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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-28
(45)【発行日】2023-09-05
(54)【発明の名称】皮膚創傷や熱傷の治療のための薬剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20230829BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230829BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230829BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230829BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20230829BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230829BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230829BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230829BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08 ZNA
A61K9/06
A61K9/08
A61K47/12
A61K47/38
A61P17/02
A61P29/00
A61P43/00 111
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021513302
(86)(22)【出願日】2019-09-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-23
(86)【国際出願番号】 IB2019057483
(87)【国際公開番号】W WO2020053712
(87)【国際公開日】2020-03-19
【審査請求日】2021-04-06
(31)【優先権主張番号】2018132558
(32)【優先日】2018-09-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521092878
【氏名又は名称】ピーブイピー ラボズ ピーティーイー． リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェルトリジスキイ エフゲニェイ アレクサンドロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】オヴチニコフ ミハイル ウラジミロヴィチ
(72)【発明者】
【氏名】クレジェメノフ アレクセイ ヴィクトロヴィッチ
【審査官】菊池 美香
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１５－１９３６７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Farmakol Toksikol. Jul-Aug 1987;50(4):64-6.，NCBI [online], [retrieved on 2022.04.11], インターネット<https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3311802/>
【文献】Biull Eksp Biol Med. 1988, 106(10), pp.487-490，NCBI [online], [retrieved on 2022.04.11], インターネット<https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3191245/>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／０８
Ａ６１Ｋ ９／０６
Ａ６１Ｋ ９／０８
Ａ６１Ｋ ４７／１２
Ａ６１Ｋ ４７／３８
Ａ６１Ｐ １７／０２
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効成分としてヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを０．０２～０．５重量％で含有し、薬学的に許容される賦形剤が残りを構成する、局所用剤形を有する表面熱傷治療用の薬剤であって、表面熱傷後の増殖性炎の重症度を軽減し、浮腫と充血を鎮静化し、好中球に対するリンパ球の比を正常にするために使用される、前記薬剤。
