(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-25
(45)【発行日】2023-09-04
(54)【発明の名称】組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/25 20060101AFI20230828BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20230828BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230828BHJP
A61K 33/08 20060101ALI20230828BHJP
A61K 33/42 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/685 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/7016 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/215 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/01 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/717 20060101ALI20230828BHJP
A61K 31/575 20060101ALI20230828BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230828BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20230828BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230828BHJP
C07K 14/04 20060101ALN20230828BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230828BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230828BHJP
【ＦＩ】
A61K39/25 ZNA
A61P31/22
A61K39/39
A61K33/08
A61K33/42
A61K31/685
A61K31/7016
A61K31/19
A61K31/215
A61K31/01
A61K31/717
A61K31/575
C12N15/13
C12N15/38
C12N15/62 Z
C07K14/04
C07K16/00
C07K19/00
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021537120
(86)(22)【出願日】2020-05-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(86)【国際出願番号】 CN2020090200
(87)【国際公開番号】W WO2021103434
(87)【国際公開日】2021-06-03
【審査請求日】2021-06-23
(31)【優先権主張番号】201911203663.2
(32)【優先日】2019-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521275666
【氏名又は名称】北京▲緑▼竹生物技▲術▼股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＬＵＺＨＵ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】３ Ｇｕａｎｇｔｏｎｇ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｔｏｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１１１３ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001494
【氏名又は名称】前田・鈴木国際特許弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】コン， ジェン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ペイ ホン
(72)【発明者】
【氏名】ペン， リン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， スァイ
(72)【発明者】
【氏名】ス， レイタオ
(72)【発明者】
【氏名】ツァン， クン
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３６０２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５０００３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／０８５４４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／０５９９５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】EMBO Mol Med, 2012, Vol.4, p.1015-1028
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
弱毒生ＶＺＶ株（ＯＫＡ株）遺伝子の組換え糖タンパク質ｇＥの細胞外領域と、ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片によって形成される融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１であって、前記融合タンパク質は４つのｇE分子と２つのＦｃが含まれる分子を形成する組換え水痘帯状疱疹ウイルスワクチン製剤。
【請求項2】
さらにワクチンアジュバントを含む請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項3】
前記ワクチンアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント、リン酸アルミニウムアジュバント、又は水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムアジュバントの混合物から選択される請求項２に記載のワクチン製剤。
【請求項4】
各投与ユニットには、５～２００μｇの融合タンパク質が含まれている請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項5】
各投与ユニットには、１０～１００μｇの融合タンパク質が含まれている請求項４に記載のワクチン製剤。
【請求項6】
各投与ユニットには、２０～６０μｇの融合タンパク質が含まれている請求項５に記載のワクチン製剤。
【請求項7】
ホスファチジルコリン、レシチン、３Ｄ－ＭＰＬ、長鎖脂肪酸（エステル）、鉱油、植物油、メチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びコレステロールを含むリポソームの組成物を含み、これらに限定されない免疫原性を高めることができる他の物質も含まれている請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項8】
凍結乾燥製剤である請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項9】
前記凍結乾燥製剤は、使用前に水酸化アルミニウムアジュバント懸濁液を添加して溶解させ、均一に混合した後、筋肉内又は皮下に注射する請求項８に記載のワクチン製剤。
【請求項10】
請求項１に記載の融合タンパク質を発現させることができ、ＤＮＡ配列が配列番号２である組換え遺伝子。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチン製剤に関し、特に生体の免疫系を誘導して、組換え水痘・帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ融合タンパク質に対する中和抗体を産生できるワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
水痘・帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ－ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のα－ヘルペスウイルス亜科の一種であり、直径１５０～２００ｎｍの２本鎖ＤＮＡウイルスであり、形態学的には、核酸コア、タンパク質コート、及びエンベロープで構成される同心円構造である。ＶＺＶゲノムは約１２５ｋｂの線状２本鎖ＤＮＡ分子であり、約１００ｋｂのユニークな長い断片（ＵＬ）と約５．４ｋｂのユニークな短い断片（ＵＳ）を含み、これらの断片は６．８ｋｂの末端と内部の反復配列で分離されていて、全部で７２のオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ、ＯＲＦ）があり、ウイルス複製、転写、パッケージング、放出などの生物活性に関連するタンパク質分子、及び宿主細胞と相互作用するタンパク質をコードする上、ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＬ及びｇＭの８つの糖タンパク質をコードし、これらの糖タンパク質は、ウイルスの成熟とパッケージングにおいて非常に重要な役割を果たしている。その中で、ｇＥ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｇＥ）はＯＲＦ６８遺伝子によってコードされ、当該遺伝子は１８７２個の塩基で構成され、ＶＺＶゲノムの短い断片領域に位置し、コードされたｇＥには、６２３個のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ＡＡ）が含まれている。そのＮ末端は５４４個ＡＡの親水性細胞外領域（シグナルペプチドを含む）であり、Ｃ末端は１７ＡＡの膜貫通疎水性領域と６２ＡＡの細胞内領域である。ｇＥは、Ｉ型膜タンパク質に属し、感染性ＶＺＶ粒子の産生に不可欠な糖タンパク質である上、ウイルスエンベロープ及び感染した細胞膜上で抗原性が最も高い、含有量が最も豊富な糖タンパク質である同時に、ＶＺＶ粒子の表面、宿主細胞の細胞膜及び細胞質にも広く存在し、細胞性免疫及び液性免疫を誘導することができる。
【0003】
