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特許7336791腫瘍を治療するためのコクサッキーウイルスＢ群

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-24

(45)【発行日】2023-09-01

(54)【発明の名称】腫瘍を治療するためのコクサッキーウイルスＢ群

(51)【国際特許分類】

A61K 35/768 20150101AFI20230825BHJP

C12N 15/41 20060101ALI20230825BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/7105 20060101ALI20230825BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20230825BHJP

A61K 35/763 20150101ALI20230825BHJP

A61K 35/761 20150101ALI20230825BHJP

A61K 35/765 20150101ALI20230825BHJP

A61K 35/766 20150101ALI20230825BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/513 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/407 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/519 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/675 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/4164 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/704 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/7048 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/337 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/17 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/136 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/282 20060101ALI20230825BHJP

A61K 31/24 20060101ALI20230825BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20230825BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20230825BHJP

C12N 15/113 20100101ALN20230825BHJP

C12N 15/63 20060101ALN20230825BHJP

【ＦＩ】

A61K35/768

C12N15/41 ZNA

C12N7/01

A61K31/7105

A61K45/00

A61K35/763

A61K35/761

A61K35/765

A61K35/766

A61K39/395 T

A61K31/513

A61K31/407

A61K31/519

A61K31/675

A61K31/4164

A61K31/704

A61K31/7048

A61K31/337

A61K31/17

A61K31/136

A61K31/282

A61K31/24

A61P35/00

A61P43/00 121

C12N15/113 Z

C12N15/63 Z

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2020557325

(86)(22)【出願日】2019-04-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-30

(86)【国際出願番号】 CN2019082608

(87)【国際公開番号】W WO2019201192

(87)【国際公開日】2019-10-24

【審査請求日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】201810338046.2

(32)【優先日】2018-04-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519326323

【氏名又は名称】シァメン・ユニヴァーシティ

(73)【特許権者】

【識別番号】517173983

【氏名又は名称】ヤンシェンターンカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100110423

【弁理士】

【氏名又は名称】曾我道治

(74)【代理人】

【識別番号】100111648

【弁理士】

【氏名又は名称】梶並順

(74)【代理人】

【識別番号】100122437

【弁理士】

【氏名又は名称】大宅一宏

(74)【代理人】

【識別番号】100209495

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤さおり

(72)【発明者】

【氏名】チェン、トン

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】イェ、シャンツォン

(72)【発明者】

【氏名】フ、ウェンクン

(72)【発明者】

【氏名】パン、デクァン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ジュン

(72)【発明者】

【氏名】シア、ニンシャオ

【審査官】濱田光浩

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／００８５４１１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１７１５２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５００１０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５０２９７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３４２９２５８（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２４６９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０６９９９５７７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３９８１１５２（ＣＮ，Ａ）

【文献】Virology，1997年，Vol. 239, No. 10，p. 71-77

【文献】Molecular Therapy，2009年，Vol. 17, No. 3，p. 409-416

【文献】Oncoimmunology，2016年，Vol. 5, No. 10，e1220467，doi: 10.1080/2162402X.2016.1220467

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ３５／７６８

Ｃ１２Ｎ１５／４１

Ｃ１２Ｎ７／０１

Ａ６１Ｐ３５／００

Ｃ１２Ｎ１５／１１３

Ｃ１２Ｎ１５／６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型コクサッキーウイルスＢ群１型（ＣＶＢ１）若しくは改変ＣＶＢ１又は核酸分子を含む、被験体における腫瘍を治療するための医薬組成物であって、前記核酸分子は、以下：
（１）前記野生型ＣＶＢ１又は改変ＣＶＢ１のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含み、
前記野生型ＣＶＢ１は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する、及び／又は、配列番号１に示されるｃＤＮＡ配列を有する；
前記改変ＣＶＢ１のゲノムは、野生型ＣＶＢ１のゲノムと比較して、以下の；
（１）５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列の外因性ＩＲＥＳ配列との置換；
（２）サイトカインをコードする核酸配列、抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドをコードする核酸配列、又はマイクロＲＮＡの標的配列から選択される外因性核酸の挿入；
から選択される１以上の改変を有する、医薬組成物。

【請求項2】

前記外因性ＩＲＥＳ配列が、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

以下の特徴：
（１）前記サイトカインがＧＭ－ＣＳＦであること；
（２）前記抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドがＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖであること；
（３）前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１３３及びｍｉＲ－２０６から選択されること；
の１つ以上によって特徴づけられる、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記改変ＣＶＢ１は、以下の特徴：
（１）前記改変ＣＶＢ１は、以下：配列番号１３～配列番号１６のいずれか１つに示されるゲノム配列を有すること、
（２）前記改変ＣＶＢ１は、以下：配列番号８～配列番号１１のいずれか１つに示されるｃＤＮＡ配列を有すること、
の１つを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

以下の特徴：
（１）前記核酸分子は、前記野生型ＣＶＢ１又は改変ＣＶＢ１のゲノム配列からなること、又は
（２）前記核酸分子は、前記野生型ＣＶＢ１若しくは改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列、又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクターであること、
の１つによって特徴づけられる、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記核酸分子は、配列番号１２～配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有するか、又は、配列番号１、配列番号８～配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列もしくはその相補的配列を含むベクターである、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記野生型ＣＶＢ１若しくは改変ＣＶＢ１又は前記核酸分子が、抗腫瘍活性を有する追加の薬学的活性剤と組み合わせて投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記追加の薬学的活性剤は、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記追加の薬学的活性剤は、以下の：
（１）前記追加の腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること；
（２）前記化学療法剤は、５－フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類、エトポシド、白金化合物、タキサン類又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること；
（３）前記免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害薬、腫瘍特異的標的化抗体又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること；
の１つ以上によって特徴づけられる、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

以下の特徴：
（１）前記腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、黒色腫、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、舌癌、鼻咽頭癌、鼻中隔の扁平上皮癌、咽頭扁平上皮癌、下顎腺の扁平上皮癌、喉頭癌、甲状腺癌、甲状腺管癌、及び膀胱癌からなる群から選択されること、
（２）前記被験体は、ヒトであること、
の少なくとも１つを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

野生型ＣＶＢ１と比較して、５’ＵＴＲの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列がヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている、改変ＣＶＢ１であって、
前記野生型ＣＶＢ１は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する、及び／又は、配列番号１に示されるｃＤＮＡ配列を有する、改変ＣＶＢ１。

【請求項12】

前記ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列が、配列番号２に示されている、請求項１１に記載の改変ＣＶＢ１。

【請求項13】

前記改変ＣＶＢ１は、サイトカインをコードする核酸配列、抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドをコードする核酸配列、及びマイクロＲＮＡの標的配列から選択される、外因性核酸を更に含む、請求項１２に記載の改変ＣＶＢ１。

【請求項14】

以下の特徴：
（１）前記サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦであること；
（２）前記抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドが、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖであること；
（３）前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－１３３及びｍｉＲ－２０６から選択されること；
の１つ以上によって特徴づけられる、請求項１３に記載の改変ＣＶＢ１。

【請求項15】

前記改変ＣＶＢ１は、以下の特徴：
１）前記改変ＣＶＢ１は、配列番号１３に示されるゲノム配列を有すること、
２）前記改変ＣＶＢ１は、配列番号８に示されるｃＤＮＡ配列を有すること、
の１つを有する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の改変ＣＶＢ１。

【請求項16】

核酸分子であって、以下：
（１）請求項１２～１５のいずれか一項に記載の改変ＣＶＢ１のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、核酸分子。

【請求項17】

以下の特徴：
（１）前記核酸分子が、前記改変ＣＶＢ１のゲノム配列からなること；
（２）前記核酸分子が、前記改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列、又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクターであること；
の１つによって特徴づけられる、請求項１６に記載の核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルス療法及び腫瘍療法の分野に関する。特に、本発明は、被験体（例えば、ヒト）における腫瘍を治療するための、及び被験体（例えば、ヒト）における腫瘍を治療するための医薬の製造のための、ＣＶＢ１若しくはその改変形、又はＣＶＢ１若しくはその改変形のゲノムヌクレオチド配列若しくはその相補的配列を含む核酸分子の使用に関する。本発明はまた、腫瘍を治療する方法であって、治療を必要とする被験体にＣＶＢ１若しくはその改変形、又はＣＶＢ１若しくはその改変形のゲノムヌクレオチド配列若しくはその相補的配列を含む核酸分子を投与する工程を含む、方法に関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍の現在の治療手段には、主として外科的治療、化学療法及び放射線療法が含まれる。これらの従来の療法は転移した腫瘍の治療には満足いくものではなく、更に患者の健康に大きな害を及ぼす場合がある。これに対して、新しいタイプの治療として、腫瘍溶解性ウイルスの使用による腫瘍治療法は、特異性が高く、効果が優れ、かつ副作用が低いという特性を有するため、現在では有望な腫瘍治療法とみなされている。

【0003】

腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内で自己複製し得ることで、腫瘍細胞を死滅若しくは溶解させる又は腫瘍細胞の成長を停止させるウイルスである。ｉｎｖｉｖｏ治療に使用される場合に、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞に対して特異的な選択性を示し、直接的に腫瘍細胞死を誘導することができるが、正常細胞にはほとんど効果を有しないか又は全く効果を有さず、一方で、腫瘍溶解性ウイルスは免疫系でＢリンパ球及びＴリンパ球の応答を刺激することにより、間接的に腫瘍細胞を死滅させることもできる。

【0004】

これまでに報告されている腫瘍溶解活性を有するエンテロウイルスには、悪性神経膠腫等のヒト固形腫瘍の治療のためのキメラポリオウイルス（非特許文献１）、ヒト胃癌細胞及び卵巣癌細胞を死滅させるエコーウイルスＥＣＨＯ１（非特許文献２、非特許文献３）等が含まれる。しかしながら、依然として、腫瘍特異性と腫瘍死滅活性との両方を有するウイルスを得ることが必要とされる。

【0005】

ＣＶＢ１は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属に属している。研究によると、ＣＶＢ１は一般には、感染後に感染者に発熱、くしゃみ及び咳等の軽度の症状を引き起こすにすぎないが、新生児、幼児、及び免疫不全成人においてウイルス性心筋炎、膵炎、肝炎、無菌性髄膜炎及びインスリン依存性糖尿病等の重度の慢性自己免疫疾患を引き起こす場合もあることが分かっている（非特許文献４）。現在、当該技術分野においてＣＶＢ１の腫瘍溶解活性に関する報告はない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Dobrikova et al., Mol Ther 2008, 16 (11): 1865-1872

【文献】Shafren et al., Int J Cancer 2005, 115 (2): 320-328

【文献】Haley et al., J Mol Med (Berl) 2009, 87 (4): 385-399

【文献】Rinehart et al., J Virol 1997, 71(5): 3986-3991

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明においては、特段の定めがない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、生化学、細胞生物学、核酸化学等のための作業工程は、対応する分野で広く使用されている慣用の工程である。一方で、本発明をより良く理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。

