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特許7335971ＮＫ細胞培養培地用添加組成物、前記添加組成物を用いたＮＫ細胞培養方法、及び前記培養方法で得られた皮膚トラブル改善用化粧料組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-22
(45)【発行日】2023-08-30
(54)【発明の名称】ＮＫ細胞培養培地用添加組成物、前記添加組成物を用いたＮＫ細胞培養方法、及び前記培養方法で得られた皮膚トラブル改善用化粧料組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20230823BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230823BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20230823BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230823BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230823BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230823BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20230823BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230823BHJP
A61K 38/20 20060101ALN20230823BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 G
C12N5/0783
C12P21/00 A
A61P17/02
A61Q19/00
A61K35/17
A61K8/98
A61P17/00
A61K38/20
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021557578
(86)(22)【出願日】2020-03-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-08
(86)【国際出願番号】 KR2020003943
(87)【国際公開番号】W WO2020197216
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2021-11-26
(31)【優先権主張番号】10-2019-0035275
(32)【優先日】2019-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】521404602
【氏名又は名称】シン，ジ ソプ
(73)【特許権者】
【識別番号】521404613
【氏名又は名称】シン，ウ ソプ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】シン，ジ ソプ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ウ ソプ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ミン ジ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ドン ヒョク
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】韓国登録特許第１０－１７６０７６４（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】特開２０１９－０３１４７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０２７３８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０１２０１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５１２８４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５００２１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２００８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平１１－５０１６５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０９７５４０（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１５－５２６０８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０８２２０２３５（ＣＮ，Ａ）
【文献】Justin L. Eddy et al.，Cellular Immunology，2014年06月18日，Vol. 290，p. 120-130
【文献】David J. Morgan et al.，frontiers in Immunology，2017年04月13日，Vol. 8, Article 432，p. 1-15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一つ以上を有効成分として含む、ＮＫ細胞を増殖するためのＮＫ細胞培養培地用添加組成物であって、
前記有効成分は、ステロイド剤であって、ＮＫ細胞が増殖されるように作用し、
前記ステロイド剤はグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）であり、
前記グルココルチコイドは、コルチゾール（Ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、コルチゾン（Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉ ｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、トリアムシノロン（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、酢酸フルドロコルチゾン（Ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、及び酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｅｏｘｙｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）よりなる群から選ばれる１つ以上であり、
前記ＮＫ細胞培養培地用添加組成物は、さらに、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８を含有することを特徴とする、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物。
【請求項2】
前記添加組成物は、ＮＫ細胞培養段階で前記ＮＫ細胞培養培地のＴ細胞が刺激された後に処理されることを特徴とする、請求項１に記載のＮＫ細胞培養培地用添加組成物。
【請求項3】
前記ステロイド剤は０．２μｇ／ｍｌ以上の濃度で含まれることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＮＫ細胞培養培地用添加組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫療法に適用されるナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＮＫ細胞）の培養方法に係り、より具体的には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を抑制してＮＫ細胞を効率よく増幅及び活性化させるＮＫ細胞培養培地用添加組成物、前記添加組成物を用いたＮＫ細胞培養方法、及び前記培養方法で得られた皮膚トラブル改善用化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＮＫ細胞は、初期の生体防御機構と人体の腫瘍免疫において重要な役割を果たすことが知られている。つまり、ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）の発現による免疫取得過程なしでも、特定の自家細胞、同種細胞、さらには異種がん細胞も殺傷することができ、特に、Ｃｌａｓｓ１ ＭＨＣを少なく発現するか或いは発現しない標的細胞をより上手く殺すことができる。したがって、ＮＫ細胞は、ＭＨＣが発現されない大部分のがん細胞を効果的に殺すことができ、その他にも、幾つかのウイルスに感染した細胞とジャンチプス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）などの細菌を殺すことができる。しかし、このようにがん細胞の殺傷に優れた作用をするＮＫ細胞は、健常な人の場合にも末梢血リンパ球の５～１５％のみを占めており、特に重症のがん患者の場合にはその割合が１％未満に低下するので、免疫療法による別途の増幅過程なしではがん細胞を効果的に攻撃するのに限界がある。
