特許 7339309 がん治療のためのナチュラルキラー細胞および組成物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-28

(45)【発行日】2023-09-05

(54)【発明の名称】がん治療のためのナチュラルキラー細胞および組成物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20230829BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230829BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230829BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61K38/20

A61P43/00 121

C12N5/0783

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2021165698

(22)【出願日】2021-10-07

(62)【分割の表示】P 2020541915の分割

【原出願日】2019-01-31

(65)【公開番号】P2022000060

(43)【公開日】2022-01-04

【審査請求日】2022-01-25

(31)【優先権主張番号】10-2018-0012938

(32)【優先日】2018-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2018-0012942

(32)【優先日】2018-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0001981

(32)【優先日】2019-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0001983

(32)【優先日】2019-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】513205259

【氏名又は名称】エヌケーマックス カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＫＭＡＸ ＣＯ．， Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パク，ソンウ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヨンマン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ジェソブ

(72)【発明者】

【氏名】リーイー，ヨンヒ

【審査官】山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１２２１４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５１５５０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５０２７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－００８１９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】Granzin, M. et al.，Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic a，Oncoimmunology，2016年，Vol. 5(9):e1219007，pp. 1-18

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞治療用組成物であって、
治療有効量のＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の少なくとも１つのＮＫ細胞であって、前記細胞治療用組成物におけるＮＫ細胞の純度が、前記細胞治療用組成物における他の細胞と比較して、少なくとも９０％以上である、ＮＫ細胞、
５０～５０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度であるＩＬ－２、ならびに
薬剤的に許容可能な担体
を含み、
前記細胞治療用組成物は、ＮＫ細胞治療を必要とするヒト患者への投与に適した形態である、
組成物。

【請求項2】

前記治療有効量が、ヒト患者の体重のｋｇ当たり、１×１０ ^６ ～１×１０ ^１１ のＮＫ細胞を含むものである、請求項１に記載の細胞治療用組成物。

【請求項3】

細胞組成物を含むバッグであって、
前記組成物が、
ヒト対象の体重のｋｇ当たり、１×１０ ^６ ～１×１０ ^１１ のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、前記ＮＫ細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＣＤ５６＋ＮＫ細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞であって、前記ＮＫ細胞が少なくとも９０％の純度を有している細胞、ただし前記バッグ中における細胞のうち１％未満がＴ細胞である、
５０～５０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度であるＩＬ－２、ならびに
ハルトマン溶液、アルブミン、ＤＭＳＯを含むが、ＩＬ－２１を含まない、薬剤的に許容可能な担体
を含む組成物である、
バッグ。

【請求項4】

前記ＩＬ－２が、５０～１，０００ＩＵ／ｍＬで存在する、請求項１または２に記載の
細胞治療用組成物。

【請求項5】

前記細胞治療用組成物が、ＩＬ－２１を含まないものである、請求項４に記載の細胞治療用組成物。

【請求項6】

前記ＩＬ－２が、５００ＩＵ／ｍＬで存在する、請求項１または２に記載の細胞治療用組成物。

【請求項7】

細胞組成物であって、
ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の少なくとも１つのＮＫ細胞であって、前記細胞組成物におけるＮＫ細胞の純度が、前記細胞組成物における他の細胞と比較して、少なくとも９０％以上である、ＮＫ細胞、
５０～５０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度であるＩＬ－２、ならびに
ＤＭＳＯを含むが、ＩＬ－２１を含まない、薬剤的に許容可能な担体
を含み、
前記細胞組成物は、ヒト患者への投与に適した形態である、
組成物。

【請求項8】

前記ＩＬ－２が、５０～１，０００ＩＵ／ｍＬで存在する、請求項７に記載の細胞組成物。

【請求項9】

ハルトマン溶液をさらに含む、請求項８に記載の細胞組成物。

【請求項10】

アルブミンをさらに含む、請求項９に記載の細胞組成物。

【請求項11】

前記アルブミンが、１％で存在する、請求項１０に記載の細胞組成物。

【請求項12】

前記ＩＬ－２が、５００ＩＵ／ｍＬで存在する、請求項１０に記載の細胞組成物。

【請求項13】

細胞組成物であって、
ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の少なくとも１つのＮＫ細胞であって、前記細胞組成物におけるＮＫ細胞の純度が、前記細胞組成物における他の細胞と比較して、少なくとも９０％以上である、ＮＫ細胞、
５０～５０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度であるＩＬ－２、ならびに
薬剤的に許容可能な担体
を含み、
前記細胞組成物は、ヒト患者への投与に適した形態である、
組成物。

【請求項14】

前記細胞が、少なくとも２４時間貯蔵されたものである、請求項１３に記載の細胞組成物。

【請求項15】

前記細胞が、少なくとも４８時間貯蔵されたものである、請求項１３に記載の細胞組成物。

【請求項16】

前記ＩＬ－２が、ヒトＩＬ－２である、請求項１～１５の何れか一項に記載の細胞治療用組成物、細胞組成物またはバッグ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年２月１日に出願された韓国特許出願第ＫＲ－１０－２０１８－００１２９３８号、２０１８年２月１日に出願された韓国特許出願第ＫＲ－１０－２０１８－００１２９４２号、２０１９年１月７日に出願された韓国特許出願第ＫＲ－１０－２０１９－０００１９８１号、および２０１９年１月７日に出願された韓国特許出願第ＫＲ－１０－２０１９－０００１９８３号の優先権を主張し、これらの全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。

【0002】

本開示は、高純度ナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ヒトの体は、多くの免疫関連細胞、サイトカインなどの化学伝達因子、および同種のものから成る免疫系により協調される免疫応答によって病原体から保護されている。白血球、特にリンパ球は、このような免疫系において重要な役割を果たす。リンパ球は、自然免疫および獲得免疫の両方に関係する。

【0004】

ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、自然免疫細胞の一種であり、がんを非特異的に殺傷し、ウイルス、細菌などを認識して殺傷し、パーフォリンおよびグランザイムなどの酵素で、またはＦａｓ－ＦａｓＬ相互作用により病原体を殺傷することが知られている。がん患者の場合、これらのＮＫ細胞のがん細胞傷害性の低下は、肺がん（Ｃａｒｒｅｇａ
Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２００８：１１２：８６３－８７５）、肝がん（Ｊｉｎｕｓｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．，２００５：４３；１０１３－１０２０）、乳がん、（Ｂａｕｅｒｎｈｏｆｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３：３３：１１９－１２４）、子宮がん（Ｍｏｃｃｈｅｇｉａｎｉ
Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，１９９９：７９：２４４－２５０）、血液がん（Ｔａｊｉｍａ Ｆ．，ｅｔ ａｌ，Ｌｅｋｅｍｉａ １９９６：１０：４７８－４８２）および同種のものなどの様々な種類のがんの発症と関連する。したがって、がん治療のため、ＮＫ細胞のがん細胞傷害性を増大することは望ましい。

【0005】

がん細胞のＮＫ媒介殺傷の治療効果を得るため、大量の高純度ＮＫ細胞を必要とするが、がん患者から大量の血液を得ることは容易ではなく、血液中のＮＫ細胞の比率は小さく、約５～２０％しかない。したがって、免疫療法薬としてＮＫ細胞を使用することは難しかった。

【0006】

結果として、ＮＫ細胞のみを効率的に拡大および増殖することが望ましいが、ＮＫ細胞増殖の従来の方法では、様々な高価なサイトカインを高濃度で使用する必要があり、したがって、対応する治療は一部の経済的に安定した患者にしか利用できない。更に、ＮＫ細胞増殖の従来の方法によれば、他の種類（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、その他）の免疫細胞はＮＫ細胞と共に存在し得、Ｔ細胞を含むＮＫ細胞の同種投与は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得、血液型不適合対象へのＢ細胞を含むＮＫ細胞の同種投与はパッセンジャーＢリンパ球症候群を引き起こし得、したがって、抗がん効果は最大限に高められない。