ＶＺＶウイルスの糖タンパク質Ｅには、２つのエピトープクラスターであるｅ１とｃ１が含まれ、異なる地域からのＶＺＶ株の間で、これらの抗原決定クラスターは安定しており、非常に保守的であり、ワクチン抗原候補サブユニットに適している。ｇＥは、ＶＺＶウイルス粒子の表面、感染された細胞の表面及び細胞質内に存在し、ウイルスが成熟になるさまざまな段階に対応してさまざまな糖を含むポリペプチドの形で存在する。ｇＥ分子には輸送シグナルが含まれており、ウイルスタンパク質の組み立てとゴルジ体のエンベロープの形成に関与する。回復期の水痘や帯状疱疹患者の血清において、ＶＺＶ抗体は主に、ｇＢ、ｇＨ及びｇＥの３つの糖タンパク質、特にｇＥを主な標的としている。ｇＥは生体が特異性液性免疫及び細胞性免疫を産生するように誘導し、ウイルスの攻撃から生体を保護することができる。ｇＥにはリン酸化された高マンノースＯ－鎖及びＮ－鎖複合糖鎖が含まれており、ｇＩと協力してヒトＩｇＧのＦｃ断片に結合でき、ｇＥとｇＩは共有結合して、感染された細胞の表面でＦｃ受容体として機能している。
【0004】
ＶＺＶは、一次感染時に呼吸器粘膜上皮を介して局所リンパ節に侵入して複製し、ウイルスに感染されたリンパ球は、リンパ循環により、血液循環に入り、末梢血単核白血球を感染し、ウイルスは血流とともに皮膚に広がり、臨床症状は水痘である。水痘が治癒された後、ウイルスは頭蓋大脳神経節、脊髄の後根神経節、自律神経細胞、又は腸管神経節に潜伏する。生体の抵抗が減少すると、潜伏ウイルスは再活性化され、複製され、末梢神経に沿って皮膚に移動し、帯状疱疹として臨床的に現れる。
【0005】
ＶＺＶは伝染性が高く、水痘又は帯状疱疹の患者が唯一の感染源であり、ＶＺＶは主に空気飛沫と直接接触によって広がる。水痘の患者は、発疹が現れる２日前に唾液又は眼液を介してウイルスを排泄する。水痘又は帯状疱疹の患者の水疱液には、感染性ウイルス粒子が含まれて、呼吸中に発生する飛沫は、感受性の高い人に吸入された後に感染する可能性があり、皮膚病変の小胞液と直接接触することによっても感染する可能性があり、皮膚病変が多いほど、感染性が高くなる。感受性の高い人が感染した後、水痘が発生する可能性はあるが、帯状疱疹は直接引き起こされることはない。
【0006】
血清疫学的調査によると、出産可能年齢の女性の９５％～９７％が、血清抗ＶＺＶ抗体が陽性であるため、乳児が生後６か月以内に水痘ウイルス感染症にかかる可能性は非常に低い。血清抗体が陰性の成人、血清抗体が陰性の妊婦から生まれた新生児、免疫不全の人、妊娠４～５ヶ月目に水痘にかかった妊婦の胎児及び出産前後に水痘にかかった母親から生まれた新生児のすべてがＶＺＶの重度の一次感染を起こしやすい。高齢者、免疫不全の人、妊娠中に水痘かかった母親から生まれた子供及び出生後１年に水痘にかかった子供は、帯状疱疹を発症するリスクが高くなる。
【0007】
北米とヨーロッパ地域の若者では９５％以上が血清ＶＺＶ抗体陽性であるため、帯状疱疹にかかるリスクがある。統計が人口ベースに基づいている場合、帯状疱疹の発生率は３～５／千人・年であり、そのうちアジア太平洋地域が３～１０／千人・年、韓国が１０．４／千人・年、日本が１０．９／千人・年、中国大陸と台湾はそれぞれが３．４～５．８／千人・年と４．８９～５．６７／千人・年である。現在、アフリカ地域での帯状疱疹の発生率に関するデータはない。
【0008】
帯状疱疹の患者の約１３％～４７％は、主に神経系と眼に関係する合併症又は後遺症を持っている。神経系の合併症には、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）、Ｒａｍｓａｙ－Ｈｕｎｔ症候群、Ｂｅｌｌ顔面神経麻痺、髄膜炎、脊髄炎、及び一過性脳虚血又は脳卒中が含まれる。眼の合併症は主に眼の帯状疱疹である。
【0009】
ＰＨＮは帯状疱疹の最も一般的な後遺症であり、国際的に認められている定義では、発疹が現れてから９０日以上痛みが続くというものである。ＰＨＮの約３０％～５０％は１年以上持続し、少数は１０年も持続することもある。帯状疱疹患者の約５％～３０％がＰＨＮを患っており、複数の文献報告では１０％～２０％であり、中国大陸地区では８．６％～１３．８％である。ＰＨＮの発生率は、患者の年齢とともに増加し、５０歳以上の患者では約８％、８０歳以上の患者では３３％に達する。ＰＨＮの素因として比較的明確であるのは、高齢、重度の前駆症状、重度の発疹、重度の痛み、免疫力の低下がある。三叉神経の疲れ、ＳＬＥに伴う、糖尿病、又は神経精神障害のある人もＰＨＮの影響を受けやすくなっている。
【0010】
帯状疱疹眼症（ＨＺＯ）は、潜伏性的なＶＺＶが再活性化され、複製された後、三叉神経の眼神経への巻き添えに引き起こされる。人口をベースとしての統計に基づくと、ＨＺＯの発生率は３０．９人／１０万人であり、６５歳以上の人口では１０４．６人／１０万人である。帯状疱疹患者をベースとしての統計に基づくと、ＨＺＯの発生率は１０％～２０％であり、年齢とともに増加する。ＨＺＯの臨床症状は、順次眼瞼炎、角膜炎、結膜炎、強膜炎、ブドウ膜炎、又は急性進行性網膜壊死である。米国のＨＺＯ患者の約２．５％が眼の損傷を持っており、それらの６％が失明を引き起こしている。ＨＺＯ患者の約半数が皮膚の損傷を持っており、約２１％が最終的にＰＨＮに発展している。
【0011】
高齢の患者や免疫不全の患者には、帯状疱疹に再発が見られ、皮膚病変の広がりや、細菌感染症の伴いや疣贅状の増殖があり、ウイルス耐性を引き起こす可能性もある。重症の場合、肺、胃腸管、脳、その他の臓器にも波及して、帯状疱疹の発疹が現れる前に肝炎、膵炎、肺炎、心筋炎、食道炎、又は消化性潰瘍が発生するため、誤診され易い。
【0012】
ＶＺＶの弱毒株（ＯＫＡ株）を接種した人、又はＶＺＶに自然感染した人は防御免疫を得ることができる。ＯＫＡ株生弱毒化ワクチンは、米国ＦＤＡ、中国国家医療製品管理局、欧州連合、及びその他の機関によって、野生型水痘ウイルスによる子供への感染を防ぐための子供へのワクチン接種が承認され、高用量のＯＫＡ株生弱毒化ワクチンを、肋間神経痛などの帯状疱疹ウイルスによって引き起こされる疾病を予防又は軽減するために、５０歳以上の高齢者に使用するのは、米国ＦＤＡ及び欧州連合によって承認されている。現在、欧州連合と米国を含む６０以上の国と地域が、免疫機能が正常な５０歳以上の人口に、帯状疱疹とＰＨＮを予防するために、Ｚｏｓｔａｖａｘを接種することを推奨している。ワクチン接種方法は、上腕の三角筋領域にワクチンの単回投与（０．６５ｍＬ、１９，４００ＰＦＵのウイルスを含む）を皮下注射することである。頭痛や注射の局所反応などの副作用がまれに発生することがある。大規模な多施設臨床試験によると、帯状疱疹の発生率は、ワクチン接種後に免疫機能が正常な５０～５９歳の人口では６９．８％減少したが、６０歳以上の人口では、帯状疱疹の発生率、ＰＨＮ発生率、及び疾病負荷はそれぞれ５１．３％、６６．５％及び６１．１％減少した。Ｚｏｓｔａｖａｘの予防効果は、ワクチン接種者の年齢とともに徐々に低下し、重度の免疫抑制と妊婦は、また、ワクチン接種の禁忌である。したがって、より安全性、効果的なワクチンを調製する必要性は、特に緊急である。ＧＳＫによって開発されたＶＺＶｇＥ組換えタンパク質とＡＳ０１Ｂアジュバントによって調製された帯状疱疹サブユニットワクチンは、免疫機能が正常な５０歳以上の人へのワクチン接種は、帯状疱疹とＰＨＮの発生率をそれぞれ９７．２％と９１．２％減少させ、７０歳以上の人へのワクチン接種は、それぞれ８９．８％と８８．８％の発生率を減少させ、効果が弱毒生ワクチンＺｏｓｔａｖａｘよりも優れていて、より良い応用の見通しが可能である。組換えＶＺＶウイルスｇＥワクチンは、ＱＳ２１、３Ｄ－ＭＰＬ、及びホスファチジルコリンなどの油性アジュバントが含まれるＡＳ０１Ｂ希釈剤を使用し、その効果はＶＺＶ生弱毒化ワクチンＺｏｓｔａｖａｘよりも大幅に優れているが、注射部位に一時的な結節や、結節の解消には長い時間がかかるという最大の欠点を有する。
【0013】
特許文献１は、水痘・帯状疱疹ウイルスの短縮型糖タンパク質Ｅの組換え発現方法とその応用を開示した。当該方法によると、膜貫通領域と細胞内領域が削除され、Ｈｉｓタグが追加された水痘・帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の短縮型糖タンパク質Ｅ（ｇｐＥ）の遺伝子を宿主細胞に導入し、発現により組換え水痘・帯状疱疹ウイルスの短縮型糖タンパク質Ｅが得られる。当該発現方法は、標的タンパク質の発現レベルを上げるのに役たち、下流の精製作業を簡素化し、タンパク質の大量生産を容易に実現する方法である。そして、捕捉抗原として当該組換えタンパク質を使用すると、血漿サンプルにおける抗水痘帯状疱疹ウイルスの特定免疫グロブリンの間接ＥＬＩＳＡ検出に使用でき、ＶＺＶ感染症の臨床診断の精度を向上でき、また、ＶＺＶ特異的免疫グロブリンのハイスループット検出を必要とする他の分野で使用できる。この方法は原核生物発現の非グリコシル化タンパク質のであるため、主にＶＺＶの以前の感染の検出に使用され、血清中和ＶＺＶ抗体を生成するために複雑なグリコシル化を必要とする免疫組成物又はヒトワクチンの調製には適していない。李福民らは、ＰＣＲ方法を使用してＶＺＶ糖タンパク質Ｅ遺伝子を増幅する方法を開示し、それを真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、二重酵素消化及び配列決定法で識別した。結果増幅された標的遺伝子には、約１．９ＫＢの長さの完全長糖タンパク質Ｅ遺伝子が含まれ；そして糖タンパク質Ｅ遺伝子の組換え発現ベクターの構築に成功した（非特許文献１）。伊興旭らは、ＶＺＶｇＥ細胞外ドメイン遺伝子を含む真核生物発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ｇＥの構築を開示し、シーケンシング後、ＣＯＳ－７細胞をリポソームトランスフェクションし、ＶＺＶｇＥを安定的に発現する細胞株をＧ４１８でスクリーニングした。ＶＺＶｇＥのｍＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲ法で検出され、イムノブロッティング及び間接免疫蛍光法により、ｇＥの免疫反応性を検出し、発現した産物をＮｉ＋＋－ＮＴＡカラムで精製し、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、１２７人の０～１０歳の正常な子供の血清におけるＶＺＶ－ＩｇＧ抗体のレベルを検出した。結果ＶＺＶｇＥ細胞外ドメイン遺伝子を安定して発現するＣＯＳ－７細胞株のスクリーニングに成功し、ｇＥのｍＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲによって検出され、発現したｇＥは免疫反応性を有し、発現されたｇＥが免疫反応性を有すること、ＣＯＳ－７細胞株とその培養上清液はすべてがｇＥタンパク質の発現があり、発現レベルは約０．６３２ｇ／ｍＬ、純度は約９０％であることがイムノプリンティング及び間接免疫蛍光により同定された。ＥＬＩＳＡ試験では、１２７個の０～１０歳の子供血清におけるＶＺＶ－ＩｇＧ抗体が検出され、総陽性率は８１．８９％であり、特異度と感度はそれぞれ９３．７５％と８８．２４％だった（非特許文献２）。ＶＺＶ糖タンパク質Ｅに関するこれらの研究は、主にタンパク質の真核細胞発現の実現に焦点を当てており、発現産物の純度は非常に低く、実際の検出ニーズを満たすことしかできず、ヒトワクチンの品質要件を満たすにはほど遠いし、発現産物の精製に関する後続研究が見られず、ヒト用ワクチンに関する報告もない。
【0014】