【0003】
免疫療法は、がんの治療に最も重要な免疫細胞、例えばナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＮＫ細胞）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞などを患者の血液から抽出した後、多様な種類の刺激剤を用いて、がんに強く作用する免疫細胞に育てた後、再び患者に注入する方法であって、患者自身の血液を使用するため、従来の化学療法などに比べて副作用も少なく、投与法も簡便であって、最近、盛んに研究されている。
【0004】
特に、ＮＫ細胞培養においてＴ細胞、特にヘルパーＴ細胞の役割が必要であるが、ヘルパーＴ細胞（Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ又はＴｈ ｃｅｌｌ）は、白血球の分化及び活性化を調節することにより体液性及び細胞性免疫を促進する細胞をという。細胞の表面にＣＤ４タンパク質を持っているという特徴のため、ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ぶ。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、詳細機能によってさらにＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇなどに分類される。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン－γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）と腫瘍壊死因子－β（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ、ＴＮＦ－β）を分泌することにより、マクロファージの内部でエンドソームとリソソームとが融合してエンドリソソームを形成するように誘導する。一方、Ｔｈ２細胞は、さまざまな種類のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）を分泌してＢ細胞が形質細胞に分化するようにする。Ｔｈ１７細胞は、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）を分泌して好中球を集めさせる。制御性Ｔ細胞とも呼ばれＴｒｅｇ細胞は、免疫反応を促進するのではなく、むしろ抑えることにより、免疫の恒常性を維持しながら自己免疫反応などを遮断する。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系の構成成分であって、他の細胞の免疫反応を抑制するが、これは、免疫系で過剰な反応を防ぐために作られた重要な「自己点検」である。制御性Ｔ細胞は、侵入した微生物を成功的になくした後の免疫反応を止めるのに関与するほか、自己免疫細胞疾患を防ぐのにも関与する。免疫システムは、自己（ｓｅｌｆ）と非自己を区別することができなければならない。自己／非自己の区別に失敗した場合、免疫システムは、体内の細胞と組織を破壊し、その結果、自己免疫疾患を起こす。制御性Ｔ細胞は、積極的に免疫システムの活性を抑制し、自己免疫疾患などの病的な自己反応を防ぐ。制御性Ｔ細胞がどのように抑制／調節活動をするかに対する分子単位作用原理は、まだ明らかに解明されておらず、免疫抑制サイトカインＴＧＦ－βとインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）も、制御性Ｔ細胞の機能に関連していることが報告されている。
【0005】
一方、免疫細胞を活性化するために、さまざまな種類の抗体やサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などを使用すると、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ（Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇｓ））も一緒に活性化される。ただし、Ｔｒｅｇは、活性化に他の細胞に比べてより時間がかかる。したがって、細胞培養の初期には細胞の数がよく増加するが、約８日～９日以上培養したときには活性化されたＴｒｅｇによって細胞の数が思ったほど増加しない場合がたまにある。特に免疫力が多く低下しているがん患者などで多く発見され、Ｔｒｅｇ細胞の数が多く活性化されている患者の場合にはこのような現象が顕著になるが、これはＴｒｅｇによる影響のせいである。
【0006】
よって、Ｔｒｅｇによる影響を最小限に抑えて免疫細胞を大量に増殖することができるＮＫ細胞大量培養方法に関する技術が開発される必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者は、かかる問題点を解決するために研究努力した結果、免疫細胞の培養時に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を阻害することができる技術を開発することにより、本発明を完成した。
【0008】
そこで、本発明の目的は、ＮＫ細胞培養の際に特定の時期にＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を阻害することによりＮＫ細胞をより多く増殖させることができるＮＫ細胞培養培地用添加組成物、前記添加組成物を用いたＮＫ細胞培養方法、及びその方法で得られたＮＫ細胞を含む免疫細胞治療剤を提供することにある。
【0009】
本発明の他の目的は、ＩＦＮ－γとＩＬ－１０などの濃度が高い無血清免疫細胞培養液を有効成分として含むため炎症の除去に効果的に作用するので、皮膚トラブルの改善などに優れた効果を示す化粧料組成物を提供することにある。
【0010】
本発明の別の目的は、ＩＦＮ－γとＩＬ－１０などの濃度が高い無血清免疫細胞培養液を有効成分として含むため炎症の除去に効果的に作用するので、創傷や火傷などの傷の治療及び皮膚疾患の治療などに優れた効果を示す薬学組成物を提供することにある。
【0011】
本発明の目的は、以上で言及した目的に制限されず、明示的に言及されていなくても、後述される発明の詳細な説明の記載から通常の知識を有する者が認識することが可能な発明の目的も当然含まれることができる。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記の目的を達成するために、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一つ以上を有効成分として含む、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物を提供する。
【0013】
好適な実施例において、前記有効成分は、ステロイド剤であって、ＮＫ細胞が増殖されるように作用する。
【0014】
好適な実施例において、前記ステロイド剤は、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）である。
【0015】
好適な実施例において、前記グルココルチコイドは、コルチゾール（Ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、コルチゾン（Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉ ｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、トリアムシノロン（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、酢酸フルドロコルチゾン（Ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、及び酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｅｏｘｙｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）よりなる群から選ばれる１つ以上である。
【0016】
好適な実施例において、前記添加組成物は、ＮＫ細胞培養段階で前記ＮＫ細胞培養培地のＴ細胞が刺激された後に処理される。
【0017】
好適な実施例において、前記ステロイド剤は０．２μｇ／ｍｌ以上の濃度で含まれる。
【0018】