【0007】

更に、ＮＫ細胞の拡大および増殖に加えて、拡大および増殖されたＮＫ細胞を実際に使用するまで、ＮＫ細胞の機能を高度に維持することが望ましい。結果として、ＮＫ細胞増殖を促進、ＮＫ細胞由来のＴＮＦ－、ＩＮＦ－およびＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインの
産生を増加、ならびにＮＫ細胞のがん細胞傷害性の増大を可能とする組成物の開発が探求されている。

【発明の概要】

【0008】

本願は、高純度ナチュラルキラー細胞の製造方法ならびに高純度ナチュラルキラー細胞およびサイトカインを含むがんを治療するための細胞治療用組成物に関する。本明細書で開示されているいずれかの特徴、構造、またはステップは、本明細書で開示されている他の特徴、構造、またはステップで置き換えてもよく、これと組み合わせてもよく、省略してもよい。更に、本開示を要約する目的のため、本発明の特定の態様、利点、および特徴を本明細書に記載している。本明細書に開示されている本発明のいずれかの特定の実施形態により、必ずしもいずれかまたは全てのかかる利点を達成するとは限らないと理解されるべきである。本開示の個々の態様は必須でも不可欠でもない。

【0009】

ある実施形態では、ナチュラルキラー細胞の製造方法を開示する。方法は、血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離すること、ＰＢＭＣからＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の少なくとも１つを単離すること、ならびにサイトカインの存在下フィーダー細胞の組合せと共にＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の少なくとも１つを共培養することを含む。

【0010】

特定の実施形態では、ＰＢＭＣからＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の少なくとも１つを単離することを、ＣＤ５６マイクロビーズおよびＣＤ３マイクロビーズの少なくとも１つを使用することによって行う。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＧＦ １およびこれらの組合せから成る群から選択される。特定の実施形態では、サイトカインを、５０～１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で添加してもよい。

【0011】

特定の実施形態では、フィーダー細胞の組合せは、照射ジャーカット細胞および照射エプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ球継代株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞を含む。バリエーションにおいて、照射ジャーカット細胞と照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞との比は、約１：０．１～５であってもよい。照射ジャーカット細胞および照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞の各々を、５０～５００Ｇｙ（グレイ）の照射によって得てもよい。

【0012】

特定の実施形態では、共培養は、１～５０日間の共培養を含んでもよい。

【0013】

特定の実施形態では、方法は、第一期間、第一サイトカインの存在下、フィーダー細胞の組合せと共にＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の少なくとも１つを共培養すること、ならびにその後、第二期間、第二サイトカインの存在下、前記フィーダー細胞の組合せと共にＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の少なくとも１つを共培養することを更に含んでもよい。バリエーションにおいて、第二期間の０～６日目の間、第二サイトカインを１回以上添加してもよい。第二期間、１４日サイクル毎の最初の６日間に、第二サイトカインを１回以上添加してもよい。第一サイトカインは、ＩＬ－２であってもよい。第二サイトカインは、ＩＬ－２１であってもよい。第二サイトカインを、１０～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加してもよい。

【0014】

特定の実施形態では、ＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の少なくとも１つならびにフィーダー細胞の組合せを、約１：１～１００のフィーダー細胞に対するＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の比で共培養する。

【0015】

特定の実施形態では、方法によって製造された組成物を開示する。

【0016】

ある実施形態では、それを必要とする患者のがんを治療するための組成物を開示する。組成物は：有効量の末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞、５０～５０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２、および薬剤的に許容可能な担体を含み、該有効量は患者体重のｋｇ当たり約１×１０^６～５×１０^８の細胞の範囲であり、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞は少なくとも約９０％の純度である。

【0017】

特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＳＣＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＧＦ １およびこれらの組合せから成る群から選択され得る。バリエーションにおいて、サイトカインは、ＩＬ－２であってもよい。サイトカインは、５０～５０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度を有してもよい。

【0018】

特定の実施形態では、がんは、血液がん、胃がん、膵がん、胆管がん、結腸がん、乳がん、肝がん、卵巣がん、肺がん、腎がん、前立腺がんおよび神経芽細胞腫から成る群から選択される。

【0019】

特定の実施形態では、組成物は、約１％未満のＴ細胞を含む。

【0020】

様々な実施形態を例証する目的のため附属の図面に示すが、実施形態の範囲に限定するものと決して解釈すべきでない。さらに、種々の開示されている実施形態の様々な特徴を組み合わせて更なる実施形態を生成することができるが、これも本開示の一部である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】図１Ａは、ＰＢＭＣ、ＣＤ５６＋細胞、およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞から製造されたＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図1B】図１Ｂは、ＩＬ－２１での処置あり又はなしのＰＢＭＣおよびＣＤ５６＋細胞から製造されたＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図2】図２は、ＩＬ－２１での処置あり又はなしのＰＢＭＣまたはＣＤ５６＋細胞から製造されたＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純度を示すグラフを図示する。

【図3】図３は、ＮＫ細胞の抗がん活性を分析するためのプレートデザインを示す。

【図4A】図４Ａは、様々なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比に対する、ＰＢＭＣおよびＣＤ５６＋細胞から製造されたＮＫ細胞の短期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図4B】図４Ｂは、ＡＧＳ、Ａ５４９、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する、ＰＢＭＣおよびＣＤ５６＋細胞から製造されたＮＫ細胞の長期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図5A】図５Ａは、様々な期間、ＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図5B】図５Ｂは、様々な期間、ＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図6】図６は、様々な濃度のＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図7A】図７Ａは、様々なＥ：Ｔ比に対する、様々な期間、ＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の短期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図7B】図７Ｂは、ＡＧＳ、Ａ５４９、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する、様々な期間、ＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の長期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図7C】図７Ｃは、ＡＧＳ、Ａ５４９、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する、様々な期間、ＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の長期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図8A】図８Ａは、様々なＥ：Ｔ比に対する、様々な期間、ＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の短期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図8B】図８Ｂは、ＡＧＳ、Ａ５４９、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する、様々な濃度を有するＩＬ－２１での処置によって製造されたＮＫ細胞の長期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図9】図９は、フィーダー細胞刺激がある場合のＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図10A】図１０Ａは、ＩＬ－２１での処置あり又はなしのがん患者のＰＢＭＣから製造されたＮＫ細胞の細胞増殖率を示すグラフを図示する。

【図10B】図１０Ｂは、ＩＬ－２１での処置あり又はなしのがん患者のＰＢＭＣから製造されたＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純度を示すグラフを図示する。

【図10C】図１０Ｃは、Ｋ５６２細胞に対するＩＬ－２１の処置あり又はなしのＰＢＭＣから製造されたＮＫ細胞の短期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図10D】図１０Ｄは、ＡＧＳ、Ａ５４９、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する、ＩＬ－２１の処置あり又はなしのＰＢＭＣから製造されたＮＫ細胞の長期細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図11】図１１は、ＩＬ－２での処置あり又はなしのＮＫ細胞の生存率を示すグラフを図示する。

【図12】図１２は、様々なＥ：Ｔ比における様々ながん細胞に対する、ＩＬ－２での処置あり又はなしのＮＫ細胞の細胞傷害性を示すグラフを図示する。

【図13】図１３は、ＩＬ－２での処置あり又はなしのＮＫ細胞を用いて治療された残りのＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３細胞の写真を示す。

【図14】図１４は、ＩＬ－２での処置あり又はなしのＮＫ細胞を用いて治療された残りのＡＧＳ細胞の写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