李春明らは、ヒト二倍体細胞（２ＢＳ株）にＯｋａ株ＶＺＶ（ＶＺＶ－Ｏｋａ）を感染させ、ゲノムＤＮＡを抽出し、テンプレートとして使用し、ｇＥ５３７標的断片をＰＣＲ増幅し、ベクターｐＣＩ－ｎｅｏにクローニングし、組換え真核生物発現プラスミドｐＣＩ－ｎｅｏ－ｇＥ５３７－Ｈｉｓを構築した。大量の増幅後、プラスミドを抽出し、２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、一過性に発現させ、ニッケルカラムで精製して、標的タンパク質ｇＥ５３７－Ｈｉｓを得る方法を開示した。精製された産物は、約９０ＫＤａの相対分子量でマウス抗ｇＥ糖タンパク質モノクローナル抗体のバンドに特異的に結合することができ、ｍＡｂ－１０及びｍＡｂ－１２抗ｇＥモノクローナル抗体と反応することがでる（非特許文献３）。伊興旭は、ＶＺＶｇＥ遺伝子の細胞外ドメインのクローニングと発現の方法を開示し、具体的には、臨床的に収集された帯状疱疹患者の皮膚小水疱液をウイルス分離のために単層のヒト胚性線維芽細胞に接種し、ウイルス分離を実行する；分離されたウイルス株に対して特徴的な細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）、間接蛍光抗体法及びＤＮＡシーケンシングの同定をする。確認されたＶＺＶの臨床分離株をインビトロで培養し、ＶＺＶｇＥ遺伝子の細胞外ドメイン断片をＰＣＲで増幅して、原核生物発現プラスミドｇＥ－ｐＥＴ－３２ａ（＋）と真核生物発現プラスミドｇＥ－ｐＣＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（－）をそれぞれ構築し、シーケンシング後、原核生物プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）で誘導して、ＶＺＶｇＥ原核生物発現融合タンパク質を得た。組換えタンパク質の特異性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びウエスタンブロッティングによって同定され、Ｎｉ＋＋－ＮＴＡカラムを使用して発現されたタンパク質は、精製され、カラム上でリフォールディングされた。真核生物プラスミドをリポソームで媒介してＣＯＳ－７細胞にトランスフェクトし、ＶＺＶｇＥタンパク質を安定的に発現する細胞株をＧ４１８でスクリーニングし、発現産物をＮｉ＋＋－ＮＴＡカラムで精製した；ＶＺＶｇＥ遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲで検出し、ウエスタンブロットと間接免疫蛍光でｇＥ融合タンパク質の免疫反応性を検出した。ニュージーランドのウサギを、精製された原核生物の発現ｇＥタンパク質と真核生物の発現ｇＥタンパク質でそれぞれ免疫して、ウサギ抗ＶＺＶｇＥポリクローナル抗体を得た（非特許文献４）。上記の結果では、動物細胞におけるＶＺＶｇＥの発現を達成したが、得られた発現産物の純度は低いことを示している。
【0015】
Ｆｃ受容体は多くの自然免疫細胞の表面に発現しているため、ＤＣターゲティングの研究にも広く使用されており、受容体が結合するさまざまな抗体サブタイプに応じて、Ｆｃ受容体はＦｃαＲ（ＩｇＡ）、Ｆｃα／γＲ（ＩｇＡ及びＩｇＭ）、ＦｃεＲ（ＩｇＥ）及びＦｃγＲ（ＩｇＧ）に分類される。また、Ｆｃ受容体は親和性に応じて高親和性受容体と低親和性受容体に分けられ、高親和性受容体はモノクローナル抗体に結合し、低親和性受容体はポリクローナル抗体に結合する。ＤＣを標的とする研究では、ＦｃγＲを標的とする応用が最も初期であり、公開されている多くの研究は、ＦｃγＲ標的がｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗原提示の効率を大幅に向上でき、抗原とＭＨＣＩＩへの結合を促進でき、ＦｃγＲを標的とする抗原は最終的にＣＤ４＋Ｔ細胞に提示され、ＴＨ１シグナル伝達経路を活性化した（非特許文献５）。
【0016】
ＶＺＶｇＥ（又は他の病原性微生物に由来する抗原）とＤＣ受容体モノクローナル抗体Ｆｃ断片を融合して発現し、このように構築された融合タンパク質はＤＣｓによって内在化され、エンドサイトーシス経路では、Ｆｃ組換えタンパク質又はＦｃ結合タンパク質が細胞内プロテアーゼによって分解され、形成された抗原ペプチドはＭＨＣ－１及び／又はＭＨＣ－ＩＩ分子にロードできる。このようなＦｃの媒介した方法の優れた利点は、抗原が抗原提示細胞に直接送達できるため、抗原提示の効率が向上し、また、この方法では、ＤＣの表面にある特定の受容体を標的とすることにより、特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することもできる（非特許文献６）。
【0017】
本発明は、ＶＺＶウイルスｇＥタンパク質のペプチド鎖をコードする膜外領域をヒト免疫グロブリンのＣＨ２－ＣＨ３領域をコードする遺伝子と連結し、標的遺伝子を真核細胞発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、ＶＺＶを含むｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質の発現に成功した。組換えタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーカラム及びモレキュラーシーブクロマトグラフィーにより精製され、そしてウイルス不活化によりウイルス汚染の可能性を排除して、高度に精製された融合タンパク質が得られた。当該融合タンパク質のＦｃ断片は、人体の免疫系の樹状細胞の表面にあるＦｃ受容体に結合でき、樹状細胞の抗原提示効率を高め、免疫後に高力価の血清中和抗体を産生することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0018】
【文献】中国特許１０２５１７３０２Ａ
【非特許文献】
【0019】
【文献】Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６年０２期
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１５年０３期
【文献】Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、２０１６年１１期
【文献】Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 修士及び博士論文
【文献】Ｄａｉ Ｘ， Ｊａｙａｐａｌ Ｍ， Ｔａｙ ＨＫ， Ｒｅｇｈｕｎａｔｈａｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ， ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＦｃγＲＩ ｖｅｒｓｕｓ ＦｃγＲＩＩａ． Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４：３１８－２７．
【文献】Ｃａｍｉｎｓｃｈｉ Ｉ， Ｓｈｏｒｔｍａｎ Ｋ． Ｂｏｏｓｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；３３：７１－７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本発明は、帯状疱疹及び／又は帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）の予防及び／又はその重症度を軽減するための方法に関し、当該方法には、弱毒生ＶＺＶ（ＯＫＡ株）、又は完全に不活化されたＶＺＶと組み合わせるＶＺＶ抗原又はその組換え免疫原性誘導体ｇＥタンパク質を含む免疫原性組成物を個体に供給することが含まれる。
【0021】
また、本発明は、帯状疱疹の再活性化及び／又は帯状疱疹後神経痛を予防又は改善するための方法に関し、当該方法には、アジュバントと組み合わせたｇＥ融合タンパク質又はその免疫原性誘導体又は免疫原性断片を含む免疫原性組成物又はワクチンを必要とする個体に配達することが含まれる。
【0022】
従来技術における上記の問題を考慮して、本発明の目的の１つは、哺乳類における高純度の水痘・帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅの発現による産物を得るために、水痘・帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ－Ｆｃ融合タンパク質の遺伝子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0023】
本発明の上記の目的を達成するために、本発明によって使用される技術的解決策は以下の通りである。
組換え水痘・帯状疱疹ウイルスワクチ製剤であって、弱毒生ＶＺＶ株（ＯＫＡ株）遺伝子の組換え糖タンパク質ｇＥの細胞外領域のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片によって形成される融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１である。
組換え水痘・帯状疱疹ウイルスワクチ製剤であって、弱毒生ＶＺＶ株（ＯＫＡ株）遺伝子の組換え糖タンパク質ｇＥの細胞外領域のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片によって形成される融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１である。
【0024】
本発明の前記ワクチン製剤は、さらにワクチンアジュバントを含み、前記ワクチンアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント、リン酸アルミニウムアジュバント、又は水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムアジュバントの混合物から選択される。
【0025】
本発明の前記ワクチン製剤は、各投与ユニットに５～２００μｇの融合タンパク質が含まれている。
【0026】
本発明の前記ワクチン製剤は、各投与ユニットには、１０～１００μｇの融合タンパク質が含まれている。
【0027】
本発明の前記ワクチン製剤は、各投与ユニットには、２０～６０μｇの融合タンパク質が含まれている。
【0028】
本発明の前記ワクチン製剤は、さらに、ホスファチジルコリン、レシチン、３Ｄ－ＭＰＬ、長鎖脂肪酸（エステル）、鉱油、植物油、メチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びコレステロールを含むリポソームの組成物を含み、これらに限定されない免疫原性を高めることができる他の物質も含まれている。
【0029】
本発明の前記ワクチン製剤は、凍結乾燥製剤である。前記凍結乾燥製剤は、使用前に水酸化アルミニウムアジュバント懸濁液を添加して溶解させ、均一に混合した後に筋肉内又は皮下に注射する。
【0030】
本発明はさらに、本発明の前記融合タンパク質を発現でき、そのＤＮＡ配列が配列番号２である組換え遺伝子を提供する。
【0031】
本発明の前記融合タンパク質（以下、ｇＥ－Ｆｃ又はＶＺＶｇＥと略す）発現ベクターは、ｇＥ－Ｆｃ融合遺伝子を真核生物の哺乳類細胞発現ベクターに挿入することによって形成される。
【0032】
本発明の前記融合タンパク質は、人体の免疫系を効率的に誘発して免疫応答を生じさせることができる外因性抗原又はその誘導体であり、前記免疫応答とは、生体の免疫系が応答して高力価の血清中和抗体を産生するように誘導することである。このような応答は、集団における帯状疱疹疾患の発生率を減らすことができ、又は帯状疱疹によって引き起こされる肋間神経痛などの痛みや症状を軽減できる。血清中和抗体レベル又はＶＺＶｇＥ（グリコシル化タンパク質）ＥＬＩＳＡ抗体レベル測定などの当技術分野の一般的な技術を使用して免疫応答の改善を評価し又は、既知の臨床基準を使用して臨床症状又は徴候レベルの改善を評価する。