また、本発明は、血液から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が培養される培養培地にＮＫ細胞刺激用物質を処理するＮＫ細胞刺激段階と、前記ＮＫ細胞刺激段階でＮＫ細胞が刺激された後、前記培養培地にＴ細胞刺激用物質を処理するＴ細胞刺激段階と、前記Ｔ細胞刺激段階によってＴ細胞が刺激された後、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一つ以上を含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物を前記培養培地に処理する添加組成物処理段階と、を含んでなる、ＮＫ細胞培養方法を提供する。
【0019】
好適な実施例において、前記ＮＫ細胞刺激用物質は、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体及びＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８よりなる群から選ばれる一つ以上であり、前記Ｔ細胞刺激用物質は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ２８抗体よりなる群から選ばれる１つ以上である。
【0020】
好適な実施例において、前記制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物は、ステロイド剤であって、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性を抑制することによりＮＫ細胞がうまく増殖されるように作用する。
【0021】
好適な実施例において、前記Ｔ細胞刺激段階は培養２日目に行われ、前記添加組成物処理段階は培養３日目に行われる。
【0022】
好適な実施例において、前記添加組成物処理段階が培養５日後に１回以上さらに行われることができる。
【0023】
好適な実施例において、前記添加組成物は、前記ステロイド剤を０．２μｇ／ｍＬ以上の濃度で含み、前記ステロイド剤は、ＩＬ－１２が０．５～５ｎｇ／ｍＬの濃度、ＩＬ－１８が２～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれるように前記ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を基本溶液に溶解させて形成されたサイトカイン１－１溶液又は担体に溶解される。
【0024】
好適な実施例において、前記添加組成物処理段階の実行後に１１日乃至１６日培養した後、ＮＫ細胞を収穫する段階をさらに含む。
【0025】
また、本発明は、上述したＮＫ細胞培養方法によって得られたＮＫ細胞を有効成分として含む免疫細胞治療剤を提供する。
【0026】
また、本発明は、上述したいずれか一つのＮＫ細胞培養方法で２０日以上培養されて分離されるか或いは収穫されて凍結した後、解凍されて活力が低下したＮＫ細胞を準備する段階；及び前記準備されたＮＫ細胞をサイトカイン１－１溶液で培養する段階；を含むＮＫ細胞再活性化方法を提供する。
【0027】
また、本発明は、上述したいずれか一つのＮＫ細胞培養方法で１１日間培養した後、ＮＫ細胞を分離する段階；前記分離されたＮＫ細胞をサイトカイン１－１溶液で培養する段階と、前記ＮＫ細胞を収穫して残った培地組成物を得る段階と、を含む、ＮＫ細胞培地組成物の製造方法を提供する。
【0028】
また、本発明は、上述したＮＫ細胞培地組成物の製造方法によって得られたＮＫ細胞培地組成物を有効成分として含む、皮膚トラブル改善用化粧料組成物を提供する。
【0029】
また、本発明は、上述したＮＫ細胞培地組成物の製造方法によって得られたＮＫ細胞培地組成物を有効成分として含む、皮膚疾患治療用薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【0030】
上述した本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物は、ＮＫ細胞培養の際に特定の時期にＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性を抑制することによりＮＫ細胞をより多く増殖させることができる。
【0031】
また、本発明の化粧料組成物及び薬学組成物は、ＩＦＮ－γとＩＬ－１０などの濃度が高い無血清免疫細胞培養液を有効成分として含むため、炎症の除去に効果的に作用するので、皮膚トラブルの改善だけでなく、創傷や火傷などの傷の治療及び皮膚疾患の治療などに優れた効果がある。
【0032】
本発明のかかる技術的効果は、以上で言及した範囲のみに制限されず、明示的に言及されていなくても、後述される発明の実施のための具体的内容の記載から通常の知識を有する者が認識することができる発明の効果も当然含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】本発明の実施例に係るＮＫ細胞培養方法において時間による細胞数の変化を示すグラフである。
【図2a】本発明の実施例に係るＮＫ細胞培養方法で培養された培養培地のＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図2b】比較例によって培養された培養培地のＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図3a】ＮＫ細胞の割合が約５０％程度となる細胞を用いて、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物に含まれるステロイド剤の濃度を約２倍高めてｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ８に処理したものと処理していないものを培養して得られたＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図3b】ＮＫ細胞の割合が約５０％程度となる細胞を用いて、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物に含まれるステロイド剤の濃度を約２倍高めてｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ８に処理したものと処理していないものを培養して得られたＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図4a】サイトカインと抗ＣＤ３抗体のみを用いてＮＫ細胞培養の際にＮＫ細胞培養培地用添加組成物を処理した培養培地のＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図4b】サイトカインと抗ＣＤ３抗体のみを用いてＮＫ細胞培養の際にＮＫ細胞培養培地用添加組成物を処理していない培養培地のＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図5a】抗ＣＤ３抗体を固定化させる方法でＮＫ細胞培養の際にＮＫ細胞培養培地用添加組成物を処理した培養培地のＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【図5b】抗ＣＤ３抗体を固定化させる方法でＮＫ細胞培養の際にＮＫ細胞培養培地用添加組成物を処理していない培養培地のＦＡＣＳデータを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明で使用する用語は、特定の実施例を説明するために使用されたもので、本発明を限定するものではない。単数の表現は、文脈上明白に異なる意味を有しない限り、複数の表現を含む。本出願において、「含む」又は「有する」などの用語は、明細書に記載された特徴、数字、段階、動作、構成要素、部分品又はこれらの組み合わせが存在することを指定しようとするもので、一つ又はそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素、部分品又はこれらの組み合わせの存在又は付加の可能性を予め排除しないものと理解されるべきである。
【0035】
「第１」、「第２」などの用語は、多様な構成要素の説明に使用できるが、これらの構成要素は、これらの用語によって限定されてはならない。これらの用語は、一つの構成要素を他の構成要素から区別する目的のみで使われる。例えば、本発明の権利範囲から逸脱することなく、第１構成要素は第２構成要素と命名でき、同様に第２構成要素も第１構成要素と命名できる。
【0036】
また、別に定義しない限り、技術的或いは科学的用語を含んで、ここで使用される全ての用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に使用される辞典に定義されているような用語は、関連技術の文脈上において持つ意味と一致する意味であると解釈されるべきであり、本明細書において明白に定義しない限りは、理想的又は過度に形式的な意味で解釈されない。
【0037】
本発明において、「免疫細胞」は、ＮＫ細胞及びＴ細胞のみを含む意味で使用された。「ＮＫ細胞」は、ＮＫ細胞とＮＫＴ細胞をすべて含む意味で使用されるが、場合によっては、ＮＫ細のみを意味するものとしても使用できる。