【0008】

本明細書で使用される場合に、「ＣＶＢ１（コクサッキーウイルスＢ群１型）」という用語は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属のコクサッキーウイルスＢ群の１つの種を指し、そのゲノムは５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と、ポリ（Ａ）テールとからなる一本鎖プラス鎖ＲＮＡである。ＯＲＦは、自体のプロテアーゼにより加水分解され切断されて、構造タンパク質ＶＰ１～ＶＰ４並びに非構造タンパク質２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄを生成し得る前駆体ポリタンパク質をコードしている。本発明をより明確に記載するために、ＣＶＢ１ゲノムにおける上記タンパク質に対応する核酸配列は、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、２Ａ遺伝子、２Ｂ遺伝子、２Ｃ遺伝子、３Ａ遺伝子、３Ｂ遺伝子、３Ｃ遺伝子及び３Ｄ遺伝子と呼ばれる。本発明において、「コクサッキーウイルスＢ群１型（ＣＶＢ１）」という表現は、天然源から分離することができ、意図的かつ人工的に改変されていない野生型ＣＶＢ１を意味し、その例には、限定されるものではないが、原型株Ｃｏｎｎ－５及び様々な臨床分離株（例えば、本発明の実施例１に記載される臨床分離株）が含まれる。野生型ＣＶＢ１のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列は、当該技術分野においてよく知られており、様々な公共データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのアクセッション番号：ＭＧ７８０４１４）において見出すことができる。

【0009】

本明細書で使用される場合に、ウイルスの「改変形」という用語は、野生型ウイルスを改変することにより得られる、野生型ウイルスの所望の活性（例えば、腫瘍溶解活性）を保持する改変ウイルスを指す。本発明において、ＣＶＢ１の「改変形」には、限定されるものではないが、野生型ＣＶＢ１のゲノム配列と比較して、ゲノム配列が１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有し、少なくともＣＶＢ１の腫瘍溶解活性を保持する改変ＣＶＢ１ウイルスが含まれる。

【0010】

本明細書で使用される場合に、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞内で複製し、腫瘍細胞死及び溶解を引き起こし、又は腫瘍細胞成長を妨げることができるウイルスを指す。このウイルスは、非腫瘍細胞に対して最小限の毒性効果を有することが好ましい。

【0011】

本明細書で使用される場合に、「腫瘍特異性」という用語は、腫瘍細胞内で生物学的機能又は生物学的活性を選択的に示すことを指す。例えば、本発明において「腫瘍特異性」という用語がウイルスの死滅選択性を説明するために使用される場合に、その用語は、ウイルスが非腫瘍細胞を死滅させることなく若しくは実質的に死滅させずに、腫瘍細胞を選択的に死滅させることができること又はウイルスが非腫瘍細胞を死滅させるよりも腫瘍細胞を死滅させることに有効であることを意味する。

【0012】

本明細書で使用される場合に、「腫瘍溶解活性」という用語は、主に腫瘍死滅活性を含む。ウイルスの腫瘍溶解活性を説明する場合に、ウイルスの腫瘍溶解活性は、典型的には、ウイルスが腫瘍細胞に感染する能力、腫瘍細胞内で複製する能力、及び／又は腫瘍細胞を死滅させる能力によって測定することができる。ウイルスの腫瘍溶解活性は、当該技術分野において知られる任意の方法を用いて測定され得る。例えば、ウイルスが腫瘍細胞に感染する能力は、所与の割合の腫瘍細胞（例えば、細胞の５０％）に感染するのに必要なウイルス量を測定することによって評価することができ、腫瘍細胞内で複製する能力は、腫瘍細胞内でのウイルスの増殖を測定することにより評価することができ、腫瘍細胞を死滅させる能力は、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察する又は腫瘍細胞活性を測定することにより評価することができる。

【0013】

本明細書で使用される場合に、「ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列」という表現は、ＲＮＡ配列中のリボヌクレオチドが対応するデオキシリボヌクレオチドにより置き換えられている点、例えばウラシルリボヌクレオチド（ＵＭＰ）がチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴＭＰ）により置き換えられている点のみがウイルスゲノムＲＮＡ配列と異なるウイルスゲノムＲＮＡ配列のＤＮＡ形を意味する。

【0014】

本明細書で使用される場合に、「外因性核酸」という用語は、元の配列に対して外来である人工的に導入されたヌクレオチド配列を指す。外因性核酸には、限定されるものではないが、ウイルスゲノムには見られない任意の遺伝子又はヌクレオチド配列が含まれる。しかしながら、本発明において、外因性核酸は、最大１５００ヌクレオチド、例えば最大１２００ヌクレオチド、最大１０００ヌクレオチドからなることが特に好ましい。幾つかの場合には、好ましくは、外因性核酸は、サイトカイン等の抗腫瘍死滅活性を有するタンパク質若しくはポリペプチド若しくは抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドをコードする、又は外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列を含む。本発明においては、マイクロＲＮＡは、好ましくは、腫瘍細胞中での発現レベルが正常細胞よりも大幅に低い及び／又は明らかな組織特異性を有するマイクロＲＮＡであり、その例としては、限定されるものではないが、肝臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－４８３等、膵臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ２１６ａ／ｂ、ｍｉＲ２１７及びｍｉＲ－３７５、心臓で特異的に発現されるｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ／ｂ、ｍｉＲ－２０８等、腎臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９６ａ／ｂ、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１５等、筋肉組織で特異的に発現されるｍｉＲ－１３３ａ／ｂ、ｍｉＲ－２０６等、脳組織で特異的に発現されるｍｉＲ－１２４ａ、ｍｉＲ－１２５ａ／ｂ、ｍｉＲ－１２８ａ／ｂ、ｍｉＲ－１３８等、並びに肝臓腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ－３４、ｍｉＲ－１２２ａ、ｍｉＲ－２６ａ、膵臓腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－９６及びｍｉＲ－１９６、腎臓腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ－３４、膀胱腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１３３ａ／ｂ、肺腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ－Ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－２９等が含まれる（例えば、Ruiz AJ and Russell S J. MicroRNAs and oncolytic viruses. [J]. Curr Opin Virol, 2015, 13: 40-48を参照；その全ては、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。

【0015】

本発明においては、改変ＣＶＢ１が上記マイクロＲＮＡの標的配列を含む場合に、その改変ＣＶＢ１は、該マイクロＲＮＡが高度に発現される又は特異的に発現される細胞／組織において該マイクロＲＮＡによって調節されるので、腫瘍溶解性ウイルスの複製は弱まり、更にはその死滅活性が失われ、その一方で、該マイクロＲＮＡの発現が低い又は発現のない腫瘍細胞／組織では、腫瘍溶解性ウイルスは正常に複製するため、腫瘍細胞を死滅させることができる。

【0016】

本明細書で使用される場合に、「サイトカイン」という用語は、当業者によく知られる意味を有する。しかしながら、本発明において、本発明の腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍の治療に使用される場合に、サイトカインは腫瘍治療のために使用することができるサイトカインであることが特に好ましい。「サイトカイン」の例には、限定されるものではないが、インターロイキン類（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５）、インターフェロン類（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）並びにそれらの任意の組合せが含まれる（例えば、Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J]. Oncotarget, 2015, 6 (23): 19346-19347を参照）。

【0017】

本明細書で使用される場合に、「抗腫瘍タンパク質又はポリペプチド」という用語は、限定されるものではないが、（１）細胞に対して毒性を有し、細胞増殖を阻害する又はアポトーシスを誘導することができるタンパク質又はポリペプチド（その例には、限定されるものではないが、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬが含まれる）（例えば、Candolfi M, King GD, Muhammad AG, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM) [J]. FASEB J, 2008, 22: 1077.13を参照）、（２）免疫療法効果を有するタンパク質又はポリペプチド（その例には、限定されるものではないが、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（抗ＣＴＬＡ－４）、プログラム死受容体１（抗ＰＤ－１）及びプログラム死リガンド１（抗ＰＤＬ－１）に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる）（例えば、Nolan E, Savas P, Policheni AN, et al. Combined immune checkpoint blockade as a therapeutic strategy for BRCA1-mutated breast cancer [J]. Science Trans Med, 2017, 9: eaal4922を参照；その全ては、引用することにより本明細書の一部をなす）、（３）腫瘍血管新生を阻害するタンパク質又はポリペプチド（その例には、限定されるものではないが、血管内皮成長因子（抗ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ由来ポリペプチド（例えば、_Ｄ（ＬＰＲ）、ＫＳＲＶＲＫＧＫＧＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫ等）及びＡＴＮ－１６１に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる）（例えば、Rosca EV, Koskimaki JE, Rivera CG, et al. Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12 (8): 1101-1116を参照；その全ては、引用することにより本明細書の一部をなす）を含む、腫瘍に対する治療活性を有するタンパク質又はポリペプチドを指す。

【0018】

本明細書で使用される場合に、「ｓｃＦｖ」という用語は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬとＶＨとがリンカーによって連結されている単一ポリペプチド鎖を指す（例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)、及びPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Volume 113, edited by Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pages 269-315 (1994)を参照）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有し得る。

【0019】

本明細書で使用される場合に、「同一性」という用語は、２つのタンパク質／ポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較される２つの配列が或る特定の部位に同じ単量体サブユニットの塩基又はアミノ酸を有する（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々が或る特定の部位にアデニンを有する又は２つのタンパク質／ポリペプチドの各々が或る特定の部位にリジンを有する）場合に、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性のパーセントは、比較される部位の総数に対する、２つの配列が共有する同一の部位の数に１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位の６個が一致している場合に、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは、５０％の同一性を共有する（６個の部位の３個が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。そのようなアラインメントは、例えばNeedlemanらの方法（J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970）に基づくＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.社）等のコンピュータープログラムを使用することにより実施することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers及びW. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）を使用して、ＰＡＭ１２０残基重み付け表を使用して、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーで決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschのアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）によって、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれかを使用して、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み付け及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付けで決定することができる。

【0020】

本明細書で使用される場合に、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドがその中に挿入され得る核酸の運搬体を指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合に、そのベクターは発現ベクターと呼称される。ベクターを形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞へと導入することができるので、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントは宿主細胞において発現され得る。ベクターは当業者によく知られており、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、λファージ又はＭ１３ファージ等のバクテリオファージ及び動物ウイルスが含まれる。ベクターとして使用され得る動物ウイルスには、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択用のエレメント及びレポーター遺伝子を含む発現を制御する様々なエレメントを含み得る。さらに、ベクターは複製開始部位を含み得る。

【0021】

本明細書で使用される場合に、「内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、５’キャップ構造に頼らずに翻訳を開始することができるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列中に位置するヌクレオチド配列を指す。ＩＲＥＳは、通常は５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内に位置しているが、ｍＲＮＡの他の場所に位置する場合もある。