【0033】
好ましい実施形態として、上記の発現産物は、アルミニウムアジュバント又は免疫原性を高める他の薬物と混合して調製でき、５０歳以上高齢者の帯状疱疹によって引き起こされる肋間神経痛などの感染症の予防に使用でき、同時に、乳児の水痘・帯状疱疹ウイルスによる感染症の予防にも使用できる。
【0034】
さまざまなウイルスの防御抗原と同様に、ＶＺＶの防御抗原も糖タンパク質、特に糖タンパク質ｇＥのようなＶＺＶの主要なグリコシル化タンパク質は、その多様なグリコシル化形態は、ＶＺＶの主要な中和抗原を形成し、既存の研究では、ｇＥタンパク質に対する血清抗体がＶＺＶを中和できることが確認されている。
【0035】
他の適切な抗原には、さらに例えばｇＢ、ｇＨ、ｇＣ、ｇＩ、ＩＥ６３（例えば、ＨｕａｎｇなどＪ．Ｖｉｒｏｌ．１９９２、６６：２６６４、ＳｈａｒｐなどＪ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１９９２、１６５：８５２、Ｄｅｂｒｕｓ、ＪＶｉｒｏｌ．１９９５Ｍａｙ；６９（５）：３２４０－５及びその中の参考文献を参照）、ＩＥ６２（ＡｒｖｉｎなどＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１１４６：２５７、Ｓａｂｅｌｌａ Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９３Ｄｅｃ；６７（１２）：７６７３－６及びその中の参考文献を参照）、ＯＲＦ４又はＯＲＦ１０（ＡｒｖｉｎなどＶｉｒａｌＩｍｍｕｎｏｌ．２００２ １５：５０７．）などの様々な糖タンパク質も含まれるが、ＶＺＶ膜上でのこれらの糖タンパク質の存在量は、ｇＥの存在量よりも低く、ＶＺＶ中和抗体を産生するための生体の主要な供給源を構成していない。
【0036】
本発明は、哺乳動物発現系におけるＶＺＶ糖タンパク質Ｅ遺伝子の高効率発現を実現し、アミノ酸配列を変更せずに、ＣＨＯ細胞の優先コドンである最適化コドンに従って、ＶＺＶ糖タンパク質Ｅの細胞外領域遺伝子を合成し、ｇＥ－Ｆｃ融合遺伝子を構築した後、これを使用して真核生物の発現ベクターを構築し、それをＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトし、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡアフィニティークロマトグラフィーＨＰＬＣを使用してそのタンパク質発現状況を検出し、ＥＬＩＳＡを使用してＶＺＶｇＥとヒト抗水痘ウイルス特異的免疫グロブリンの結合活性を検出して、ＣＨＯ細胞におけるＶＺＶ糖タンパク質Ｅ遺伝子の分泌及び発現が実現できたことを実証した。高度に精製されたＶＺＶｇＥ免疫ウサギとＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫血清がＯＫＡ株ウイルスを中和する血清中和試験で、発現したＶＺＶｇＥ－Ｆｃタンパク質は、良好な免疫原性を有し、２回の免疫後、高力価の血清中和抗体を産生できたことが証明された。
【0037】
ＶＺＶｇＥ抗原の投与量は、明らかな有害な副作用なしに免疫防御応答を引き起こすように生体を誘導できる投与量である必要がある。使用される抗原の量は、使用されるアジュバントとその存在方法によって異なる。一般に、各用量には約２～１０００μｇのＶＺＶｇＥが含まれると予想される；人体に使用する場合、注射回数を減少させるためにアルミニウムアジュバントを吸着に使用でき、アルミアジュバントを使用して吸着する場合、５～２００μｇのＶＺＶｇＥを使用すれば、高力価の中和抗体を産生できることが予想され、好ましい用量は約１０～１００μｇであることができ、適切な免疫用量は約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇＶＺＶｇＥ、又は約２００μｇＶＺＶｇＥであることができ、成人の最適用量は５０μｇ又は１００μｇＶＺＶｇＥであることができ；乳幼児の最適用量は１０μｇ、２０ＶＺＶｇＥであることができる。
【0038】
本発明のワクチン製剤の投与方法は、例えば、局所、鼻腔内、粘膜、皮内、腹腔内、皮下及び筋肉内注射投与を含む。
【0039】
本発明のワクチン製剤は、任意選択で、アジュバント及び／又は（他の）適切な担体と組み合わされる。
【0040】
予防接種の強化プログラムを使用する場合、又は複数回ワクチン接種プログラムの場合は、２、３、４回又はそれ以上の予防接種を使用することができる。強化を刺激するのに適したプロトコールには、各予防接種の間に１、２、３又は６ヶ月の間隔があることが含まれる。
ＶＺＶｇＥ被膜外領域の配列は、本発明の附属書１に記載されている配列の一部を有し、ＶＺＶｇＥの完全な配列は、ウイルス研究で最初に公開された（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＨａｕｍｏｎｔなどＶｏｌ．４０、１９９６ｐ１９９－２０４）。
ＶＺＶｇＥ被膜外領域の配列は、本発明の附属書１に記載されている配列の一部を有し、ＶＺＶｇＥの完全な配列は、ウイルス研究で最初に公開された（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＨａｕｍｏｎｔなどＶｏｌ．４０、１９９６ｐ１９９－２０４）。
【0041】
文脈で明示されていない限り、以下で言及されるＶＺＶｇＥ又はｇＥには、切断して得られたＶＺＶｇＥ又はＶＺＶｇＥ－ＦＣの他の断片又は誘導体が含まれる。
【0042】
ｇＥ又はその誘導体又は断片は、液体又は凍結乾燥されていて、一方では、ｇＥ又はその誘導体ｇＥ－Ｆｃ又はその断片、ポリマーは、アルミニウムアジュバントを含む懸濁液の中に存在でき、又は他の免疫増強剤成分（例えばＱｓ２１、コレステロール、鉱油、植物油、魚油、長鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸エステル及び３Ｄ－ＭＰＬアジュバントなど。）を含む溶液又は懸濁液の中に存在できる。
【0043】
ｇＥ又はその誘導体は、ポリ乳酸マイクロキャリア、又はグリコリド／ラクチド共重合体によって形成されたマイクロキャリアにカプセル化でき、形成されたマイクロキャリアを筋肉又は皮下に注射した後、カプセル化された組換えタンパク質薬物を一定期間かけて徐々に放出して、生体の免疫系を刺激して抗体を産生ようにすることができる。
【発明の効果】
【0044】
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する：
１．本発明は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）を用いて分泌型ｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質を効率的に発現し、得られる標的産物はグリコシル化タンパク質であり、発現産物は主に二量体であり、その次が単量体である；各二量体型分子には４個分子のｇＥが含まれ、本発明によって産生される融合タンパク質は、分子量が大きく、免疫原性が強い。
１．本発明は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）を用いて分泌型ｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質を効率的に発現し、得られる標的産物はグリコシル化タンパク質であり、発現産物は主に二量体であり、その次が単量体である；各二量体型分子には４個分子のｇＥが含まれ、本発明によって産生される融合タンパク質は、分子量が大きく、免疫原性が強い。
【0045】
２．本発明のｇＥ－Ｆｃは、ＶＺＶｇＥ外膜領域とヒト免疫グロブリンＦｃ断片（ＣＨ２－ＣＨ３領域）の融合タンパク質であり、市販のＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーパッキングを使用することにより、高効率の予備分離と精製を実行でき、環境汚染物質の排出を最小限に抑え、これは環境にやさしい分離プロセスであり、後続のステップでのイオン交換クロマトグラフィー、分子サイズ排除クロマトグラフィーなどによる標的タンパク質に対するさらなる精製に有利である；
３．本発明のＣＨＯ細胞によって発現される組換えｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質は、グリコシル化タンパク質であり、天然のｇＥタンパク質の空間構造を維持したので、良好な免疫原性を有し、大規模な促進の見通し及び利点を有する。
３．本発明のＣＨＯ細胞によって発現される組換えｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質は、グリコシル化タンパク質であり、天然のｇＥタンパク質の空間構造を維持したので、良好な免疫原性を有し、大規模な促進の見通し及び利点を有する。
【0046】
４．本発明によって提供されるｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃは、ヒト免疫系に存在する抗原提示細胞の表面上のＦｃ受容体に結合して、ｇＥ抗原を主導的に提示できる。動物の免疫原性実験の結果は、本発明の組換えＣＨＯ細胞によって産生されたｇＥ－Ｆｃタンパク質を抗原として使用して、油性アジュバント及び免疫刺激剤を使用せずにウサギとマウスを免疫した後でも、高力価の血清中和抗体を産生できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】ＶＺＶｇＥ－Ｆｃプラスミド酵素切断した産物のアガロースゲル電気泳動検出 レーン１：ＤＬ１００００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（１００００ｂｐ、７０００ｂｐ、４０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、５００ｂｐ及び２５０ｂｐ） レーン２－３：プラスミドｐＵＣ５７－ｇＥ－Ｆｃの酵素切断産物 レーン４－５：プラスミドｐＸＣ－Ｋ３８３Ｌの酵素切断産物。
【図2】ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ組換えプラスミドコロニーのＰＣＲによる陽性クローンのスクリーニング レーン１：ＤＬ１００００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（１００００ｂｐ、７０００ｂｐ、４０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、５００ｂｐ及び２５０ｂｐ） レーン２－７：コロニーＰＣＲによるスクリーニングで得られた６つのクローンｇＥ－Ｆｃ－１～６。