【請求項2】
前記薬剤が、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン及び薬学的に許容される賦形剤である精製水を以下の重量％の成分比で含有する薬液である、請求項１に記載の薬剤：ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン：０.０２～０.５重量％、
精製水：全量が１００重量％になるまで。
【請求項3】
前記薬剤が、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン及び薬学的に許容される賦形剤であるヒドロキシエチルセルロース、ソルビン酸カリウム及び精製水を以下の重量％の成分比で含有するゲルである、請求項１に記載の薬剤：ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン：０.０２～０.５重量％、
ヒドロキシエチルセルロース：２.５～３重量％、
ソルビン酸カリウム：２～３重量％、精製水：全量が１００重量％になるまで。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連技術
本発明は医薬に関するものであり、局所用医薬品としての皮膚創傷または熱傷の治療におけるヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの適用に関する。
本発明は医薬に関するものであり、局所用医薬品としての皮膚創傷または熱傷の治療におけるヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの適用に関する。
【0002】
最先端技術
世界保健機関によると、毎年１８万人以上の人が熱傷で亡くなっている。一方、熱傷は長期入院や持続的な障がいの主な原因であり、社会的不名誉を伴うことが多く、生活の質を著しく低下させる[１]。熱傷患者の治療を支える局所及び全身療法の統一原則は、熱傷の完全治癒と皮膚の早期回復を目的とした局所治療を特に重視している[２]。したがって、新しい効果的な局所熱傷治療法の開発は、依然として公衆衛生のための重要な目標である。
世界保健機関によると、毎年１８万人以上の人が熱傷で亡くなっている。一方、熱傷は長期入院や持続的な障がいの主な原因であり、社会的不名誉を伴うことが多く、生活の質を著しく低下させる[１]。熱傷患者の治療を支える局所及び全身療法の統一原則は、熱傷の完全治癒と皮膚の早期回復を目的とした局所治療を特に重視している[２]。したがって、新しい効果的な局所熱傷治療法の開発は、依然として公衆衛生のための重要な目標である。
【0003】
熱傷は、低酸素症及び脂質過酸化（ＬＰＯ）、うっ血ゾーンでの組織灌流の減少、好中球の凝集及び過剰活性化、炎症反応の連鎖及び激しい痛みなどの病態生理学的メカニズムの複合体全体に関連している。新規製品は明らかに、創傷の病原性の側面と一致する多面的な作用メカニズムに依存する必要がある。このような観点から、広範囲の生物学的活性を有する合成調整ペプチドをベースにした新しい熱傷治療剤の臨床開発は、大きな関心を集めている。
【0004】
ストレス制限系の成分として、該ヘキサペプチドは、抗酸化作用を示し[３]、ＬＰＯを阻害し[４]、末梢微小循環を改善する[５]。
【0005】
オピオイド抗侵害受容系のメディエータであるにもかかわらず、血液脳関門を通過することはほとんど不可能である。主に末梢及び組織レベルで鎮痛効果を示すので、該製品は局所麻酔薬のいくつかの特性を持っていると考えることができる[６]。
【0006】
さらに、該ヘキサペプチドは、組織再生に関しても重大な可能性を示した。具体的には、複数の研究者が、該ヘキサペプチドがオピオイド受容体と相互作用して細胞の有糸分裂活性を刺激し、創傷修復メカニズムを活性化することを実証している[７,８,９]。
【0007】
医薬品ダラルギンの形態の該ヘキサペプチドは、胃液の酸性度と膵臓の外分泌活性を低下させる医薬品として、消化性潰瘍疾患と膵炎の治療のためにロシアでヒトへの使用が承認された[１０]。しかし、消化性潰瘍疾患の治療におけるこの薬の有効性は、胃及び十二指腸粘膜の修復作用によるところも大きい[１１,１２,１３]。また、クローン病の併用療法（ＩＭ １ｍｇ １日２回）の一環としてのダラルギンの有効性（特許RU2363455、2007/19/11付出願番号2007142745/14）は、全身的な修復効果を示唆している。E.V.マクサコバは、ダラルギンの創傷治癒の可能性を角膜損傷の治療に使用すべきであると提案した[14]。
【0008】
細胞レベルで起こっている「意思決定プロセス」（細胞死またはＤＮＡ合成及び有糸分裂）は、酸化状態または酸化還元状態に大きく依存しており[15]、これは熱傷うっ血ゾーンを減少させるために特に重要である。抗酸化特性、抗ラジカル及びニトロ活性[16]は、明らかに熱傷の再生に関連するダラルギンの追加機能である。
