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特許7336145ＰＭＹＯＮＧ２ベクターシステムを用いたＨＩＶ－１ Ｐ２４を発現する組換えＢＣＧ及びそのＨＩＶ－１ワクチンへの利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-23
(45)【発行日】2023-08-31
(54)【発明の名称】ＰＭＹＯＮＧ２ベクターシステムを用いたＨＩＶ－１ Ｐ２４を発現する組換えＢＣＧ及びそのＨＩＶ－１ワクチンへの利用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230824BHJP
A61K 39/21 20060101ALI20230824BHJP
A61K 39/04 20060101ALI20230824BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230824BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230824BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20230824BHJP
C12N 15/49 20060101ALN20230824BHJP
C07K 14/16 20060101ALN20230824BHJP
C12R 1/32 20060101ALN20230824BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
A61K39/21
A61K39/04
A61P37/04
A61P31/18
A61P31/06
C12N15/49
C07K14/16 ZNA
C12R1:32
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020564211
(86)(22)【出願日】2019-03-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-09
(86)【国際出願番号】 KR2019003597
(87)【国際公開番号】W WO2019221383
(87)【国際公開日】2019-11-21
【審査請求日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】10-2018-0055059
(32)【優先日】2018-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0034183
(32)【優先日】2019-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成３０年３月２７日にウェブサイト（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００６４３）で公開されたＦｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅ ６４３にて学術論文（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＣＧ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ （ＨＩＶ－１） Ｇａｇ Ｕｓｉｎｇ ａ ｐＭｙｏｎｇ２ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｕｓｅ Ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ ＨＩＶ－１ Ｖａｃｃｉｎｅ）を公開
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】509329800
【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ボム－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ビョン－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ボ－ラム
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０５５９１６３２（ＵＳ，Ａ）
【文献】nature，1991年，351:6326，479-482
【文献】scientific reports，2017年，7:44776，1-11
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ １／３８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列で示すヒト免疫不全ウイルスタイプ１由来のｐ２４タンパク質を発現する組換えマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧであって、前記ｐ２４タンパク質を発現するｐＭｙｏｎｇ２－ＴＯＰＯベクターシステムで形質転換された、組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ。
【請求項2】
前記ｐ２４タンパク質は、配列番号２の塩基配列で示すヒト免疫不全ウイルスタイプ１由来のＧａｇ遺伝子がコーディングされたものである、請求項１に記載の組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ。
【請求項3】
前記マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧは、Ｔｏｋｙｏ １７２菌株である、請求項１又は２に記載の組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧを有効成分として含む、ＨＩＶ－１に対する免疫反応を誘導するための組成物。
【請求項5】
前記組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧは、生きているものである、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧは、さらに弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）されないものである、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項7】
ＨＩＶ－１に対する免疫反応を誘導するための組成物の製造のための請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルスタイプ－１（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－Ｉ、ＨＩＶ－１）感染に対する予防及び／又は治療に用いられる新規な組換えＢＣＧ、これを含むワクチン組成物、その製造方法などに関する。より詳しくは、本発明は、新規なマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）－大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）用シャトルベクター（以下、「ｐＭｙｏｎｇ２」、大韓民国特許登録番号：１０１２９１６６８００００、アメリカ特許登録番号：８，８４１，４３２）システムを用いた組換えＢＣＧ生ワクチンプラットフォームに関する。
【0002】
本出願は、２０１８年０５月１４日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０１８－００５５０５９号及び２０１９年０３月２６日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００３４１８３号に基づく優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は本出願の一部として組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
ＨＩＶ－１の感染率は、全世界的に徐々に減少しているが、ＨＩＶ－１に対する効率的な予防ワクチンは、相変らず喫緊な要望がある。組換えマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ（ｒＢＣＧ）は、ＨＩＶ－１ワクチンの開発において有望な菌株である。そこで、本発明では、ＨＩＶ－１の感染に対するワクチン適用においてｐＭｙｏｎｇ２ベクターを用いたＨＩＶ－１ ｐ２４抗原Ｇａｇを発現するｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）の潜在力を開示する。
【0004】
ＨＩＶ感染個体でＨＩＶの複製を制御する高活性抗レトロウイルス療法（ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ、ＨＡＡＲＴ）の寄与にもかかわらず、長期間の治療後に発生する薬物耐性ウイルス及び高い薬剤の費用などは相変らず解決されなければならない多くの問題点のうち一つとして残っている。したがって、たとえ新しいＨＩＶ－１の感染速度が全世界的に徐々に減少してはいても、ウイルスのさらなる拡散を抑制するために効率的な予防ワクチンの必要性は相変らず要求されている。ＨＩＶ特異的細胞性免疫は、主に多機能性、そして免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）ウイルスペプチドに対する増殖能力を有するＨＩＶ特異的Ｔ細胞により誘導され、このような特徴によってＨＩＶ－１に対する効率的な免疫反応が発生できるので、このような細胞性免疫、特に、ウイルス－特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＣＴＬ）は、ＨＩＶ－１に対抗するための宿主免疫系においてより重要な構成要素でなければならない。
【0005】
このような事実を基盤として、生きているウイルスベクター及びプラスミドＤＮＡワクチンの使用を含む強力なＨＩＶ－１－特異的ＣＴＬ及びＴｈ１（Ｔｙｐｅ １ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）の反応を導出するための多くの戦略が開発中にある。しかし、このようなそれぞれのアプローチには安全上の争点を含む様々な問題点が関連しているので、実際的、実用的な使用が制限されている。現在、全世界的に最も幅広く投与されるワクチンであるマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（ＢＣＧ）は、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＴＢ）に対抗するために用いられた唯一の生きている弱毒化ワクチンとして８０年以上用いられてきた。ＢＣＧは、児童の播種性疾患（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）を予防することができるので、１９７０年代初頭から児童予防接種のための世界保健機構の予防接種拡大計画（ＥＰＩ）の一環として用いられてきた。
【0006】
外来抗原を発現して免疫反応を誘導するために成功的に用いられてきたＢＣＧの組換え形態、すなわち、ｒＢＣＧは、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、げっ歯類マラリア（ｒｏｄｅｎｔ ｍａｌａｒｉａ）、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｌ）、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む多様な感染性病原体に対するワクチン候補として用いられてきた。ｒＢＣＧベクターの最も実際的・実用的な長所は高い安全性である。さらに、ｒＢＣＧは、優れた免疫増強（ａｄｊｕｖａｎｔ）特性を示し、少なくとも１～２年の間維持される長い持続性細胞性免疫反応を誘導し、製造コストが低く、投与が容易であり、一般に、１回又は２回の免疫化のみを必要とする。したがって、他の組換えワクチンの接近法を凌駕するｒＢＣＧベースのワクチンの上記言及された長所は、ｒＢＣＧが安全でウイルス特異的免疫反応を誘導することができる、ＨＩＶ－１感染に対する強力なワクチンであることを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が解決しようとする課題は、ＨＩＶ－１由来のｐ２４タンパク質を発現する組換えマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ（ｒＢＣＧ）及びそのＨＩＶ－１ワクチンへの利用を提供することである。
【0008】
ｒＢＣＧベクターは、潜在的なＨＩＶ－１ワクチンとしての可能性にもかかわらず、そのＨＩＶ－１ワクチンとしての実在的な適用は、ｒＢＣＧ内で外来遺伝子の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）発現の低い安定性及び量の欠乏による低い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）により制限される。したがって、十分な免疫原性を確保して防御的ワクチンの効能を導出するためには、ヒトで結核に対する実際のＢＣＧ予防接種に必要な用量の大略１０～１００倍の高いｒＢＣＧ用量が必要である。しかし、高用量のＢＣＧを生体内に投与することは、免疫力の低下した（ｉｍｍｕｎｏ－ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）ワクチン投与者の播種性ＢＣＧの危険を増加させるか、Ｔ細胞の過度な活性化によるＨＩＶ－１の複製及び拡散のための駆動力として作用し得る。
【0009】
このような理由で、安全性の保障のためにＨＩＶ－１に対する予防的ワクチン接種でｒＢＣＧの低用量免疫化が勧奨されてきて、したがって、本発明では、ヒトの予防接種に必要な、より低い用量でも効力を示すことができる、ＨＩＶ－１からの保護のためのｒＢＣＧワクチンを開発しようとした。
【0010】
また、前記組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの治療学的有効量を有効成分で含むワクチン組成物を個体に投与してエイズ及び／又は結核を治療又は予防する方法、前記ワクチンを製造するための組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの用途乃至エイズ及び／又は結核を治療又は予防するための組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの用途を開発しようとした。
【0011】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されなかったまた他の課題は、下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有した者に明確に理解されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上述した課題を解決するために、本発明者らは、マイコバクテリウム・アビウム複合体（Ｍ．ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＡＣ）のヒト病原体構成員であるマイコバクテリウム・ヨンゴネンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｙｏｎｇｏｎｅｎｓｅ）のＤＳＭ ４５１２６Ｔゲノム分析を通じて、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）に由来した従来のｐＡＬ５０００ベクターシステムを用いたものと比較して、組換えマイコバクテリウム・スメグマチス（ｒＳｍｅｇ）及びｒＢＣＧから増加された異種性遺伝子発現を誘導できる、線形プラスミドであるｐＭｙｏｎｇ２のマイコバクテリアレプリコンを用いた新規なマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターシステムを導入した。
【0013】
さらに、本明細書では、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムを用いてＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇを発現するｒＳｍｅｇが、ｐＡＬ５０００ベクターシステムで、又は統合型プラスミドであるｐＭＶ３０６システムを用いるｒＳｍｅｇと比較して、マウスでＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇに対する向上された免疫反応を誘導したことを示した。これは、ｒＳｍｅｇワクチンの適用でｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムの実行可能性を示唆する。
【0014】