【0022】

本明細書で使用される場合に、「ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）」という用語は、ピコルナウイルス科のウイルスであって、そのゲノム配列又はｃＤＮＡ配列が当該技術分野においてよく知られており、様々な公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのアクセッション番号Ｘ０２３１６．１）に見出すことができるウイルスを指す。

【0023】

本明細書で使用される場合に、「ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列を含む核酸分子」又は「核酸分子がＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列を含む」という表現は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。すなわち、核酸分子がＤＮＡである場合に、その核酸分子は、ＣＶＢ１又はその改変形のＤＮＡの形のゲノム配列を含み、核酸分子がＲＮＡである場合に、その核酸分子は、ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列を含む。

【0024】

本明細書で使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤」という用語は、被験体及び活性成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合可能な担体及び／又は添加剤を指し、その担体及び／又は添加剤は、当該技術分野においてよく知られており（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、イオン強度増強剤、浸透圧維持剤、吸収遅延剤、希釈剤、アジュバント、防腐剤、安定剤等が含まれる。例えば、ｐＨ調整剤には、限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。界面活性剤には、限定されるものではないが、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０が含まれる。イオン強度増強剤には、限定されるものではないが、塩化ナトリウムが含まれる。浸透圧維持剤には、限定されるものではないが、糖、ＮａＣｌ等が含まれる。吸収遅延剤には、限定されるものではないが、モノステアレート及びゼラチンが含まれる。希釈剤には、限定されるものではないが、水、水性緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）、アルコール類及びポリオール類（例えば、グリセロール）等が含まれる。アジュバントには、限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）等が含まれる。防腐剤には、限定されるものではないが、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、チメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン類、トリクロロ－ｔ－ブタノール、フェノール、ソルビン酸等が含まれる。安定剤は、当業者により一般的に理解される意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性（例えば、腫瘍溶解活性）を安定化することができ、限定されるものではないが、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストラン又はグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥ホエー、アルブミン又はカゼイン）又はそれらの分解産物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）が含まれる。

【0025】

本明細書で使用される場合に、「治療する」という用語は、疾患（例えば、腫瘍）の治療若しくは治癒、疾患（例えば、腫瘍）の症状の発症の遅延、及び／又は疾患（例えば、腫瘍）の進行の遅延を指す。

【0026】

本明細書で使用される場合に、「有効量」という用語は、意図される目的を有効的に達成することができる量を指す。例えば、治療的有効量は、疾患（例えば、腫瘍）を治療若しくは治癒する、疾患（例えば、腫瘍）の症状の発症を遅延させる、及び／又は疾患（例えば、腫瘍）の進行を遅延させるのに有効な又は十分な量であり得る。そのような有効量は、当業者又は医師によって容易に決定することができ、意図される目的（治療等）、全体的健康状態、年齢、性別、被験者の体重、治療されるべき疾患の重症度、合併症、投与経路等に関連し得る。そのような有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0027】

本明細書で使用される場合に、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば霊長類哺乳動物、例えばヒトを指す。或る特定の実施の形態では、被験体（例えば、ヒト）は腫瘍を有する、又は腫瘍を有するリスクがある。

【0028】

多数の実験を行うとともに探求を繰り返した末に、本出願の発明者らは、予想外にも、ＣＶＢ１が幅広いスペクトルと顕著な腫瘍細胞死滅能力とを有することを見出した。この発見に基づいて、本発明者らは、腫瘍を治療するための新しい腫瘍溶解性ウイルス及び該ウイルスに基づく腫瘍治療方法を開発した。

【0029】

したがって、第１の態様では、本発明は、被験体における腫瘍を治療するための、又は被験体における腫瘍を治療するための医薬の製造のための、コクサッキーウイルスＢ群１型（ＣＶＢ１）若しくはその改変形又は核酸分子の使用であって、前記核酸分子は、以下：
（１）ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、使用を提供する。

【0030】

或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１は野生型ＣＶＢ１である。或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１はコクサッキーウイルスＢ群１型に感染した個体から分離された臨床分離株であり得る。

【0031】

或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列である。

【0032】

或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１又はその改変形のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１又はその改変形のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列である。

【0033】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変形は、野生型ＣＶＢ１と比較してゲノム中に１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＣＶＢ１である。

【0034】

或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＣＶＢ１と比較して、改変ＣＶＢ１は、以下：
（１）非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異と、
（２）１つ以上の外因性核酸の挿入と、
（３）１つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
（４）上記３つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される１つ以上の改変を有する。

【0035】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）において１つ以上の突然変異を含む。

【0036】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は、５’ＵＴＲ配列の全て又は部分の置換を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１の５’ＵＴＲにおける内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、外因性ＩＲＥＳ配列、例えばヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている。或る特定の好ましい実施の形態では、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は配列番号２に示されている。

【0037】

ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列の使用は、幾つかの場合には、例えば、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍特異性の改善に有利である。正常なヒト神経細胞では、ヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列に宿主ＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢＰ７６及びＮＦ４５）が特異的に結合し、それによりｅｌＦ４Ｇ等の因子の動員が妨げられ（Merrill et al. J Virol 2006,80 (7): 3147-3156、Merrill and Gromeier, J Virol 2006,80 (14): 6936-6942、Neplioueva et al., PLoS One 2010,5 (7): e11710)、その一方で、Ｒａｆ／Ｅｒｋ１／２／ＭＡＰＫ及びその他のシグナル伝達経路に対応しておらず、リボソームはヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列にほとんど結合することができないため、ウイルスタンパク質の翻訳を開始することができない（Dobrikov et al., Mol Cell Biol 2011, 31(14): 2947-2959、Dobrikov et al., Mol Cell Biol 2013, 33(5): 937-946）ことが以前に報告されている。ヒト神経膠腫腫瘍細胞においては、ヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位は上記の２つの要因により影響されないため、ウイルスタンパク質の転写及び翻訳を正常に開始することができる。したがって、幾つかの場合には、ＣＶＢ１の内部リボソーム進入部位配列をヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列で置き換えることは、正常なヒト神経細胞に対する本発明のウイルスの毒性副作用を、ヒト神経膠腫の治療でのそのウイルスの使用に影響を与えることなく回避又は低減するのに有益である。

【0038】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は外因性核酸を含む。

【0039】

或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ－ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードする。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、改変ＣＶＢ１のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入される。

【0040】

或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ－１３３又はｍｉＲ－２０６）の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、マイクロＲＮＡの標的配列は、改変ＣＶＢ１のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入される。

【0041】

腫瘍細胞における或る特定のマイクロＲＮＡの発現レベルが正常細胞よりも大幅に低いこと、及び／又は明らかな組織特異性を有することが以前に報告されている。したがって、幾つかの場合には、本発明の改変ＣＶＢ１がそのようなマイクロＲＮＡの標的配列を含むことが有利である。それというのも、正常な細胞又は組織で高度に発現されるそのようなマイクロＲＮＡは、対応する標的配列を介して正常な細胞又は組織における改変ＣＶＢ１の複製を低減し得るか、又は更には遮断し得るため、非腫瘍細胞に対する改変ＣＶＢ１の毒性副作用は減少、更には回避されるからである。そのようなマイクロＲＮＡには、限定されるものではないが、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－２１７、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６等が含まれる（例えば、国際公開第２００８１０３７５５号、米国特許出願公開第２０１６０１４３９６９号、又はBaohong Zhang et al., Developmental Biology, Volume 302, Issue 1, 1 February 2007, Pages 1-12を参照；その全ては、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。

【0042】

或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、上記の１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、ｍｉＲ－１３３及び／又はｍｉＲ－２０６の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ－１３３の標的配列は、配列番号３に示されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ－２０６の標的配列は、配列番号４に示されている。幾つかの場合には、ｍｉＲ－１３３及び／又はｍｉＲ－２０６の標的配列の挿入が有利である。これは、ｍｉＲ－１３３及びｍｉＲ－２０６が筋肉組織で特異的に発現されるため、ｍｉＲ－１３３及び／又はｍｉＲ－２０６の標的配列を改変ＣＶＢ１へと挿入することで、腫瘍溶解性ウイルスの組織向性を変化させることにより正常な筋肉組織への損傷を減少する又は回避することができるからである。

【0043】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は、上記の外因性核酸の少なくとも１つの挿入及び／又は上記の非翻訳領域における少なくとも１つの突然変異を含む。

【0044】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のゲノム配列は、以下：配列番号１３～配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のゲノム配列は、配列番号１３～配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるいずれか１つである。

【0045】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列は、以下：配列番号８～配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列は、配列番号８～配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるいずれか１つである。

【0046】

本発明の改変ＣＶＢ１は逆遺伝学技術により得ることができ、逆遺伝学技術は当該技術分野において知られており、例えば、Yang LS, Li SX, Liu YJ, et al. Virus Res, 2015, 210: 165-168、Hou WH, Yang LS, Li SX, et al. Virus Res, 2015, 205: 41-44を参照のこと（その全ては、引用することにより本明細書の一部をなす）。そのような実施の形態では、典型的には、野生型ＣＶＢ１のｃＤＮＡに改変を加えることで（例えば、外因性核酸の挿入、内因性遺伝子の欠失若しくは突然変異、又は非翻訳領域における突然変異）、改変ＣＶＢ１が得られる。

【0047】

本発明によるＣＶＢ１又はその改変形を前処理することで、被験体におけるウイルスに対する免疫応答を低減させる又は排除することができ、ここで、上記前処理は、リポソーム又はミセル中にＣＶＢ１をパッケージングすること、及び／又はプロテアーゼ（例えば、キモトリプシン又はトリプシン）を使用してウイルスのキャプシドタンパク質を除去し、宿主におけるウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫を低下させることを含み得る。

【0048】

本発明において、本明細書に記載されるＣＶＢ１又はその改変形は、腫瘍細胞における馴化のために連続継代され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍細胞は、当該技術分野において知られる腫瘍細胞系統若しくは腫瘍細胞株であり得る、又は腫瘍を有する個体（例えば、被験体）からのｉｎｖｉｖｏでの外科的切除若しくは臨床的分離によって得られた腫瘍細胞であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１又はその改変形は、腫瘍を有する個体（例えば、被験体）から得られた腫瘍細胞における馴化のために連続継代される。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍細胞は、腫瘍を有する個体（例えば、被験体）からの外科的切除又は臨床的分離によって得られる。或る特定の好ましい実施の形態では、馴化のための連続継代法は、以下の過程、すなわち１）標的腫瘍細胞にウイルスを感染させる過程と、２）上清中のウイルスを採取する過程と、３）新たな標的腫瘍細胞に得られたウイルスを再感染させる過程とからなる複数のサイクル（例えば、少なくとも５サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも１５サイクル、少なくとも２０サイクル）を含む。