【0038】
時間関係に関する説明の場合、例えば、「～の後」、「～に続いて」、「～次に」、「～前に」などで時間的前後関係が説明される場合は、「すぐに」又は「直接」が使用されない限り、連続的ではない場合も含む。
【0039】
以下、添付図面及び好適な実施例を参照して本発明の技術的構成を詳細に説明する。
【0040】
しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態で具体化されることもできる。明細書全体にわたって、本発明を説明するために使用される同じ参照番号は同じ構成要素を示す。
【0041】
本発明の技術的特徴は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の新規用途に関することであり、特に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一つ以上を有効成分として含むことで、ＮＫ細胞培養の際に特定の時期にＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性を阻害することによりＮＫ細胞をより多く増殖させることができるＮＫ細胞培養培地用添加組成物、これを用いたＮＫ細胞培養方法、その方法により得られた免疫細胞治療剤及び培地組成物にある。
【0042】
つまり、ＮＫ細胞を培養する際に、ＮＫ細胞は、初期だけでなく、培養中にも刺激が必要であるが、Ｔ細胞の刺激は初期刺激のみで十分なので、ＮＫ細胞刺激物質でＮＫ細胞をまず刺激した後、Ｔ細胞刺激物質でＴ細胞を刺激して活性化させ、活性化されたＴ細胞とＮＫ細胞刺激物質が一緒にＮＫ細胞をさらに刺激するようにした後、すぐに活性化されたＴ細胞のうちのＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性を抑制することができる方法を見つけることができれば、ＮＫ細胞をより多く活性化或いは増殖させることができることは自明であるからである。
【0043】
このような事実を基に、本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制することが知られており、その中でも、Ｔｒｅｇ細胞をさらに抑制することが知られている制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の作用をＮＫ細胞の培養に活用することができるという、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の新規用途を開発した。
【0044】
より具体的には、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物として広く知られているステロイド剤は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、ＴｒｅｇなどのＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制して炎症及び疼痛除去効果があるものの、長期間使用した場合に免疫低下などの関連副作用が激しいことが知られているが、ＮＫ細胞培養の際には、免疫細胞の活性化後、ステロイド剤によってＴｒｅｇ細胞が抑制されると、むしろＮＫ細胞の増殖及び活性化が抑制されず、培養中に免疫細胞がある程度過密してもＮＫ細胞の活性化及び細胞増殖を妨害しないことを確認したからである。
【0045】
したがって、本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一つ以上を有効成分として含む。
【0046】
ここで、前記有効成分は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を抑制することさえできれば、公知の全ての薬物が使用できるが、一具現例としてステロイド剤を使用することができる。ステロイド剤は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性を抑制することによりＮＫ細胞の増殖に作用するものである。実験的に、ステロイド剤は、制御性Ｔ細胞の免疫反応抑制活性を除去して全体的にＴ細胞の成長をある程度抑制する特性も持つことが分かった。
【0047】
本発明において、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物に含まれるステロイド剤は、ステロイド剤として作用することができる公知の全てのステロイド剤薬物を使用することができるが、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｌｉｄｓ）系であり得る。一具現例として、コルチゾール（Ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、コルチゾン（Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉ ｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、トリアムシノロン（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、酢酸フルドロコルチゾン（Ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、及び酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｅｏｘｙｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）よりなる群から選ばれる１つ以上であることができる。
【0048】
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物は０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で含まれることができるが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一例として使用されたステロイド薬物類は、後述する実験例から分かるように、一度活性化されたＮＫ細胞及びＴｃ細胞などの細胞性免疫細胞の増殖には全く影響を与えないことを確認したとともに、培養時間が経つほどＮＫ細胞の割合がさらに上がることが確認することができた。特に、ステロイド薬物の濃度が高くなると、Ｔ細胞の増殖率がある程度抑制されてステロイド薬物の濃度に比例してＮＫ細胞の割合が相対的に多く高まる効果もあった。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物として使用されたステロイド剤が０．１μｇ／ｍｌ未満で処理されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性を抑制する特性が十分に発揮されず、後述する実験例を介してステロイド剤が高濃度で処理されても９μｇ／ｍｌを超えると、ＮＫ細胞の培養に及ぼす影響が大きく変わらないことが予測された。したがって、本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物に含まれる調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物は０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度を持つことさえすれば、所望の効果を得ることができると予測される。
【0049】
また、公知のように、ＮＫ細胞培養の際に、ＮＫ細胞は、初期に刺激された後に十分に活性化されるためには必ず刺激されたＴ細胞の助けが必要であるので、本発明の添加組成物は、ＮＫ細胞培養段階でＮＫ細胞培養培地のＴ細胞が刺激された後に処理できる。このようにＮＫ細胞培養の際に、本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物をＮＫ細胞培養培地のＴ細胞刺激後の適切な時期に使用すると、非常に効果的にＴｃ及びＮＫ免疫細胞増殖率、特にＮＫ細胞の増殖率を増加させることができる。
【0050】
次に、本発明のＮＫ細胞培養方法は、血液から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が培養される培養培地にＮＫ細胞刺激用物質を処理するＮＫ細胞刺激段階と、前記ＮＫ細胞刺激段階でＮＫ細胞が刺激された後、前記培養培地にＴ細胞刺激用物質を処理するＴ細胞刺激段階と、前記Ｔ細胞刺激段階によってＴ細胞が刺激された後、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物の一つ以上を含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物を前記培養培地に処理する添加組成物処理段階と、を含むことができる。また、添加組成物処理段階の実行後に１１日乃至１６日培養した後、ＮＫ細胞を収穫する段階をさらに行うことができる。