高価なサイトカインを使用しない高純度ＮＫ細胞の製造方法を、本発明者らは開発した。本発明者らは、ＣＤ５６＋細胞を末梢血単核細胞から単離した後、末梢血単核細胞から単離されたＣＤ５６＋細胞をサイトカインの存在下でフィーダー細胞と共に共培養する場合、高純度ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造することができることを見出した。さらに、本発明者らは、同種治療に効果的に使用することができるＮＫ細胞を含むがんを治療するための細胞治療用組成物を開発した。結果として、本発明者らは、末梢血単核細胞から単離されたＣＤ５６＋ＮＫ細胞へ特定のサイトカインを添加する場合、高い生存率および高い抗がん活性を示すことを見出した。したがって、本発明者らは、ＮＫ細胞の増殖方法を開発およびサイトカインと共に増殖された末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を含むがん治療のための細胞治療用組成物を提供することを探求した。

【0023】

いくつかの実施形態によれば、高純度ＮＫ細胞の製造方法は：血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離すること（「第一単離ステップ」）と、末梢血単核細胞からＣＤ５６＋細胞およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞から成る群から選択される細胞を単離すること（「第二単離ステップ」）と、サイトカインの存在下フィーダー細胞と共にＣＤ５６＋細胞およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞から成る群から選択される細胞を共培養すること（「培養ステップ」）とを含んでもよい。本明細書において、各ステップを更に詳細に説明する。開示されている方法により製造されたＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ５６＋細胞を単離しないで末梢血単核細胞から製造されたＮＫ細胞と比較して、より高純度およびより高い抗がん活性だけでなく、種々の表面マーカーまたは活性化された受容体、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ２６６、ＣＤ２４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ２Ｓ、ＫＩＲ３Ｓ、Ｌｙ９４Ｄ、ＮＣＲｓ、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－ｂ，ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ
１、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ５７から１つ以上を有するなど、他の顕著な特性を示し得る。

【0024】

第一単離ステップ
本明細書では、「血液サンプル」は、これに限定されないが、末梢血の全血または白血球アフェレーシスを使用して末梢血から単離された白血球であってもよい。更に、末梢血を、健常人、がんのリスクのある患者、またはがん患者から得てもよいが、末梢血の供給源はこれに限定されない。

【0025】

本明細書では、用語「白血球アフェレーシス」は、採取された血液から白血球を選択的に除き（単離し）、次いで、再び患者に該血液を与える方法を表すことができ、いくつかの実施形態では、方法により単離された白血球をフィコール－ハイパック密度勾配法など、追加の方法なしで使用してもよい。

【0026】

本明細書では、用語「末梢血単核細胞」は「ＰＢＭＣ」、「単核細胞」または「単球」と互換的に使用してよく、抗がん免疫療法に一般的に使用される末梢血から単離された単核細胞を表すことができる。末梢血単核細胞を、フィコール－ハイパック密度勾配法などの公知の方法を使用して採取されたヒト血液から得てもよい。

【0027】

いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞は自己由来であってもよいが、同種末梢血単核細胞を、本明細書に記載されている方法により抗がん免疫療法用に高純度ＮＫ細胞を製造するために使用してもよい。更に、いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞を健常人から得てもよいが、末梢血単核細胞をがんのリスクを有する患者および／またはがん患者から得てもよい。

【0028】

本明細書では、用語「ＣＤ５６＋細胞」は「ＣＤ５６＋ＮＫ細胞」、または「ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞」と互換的に使用してよく、用語「ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞」は「ＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞」と互換的に使用してもよい。ＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞としては、細胞表面上のＣＤ５６糖タンパク質が発現される細胞、または更にＣＤ３糖タンパク質が発現されないが、ＣＤ５６糖タンパク質が発現される細胞を挙げることができる。同じ型の免疫細胞でさえ、細胞表面に結合したＣＤ型及び発現率の差異を有し得、したがってその機能は異なり得る。

【0029】

第二単離ステップ
いくつかの実施形態では、血液サンプルからのＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞の単離を、ＣＤ５６マイクロビーズおよびＣＤ３マイクロビーズマイクロビーズから成る群から選択される少なくとも１つを使用する単離方法、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、フローサイトメトリー細胞ソーター、その他などの装置を使用する単離方法によって行ってもよい。

【0030】

例えば、ＣＤ５６マイクロビーズおよび／またはＣＤ３マイクロビーズを使用する単離方法を、ＰＢＭＣへＣＤ５６マイクロビーズを添加してから非特異的結合を取り除くことによって行ってもよく、ＰＢＭＣへＣＤ３マイクロビーズを添加して特異的結合を取り除いてから再度ＣＤ５６マイクロビーズを添加して非特異的結合を取り除くことによって行ってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣからＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を単離することにより、Ｔ細胞または他の非ナチュラルキラー細胞を取り除いてもよい。

【0031】

培養ステップ
本明細書では、用語「サイトカイン」は、末梢血単核細胞がＮＫ細胞に分化するように誘発するために使用することができる免疫活性化合物を表すことができる。

【0032】

いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、ＩＬ－１８、ＩＬ－４、Ｉ型インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ １）であり得るが、これらに限定されない。

【0033】

いくつかの実施形態では、サイトカインを、５０～１，０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５５０、１００～５５０、１５０～５５０、２００～５５０、２５０～５５０、３００～５５０、３５０～５５０、４００～５５０、４５０～５５０ＩＵ／ｍＬの濃度で使用してもよい。ＮＫ細胞の従来の増殖方法は、様々なサイトカインの高濃度を利用する。逆に、本明細書に記載されているＮＫ細胞の増殖方法のいくつかの実施形態では、２つの型のフィーダー細胞を高純度ＣＤ５６＋細胞と共に使用してもよいので、高収率および高純度を有するＮＫ細胞を低い濃度の１つのサイトカインのみを使用して増殖してもよい。

【0034】

本明細書では、用語「フィーダー細胞」は、分裂および増殖しないが、代謝活性を有して様々な代謝産物を産生し、したがって、標的細胞の増殖の助けとなる細胞を表すことができる。

【0035】

いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、照射ジャーカット細胞、照射エプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ球継代株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）細胞、およびＰＢＭＣ、ＨＦＷＴ、ＲＰＭＩ １８６６、Ｄａｕｄｉ、ＭＭ－１７０、Ｋ５６２またはＫ５６２を標的にすることにより遺伝子的に改変された細胞（例えば、Ｋ５６２－ｍｂＩＬ－１５－４１ＢＢリガンド）から成る群から選択される少なくとも１つであってもよい。例えば、１つの実施形態では、フィーダー細胞は、照射ジャーカット細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞であってもよい。

【0036】

本明細書では、用語「ジャーカット細胞」または「ジャーカット細胞株」は、米国サンフランシスコのカリフォルニア大学のＡｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓ博士により開発された血液がん（不死化急性Ｔ細胞白血病）細胞株を表すことができる。様々なケモカイン受容体が発現され、ＩＬ－２を産生することができるジャーカット細胞は、通常、ナチュラルキラー細胞活性化阻害剤であるＭＨＣクラスＩがその細胞表面上で高度に発現されるので、抗がん免疫療法のためのフィーダー細胞の可能性がある候補と見做されなかった。ジャーカット細胞を、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）から得ることができる。

【0037】

本明細書では、用語「ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞」または「ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞株」は、エプスタイン・バーウイルス形質転換リンパ球継代株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）（Ｄ．Ｍ．Ｋｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９３：９１：９６１－９６８）を表し、試験管中でヒトＢ細胞にエプスタイン・バーウイルスを感染させることにより製造されるＢ細胞である。ＰＢＭＣ中ＥＢＶを感染させる方法においてシクロスポリンＡを添加する方法によって、一般的な研究室においてＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を直接的に製造して使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を次のステップにより製造してもよい。９ｍＬの培養培地に３０×１０^６のＰＢＭＣを添加し、Ｔ２５培養フラスコ内に混合物を添加してから、９ｍＬのＥＢＶ上澄み液を添加する。８０μＬのシクロスポリンＡ（５０μｇ／ｍＬ）を添加してから、３７℃で培養する。培養７日後、上澄み液の半分を除き、新しい培養培地を添加してから、４０μＬのシクロスポリンＡを添加する。培養２８日まで、７日毎に１回、同じ方法を反復してもよい。培養２８日後、細胞株は使用可能であり得、この時点から、シクロスポリンＡを添加しないで培養培地中で細胞株を培養してもよい。