【0049】

或る特定の好ましい実施の形態では、上記のＣＶＢ１及びその改変形は、組み合わせて使用され得る。したがって、医薬はＣＶＢ１及びその改変形の１つ又は幾つかを含み得る。

【0050】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるＣＶＢ１若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列又は上記ゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列の相補的配列からなる。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は本明細書に記載されるＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、配列番号１２～配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。

【0051】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるＣＶＢ１若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるＣＶＢ１若しくはその改変形のｃＤＮＡ配列、又は上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。

【0052】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、以下：
（１）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
（３）配列番号１３～配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（４）配列番号１３～配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。

【0053】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、ＣＶＢ１又はその改変形のｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、以下：
（１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
（３）配列番号８～配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（４）配列番号８～配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。

【0054】

本発明の核酸分子は、当該技術分野において知られる任意の手段によって送達することができ、例えば、ネイキッド核酸分子（例えば、ネイキッドＲＮＡ）を直接的に注入することができる又は非ウイルス送達システムを使用することができる。非ウイルス送達システムは、限定されるものではないが、"Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55."及び"Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に詳細に記載される材料、例えばリポソーム、無機ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を含む当該技術分野においてよく知られる様々な材料から得ることができる。

【0055】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、治療的有効量の本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は治療的有効量の核酸分子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、医療技術分野で知られる任意の形で存在し得る。例えば、医薬は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤、又は注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態であり得る。幾つかの実施の形態では、医薬は、注射液又は凍結乾燥粉末である。

【0056】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は薬学的に許容可能な担体又は添加剤を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は安定剤を含む。

【0057】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、任意に、追加の薬学的活性剤を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明によるＣＶＢ１若しくはその改変形、又は本発明の核酸分子は、追加の薬学的活性剤と組み合わせて使用される。好ましい実施の形態では、追加の薬学的活性剤は追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤等の抗腫瘍活性を有する薬剤である。

【0058】

本発明において、追加の腫瘍溶解性ウイルスには、限定されるものではないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス又はそれらの任意の組合せが含まれる。化学療法剤には、限定されるものではないが、５－フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類（例えば、エピルビシン又はドキソルビシン）、エトポシド、白金化合物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）、タキサン類（例えば、パクリタキセル又はドセタキセル）又はそれらの任意の組合せが含まれる。免疫療法剤には、限定されるものではないが、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１阻害薬又はＣＴＬＡ－４阻害薬）、腫瘍特異的標的化抗体（例えば、リツキシマブ又はハーセプチン）又はそれらの任意の組合せが含まれる。

【0059】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬はＣＶＢ１及び／又はその改変形の単位用量を含み、例えば、少なくとも１×１０^２ｐｆｕ、少なくとも１×１０^３ｐｆｕ、少なくとも１×１０^４ｐｆｕ、１×１０^５ｐｆｕ、１×１０^６ｐｆｕ、少なくとも１×１０^７ｐｆｕ、少なくとも１×１０^８ｐｆｕ、少なくとも１×１０^９ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１０ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１１ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１２ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１３ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１４ｐｆｕ又は少なくとも１×１０^１６ｐｆｕのＣＶＢ１及び／又はその改変形を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は１×１０^２ｐｆｕ～１×１０^１７ｐｆｕのＣＶＢ１及び／又はその改変形を含む。

【0060】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は本明細書に記載される核酸分子の単位用量を含み、例えば３×１０^１０～３×１０^１４のウイルスゲノムコピーの核酸分子を含む。

【0061】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は追加療法と組み合わせて投与され得る。この追加療法は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法又は遺伝子療法等の腫瘍に関して知られている任意の療法であり得る。この追加療法は医薬の投与前に、その投与と同時に又はその投与後に施すことができる。

【0062】

或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、黒色腫、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、舌癌、鼻咽頭癌、鼻中隔の扁平上皮癌、咽頭扁平上皮癌、下顎腺の扁平上皮癌、喉頭癌、甲状腺癌、甲状腺管癌、及び膀胱癌から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍は、肺癌、食道癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膵臓癌、舌癌、腎臓癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、及び膀胱癌から選択される。

【0063】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0064】

第２の態様では、本発明は、腫瘍を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、有効量のＣＶＢ１若しくはその改変形又は有効量の核酸分子を投与する工程を含み、上記核酸分子は、以下：
（１）上記ＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）上記ゲノム配列又は上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、方法を提供する。

【0065】

或る特定の好ましい実施の形態では、被験体にＣＶＢ１が投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１は野生型ＣＶＢ１である。或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１はコクサッキーウイルスＢ群１型に感染した個体から分離された臨床分離株であり得る。

【0066】

【0067】

【0068】

或る特定の好ましい実施の形態では、被験体にＣＶＢ１の改変形が投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、改変形は、野生型ＣＶＢ１と比較してゲノム中に１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＣＶＢ１である。

【0069】

【0070】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）において１つ以上の突然変異を含む。

【0071】

【0072】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は外因性核酸を含む。

【0073】

【0074】

【0075】

【0076】

【0077】

【0078】

【0079】

或る特定の好ましい実施の形態では、上記のＣＶＢ１及びその改変形は、組み合わせて使用され得る。したがって、ＣＶＢ１及びその改変形の１つ以上を被験体に投与することができる。

【0080】

或る特定の好ましい実施の形態では、本明細書に記載される核酸分子が被験体に投与される。

【0081】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるＣＶＢ１若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなる。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は本明細書に記載されるＣＶＢ１又はその改変形のゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、配列番号１２～配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。

【0082】

【0083】

【0084】

【0085】

本発明において、本発明の核酸分子は、当該技術分野において知られる任意の手段によって送達することができ、例えば、ネイキッド核酸分子（例えば、ネイキッドＲＮＡ）を直接的に注入することができる又は非ウイルス送達システムを使用することができる。非ウイルス送達システムは、限定されるものではないが、"Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55."及び"Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に詳細に記載される材料、例えばリポソーム、無機ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を含む当該技術分野においてよく知られる様々な材料から得ることができる。

【0086】

或る特定の好ましい実施の形態では、本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は核酸分子を、医薬組成物として製剤化して投与することができる。このような医薬組成物は、治療的有効量の本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は治療的有効量の核酸分子を含み得る。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、医療技術分野で知られる任意の形で存在し得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）及び他の形態であり得る。幾つかの実施の形態では、医薬組成物は、注射液又は凍結乾燥粉末である。

【0087】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は薬学的に許容可能な担体又は添加剤を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は安定剤を含む。

【0088】

本発明において、本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は核酸分子は様々な適切な経路により被験体に投与され得る。幾つかの場合には、本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は核酸分子の投与経路は腫瘍の位置及び種類に依存する。例えば、容易にアクセス可能な固形腫瘍の場合に、ウイルス又は核酸分子は任意に腫瘍への直接注射（例えば、腫瘍内注射）により投与され、造血系の腫瘍の場合に、ウイルス又は核酸分子は静脈内又は他の血管内経路で投与することができ、体内の容易にアクセス可能でない腫瘍（例えば、転移）の場合に、ウイルス又は核酸分子は全身を駆け巡ることで腫瘍に到達することができるように全身投与することができる（例えば、静脈内注射又は筋肉内注射）。任意に、本発明のウイルス又は核酸分子は、皮下経路、腹腔内経路、くも膜下経路（例えば、脳腫瘍の場合）、局所経路（例えば、黒色腫の場合）、経口経路（例えば、口腔癌又は食道癌の場合）、鼻腔内経路又は吸入スプレー経路（例えば、肺癌の場合）等を介して投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、本明細書に記載される本発明のＣＶＢ１及び／又はその改変形又は核酸は、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路及び経口経路等を介して投与され得る。

【0089】

或る特定の好ましい実施の形態では、上記方法は、抗腫瘍活性を有する追加の薬学的活性剤を投与することを更に含む。そのような追加の薬学的活性剤は、本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は核酸分子の投与の前に、その投与と同時に又はその投与の後に投与され得る。

【0090】

或る特定の好ましい実施の形態では、追加の薬学的活性剤には、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤が含まれる。

【0091】

【0092】

或る特定の好ましい実施の形態では、ＣＶＢ１及び／又はその改変形は被験体の体重１ｋｇ当たり１ｐｆｕ～１×１０^１５ｐｆｕの任意の量で投与することができ、例えば、ＣＶＢ１及び／又はその改変形は被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０^３ｐｆｕ、少なくとも１×１０^４ｐｆｕ、１×１０^５ｐｆｕ、１×１０^６ｐｆｕ、少なくとも１×１０^７ｐｆｕ、少なくとも１×１０^８ｐｆｕ、少なくとも１×１０^９ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１０ｐｆｕ、少なくとも１×１０^１１ｐｆｕ、又は少なくとも１×１０^１２ｐｆｕの量で投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、本明細書に記載される核酸分子は被験体の体重１ｋｇ当たり３×１０^１０～３×１０^１４のウイルスゲノムコピーのいずれかの量で投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、本明細書に記載されるＣＶＢ１及び／又はその改変形又は核酸分子は１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回又は週に１回投与することができ、任意に上述の投与計画は、必要に応じて毎週又は毎月繰り返すことができる。

【0093】

或る特定の好ましい実施の形態では、上記方法は追加療法を施すことを更に含む。この追加療法は外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法又は遺伝子療法等の腫瘍に関して知られている任意の療法であり得る。この追加療法は上記方法を施す前に、それと同時に又はその後に施すことができる。

【0094】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0095】

【0096】

第３の態様では、本発明はまた、第１の態様若しくは第２の態様で規定されるＣＶＢ１及び／又はその改変形、又は第１の態様若しくは第２の態様で規定される核酸分子を含む医薬組成物に関する。

【0097】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、医療技術分野で知られる任意の形で存在し得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）及び他の形態であり得る。幾つかの実施の形態では、医薬組成物は、注射液又は凍結乾燥粉末である。

【0098】

【0099】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、任意に、追加の薬学的活性剤を更に含む。好ましい実施の形態では、追加の薬学的活性剤は追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤等の抗腫瘍活性を有する薬剤である。

【0100】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は被験体における腫瘍の治療のために使用される。

【0101】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0102】

【0103】

第４の態様では、本発明はまた、医薬として使用される、第１の態様若しくは第２の態様で規定されるＣＶＢ１及び／又はその改変形、又は第１の態様若しくは第２の態様で規定される核酸分子に関する。

【0104】

第５の態様では、本発明は、野生型ＣＶＢ１と比較して、５’ＵＴＲの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列がヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている、改変ＣＶＢ１を提供する。

【0105】

或る特定の好ましい実施の形態では、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は配列番号２に示されている。

【0106】

或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＣＶＢ１のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＣＶＢ１のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列である。

【0107】

或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列である。

【0108】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１はまた、外因性核酸を含む。

【0109】

【0110】

【0111】

【0112】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は、上記の外因性核酸の少なくとも１つの挿入を含む。

【0113】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のゲノム配列は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のゲノム配列は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列である。