ＨＩＶ－１ Ｇａｇ－特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、ＨＩＶ感染の免疫調節に非常に重要であり得る。したがって、本発明では、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムで発現するための標的抗原としてＨＩＶ－１ Ｇａｇ ｐ２４を選択した。したがって、本発明では、ｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）内で外来ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ遺伝子の発現を向上させるためにｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムを採択した。ｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムの効能、すなわち、その向上された組換えタンパク質の製造は、ｒＢＣＧ及びｒＢＣＧで感染された一次骨髓由来樹状細胞（ｂｏｎｅ－ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、以下、「ＢＭＤＣｓ」）で証明された。また、ワクチン効能を証明するために、本発明者らは、予防接種されたマウスでＨＩＶ Ｇａｇタンパク質に対するその細胞性及び体液性免疫反応を探索した。
【0015】
ＨＩＶワクチンとしてｒＢＣＧの潜在力を改善するための最上の戦略は、プライム－ブースト（ｐｒｉｍｅ－ｂｏｏｓｔｅｒ）ワクチンプロトコルでｒＢＣＧをプライムワクチン（ｐｒｉｍｅ ｖａｃｃｉｎｅ）で用い、ブーストワクチン（ｂｏｏｓｔｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）として安全な組換えウイルスベクターを用いることであって、これは、動物モデルで予防接種後に長く持続する効率的なウイルス－特異的細胞性免疫を誘導する。このような脈絡で、ｒＢＣＧベクターにより誘導されたＴｈ１反応は、Ｇａｇ－特異的ＣＴＬ反応を誘導するのに寄与できる。しかし、ＨＩＶ－１ワクチンとしてｒＢＣＧの実際的使用で主な障壁になるのは、ｒＢＣＧで外来ＨＩＶ－１抗原の低い発現によりウイルス感染に対抗するための十分なウイルス－特異的ＣＴＬ反応を誘導できないことである。
【0016】
このような限界を克服するために、ｒＢＣＧの優先的細胞質位置を通じてより大きいＣＴＬ反応を誘導できる溶血素（ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）発現ＢＣＧ菌株の使用及びｒＢＣＧシステムでＨＩＶ－１ ｇａｇ ｐ２４遺伝子に対するコドン最適化を含む戦略を用い、本発明では、ｒＢＣＧでＨＩＶ－１ ｇａｇ ｐ２４遺伝子の発現を向上させるためにｐＭｙｏｎｇ２シャトルベクターシステムを適用した。
【0017】
本発明では、比較のために、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４が感染されたマクロファージ及びＢＭＤＣｓで、従来のエピソーム性ｐＡＬ５０００ベクター（ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４）及び統合型ｐＭＶ３０６ベクター（ｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－ｐ２４）（図３Ａ、Ｂ及びＨ）においてよりさらに多くのｐ２４タンパク質を生成したことを確認し、ＢＭＤＣｓの向上されたｐ２４特異的Ｔ細胞増殖（図４Ｂ及びＣ）、Ｔ細胞エフェクター機能（図５Ｂ及びＣ）、特に、ＣＴＬｓ（図７）、及びＴｈ１に傾斜した体液性免疫反応（図６）を含むｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の向上されたウイルス特異的ワクチン効能に対するメカニズム基盤を提供した。
【0018】
本発明では、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４よりさらに低いレベルのＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を生成したｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４でのマクロファージ感染でさらに弱毒化される傾向が観察されたが（図２Ｃ）、これは、他のベクターシステムでのそれらよりｒＢＣＧでｐＭｙｏｎｇ２のより高いコピー数によると推測される。より低い用量又はより弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）されたｒＢＣＧへの免疫化は、不利な局所皮膚反応、Ｔｈ２－型免疫反応との可能な結付、又はレトロウイルス感染の悪化を含む高－投与量皮膚投与と関連した危険を減らすことが可能であるという点を考慮すれば、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ｒＢＣＧを用いるＨＩＶワクチンプロトコルで追加的な長所を有することができる。
【0019】
多コピーエピソームベクターベースのマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターシステムは、統合型プラスミドシステムと比較して、組換えマイコバクテリアの安定性欠乏と関連した欠点を有することが知られている。実際に、ｒＳｍｅｇ（ｒＳｍｅｇ-ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）でのｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４プラスミドが抗生物質のない培地で５回継代後に安定性を徐々に失って行くことを示した。しかし驚くべきことに、本発明は、同一のｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムを用いるにもかかわらず、ｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）でｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４プラスミドが抗生物質の添加有無に関係なく１２回の継代後にもその安定性を維持することができる（図３Ｆ）。これは、遅く成長するマイコバクテリア・ヨンゴネンセから得たｐＭｙｏｎｇ２プラスミドが、Ｓｍｅｇのように速く成長するマイコバクテリアの場合よりＢＣＧのように遅く成長するマイコバクテリアでより安定的であり得ることを示唆する。抗生物質のない培地でプラスミドを統合させることの安定性が実際の使用のための組換え生ワクチンの製造に重要であることを考慮するとき、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ＨＩＶ－１ワクチンへの適用でｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４を凌駕する長所を有する。
【0020】
本発明では、相異なるエピソーム性ベクターシステムでのｒＢＣＧ菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４を用いることに加え、２個の相異なるマイコバクテリアでのＨＩＶ－１に対するワクチン効能、すなわち、ＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）及びＳｍｅｇ（ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）を同一のｐＭｙｏｎｇ２システムを用いて比較した。ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原に対する免疫反応で、免疫化された脾臓細胞からのＣＴＬ反応、感染されたＢＭＤＣｓのＴ細胞増殖能力及び大部分のＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴレベルがｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４でほとんど同一ではあったが、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４と比較して脾臓細胞及びＴｈ１－バイアスされた体液性免疫反応で非常に向上されたＩＬ－２生成を示した。これは、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の方がｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４よりＨＩＶ－１ワクチン療法（ｒｅｇｉｍｅｎ）において優秀でであり得ることを示唆する。
【0021】
さらに、本発明では、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｐ２４タンパク質を用いて２個の相異なるワクチンモジュールの間でＨＩＶ－１に対するワクチン効能を比較した。本明細書のデータは、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がｐ２４タンパク質に比べて向上されたｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴレベル、ＣＴＬ反応及びＴｈ１側に傾斜した体液性免疫反応を有したことを示し（図８のＡ～Ｃ）、また、これはＨＩＶ－１ワクチン療法においてｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の方がｐ２４タンパク質より優秀であり得ることを示唆する。ＢＣＧ、麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹ワクチン、及びインフルエンザワクチンを含んで、多様なワクチンに対する反応には性別の差があることが知られている。一般的に、適応性免疫反応で、女性は男性に比べて向上された体液性及び細胞媒介免疫反応を示す。これは、本発明で現在のワクチン研究に雌のマウスのみを選択した理由である。
【0022】
本明細書では、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムのｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の方がｐＡＬ５０００－（ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４）又はｐＭＶ３０６－由来システム（ｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－ｐ２４）を用いる他のＢＣＧ菌株よりｒＢＣＧで高レベルのＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇタンパク質発現を誘導し、より多くのｐ２４抗原を食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）に伝達することを証明した。
【0023】
また、本明細書では、上記言及された菌株がｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４又はｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４に比べて予防接種されたマウスで感染されたＢＭＤＣｓのＴ細胞増殖能力を向上させ得、改善されたＣＴＬ反応及びＴｈ１バイアスされた体液性免疫反応を誘導できることを示した。
【0024】
このような発見は、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がＨＩＶ－１感染に対する異種性プライム－ブーストワクチン戦略においてプライムワクチンとして効率的な候補であることを示唆する。
【0025】
総合すれば、一様態で、本発明は、ＨＩＶ－１由来のｐ２４タンパク質を発現する組換えマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ（ｒＢＣＧ）を提供する。
【0026】
一具現例で、前記ｐ２４タンパク質は、図２Ａに開示されたｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４ベクターシステムにより発現されるものであってもよい。
【0027】
一具現例で、前記ｐ２４タンパク質は、配列番号２の塩基配列で示すヒト免疫不全ウイルスタイプ１由来のＧａｇ遺伝子がコーディングされたものであってもよい。
【0028】
一具体例で、本発明によるマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ菌株は、Ｔｏｋｙｏ １７２菌株である。
【0029】
また、本発明による組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧを有効成分で含むＨＩＶ－１ワクチン組成物を提供する。
【0030】
また、本発明による組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの治療学的有効量を有効成分で含むワクチン組成物を個体に投与してエイズ及び／又は結核を治療又は予防する方法を提供する。
【0031】
また、本発明は、エイズ及び／又は結核の予防又は治療用ワクチンの製造のための組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの用途を提供する。
【0032】
また、本発明は、エイズ及び／又は結核の予防又は治療のための組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧの用途を提供する。
【0033】
また、本発明による組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧを有効成分で含むＨＩＶ感染症又はＨＩＶ及び結核菌同時感染症に対するワクチン組成物を提供する。
【0034】
一具現例で、本発明によるワクチン組成物で前記組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧは生きているものである。
【0035】
一具現例で、本発明によるワクチンは、追加で人為的に弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）されないものである。
【0036】
一具現例で、本発明によるワクチンは、特に、プライム－ブーストワクチン接種プロトコルでプライムワクチンとして用いられるものであってもよい。
【0037】
一具現例で、前記感染症は、エイズ（ＡＩＤＳ、後天性兔疫不全症）又は結核であってもよい。
【発明の効果】
【0038】
本発明によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ｒＢＣＧ及び感染された抗原提示細胞（ＡＰＣ）で向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ発現を導出することを確認した。
【0039】
また、本明によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ｐＡＬ５０００由来のベクターシステムでのｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４と比較して、高レベルのＨＩＶ－１ Ｇａｇ－特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔリンパ球増殖、ガンマインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ細胞誘導、抗体生成及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応により証明される向上されたｐ２４特異的免疫反応を誘導することを確認した。
【0040】
さらに、本発明によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、同一のｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムでｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４より高いレベルのＰ２４特異的抗体を生成することを確認した。
【0041】
結論的に、本発明は、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムを用いてＰ２４を発現する組換えＢＣＧ、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がＨＩＶ－１感染に対する向上された免疫反応を誘導することを示す。したがって、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ＨＩＶ－１感染に対する異種性プライム－ブーストワクチン戦略においてプライムワクチンとしての潜在力を有する。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【図3B】図３Ｂは、ウエスタンブロッティング分析を用いたｒＢＣＧ菌株のｐ２４発現を確認した図である。野生型ＢＣＧ（レーン１）及びｒＢＣＧ菌株（レーン２：ｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－ｐ２４、レーン３：ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４、レーン４：ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）からタンパク質を抽出した。陽性対照群としては、精製されたｐ２４タンパク質を用いた（レーン５）。Ｍ：分子量標準（Ｅｌｐｉｓ Ｂｉｏ、大田、大韓民国）。それぞれのメンブレンは、白色空白で区分され、マーカーレーンは、黒色垂直線で区分される。本図には、ｐ２４の発現レベルが示されており、ウエスタンブロッティングイメージは、鮮明度向上のために全長のブロットから切り出したものである。全長のブロッティングイメージは、下記図３Ｃに示した。