【0009】
化粧品分野で公開された発明では、ダラルギンがニキビの症状を緩和するための抗炎症クリームの成分として使用された（特許RU2.045.949）。別の特許（RU2221547、2002年12月24日付けの出願番号2002134728/15）は、化粧品の成分としてのダラルギンの免疫調節作用を主張している。
【0010】
熱傷患者（ｎ=１５）の末梢血サンプルにダラルギンを添加すると、好中球の機能的及び代謝的活性の上昇を正常化し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ミエロペルオキシダーゼ及び核クロマチンの活性を上昇が低下させ、好中球中のカチオン性タンパク質のレベルの上昇と活性化された好中球の総数を正常化することを、生体外で実証した実験のデータがある。重要なことに、健康な人間の血液（n=27）では、ダラルギンは、活性化された好中球の総数とNADPHase活性を増加させるという逆の効果があった。これらの効果はオピオイド受容体によって媒介され、用量依存的であり、最大の効果は５ｘ１０－８Ｍのモル濃度で達成された[17]。しかし、この効果は、生体内の熱傷モデルにおいては研究されていない。
【0011】
一般に、組織の損傷は好中球の活性化を引き起こし、活性酸素ラジカル、ＬＰＯの生成を増加させ、病理学的プロセスによって免れた組織に損傷を与える反応の連鎖を引き起こす[18]。したがって、好中球過剰活性化を正常化するダラルギンの能力は、その熱傷治癒効果において病理学的に重要なリンクである。
【0012】
熱傷治療におけるダラルギンの非経口投与の有効性を検討した実験結果は発表されているが、局所適用として使用した場合の熱傷治癒活性については、いずれの実験も言及していない。ある研究では、熱傷治療におけるダラルギンとデルタ睡眠誘導ペプチド（ＤＳＩＰ）を比較した。両製品を試験動物に腹腔内投与した（特許第2070054号、公開日1996年12月10日）。別の研究では、ダラルギン（０.３ｍｇＳＣ）は、ラットの第３度熱傷モデルにおいて、皮膚修復の有意な加速と増殖性炎の強度減少と関連していた[9]。特許RU2196603は、熱傷治療のための注入療法の一環として、ダラルギンの使用（１～２ｍｇを１～２ｍＬでＩＶ注入）を開示している。
【0013】
ここで引用した研究とは異なり、本発明は、局所用医薬品としてのダラルギンの可能性を開示している。
【0014】
さらに、他の多数疾患におけるダラルギンの使用に関するデータがある。特許UA6829U、UA6823U、及びUA6826Uは、急性実験的膵炎の治療のためのダラルギンの使用を開示している。抗ストレス剤としてのダラルギンの使用は、慢性膵炎、急性付属器炎、及び腹膜炎の実験モデルにおいて、それぞれ特許UA67632、UA67630、UA67629に記載されている。ダラルギンの抗ストレス活性は、特許UA 67626において、実験的慢性ストレスモデルにおいて実証された。特許RU 2180598は、慢性薬物中毒患者における中毒性肝炎の治療のためのダラルギンの使用を開示している。ウイルス性疾患の治療におけるダラルギンの有効性は、特許RU2261722（胎児死亡症候群の女性における潜伏性性器ヘルペスの治療）及びRU2167671（ダニ媒介脳炎の治療）で実証された。論文MD1413Fは、口腔粘膜及び扁平苔癬の治療のためのダラルギンの使用を開示し、論文MD1296Fは、ダラルギンを用いた扁平苔癬の治療に関するデータを開示している。特許RU2008131509は、ダラルギンを含む脱髄性疾患の治療のための医薬組成物を提示している。特許RU2218896は、水疱性角膜症の治療のためのダラルギンの使用を開示している。論文MD1963F及びMD1610Fには、慢性再発性口腔潰瘍の場合のダラルギンの使用が記載されており、特許RU2230549には、アレルギー性皮膚症の治療への使用が提示されている。A.V.ドンツォフ による論文[19]では、虚血性心疾患及びメタボリックシンドローム患者におけるサイトカインプロファイル補正に対するダラルギンの有効性が実証されている。同時に、本発明は、熱傷治療におけるダラルギンの有効性を主張しながらも、他の疾患の治療に関する引用文献とは根本的に異なるものである。
【0015】
上記を要約すると、ダラルギンは臨床開発の観点から大変有望であり、病態生理学的プロセス（酸化ストレス、ＬＰＯ、過炎症及び侵害受容反応）を排除し、修復プロセスを刺激するという多面的活性は、皮膚創傷や熱傷の局所治療としての該薬剤の紛れもない利点である。
【0016】