【0114】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列である。

【0115】

或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＣＶＢ１は、被験体における腫瘍を治療するために又は被験体における腫瘍を治療するための医薬を製造するために使用される。

【0116】

【0117】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0118】

第６の態様では、本発明は、核酸分子であって、以下：
（１）第５の態様に記載される改変ＣＶＢ１のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、核酸分子を提供する。

【0119】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、上記の改変ＣＶＢ１のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなる。

【0120】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は上記の改変ＣＶＢ１のゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有する。

【0121】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、本明細書に記載される改変ＣＶＢ１のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、本明細書に記載される改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列、又は上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。

【0122】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、改変ＣＶＢ１のゲノム配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、以下：
（１）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。

【0123】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、上記の改変ＣＶＢ１のｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、以下：
（１）配列番号８に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。

【0124】

或る特定の好ましい実施の形態では、核酸分子は、被験体における腫瘍を治療するために又は被験体における腫瘍を治療するための医薬を製造するために使用される。

【0125】

【0126】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0127】

第７の態様では、本発明は、第５の態様による改変ＣＶＢ１又は第６の態様による核酸分子を含む医薬組成物に関する。

【0128】

【0129】

【0130】

【0131】

或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、被験体における腫瘍を治療するために使用される。

【0132】

【0133】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0134】

第８の態様では、本発明はまた、被験体における腫瘍を治療するための、又は被験体における腫瘍を治療するための医薬の製造のための、第５の態様による改変ＣＶＢ１又は第６の態様による核酸分子の使用に関する。

【0135】

【0136】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【0137】

第９の態様では、本発明はまた、腫瘍を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、有効量の第５の態様に記載される改変ＣＶＢ１又は有効量の第６の態様に記載される核酸分子を投与する工程を含む、方法に関する。

【0138】

【0139】

或る特定の好ましい実施の形態では、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である。

【発明の効果】

【0140】

従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は、少なくとも以下の有益な効果を有する。

【0141】

本出願の発明者らは、ＣＶＢ１が幅広いスペクトルの腫瘍死滅活性を有することを初めて見出した。この知見に基づき、本発明は、より高い腫瘍死滅活性及び腫瘍特異性を有するため、腫瘍の治療に単独で使用することができ、また従来の腫瘍治療のための補助的方法として又は他の治療方法がない場合の治療方法として使用することもできる、ＣＶＢ１ベースの腫瘍溶解性ウイルスを更に提供する。

【0142】

本発明によるＣＶＢ１又はその改変形は、正常細胞に対してほとんど又は全く効果を有さず、被験体（例えば、ヒト）に安全に投与することができる。したがって、本発明によるＣＶＢ１又はその改変形は、大きな臨床的価値を有する。

【0143】

本発明の実施形態を添付の図面及び以下の実施例と併せて詳細に説明するが、当業者であれば、添付の図面及び以下の実施例は本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な対象及び有利な態様は、当業者には以下の図面の詳細な説明及び好ましい実施形態から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0144】

【図1A】図１Ａ～図１Ｄは、実施例２におけるヒト膵管上皮細胞系統ｈＴＥＲＴ－ＨＰＮＥ、ヒト鼻咽頭癌細胞系統ＣＮＥ、ヒト肝臓癌細胞系統ＨｅｐＧ２、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｉｓｈｉｋａｗａ、ヒト乳癌細胞系統ＢＴ－４７４、ヒト非小細胞肺癌細胞系統ＥＢＣ－１、ヒト喉頭癌細胞系統ＨＥｐ－２、ヒト舌癌細胞系統ＳＣＣ－２５、ヒト結腸直腸癌細胞系統ＨＴ－２９、ヒト卵巣癌細胞系統Ａ２７８０、ヒト膵臓癌細胞系統ＡｓＰＣ－１及びヒト前立腺癌細胞系統ＤＵ１４５に対する野生型ＣＶＢ１のｉｎｖｉｔｒｏ死滅実験の顕微鏡写真を示す図であり、ここで、ＭＯＣＫは、ウイルスに感染していない細胞を表す。これらの結果は、ＣＶＢ１が、感染多重度（ＭＯＩ）１で感染の７２時間後に、ヒト腫瘍細胞系統ＣＮＥ、ＨｅｐＧ２、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＢＴ－４７４、ＥＢＣ－１、ＨＥｐ－２、ＳＣＣ－２５、ＨＴ－２９、Ａ２７８０、ＡｓＰＣ－１及びＤＵ１４５に対して顕著な腫瘍溶解効果を示したが、ヒト非腫瘍細胞ｈＴＥＲＴ－ＨＰＮＥに対しては効果を有しなかったことを示している。

【図1B】図１Ａの説明を参照

【図1C】図１Ａの説明を参照

【図1D】図１Ａの説明を参照

【図2】実施例２におけるｉｎｖｉｔｒｏ転写法により得られた野生型ＣＶＢ１ウイルスゲノムＲＮＡの１つの試料の電気泳動図を示す図である。

【図3】実施例２におけるヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａに対する野生型ＣＶＢ１ウイルスゲノムＲＮＡの死滅効果を示す図である。これらの結果は、ＣＶＢ１ゲノムＲＮＡでトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞がほぼ完全に溶解され、トランスフェクションの４８時間後に死に至ることを示している。

【図4-1】図４Ａ～図４Ｉは、本発明の実施例３におけるヒト乳癌細胞系統ＢｃａＰ３７（Ａ）、ヒト非小細胞肺癌細胞系統Ａ５４９（Ｂ）及びＳＰＣ－Ａ－１（Ｃ）、ヒトバーキットリンパ腫細胞系統Ｒａｊｉ（Ｄ）、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｉｓｈｉｋａｗａ（Ｅ）及びＨＥＣ－１－Ｂ（Ｆ）、ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ（Ｇ）及びＣ－３３Ａ（Ｈ）、並びにヒト神経膠腫細胞系統ＧＢＭ（Ｉ）に対する野生型ＣＶＢ１のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍実験の結果を示す図である。これらの結果は、チャレンジ実験群では、腫瘍量当たり１０^６のＴＣＩＤ５０のＣＶＢ１が、２日毎に腫瘍内注射されることを示している。合計５回の処理後に、ＳＣＩＤマウスにおけるＢｃａＰ３７細胞、Ａ５４９細胞、ＳＰＣ－Ａ－１細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＥＣ－１－Ｂ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｃ－３３Ａ細胞又はＧＢＭ細胞の皮下接種によって形成された腫瘍の成長は大幅に遅くなって停止し、腫瘍は更には溶解されて消失した。それに対して、腫瘍溶解性ウイルスの処理をしていないネガティブ群（ＣＴＲＬ）の腫瘍は通常の成長を維持し、その腫瘍体積はチャレンジ群の腫瘍よりも有意に大きかった。

【図4-2】図４－１の説明を参照。

【図4-3】図４－１の説明を参照。

【図5】実施例３におけるヒト神経膠腫細胞系統ＧＢＭに対するＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍実験の結果を示す図である。これらの結果は、チャレンジ実験群では、腫瘍量当たり１０^６のＴＣＩＤ５０のＣＶＢ１又はその改変形が、２日毎に腫瘍内注射されることを示した。１０日間にわたる合計５回の処理後に、ＳＣＩＤマウスにおけるＧＢＭ細胞の皮下接種によって形成された腫瘍の成長は停止し、腫瘍は更には溶解されて消失した。それに対して、腫瘍溶解性ウイルスの処理をしていないネガティブ群（ＣＴＲＬ）の腫瘍は通常の成長を維持し、その腫瘍体積はチャレンジ群の腫瘍よりも有意に大きかった。

【発明を実施するための形態】

【0145】

配列情報
本発明に関係する配列の一部の情報を以下の表１に示す。

【0146】

【表1】

【0147】

本発明を実施するための具体的なモデル
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を例示することを意図するものである（本発明を限定することを意図するものではない）。

【0148】

特段の指示がない限り、本発明で使用される分子生物学実験方法及びイムノアッセイは、基本的にJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及びFM Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照した。制限酵素の使用は、製品の製造業者により推奨される条件に従った。実施例に具体的な条件が示されていない場合には、慣用の条件又は製造業者により推奨される条件に従うべきである。製造業者が示されていない使用される試薬又は機器は全て、市販される慣用の製品であった。当業者は、実施例が本発明を例として説明し、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図しないことを認識している。本明細書で挙げられる全ての刊行物及び他の参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

【実施例】

【0149】

実施例１：ＣＶＢ１及びその改変形の取得及び準備
１．１患者の臨床検体からのエンテロウイルスＣＶＢ１の分離
（１）患者の咽頭スワブ及び肛門スワブは、中国廈門市の疾病管理予防センター（Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City, China）に由来し、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ細胞；ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－８１（商標））は、中国国立感染病診断ワクチン開発研究所（National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases）（廈門大学、中国）によって保管され、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＭＥＭ培地中で培養された。

【0150】

（２）試料処理：患者の咽頭スワブ及び肛門スワブを、検体保存溶液中で十分に撹拌して、スワブに付着したウイルス及びウイルス含有細胞を洗い流した後に、検体保存溶液を４０００ｒｐｍ及び４℃で３０分間にわたり高速遠心分離にかけた。

【0151】

（３）接種及び観察：
Ａ．Ｖｅｒｏ細胞を、２４ウェルプレートに１×１０^５細胞／ウェルで播種した。成長培地（１０％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するＭＥＭ培地）を吸引し、１ｍＬの維持培地（２％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するＭＥＭ培地）を各ウェル中に加えた。次いで、ネガティブコントロールウェルを除き、各ウェルに５０μＬの試料上清を接種し、各ウェルをインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0152】

Ｂ．細胞を顕微鏡下で１週間にわたり毎日観察し、接種されたウェルにおける特異的な細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生を記録した。

【0153】

Ｃ．接種されたウェル中の細胞にエンテロウイルス特異的な細胞変性効果が７日以内に現れたら、細胞及び上清を回収して－８０℃で凍結させた。ＣＰＥが７日後に現れなかったら、それらの細胞を盲継代した。

【0154】

Ｄ．ＣＰＥが６回の盲継代の間に現れたら、細胞及び上清を回収して－８０℃で凍結させた。６回の盲継代後にＣＰＥが現れなかったら、それらの細胞は陰性と決定した。

【0155】

（４）ウイルスの分離及びクローニング：
ＲＴ－ＰＣＲ（Hou et al., Virus Res 2015, 205: 41-44）及び特定の抗体に基づく酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）（Yang et al. Clin Vaccine Immunol 2014, 21(3): 312-320）によって、臨床検体から分離されたウイルスを特定し、コクサッキーウイルスＢ群１型陽性培養物を選択して、少なくとも３回のクローニング実験を行った。各実験で限界希釈法によって得られたウイルスクローンもまた、ＲＴ－ＰＣＲ及びＥＬＩＳＰＯＴによって特定し、コクサッキーウイルスＢ群１型陽性クローンを選択して後続回のクローニングに供した。成長生存力の強い単一のコクサッキーウイルスＢ群１型株を、腫瘍溶解性ウイルスの候補株として選択した。

