：やっと感知できるにおい（不快ではないにおい）
２点：何のにおいか判る程度の弱いにおい（やや不快なにおい）
３点：楽に感知できるにおい
４点：強いにおい
５点：強烈なにおい

【0056】

ジュンサイ抽出物を終濃度１．０質量％に希釈した水溶液４０ｍＬを口に入れ、２０秒間口内でゆすいだ。その後、１分間、口を閉じた後の口気を、２００ｍＬのテドラーバッグ（近江オドエアーサービス社製）に採取し、上記基準にしたがって臭気強度を測定・算出した。その結果を表３の「直後」の欄に記載した。また、その１時間経過後に、１分間、口を閉じた後の口気について、上記と同様の方法で臭気強度を測定・算出した。その際の結果を表３の「１ｈｒ後」の欄に記載した。なお、表中の「減少度１」とは「ブランク」から「直後」を減じた数値であり、「減少度２」とは「ブランク」から「１ｈｒ後」を減じた数値である。また、数値は小数点以下第２位を四捨五入したものである。

【0057】

さらに、ジュンサイ抽出物を１．０質量％に希釈した水溶液に代えて、表３に記載したサンプルを用いたこと以外は同様にして、それぞれの臭気強度を測定・算出した。結果を表３に示す。

【0058】

【表3】

【0059】

表３の通り、In vivo試験においてもジュンサイ抽出物、ルイボス抽出物、リンゴンベリー抽出物の口臭抑制効果が示された。本評価においても、ジュンサイ抽出物とルイボス抽出物とが、極めて高い口臭抑制効果があることが明らかとなった。また、驚くべきことにジュンサイ抽出物とルイボス抽出物とを含むサンプルや、ジュンサイ抽出物とリンゴンベリー抽出物とを含むサンプルは、ジュンサイ抽出物のみを含むサンプルよりも高い口臭抑制効果があることが明らかとなった。すなわち、ジュンサイ抽出物は、ルイボス抽出物やリンゴンベリー抽出物と併用することにより、相乗的な口臭抑制効果が発揮されることが示された（「減少度１」を参照）。さらに、この効果は持続することが示された（「減少度２」を参照）。

【0060】

［実施例３（ＶＳＣ産生抑制効果）］
上記のジュンサイ抽出物、ルイボス抽出物、リンゴンベリー抽出物の口臭抑制効果と揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）との関係性を確認するため、以下の評価を行った。
被験者３名に対し、１分間、口を閉じた後の口気を、２００ｍＬのテドラーバッグ（近江オドエアーサービス社製）に採取した後、口気に含まれるＶＳＣ濃度をハリメーター ＲＨ１７Ｋ（タイヨウ）で３回測定し、平均値を算出した。得られた結果（数値）の平均値を算出した。算出されたＶＳＣ濃度は、下記の式（２）における「ｃ」に相当する。

【0061】

ジュンサイ抽出物を１．０質量％に希釈した水溶液４０ｍＬを口に入れ、２０秒間口内でゆすいだ。その後、１分間、口を閉じた後の口気を、２００ｍＬのテドラーバッグ（近江オドエアーサービス社製）に採取し、上記と同様にしてＶＳＣ濃度を測定・算出した（表４の「直後」に関する）。また、その１時間経過後に、１分間、口を閉じた後の口気について、上記と同様の方法でＶＳＣ濃度を測定・算出した（表４の「１ｈｒ後」に関する）。算出されたＶＳＣ濃度は、下記の式（２）における「ｓ」に相当する。

【0062】

下記式（２）にしたがって、サンプルのＶＳＣ産生抑制率を評価した。その結果を表４に示す。
ＶＳＣ産生抑制率（％）＝［（ｃ－ｓ）／ｃ］×１００ 式（２）
ｃ：コントロールのＶＳＣ濃度
ｓ：サンプル配合時のＶＳＣ濃度

【0063】

【表4】

【0064】

表４の通り、ＶＳＣ濃度に基づいた評価においても、ジュンサイ抽出物、ルイボス抽出物、リンゴンベリー抽出物の口臭抑制効果の存在を裏付ける結果となった。また、ジュンサイ抽出物とルイボス抽出物を含むサンプルや、ジュンサイ抽出物とリンゴンベリー抽出物とを含むサンプルが、ジュンサイ抽出物のみを含むサンプルよりも高い口臭抑制効果を有することを裏付ける結果となった。すなわち、上記結果は、ジュンサイ抽出物はルイボス抽出物やリンゴンベリー抽出物と同時に使用することにより、相乗的な口臭抑制効果が発揮されるという実施例２の結果を裏付けるものといえる。