本発明に最も近い類似体は、創傷及び熱傷治癒特性を有する局所用薬剤であるＤ－パンテノールであり、１ｇあたり以下を含有する：有効成分：デクスパンテノール：５０ｍｇ；賦形剤：フェノニップ ４ｍｇ；ラノリン：１６０ｍｇ；白蜜蝋：５０ｍｇ；軟白パラフィン：２１０.８ｍｇ；ジメチコン：５ｍｇ；ラネットＳＸ乳化剤：２０ｍｇ；プロピレングリコール：２０ｍｇ；ブチルヒドロキシアニソール：０.１ｍｇ；ブチルヒドロキシトルエン：０.１ｍｇ；デカメチルシクロペンタシロキサン：２０ｍｇ；硫酸マグネシウムヘプタハイドレート：５ｍｇ；プロテジンＷ：２９５ｍｇ；精製水：１６０ｍｇ（ＲＬＳ、Ｄ－パンテノールのエントリ。製造元による最終更新日は2017年9月19日、https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_12869.htm）
該薬剤の有効成分はデクスパンテノールで、皮膚の再生を刺激し、細胞代謝を正常化し、コラーゲン繊維の強度を高める。したがって、該薬剤の明らかな欠点は、皮膚損傷の場合に活性化され、創傷治癒に付与するという他の生物学的メカニズムを含まない事実にある。
該薬剤の有効成分はデクスパンテノールで、皮膚の再生を刺激し、細胞代謝を正常化し、コラーゲン繊維の強度を高める。したがって、該薬剤の明らかな欠点は、皮膚損傷の場合に活性化され、創傷治癒に付与するという他の生物学的メカニズムを含まない事実にある。
【0017】
本発明の開示
上記に鑑み、本発明の目的は、異なる病因の創傷の治癒に寄与する様々なメカニズムに作用する局所適用のための熱傷及び創傷治癒剤を創出することである。
上記に鑑み、本発明の目的は、異なる病因の創傷の治癒に寄与する様々なメカニズムに作用する局所適用のための熱傷及び創傷治癒剤を創出することである。
【0018】
本発明の技術的成果は：
-創傷領域の組織再生プロセスを刺激し、熱傷後の増殖性炎の重症度を軽減し、浮腫と充血を鎮静化するためのヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの使用。
-創傷領域の組織再生プロセスを刺激し、熱傷後の増殖性炎の重症度を軽減し、浮腫と充血を鎮静化するためのヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの使用。
【0019】
-局所用成分の一部としてクレームされた物質による創傷及び熱傷における顕著な治癒効果は、病態生理学的プロセス（酸化ストレス、ＬＰＯ、過炎症及び侵害受容反応）の排除及び修復プロセスの強化を含むその多面的活性の結果であり、皮膚創傷や熱傷の局所治療における該製品の紛れもない利点である。
【0020】
この目標を達成するために、本発明者らは、皮膚創傷または熱傷の治療に使用するため、有効成分として、ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを０.０２～０.５重量％で含有し、残りは薬学的に許容される賦形剤から構成される薬剤を、局所用剤形の形態で提案する。
【0021】
本発明の特定の実施形態において、本薬剤は、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン及び薬学的に許容される賦形剤を以下の重量％の成分比で含有する薬液である：ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン：０.０２～０.５重量％、精製水：１００％まで。
【0022】
本発明の特定の実施形態において、本薬剤は、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン及び薬学的に許容される賦形剤を以下の重量％の成分比で含有するゲルである：ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン：０.０２～０.５％、ヒドロキシエチルセルロース２.５～３％、ソルビン酸カリウム２～３％、精製水：１００％まで。
【図面の簡単な説明】
【0023】
図面及びその他の説明資料の簡単な説明
（図Ａ）表１ 熱傷に対する反応を示す指標として、熱傷浮腫スコアと時間を比較したところ、*は対照群と比較して統計的に有意な差を示し、**はデクスパンテノール群と比較して統計的に有意な差を示した。
（図Ｂ）表２ 熱傷充血のスコアと時間を比較したところ、*はコントロール群と比較して統計的に有意な差を示し、**はデクスパンテノール群と比較して統計的に有意な差を示した。
（図Ｃ）表３ 面積測定評価結果（ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン薬液の形態）：熱傷面積（単位：ｃｍ２）、ここで*はコントロール群と比較して統計的に有意な差を示し、**はデクスパンテノール群と比較して統計的に有意な差を示す。
（図Ｄ）表４ 面積測定評価結果（ゲル状のヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン）：熱傷面積（ｃｍ２）、ここで*はコントロール群と比較して統計的に有意な差を示し、**はベパンテン群と比較して統計的に有意な差を示す。