【0156】

１．２感染性クローニング及び逆遺伝学技術に基づくＣＶＢ１及びその改変形のレスキュー株の取得
この実施例は、逆遺伝学技術により本発明で使用されるＣＶＢ１及びその改変形をどのようにして取得するかを示すために、一例として野生型ＣＶＢ１（配列番号１）を使用した。具体的な方法は以下の通りとした。

【0157】

（１）ウイルス感染性クローンの構築：野生型ＣＶＢ１（ＣＶＢ１－ＷＴと呼称される）のｃＤＮＡ配列は配列番号１に示されており、そのゲノムＲＮＡ配列は配列番号１２に示されており、又は遺伝子挿入若しくは置換は、野生型ＣＶＢ１のｃＤＮＡ（配列番号１）を基礎とした。以下の改変形が含まれる。

【0158】

改変形１：野生型ＣＶＢ１の内部リボソーム進入部位配列をヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を有する）に置き換えることで、配列番号１３として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＣＶＢ１－ＨＲＶ２と呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号８）を得た。

【0159】

改変形２：ｍｉＲ－１３３標的配列（配列番号１７に示されるＤＮＡ配列を有する）及びｍｉＲ－２０６標的配列（配列番号１８に示されるＤＮＡ配列を有する）のタンデム配列（配列番号１９に示されるＤＮＡ配列を有する）を野生型ＣＶＢ１のｃＤＮＡ（配列番号１）の３’非翻訳領域の７３０３ｂｐから７３０４ｂｐの間に挿入することで、配列番号１４として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔと呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号９）を得た。

【0160】

改変形３：ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子（配列番号６）を野生型ＣＶＢ１のｃＤＮＡ（配列番号１）のＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入することで、配列番号１５として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦと呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号１０）を得た。

【0161】

改変形４：ヒトプログラム死受容体１に対する一本鎖抗体（Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ｓｃＦｖ）をコードする配列（配列番号７）を野生型ＣＶＢ１のＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入することで、配列番号１６として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１と呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号１１）を得た。

【0162】

上記５つの腫瘍溶解性ウイルスのｃＤＮＡ配列（配列番号１、配列番号８～配列番号１１）を、全遺伝子合成のために遺伝子合成会社（Shanghai Shenggong Bioengineering Co., Ltd.社）に送り、ｐＳＶＡプラスミド（Hou et al. Human, Virus Res 2015, 205: 41-44）へとライゲーションすることで、ＣＶＢ１又はその改変形（すなわち、ＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１）の感染性クローニングプラスミドを得た。

【0163】

（２）プラスミドミニキット及び大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞は、Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.社から購入し、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２（商標））及びヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞；ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－１３６（商標））は、中国国立感染病診断ワクチン開発研究所（廈門大学、中国）によって維持され、１０％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとが添加されたＤＭＥＭ培地及びＭＥＭ培地をそれぞれ用いて培養され、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００及びＯｐｔｉ－ＭＥＭは、Thermo Fisher Scientific社から購入した。

【0164】

（３）上記５つの腫瘍溶解性ウイルスのｃＤＮＡ配列を含む感染性クローニングプラスミドを、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞へと形質転換し、単クローン株をクローンの成長後に採取して振盪し、プラスミドミニキットを使用してそれらのプラスミドを抽出した後に、シーケンシング分析のために会社（Shanghai Biotech Engineering Co., Ltd.社）に送った。

【0165】

（４）正しい配列を有する感染性クローニングプラスミドとヘルパープラスミドｐＡＲ３１２６とを細胞へと同時トランスフェクションさせることで、ウイルスをレスキューした（Hou et al. Virus Res 2015, 205: 41-44）。Ｈｅｌａ細胞をまずはトランスフェクション試薬の使用説明書に従ってトランスフェクションさせた後に、顕微鏡下で観察した。Ｈｅｌａ細胞においてＣＰＥが現れたら、細胞及び培養上清を採取し、ＲＤ細胞を接種した後に継代培養した。それにより得られたレスキュー株を腫瘍溶解性ウイルスの候補株として使用することができる。

【0166】

実施例２：ＣＶＢ１及びその改変形のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験
２．１使用されるウイルス及び細胞系統
（１）ウイルス：この実施例では、実施例１に示されるＣＶＢ１－ＷＴ（配列番号１２）、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２（配列番号１３）、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ（配列番号１４）、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号１５）及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１（配列番号１６）並びに野生型コクサッキーウイルスＢ群３型株（以下で、ＣＶＢ３－ＷＴと呼称される；ＧｅｎＢａｎｋデータベースのアクセッション番号：ＫＹ２８６５２９．１）を使用した。

【0167】

（２）細胞系統：ヒト横紋筋肉腫細胞ＲＤ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－１３６（商標））、ヒト結腸直腸癌細胞系統ＳＷ１１１６（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２３３（商標））、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２２８（商標））及びＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－３８（商標））、ヒト胃癌細胞系統ＡＧＳ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１７３９（商標））、ＳＧＣ７９０１（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１５０）、ＢＧＣ８２３（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１５１）及びＮＣＩ－Ｎ８７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－５８２２（商標））、ヒト食道癌細胞系統ＴＥ－１（中国科学院上海生物科学研究所細胞資源センター（Cell Resource Center, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences）から購入、番号３１３１Ｃ０００１０００７０００８９）、ヒト小細胞肺癌細胞系統ＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－２０６６（商標））、ヒト非小細胞肺癌細胞系統ＳＰＣ－Ａ－１（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ０５０）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－５９０８（商標））、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－５８０３（商標））、Ａ５４９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－１８５（商標））、ＮＣＩ－Ｈ６６１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－１８３（商標））、ＥＢＣ－１（Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号：１１８７５１０１）及びＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－５８８９（商標））、ヒト肝臓癌細胞系統Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１０７４１（商標））、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＢ－８０６５（商標））、ＳＭＭＣ７７２１（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センター（Basic Medical Cell Center, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences）から購入、番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００８７）、ＢＥＬ７４０２（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ０３５）、ＢＥＬ７４０４（中国科学院上海生物科学研究所細胞資源センターから購入、番号：３１３１Ｃ０００１０００７０００６４）、Ｈｕｈ７（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１３４）及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－８０２４（商標））、ヒト卵巣癌細胞系統ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－７７（商標））及びＣａｏｖ３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－７５（商標））、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｈｅｃ－１－Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－１１２（商標））、Ｈｅｃ－１－Ｂ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－１１３（商標））及びＩｓｈｉｋａｗａ（ＥＣＡＣＣ番号９９０４０２０１）、ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２（商標））、Ｃａｓｋｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１５５０（商標））及びＣ－３３Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－３１（商標））、ヒト黒色腫細胞系統ＳＫ－ＭＥＬ－１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－６７（商標））及びＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－６５（商標））、ヒト乳癌細胞系統ＢｃａＰ３７（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ２０６）、ＢＴ－４７４（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－２０（商標））及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－２６（商標））、ヒト腎臓癌細胞系統Ａ－４９８（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－４４（商標））及び７８６－Ｏ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１９３２（商標））、ヒト膵臓癌細胞系統Ｃａｐａｎ－２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－８０（商標））、ＡｓＰＣ－１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１６８２（商標））、ＳＷ１９９０（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－２１７２（商標））、ＨＰＡＦ－２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１９９７（商標））及びＣＦＰＡＣ－１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１９１８（商標））、ヒト骨肉腫細胞系統Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－９６（商標））、ヒト前立腺癌細胞系統ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－８１（商標））及びＬＮＣａｐ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１７４０（商標））、ヒト神経膠腫細胞系統ＧＢＭ（患者の腫瘍組織から分離された原発腫瘍細胞系統）、ヒト神経芽腫細胞系統ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－２２６６（商標））；ヒト舌扁平上皮癌細胞系統ＣＡＬ２７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－２０９５（商標））及びＳＣＣ－２５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１６２８（商標））、ヒト鼻咽頭癌細胞系統ＣＮＥ（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センターから購入、番号：３１３１Ｃ０００１０００７０００１３）、ヒト鼻中隔扁平上皮癌細胞系統ＲＰＭＩ２６５０（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－３０（商標））、ヒト喉頭癌細胞系統ＨＥｐ－２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２３（商標））、ヒト甲状腺癌細胞系統ＳＷ５７９（中国国立感染病診断試薬ワクチン開発研究センター（National Engineering Research Center for Diagnostic Reagents and Vaccines for Infectious Disease）によって保管されている）及びヒト甲状腺管癌細胞系統ＴＴ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－１８０３（商標））、ヒト膀胱癌細胞系統Ｊ８２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－１（商標））及び５６３７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－９（商標））、ヒトバーキットリンパ腫細胞系統Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２１３（商標））及びＲａｊｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－８６（商標））；ヒト膵管上皮細胞系統ｈＴＥＲＴ－ＨＰＮＥ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－４０２３（商標））、ヒト皮膚ケラチノサイト細胞系統ＨａＣａｔ（ＣＣＴＣＣ、寄託番号：ＧＤＣ１０６）、ヒト胎児肺線維芽細胞系統ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－１７１（商標））、ヒト包皮線維芽細胞系統ＨＦＦ－１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＳＣＲＣ－１０４１（商標））、ヒト前立腺間質細胞系統ＷＰＭＹ－１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ－２８５４（商標））、ヒト臍帯静脈内皮細胞系統ＨＵＶＥＣ（Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号：Ｃ０１５１０Ｃ）及び分化したヒト肝前駆細胞系統ＨｅｐａＲＧ（初代肝細胞の特徴を有する；Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号：ＨＰＲＧＣ１０）を含むヒト正常細胞系統。上記細胞は全て中国国立感染病診断ワクチン開発研究所（廈門大学、中国）によって保管された。ＨｅｐａＲＧ細胞はＷＭＥ培地（１．５％ＤＭＳＯを添加）中で培養され、ＡＧＳ及びＴＴはＦ－１２Ｋ培地中で培養され、ＳＨ－ＳＹ５ＹはＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地中で培養され、ＣＦＰＡＣ－１はＩＭＤＭ培地中で培養され、ＲＤ、Ｃ－３３Ａ、ＥＢＣ－１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、Ｊ８２及びＤＵ１４５はＭＥＭ培地中で培養され、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、５６３７、７８６－Ｏ、ＴＥ－１、Ｃａｓｋｉ、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＮＣＩ－Ｈ１７０３、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＮＣＩ－Ｈ６６１、ＳＧＣ７９０１、ＢＧＣ８２３、ＳＷ１１１６、ＨＥｐ－２及びＬＮＣａｐはＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養され、その他の細胞はＤＭＥＭ培地中で培養された。これらの全ての培地には１０％ウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリン－ストレプトマイシンを補充した。上記の全ての細胞は３７℃及び５％ＣＯ_２の標準条件下で培養した。