【図3】プラスミド発現ベクターの線形化し、酵素切断産物のアガロースゲル電気泳動検出 レーン１：ＤＬ１００００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（１００００ｂｐ、７０００ｂｐ、４０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、５００ｂｐ及び２５０ｂｐ） レーン２：プラスミドｐＸＣ４－ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ レーン３：線形化されたプラスミドＶＺＶｇＥ－Ｆｃ－ｓｔｒａｉｇｈｔ。
【図4】アフィニティークロマトグラフィーで精製した組換えＶＺＶｇＥタンパク質のＨＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。
【図5】組換えＶＺＶｇＥタンパク質のＨＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。
【図6】各用量のＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバントワクチンで免疫されたマウスの血清抗体価（幾何平均抗体価ＧＭＴ）。
【図7】組換えＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバント吸着ワクチンでＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫後の血清中和抗体価の測定。
【図8】異なる用量のＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバントワクチンでＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫した後の中和抗体の幾何平均抗体価。
【発明を実施するための形態】
【0048】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【0049】
実施例１、プラスミド発現ベクターの構築：
１．遺伝子配列の供給源
本発明の前記水痘帯状疱疹ウイルスＥタンパク質（ＶＺＶｇＥ）は、ｇＥタンパク質の細胞外領域（ＥＣＤ、３１－５４６ａａ）であり、合計５１６個のアミノ酸を有する；ＦｃセグメントはヒトＩｇＧ１Ｆｃであり、合計２３２個のアミノ酸がある（付録：アミノ酸配列１）。水痘帯状疱疹ウイルスＥタンパク質遺伝子とヒトＩｇＧ１のＦｃの遺伝子を直列に接続し（付録：ＤＮＡ配列２）、南京キングスレイバイオテクノロジー株式会社に委託し、合成されたＶＺＶｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質遺伝子配列をｐＵＣ５７－１．８Ｋベクターへ接続させ、合成された遺伝子には、酵素切断制限部位、Ｋｏｚａｋ配列、シグナルペプチド、標的遺伝子（２２４４ｂｐ）、及び終止コドンが含まれ、全長は合計２３５５ｂｐである。組換え遺伝子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＣＨＯ細胞）での発現を促進するために、合成中にコドン最適化された。
１．遺伝子配列の供給源
本発明の前記水痘帯状疱疹ウイルスＥタンパク質（ＶＺＶｇＥ）は、ｇＥタンパク質の細胞外領域（ＥＣＤ、３１－５４６ａａ）であり、合計５１６個のアミノ酸を有する；ＦｃセグメントはヒトＩｇＧ１Ｆｃであり、合計２３２個のアミノ酸がある（付録：アミノ酸配列１）。水痘帯状疱疹ウイルスＥタンパク質遺伝子とヒトＩｇＧ１のＦｃの遺伝子を直列に接続し（付録：ＤＮＡ配列２）、南京キングスレイバイオテクノロジー株式会社に委託し、合成されたＶＺＶｇＥ－Ｆｃ融合タンパク質遺伝子配列をｐＵＣ５７－１．８Ｋベクターへ接続させ、合成された遺伝子には、酵素切断制限部位、Ｋｏｚａｋ配列、シグナルペプチド、標的遺伝子（２２４４ｂｐ）、及び終止コドンが含まれ、全長は合計２３５５ｂｐである。組換え遺伝子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＣＨＯ細胞）での発現を促進するために、合成中にコドン最適化された。
【0050】
２．ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ遺伝子を含む発現プラスミドの構築
キングスクリプトバイオテクノロジー株式会社から提供された組換え遺伝子を含むグリセロール株をＬＢ（Ａｍｐ＋）培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで１５時間培養し、プラスミドｐＵＣ５７－ｇＥ－ＦｃをＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．４．０を使用して抽出した；ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲを使用してｐＵＣ５７－ｇＥ－Ｆｃプラスミドを２種類の酵素で切断（Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）して、標的遺伝子断片ｇＥ－Ｆｃ－Ｈ／Ｅ（サイズ約２３００ｂｐ）を取得し、哺乳動物細胞発現プラスミドｐＸＣ－Ｋ３８３Ｌを酵素で切断して、ベクター断片ｐＸＣ－Ｈ／Ｅ（サイズ約７０００ｂｐ）を取得する；酵素で切断した産物のアガロースゲル電気泳動検出は図１に示す。
キングスクリプトバイオテクノロジー株式会社から提供された組換え遺伝子を含むグリセロール株をＬＢ（Ａｍｐ＋）培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで１５時間培養し、プラスミドｐＵＣ５７－ｇＥ－ＦｃをＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．４．０を使用して抽出した；ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲを使用してｐＵＣ５７－ｇＥ－Ｆｃプラスミドを２種類の酵素で切断（Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）して、標的遺伝子断片ｇＥ－Ｆｃ－Ｈ／Ｅ（サイズ約２３００ｂｐ）を取得し、哺乳動物細胞発現プラスミドｐＸＣ－Ｋ３８３Ｌを酵素で切断して、ベクター断片ｐＸＣ－Ｈ／Ｅ（サイズ約７０００ｂｐ）を取得する；酵素で切断した産物のアガロースゲル電気泳動検出は図１に示す。
【0051】
ＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢｅｓｔ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、標的断片を回収する（図１の矢印で示す）。粘着末端ライゲーション技術を使用して、回収された酵素で切断した産物ｇＥ－Ｆｃ－Ｈ／Ｅ及びｐＸＣ－Ｈ／Ｅを、ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＬＯＮＧ（ＴａＫａＲａ）によって１６℃で６時間ライゲーションした後、コンピテントＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１５時間の逆培養する；コロニーＰＣＲで２つのクローンであるｇＥ－Ｆｃ－１及びｇＥ－Ｆｃ－２をスクリーニングした（図２）；ｐＸＣ－ＦとｐＸＣ－Ｒをプライマーとして使用し、プラスミドｇＥ－Ｆｃ－１をテンプレートとして使用して標的遺伝子をＰＣＲ増幅させ、サイズは約２４００ｂｐである；増幅産物は北京華大遺伝子によって遺伝子配列測定を完成し、２つの反応が追加されて配列決定が完了した；ソフトウェアＢｉｏＥｄｉｔ７．０．９．０を使用して配列結果を分析すると、クローンされたｇＥ－Ｆｃ－１の配列と設計された配列は完全に一致していた。配列プライマーは次のとおりである。
ｐＸＣ－Ｆ：５’－ＴＡＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧ－３’
ｐＸＣ－Ｒ：５’ＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴ－３’
１－Ｆ：５’－ＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣ－３’
１－Ｆ１：５’－ＧＣＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴ－３’
クローンのｇＥ－Ｆｃ－１を３００ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで１６時間培養し、大量／大型のプラスミド抽出キット（北京ボメッド遺伝子工学株式会社）を使用して、プラスミドｐＸＣ－ＶＺＶｇＥ－Ｆｃを抽出する；プラスミドはエンドヌクレアーゼＰｖｕＩ（ＴａＫａＲａ）によって線形化された後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを使用して抽出及び精製し、エタノールによる沈殿の後、１ｍｌの滅菌ＴＥバッファー（ＴａＫａＲａ）に再溶解した。プラスミドｐＸＣ－ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ及び線形化されたプラスミドＶＺＶｇＥ－Ｆｃ－ｓｔｒａｉｇｈｔのゲル電気泳動検出は図３に示す。
ｐＸＣ－Ｆ：５’－ＴＡＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧ－３’
ｐＸＣ－Ｒ：５’ＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴ－３’
１－Ｆ：５’－ＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣ－３’
１－Ｆ１：５’－ＧＣＴＴＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴ－３’
クローンのｇＥ－Ｆｃ－１を３００ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで１６時間培養し、大量／大型のプラスミド抽出キット（北京ボメッド遺伝子工学株式会社）を使用して、プラスミドｐＸＣ－ＶＺＶｇＥ－Ｆｃを抽出する；プラスミドはエンドヌクレアーゼＰｖｕＩ（ＴａＫａＲａ）によって線形化された後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを使用して抽出及び精製し、エタノールによる沈殿の後、１ｍｌの滅菌ＴＥバッファー（ＴａＫａＲａ）に再溶解した。プラスミドｐＸＣ－ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ及び線形化されたプラスミドＶＺＶｇＥ－Ｆｃ－ｓｔｒａｉｇｈｔのゲル電気泳動検出は図３に示す。
【0052】
実施例２．安定的なクローン株の確立及びスクリーニング