【0038】

ジャーカット細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を、照射後にフィーダー細胞として使用してよい。

【0039】

いくつかの実施形態では、照射ジャーカット細胞および照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、１：０．１－５、１：０．１－４、１：０．１－３、１：０．１－２、１：０．１－１．５、１：０．５－１．５、１：０．７５－１．２５、０．１－５：１、０．１－４：１、０．１－３：１、０．１－２：１、０．１－１．５：１、０．５－１．５：１または０．７５－１．２５：１の含有率比で含まれてもよい。例えば、照射ジャーカット細胞および照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞は、１：１の含有比率で含まれてもよい。

【0040】

いくつかの実施形態では、照射ジャーカット細胞および照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１５０、７０～１３０、８０～１２０または９０～１１０Ｇｙの照射での処置により得てもよい。例えば、照射ジャーカット細胞および／または照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を、１００Ｇｙの照射でジャーカット細胞および／またはＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を処置することによって得てもよい。

【0041】

いくつかの実施形態では、１～５０、１～４２、１～４０、１～３５、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５または１～１４日間、培養を行ってもよい。

【0042】

いくつかの実施形態では、培養ステップは、次のステップ：フィーダー細胞および第一サイトカインを共培養すること（「第一培養ステップ」）、および第二サイトカインを添加後更に共培養すること（「第二培養ステップ」）を更に含んでもよい。

【0043】

第二培養ステップは、培養０～６日目の間に１回以上第二サイトカインの添加を含んでもよい。例えば、第二培養ステップは、培養０日目および３日目にそれぞれ１回、第二サイトカインの添加を含んでもよい。

【0044】

第二培養ステップは、培養１４日サイクルの最初の６日間に第二サイトカインおよびフィーダー細胞の添加を含んでもよい。例えば、第二培養ステップは、１４日サイクル中にフィーダー細胞の添加、ならびにサイクル毎に１回、各サイクルの３日目および６日目に第二サイトカインの添加を含んでもよい。

【0045】

いくつかの実施形態では、第一サイトカインは、ＩＬ－２であってもよい。いくつかの実施形態では、第二サイトカインは、ＩＬ－２１であってもよい。いくつかの実施形態では、第二サイトカインを、１０～１０００、１０～５００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００または１０～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用してもよい。いくつかの実施形態では、０～６日目に１回以上第二サイトカインを添加する培養は、優れた増殖および／または抗がん活性を示し得る。いくつかの実施形態では、１４日サイクル中の６日間にフィーダー細胞および第二サイトカインを添加する培養は、優れた増殖および／または抗がん活性を示し得る。

【0046】

いくつかの実施形態では、１：１～１００、１：１～９０、１：１～８０、１：１～７０、１：１０～６５、１：２０～６５、１：３０～６５、１：４０～６５、１：５０～６５または１：５５～６５の混合比で末梢血単核細胞およびフィーダー細胞（例えば、ジャーカット細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）を含むことによって、共培養を行ってもよい。

【0047】

共培養を培地で行うことができ、当技術分野においてＮＫ細胞に対して末梢血単核細胞を誘発および増殖のために通常使用されるいずれもの適切な培地をかかる培地として限定されることなく使用してもよい。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０、ＤＭＥＭ、ｘ－ｖｉｖｏ
１０、ｘ－ｖｉｖｏ２０、またはｃｅｌｌｇｒｏ ＳＣＧＭ培地をかかる培地として使用してもよい。加えて、温度などの培養条件は、当技術分野において公知の末梢血単核細胞のいずれかの適切な培養条件に従ってもよい。

【0048】

いくつかの実施形態では、産生されたＮＫ細胞内で、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の比または純度は、全細胞に対して８５％以上、９０％以上、または９５％以上、または９８％以上であってもよい。いくつかの実施形態では、産生されたＮＫ細胞内で、全細胞に対するＴ細胞の比は、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下であってもよい。

【0049】

がん治療のための細胞治療用組成物
いくつかの実施形態によれば、がん治療のための細胞治療用組成物は、末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびサイトカインを含んでもよい。

【0050】

本明細書では、用語「末梢血由来」は、細胞が「末梢血の全血」または「白血球アフェレーシスをして末梢血から単離された白血球」由来であることを意味する。末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞と互換的に使用してもよい。

【0051】

いくつかの実施形態では、サイトカインを、１８～１８０，０００、２０～１００，０００、５０～５０，０００、５０～１，０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５５０、１００～５５０、１５０～５５０、２００～５５０、２５０～５５０、３００～５５０、３５０～５５０、４００～５５０、４５０～５５０ＩＵ／ｍＬの濃度で使用してもよい。サイトカインをこれらの範囲で使用する場合、がん治療組成物中に含まれるＮＫ細胞のアポトーシスを抑制し、ＮＫ細胞の抗がん活性を増大し得る。

【0052】

いくつかの実施形態では、組成物は、サイトカインとしてＩＬ－２を含んでもよい。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、本明細書において他所に記載されているように得てもよい。例えば、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、フィーダー細胞（例えば、照射ジャーカット細胞および照射ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共に共培養することによって得てもよい。いくつかの実施形態では、全細胞に対するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の比（純度）は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上であってもよい。

【0054】

いくつかの実施形態では、がんは、血液がん、胃がん、膵がん、胆管がん、結腸がん、乳がん、肝がん、卵巣がん、肺がん、腎がん、前立腺がんまたは神経芽細胞腫であってもよいが、これらに限定されない。

【0055】

いくつかの実施形態では、組成物はＴ細胞を含まなくてもよく、微量のＴ細胞のみを含んでもよい。例えば、組成物における全細胞に対するＴ細胞の比は、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％以下未満であってもよい。

【0056】

本明細書では、用語「Ｔ細胞」は、以前に出会った抗原を「記憶」し、Ｂ細胞に情報を提供し、それにより、抗体の産生を亢進して細胞免疫系において重要な役割を果たすことができる、胸腺由来のリンパ球を表す。これらのＴ細胞は種々の抗原の中で非常に小さな差異を識別して同種抗原に対する免疫応答を誘発するので、自己治療は可能であるが、同種治療のために使用される限度があり得る。したがって、Ｔ細胞を含まない細胞治療用組成物は、同種移植に適切であり得る。

【0057】

本明細書では、用語「細胞治療薬」は、増殖などの一連の作用により治療、診断、およ
び予防のために、ならびに他の方法によって細胞および組織の機能を回復または細胞の生物学的特性を変更するためにインビトロでの自己、同種、および異種間生細胞のスクリーニングのために使用される医薬を表す。細胞治療薬は、米国において１９９３年から、韓国において２００２年から医薬品として規制されている。これらの細胞治療薬は、二分野に大きく分類され得、すなわち、第一は、組織再生または臓器機能回復のための幹細胞治療薬であり、第二は、インビボでの免疫応答の阻害または免疫応答の増強などの免疫応答の調節のための免疫細胞治療薬である。

【0058】

本明細書に記載されている細胞治療用組成物の投与経路は、組成物が標的組織に到達する限り、いずれもの適切な経路であってもよい。投与は、非経口投与、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または皮内投与であってもよいが、これらに限定されない。