【0051】
ここで、ＮＫ細胞刺激用物質は、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体及びＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８よりなる群から選ばれる一つ以上であり、Ｔ細胞刺激用物質は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ２８抗体よりなる群から選ばれる１つ以上であることができる。
【0052】
より具体的には、一般的にＮＫ免疫細胞培養の際にＩＬ－２によってＴｈ１を刺激して活性化する状態で抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体などのＮＫ細胞刺激物質によってＮＫ細胞を刺激する。また、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質によってＴｈ細胞を刺激して活性化されたＴｈ１細胞によってＮＫ細胞及びＴｃ細胞を刺激するようになり、ＮＫ及びＴｃ細胞が活性化され、特に、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ５６抗体の刺激によってＮＫ細胞が活性化され、うまく育てられる。しかし、抗ＣＤ３抗体などで刺激をすると、全てのＴ細胞を刺激するので、特にＴｈ２などの体液性免疫細胞及びＴｒｅｇも一緒に刺激するが、これらの細胞は、ＮＫ細胞が活性化及び増殖されるのに役立たない。特に、Ｔｒｅｇ細胞は、ＮＫ細胞の活性化及び増殖を妨害するため、Ｔｒｅｇ細胞を無力化すると、ＮＫ細胞をうまく増殖させることができる。
【0053】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物のうちの複数種類のステロイド薬物は、Ｔ細胞、特にＴｒｅｇを抑制するので、時期に合わせてうまく使用すると、ナチュラルキラー細胞の培養に効果的に使用できるが、一具現例として、Ｔ細胞刺激段階は培養２日目に行われ、添加組成物処理段階は培養３日目に行われることができる。つまり、ＮＫ細胞培養０日及び／又は１日目にＮＫ細胞刺激物質を処理してＮＫ細胞を刺激した後、培養２日目に抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ２８などのＴ細胞刺激物質でＴ細胞を刺激してＴｃ、ＮＫ細胞などを活性化した後、培養３日目に、本発明のステロイド剤が含まれている添加組成物で処理すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制活性が抑制されるので、ＮＫ細胞などが増殖及び／又は活性化されるのに抑制活性を示さない。また、添加組成物処理段階が培養５日後に１回以上さらに行われることができる。
【0054】
このように本発明のＮＫ細胞培養方法によってＣＤ４＋Ｔ細胞、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を抑制すると、後述する実験例から分かるように、ＮＫ細胞の割合を、添加組成物を処理していない場合に比べて大幅に高めることができる。
【0055】
一方、本発明のＮＫ細胞培養方法で使用される添加組成物は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性抑制用薬物を０．１μｇ／ｍＬ以上の濃度で含むが、一具現例として、ステロイド剤は、サイトカイン１－１溶液（ＩＬ－１２が０．５～５ｎｇ／ｍＬの濃度、ＩＬ－１８が２～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれるように前記ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を基本溶液に溶解させて形成）又は担体に溶解することができる。ここで、基本溶液（Ｂ溶液）は、ＩＬ－２、Ｌ－グルタミン及び細胞培養用培地を含むものである。
【0056】
次に、本発明の免疫細胞治療剤は、上述したＮＫ細胞培養方法で得られたＮＫ細胞を有効成分として含む。本発明の免疫細胞治療剤は、概して、ＮＫ細胞を生理食塩水などの担体に含ませてリンガー形式で患者の体内に投与できるが、ＮＫ細胞には影響を与えないものの、患者の治療に有効な公知の成分をさらに含むことができる。ここで、患者は、人間だけでなく、哺乳動物を含むことができる。
【0057】
また、本発明のＮＫ細胞再活性化方法は、活力が低下したＮＫ細胞の力価を高めるための方法であって、上述したＮＫ細胞培養方法で２０日以上培養されて分離されるか、或いは上述したＮＫ細胞培養方法で収穫されて凍結保管された後、解凍されて活力が低下したＮＫ細胞を準備する段階と、前記準備されたＮＫ細胞をサイトカイン１－１溶液で培養する段階と、を含む。
【0058】
一般的に、リンパ球細胞の培養初期、すなわち、細胞が若いとき（培養初期）には、ＩＬ－２などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の高濃度でうまく増殖されるが、培養約８～１０日後には増殖率が低下し、上手く育てられない。この時、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の濃度を薄くすれば、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を低下させることにより、比較的にうまく増殖される。ところが、この場合、ＮＫ細胞増殖率が大きくないだけでなく、弱いＮＫ細胞の場合にはその活性を失いやすい。このとき、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８などのサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が含まれている溶液で処理すると、ＮＫ細胞の活性度が上がるが、Ｔｒｅｇ細胞も一緒に活性化されてＮＫ細胞の数が減少し、一貫してＮＫ細胞を活性化することが容易ではない。Ｔｒｅｇが弱ければ、ＮＫ細胞の活性化がある程度になることもできるが、殆どは、細胞の数が急激に減少するか、或いは特に重症のがん患者の場合にはＮＫ細胞が活性化されないことが多い。しかし、本発明のＮＫ細胞培養方法のように培養初期にＮＫ細胞とＴ細胞を刺激した後、ステロイド剤を含む添加組成物を処理してＴｒｅｇを抑えた状態では、培養８～１０日後にサイトカインの濃度を高めれば、ＮＫ細胞の増殖に妨げることなくＮＫ細胞がうまく増殖及び活性化される。
【0059】
特に、本発明の再活性化方法によれば、ＮＫ細胞は培養３～４週に細胞分裂がほぼ最後に達し、非常に老いて活性を失った細胞であっても上手く活性化されることを確認した。
【0060】
次に、本発明のＮＫ細胞培地組成物の製造方法は、大量のＩＦＮ－γとＩＬ－１０を含む培地組成物を得るための方法であって、ＮＫ細胞培養方法で１１日間培養した後、ＮＫ細胞を分離する段階と、前記分離されたＮＫ細胞をサイトカイン１－１溶液で培養する段階と、前記ＮＫ細胞を収穫して残った培地組成物を得る段階と、を含む。つまり、ＩＬ－１０は、マクロファージをＭ２ｂ型に誘導して炎症を除去する役割を果たすようにすることが知られているからである。
【0061】
次に、本発明の化粧料組成物及び薬学組成物は、上述したＮＫ細胞培地組成物の製造方法で得られた培地組成物を有効成分として使用することができる。特に、本発明の培地組成物は、後述する実験例のようにＩＦＮ－γとＩＬ－１０が多く含まれていることが確認され、皮膚トラブルの改善だけでなく、傷の治療及び皮膚疾患の治療に効果的である。また、ＮＫ細胞培養の際に得られた培地組成物の効果が記載されている韓国特許公開第１０－２０１８－００５７３５９号公報によれば、皮膚美白、色素沈着の除去、しわ改善のうちの一つ以上に有効であり、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、にきび、虫刺されによって生じた炎症などに炎症改善効果が良かった。特に、かゆみを迅速になくす効果があり、火傷、創傷などの治療による皮膚再生効果と沈着色素の除去効果が非常に良いことが確認されるので、本発明の化粧料組成物及び薬学組成物に対する有効性が間接的に裏付けられることが分かる。
【0062】
また、後述する本発明のＮＫ細胞培養方法の幾つかの実施例で使用される免疫細胞培養用培地添加キット（ＮＫＴＭ）は、免疫細胞培養の各段階で培地に添加できるようにそれぞれ個別に包装され、内容物、すなわち構成成分が異なるＢユニット（基本溶液、Ｂ溶液）、Ｃ１－１ユニット（サイトカイン１－１溶液）、Ｃ１－２ユニット、Ｃ２ユニット、Ａ１ユニット、Ａ２ユニット及びＤユニットを含んで構成されるが、各ユニットについての詳細な説明、及び前記ユニットを用いて免疫細胞を培養する培養過程（ＮＫＴＭ培養過程）に対する具体的な条件についての詳細な説明は、韓国特許公開第１０－２０１８－００５７３５９号公報（以下、「先行特許」という）に開示されているので、下記の実施例では、先行特許に記載されたている部分と異なる部分だけを重点的に説明する。