無菌層流ワークベンチで、遺伝子パルス発生器Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の穿孔電圧を３００Ｖ電圧、９００μＦの単一パルス、及び無限抵抗に設定し、４ｍｍのギャップのある使い捨て電気ショックカップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を取り出し、４０μｇの線形化されたプラスミドＤＮＡ（１００μｌ）及び０．７ｍｌのＣＨＯ Ｋ１細胞懸濁液（１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を加え、線形化されたプラスミドＶＺＶｇＥ－Ｆｃ－ｓｔｒａｉｇｈｔは、エレクトロトランスフェクション法によってＣＨＯＫ１細胞内にトランスフェクトされ、電気ショックカップ内の細胞を三角培養フラスコに移し、３０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ液体培地（ＧＩＢＣＯ）を加え、３６～３７℃、５％ＣＯ２シェーカーで培養し、１３５ｒｐｍ／分間で２４時間のインキュベーション後、低速で遠心分離して細胞を収集し、５０μＭ ＭＳＸを含むＣＤＣＨＯ培地に交換し（グルタミンを含まない）、限界希釈法により、細胞を９６ウェル平底培養プレートに移し、培養プレートを３７℃、１０％ＣＯ２のインキュベーターに入れて培養し、倒立顕微鏡で観察し、モノクローナル細胞の細孔を標識し、その後ＥＬＩＳＡの方法（ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋発現産物ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ＋ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ）及びｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰＬＣ方法を使用して、より高い発現レベルのモノクローナル株をスクリーニングし、継続的な継代培養し、検出して、最後に、標的遺伝子の発現が高い３つの細胞クローン株が得られ、クローン番号はそれぞれ５Ｂ３、８Ｄ８及び１２Ｃ３である；流加培養試験とＨＰＬＣにより、培養上清中の組換えタンパク質の発現の量を検出して、スケールアップ試験用に５Ｂ３クローン株を選択した。
無菌層流ワークベンチで、遺伝子パルス発生器Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の穿孔電圧を３００Ｖ電圧、９００μＦの単一パルス、及び無限抵抗に設定し、４ｍｍのギャップのある使い捨て電気ショックカップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を取り出し、４０μｇの線形化されたプラスミドＤＮＡ（１００μｌ）及び０．７ｍｌのＣＨＯ Ｋ１細胞懸濁液（１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を加え、線形化されたプラスミドＶＺＶｇＥ－Ｆｃ－ｓｔｒａｉｇｈｔは、エレクトロトランスフェクション法によってＣＨＯＫ１細胞内にトランスフェクトされ、電気ショックカップ内の細胞を三角培養フラスコに移し、３０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ液体培地（ＧＩＢＣＯ）を加え、３６～３７℃、５％ＣＯ２シェーカーで培養し、１３５ｒｐｍ／分間で２４時間のインキュベーション後、低速で遠心分離して細胞を収集し、５０μＭ ＭＳＸを含むＣＤＣＨＯ培地に交換し（グルタミンを含まない）、限界希釈法により、細胞を９６ウェル平底培養プレートに移し、培養プレートを３７℃、１０％ＣＯ２のインキュベーターに入れて培養し、倒立顕微鏡で観察し、モノクローナル細胞の細孔を標識し、その後ＥＬＩＳＡの方法（ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋発現産物ＶＺＶｇＥ－Ｆｃ＋ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ）及びｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰＬＣ方法を使用して、より高い発現レベルのモノクローナル株をスクリーニングし、継続的な継代培養し、検出して、最後に、標的遺伝子の発現が高い３つの細胞クローン株が得られ、クローン番号はそれぞれ５Ｂ３、８Ｄ８及び１２Ｃ３である；流加培養試験とＨＰＬＣにより、培養上清中の組換えタンパク質の発現の量を検出して、スケールアップ試験用に５Ｂ３クローン株を選択した。
【0053】
実施例３．標的産物の発現及び精製
得られた５Ｂ３クローン株を５００ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培養液を入れた２Ｌ三角フラスコに接種し、通気性のある瓶のキャップを締め、回転シェーカーで３６～３７℃、５％ＣＯ２、１３５ｒ／ｍｉｎで培養し、４日間の培養後、５Ｂ３細胞を２．０Ｌ ＣＤ Ｏｐｔｉ－ＣＨＯ培養液を含む５Ｌ自動バイオリアクターに移し、培養パラメーターを６０ｒ／ｍｉｎ、温度３６．５℃、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４、溶存酸素ＤＯ ４０％～６０％に設定し、毎日サンプルを取って細胞の生存率、細胞密度、及びグルコース含有量を検出すると、４日間の培養後、生存細胞密度は５×１０６～７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに増加し、２００ｍｌ～３００ｍｌのＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃを追加してから、１日おきに１回追加し、培地中のグルコース含有量を毎日測定し、グルコース含有量が１１．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ未満の場合は、グルコース含有量が２２ｍｍｏｌｅ／Ｌに達するまで、蠕動ポンプを介して自動バイオリアクターに４０％グルコース溶液を追加する；１２～１４日間培養して、生細胞の割合が６０％～７０％に低下した時点で、培養を停止し、１２０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離（又は３Ｍ深層濾過器を使用）して細胞と細胞破片を除去し、細胞培養物上清を収集する。培養物上清を０．４５μｍフィルターメンブレンで濾過し、濾液を４０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）であらかじめ平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａゲルクロマトグラフィーカラム（ＭａｂｓｅｌｅｃｔＴＭ Ｓｕｒｅ，ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ Ｓｕｒｅ ＬＸ，ＭａｂＣａｐｔｕｒｅＴＭ Ａ，ＡＴ Ｂｅｓｔｅｒｏｓｅ Ａなど）に通し、次に４０ｍＭ ＰＢＳを使用してＡ２８０がベースラインレベルに戻るまで２～４個カラム容量のフローウォッシュをする；フローウォッシュを１００ｍＭグリシン－塩酸バッファー（又はクエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３．０～４．０）に変更し、コンジュゲートを溶出し、収集した溶出物を室温（１８～２５℃）で３０分間（低ｐＨでウイルスを不活化）静置し、その後０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４でｐＨを７．４～８．０に調整し、０．４５μｍフィルターメンブレンで濾過し、不溶性粒子をさらに除去する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーで精製して得られたタンパク質溶液は、島津ＬＣ－２０ＡＴ ＨＰＬＣ（ＢｉｏＣｏｒｅ ＳＥＣ－５００、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、蘇州Ｎａｗｅｉバイオテクノロジー株式会社）の検出によると、メインピーク（二量体）の割合が約６５％～７８％を占め、モノマーは約２０％～３０％を占め、メインピークの前にまだ一部のポリマー産物があり、比率は一般的に１０％未満であり、クロマトグラムを図４に示す。
得られた５Ｂ３クローン株を５００ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培養液を入れた２Ｌ三角フラスコに接種し、通気性のある瓶のキャップを締め、回転シェーカーで３６～３７℃、５％ＣＯ２、１３５ｒ／ｍｉｎで培養し、４日間の培養後、５Ｂ３細胞を２．０Ｌ ＣＤ Ｏｐｔｉ－ＣＨＯ培養液を含む５Ｌ自動バイオリアクターに移し、培養パラメーターを６０ｒ／ｍｉｎ、温度３６．５℃、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４、溶存酸素ＤＯ ４０％～６０％に設定し、毎日サンプルを取って細胞の生存率、細胞密度、及びグルコース含有量を検出すると、４日間の培養後、生存細胞密度は５×１０６～７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに増加し、２００ｍｌ～３００ｍｌのＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃを追加してから、１日おきに１回追加し、培地中のグルコース含有量を毎日測定し、グルコース含有量が１１．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ未満の場合は、グルコース含有量が２２ｍｍｏｌｅ／Ｌに達するまで、蠕動ポンプを介して自動バイオリアクターに４０％グルコース溶液を追加する；１２～１４日間培養して、生細胞の割合が６０％～７０％に低下した時点で、培養を停止し、１２０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離（又は３Ｍ深層濾過器を使用）して細胞と細胞破片を除去し、細胞培養物上清を収集する。培養物上清を０．４５μｍフィルターメンブレンで濾過し、濾液を４０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）であらかじめ平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａゲルクロマトグラフィーカラム（ＭａｂｓｅｌｅｃｔＴＭ Ｓｕｒｅ，ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ Ｓｕｒｅ ＬＸ，ＭａｂＣａｐｔｕｒｅＴＭ Ａ，ＡＴ Ｂｅｓｔｅｒｏｓｅ Ａなど）に通し、次に４０ｍＭ ＰＢＳを使用してＡ２８０がベースラインレベルに戻るまで２～４個カラム容量のフローウォッシュをする；フローウォッシュを１００ｍＭグリシン－塩酸バッファー（又はクエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３．０～４．０）に変更し、コンジュゲートを溶出し、収集した溶出物を室温（１８～２５℃）で３０分間（低ｐＨでウイルスを不活化）静置し、その後０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４でｐＨを７．４～８．０に調整し、０．４５μｍフィルターメンブレンで濾過し、不溶性粒子をさらに除去する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーで精製して得られたタンパク質溶液は、島津ＬＣ－２０ＡＴ ＨＰＬＣ（ＢｉｏＣｏｒｅ ＳＥＣ－５００、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、蘇州Ｎａｗｅｉバイオテクノロジー株式会社）の検出によると、メインピーク（二量体）の割合が約６５％～７８％を占め、モノマーは約２０％～３０％を占め、メインピークの前にまだ一部のポリマー産物があり、比率は一般的に１０％未満であり、クロマトグラムを図４に示す。