（図１）図１は、熱傷の平均治癒率（ｃｍ２／日）、ここでI=コントロール、II=デクスパンテノール、III=ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.０２～０.５％薬液）。
（図２）図２は、リンパ球-好中球比対熱傷後の時間、ここで、縦軸は比率を表し、横軸は追跡日数を表します。
（図３）図３は、皮膚の創傷治癒への影響。横軸は追跡日数を表し、縦軸は創傷の平均直
線寸法を表す。
（図４）図４は、熱傷の平均治癒率（ｃｍ２／日）、I=コントロール、II=ベパンテノー
ル、III=ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.０２％ゲル）、IV=ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.５％ゲル）
（図Ａ）表１ 熱傷に対する反応を示す指標として、熱傷浮腫スコアと時間を比較したところ、*は対照群と比較して統計的に有意な差を示し、**はデクスパンテノール群と比較して統計的に有意な差を示した。
（図Ｂ）表２ 熱傷充血のスコアと時間を比較したところ、*はコントロール群と比較して統計的に有意な差を示し、**はデクスパンテノール群と比較して統計的に有意な差を示した。
（図Ｃ）表３ 面積測定評価結果（ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン薬液の形態）：熱傷面積（単位：ｃｍ２）、ここで*はコントロール群と比較して統計的に有意な差を示し、**はデクスパンテノール群と比較して統計的に有意な差を示す。
（図Ｄ）表４ 面積測定評価結果（ゲル状のヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン）：熱傷面積（ｃｍ２）、ここで*はコントロール群と比較して統計的に有意な差を示し、**はベパンテン群と比較して統計的に有意な差を示す。
（図１）図１は、熱傷の平均治癒率（ｃｍ２／日）、ここでI=コントロール、II=デクスパンテノール、III=ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.０２～０.５％薬液）。
（図２）図２は、リンパ球-好中球比対熱傷後の時間、ここで、縦軸は比率を表し、横軸は追跡日数を表します。
線寸法を表す。
ル、III=ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.０２％ゲル）、IV=ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.５％ゲル）
【0024】
本発明の実施形態
実施例１ 皮膚創傷や熱傷の治療のための局所用薬液の形態の薬剤の製造
局所用薬液の形態でヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを含有する組成物の製造には、以下が含まれる： ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの薬液の調製、バイアル充填、薬液の品質管理。
実施例１ 皮膚創傷や熱傷の治療のための局所用薬液の形態の薬剤の製造
局所用薬液の形態でヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを含有する組成物の製造には、以下が含まれる： ヘキサペプチドチロシル－D－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの薬液の調製、バイアル充填、薬液の品質管理。
【0025】
精製水２００ｍLに計算量のダラルギン(０.０４～１.０ｇ)を混合下で添加し、完全に溶解するまで混合する。得られた薬液を滅菌フィルター（孔径０.２２μm）に通して、局所用の薬液を生成する。
【0026】
【0027】
実施例２ 皮膚創傷や熱傷の治療のための局所用ゲル形態の薬剤の製造
該ゲルを１５０ｍL製造するには以下の成分を使用：
ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン：０.０４～０.７５ｇ、精製水：１３５～１３９ｍＬ、ヒドロキシエチルセルロース：４～４.５ｇ、ソルビン酸カリウム：３～４ｇ。
該ゲルを１５０ｍL製造するには以下の成分を使用：
ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン：０.０４～０.７５ｇ、精製水：１３５～１３９ｍＬ、ヒドロキシエチルセルロース：４～４.５ｇ、ソルビン酸カリウム：３～４ｇ。
【0028】