【0059】

本明細書に記載されている細胞治療用組成物を、細胞治療に適したまたは通常は使用される薬剤的に許容可能な担体と共に、適切な形態で製剤してもよい。「薬剤的に許容可能な」は、生理学的に許容可能であり、ヒトの体に投与された場合に、胃腸疾患、眩暈、もしくは同種のものなどのアレルギー反応、またはそれに類似の反応を通常は引き起こさない組成物を表す。薬剤的に許容可能な担体としては、例えば、水、適切な油、生理食塩水、水性グルコースおよびグリコール、および同種のものなどの非経口投与用担体を挙げることができ、安定剤および防腐剤を更に挙げることができる。適切な安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸、ショ糖、アルブミンなどが挙げられる。適切な防腐剤としては、ＤＭＳＯ、グリセロール、エチレングリコール、ショ糖、トレハロース、デキストロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0060】

細胞治療用組成物を、細胞治療薬を標的細胞に移動し得るいずれものデバイスにより投与してもよい。

【0061】

細胞治療用組成物は、疾病の治療のための細胞治療薬の治療有効量を含んでもよい。用語「治療有効量」は、研究者、獣医師、内科医、または他の臨床医により見做される組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発し、治療しようとする疾病または障害の徴候の緩和を誘発する量を含む、有効成分または細胞治療用組成物の量を意味する。細胞治療用組成物中に含まれる細胞治療薬を所望の効果に応じて変更してもよいことは、当業者には明白であろう。したがって、細胞治療薬の最適含有率は、当業者により容易に決定してよく、疾病の種類、疾病の重症度、組成物中に含まれる他成分の含有率、製剤の種類、ならびに年齢、体重、一般的健康状態、性別および患者の食事、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、ならびに同時に使用される薬物を含む様々な因子に応じて調節してもよい。全ての因子を考慮することにより副作用のない最少量によって最大効果を得ることができる量を含むことが重要である。例えば、細胞治療用組成物は、体重ｋｇ当たり１×１０^６～５×１０^８細胞の細胞治療薬を含んでもよい。

【0062】

がんの予防または治療方法
更に、本発明の別の態様によれば、がんの予防または治療方法を提供し、方法は、末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞およびサイトカインを含む抗がん用細胞治療用組成物を対象に投与することを含む。用語「対象」は、治療、観察、または試験のための対象である哺乳類、好ましくはヒトを表す。対象は、これらに限定されないが、血液がん、胃がん、膵がん、胆管がん、結腸がん、乳がん、肝がん、卵巣がん、肺がん、腎がん、前立腺がんまたは神経芽細胞腫の患者であってもよい。

【0063】

いくつかの実施形態では、成人の場合、細胞治療用組成物を、１日１回～数回、投与してもよい。細胞治療用組成物を毎日または２～１８０日間隔で投与してよく、組成物中に
含まれる細胞治療薬は、１×１０^６～１×１０^１１の末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞、例えば、体重ｋｇ当たり約１×１０^６～１×１０^８のＮＫ細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞治療用組成物中の末梢血由来ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞は、少なくとも約９０％の純度である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、約５０～５０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲の濃度のＩＬ－２である。

【0064】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞治療用組成物を、直腸、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、局所、眼内、または皮内経路による投与など、いずれもの適切な方法によって投与してもよい。いくつかの実施形態では、組成物中に含まれるＮＫ細胞は同種であってもよい、すなわち、治療される対象以外のヒトから得てもよい。いくつかの実施形態では、ヒトは健常人またはがん患者であってもよい。いくつかの実施形態では、組成物中に含まれるＮＫ細胞は自己であってもよい、すなわち、治療される対象から得てもよい。

【0065】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＮＫ細胞および本明細書に開示されているＮＫ細胞を含む細胞治療用組成物を、がん以外の疾病または病態の治療のために使用してもよい。ＮＫ細胞は、例えば、Ｔ細胞の調節による免疫系の調節に重要な役割を果たし、したがって、ＮＫ細胞を有する細胞治療用組成物を投与して免疫系に関連する病態を治療することが報告されている。例えば、細胞治療用組成物を投与して神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）または自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、脊椎関節症、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、全身性硬化症）を治療してもよい。

【0066】

有利な効果
本発明の特徴および利点は次のように要約される：

【0067】

（ａ）本発明は、ナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。

【0068】

（ｂ）ナチュラルキラー細胞の製造方法によれば、Ｔ細胞などを取り除いた高純度ナチュラルキラー細胞を様々な高価なサイトカインを使用しないで製造することができるので、がんの予防および治療、特に、ナチュラルキラー細胞を使用する同種治療の効果を増強することが可能である。

【0069】

（ｃ）本発明は、末梢血由来ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびサイトカインを含む抗がんのための細胞治療用組成物に関する。

【0070】

（ｄ）本発明の組成物は、最小限（例えば、約１％未満）のＴ細胞と共に高純度ナチュラルキラー細胞を含み、したがって、組成物を、自己治療だけでなく同種治療に効果的に使用してもよい。

【実施例】

【0071】

次の実施例を提供し、特定の具体的特徴および／または実施形態を例証する。これらの実施例は、本開示を、記載されている特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきでない。

【0072】

実施例１．ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の製造
ＣＤ５６＋細胞およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を、次の方法によってＰＢＭＣから単離した。第一に、ＰＢＭＣをフィコール－ハイパック密度勾配法を使用して血液から単離してから、細胞を計数した。

【0073】

実施例１－１．ＣＤ５６＋細胞製造のための調製
計数されたＰＢＭＣをＭＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ＋０．５％ＨＳＡ）と共に添加し、懸濁し、ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）と共に添加し、１．０×１０^７のＰＢＭＣ当たり１～２０μＬとし、それから、２～８℃で５～３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＡＣＳバッファーを添加し、混合してから、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後、上澄み液を取り除き、ＭＡＣＳバッファーを添加することにより細胞を懸濁し、ＭＡＣＳセパレーターを連結したカラムに添加した。ＭＡＣＳバッファーはカラムを通過し、非特異的結合を除去した。カラムをＭＡＣＳセパレーターから分離し、１５ｍＬコニカルチューブに移してから、ＭＡＣＳバッファーと共に添加してカラムに結合したＣＤ５６＋細胞を単離した。

【0074】

実施例１－２．ＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞製造のための調製
計数されたＰＢＭＣをＭＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ±０．５％ＨＳＡ）と共に添加し、懸濁し、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）と共に添加し、１．０×１０^７のＰＢＭＣ当たり１～２０μＬとし、それから、２～８℃で５～３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＡＣＳバッファーを添加し、混合してから、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後、上澄み液を取り除き、ＭＡＣＳバッファーを添加することにより細胞を懸濁し、ＭＡＣＳセパレーターを連結したカラムに添加した。ＭＡＣＳバッファーはカラムを通過し、ＣＤ３－細胞を集めた。計数されたＣＤ３－細胞をＭＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ＋０．５％ＨＳＡ）と共に添加し、懸濁し、ＣＤ５６マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）と共に添加し、１．０×１０^７のＣＤ３－細胞当たり１～２０μＬとし、それから、２～８℃で５～３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＡＣＳバッファーを添加し、混合してから、混合物を遠心分離（６００×ｇ）して細胞を沈殿させた。遠心分離後、上澄み液を取り除き、ＭＡＣＳバッファーを添加することにより細胞を懸濁し、ＭＡＣＳセパレーターを連結したカラムに添加した。ＭＡＣＳバッファーはカラムを通過し、非特異的結合を除去した。カラムをＭＡＣＳセパレーターから分離し、１５ｍＬコニカルチューブに移してから、ＭＡＣＳバッファーと共に添加してカラムに結合したＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を単離した。

【0075】

実施例１－３．ＣＤ５６＋細胞およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を使用するＮＫ細胞の製造
実施例１－１および１－２のようにＰＢＭＣから単離されたＣＤ５６＋細胞またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞を、１００Ｇｙ放射線で照射されたフィーダー細胞（ジャーカット細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）の調製された組合せと共に５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２と共に添加されたＦＢＳ１０％を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中に添加し、それから、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーター内で共培養した。（ＣＤ５６＋細胞および／またはＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞）：（ジャーカット細胞）：（ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）の比は、約１：３０：３０であった。