【0054】
次に、収集した標的産物を含むタンパク質溶液を、２０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４～８．０）バッファーで平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（又はＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，ＮａｎｏＧｅｌ ５０Ｑ、Ｂｅｓｔｅｒｏｓｅ ＤＥＡＥ，Ｂｅｓｔｅｒｏｓｅ Ｑ，ＰＯＲＯＳ Ｑ，ＰＯＲＯＳ ＸＱ等）にロードした後、Ａ２８０がベースラインレベルに戻るまでカラムを２０ｍＭ ＰＢバッファーでフローウォッシュし、異なる濃度のＮａＣｌ溶液を順番に使用してグラジエント溶出を行い、標的タンパク質ＶＺＶｇＥを収集し、１．０ＭＮａＣｌ溶液で陰イオン交換クロマトグラフィーカラムのカラム１個の容量を再生し、最後に、２０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４～８．０）バッファーで平衡化して予備する。
【0055】
得られたＶＺＶｇＥは、さらにＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ ＨＲ、又はその他の適切なモレキュラーシーブクロマトグラフィーカラムで精製され、標的の産物を収集し、滅菌、濾過した後に、２～８℃で保存する。
【0056】
精製されたＶＺＶｇＥは、島津ＬＣ－２０ＡＴＨＰＬＣによって純度が試験され、移動相は４０ｍＭＰＢＳ（０．５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、ｐＨ７．５を含む）で、流量０．７５０ｍｌ／ｍｉｎであり、分析カラムはＢｉｏＣｏｒｅＳＥＣ５００（７．８×３００ｍｍ、ナウェイテクノロジー株式会社、又はＴＳＫ ５０００ ＳＷｘｌ、東洋ソーダ株式会社）であり、Ａ２８０の試験結果は、ＶＺＶｇＥの純度が９８％以上であることを示し、結果を図５に示し、相対分子量は約４００ＫＤａである。
【0057】
実施例４ホルムアルデヒドによる標的産物の不活性化
実施例３で得られた組換えＶＺＶｇＥを２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２～８．０、１３５ｍＭ ＮａＣｌ）で１００μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌに希釈し、３８％ホルムアルデヒド溶液を溶液総量の０．１％（ｖ／ｖ）まで加え、３７℃で７２時間静置し、この期間中１日２回振とうし、よく混合してから、溶液を２～８℃で静置した。
実施例３で得られた組換えＶＺＶｇＥを２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２～８．０、１３５ｍＭ ＮａＣｌ）で１００μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌに希釈し、３８％ホルムアルデヒド溶液を溶液総量の０．１％（ｖ／ｖ）まで加え、３７℃で７２時間静置し、この期間中１日２回振とうし、よく混合してから、溶液を２～８℃で静置した。
【0058】
実施例５β－プロピオラクトンによる標的産物の不活性化
実施例３で得られた組換えＶＺＶｇＥ溶液を２～８℃に冷却し、秤量した後、溶液の重量の０．１％～０．０１％の最終濃度になるまでβ－プロピオラクトンを添加し、２～８℃でまた７２時間静置し、この期間中、毎日２回振ってよく混ぜる。７２時間後に、β－プロピオラクトンを乳酸に完全に変換させるために、ＶＺＶｇＥ溶液を３７℃に加熱して４時間維持させ、次に溶液を２～８℃で静置した。
実施例３で得られた組換えＶＺＶｇＥ溶液を２～８℃に冷却し、秤量した後、溶液の重量の０．１％～０．０１％の最終濃度になるまでβ－プロピオラクトンを添加し、２～８℃でまた７２時間静置し、この期間中、毎日２回振ってよく混ぜる。７２時間後に、β－プロピオラクトンを乳酸に完全に変換させるために、ＶＺＶｇＥ溶液を３７℃に加熱して４時間維持させ、次に溶液を２～８℃で静置した。
【0059】
実施例６標的産物からのホルムアルデヒド又はβ－プロピオラクトンの除去
実施例５又は実施例６で得られた組換えＶＺＶｇＥを含むタンパク質溶液を、２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．２～８．０、又は２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液ｐＨ７．２～８．０）で適切に希釈して、溶液中のＮａＣｌの濃度を５０ｍＭ以下になるまで下げ、次にＶＺＶｇＥを含む溶液を２０ｍＭＰＢ（又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２～８．０）で平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムに流した後、２０ｍＭ ＰＢ（又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、ＰＨ７．２～８．０）でＡ２８０がベースラインレベルに完全に戻るまでフローウォッシュを続け、４個カラム容量に相当する液量のフローウォッシュを続け、０．４Ｍ ＮａＣｌ（２０ｍＭＰＢ又は２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を含み、ｐＨ７．５）を含む溶出液を使用して、ゲルに結合したＶＺＶｇＥを溶出させ、標的産物を含む溶液を収集し、０．２μｍ孔径の滅菌フィルターメンブレンで濾過し、収集した濾液がワクチン原液である。
実施例５又は実施例６で得られた組換えＶＺＶｇＥを含むタンパク質溶液を、２０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．２～８．０、又は２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液ｐＨ７．２～８．０）で適切に希釈して、溶液中のＮａＣｌの濃度を５０ｍＭ以下になるまで下げ、次にＶＺＶｇＥを含む溶液を２０ｍＭＰＢ（又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２～８．０）で平衡化されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムに流した後、２０ｍＭ ＰＢ（又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液、ＰＨ７．２～８．０）でＡ２８０がベースラインレベルに完全に戻るまでフローウォッシュを続け、４個カラム容量に相当する液量のフローウォッシュを続け、０．４Ｍ ＮａＣｌ（２０ｍＭＰＢ又は２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を含み、ｐＨ７．５）を含む溶出液を使用して、ゲルに結合したＶＺＶｇＥを溶出させ、標的産物を含む溶液を収集し、０．２μｍ孔径の滅菌フィルターメンブレンで濾過し、収集した濾液がワクチン原液である。
【0060】
実施例７アルミニウムアジュバントを含むワクチンの調製
実施例６で得られたワクチン原液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２～７．５，１３５～１５０ｍＭの ＮａＣｌを含む）で１０μｇ／ｍｌ～８００μｇ／ｍｌに希釈し、室温で等量の水酸化アルミニウムアジュバント懸濁液（アルミニウム含有量０．２～１．５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、２～８℃で静置する。
実施例６で得られたワクチン原液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２～７．５，１３５～１５０ｍＭの ＮａＣｌを含む）で１０μｇ／ｍｌ～８００μｇ／ｍｌに希釈し、室温で等量の水酸化アルミニウムアジュバント懸濁液（アルミニウム含有量０．２～１．５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、２～８℃で静置する。
【0061】
アルミニウムアジュバントを含むワクチン溶液を２～８℃から取り出し、無菌状態で２ｍｌのバイアル瓶（又はプレフィルドガラスシリンジ）に分装し、各瓶は０．５ｍＬ（又は１．０ｍＬ）にし、密封後は２～８℃で光を避けて保管した。
【0062】
次の表は、ＶＺＶｇＥ含有量の異なる容量が１０００ｍｌであるのワクチンの調製を例として取り上げ、（左から１列目は、調製した各１ｍｌワクチンにおける抗原含有量であり、右から１列目は、通常の筋肉内注射用の０．５ｍｌワクチンの抗原含有量である）、ＶＺＶｇＥを含む濃度が８００μｇ／ｍｌのワクチン原液を使用して、アルミニウムを含むアジュバントワクチンを調製し、調製方法は以下のとおりである。
【0063】
表１、異なる抗原含有量のＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバントワクチン溶液の調製
【表1】
【0064】
実施例８組換えのＶＺＶｇＥ融合タンパク質の凍結乾燥
実施例６で得られたワクチン原液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２～７．５、１３５ｍＭ ＮａＣｌを含む）で４０μｇ／ｍｌ～８００μｇ／ｍｌに希釈し、１０％スクロース（又は１０％トレハロース、１０％マンニトール、１０％ラクトース）最終濃度が３％になるまで溶液を追加し、分けて入れる溶液におけるＶＺＶｇＥの濃度を２０μｇ／ｍｌ（又は５０、８０、１００、２００、４００μｇ／ｍｌ）に調整し、均一に混合した後、２ｍｌのガラスバイアル瓶に分装し、各瓶１０ｍｌずつ、ブチルゴムを半打栓した後、凍結乾燥チャンバーに送り、予備凍結の温度を－４０～－４５℃に設定して、４時間凍結した後、真空及び凍結乾燥を開始し、自動加熱プログラムを使用して温度を制御し、温度を－４０～－２５℃から６時間加熱し、－２５～－５℃から４時間加熱し、０～５℃で１時間維持し、２５℃で１時間維持し、３５℃で６～８時間維持し、次に、真空状態で（又は高純度窒素又はアルゴンガスを吹き入れ、栓を押し込む）ブチルゴム栓をしっかり押し込む。
実施例６で得られたワクチン原液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２～７．５、１３５ｍＭ ＮａＣｌを含む）で４０μｇ／ｍｌ～８００μｇ／ｍｌに希釈し、１０％スクロース（又は１０％トレハロース、１０％マンニトール、１０％ラクトース）最終濃度が３％になるまで溶液を追加し、分けて入れる溶液におけるＶＺＶｇＥの濃度を２０μｇ／ｍｌ（又は５０、８０、１００、２００、４００μｇ／ｍｌ）に調整し、均一に混合した後、２ｍｌのガラスバイアル瓶に分装し、各瓶１０ｍｌずつ、ブチルゴムを半打栓した後、凍結乾燥チャンバーに送り、予備凍結の温度を－４０～－４５℃に設定して、４時間凍結した後、真空及び凍結乾燥を開始し、自動加熱プログラムを使用して温度を制御し、温度を－４０～－２５℃から６時間加熱し、－２５～－５℃から４時間加熱し、０～５℃で１時間維持し、２５℃で１時間維持し、３５℃で６～８時間維持し、次に、真空状態で（又は高純度窒素又はアルゴンガスを吹き入れ、栓を押し込む）ブチルゴム栓をしっかり押し込む。