【0168】

２．２ウイルスの培養
１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＭＥＭ培地、３７℃、５％のＣＯ_２、並びに飽和湿度の培養条件下で、ＲＤ細胞を１０ｃｍの細胞培養プレート上に均等に播種した。細胞コンフルエンスが９０％以上に達したら、細胞培養培地を無血清ＭＥＭ培地と交換し、各プレートに１０^７のＴＣＩＤ５０のＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ又はＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１を接種した。２４時間の連続培養後にＣＶＢ１又はその改変形はＲＤ細胞内で増殖し、細胞内でＣＰＥを生じた。９０％を超える細胞が収縮して丸くなり、粒状性の増加を示し、剥離して溶解されたら、細胞及びそれらの培養上清を採取した。３回のサイクルの凍結融解後に、培養上清を回収して、４０００ｒｐｍ、１０分及び４℃の遠心分離条件下で遠心分離をすることで、細胞片を除去した。最後に上清を０．２２μｍの使い捨てフィルター（Millipore社）で濾過して、全ての細胞片及び他の不純物を除去した。

【0169】

２．３ウイルス力価の決定
ＲＤ細胞を、９６ウェルプレートに１０^４細胞／ウェルの細胞密度でコーティングした。細胞が接着した後に、実施例２．２で得られたウイルス溶液を、１０倍から始めて無血清ＭＥＭ培地で１０倍の勾配希釈に供した。５０μｌの希釈されたウイルスを細胞が入ったウェルに加えた。７日後に、ＣＰＥが現れたウェルを観察して記録し、引き続きKarber法を使用して計算した。ここで、計算式は、ｌｇ^{ＴＣＩＤ５０}＝Ｌ－Ｄ（Ｓ－０．５）
（式中、Ｌ：最高希釈の対数、Ｄ：希釈の対数間の差、Ｓ：陽性のウェルの割合の合計）であった。それにより計算されたＴＣＩＤ５０の単位はＴＣＩＤ５０／５０μｌであり、これはＴＣＩＤ５０／ｍｌへと変換されるべきである。

【0170】

２．４ウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験
ヒト腫瘍細胞及び正常細胞を９６ウェルプレートへと１０^４細胞／ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を対応する無血清の細胞培養培地と交換し、ウイルスを、それぞれ１０、１、０．１及び０．０１のＭＯＩで接種した。その後、細胞のＣＰＥを顕微鏡により毎日観察した。

【0171】

図１Ａ～図１Ｄは、ウイルスに感染させていない（ネガティブコントロール群、Ｍｏｃｋ）又はＭＯＩ＝１でＣＶＢ１－ＷＴにより７２時間処理されたヒト膵管上皮細胞系統ｈＴＥＲＴ－ＨＰＮＥ、ヒト鼻咽頭癌細胞系統ＣＮＥ、ヒト肝臓癌細胞系統ＨｅｐＧ２、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｉｓｈｉｋａｗａ、ヒト乳癌細胞系統ＢＴ－４７４、ヒト非小細胞肺癌細胞系統ＥＢＣ－１、ヒト喉頭癌細胞系統ＨＥｐ－２、ヒト舌癌細胞系統ＳＣＣ－２５、ヒト結腸直腸癌細胞系統ＨＴ－２９、ヒト卵巣癌細胞系統Ａ２７８０、ヒト膵臓癌細胞系統ＡｓＰＣ－１及びヒト前立腺癌細胞系統ＤＵ１４５の顕微鏡写真を示した。これらの結果により、感染多重度（ＭＯＩ）１での感染の７２時間後に、ウイルス感染群において腫瘍細胞数の大幅な減少、顕著な収縮及び溶解等が検出されるが、Ｍｏｃｋ群の非腫瘍細胞と比較すると、ウイルスに感染した非腫瘍細胞は細胞形態にほとんど変化を示さないことが示された。上記結果により、ＣＶＢ１がヒト鼻咽頭癌細胞系統ＣＮＥ、ヒト肝臓癌細胞系統ＨｅｐＧ２、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｉｓｈｉｋａｗａ、ヒト乳癌細胞系統ＢＴ－４７４、ヒト非小細胞肺癌細胞系統ＥＢＣ－１、ヒト喉頭癌細胞系統ＨＥｐ－２、ヒト舌癌細胞系統ＳＣＣ－２５、ヒト結腸直腸癌細胞系統ＨＴ－２９、ヒト卵巣癌細胞系統Ａ２７８０、ヒト膵臓癌細胞系統ＡｓＰＣ－１及びヒト前立腺癌細胞系統ＤＵ１４５に対して顕著な腫瘍溶解効果を示すが、ヒト膵管上皮細胞系統ｈＴＥＲＴ－ＨＰＮＥ等の非腫瘍細胞に対しては効果を有しないことが示された。

【0172】

ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８キット；Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.社）を使用して、７２時間のウイルス感染及び培養後の細胞生存率を検出した。具体的な方法は以下の通りであった。

【0173】

接着細胞については、９６ウェル細胞培養プレート中の元の培地を直接廃棄し、懸濁細胞については、９６ウェル細胞培養プレート中の元の培地は遠心分離後に慎重に廃棄し、その後に、ウェル毎に１００μｌの新鮮な無血清培地を加えた。１０μｌのＣＣＫ－８溶液を、細胞が接種された各ウェルに添加し、また等量のＣＣＫ－８溶液をネガティブコントロールとしてブランク培養培地に添加し、引き続き細胞培養インキュベーター中、３７℃で０．５時間～３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を４５０ｎｍで、それぞれ０．５時間、１時間、２時間、３時間で検出し、吸光度が適切な範囲内であった時点を細胞生存率のための参照として選択した。各種類の細胞に対するＣＶＢ１－ＷＴのＣＣＫ－８試験結果を表２に示した。ここで、「－」は、ウイルス処理後の細胞生存率がＭＯＣＫ群の細胞生存率と有意に異ならないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が依然として５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した。

【0174】

細胞生存率の計算は、
細胞生存率（％）＝（試験群の読取値－ネガティブ群の読取値）／（ポジティブ群の読取値－ネガティブ群の読取値）×１００％
である。

【0175】

【表2-1】

【0176】

【表2-2】

【0177】

【0178】

表２から、ＣＶＢ１－ＷＴが見つけ出された腫瘍細胞のほとんどに対して死滅効果を有したことが分かる。特に、該ウイルスは結腸直腸癌細胞系統、胃癌細胞系統、肺癌細胞系統、肝臓癌細胞系統、子宮頸癌細胞系統、子宮内膜癌細胞系統、膵臓癌細胞系統、前立腺癌細胞系統、鼻咽頭癌細胞系統、舌癌細胞系統、喉頭癌細胞系統、神経膠腫細胞系統及び神経芽細胞腫細胞系統に対して顕著な死滅効果を有した。一方で、該ウイルスは、ヒト胎児肺線維芽細胞系統ＭＲＣ－５、ヒト包皮線維芽細胞系統ＨＦＦ－１、ヒト皮膚ケラチノサイト細胞系統ＨａＣａｔ、ヒト前立腺間質細胞系統ＷＰＭＹ－１及びヒト臍帯静脈内皮細胞系統ＨＵＶＥＣを含む試験された非腫瘍細胞系統に対してほぼ無毒であったが、但し、ＭＯＩ＝１０ではヒトの正常な膵管上皮細胞系統ｈＴＥＲＴ－ＨＰＮＥ及び分化したヒト肝前駆細胞系統ＨｅｐａＲＧに対して或る一定の毒性を有した。

【0179】

特に、特定の腫瘍に対して或る一定の死滅活性を有することが報告された野生型コクサッキーウイルスＢ群３型株（ＣＶＢ３－ＷＴ；ＧｅｎＢａｎｋデータベースのアクセッション番号：ＫＹ２８６５２９．１）及びＣＶＢ１－ＷＴはコクサッキーウイルスに属するが、２つの株間のゲノム全体のヌクレオチドの相同性はわずか７２．８％であり、コーディング領域のヌクレオチドの相同性はわずか７１％であり、つまり、これらの株は２つの完全に異なるウイルスであることに注目すべきである。特に、本発明者らは、異なるタイプの腫瘍細胞に対してＣＶＢ１－ＷＴ及びＣＶＢ３－ＷＴの死滅効力を比較することによって、ＣＶＢ１が、ＣＶＢ３と比較して顕著に優れた腫瘍死滅効果を有し、見つけ出された腫瘍細胞のほとんどに対して少なくとも数十倍、又は更には数百倍の死滅活性を有することを見出した（表３）。このことから、本発明のＣＶＢ１は、比較的低用量でより強力な抗腫瘍活性を生ずることができ、それにより治療効力を保証しつつも投与の安全性を大きく改善することができるため、抗腫瘍治療に特に適していることが分かる。

【0180】

【表3】

【0181】

備考：「－」は、ウイルス処理群とＭＯＣＫ群との間の細胞生存率に有意差がないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した；ＥＣ５０（有効用量の半分）は、本明細書では、細胞生存率が５０％に低下するウイルスのＭＯＩを指し、効力の倍数は、本明細書では、特定の細胞に対するＣＶＢ１及びＣＶＢ３の腫瘍溶解効力の倍数、つまりＥＣ５０比を指す。

【0182】

さらに、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験の結果は、ＣＶＢ１の上述の改変形の全てが、見つけ出された腫瘍細胞に対する野生型ＣＶＢ１の親株の死滅効果を維持し、結腸直腸癌細胞系統、胃癌細胞系統、肺癌細胞系統、肝臓癌細胞系統、子宮頸眼細胞系統、子宮内膜癌細胞系統、膵臓癌細胞系統、前立腺癌細胞系統、鼻咽頭癌細胞系統、舌癌細胞系統、喉頭癌細胞系統、神経膠腫細胞系統及び神経芽細胞腫細胞系統に対する野生型ＣＶＢ１の親株の顕著な死滅効果を維持することを示した。ここで、ヒト結腸直腸癌細胞系統ＳＷ４８０、ヒト胃癌細胞系統ＡＧＳ、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｉｓｈｉｋａｗａ系統及びヒト神経膠腫細胞系統ＧＢＭに対する腫瘍溶解活性のＣＣＫ－８検出の結果を表４に示した。

【0183】

特に、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２は、ＣＶＢ１－ＷＴが弱い死滅活性を示した幾つかの腫瘍細胞に対して顕著な死滅活性を有し、顕著な有益な技術的効果をもたらすことに注目すべきである。ここで、ヒト甲状腺癌細胞系統ＳＷ５７９に対する腫瘍溶解活性のＣＣＫ－８検出の結果を表５に示した。

【0184】

【表4】

【0185】

【0186】

【表5】

【0187】

【0188】

２．５馴化のためのＣＶＢ１の連続継代
この実施例では、或る特定の腫瘍細胞における馴化のためにＣＶＢ１を連続継代することで、腫瘍細胞に対する死滅活性が高められた株を得た。