製造処方に従って必要量の水を反応器に充填し、混合をオンにし、粉末成分を加え、完全に溶融するまで混合した後に、製造処方で必要とされる残りの成分を加える。均一な乳剤が得られるまで、30分間混合を続ける。試験サンプル収集試験パラメータの値が製造者のモノグラフに一致する場合は、中間容器に梱包されていない完成品を降ろし、充填段階に移す。
【0029】
【0030】
実施例３ ラットの熱傷モデルにおけるヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの有効性を評価した実験結果。
【0031】
熱傷治療におけるヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの局所投与の有効性を、３０匹の非近交系雄ラットを対象としたII-IIIA度熱傷モデルを用いて評価した。ユーラシア経済連合の医薬品安全性試験実施規格及び該当するガイドライン[20]に従って、被験動物を飼育室（周囲温度１９～２３℃）に保管した。
【0032】
熱剤として、体積の２／３まで液体パラフィンを充填した適切な直径の平底ガラス容器を使用した。容器は、皮膚に塗布する前に水浴で加熱した。ラットを３つのグループ（各グループはｎ＝１０）に無作為に割り分けた：１つのコントロール群及び２つの実験群。別の組織修復刺激剤であるデクスパンテノール（５％局所軟膏）を対照薬として使用した。すべてのラットに、約４０ｃｍ２の標準化された面積で熱傷を与えた。
【0033】
２０分以内。熱傷を与えた後、コントロール群のラットに無菌包帯を適用し、続いてヨードピロンとレボメコールを投与した（I群）。実験群のラットにはさらに、デクスパンテノール（II群）またはヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの０.０２～０.５％薬液（０.０２％薬液を投与した５匹と０.５％薬液を投与した５匹からなるIII群）を追加投与した。
【0034】
実験では、被験動物の一般的な状態を評価し、熱傷領域の組織浮腫の重症度、充血、浸潤、膿の出現及び上皮再形成を評価するために肉眼検査を実施した。これらの徴候は次のようにスコア化された：徴候が最大の重症度は３点、徴候の不在は０点とした。治癒過程の客観的評価は、面積測定に基づいている。すべての観察は、実験の１、３、５、７、及び１０日目に実行された。
【0035】
治癒率は、式Ｖ＝（Ｓ１-Ｓ２）／ｔを用いて決定し、ここでは、Ｓ１＝前回の測定時の創傷面積、Ｓ２＝次回の測定時の創傷面積、ｔ＝前回の測定と次回の測定の間の日数である。
【0036】
また、実験では、静脈血中の分葉核白血球に対するリンパ球の総数の比率として、白血球集団の評価も実施した。
【0037】
結果実験１日目に、全ての被験動物の一般的な状態を中等度と評価したが、これは、与えられた熱傷の程度に起因するものである。檻の中の被験動物はほとんど動きを見せず、ほとんどの時間は眠っており、外部刺激に対する反応は弱かった。
【0038】
３日目までに試験動物の活動性や運動性が高まり、檻から出したときに防御反応を示したり、食欲が出てきたりした。被験動物の一般的な状態における群間差は観察されなかった。表１に、熱傷と隣接組織の浮腫スコアを示す。分析の結果、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを投与した群では、コントロール群及びデクスパンテノール群と比較して、熱傷に対する反応としての初期浮腫及びその消失までの時間が有意に減少したことが示された。
【0039】
同様の変化は、充血の場合にも観察された（表２）。治療により、1日目にはすでに皮膚の紅斑が減少していた。一方、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンは、充血の軽減においてデクスパンテノールよりも有意に優れていた。
【0040】
面積測定では、III群の被験動物（ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン投与）における熱傷治癒の統計的に有意な正の変化を顕著に実証した。実験３日目にはすでに熱傷面積が大幅に減少し、熱傷の深さが減少し、結果的に創傷治癒過程がより良好な経過をたどっていることが特徴であった。また、II群及びIII群で得られた結果から、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの熱傷面積の低減に対する優位性が示された（表３）。
【0041】
平均治癒率を図１に示す。統計的に有意な差は、コントロール群とヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを投与された群との間でのみ検出された。
【0042】
リンパ球と好中球の比率の経時変化。生物学的モデルとしてのラットの特徴的な形質の1つが、末梢血の白血球集団における単球の優勢（リンパ球は通常、健康な動物のすべての白血球の６５～７７％を占める）であることを考慮して、試験群における白血球プロファイルの変化を、リンパ球－好中球の比率（リンパ球と分葉核白血球の比率）を評価することで調べた。