【0065】
栓をしたバイアルを自動凍結乾燥機から取り出し、自動キャッピング機に送り、アルミキャップをロックする。次に２～８℃の冷蔵に移して保存する。
【0066】
使用前に、使い捨て滅菌注射器を使用して、注射用水１．０ｍｌ又は水酸化アルミニウムアジュバント懸濁液を凍結乾燥ＶＺＶｇＥが入っているバイアルに注入し、穏やかに混合し、約５分後、目に見える粒子が存在しないワクチンになる。ワクチンは、溶解した直後、又は遅くとも３０分以内に使用する必要がある。本発明のワクチンは皮下又は筋肉内注射に使用され、静脈内注射は厳禁である。
【0067】
実施例９動物免疫実験
ＶＺＶｇＥ１００μｇ／ｍｌを含むアルミニウムアジュバント吸着のワクチンを２～８℃の冷蔵から取り出し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで、ＶＺＶｇＥ８μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌを含む溶液に希釈し、次に、等容量のアルミニウムアジュバントを添加して、ＶＺＶｇＥ４μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌを含む（又はＶＺＶｇＥを２μｇ／０．５ｍｌ、０．５μｇ／０．５ｍｌを含む）動物実験用のアルミニウムアジュバントワクチンに調製した。
ＶＺＶｇＥ１００μｇ／ｍｌを含むアルミニウムアジュバント吸着のワクチンを２～８℃の冷蔵から取り出し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで、ＶＺＶｇＥ８μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌを含む溶液に希釈し、次に、等容量のアルミニウムアジュバントを添加して、ＶＺＶｇＥ４μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌを含む（又はＶＺＶｇＥを２μｇ／０．５ｍｌ、０．５μｇ／０．５ｍｌを含む）動物実験用のアルミニウムアジュバントワクチンに調製した。
【0068】
４～６週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃをランダムに各グループに８匹ずつ５つのグループに分け、対照グループの各マウスに０．５ｍｌのアルミニウムアジュバントを腹腔内注射し；４つの実験グループは、０．５ｍｌのアルミニウムアジュバント吸着を含むＶＺＶｇＥ抗原５０、１０、２、０．５μｇを、それぞれ腹腔内注射し、各用量グループに、８匹のマウスを注射する；初回免疫後、２週間に１回免疫して、合計４回免疫し、第２回目、第３回目の免疫から７日後に、尾静脈から採血し、血清を分離した後、－７０℃で凍結保存し、第４回目の免疫から７日後に心臓から採血し、血清を分離し、分離後－７０℃で凍結保存した。
【0069】
ＥＬＩＳＡ抗体力価検出：組換えＶＺＶｇＥ－Ｈｉｓタンパク質を炭酸緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）をウェルあたり１００μｌでコーティングし、３７℃で１時間静置した後、２～８℃で一晩静置する；９６ウェルプレート内の液体を捨て、２０ｍＭ ＰＢＳで３回洗浄し、次に２００μｌのブロッキング溶液（２％ウシ血清アルブミン、成分Ｖ）を各ウェルに加え、室温で６０分間ブロックする；ウェル内のブロッキング溶液を吸引し、２０ｍＭ ＰＢＳ－Ｔ溶液で３回洗浄し、１：５０（又は１：５００、又は１：１０００）に前希釈したマウス血清を９６ウェルマイクロタイタープレートの第１列目のウェルに加え、次に２倍系列の倍希釈を行い、陰性対照は、アルミニウムアジュバントのみを使用して腹腔内免疫したマウスの血清（１：１００）であり、３７℃で６０分間反応させ、ウェル内の溶液を吸引し、２０ｍＭ ＰＢＳ－Ｔ溶液を使用して３回洗浄した；ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートを取り出し、酵素コンジュゲート希釈液１：１００（希釈液にはヒトＩｇＧ １ｍｇ／ｍｌが含まれ）で希釈し、室温で３０分間前反応させてから、９６ウェルマイクロタイタープレートに加え，ウェルあたり１００μｌであり、３７℃で３０分間反応させる；ウェル内の溶液を吸引した後、２０ｍＭ ＰＢＳ－Ｔ溶液を使用して３回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ発色溶液を加え、１０分後に５０μｌの停止溶液を加えて反応を停止させ、次にＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔ ２００マイクロプレートリーダーを使用してＡ４５０吸光度値を測定し、陰性対照グループの混合血清Ａ４５０の３倍をＣｕｔ－Ｏｆｆ値とし（陰性対照Ａ４５０の値が０．１００未満の場合、０．１００として計算）、免疫後の血清の力価を判定する。各実験グループのマウスの血清における抗ＶＺＶｇＥ抗体価の幾何平均値と標準偏差を以下の表２に示す；２回免疫後、抗体陽転（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）しなかった最低用量グループ（０．５μｇ）の１匹マウスを除いて、すべてのマウスが抗体陽転（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）である；各グループの実験動物に対する測定の抗体力価の統計分析では、各用量グループの実験マウスは３回免疫した後、血清抗体価は２回の免疫した後より明らかに高く、第４回目の免疫後も血清抗体価は、部分的に上昇はあるが、その上昇は明らかではない；第２回目、３回目、４回目の免疫後、３つの高用量グループマウスの血清力価に有意差がない。各用量のＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバントワクチンでＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫した後の血清抗体価は図６に示す。
【0070】
血清の中和抗体価の測定：ＶＺＶウイルスは、ヒト胚の肺二倍体細胞に細胞融合病変を生じさせることができるウイルスであるため、ウイルスプラーク減少中和試験で血清希釈度の異なる抗体の中和能を検出し、ウイルスの数を５０％減らす血清力価を計算できる。血清抗体中和ウイルス実験は、免疫された血清中のＶＺＶウイルスを中和できる抗体の存在の有無を検出するための最も直接的な実験であり、当該実験には、操作が複雑で、感度が低く、人員が多く、時間がかかり、設備を使用して自動的に読み、判断できないなどの欠点があり、さらに、ＥＤ５０の計算には専門のデータ処理ソフトウェアが必要であり、上記の不便さにより、血清中和抗体の測定にこの実験を使用する人はほとんどいない。当該実験に使用される血清の量が多いため、最後の免疫後に収集したマウスの血清に対してのみ中和抗体の測定を行った。
【0071】
この試験は、平底の９６ウェルマイクロタイタープレートで実行されるＶＺＶ血清中和試験であり、細胞マトリックスはＶＺＶに敏感なＭＲＣ－５細胞である（ＡＴＣＣから購入）。－７０℃の冷蔵庫から凍結保存した血清を取り出し、室温で溶かした後、無菌浄化作業台で試験する血清を、１０％ＦＢＳを含む１９９培地（ＧＩＢＣＯ）で、まず１：１０に希釈し、次に、９６ウェルプレートで４倍段階希釈を実行し、合計７つの希釈度があり、各希釈度は２つのウェルで測定され、陽性対照血清はウサギ抗ＶＺＶｇＥ血清であり、陰性対照血清は、アルミニウムアジュバント（１：１０希釈）で免疫したマウスの混合血清であり、各９６ウェルプレートには、６つウェルのウイルス液体のコントロールウェルと６つウェルの細胞コントロールを設置し；試験対象とする希釈された血清を一定量のＯＫＡ株ウイルス（ＡＴＣＣ、ＵＳＡから購入）と混合し、９６ウェルマイクロプレートカバーをカバーし、マイクロプレートシェーカーで３０秒振とうし、次に、１０％ＣＯ２、３７℃インキュベーター（１０％）に３０分間入れて反応させる。
【0072】
増殖で覆われた単層のＭＲＣ－５細胞（ＡＴＣＣ、世代２５～３８代）を二酸化炭素インキュベーターから取り出し、Ｔ７５培養瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内の培地液は、１００グレードの清潔な作業台で吸引され、５ｍｌの０．２５％パンクレリパーゼ（ＧＩＢＣＯ）溶液を添加して、単層に増殖したＭＲＣ－５細胞を消化し、室温で３分間作用させ、パンクレリパーゼ溶液を吸引した後、１０ｍｌの細胞培養液を加え、細胞培養瓶の内面をやさしくブロー・ビートして、ＭＲＣ－５細胞を分散させ、一定量の細胞培養液を加えて細胞懸濁液を作る。試験対象とする血清を含む９６ウェルマイクロプレートをインキュベーターから取り出し、細胞懸濁液をマルチチャンネルピペットで加え、マイクロプレートを覆い、マイクロプレート発振器上で３０秒間振動させ、３７℃の二酸化炭素インキュベーター（１０％）に入れて３～４日間培養し、４８時間後、毎日倒立顕微鏡で各ウェルの細胞病変を観察して、各穴のプラークの数を正確に数えて記録した。９６時間後、１２連ピペットを使用してウェル内の液体を、０．１％次亜塩素酸ナトリウムを含む廃液タンクへ吸引して、０．１％クリスタルバイオレットを加えて１時間染色し、脱色後、マイクロウェルプレートを吸収紙上に逆バックバックし、室温で乾燥させる。
【0073】
各血清の各希釈度のプラーク数をＥＸＣＥＬ２０１６表に入力し、ウイルス溶液ウェル内のプラークの平均数（６ウェルの平均値、２５～３０個／ウェル）を１００％とし、各希釈度における血清のプラーク減少数を計算し、それをパーセンテージに変換し、次に、Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェアを使用して、データのＥＤ５０値を計算、このＥＤ５０値は、プラークの数が５０％減少した血清力価であり、４つの用量グループにおける各マウスの血清中和抗体力価であるＥＤ５０の決定曲線は、図７を参照し、各用量グループにおける血清中和抗体価の幾何平均抗体価及び中和抗体力価の分布は、表３を参照する；各用量グループにおけるＶＺＶ血清中和抗体価の幾何平均抗体価の比較は図８を参照し、図からは、中和抗体価が他の３グループより明らかに低い最低用量グループを除いて、他の３つの各グループの血清中和抗体価はいずれも比較的に高いレベルに達したことか分かる。
【0074】
表２、異なる用量のＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバントワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの血清抗体価（ＥＬＩＳＡ）
【表2】
【0075】
表３．異なる用量のＶＺＶｇＥアルミニウムアジュバント吸着ワクチンでＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫した後の血清中和抗体価
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】