【0076】

一方、ジャーカット細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）から得てもよく、ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を次の方法により調製した：３０×１０^６のＰＢＭＣを９ｍＬの培養培地に添加し、混合物をＴ２５培養フラスコに添加してから、９ｍのＥＢＶ上澄み液を添加した。８０μＬのシクロスポリンＡを添加してから、３７℃で培養した。培養７日後、上澄み液の半分を除き、新しい培養培地を添加してから、４０μＬのシクロスポリンＡを添加した。培養２８日まで、７日毎に１回、７日目に同じ方法を反復した。培養２８日後、細胞株は使用可能であり、この時点から、シクロスポリンＡを添加しないで培養培地中で細胞株を培養した。

【0077】

実施例２．ＣＤ５６＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＩＬ－２／ＩＬ－２１処置）の製造
ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）の代わりにＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）を添加したこと以外、実施例１（１－１～１－３）と同じ方法を使用してＮＫ細胞を製造した。

【0078】

比較例１．ＣＤ５６＋細胞単離ステップ（ＩＬ－２処置）を有しないナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の製造
フィコール－ハイパック密度勾配法を使用して血液からＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、１００Ｇｙ放射線で照射された調製されたフィーダー細胞（ジャーカット細胞およびＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）と共に５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２と共に添加されたＦＢＳ１０％を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中に添加し、それから、３７℃、５％ＣＯ_２においてインキュベーター内で共培養した。

【0079】

比較例２．ＣＤ５６＋細胞単離ステップ（ＩＬ－２／ＩＬ－２１処置）を有しないナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の製造
ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）の代わりにＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）の添加以外、比較例１と同じ方法を使用してＮＫ細胞を製造した。

【0080】

比較例３および４．ＣＤ５６＋細胞単離ステップを有しないナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の製造
ＰＢＭＣ：（ジャーカット細胞）：ＥＢＶ－ＬＣＬ細胞）の比が１：０．５：０．５であること以外、それぞれ、比較例１および２と同様な方法を使用してＮＫ細胞を製造した。

【0081】

実験例１．ＮＫ細胞の増殖能の確認
実施例１、２および比較例１、２によるＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、Ｔ２５培養フラスコ内の培養６日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養した。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養した。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養した。

【0082】

図１Ａは、培養中のＮＫ細胞の倍増加（fold increase）を図示する。図１Ａおよび下
表１に示されるように、実施例１のＣＤ５６＋ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋）は、０日目と比較して１７日目に、それぞれ、２６７５倍および１９０３倍増殖したが、比較例１のＰＢＭＣ細胞は０日目と比較して１７日目に１７６８倍増殖した。

【表1】

【0083】

図１Ｂは、ＮＫ細胞の倍増加および集団倍加数（ＰＤＬ）を図示する。更に、図１Ｂに示されているように、比較例１（ＩＬ－２１なしのＰＢＭＣ）および比較例２（ＩＬ－２１ありのＰＢＭＣ）のＰＢＭＣは、０日目と比較して、それぞれ、２４３倍および１２４８倍増殖したが、実施例１（ＩＬ－２１なしのＣＤ５６）および実施例２（ＩＬ－２１ありのＣＤ５６）のＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、０日目と比較して、それぞれ、２９９０倍および２０４３４倍増殖した。

【0084】

実験例２．ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純度の確認
実施例１、２および比較例１、２のＮＫ細胞をＦＡＣＳ染色バッファーで１回洗浄し、１００μＬ中に懸濁してから、蛍光に結合するモノクローナル抗体と混合した後、暗状態下２０～３０分間２～８℃で貯蔵した。１回更なる洗浄後、細胞を、３００～５００μＬのＦＡＣＳ染色バッファー中に懸濁してから、チューブ当たり１０，０００～１００，０００細胞を得て、フローサイトメーターのＣＤ５６－ＦＩＴＣ／ＣＤ３－ＰＥ／ＣＤ２０－ＰｅｒＣＰ５／ＣＤ１４－ＡＰＣパネルを使用することにより分析した。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純度は、ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティング後ＣＤ３－／ＣＤ５６＋領域に導入された細胞の比と定義され、ＣＤ２０およびＣＤ１４はＣＤ３－／ＣＤ５６＋領域における細胞内で発現されなかったことを更に確認した。

【0085】

図２に示されているように、比較例１（ＩＬ－２１なしのＰＢＭＣ）および比較例２（ＩＬ－２１ありのＰＢＭＣ）のＮＫ細胞の純度は、それぞれ、８４．２％および８４．７％であったが、実施例１（ＩＬ－２１なしのＣＤ５６）および実施例２（ＩＬ－２１ありのＣＤ５６）のＮＫ細胞の純度は、それぞれ、９８．６％および９９．２％であった。

【0086】

実験例３．ＮＫ細胞のがん細胞傷害性の確認
第一に、慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞（血液がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－２４３（商標））に対する細胞傷害性を確認した。

【0087】

実験で使用される前に、Ｋ５６２細胞を、７日以上の間に３日の間隔で３７±１℃において、ＦＢＳ １０％を含むＲＰＭＩ １６４０培地中に懸濁されたＫ５６２細胞の継代培養によって製造した。

【0088】

製造されたＫ５６２細胞を１．０×１０^６細胞／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ－１６４０培地中に懸濁し、４μＭの濃度で蛍光物質（カルセイン－ＡＭ）と共に添加した。Ｋ５６２細胞を３７±１℃、３０分間染色してから、１０分の間隔で反転した。蛍光物質で染色されたＫ５６２細胞を３，３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、３回洗浄してから、１．０×１０^６細胞／ｍＬの比でＦＢＳ １０％を含むＳＮＫ培地中に懸濁した。Ｋ５６２細胞を、ウェル当たり１．０×１０^４細胞の量で丸底マイクロウェルプレート（９６ウェル）中に接種した。

【0089】

培養１４～２０日目の実験例１のＮＫ細胞（エフェクター細胞）を懸濁し、それぞれ、１．０×１０^６細胞／ｍＬ、３．０×１０^５細胞／ｍＬ、１．０×１０^５細胞／ｍＬおよび０．５×１０^５細胞／ｍＬの比でＦＢＳ １０％を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中に希釈した。

【0090】

それぞれ、各３ウェル（三重反復）に対してウェル当たり１００μＬの濃度で標的細胞（Ｋ５６２細胞）を接種したプレートに、希釈されたエフェクター細胞を接種した。この場合、エフェクター細胞および標的細胞の比は、下表２に示す。

【表2】

【0091】

本実験に使用されたプレートデザインを図３に示しており、ネガティブコントロール群（自然）では、蛍光染色Ｋ５６２生細胞を添加し、ポジティブコントロール群（最大放出）では、Ｋ５６２細胞を、ＴＸ－１００を使用して完全に殺傷し、最大蛍光を示した。

【0092】

標的細胞およびエフェクター細胞を播種されたプレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３７±１℃、３～４時間培養してから、１０００ｒｐｍで５分間、再度、遠心分離した。遠心分離後、８０μＬの上澄み液を黒色プレート（９６ウェル）へ移してから、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して蛍光量を測定し、がん細胞に対する細胞傷害性を、下記式１を使用して算出した。

【数1】

【0093】

図４Ａおよび下表３は、様々なＥ：Ｔ比におけるＫ５６２細胞の溶解％を示す。図４Ａおよび下表２に示されているように、比較例３（ＩＬ－２１なしのＰＢＭＣ）および比較例４（ＩＬ－２１ありのＰＢＭＣ）と比較したとき、実施例１（ＩＬ－２１なしのＣＤ５６＋）および実施例２（ＩＬ－２１ありのＣＤ５６＋）により培養されたＣＤ５６＋細胞は、より高い抗がん活性を示した。