【0043】
分析により、１日目にリンパ球と好中球の比率が大幅に低下し、熱傷に対する予想された反応が示された。図２に示すリンパ球-好中球比の経時変化は、I群（コントロール）とIII群（ヘキサペプチドチロシル-Ｄ-アラニル-グリシル-フェニルアラニル-ロイシル-アルギニン）との間で統計的に有意な差を示した。III群では、このパラメータは７日目に既に正常に戻ったが、他の群では上昇傾向が続いた。
【0044】
以上をまとめると、熱傷直後にヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを局所投与することにより、浮腫や充血を軽減することができる。また、創傷面の減少、平均創傷治癒率、リンパ球－好中球の比率の変化の点でも顕著な有効性を示した。
【0045】
前臨床実験で得られた結果は、応急処置として、及びその後の中等度の表面熱傷の治療の両方において、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンが高い有効性を有することを証明するものである。さらに、この結果は、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンが、深部熱傷による皮膚移植のための創傷床調製、及び再生能力の低い衰弱した患者の栄養性潰瘍の治療にも使用できるという記述を正当化するものである。
【0046】
実施例４ ラットの平面創傷モデルにおけるヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの有効性を評価した実験結果。
【0047】
この実験は、白色雄性ウィスターラットを用いて実施された。全ての被験動物を１３匹ずつの３群に無作為に割り分けた： （I）コントロール群（無処置）、（II）対照群（デクスパンテノール５％含有ベパンテン局所用クリーム）、及び（III）実験群（ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン）。実験群は、０.０２％薬液を投与された５匹の被験動物と０.５％薬液を投与された５匹の被験動物で構成された。このグループの平均統計は、申請書本文に記載されている。
【0048】
線状の創傷は、背中の正中線に沿った皮膚と皮下脂肪を約４ｃｍの長さで縦に切開してモデル化した。切開した後、傷口の縁を寄せ、等間隔で３針の縫合を実施した。被験動物には手術当日から試験薬を投与し、コントロール群にはプラセボを投与した。各群３匹のラットには、実験の７日目に安楽死を必要とする張力測定を実施した。組織学的評価のためのサンプルは、完全治癒の直後（２５日目～２６日目）に採取した。
【0049】
試験薬を、１日１回、毎日、２０日間塗布した。創傷治癒効果は、実験４日目、７日目、１５日目、２０日目の臨床経過（化膿性分泌物の有無、創傷端付着の変化）に基づいて評価した。
【0050】
図３は、実験群（ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン）の線状創傷の治癒が、コントロール群及び対照群と比較して、より迅速であることを明確に示す目視検査の結果を示している。
【0051】
治癒の第３段階である１５～２０日目は、上皮化及び瘢痕形成によって特徴づけられることが知られている。しかし、コントロール群では観察２０日目になっても治癒が完了せず、かさぶたが残り、完全な上皮化が起こったのは２５～２６日目になってからであった。
【0052】
顕微鏡検査の結果、コントロール群の無傷領域のコラーゲン線維は緩く太いのに対し、創傷治癒領域ではコラーゲン線維ははるかに細く、多数の毛細血管が残っていた。すなわち、瘢痕は未成熟の複数の兆候を示した。さらに、創傷縫合領域の上皮再生は完全ではなかった。瘢痕構造には局所性及びびまん性の炎症性浸潤が観察された。肉芽組織は真皮の奥深く、ほぼ皮下脂肪の境界まで伸びていた。
【0053】
ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを投与した群では、瘢痕は毛包の深部で終わり、血管の空洞化が観察され、瘢痕組織では細胞成分に比べて線維成分が優勢であったことから、瘢痕は発生の最終段階にあることが示唆された。
【0054】
ベパンテンクリーム投与群において、組織学的評価の中間結果（コントロール群とヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン投与群との間）が得られた。
【0055】
張力測定評価の結果、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンは、コントロール群と比較して（２倍以上の）相当な優位性を示した。