【0048】
【0049】
【図3D】図３Ｄは、カナマイシンを含有した７Ｈ１０寒天プレート（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）で継代したｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株でｐ２４発現の安定性を、ウエスタンブロッティングを用いて確認した図である。タンパク質は、野生型ＢＣＧ（レーン１）及びｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株からそれぞれの継代地点で抽出した（レーン２：第１継代、レーン３：第４継代後、レーン４：第６継代後、レーン５：第８継代後、レーン６：第１０継代後、レーン７：第１２継代後）。陽性対照群としては、精製されたｐ２４タンパク質を用いた（レーン８）。Ｍ、分子量標準（Ｅｌｐｉｓ Ｂｉｏ、大田、大韓民国）。上位サイズメンブレンで内部対照群としてメンブレンを切った後Ｈｓｐ６５抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてｐ２４を検出した。個別メンブレンは、白色空白で区分され、マーカーレーンは、黒色垂直線で区分される。
【0050】
【0051】
【図3F】図３Ｆは、カナマイシンがない７Ｈ１０寒天プレートで継代したｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株でｐ２４発現の安定性を、ウエスタンブロッティングを用いて確認した図である。タンパク質は、野生型ＢＣＧ（レーン１）及びｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株からそれぞれの継代時点で抽出した（レーン２：第１継代、レーン３：第４継代後、レーン４：第５継代後、レーン５：第６継代後、レーン６：第７継代後、レーン７：第８継代後、レーン８：第９継代後、レーン９：第１０継代後、レーン１０：第１１継代後、レーン１１：第１２継代後）。陽性対照群としては、精製されたｐ２４タンパク質を用いた（レーン１２）。Ｍ：分子量標準（Ｅｌｐｉｓ Ｂｉｏ、大田、大韓民国）。上位サイズメンブレンで内部対照群としてメンブレンを切り取った後Ｈｓｐ６５抗体（Ａｂｃａｍ）を用いてｐ２４を検出した。個別メンブレンは、白色空白で区分され、マーカーレーンは、黒色垂直線で区分される。
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【図4A-D】図４Ａ～Ｄは、ｐ２４ ｒＢＣＧ菌株に感染されたＢＭＤＣｓにより誘導されたＴ細胞増殖レベルを示した図である：（図４Ａ）Ｔ細胞増殖分析日程の概路図。マウス２匹にｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）を注射し、７日後に前記マウスの脾臓細胞をＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に分類してＣＦＳＥで標識した。共培養する一日前、ＤＣを各菌株（１０Ｍ．Ｏ．Ｉ）に感染させた。ＣＦＳＥで標識されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞及び感染されたＤＣを４日間共培養した後、上の細胞をＴ細胞増殖に対して分析した；（図４Ｂ及び図４Ｃ）ｐ２４ ｒＢＣＧ菌株に感染されたＢＭＤＣｓのＣＦＳＥ－標識ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞増殖に対するフローサイトメトリー分析結果；（図４Ｄ）ＭＬＲ分析法を用いてＣＤ４（左側パネル）及びＣＤ８（右側パネル）細胞の上澄液から放出されたＩＬ－２のＥＬＩＳＡ測定。データは、三つの独立的な実験を代表する。結果は、平均±分散値で示した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。
【0056】
【図5A-C】図５Ａ～Ｃは、それぞれｐ２４ ｒＢＣＧ菌株により誘導された生体内免疫反応を示した図である：（図５Ａ）生体内免疫学的分析のために実行された免疫化の概路図。４週の間隔で各群（５匹／グループ）を野生型ＢＣＧ、二つの種類のｒＢＣＧ菌株及びｒＳｍｅｇ菌株でそれぞれ２回免疫させた。最終免疫化４週後、マウスを犠牲にして免疫分析のために脾臓及び血液サンプルを収集した；（図５Ｂ）ｐ２４ ｒＢＣＧ菌株を接種したマウスの脾臓細胞を試験管内刺激した後、ＩＦＮ－γ分泌レベルＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて検出した。各グループのＥＬＩＳＰＯＴメンブレン代表イメージは、グラフの下に表示した。（－）、陰性対照群；（＋）、陽性対照群；（図５Ｃ）ｐ２４ ｒＢＣＧ菌株を接種したマウスの脾臓細胞をｐ２４で試験管内刺激した後、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６サイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡ分析を用いて検出した。グループ当たり計５匹のマウスを分析した。データは二つの独立的な実験を代表する。結果は、平均±分散値で示した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。
【0057】
【0058】
【0059】
【図8A-C】図８Ａ～Ｃは、ｐ２４タンパク質の注射とｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の相異なるＭ．Ｏ．Ｉによるｐ２４特異的免疫反応の比較結果を示した図である：（図８Ａ）ｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）及び相異なるＣＦＵｓ（１×１０６及び１×１０７ＣＦＵ）のｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株（１週の間隔、２回注射）を皮下注射したマウス（３匹／グループ）から得た脾臓細胞を試験管内刺激した後、ＩＦＮ－γ分泌レベルを比較するためにＥＬＩＳＰＯＴ分析した結果である。各グループのＥＬＩＳＰＯＴメンブレン代表イメージは、グラフの下に表示した。（－）、陰性対照群；（＋）、陽性対照群。結果は、トリプリケートから平均±分散値で示した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）；（図８Ｂ）ｐ２４特異的免疫グロブリン亜型（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１及び総ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡにより検出した結果である。グループ当たり３匹マウスの血清サンプルを分析した。結果は、トリプリケートから平均±分散値で示した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）；（図８Ｃ）ｐ２４タンパク質及びｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４注入マウスから得た脾臓細胞（Ａ９Ｉ、ｐ２４エピトープペプチドで刺激される；エフェクター細胞）及びＡ９ＩペプチドパルスされたＰ８１５細胞（標的細胞）の反応による細胞傷害性Ｔリンパ球反応を示している図である。グループ当たり３匹のマウスの血清サンプルを分析した。結果は、トリプリケートから平均±分散値で示した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【0060】
本発明は、ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原を発現する組換えマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ菌株がワクチンに効果的に用いられ得るという発見に基づいたものである。
【0061】
したがって、一様態で、本発明は、ＨＩＶ－１のｐ２４タンパク質を発現する組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ菌株に関するものであって、前記ｐ２４タンパク質は、図２Ａに開示されたｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４ベクターにより発現される。
【0062】
本発明によるベクターにより発現されるｐ２４カプシド（ＣＡ）タンパク質は、プロセッシングされないＧａｇポリタンパク質でＭＡ（マトリックスタンパク質）の３’末端に連結されている。ｐ２４カプシド（ＣＡ）タンパク質は、Ｎ及びＣ末端にＨＩＶボーディング及びカプシド構造において重要な役目をする二つのドメインを含んでいる。本発明によるベクターにより発現されるｐ２４は、ＨＩＶ－１由来であって、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＭ３９００２６．１ｄに含まれているか、配列番号１のアミノ酸又は配列番号４の配列の３１６１～３８５６ヌクレオチドに該当し、本願による目的のために、抗原として作用する限り、その配列変異体も用いられる得る。本願による菌株が発現するｐ２４は、人体に投与するときＨＩＶ感染に対する抗原として作用できる。
【0063】
本発明による菌株で、ｐ２４は、特に、図２Ａに開示されたｐＭｙｏｎｇ２ベクターにより発現される。本発明によるｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４を含む組換えＢＣＧ菌株は、ｐＡＬ５０００又はｐＭＶ３０６誘導システムを用いる他のｒＢＣＧ菌株に比べてより高いレベルのＨＩＶ－１ ｐ２４タンパク質発現を誘導し、より多いｐ２４抗原をマクロファージに伝達することができるので、非常に優れていることが示された。
【0064】
また、本願によるｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４を含むＢＣＧ組換え菌株は、感染されたＢＭＤＣｓ（骨髄由来樹状細胞）のＴ細胞増殖能力を向上させ、接種されたマウスで向上されたＴ細胞エフェクター機能とＴｈ１に傾斜した体液性免疫反応を誘導できることが示された。また、本願によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、初期成長が遅延されて弱毒化されることで、より多くの抗原を食細胞に提示してより強い免疫反応を維持することができる。このような結果は、本発明によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がＨＩＶ－１又はＨＩＶ－１と結核との同時感染に効果的な候補ワクチンになり得ることを示す。
【0065】
また、他の様態で、本発明は、本明細書に開示された菌株を含むＨＩＶ感染症に対する免疫原性、ワクチン又は免疫治療用組成物に関する。ＨＩＶは、ヒトの免疫系を破壊するレトロウイルスの一種であって、ＨＩＶに感染される場合、宿主の免疫システムが低下されてエイズに進行し、細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫などによる日和見感染の危険が顕著に増加される。エイズは、後天性兔疫不全症であって、ＨＩＶ感染の結果として人体免疫機能の低下により現われるさまざまな症状を称するものである。
【0066】
本発明によるワクチン組成物は、ｐ２４特異的免疫反応、例えば、より多くのｐ２４抗原を食細胞に伝達し、ＢＭＤＣｓのＴ細胞増殖能力を向上させ、接種されたラットで向上されたＴ細胞エフェクター機能とＴｈ１に傾斜した体液性免疫反応を誘導することができるので、ＨＩＶ感染を予防するか又は感染による症状を軽減、緩和及び／又は治療することができる。
【0067】
ワクチンは、通常、プライム－ブースト（ｐｒｉｍｅ－ｂｏｏｓｔｅｒ）形態で２回以上投与されることが一般的である。この場合、同一のワクチンを数回投与するか（ｈｏｍｏｌｏｇｕｓ）又は同一の抗原を含む相異なる種類のワクチンが投与（異種、ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ）される。一具現例で、本願によるワクチンは、相同又は異種性プライム－ブーストでプライムワクチン（ｐｒｉｍｅ ｖａｃｃｉｎｅ）として用いられる。本願によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、ｐ２４抗原の発現量が高く、抗原提示能が高いため、ｎａｉｖｅな個体に十分なｐ２４特異免疫反応を誘導することができるので、特にプライムワクチンへの使用に有利である。
【0068】
本発明による組成物に用いられるマイコバクテリアは、上述した通りであり、特に、生きている生菌が用いられ得る。特に、本発明によるｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、初期成長が遅延されて自然的に弱毒化されることで、より多い抗原を食細胞に提示して一層強い免疫反応を維持することができる。
【0069】
本発明で用語「ワクチン」は、生体に免疫を与える抗原性物質を含有した生物学的な製剤であって、エイズ及び／又は結核の予防又は治療のために生物体に注入又は注射して生体に免疫が生ずるようにする免疫原を意味する。
【0070】
本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
【0071】
本発明で「免疫反応」は、提供されたＤＮＡプラスミドワクチンを通じてＨＩＶ－１抗原、例えば、普遍的なＨＩＶ－１抗原の導入に対する回答であって、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味するために本願で用いられる。免疫反応は、細胞性又は体液性反応、又は両方ともの形態であってもよい。
【0072】
本発明によるワクチン組成物は、全身又は局所投与用で製剤化され得、薬学的に可能な賦形剤、担体及び／又は媒体、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、蒸溜水、水／油エマルジョン、湿潤剤、エマルジョン化剤、ｐＨ調節剤などを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【0073】
本発明によるワクチン組成物は、必要な場合、免疫補助剤（アジュバント）、特に、Ｔ－細胞媒介反応を促進又は増加させ得る任意の物質又は化合物を含むことができる。一具現例で、前記免疫補助剤は、化学的又は熱により死滅された菌が組成物に含まれる場合に用いられ得る。免疫補助剤は、当業界で公知にされており、例えば、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、硫酸アルミニウムカリウム、架橋ポリアクリル酸重合体、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、免疫調節物質、ラクトフェリン又はＩＦＮ－γ誘導剤などが用いられ得る。一具現例で、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、ＣａｒｂｏｐｏｌＣｃ単一重合体又は共重合体を含み、前記リンフォカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－２又はＩＬ－１２を含み、前記ＩＦＮ－γ誘導剤は、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを含むことができるが、これに制限するものではない。一具現例で、合成された糖ポリマーである前記アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート又は硫酸アルミニウムカリウムは、約０．０５～０．１重量％で含まれ、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、０．２５重量％で含まれ得るが、これに制限するものではない。
【0074】
本発明による組成物は、局所又は全身投与されてもよく、一回又は多回投与されてもよく、多様な経路、例えば、皮下、皮内、筋肉内又は静脈に投与されるか、又は経口、鼻腔又は吸入経路で投与されてもよい。本発明による一具現例では、筋肉内注射で一回投与される。
【0075】
本発明によるワクチン組成物は、投与経路に適合する液状溶液又は懸濁剤に製造されるか又は注射する前に溶液に溶解または懸濁される固形の形態に剤型化され得る。
【0076】