【表3】

【0094】

次に、ＮＫ細胞に対してより大きな耐性を有することが知られている固形腫瘍細胞に対する細胞傷害性を確認する。ＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標）、Ａ５４９（肺がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１８５（商標））、およびＭＤＡ－ＭＢ０２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））を、固形腫瘍細胞株として使用した。

【0095】

各固形腫瘍細胞を、ＣＹＴＯ－ＩＤ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ長期トレーサーキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して緑色蛍光マーカーでタグ付けし、プレートに接種して、２４時間培養した。翌日、ＮＫ細胞およびがん細胞を、０．５：１の比で４８時間反応させた。４８時間後、フローサイトメーターを使用して緑色蛍光を示す細胞数を測定することによって、細胞傷害性を確認した。

【0096】

図４Ｂに示されているように、実施例３（ＩＬ－２１なしのＰＢＭＣ）および比較例２（ＩＬ－２１ありのＰＢＭＣ）と比較したとき、実施例１（ＩＬ－２１なしのＣＤ５６＋）および実施例２（ＩＬ－２１ありのＣＤ５６＋）により培養されたＣＤ５６＋細胞は、より高い抗がん活性を示した。

【0097】

実験例４．ＩＬ－２１処置のタイミングおよび数に依存するＮＫ細胞の増殖能の比較
ＩＬ－２１処置のタイミングによるＮＫ細胞の増殖能を評価するため、下記概略の通り実験を行った。

【0098】

実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０～６日目（Ｄ０～６群）、６～１０日目（Ｄ６～１０群）、１０～１４日目（Ｄ１０～１４群）、または１４～１７日目（Ｄ１４～１７群）の間で、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）で処置し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖能を実験例１による方法を使用して比較した。

【0099】

ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置した：Ｄ０～６群に対して０および３日目に２回、Ｄ６～１０群に対して６日目に１回、Ｄ１０～１４群に対して１０日目に１回、Ｄ１４～１７群に対して１４日目に１回。コントロール群については、ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置しなかった。

【0100】

図５Ａおよび表４に示されているように、Ｄ１０～１４群およびＤ１４～１７群は、コントロール群と比較して、増殖能の有意差を示さなかったが、Ｄ０～６群およびＤ６～１０群は、コントロール群と比較して、増殖能増大を示した。特に、Ｄ０～６群は、最も大きな増殖倍率の増加を示した。

【表4】

【0101】

ＩＬ－２１処置の数によるＮＫ細胞の増殖能を評価するため、下記概略の通り実験を行った。

【0102】

実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０～３日目（Ｄ０～３群）、３～６日目（Ｄ３～６群）、または０～６日目（Ｄ０～６群）の間で、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）で処置し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖能を実験例１による方法を使用して比較した。

【0103】

ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置した：Ｄ０～３群に対して０日目に１回、Ｄ３～６群に対して３日目に１回、Ｄ０～６群に対して０および３日目に２回。コントロール群については、ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置しなかった。

【0104】

図５Ｂおよび表５に示されているように、培養初期段階にＩＬ－２１処置した全ての群は、コントロール群と比較して、増殖倍率の増加を示した。特に、Ｄ０～６群は、最も大きな増殖倍率の増加を示した。

【表5】

【0105】

実験例５．ＩＬ－２１処置の濃度に依存するＮＫ細胞の増殖能の比較
実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で２回処置し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖能を実験例１による方法を使用して比較した。

【0106】

図６に示されているように、１０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で処置した場合でさえ、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１処置しないＮＫ細胞と比較して、より大きな増殖倍率を示し、ＩＬ－２１の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの間で増加すると共に、ＮＫ細胞の増殖倍率は増加した。しかしながら、１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で処置する場合、ＮＫ細胞は、５０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で処理されたＮＫ細胞との増殖の有意差を示さなかった。

【0107】

実験例６．ＩＬ－２１処置のタイミングおよび数に依存するＮＫ細胞の細胞傷害性の比較
ＩＬ－２１処置のタイミングによるがん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を評価するため、下記概略の通り実験を行った。

【0108】

実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０～６日目（Ｄ０～６群）、６～１０日目（Ｄ６～１０群）、１０～１４日目（Ｄ１０～１４群）、または１４～１７日目（Ｄ１４～１７群）の間でＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）で処置し、血液がん細胞（Ｋ５６２細胞、ＣＣＬ－２４３（商標））に対するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の細胞傷害性を実験例３による方法を使用して比較した。

【0109】

ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置した：Ｄ０～６群に対して０および３日目に２回、Ｄ６～１０群に対して６日目に１回、Ｄ１０～１４群に対して１０日目に１回、Ｄ１４～１７群に対して１４日目に１回。コントロール群については、ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置しなかった。

【0110】

図７Ａおよび表６に示されているように、Ｄ１４～１７群を除いてＩＬ－２１処置したＮＫ細胞の全ての群は、コントロール群と比較して、より大きな抗がん活性を示した。

【表6】

【0111】

更に、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の製造された群のそれぞれに対して、固形腫瘍細胞に対するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の細胞傷害性を実験例３による方法を使用して比較した。ＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標）、Ａ５４９（肺がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１８５（商標））、およびＭＤＡ－ＭＢ０２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））を、固形腫瘍細胞株として使用した。

【0112】

図７Ｂに示されているように、培養初期段階（Ｄ０～６群）にＩＬ－２１処置したＮＫ細胞は、全ての３種類の固形腫瘍細胞に対する最も大きな抗がん活性を示した。

【0113】

ＩＬ－２１処置の数によるＮＫ細胞の増殖能を評価するため、下記概略の通り実験を行った。

【0114】

実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０～３日目（Ｄ０～３群）、３～６日目（Ｄ３～６群）、または０～６日目（Ｄ０～６群）の間で、ＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）で処置し、固形腫瘍細胞に対するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の細胞傷害性を実験例３による方法を使用して比較した。ＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標）、Ａ５４９（肺がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１８５（商標））、およびＭＤＡ－ＭＢ０２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））を、固形腫瘍細胞株として使用した。

【0115】

ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置した：Ｄ０～３群に対して０日目に１回、Ｄ３～６群に対して３日目に１回、Ｄ０～６群に対して０および３日目に２回。コントロール群については、ＮＫ細胞をＩＬ－２１で処置しなかった。

【0116】

図７Ｃに示されているように、培養初期段階にＩＬ－２１処置した全ての群は、コントロール群と比較して、より大きな抗がん活性を示した。

【0117】

実験例７．ＩＬ－２１処置の濃度に依存するＮＫ細胞の細胞傷害性の比較
実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で２回処置し、血液がん細胞（Ｋ５６２細胞、ＣＣＬ－２４３（商標））に対するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の細胞傷害性を実験例３による方法を使用して比較した。

【0118】

図８Ａに示されているように、ＩＬ－２１で処置された大部分のＮＫ細胞は、ＩＬ－２１処置しないＮＫ細胞と比較して、より大きな細胞傷害性を示し、１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で処理した場合、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞との増殖の有意差を示さなかった。

【0119】

実施例１の方法によりＣＤ５６＋ＮＫ細胞を製造したが、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で２回処置し、固形腫瘍細胞（Ｋ５６２細胞、ＣＣＬ－２４３（商標））に対するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の細胞傷害性を実験例３による方法を使用して比較した。ＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標）、Ａ５４９（肺がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１８５（商標））、およびＭＤＡ－ＭＢ０２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））を、固形腫瘍細胞株として使用した。

【0120】

図８Ｂに示されているように、５０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で処置されたＮＫ細胞は、最も大きな抗がん活性を示した。