【0189】

野生型エンテロウイルスＣＶＢ１を、ＣＶＢ１の腫瘍溶解効果があまり大きくなかったヒト骨肉腫細胞系統Ｕ２ＯＳ、ヒト甲状腺癌細胞系統ＳＷ５７９及びヒト膀胱癌細胞系統Ｊ８２における馴化のために連続継代した。具体的な方法は以下の通りであった。

【0190】

上記腫瘍細胞の１種類を１０ｃｍの細胞培養プレート上に均等に播種した。培養条件は１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有する対応する細胞培養培地、３７℃、５％のＣＯ_２、飽和湿度であった。細胞コンフルエンスが９０％以上に達したら、細胞培養培地を無血清細胞培養培地と交換し、各プレートに１０^７のＴＣＩＤ５０のＣＶＢ１ウイルスを接種し、培養環境を３３℃、５％のＣＯ_２、飽和湿度に変更した。ＣＶＢ１が腫瘍細胞内で増殖し、細胞内にＣＰＥが引き起こされたら（最長３日間の感染後）、細胞及びそれらの培養上清を採取した。３回のサイクルの凍結融解後に、遠心分離を４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間行った。遠心上清を採取し、９０％より高いコンフルエンスの新しい腫瘍細胞上に加えることで、１回のウイルスの継代が完了した。継代をこのように１１回以上繰り返し、ＲＤ細胞におけるウイルス力価測定のために、各回の継代のウイルス溶液の一部を採取した。具体的な方法は実施例２．３を参照した。一般的に、ウイルス複製能力は世代が増すにつれ増加すると考えられる。比較的高い感染力価に達し、ウイルス複製が腫瘍細胞において安定した場合に、その腫瘍細胞に馴化されたＣＶＢ１株が得られた。

【0191】

引き続き、実施例２．４に記載されるｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験法により、ヒト腫瘍細胞Ｕ２ＯＳ、ＳＷ５７９又はＪ８２を９６ウェルプレートに１０^４細胞／ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を対応する無血清の細胞培養培地と交換し、その後に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、上記種類の細胞の各々について馴化された連続継代されたＣＶＢ１株（ウイルス力価はＲＤ細胞で検出された）を、それぞれ１０、１、０．１及び０．０１のＭＯＩで接種した。引き続き、細胞のＣＰＥを顕微鏡で毎日観察し、ウイルスの感染及び培養の７２時間後にＣＣＫ－８法を使用して細胞生存率を検出した。

【0192】

これらの結果を表６に示した。ＣＶＢ１が不十分な腫瘍溶解効果を有する種類の腫瘍細胞における野生型ＣＶＢ１の連続継代後に、腫瘍細胞に対するその死滅活性は大幅に高められ、こうして上述の連続継代法によって、腫瘍細胞に対する腫瘍溶解効果が高められたＣＶＢ１馴化株を得ることができることが指摘される。

【0193】

【表6】

【0194】

【0195】

２．６ＣＶＢ１のゲノムＲＮＡの腫瘍溶解効果の評価
この実施例では、ＣＶＢ１の精製されたゲノムＲＮＡを或る特定の種類の腫瘍細胞にトランスフェクションさせることにより、大量のＣＶＢ１の感染性の生ウイルスが産生されるため、該腫瘍細胞を死滅させることができる。

【0196】

ウイルスのゲノムＲＮＡを、まずはｉｎｖｉｔｒｏ転写によって得た。この方法は、例えばHadac E M, Kelly E J and Russell S J. Mol Ther, 2011, 19(6): 1041-1047に見出すことができる。具体的には、実施例１で得られた野生型ＣＶＢ１の感染性クローニングプラスミドを線状化し、線状化されたプラスミドを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（Thermo Fisher Scientific社、ＡＭ１３３３）を用いるｉｎｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用することで、大量のウイルスＲＮＡを産生させた。そして得られたウイルスＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣｌｅａｎ－ＵｐＫｉｔ（Thermo Fisher Scientific社、ＡＭ１９０８）を使用して後続使用のために精製した。１つの試料のＲＮＡ電気泳動図を図２に示した。

【0197】

引き続き、実施例２．４に記載されるｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験の方法に従って、ヒト子宮頸癌腫瘍細胞系統Ｈｅｌａを、２４ウェルプレートに１０^５細胞／ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を、対応する無血清の細胞培養培地と交換し、その後に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Thermo Fisher Scientific社、１１６６８０１９）を使用して、Ｈｅｌａ細胞に１ウェル当たり１μｇで精製されたウイルスＲＮＡをトランスフェクションさせ、ネガティブコントロール群には無関係のＲＮＡ核酸分子をトランスフェクションさせた。引き続き、細胞のＣＰＥを顕微鏡により毎日観察した。

【0198】

これらの結果は、トランスフェクションの約８時間後にＣＶＢ１のゲノムＲＮＡがトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞にＣＰＥが現れ始め、その後に、細胞変性が徐々に増加することを示した。４８時間後に、ＣＣＫ８法を使用して生存率を測定した。Ｈｅｌａ細胞は、ほとんど全てが死滅して溶解された。そして感染の０時間後及び４８時間後のＨｅｌａ細胞の顕微鏡写真を図３に示した。培養上清を新しいＨｅｌａ細胞へと接種すると、ＣＰＥが素早く生じた。これらの結果により、ＣＶＢ１の核酸による直接投与も優れた死滅活性を有し、腫瘍の治療に使用することができることが示された。

【0199】

実施例３：ＣＶＢ１及びその改変形のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍実験
３．１ウイルス、細胞系統及び実験動物
（１）ウイルス：この実施例では、実施例１に示されるＣＶＢ１－ＷＴ（配列番号１２）、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２（配列番号１３）、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ（配列番号１４）、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ（配列番号１５）及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１（配列番号１６）を使用した。ウイルス培養及びウイルス力価の決定方法については、それぞれ実施例２．２及び実施例２．３を参照のこと。

【0200】

（２）細胞系統：ヒト乳癌細胞系統ＢｃａＰ３７（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ２０６）、ヒト非小細胞肺癌細胞系統Ａ５４９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－１８５（商標））及びＳＰＣ－Ａ－１（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ０５０）、ヒトバーキットリンパ腫細胞系統Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－８６（商標））、ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｉｓｈｉｋａｗａ（ＥＣＡＣＣ番号９９０４０２０１）及びＨＥＣ－１－Ｂ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－１１３（商標））、ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ－２（商標））及びＣ－３３Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ－３１（商標））、並びにヒト神経膠腫細胞系統ＧＢＭ（患者の腫瘍組織から分離された原発腫瘍細胞系統）。ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いてＲａｊｉを培養すること及びＭＥＭ培地を用いてＣ－３３Ａを培養することを除いて、上記細胞はＤＭＥＭ培地を用いて培養され、上記培地には１０％ウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリン－ストレプトマイシンを補充した。上記の全ての細胞は３７℃及び５％ＣＯ_２の標準条件下で培養した。

【0201】

（３）実験動物：６週齢～８週齢の雌のＣ．Ｂ１７ＳＣＩＤマウスは、Shanghai Silaike Experimental Animal Co., Ltd.社から得られ、これらのマウスは廈門大学の実験動物センター及び倫理委員会により承認されたプロトコルに従ってＳＰＦ条件下で飼育された。

【0202】

３．２ウイルスのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍実験
ＳＣＩＤマウスにおける皮下腫瘍形成のために使用された腫瘍細胞を０．０１％のトリプシンで消化し、次いで１０％のウシ胎児血清を含む細胞培養培地を使用して再懸濁して、単一細胞懸濁液にした。その懸濁液の細胞密度を計数した。細胞を１０００ｇで３分間の遠心分離により沈殿させた後に、細胞を適切な容量のＰＢＳで再懸濁して、約１０^６細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）～１０^７細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）の濃度に到達させた。腫瘍細胞を注射器でＳＣＩＤマウスの背部に１０^６細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）／部位～１０^７細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）／部位で皮下接種した。腫瘍細胞が約１４日～２１日後にＳＣＩＤマウスの皮下で約１００ｍｍ^３の腫瘍量を形成したら、担癌のＳＣＩＤマウスを実験群（ＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ又はＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１を投与する）及びネガティブコントロール群に無作為に分けた。ここで各群には４匹の動物（ｎ＝４）が含まれる。１０^６のＴＣＩＤ５０／１００μｌ（無血清培地）／腫瘍量での腫瘍溶解性ウイルス（ＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ又はＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１）又は同等量の無血清培地を、合計５回の処理につき２日毎に腫瘍内注射した。腫瘍サイズをノギスで計測し、２日毎に記録した。腫瘍サイズの計算方法は以下の通りであった。
腫瘍サイズ（ｍｍ^３）＝腫瘍の長さの値×（腫瘍の幅の値）^２／２

【0203】

上記の６種の腫瘍に対するＣＶＢ１－ＷＴの処理結果を、それぞれ図４Ａ～図４Ｉに示した。これらの結果は、ＣＶＢ１－ＷＴのチャレンジ後に、ＢｃａＰ３７（Ａ）、Ａ５４９（Ｂ）、ＳＰＣ－Ａ－１（Ｃ）、Ｒａｊｉ（Ｄ）、Ｉｓｈｉｋａｗａ（Ｅ）、ＨＥＣ－１－Ｂ（Ｆ）、Ｈｅｌａ（Ｇ）、Ｃ－３３Ａ（Ｈ）及びＧＢＭ（Ｉ）の見つけ出さた腫瘍の成長が徐々に遅くなって停止し、更に腫瘍は溶解して消失するが、それに対して、ネガティブ群（ＣＴＲＬ）の腫瘍は正常な成長を維持し、その腫瘍サイズは実験群の腫瘍サイズよりも有意に大きいことを示した。

【0204】

図５は、ＧＢＭ腫瘍モデルを１０日間にわたりＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ又はＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１で処理した後に得られた結果を示した。これらの結果は、それぞれＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１で処理した後に、腫瘍溶解性ウイルスで処理されていないネガティブコントロール群と比較して腫瘍体積が有意に減少し、更にはほとんど消失し、５種の腫瘍溶解性ウイルスで処理した後の腫瘍体積の減少の程度は同様であったことを示した。上記の結果は、ＣＶＢ１－ＷＴ、ＣＶＢ１－ＨＲＶ２、ＣＶＢ１－ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＣＶＢ１－ＧＭ－ＣＳＦ及びＣＶＢ１－Ａｎｔｉ－ＰＤ－１の全てがｉｎｖｉｖｏで顕著で好ましい抗腫瘍活性を示すことを示した。

【0205】

本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者は、公開されているあらゆる教示に基づいて、その詳細に対して様々な修正及び変更を加えることができ、これらの変更が本発明の範囲内であることを理解するであろう。本発明の全体は、添付の特許請求の範囲及びそれらのあらゆる等価物によって与えられる。

【図1A】