本発明で「治療学的有効量」とは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１に感染される確率又は感染の深刻性を非常に減少させ得る程度の抗体を誘発するにおいて必要な投与量を意味する。前記有効量は、投与される疾患種類及び重度、患者の年齢及び性別、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素及びその他医学分野でよく知られた要素によって決定され、前記要素を全て考慮して副作用なしに最大の効果を得ることができる量であって、当業者によって容易に決定され得る。
【0077】
ワクチンの投与量は、投与経路はもちろん患者の年齢、体重及び／又は健康状態によって変わる。例えば、適切な投与量は、例えば、１～１０９ＣＦＵであってもよい。一具現例では、１０６ＣＦＵが用いられる。本発明による菌株の場合、抗原の発現量が優秀であり、抗原提示能などが優秀であるので、これより少ない投与量又は既存菌株ワクチンに比べてより少ない投与量が使用可能であることは勿論である。
【0078】
本発明で用いられる用語「予防」とは、本発明によるワクチン組成物の投与によりエイズ及び／又は結核を抑制させるか発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0079】
本発明で用いられる用語「治療」とは、本発明によるワクチン組成物の投与によりエイズ及び／又は結核による症状が好転されるか有益であるように変更されるすべての行為を意味する。
【0080】
また他の様態で、本発明は、本発明による菌株でｐ２４の発現に用いられる図２Ａに開示されたベクターに関する。
【0081】
一具現例で、前記ベクターは、最も好ましくは、配列番号４の塩基配列で示す。
【0082】
また他の様態で、本発明は、前記ベクターに形質転換された細胞に関する。前記細胞は、特に、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む。
【0083】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0084】
［実験方法］
（１．マウス及び免疫化過程）
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約２５ｇ、生後７週齢）をＯｒｉｅｎｔ－Ｂｉｏ社（大韓民国、ソウル）から購買し、生後８週齢になったとき実験に用いた。マウスは、グループ当たり５匹のマウスで構成される４個のグループに無作為に分けた。
（１．マウス及び免疫化過程）
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約２５ｇ、生後７週齢）をＯｒｉｅｎｔ－Ｂｉｏ社（大韓民国、ソウル）から購買し、生後８週齢になったとき実験に用いた。マウスは、グループ当たり５匹のマウスで構成される４個のグループに無作為に分けた。
【0085】
Ｔ細胞増殖の分析のために、ｐ２４タンパク質を尾静脈を通じて２匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に注射し（３０μｇ／マウス）、５匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を各テストで骨髓由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）の製造に用いた。
【0086】
予防接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）テストのために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを野生型、２種類の組換えＢＣＧ菌株（ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）又はｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株で２回（１００μｌ ＰＢＳ中の１ｘ１０６ＣＦＵ；４週間隔で）尾の基部から皮下に免疫化した。陰性対照群の場合、ＰＢＳを皮下に注射した。最終免疫化した後４週後に、マウスを各時点でＣＯ２吸入により安楽死させた後、マウスの血液及び脾臓を除去してＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ、サイトカイン測定、血清抗体検出（５匹／グループ）及びＣＴＬ分析（３匹／グループ）のような免疫学的検定に用いた。
【0087】
また、ｐ２４タンパク質処理により誘導された免疫反応の差及び相異なるバクテリア数を比較するために独立的な生体内テストを実行した。この場合、１週間隔で、ＢＡＬＢ／ｃ、マウス（３匹／グループ）をｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）及び相異なる数のｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株（１ｘ１０６ＣＦＵ及び１ｘ１０７ＣＦＵ）で２回皮下注射した。陰性対照群グループの場合、ＰＢＳを皮下に注射した。最終免疫化した後１週後、マウスを各時点でＣＯ２吸入により安楽死させ、マウスの血液及び脾臓を除去してＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ、血清抗体検出及びＣＴＬ分析のような免疫学的検定に用いた。
【0088】
（２．ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇを発現するｒＢＣＧ菌株の生成）
ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇを発現するｒＢＣＧ菌株の３個の相異なる類型、すなわち、ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４プラスミドを有するＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）、ｐＡＬ－ｐ２４プラスミドを有するＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４）及びｐＭＶ３０６－ｐ２４プラスミドを有するＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－ｐ２４）を生成するために、３個で構成されたプラスミド、すなわち、ｐＭＶ３０６－ｐ２４、ｐＡＬ－ｐ２４及びｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４をコンピテントＢＣＧ菌株（Ｔｏｋｙｏ １７２）にＧｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩエレクトロポレーション装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてエレクトロポレーションした。形質転換体は、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びＯＡＤＣが含有されたＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）上で選択した。典型的に、形質転換体コロニーをプレートから選択し、０．５％グリセロール、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－８０、１０％ ＡＤＣ及びカナマイシンが補充された７Ｈ９培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）に移して３週～４週間培養した。ｒＢＣＧ菌株の成長率を６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）により測定した。
ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇを発現するｒＢＣＧ菌株の３個の相異なる類型、すなわち、ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４プラスミドを有するＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）、ｐＡＬ－ｐ２４プラスミドを有するＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４）及びｐＭＶ３０６－ｐ２４プラスミドを有するＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－ｐ２４）を生成するために、３個で構成されたプラスミド、すなわち、ｐＭＶ３０６－ｐ２４、ｐＡＬ－ｐ２４及びｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４をコンピテントＢＣＧ菌株（Ｔｏｋｙｏ １７２）にＧｅｎｅ ＰｕｌｓｅｒＩＩエレクトロポレーション装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてエレクトロポレーションした。形質転換体は、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びＯＡＤＣが含有されたＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）上で選択した。典型的に、形質転換体コロニーをプレートから選択し、０．５％グリセロール、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－８０、１０％ ＡＤＣ及びカナマイシンが補充された７Ｈ９培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）に移して３週～４週間培養した。ｒＢＣＧ菌株の成長率を６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）により測定した。
【0089】
（３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｐ２４タンパク質の生産）
組換えｐ２４タンパク質は、上述したものから多少変形させて大腸菌から精製した。融合タンパク質の発現及び精製のために、大腸菌ＢＬ２１菌株（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ、台湾）をｐＥＴ２３ａ－ｐ２４に形質転換させた。タンパク質の発現は、０．４ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラシド（ＩＰＴＧ、ＤｕｃｈｅｆａＢｉｏｃｈｅｍｉｅ、Ｈａａｒｌｅｍ、オランダ）を添加することで誘導した。バクテリア細胞を収得して氷で１０分間超音波処理により破壊した。超音波処理された溶解物を１６００×ｇで２０分間４℃で遠心分離し、ｐ２４タンパク質を含有したペレットを４Ｍ尿素（Ｕｒｅａ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有した結合緩衝液に再懸濁した。タンパク質をＮｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ結合樹脂（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて精製し、４Ｍ尿素を含有した溶出緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。精製されたタンパク質を溶出緩衝液に対して連続的に透析してイミダゾール、尿素及び残留塩を除去した。ｐ２４タンパク質の純度をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；１２％ゲル）により評価した。ゲルは、クマシーブリリアントブルー染色法を用いて視覚化した（図１）。
組換えｐ２４タンパク質は、上述したものから多少変形させて大腸菌から精製した。融合タンパク質の発現及び精製のために、大腸菌ＢＬ２１菌株（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ、台湾）をｐＥＴ２３ａ－ｐ２４に形質転換させた。タンパク質の発現は、０．４ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラシド（ＩＰＴＧ、ＤｕｃｈｅｆａＢｉｏｃｈｅｍｉｅ、Ｈａａｒｌｅｍ、オランダ）を添加することで誘導した。バクテリア細胞を収得して氷で１０分間超音波処理により破壊した。超音波処理された溶解物を１６００×ｇで２０分間４℃で遠心分離し、ｐ２４タンパク質を含有したペレットを４Ｍ尿素（Ｕｒｅａ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有した結合緩衝液に再懸濁した。タンパク質をＮｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ結合樹脂（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて精製し、４Ｍ尿素を含有した溶出緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。精製されたタンパク質を溶出緩衝液に対して連続的に透析してイミダゾール、尿素及び残留塩を除去した。ｐ２４タンパク質の純度をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；１２％ゲル）により評価した。ゲルは、クマシーブリリアントブルー染色法を用いて視覚化した（図１）。
【0090】
（４．マウスで骨髓由来樹状細胞の生産）
骨髓由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）を上述したように８週齢～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髓（ＢＭ）から製造した。簡単に説明すれば、ＢＭ細胞を血清不含有のＩｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用いて大腿骨及び硬骨から除去した。単一細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（１．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）及びマウスＩＬ－４（１．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＵＳＡ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びβ－メルカプトエタノール（５０ｎＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充された最終体積２ｍｌの完全ＩＭＤＭにウェル当たり１×１０６細胞の濃度で播種した。培地の半分を６日間一日おきに同等な体積の完全ＩＭＤＭに交替した。ＢＭＤＣｓを用いたそれぞれの実験を準備するために５匹のマウスを用い、ＢＭＤＣｓを分化させるために５個の２４ウェルプレートを用いた。
骨髓由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）を上述したように８週齢～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髓（ＢＭ）から製造した。簡単に説明すれば、ＢＭ細胞を血清不含有のＩｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を用いて大腿骨及び硬骨から除去した。単一細胞懸濁液を２４ウェルプレートに１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（１．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）及びマウスＩＬ－４（１．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＵＳＡ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びβ－メルカプトエタノール（５０ｎＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充された最終体積２ｍｌの完全ＩＭＤＭにウェル当たり１×１０６細胞の濃度で播種した。培地の半分を６日間一日おきに同等な体積の完全ＩＭＤＭに交替した。ＢＭＤＣｓを用いたそれぞれの実験を準備するために５匹のマウスを用い、ＢＭＤＣｓを分化させるために５個の２４ウェルプレートを用いた。
【0091】
（５．ｒＢＣＧ菌株で感染されたＪ７７４Ａ．１及びＢＭＤＣｓでのＣＦＵ検定）
マウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４．１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－６７）を３７℃及び５％ＣＯ２で１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン及び必須アミノ酸が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で維持させた。上述したように、マウス骨髓からＢＭＤＣｓを生成させ、３７℃及び５％ＣＯ２で１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（１．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）、マウス ＩＬ－４（１．５ｎｇ/ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＵＳＡ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びβ－メルカプトエタノール（５０ｎＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＩｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）で維持させた。
マウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４．１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－６７）を３７℃及び５％ＣＯ２で１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン及び必須アミノ酸が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で維持させた。上述したように、マウス骨髓からＢＭＤＣｓを生成させ、３７℃及び５％ＣＯ２で１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、組換えマウスＧＭ－ＣＳＦ（１．５ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）、マウス ＩＬ－４（１．５ｎｇ/ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＵＳＡ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びβ－メルカプトエタノール（５０ｎＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＩｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）で維持させた。
【0092】
Ｊ７７４Ａ．１細胞及びＢＭＤＣｓをｒＢＣＧ菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４、－ｐＡＬ－ｐ２４、及び－ｐＭＶ３０６－ｐ２４及び野生型ＢＣＧ菌株（１０Ｍ．Ｏ．Ｉ）（３個一セット）で４時間感染させ、その後、ＰＢＳで３回洗浄した後に新しい培地とともに２４時間の間培養した。２４時間後、感染された細胞を０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で溶解させた。細胞溶解物をＰＢＳで希釈してコロニー形成単位（ＣＦＵｓ）の計算のためにＯＡＤＣが補充されたＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０寒天プレート上にプレーティングした。全ての感染グループを各実験で３個一セットで分析し、計２個の独立実験を実行した。
【0093】
（６．ｒＢＣＧ菌株でｐ２４ Ｇａｇ発現レベルの測定）
ｒＢＣＧ菌株でｐ２４ Ｇａｇ発現レベルを測定するために、ウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ分析を実行した。簡単に説明すれば、培養されたｒＢＣＧ菌株のペレットをリゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ（５Ｕ／ｍｌ）及びプロテアーゼインヒビターが補充されたＢ－ＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に懸濁させた。その後、懸濁液を氷で５分間超音波処理し（パルス：０．３秒、中断：０．７秒）、１３，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。水相の同一の量のタンパク質をウエスタンブロッティング分析に用いた。各ｒＢＣＧ菌株でｐ２４の発現レベルは、マウス抗ｐ２４モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ；１：１，０００希釈）を用いて測定した。タンパク質濃度が全てのサンプルで同等であったかを確認するために、マイコバクテリアＨｓｐ６５（Ａｂｃａｍ、１：１，０００希釈）を内部対照群として用いた。ｐ２４の安定的な発現を評価するために、多様な継代地点（１、４、６、８、１０及び１２回継代後）でｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株のｐ２４発現レベルも測定した。継代過程は、プレートからプレートに（カナマイシンがあるかない７Ｈ１０寒天プレート）実行し、各継代から得たコロニーを７Ｈ９ ｂｒｏｔｈ培地で３週間培養した後にそれぞれの実験を実行した。追加的に、ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを用いて（製造社から提案された方法で）同一の量のタンパク質でｐ２４レベルの検出のために用いた（３個一セットのウェルで）（ＡＢＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）。全てのグループを２個の独立的な実験で分析した。
ｒＢＣＧ菌株でｐ２４ Ｇａｇ発現レベルを測定するために、ウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ分析を実行した。簡単に説明すれば、培養されたｒＢＣＧ菌株のペレットをリゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）、ＤＮａｓｅ（５Ｕ／ｍｌ）及びプロテアーゼインヒビターが補充されたＢ－ＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に懸濁させた。その後、懸濁液を氷で５分間超音波処理し（パルス：０．３秒、中断：０．７秒）、１３，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。水相の同一の量のタンパク質をウエスタンブロッティング分析に用いた。各ｒＢＣＧ菌株でｐ２４の発現レベルは、マウス抗ｐ２４モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ；１：１，０００希釈）を用いて測定した。タンパク質濃度が全てのサンプルで同等であったかを確認するために、マイコバクテリアＨｓｐ６５（Ａｂｃａｍ、１：１，０００希釈）を内部対照群として用いた。ｐ２４の安定的な発現を評価するために、多様な継代地点（１、４、６、８、１０及び１２回継代後）でｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株のｐ２４発現レベルも測定した。継代過程は、プレートからプレートに（カナマイシンがあるかない７Ｈ１０寒天プレート）実行し、各継代から得たコロニーを７Ｈ９ ｂｒｏｔｈ培地で３週間培養した後にそれぞれの実験を実行した。追加的に、ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを用いて（製造社から提案された方法で）同一の量のタンパク質でｐ２４レベルの検出のために用いた（３個一セットのウェルで）（ＡＢＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）。全てのグループを２個の独立的な実験で分析した。
【0094】
（７．ｒＢＣＧ菌株で感染されたＢＭＤＣｓ及びＪ７７４．１細胞でｐ２４ Ｇａｇ発現レベルの測定）
ｒＢＣＧ感染のために、Ｊ７７４．１細胞及びＢＭＤＣｓをウェル当たり５～１０×１０５個の細胞で（２４ウェルプレート、３個一セット）播種して１８時間の間培養した。３個の相異なるｒＢＣＧ菌株を細胞に１０の感染多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｍ．Ｏ．Ｉ）で感染させた。また、相異なるＭ．Ｏ．Ｉ（１及び１０Ｍ．Ｏ．Ｉ）のｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株をＢＭＤＣｓに感染させて相異なるＭ．Ｏ．Ｉによるｐ２４発現の差を比較した。Ｊ７７４．１細胞及びＢＭＤＣｓを４時間の間インキュベーションしてバクテリアの食作用を許容し、細胞外バクテリアをＰＢＳで３回洗浄して除去した。感染されたＪ７７４．１細胞及びＢＭＤＣｓは、２４時間及び／又は７２時間の間インキュベーションした。
ｒＢＣＧ感染のために、Ｊ７７４．１細胞及びＢＭＤＣｓをウェル当たり５～１０×１０５個の細胞で（２４ウェルプレート、３個一セット）播種して１８時間の間培養した。３個の相異なるｒＢＣＧ菌株を細胞に１０の感染多重性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｍ．Ｏ．Ｉ）で感染させた。また、相異なるＭ．Ｏ．Ｉ（１及び１０Ｍ．Ｏ．Ｉ）のｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株をＢＭＤＣｓに感染させて相異なるＭ．Ｏ．Ｉによるｐ２４発現の差を比較した。Ｊ７７４．１細胞及びＢＭＤＣｓを４時間の間インキュベーションしてバクテリアの食作用を許容し、細胞外バクテリアをＰＢＳで３回洗浄して除去した。感染されたＪ７７４．１細胞及びＢＭＤＣｓは、２４時間及び／又は７２時間の間インキュベーションした。
【0095】
細胞でのｐ２４発現を分析するために、細胞ペレット中の総タンパク質をＲＩＰＡ溶解緩衝液での懸濁液により製造し、ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（ＡＢＬ）(３個一セットのｗｅｌｌで)を用いて製造社のマニュアルによってｐ２４レベルの測定のために用いた。全ての感染グループを各実験で３個を一セットで分析し、計２個の独立的な実験を実行した。
【0096】
（８．Ｔ細胞増殖分析）
Ｔ細胞増殖の分析のために次のような実験を実行した。マウス２匹にｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）を静脈内注射した。７日後、脾臓細胞を極低温ＦＡＣＳ緩衝液［１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ］で洗浄し、氷で３０分間１０％ラット血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％塩素血清（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％マウス血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２．４Ｇ２モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含有したスーパーブロック（ｓｕｐｅｒ ｂｌｏｃｋ）溶液でブロッキングした。細胞を続いてＢＶ４２１－コンジュゲートされた抗－ＣＤ４（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＥ－コンジュゲートされた抗－ＣＤ８ａ（Ｃｌｏｎｅ ５３－６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で３０分間４℃で染色して極低温ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ器機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞集団を分類した。また、共培養する前日、未成熟ＢＭＤＣｓを野生型、２個のｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及び－ｐＡＬ－ｐ２４）又はｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株で１０のＭ．Ｏ．Ｉで２４時間の間感染させた。増殖分析は、蛍光細胞質追跡染料であるＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を用いて実行した。分類されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を５μＭ ＣＦＳＥで４分間３７℃で、及び４分間氷で染色した。その後、ＣＦＳＥが標識されたＴ細胞及び感染されたＢＭＤＣｓを４日間共培養した。
Ｔ細胞増殖の分析のために次のような実験を実行した。マウス２匹にｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）を静脈内注射した。７日後、脾臓細胞を極低温ＦＡＣＳ緩衝液［１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ］で洗浄し、氷で３０分間１０％ラット血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％塩素血清（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％マウス血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２．４Ｇ２モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含有したスーパーブロック（ｓｕｐｅｒ ｂｌｏｃｋ）溶液でブロッキングした。細胞を続いてＢＶ４２１－コンジュゲートされた抗－ＣＤ４（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＥ－コンジュゲートされた抗－ＣＤ８ａ（Ｃｌｏｎｅ ５３－６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で３０分間４℃で染色して極低温ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ器機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞集団を分類した。また、共培養する前日、未成熟ＢＭＤＣｓを野生型、２個のｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及び－ｐＡＬ－ｐ２４）又はｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株で１０のＭ．Ｏ．Ｉで２４時間の間感染させた。増殖分析は、蛍光細胞質追跡染料であるＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を用いて実行した。分類されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を５μＭ ＣＦＳＥで４分間３７℃で、及び４分間氷で染色した。その後、ＣＦＳＥが標識されたＴ細胞及び感染されたＢＭＤＣｓを４日間共培養した。
【0097】
Ｔ細胞と感染されたＢＭＤＣｓを共培養して４日後に、共培養された細胞（３個一セットのｗｅｌｌ）を氷で３０分間スーパーブロック（ｓｕｐｅｒ ｂｌｏｃｋ）溶液でブロッキングし、ＣＤ４ ＢＶ４２１－コンジュゲートされた抗－ＣＤ４（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＥ－コンジュゲートされた抗－ＣＤ８ａ（Ｃｌｏｎｅ ５３－６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３０分間４℃で染色した。細胞サイクルプロファイルは、ＦＡＣＳ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定し、測定値は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを用いて分析した（図４Ａ）。全ての実験は、３個を一セットで実行した。
【0098】
（９．ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ）
前記Ｔ細胞増殖分析過程で共培養された上層液（３個一セットのウェル）のマウスＩＬ－２の量をＥＬＩＳＡを用いて製造社のマニュアル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）によって測定した。全ての実験を２回実行した。
前記Ｔ細胞増殖分析過程で共培養された上層液（３個一セットのウェル）のマウスＩＬ－２の量をＥＬＩＳＡを用いて製造社のマニュアル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）によって測定した。全ての実験を２回実行した。
【0099】
（１０．Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析）