【実施例1】
【0063】
１．基本溶液（Ｂ溶液）の準備
ＩＬ－２ ２．２ｍｇと５００ｍＭ Ｌ－グルタミン溶液１００ｍＬを浮遊細胞培養用基本培地（基本培地にＩＬ－２又はＬ－グルタミンが既に存在する場合、最終濃度を合わせるために添加量を調整する）に入れて溶かし、最終的に１０Ｌにして基本溶液（Ｂ溶液）を製造した。
ＩＬ－２ ２．２ｍｇと５００ｍＭ Ｌ－グルタミン溶液１００ｍＬを浮遊細胞培養用基本培地（基本培地にＩＬ－２又はＬ－グルタミンが既に存在する場合、最終濃度を合わせるために添加量を調整する）に入れて溶かし、最終的に１０Ｌにして基本溶液（Ｂ溶液）を製造した。
【0064】
２．サイトカイン１－１溶液の準備
ＩＬ－１２ ２０μｇとＩＬ－１８ １２５μｇを蒸留水に溶かして１０ｍＬにしてサイトカイン溶液（Ｃ溶液）を製造した。Ｃ溶液１ｍＬを基本溶液（Ｂ１溶液）１０００ｍＬに溶かしてサイトカイン１－１溶液（Ｃ１－１溶液）を製造した。
ＩＬ－１２ ２０μｇとＩＬ－１８ １２５μｇを蒸留水に溶かして１０ｍＬにしてサイトカイン溶液（Ｃ溶液）を製造した。Ｃ溶液１ｍＬを基本溶液（Ｂ１溶液）１０００ｍＬに溶かしてサイトカイン１－１溶液（Ｃ１－１溶液）を製造した。
【0065】
３．ＮＫ細胞培養培地用添加組成物の製造
サイトカイン１－１溶液にリン酸デキサメタゾンナトリウム（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が１μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように溶解させ、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物１を準備した。
サイトカイン１－１溶液にリン酸デキサメタゾンナトリウム（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が１μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように溶解させ、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物１を準備した。
【実施例2】
【0066】
プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）（ソロンド錠、５ｍｇ／錠、ユハンヤンヘン製）をＲＰＭＩ培地に溶かして１６７μｇ／ｍＬの濃度にした後、Ｃ１－１溶液で２０倍に希釈して濃度８．３μｇ／ｍＬのＮＫ細胞培養培地用添加組成物２を準備した。
【実施例3】
【0067】
メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）（ＰＤ錠、４ｍｇ／錠、ＪＷ中外製薬製）をＲＰＭＩ培地に溶かして８０μｇ／ｍＬの濃度にし、Ｃ１－１溶液で１０倍に希釈して濃度８μｇ／ｍＬのＮＫ細胞培養培地用添加組成物３を準備した。
【実施例4】
【0068】
リン酸ベタメタゾンナトリウム（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ハンオルベタメタゾン注、５．２ｍｇ／１ｍＬのアンプル、ハンオルバイオファーマ製）は、ハンオルベタメタゾン注１μＬをＣ１－１溶液１０ｍＬに溶かして濃度０．４μｇ／ｍＬのＮＫ細胞培養培地用添加組成物４を準備した。
【実施例5】
【0069】
次の方法でＮＫ細胞を培養した。
【0070】
１．培地添加キットの準備
（１）Ａ液：抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体がそれぞれ０．０１～１．５μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体をＢ１溶液に溶かして作った溶液
（２）Ａ１溶液：抗ＣＤ１６抗体が０．１～１５μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ１６をＣ１－１溶液に溶かして作った溶液
（３）Ａ２溶液：抗ＣＤ５６抗体が０．１～１５μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ５６抗体をＣ１－１溶液に溶かして作った溶液
（４）Ｂ１溶液：浮遊細胞培養用基本培地溶液にＩＬ－２を１０００～４０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように作った溶液
（５）Ｂ２溶液：Ｂ１よりＩＬ－２の濃度が２倍である溶液
（６）Ｃ１－１溶液：ＩＬ－１２が０．５～５ｎｇ／ｍＬの濃度、ＩＬ－１８が２～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれるようにＩＬ－１２及びＩＬ－１８をＢ１溶液に溶かして作った溶液
（７）Ｃ５溶液：Ｃ１－１溶液よりＩＬ－２、ＩＬ－１８の濃度が５倍である溶液
（８）Ｄ溶液：抗ＣＤ３抗体が１～１２μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ３抗体をＣ１－１溶液に溶かして作った溶液
（９）Ｒ溶液：サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）や抗体が含まれておらず、Ｌ－グルタミンが３～１２ｍＭの濃度で含まれている浮遊細胞培養用基本培地溶液
（１）Ａ液：抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体がそれぞれ０．０１～１．５μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体をＢ１溶液に溶かして作った溶液
（２）Ａ１溶液：抗ＣＤ１６抗体が０．１～１５μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ１６をＣ１－１溶液に溶かして作った溶液
（３）Ａ２溶液：抗ＣＤ５６抗体が０．１～１５μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ５６抗体をＣ１－１溶液に溶かして作った溶液
（４）Ｂ１溶液：浮遊細胞培養用基本培地溶液にＩＬ－２を１０００～４０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように作った溶液
（５）Ｂ２溶液：Ｂ１よりＩＬ－２の濃度が２倍である溶液
（６）Ｃ１－１溶液：ＩＬ－１２が０．５～５ｎｇ／ｍＬの濃度、ＩＬ－１８が２～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれるようにＩＬ－１２及びＩＬ－１８をＢ１溶液に溶かして作った溶液
（７）Ｃ５溶液：Ｃ１－１溶液よりＩＬ－２、ＩＬ－１８の濃度が５倍である溶液
（８）Ｄ溶液：抗ＣＤ３抗体が１～１２μｇ／ｍＬの濃度で含まれるように抗ＣＤ３抗体をＣ１－１溶液に溶かして作った溶液
（９）Ｒ溶液：サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）や抗体が含まれておらず、Ｌ－グルタミンが３～１２ｍＭの濃度で含まれている浮遊細胞培養用基本培地溶液
【0071】
２．培養過程
リンパ球抽出及び自己血漿準備段階を先行特許と同様に行った。
リンパ球抽出及び自己血漿準備段階を先行特許と同様に行った。
【0072】
Ｄａｙ０：血液から分離したＰＢＭＣ１．０×１０７個をＣ１－１溶液に溶かして培養を開始した。
Ｄａｙ１：細胞培養中の細胞にＡ２溶液１ｍＬを追加した。
Ｄａｙ２：細胞培養中の細胞にＤ溶液１ｍＬを追加した。
Ｄａｙ３：細胞培養中の細胞にＮＫ細胞培養培地用添加組成物１を５ｍＬ追加した。
Ｄａｙ４：必要な場合は、より大きな培養容器に細胞を移して培養する。細胞培養中の細胞にＲ溶液３ｍＬを追加するか、或いはＣ１－１溶液１０ｍＬで培地を交換する。
Ｄａｙ５：細胞培養中の細胞にＡ１溶液２０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ６：細胞培養中の細胞にＡ溶液２０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ７：細胞培養中の細胞にＢ１溶液４０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ８：細胞培養中の細胞にＲ溶液３００ｍＬを追加した。
Ｄａｙ１０：細胞培養中の細胞にＲ溶液３００ｍＬを追加した。
Ｄａｙ１１：細胞培養中の細胞にＢ２溶液３００ｍＬとＣ５溶液５０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ１４～Ｄａｙ１９：細胞を収穫した。
Ｄａｙ１：細胞培養中の細胞にＡ２溶液１ｍＬを追加した。
Ｄａｙ２：細胞培養中の細胞にＤ溶液１ｍＬを追加した。
Ｄａｙ３：細胞培養中の細胞にＮＫ細胞培養培地用添加組成物１を５ｍＬ追加した。
Ｄａｙ４：必要な場合は、より大きな培養容器に細胞を移して培養する。細胞培養中の細胞にＲ溶液３ｍＬを追加するか、或いはＣ１－１溶液１０ｍＬで培地を交換する。