【0056】
実施例５ ラットの熱傷モデルにおける、０.０２％及び０.５％ゲル状ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの有効性を評価した実験結果。
【0057】
熱傷治療におけるヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの局所投与の有効性を、４０匹の非近交系雄ラットを対象としたII-IIIA度熱傷モデルを用いて評価した。ユーラシア経済連合の医薬品安全性試験実施規格及び該当するガイドライン[２０]に従って、被験動物を飼育場に保管した。熱剤として、体積の２／３まで液体パラフィンを充填した適切な直径の平底ガラス容器を使用した。被験動物を４つのグループ（各グループのｎ＝１０）に無作為に割り分けた：第１群をコントロール群とし、他の３つを実験群とした。比較対照としては、組織修復剤として人気の高いベパンテン（デクスパンテノール５％配合の局所クリーム）を使用した。熱傷面積は約４０ｃｍ２で標準化した。
【0058】
熱傷後最初の２０分以内に無菌包帯を適用し、その後ヨードピロンとレボメコールで治療したものをコントロールとして使用した。II群にはベパンテンを投与した。III群はヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを０.０２％局所用ゲルとして、IV群はヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを０.５％局所用ゲルとしてそれぞれ投与した。
【0059】
実験の１、３、５、７、及び１０日目に被験動物の一般的な状態をモニターすることに加えて、治癒過程を平面的に評価した。治癒率は、式Ｖ＝（Ｓ１-Ｓ２）／ｔを用いて決定し、ここでは、Ｓ１＝前回の測定時の創傷面積、Ｓ２＝次回の測定時の創傷面積、ｔ＝前回の測定と次回の測定の間の日数である。
【0060】
結果実験の１日目では、すべての被験動物の一般的な状態は中程度であった。実験３日目には、被験動物の状態が改善され、活動性が高まった。この段階では、研究群間での被験動物の一般的な状態の違いは観察されなかった。
【0061】
面積測定の結果を表４に示す。III群及びIV群（ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンをそれぞれ０.０２％及び０.５％）において、熱傷治癒の統計的に有意な正の変化が顕著であった。実験３日目にはすでに熱傷部位が有意に（コントロール群とベパンテン群の両方と比較して）減少しており、熱傷部位と深さが減少し、結果として創傷治癒の経過がより良好になっていることが特徴であった。III群とIV群の間には統計的に有意な差は認められなかったが、IV群はIII群と比較して数値的に大きな熱傷面積の減少を示した（表４）。
【0062】
平均治癒率を図４に示す。統計的に有意な差は、コントロール群（Ｉ）と、ゲル状ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニン（０.０２％と０.５％の両方）を投与された群との間でのみ検出された。IV群の創傷治癒パラメータは良好であったが、本研究ではサンプル数が少ないため、III群と比較して有意差は認められなかった。その結果、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンを０.０２％又は０.５％ゲルとして使用した場合、熱傷の表面積を減少させ、熱傷の平均治癒率を向上させる効果が顕著に確認された。
【0063】
前臨床実験で得られた結果は、応急処置として、及びその後の中等度の表面熱傷の治療の両方において、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンが高い有効性を有することを証明するものである。この結果は、ヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンが、局所用ゲルまたは局所用薬液の形態で、深部熱傷による皮膚移植のための創傷床調製、及び再生能力の低い患者の栄養性潰瘍の治療にも使用できるという記述を正当化するものである。局所用薬液又は局所用ゲル形態のヘキサペプチドチロシル－Ｄ－アラニル－グリシル－フェニルアラニル－ロイシル－アルギニンの治療濃度範囲は、０.０２～０.５ %である。
【0064】
参考文献
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[20]医薬品の臨床試験に関するガイドラインパート１./ed.A.N.ミロノフモスクワGrifiK,2012.-944p.
【図A】
【図B】
【図C】
【図D】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】