野生型及びｒＢＣＧ菌株で免疫化されたマウス（５匹／グループ）から得た脾臓細胞を用いて次のようにＥＬＩＳＰＯＴ検定を実行した。簡単に説明すれば、９６－ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＰＶＤＦ膜）をＰＢＳ中のマウスＩＦＮ－γ（３μｇ／ｍｌ、クローン：ＡＮ－１８）捕捉抗体（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でコーティングして一晩４℃でインキュベーションした。捕捉抗体を捨て、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有したＰＢＳ及びＰＢＳ（それぞれ３回）で洗浄し、プレートを１０％ ＦＢＳを含んだ２００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地で３時間の間３７℃でブロッキングした。ブロッキングした後、予防接種されたマウスから採取した脾臓細胞を各ウェル当たり５×１０５個ずつローディングした。それぞれの治療グループに対して、細胞を３個一セットで総２００μｌの体積のうち５μｇ/ｍｌの精製されたｐ２４抗原又は培地単独で刺激した。その後、プレートを３７℃で２４時間の間インキュベーションした。細胞を陽性対照群として５ｎｇ／ｍｌのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）及び５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。ＰＢＳＴ及びＰＢＳ（それぞれ３回）で洗浄した後、各ウェルをビオチンが標識されたマウスＩＦＮ－γ（３μｇ／ｍｌ、クローン：ＸＭＧ１．２）検出抗体（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理してプレートを一晩４℃でインキュベーションした。細胞をさらに洗浄してホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－コンジュゲートされたストレプトアビジンを各ウェルに添加した。ＨＲＰ反応は、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質試薬セット（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて展開した。ウェル当たりスポット形成単位（ＳＦＵｓ）の数をＥＬＩＳＰＯＴ判読機（ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴ判読機、Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて自動で計数した。全てのグループを３個一セットで分析し、２回の独立的な実験を実行した。
野生型及びｒＢＣＧ菌株で免疫化されたマウス（５匹／グループ）から得た脾臓細胞を用いて次のようにＥＬＩＳＰＯＴ検定を実行した。簡単に説明すれば、９６－ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＰＶＤＦ膜）をＰＢＳ中のマウスＩＦＮ－γ（３μｇ／ｍｌ、クローン：ＡＮ－１８）捕捉抗体（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でコーティングして一晩４℃でインキュベーションした。捕捉抗体を捨て、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有したＰＢＳ及びＰＢＳ（それぞれ３回）で洗浄し、プレートを１０％ ＦＢＳを含んだ２００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地で３時間の間３７℃でブロッキングした。ブロッキングした後、予防接種されたマウスから採取した脾臓細胞を各ウェル当たり５×１０５個ずつローディングした。それぞれの治療グループに対して、細胞を３個一セットで総２００μｌの体積のうち５μｇ/ｍｌの精製されたｐ２４抗原又は培地単独で刺激した。その後、プレートを３７℃で２４時間の間インキュベーションした。細胞を陽性対照群として５ｎｇ／ｍｌのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）及び５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。ＰＢＳＴ及びＰＢＳ（それぞれ３回）で洗浄した後、各ウェルをビオチンが標識されたマウスＩＦＮ－γ（３μｇ／ｍｌ、クローン：ＸＭＧ１．２）検出抗体（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理してプレートを一晩４℃でインキュベーションした。細胞をさらに洗浄してホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－コンジュゲートされたストレプトアビジンを各ウェルに添加した。ＨＲＰ反応は、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質試薬セット（ＢＤ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて展開した。ウェル当たりスポット形成単位（ＳＦＵｓ）の数をＥＬＩＳＰＯＴ判読機（ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴ判読機、Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ、ドイツ）を用いて自動で計数した。全てのグループを３個一セットで分析し、２回の独立的な実験を実行した。
【0100】
（１１．ｒＢＣＧ菌株で免疫化されたマウスでのサイトカイン生成の測定）
免疫化されたマウス（５匹／グループ）から得た脾臓細胞を１０％ ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ １６４０培地で１×１０６細胞／ウェル（９６ウェルマイクロプレート、２００μｌ体積、３個一セットで）の濃度に調整し、精製されたｐ２４タンパク質を試験管内刺激のために５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。細胞を培養し、上層液をＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＩＬ－６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）サイトカイン測定のために収得した。全てのグループを３個一セットで分析し、２回の独立的な実験を実行した。
免疫化されたマウス（５匹／グループ）から得た脾臓細胞を１０％ ＦＢＳを含んだＲＰＭＩ １６４０培地で１×１０６細胞／ウェル（９６ウェルマイクロプレート、２００μｌ体積、３個一セットで）の濃度に調整し、精製されたｐ２４タンパク質を試験管内刺激のために５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。細胞を培養し、上層液をＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＩＬ－６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）サイトカイン測定のために収得した。全てのグループを３個一セットで分析し、２回の独立的な実験を実行した。
【0101】
（１２．血清抗体検出）
血清抗体の割合を検出するために、免疫化されたマウス（５匹／グループ）からＣＯ２の過呼吸を通じた安楽死後に心臓穿孔方法を用いて血清サンプルを収集した。９６ウェルプレートを一晩４℃で０．０５Ｍ炭酸塩－重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の精製されたｐ２４タンパク質（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをＰＢＳＴ及びＰＢＳで３回洗浄して常温（ＲＴ）で１時間の間５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳＴ中のＢＳＡ）でブロッキングした。血清サンプルをＰＢＳで１：１０の割合で希釈し、１００μｌをウェルに添加した（３個一セットで）。プレートを２時間の間常温でインキュベーションし、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで３回洗浄し、１時間の間ビオチン化ラット抗－マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１，０００希釈）及び総ＩｇＧ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１，０００希釈）抗体とともにインキュベーションした。その後、プレートを再び洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートされたストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）)とともに３０分間常温でインキュベーションした。最終洗浄段階後に、全てのウェルをＢＤ ＯｐｔＥＩＡ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１０分間反応させた後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を中断させた。分光計を用いて４５０ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を測定した。
血清抗体の割合を検出するために、免疫化されたマウス（５匹／グループ）からＣＯ２の過呼吸を通じた安楽死後に心臓穿孔方法を用いて血清サンプルを収集した。９６ウェルプレートを一晩４℃で０．０５Ｍ炭酸塩－重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の精製されたｐ２４タンパク質（５μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをＰＢＳＴ及びＰＢＳで３回洗浄して常温（ＲＴ）で１時間の間５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳＴ中のＢＳＡ）でブロッキングした。血清サンプルをＰＢＳで１：１０の割合で希釈し、１００μｌをウェルに添加した（３個一セットで）。プレートを２時間の間常温でインキュベーションし、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで３回洗浄し、１時間の間ビオチン化ラット抗－マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１，０００希釈）及び総ＩｇＧ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１，０００希釈）抗体とともにインキュベーションした。その後、プレートを再び洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートされたストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）)とともに３０分間常温でインキュベーションした。最終洗浄段階後に、全てのウェルをＢＤ ＯｐｔＥＩＡ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１０分間反応させた後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を中断させた。分光計を用いて４５０ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を測定した。
【0102】
（１３．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）分析）
誘導されたＣＴＬ反応は、上述したものから多少変形を加えて測定した。簡単に説明すれば、エフェクター細胞の場合、それぞれの免疫化されたグループのマウスから得た脾臓細胞を主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ｃｌａｓｓ Ｉ－制限ｐ２４ペプチドＡ９Ｉ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）（１０μｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｔｒｏｎ、大田、大韓民国）を用いてパルスし、６日間ＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）とともに３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーターでインキュベーションした。標的細胞、すなわち、Ｐ８１５細胞（Ｈ－２ｄ）をＡ９Ｉペプチド（１０μｇ／ｍｌ）とともに２時間の間インキュベーションした後、エフェクター細胞及び標的細胞の共培養により製造した。細胞の細胞毒性をＵ字底９６ウェルプレートで乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）分析法により製造社のプロトコル（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性分析；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）によって評価した。簡単に説明すれば、エフェクター細胞（抗原により刺激された脾臓細胞）を標的細胞（ｐ２４パルスされたＰ８１５細胞）に３個一セットで相異なるエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）割合（１０：１、２０：１～５０：１の範囲）で６時間の間添加した；その後、培養された上層液から放出されたＬＤＨ値を４９０ｎｍで分光計を用いて検出した。特異的細胞溶解の百分率を次の式を用いて計算した：［｛実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－自然発生的エフェクター（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－自然発生的標的（Ｔａｒｇｅｔ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）｝］／｛最大標的（Ｔａｒｇｅｔ ｍａｘｉｍｕｍ）－自然発生的標的（Ｔａｒｇｅｔ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）｝×１００（％）。全てのグループを３個一セットで分析し、２回の独立的な実験を実行した。
誘導されたＣＴＬ反応は、上述したものから多少変形を加えて測定した。簡単に説明すれば、エフェクター細胞の場合、それぞれの免疫化されたグループのマウスから得た脾臓細胞を主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ｃｌａｓｓ Ｉ－制限ｐ２４ペプチドＡ９Ｉ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）（１０μｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｔｒｏｎ、大田、大韓民国）を用いてパルスし、６日間ＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）とともに３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーターでインキュベーションした。標的細胞、すなわち、Ｐ８１５細胞（Ｈ－２ｄ）をＡ９Ｉペプチド（１０μｇ／ｍｌ）とともに２時間の間インキュベーションした後、エフェクター細胞及び標的細胞の共培養により製造した。細胞の細胞毒性をＵ字底９６ウェルプレートで乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）分析法により製造社のプロトコル（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性分析；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）によって評価した。簡単に説明すれば、エフェクター細胞（抗原により刺激された脾臓細胞）を標的細胞（ｐ２４パルスされたＰ８１５細胞）に３個一セットで相異なるエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）割合（１０：１、２０：１～５０：１の範囲）で６時間の間添加した；その後、培養された上層液から放出されたＬＤＨ値を４９０ｎｍで分光計を用いて検出した。特異的細胞溶解の百分率を次の式を用いて計算した：［｛実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－自然発生的エフェクター（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－自然発生的標的（Ｔａｒｇｅｔ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）｝］／｛最大標的（Ｔａｒｇｅｔ ｍａｘｉｍｕｍ）－自然発生的標的（Ｔａｒｇｅｔ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）｝×１００（％）。全てのグループを３個一セットで分析し、２回の独立的な実験を実行した。