Ｄａｙ５：細胞培養中の細胞にＡ１溶液２０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ６：細胞培養中の細胞にＡ溶液２０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ７：細胞培養中の細胞にＢ１溶液４０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ８：細胞培養中の細胞にＲ溶液３００ｍＬを追加した。
Ｄａｙ１０：細胞培養中の細胞にＲ溶液３００ｍＬを追加した。
Ｄａｙ１１：細胞培養中の細胞にＢ２溶液３００ｍＬとＣ５溶液５０ｍＬを追加した。
Ｄａｙ１４～Ｄａｙ１９：細胞を収穫した。
【実施例6】
【0073】
Ｄａｙ３にＮＫ細胞培養培地用添加組成物２を４．５ｍＬ追加した以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した。
【実施例7】
【0074】
Ｄａｙ３にＮＫ細胞培養培地用添加組成物３を４．５ｍＬ追加した以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した。
【実施例8】
【0075】
Ｄａｙ３にＮＫ細胞培養培地用添加組成物４を４．５ｍＬ追加した以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した。
【0076】
比較例１
Ｄａｙ３にＮＫ細胞培養培地用添加組成物１を添加していない以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した。
Ｄａｙ３にＮＫ細胞培養培地用添加組成物１を添加していない以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した。
【0077】
実験例１
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制用薬物の一つ以上を有効成分として含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物がＮＫ細胞培養の際に及ぼす効果を確認するために、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞培養の際に得られる細胞増殖結果と、比較例１と同様の方法で得られる細胞増殖結果を観察し、その結果を表１（単位：×１０７個）、表２、図１～図２ｂに示した。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制用薬物の一つ以上を有効成分として含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物がＮＫ細胞培養の際に及ぼす効果を確認するために、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞培養の際に得られる細胞増殖結果と、比較例１と同様の方法で得られる細胞増殖結果を観察し、その結果を表１（単位：×１０７個）、表２、図１～図２ｂに示した。
【0078】
【表1】
【0079】
【表2】
【0080】
表１及び図１から分かるように、免疫細胞を培養する過程でｄａｙ２に抗ＣＤ３抗体で処理してＴｈ細胞を刺激した後、実施例５のようにｄａｙ３にステロイド系注射剤であるデキサメタゾン１μＬが含まれているＮＫ細胞培養培地用添加組成物を培地に入れて培養し、ｄａｙ４にＴｈ２、Ｔｒｅｇなどによって作られたサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を除去するために既存の培地を除去し、Ｃ１溶液で交換して培養し続けて得られた細胞の数と、ステロイド剤を使用していない比較例１で得られた細胞の数とを比較すると、初期細胞数の差を勘案して、その増殖率が比較例１よりも実施例５の方法でｄａｙ１４まで培養したときに約４．３倍以上、ｄａｙ１７まで培養したときに約５．９倍以上さらに増殖されたことを確認することができた。また、表２、図２ａ及び図２ｂから分かるように、増殖培養培地でＮＫ細胞が占める割合だけでなく、活性度も実施例５が比較例１よりもさらに高いことが分かる。一方、実施例５において、Ｄａｙ４に培地交換後にもステロイド薬物を入れれば効果がさらに良いこともあるが、ｄａｙ３に１回のみ処理しても効果が非常に良いことが分かる。
【0081】
また、既に公知になっているように、リンパ球の培養で得られた活性化リンパ球をエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）、血液がん細胞株（Ｋ５６２）を標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）としてそれぞれ使用し、がん細胞に比べて活性化リンパ球の割合を１０：１に設定して血液がん細胞株に対する活性化リンパ球の殺害能力を測定する力価分析を行ったとき、活性化リンパ球の中でＮＫ細胞が占める割合が高いほどその値が高いことは当然なので、本発明によって培養されたＮＫ細胞の比重が非常に高い活性化リンパ球の治療効果に優れるのは当然予測することができるだろう。
【0082】
実験例２
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制用薬物として様々なステロイド剤を含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物の効果を確認するために、実施例６～８と同様の方法でＮＫ細胞培養の際に得られる細胞増殖結果を観察し、その結果を表３（単位：×１０７個）に示した。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）抑制用薬物として様々なステロイド剤を含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物の効果を確認するために、実施例６～８と同様の方法でＮＫ細胞培養の際に得られる細胞増殖結果を観察し、その結果を表３（単位：×１０７個）に示した。
【0083】
【表3】
【0084】
表３から分かるように、デキサメタゾンを含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物１とは異なり、それぞれプレドニゾロンを含有するＮＫ細胞培養培地用添加組成物２、メチルプレドニゾロンを含有するＮＫ細胞培養培地用添加組成物３、及びリン酸ベタメタゾンナトリウムを含むＮＫ細胞培養培地用添加組成物４が添加された実施例６～８の場合も、非常にうまく増殖されることを確認することができる。
【0085】
実験例３
ＮＫ細胞の割合が約５０％程度となる細胞を使用し、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物に含まれるステロイド剤の濃度を約２倍に高めてｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ８に添加して培養した以外は、実施例５と同様の方法を行って得られた結果と、ＮＫ細胞の割合が約５０％程度となる細胞を使用したことを除けば比較例１と同様の方法を行って得られた結果とを比較し、それぞれ図３ａ及び図３ｂに示した。
ＮＫ細胞の割合が約５０％程度となる細胞を使用し、ＮＫ細胞培養培地用添加組成物に含まれるステロイド剤の濃度を約２倍に高めてｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ８に添加して培養した以外は、実施例５と同様の方法を行って得られた結果と、ＮＫ細胞の割合が約５０％程度となる細胞を使用したことを除けば比較例１と同様の方法を行って得られた結果とを比較し、それぞれ図３ａ及び図３ｂに示した。
【0086】
図３ａ及び図３ｂは、本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物が使用される場合には、ＮＫ細胞の割合が８１．３５％であるが、本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物が使用されない場合には、ＮＫ細胞の割合が５１．７６％であることを示すので、最初からＮＫ細胞の細胞割合が高い状態で培養を開始しても、本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物が処理されると、培養過程でＮＫ細胞の増殖率をさらに高めることを確認することができる。
【0087】
実験例４
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物の効果を確認するために、実施例のように別途のＮＫ細胞培養用添加キットを使用せず、一般的に使用されるＮＫ細胞培養方法を用いて、ＮＫ細胞を次のとおりに培養した。リンパ球（１×１０７）を分離してＮＫ免疫細胞の刺激のためのＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８などのサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を用いて、細胞刺激後培養２日目に抗ＣＤ３抗体を刺激して培養し、ＣＤ１６、ＣＤ５６抗体などは全く使用せず、培養３日目にＮＫ細胞培養培地用組成物１を処理した。その後、培地は、ＩＬ－２が添加された一般培地を使用した。細胞数の増加に応じて培地を添加しながら細胞を培養した。１４日間培養を行い続けた後、その結果を表４、図４ａ及び図４ｂに示した。