【0103】
（１４．統計的分析）
提供された全てのデータは、平均±標準偏差として表示した。スチューデントｔ－テストは、変量を比較するためにマイクロソフトエクセルソフトウェアを用いて実行し、ｐ値が０．０５より少ないときの差を統計学的に有意味なものとみなした。
提供された全てのデータは、平均±標準偏差として表示した。スチューデントｔ－テストは、変量を比較するためにマイクロソフトエクセルソフトウェアを用いて実行し、ｐ値が０．０５より少ないときの差を統計学的に有意味なものとみなした。
【0104】
［実施例］
［実施例１．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株はバクテリア及び感染細胞でＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ発現向上をもたらす］
本発明では、ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ予防接種のためのｒＢＣＧの製造でｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムの有用性を調べるために、相異なるマイコバクテリウム－大腸菌シャトルベクター、すなわち、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＯＰＯ、ｐＡＬ－ＴＯＰＯ及びｐＭＶ３０６をそれぞれ用いてｐ２４を発現する三つの類型のｒＢＣＧ菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－p２４を生成した（図２Ａ）。７Ｈ９ ｂｒｏｔｈ（１００μｇ／ｍｌのカナマイシン含む)で３０日間３個のｒＢＣＧ菌株の成長率を比較した。その結果、ｒＢＣＧ及び野生型ＢＣＧ菌株がほとんど同一の成長率を示した（図２Ｂ）。追加的に、マクロファージ及びＤＣｓにおいてこのようなｒＢＣＧ菌株の生存を調査するために、感染された細胞を０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｉｎ ＰＢＳ）で溶解させて７Ｈ１０寒天プレート上にプレーティングした。二つの細胞で全て、向上されたｐ２４発現によるバクテリア負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｕｒｄｅｎ）によりｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、他の菌株（すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４、－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及び野生型ＢＣＧ菌株）より少ないＣＦＵを示した（図２Ｃ）。
［実施例１．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株はバクテリア及び感染細胞でＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ発現向上をもたらす］
本発明では、ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ予防接種のためのｒＢＣＧの製造でｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステムの有用性を調べるために、相異なるマイコバクテリウム－大腸菌シャトルベクター、すなわち、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＯＰＯ、ｐＡＬ－ＴＯＰＯ及びｐＭＶ３０６をそれぞれ用いてｐ２４を発現する三つの類型のｒＢＣＧ菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－p２４を生成した（図２Ａ）。７Ｈ９ ｂｒｏｔｈ（１００μｇ／ｍｌのカナマイシン含む)で３０日間３個のｒＢＣＧ菌株の成長率を比較した。その結果、ｒＢＣＧ及び野生型ＢＣＧ菌株がほとんど同一の成長率を示した（図２Ｂ）。追加的に、マクロファージ及びＤＣｓにおいてこのようなｒＢＣＧ菌株の生存を調査するために、感染された細胞を０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｉｎ ＰＢＳ）で溶解させて７Ｈ１０寒天プレート上にプレーティングした。二つの細胞で全て、向上されたｐ２４発現によるバクテリア負荷（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｕｒｄｅｎ）によりｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、他の菌株（すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４、－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及び野生型ＢＣＧ菌株）より少ないＣＦＵを示した（図２Ｃ）。
【0105】
３個のｒＢＣＧ菌株のバクテリアでｐ２４の発現レベルを比較するために、培養されたバクテリアの溶解後にｐ２４に対するＥＬＩＳＡ（図３Ａ）及びウエスタンブロッティング（図３Ｂ）解析を実行した。全てのｒＢＣＧ菌株はｐ２４タンパク質を発現することができた。ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株と同様に、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、他のベクターシステムでの菌株よりおおよそ２又は３倍さらに高いレベルのｐ２４を発現した。ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４は、ｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－ｐ２４より多少高いレベルのｐ２４を生成した（図３Ａ及びＢ）。
【0106】
また、ｐ２４の安定的な発現を評価するために、カナマイシンの有り無しの条件で、７Ｈ１０寒天プレート上で多様な継代地点でのｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４でｐ２４の発現レベルをウエスタンブロッティング分析により測定した。ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、カナマイシンの有り無しの条件で、７Ｈ１０寒天プレート上で１２回の継代後にも安定的なｐ２４発現を示した（図３Ｄ及びＦ）。追加的に、３個のｒＢＣＧ菌株で感染されたマウスマクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）及びＢＭＤＣｓでｐ２４の発現レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて調査した。観察された傾向は、溶解されたｒＢＣＧ菌株で観察されたものと類似していた（図３Ｈ）。
【0107】
また、相異なるＭ．Ｏ．Ｉによるｐ２４発現レベルを比較するために、ＢＭＤＣｓをｒＢＣＧ－ｐＡＬ－p２４及びｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の相異なるＭ．Ｏ．Ｉ（１及び１０Ｍ．Ｏ．Ｉ）で１日及び３日間感染させた。その結果、二つの菌株の増加されたＭ．Ｏ．Ｉがｐ２４発現増加に影響を及ぼしたことが確認された。しかし、上記で提示されたように、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４菌株より多くのｐ２４発現を誘導した（図３Ｉ）。
【0108】
全体的に、他の二つのｒＢＣＧ菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＭＶ３０６－p２４と比較して、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、感染された抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びバクテリアでｐ２４の生成を増加させた。
【0109】
［実施例２．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株で感染されたＢＭＤＣｓはＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇで免疫化されたマウスでＴ細胞増殖の向上をもたらす］
本発明では、向上されたｐ２４タンパク質生成を示すｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がＴ細胞増殖能力を改善させることができるか否かを測定するために、４個の相異なる菌株、すなわち、野生型ＢＣＧ（対照群として）、２つの類型のｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４）及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４でそれぞれ感染されたＢＭＤＣｓでのＴ細胞増殖を混合されたリンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＭＬＲ）を通じたＣＦＳＥ希釈方法を用いて分析を実行した。同一のｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステム、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４を用いて２個の相異なる種の間のＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的免疫反応を誘導する能力を比較するために、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株をやはり含ませた。Ｔ細胞増殖分析の概略的な内容は、図４Ａに示した。
本発明では、向上されたｐ２４タンパク質生成を示すｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がＴ細胞増殖能力を改善させることができるか否かを測定するために、４個の相異なる菌株、すなわち、野生型ＢＣＧ（対照群として）、２つの類型のｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４）及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４でそれぞれ感染されたＢＭＤＣｓでのＴ細胞増殖を混合されたリンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＭＬＲ）を通じたＣＦＳＥ希釈方法を用いて分析を実行した。同一のｐＭｙｏｎｇ２ベクターシステム、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４を用いて２個の相異なる種の間のＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的免疫反応を誘導する能力を比較するために、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株をやはり含ませた。Ｔ細胞増殖分析の概略的な内容は、図４Ａに示した。
【0110】
結果的に、２個のｒＢＣＧ及び１個のｒＳｍｅｇ菌株で感染された全てのＢＭＤＣｓは、感染されないＢＭＤＣｓよりさらに高いレベルのＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞増殖を誘導した。特に、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４で感染されたＢＭＤＣｓは、他の２つの組換え菌株（ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株）及び野生型ＢＣＧ菌株で感染されたものよりさらに高いレベルのＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞増殖を誘導した。しかし、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４で感染されたＢＭＤＣｓとｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４で感染されたもののうちでは、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の増殖において両方とも有意な差は観察されなかった（図４Ｂ及びＣ）。また、刺激されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞でＩＬ－２レベルの比較は、やはりＴ細胞増殖分析で観察されたものと類似した傾向性を示した（図４Ｄ）。
【0111】
［実施例３．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は皮下免疫化により生成されたマウス脾臓で、ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的ＩＦＮ－γスポット形成細胞（ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ、ＳＦＣ）を誘導が向上する］
ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の予防接種後にＴ細胞反応が改善されたか否かを測定するために、３個の相異なる菌株、すなわち、２つの類型のｒＢＣＧ菌株（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及び－ｐＡＬ－ｐ２４）、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（図５Ａ）及び対照群として野生型ＢＣＧ菌株（～１０６ＣＦＵ）で皮下免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／グループ）の脾臓から脾臓細胞を分離し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析法を用いてＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的Ｔ細胞反応に対して分析した。３個の組換え菌株で皮下免疫化されたマウスから得た脾臓細胞は、野生型ＢＣＧ菌株で免疫化されたマウスから得た脾臓細胞よりさらに高いＳＦＵｓを示した。特に、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（９８７．７８±１９５．１１ ＳＦＵｓ／１０６脾臓細胞）で免疫化されたマウスから採取した脾臓細胞は、他の２個の菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４（４７９．５６±２１３．９０ ＳＦＵｓ／１０６脾臓細胞）及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（６４７．００±１５１．０１ ＳＦＵｓ／１０６脾臓細胞）で免疫化されたマウスから採取した脾臓細胞よりさらに高いＳＦＵｓを誘発した（図５Ｂ）。しかし、予防接種されたマウスからのｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＵｓでｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４とｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の間に有意な差は観察されなかった（図５Ｂ）。
ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４の予防接種後にＴ細胞反応が改善されたか否かを測定するために、３個の相異なる菌株、すなわち、２つの類型のｒＢＣＧ菌株（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４及び－ｐＡＬ－ｐ２４）、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（図５Ａ）及び対照群として野生型ＢＣＧ菌株（～１０６ＣＦＵ）で皮下免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／グループ）の脾臓から脾臓細胞を分離し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析法を用いてＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的Ｔ細胞反応に対して分析した。３個の組換え菌株で皮下免疫化されたマウスから得た脾臓細胞は、野生型ＢＣＧ菌株で免疫化されたマウスから得た脾臓細胞よりさらに高いＳＦＵｓを示した。特に、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（９８７．７８±１９５．１１ ＳＦＵｓ／１０６脾臓細胞）で免疫化されたマウスから採取した脾臓細胞は、他の２個の菌株、すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４（４７９．５６±２１３．９０ ＳＦＵｓ／１０６脾臓細胞）及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（６４７．００±１５１．０１ ＳＦＵｓ／１０６脾臓細胞）で免疫化されたマウスから採取した脾臓細胞よりさらに高いＳＦＵｓを誘発した（図５Ｂ）。しかし、予防接種されたマウスからのｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＵｓでｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４とｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の間に有意な差は観察されなかった（図５Ｂ）。
【0112】
総合すれば、本発明のデータは、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４がＴｈ１に特徴的なサイトカインであるＩＦＮ－γの向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ－特異的生成を誘導し、Ｔｈ１型免疫反応を歪曲させることでワクチン効能を向上させるための実行可能性を示す。
【0113】
［実施例４．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は予防接種されたマウスから得た脾臓細胞でＴｈ１又は前炎症性（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの生成の向上をもたらす］
ｒＢＣＧ菌株及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４で二回免疫化した後４週後に得られた脾臓細胞（５匹／グループ）（図５Ａ）を精製されたｐ２４タンパク質（５μｇ／ｍｌ）で３個一セットで試験管内で刺激させ、細胞培養上層液中のＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の誘導されたサイトカイン生成を検出した。二つの種類のＴｈ１型サイトカイン、すなわち、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ、そして一つの前炎症性サイトカイン、すなわち、ＩＬ－６で、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、野生型又は他の２個の組換え菌株でよりも常に、全ての時点（１日目及び３日目）で、予防接種されたマウスから得た脾臓細胞でよりもさらに高いレベルのサイトカインを生成した（図５Ｃ及び表１）。
ｒＢＣＧ菌株及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４で二回免疫化した後４週後に得られた脾臓細胞（５匹／グループ）（図５Ａ）を精製されたｐ２４タンパク質（５μｇ／ｍｌ）で３個一セットで試験管内で刺激させ、細胞培養上層液中のＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の誘導されたサイトカイン生成を検出した。二つの種類のＴｈ１型サイトカイン、すなわち、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ、そして一つの前炎症性サイトカイン、すなわち、ＩＬ－６で、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、野生型又は他の２個の組換え菌株でよりも常に、全ての時点（１日目及び３日目）で、予防接種されたマウスから得た脾臓細胞でよりもさらに高いレベルのサイトカインを生成した（図５Ｃ及び表１）。
【0114】
【表1】
【0115】
［実施例５．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は免疫化されたマウスでＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的Ｔｈ１に傾斜した体液性反応を誘導する］
本発明では、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４が免疫化されたマウスでＴｈ１に傾斜した体液性反応を誘導するか否かを測定するために、それぞれＴｈ１及びＴｈ２反応の公知されたマーカーであるＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１のレベルを分析した。図６に示したように、２個のｒＢＣＧ及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、野生型よりさらに高いレベルのＩｇＧ２ａアイソタイプを誘導した。ＩｇＧ１アイソタイプと関連して３個の組換え菌株が類似したレベルのＩｇＧ１を誘導した；しかし、その結果は、統計学的有意性には到逹しなかった。総ＩｇＧの場合に、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、他の二つの組換え菌株（すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）より相当にさらに高いレベルの総ＩｇＧを示した（図６）。
本発明では、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４が免疫化されたマウスでＴｈ１に傾斜した体液性反応を誘導するか否かを測定するために、それぞれＴｈ１及びＴｈ２反応の公知されたマーカーであるＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１のレベルを分析した。図６に示したように、２個のｒＢＣＧ及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は、野生型よりさらに高いレベルのＩｇＧ２ａアイソタイプを誘導した。ＩｇＧ１アイソタイプと関連して３個の組換え菌株が類似したレベルのＩｇＧ１を誘導した；しかし、その結果は、統計学的有意性には到逹しなかった。総ＩｇＧの場合に、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４は、他の二つの組換え菌株（すなわち、ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４及びｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４）より相当にさらに高いレベルの総ＩｇＧを示した（図６）。
【0116】
総合的に、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の割合は、より高いほどさらにＴｈ１に傾斜した体液性免疫反応を示し、前記割合は、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（１．０３±０．０２）で免疫化されたマウスから採取した血清で、他の菌株（野生型ＢＣＧ＝０．９１±０．７１；ｒＢＣＧ－ｐＡＬ－ｐ２４＝０．８８±０．２１；ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４＝１．０１±０．１７）で免疫化されたマウスから採取した血清での割合よりさらに高かった。このような結果は、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株が免疫化されたマウスで向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的Ｔｈ１に傾斜した体液性反応を誘導できることを示す。
【0117】
［実施例６．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株は免疫化されたマウスで向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ－特異的細胞傷害性Ｔリンパ球反応を誘導する］
本発明では、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４が免疫化されたマウスで向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ－特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導するか否かを測定するために、２個のｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４、－ｐＡＬ－ｐ２４）、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４又は野生型ＢＣＧ菌株で免疫化されたマウスからの脾臓細胞でＣＴＬ活性を、ＬＤＨ細胞毒性分析を通じて評価した。免疫化過程は、図５Ａで記述した。Ａ９Ｉペプチドで２時間の間パルスされたＰ８１５細胞（Ｈ－２ｄ）が標的細胞として用いられ、エフェクター／標的割合は、上述したように１０：１、２０：１及び５０：１であった。図７に示したように、５０：１のＥ：Ｔ割合で、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４で免疫化されたマウスのＣＴＬが他の菌株で免疫化されたものより相当にさらに高いレベルのＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的標的細胞溶解を誘導できることを示す（図７）。しかし、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４とｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の間で有意な差は観察されなかった（図７）。
本発明では、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４が免疫化されたマウスで向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ－特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導するか否かを測定するために、２個のｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４、－ｐＡＬ－ｐ２４）、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４又は野生型ＢＣＧ菌株で免疫化されたマウスからの脾臓細胞でＣＴＬ活性を、ＬＤＨ細胞毒性分析を通じて評価した。免疫化過程は、図５Ａで記述した。Ａ９Ｉペプチドで２時間の間パルスされたＰ８１５細胞（Ｈ－２ｄ）が標的細胞として用いられ、エフェクター／標的割合は、上述したように１０：１、２０：１及び５０：１であった。図７に示したように、５０：１のＥ：Ｔ割合で、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４で免疫化されたマウスのＣＴＬが他の菌株で免疫化されたものより相当にさらに高いレベルのＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的標的細胞溶解を誘導できることを示す（図７）。しかし、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４とｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の間で有意な差は観察されなかった（図７）。
【0118】
［実施例７．ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株はｐ２４タンパク質予防接種に比べて免疫化されたマウスで向上されたＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ特異的体液性及び細胞媒介された免疫反応を誘導する］
本発明では、ｐ２４タンパク質とｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の相異なるＣＦＵ間のｐ２４特異的免疫反応を比較するために、次のようなグループで独立的な生体内実験を実行した。
ｉ）ＰＢＳ対照群
ｉｉ）ｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）注射、ｉｉｉ）ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（１×１０６ＣＦＵ）注射、及びｉｖ）ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（１×１０７ＣＦＵ）注射（１週間隔、２回皮下注射）群。
免疫化過程は、実験方法の段落で記述した。最後の免疫化後に、ｐ２４－特異的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩｇＧ亜型分析及びＣＴＬ分析を実行した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析の場合、ｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＵがＣＦＵ依存的方式で増加した。しかし、ｐ２４タンパク質が注射されたマウスから得た脾臓細胞は、ｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＵを誘導することができなかった（図８Ａ）。これと同様に、それぞれの免疫化されたマウスから得た血清サンプルでｐ２４特異的ＩｇＧ２ａ抗体もＣＦＵ依存的方式で増加した。しかし、ｐ２４タンパク質が注射されたマウスの血清でｐ２４特異的ＩｇＧ２ａ抗体は、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４注射グループのそれと比較してさらに低いレベルを示した（図８Ｂ）。
本発明では、ｐ２４タンパク質とｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の相異なるＣＦＵ間のｐ２４特異的免疫反応を比較するために、次のようなグループで独立的な生体内実験を実行した。
ｉ）ＰＢＳ対照群
ｉｉ）ｐ２４タンパク質（３０μｇ／マウス）注射、ｉｉｉ）ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（１×１０６ＣＦＵ）注射、及びｉｖ）ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４（１×１０７ＣＦＵ）注射（１週間隔、２回皮下注射）群。
免疫化過程は、実験方法の段落で記述した。最後の免疫化後に、ｐ２４－特異的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩｇＧ亜型分析及びＣＴＬ分析を実行した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析の場合、ｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＵがＣＦＵ依存的方式で増加した。しかし、ｐ２４タンパク質が注射されたマウスから得た脾臓細胞は、ｐ２４特異的ＩＦＮ－γ ＳＦＵを誘導することができなかった（図８Ａ）。これと同様に、それぞれの免疫化されたマウスから得た血清サンプルでｐ２４特異的ＩｇＧ２ａ抗体もＣＦＵ依存的方式で増加した。しかし、ｐ２４タンパク質が注射されたマウスの血清でｐ２４特異的ＩｇＧ２ａ抗体は、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４注射グループのそれと比較してさらに低いレベルを示した（図８Ｂ）。
【0119】
また、ｐ２４タンパク質とｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４菌株の相異なるＣＦＵ間のｐ２４特異的ＣＴＬ反応を比較した。本明細書のデータは、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２４のｐ２４特異的ＣＴＬ反応がＣＦＵ依存的方式で増加し、常にｐ２４タンパク質のそれより相当にさらに高かったことを示した（図８Ｃ））。
【0120】
総合的に、本明細書のデータは、ｒＢＣＧ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｐ２がＣＦＵ依存的方式でｐ２４－特異的ＴＨ１－バイアスされた細胞性及び体液性免疫反応を誘導することができ、ｐ２４タンパク質の予防接種モジュールと比較して、ＨＩＶ－１ワクチン療法としての長所を有することを示す。
【0121】
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるであろう。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないことで理解すべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】