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物の効果を確認するために、実施例のように別途のＮＫ細胞培養用添加キットを使用せず、一般的に使用されるＮＫ細胞培養方法を用いて、ＮＫ細胞を次のとおりに培養した。リンパ球（１×１０７）を分離してＮＫ免疫細胞の刺激のためのＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８などのサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を用いて、細胞刺激後培養２日目に抗ＣＤ３抗体を刺激して培養し、ＣＤ１６、ＣＤ５６抗体などは全く使用せず、培養３日目にＮＫ細胞培養培地用組成物１を処理した。その後、培地は、ＩＬ－２が添加された一般培地を使用した。細胞数の増加に応じて培地を添加しながら細胞を培養した。１４日間培養を行い続けた後、その結果を表４、図４ａ及び図４ｂに示した。
【0088】
下記表４、図４ａ及び図４ｂから分かるように、別途の培地添加キットを使用せず、サイトカインと抗ＣＤ３抗体のみを用いて、ＮＫ細胞培養の際にも本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物を培養３日目に処理すると、使用しない場合よりも１４日培養後のＮＫ細胞が２倍以上にうまく増殖され、ＮＫ細胞の比重が３１．１％とさらに大きいだけでなく、ＮＫＴ細胞も２６．２％にうまく増殖される。
【0089】
【表4】
【0090】
実験例５
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物の効果を確認するために、実施例のように別途のＮＫ細胞培養用添加キットを使用せず、一般的に使用されるＮＫ細胞培養方法、特に固定化された抗ＣＤ３抗体を用いて、次のとおりにＮＫ細胞を培養した。抗ＣＤ３抗体をＴ２５フラスコに固定化した後、分離されたリンパ球（０．８×１０７）を約１時間反応させ、その後、ＩＬ－２及びＣＤ１６、ＣＤ５６抗体を用いて培養した。ＣＤ１６、ＣＤ５６抗体は２日目、４日目、６日目に刺激をし、培養３日目にＮＫ細胞培養培地用組成物１を処理した。その後、培地は、ＩＬ－２が添加された一般培地を使用した。細胞数の増加に応じて培地を添加し、細胞を培養した。１４日間培養を行い続けた後、その結果を表５、図５ａ及び図５ｂに示した。
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物の効果を確認するために、実施例のように別途のＮＫ細胞培養用添加キットを使用せず、一般的に使用されるＮＫ細胞培養方法、特に固定化された抗ＣＤ３抗体を用いて、次のとおりにＮＫ細胞を培養した。抗ＣＤ３抗体をＴ２５フラスコに固定化した後、分離されたリンパ球（０．８×１０７）を約１時間反応させ、その後、ＩＬ－２及びＣＤ１６、ＣＤ５６抗体を用いて培養した。ＣＤ１６、ＣＤ５６抗体は２日目、４日目、６日目に刺激をし、培養３日目にＮＫ細胞培養培地用組成物１を処理した。その後、培地は、ＩＬ－２が添加された一般培地を使用した。細胞数の増加に応じて培地を添加し、細胞を培養した。１４日間培養を行い続けた後、その結果を表５、図５ａ及び図５ｂに示した。
【0091】
下記表５、図５ａ及び図５ｂから分かるように、別途の培地添加キットを使用せず、抗ＣＤ３抗体をＴ２５フラスコに固定化し、サイトカイン、抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６抗体を用いて、ＮＫ細胞培養の際にも本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物を培養３日目に処理すると、使用しない場合よりも１４日培養後にＮＫ細胞が２倍以上に上手く増殖され、ＮＫ細胞の比重が４９．７２％とさらに大きく増殖された。
【0092】
【表5】
【0093】
実施例９
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物が、活力が低下した細胞の再活性に及ぼす影響力を実験するために、実施例５の方法によってＴｒｅｇ細胞を抑制しつつ培養して２５日目になり、活性が低下した老化細胞を用いて再活性化を次のように試みた。既存の培地を除去するために遠心分離して上澄み液を除去し、一般培地（ＲＰＭＩ）に入れて約２時間培養した後、培地をＣ１溶液で交換して３日培養した。
本発明のＮＫ細胞培養培地用添加組成物が、活力が低下した細胞の再活性に及ぼす影響力を実験するために、実施例５の方法によってＴｒｅｇ細胞を抑制しつつ培養して２５日目になり、活性が低下した老化細胞を用いて再活性化を次のように試みた。既存の培地を除去するために遠心分離して上澄み液を除去し、一般培地（ＲＰＭＩ）に入れて約２時間培養した後、培地をＣ１溶液で交換して３日培養した。
【0094】
実験例６
実施例９で再活性化されたＮＫ細胞の活性度を測定し、その結果を表６に示した。
下記表６に示すように、Ｔｒｅｇによって活性が抑制されずに増加することが観察され、細胞の数も急激に減少することは観察されなかった。ただし、測定誤差とも考えられるが、細胞が老化して自然減少する程度の若干の細胞数減少は観察された。この方法は、非常に短時間内（１日～３日）にＮＫ細胞を活性化することができる方法であって、老化細胞だけでなく、末梢血から直ちに分離したＰＢＭＣ中のＮＫ細胞の活性化はもとより、凍結後に解凍されて活力が低下したＮＫ細胞の再活性化にも非常に効果的であると予測される。
実施例９で再活性化されたＮＫ細胞の活性度を測定し、その結果を表６に示した。
下記表６に示すように、Ｔｒｅｇによって活性が抑制されずに増加することが観察され、細胞の数も急激に減少することは観察されなかった。ただし、測定誤差とも考えられるが、細胞が老化して自然減少する程度の若干の細胞数減少は観察された。この方法は、非常に短時間内（１日～３日）にＮＫ細胞を活性化することができる方法であって、老化細胞だけでなく、末梢血から直ちに分離したＰＢＭＣ中のＮＫ細胞の活性化はもとより、凍結後に解凍されて活力が低下したＮＫ細胞の再活性化にも非常に効果的であると予測される。
【0095】
【表6】
【0096】
実施例１０
血液内にＩＬ－１０の濃度が高いためＴｒｅｇ細胞が多く活性化されているものと思われるヒトからＰＢＭＣを得た以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した後、ｄａｙ１２に細胞を取り出して既存の培養液を除去し、Ｃ１溶液を用いて２日間培養した後、ＮＫ細胞を分離して残った培養培地組成物を得た。
血液内にＩＬ－１０の濃度が高いためＴｒｅｇ細胞が多く活性化されているものと思われるヒトからＰＢＭＣを得た以外は、実施例５と同様の方法でＮＫ細胞を培養した後、ｄａｙ１２に細胞を取り出して既存の培養液を除去し、Ｃ１溶液を用いて２日間培養した後、ＮＫ細胞を分離して残った培養培地組成物を得た。
【0097】
実験例７
実施例１０で得られた培養培地組成物の成分を確認し、その結果を表７に示した。
実施例１０で得られた培養培地組成物の成分を確認し、その結果を表７に示した。
【0098】
【表7】
【0099】
表７は培養１２日にＣ１溶液で刺激して２日培養の際に細胞の数がうまく増加し、ＩＦＮ－γとＩＬ－１０が多く増加するのはもとより、ＩＬ－８は非常に少ない量だけが作られることを示す。これに対し、Ｃ１溶液で活性化せずにそのまま分離すると、全体的にサイトカインが少なく増加することが分かる。このようにＴｒｅｇ細胞が発達したヒトの免疫細胞であっても、本発明のＮＫ細胞培養培地用組成物で処理した後、培養１２日にＣ１溶液で刺激したときに細胞の数が減少せずに増加し、大量のＩＦＮ－γとＩＬ－１０を作ることを確認することができる。一方、ＩＬ－８は、好中球を集め、炎症に多く関連するサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であり、ＩＬ－１０は、マクロファージをＭ２ｂ型に誘導して炎症を除去する役割を果たすことが知られており、このように得た培養培地組成物は、皮膚トラブルの改善だけでなく、炎症から誘発される皮膚疾患治療などにも効果的である。
【0100】
本発明は、以上で説明したように好適な実施例を挙げて図示及び説明したが、前述した実施例に限定されず、本発明の精神を逸脱することなく、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって様々な変更及び修正が可能である。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