【0121】

実験例８．フィーダー細胞処置の数に依存するＮＫ細胞の増殖活性の比較
フィーダー細胞での複数処置がＮＫ細胞の増殖を持続するかどうかを分析するため、培養中のＮＫ細胞を１４日の間隔で、フィーダー細胞で処置し、ＮＫ細胞の増殖を４２日間モニターした。

【0122】

ＩＬ－２１処置に依存するＮＫ細胞増殖の増加を更に分析するため、フィーダー細胞での各処置から６日間（０～６日目、１４～２０日目、２８～３４日目）、３日の間隔で２回、ＮＫ細胞をＩＬ－２１（５０ｎｇ／ｍＬ）で処置した。

【0123】

図９に示されているように、２回以上のフィーダー細胞およびＩＬ－２１で処置された場合、ＮＫ細胞は有意な増殖倍率の増加を示し、ＩＬ－２１で処置されたＮＫ細胞はＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞と比較して４２日目により大きな増殖倍率を示した（約３．４×１０^１０ 対 約５．３×１０^８）。

【0124】

実験例９．特定のがん患者の血液を使用するＮＫ細胞の培養の効果の確認
大腸がん患者のＰＢＭＣを使用したことを除き、実施例１の方法により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を１７日間で製造した。製造されたＮＫ細胞の増殖能および純度を、実験例１および２による方法を使用して測定した。

【0125】

いくつかの群について、５０ｎｇ／ｍＬの濃度を有するＩＬ－２１で２回（培養０日目および３日目）ＮＫ細胞を治療し、ＩＬ－２１処置の効果を確認した。

【0126】

図１０Ａに示されているように、ＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞数は０日目の８倍に増加したが、ＩＬ－２１で処置された場合、ＮＫ細胞数は０日目の１４６１倍に増加した。

【0127】

更に、図１０Ｂに示されているように、ＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞の純度はたった８４．２％であったが、ＩＬ－２１で処置された場合、ＮＫ細胞の純度は９９．１９％であった。

【0128】

更に、血液がん細胞（Ｋ５６２細胞、ＣＣＬ－２４３（商標））に対するＩＬ－２１で処置されたＮＫ細胞およびＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞の細胞傷害性を、実験例３による方法を使用して比較した。図１０Ｃに示されているように、ＩＬ－２１で処置されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞と比較して、より大きな抗がん活性を示した。

【0129】

更に、ＩＬ－２１で処置されたＮＫ細胞およびＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞のそれぞれに対して、固形腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を実験例３による方法
を使用して比較した。ＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標）、Ａ５４９（肺がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１８５（商標））、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））を、固形腫瘍細胞株として使用した。図１０Ｄに示されているように、ＩＬ－２１で処置されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２１で処置されていないＮＫ細胞と比較して、より大きな抗がん活性を示した。

【0130】

したがって、本明細書に記載されている方法を使用することにより、ＮＫ細胞の充分な増殖を通常示さない特定のがん患者に対してもＮＫ細胞を製造することが可能であり得る。

【0131】

実験例１０．治療用組成物中のＮＫ細胞の生存率の確認
培養の６日目に、実施例１、２に従ってＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養した。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養した。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養した。

【0132】

培養１４～２０日目のＣＤ５６＋ＮＫ細胞を３回洗浄してから、１％アルブミンを含む主剤（生理食塩水およびハルトマン溶液）中に懸濁して、２×１０^７／ｍＬとした。細胞を４℃、４８時間貯蔵してから、細胞生存率を測定した。

【0133】

更に、ＩＬ－２の効果を比較するために、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を洗浄し、１％アルブミンを含む主剤（生理食塩水、およびハルトマン溶液またはリン酸緩衝食塩水）中に懸濁してから、５００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２と共に添加した。４℃、４８時間保持後、細胞生存率を測定した。

【0134】

１００μＬの各組成物を、合計２×１０^６ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を得るように取り、１ｍＬのＦＡＣＳ染色バッファーで１回洗浄し、遠心分離して、１００μＬのアネキシンＶ結合バッファー中に懸濁した。５μＬのアネキシンＶ－ＦＩＴＣおよび５μＬの７－ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を、懸濁液に添加し、よく混合し、暗状態下に貯蔵し、室温で１５分間反応させてから、フローサイトメトリー前に４００μＬのアネキシンＶ結合バッファーと共に添加して、５秒間混合した。その後、チューブ当たり１０，０００～１００，０００細胞を得て、分析した。ネガティブコントロールとしてアネキシンＶ－ＦＩＴＣおよび７－ＡＡＤで染色されていない試験チューブをセットすることによりカットオフを決定し、アネキシンＶ－ＦＩＴＣまたは７－ＡＡＤがネガティブである細胞フラクションのパーセンテージにより生存率を表した。

【0135】

図１１に示されているように、ＩＬ－２処置する場合（ＩＬ２あり）、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のアポトーシスは阻害された。

【0136】

実験例１１．治療用組成物中のＮＫ細胞の細胞傷害性の確認
培養の６日目に、実施例１、２に従ってＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養した。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養した。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養した。

【0137】

実験で使用される前に、がん細胞株を、次の条件下で懸濁し、３日の間隔で１週間以上、３７±１℃で継代培養することにより製造した。

【0138】

ＣＣＲＦ－ＳＢ（血液がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１２０（商標））、ＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標））およびＭＩＡ－ＰＡＣＡ２（膵がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１４２０（商標））：ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ、

【0139】

ＳＮＵ２４５（胆管がん、ＫＣＬＢ Ｎｏ．００２４５）、ＨＣＴ１５（結腸がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－２２５（商標））およびＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３（卵巣がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－１６１（商標））：ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ＋２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ならびに

【0140】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））：ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ。

【0141】

培養中のがん細胞株（血液がん細胞株を除く）を、トリプシンを使用して培養皿から剥離し、培地に懸濁して５×１０^４／ｍＬとしてから、ウェル当たり１ｍＬで２４ウェルに接種し、１日間付着させた。ＮＫ細胞から識別するため、懸濁培養細胞である血液がん細胞株を、緑色蛍光で標識し、培地に懸濁して５×１０^４／ｍＬとして、ウェル当たり１ｍＬで２４ウェルに接種した。

【0142】

第一に、がん細胞株の中でもＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標）、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ２（膵がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１４２０（商標））、ＳＮＵ２４５（胆管がん、ＫＣＬＢ Ｎｏ．００２４５）、ＨＣＴ１５（結腸がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－２２５（商標））およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６（商標））で接種された２４ウェルプレートでは、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を１日後に添加して細胞傷害性を観察した。エフェクター細胞（ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）および標的細胞（がん細胞株）を下表７に示す。

【表7】

【0143】

エフェクター細胞および標的細胞を接種されたプレートを３７±１℃で１～３日間培養し、この時点で、抗がん活性はＩＬ－２により増大するかどうかを観察するために、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を実験群へ更に添加した。ネガティブコントロール群では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞（エフェクター細胞）を添加せず、抗がん活性反応はなかった。

【0144】

培養１～３日後、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄して懸濁された形態で存在するＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除いてから、ウェル中に残っているがん細胞株を、トリプシンを使用して剥離し、トリパンブルーで染色して計数した。その後、標的細胞およびエフェクター細胞を接
種されたプレートを、３７±１℃で１～３日間培養してから、２４ウェル中に存在する緑色蛍光で標識された細胞を、フローサイトメーターを使用して計数した。

【0145】

がん細胞株に対する細胞傷害性を、下記式２を使用して算出した。

【数2】

【0146】

結果として、図１２に示されているように、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のみを処置する場合（ＩＬ２なし）と比較して、ＩＬ－２を一緒に処置する場合（ＩＬ２あり）、がん細胞傷害性は増大することが確認された。

【0147】

次に、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を２４ウェルプレートに添加し、これにＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３（卵巣がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－１６１（商標））細胞をがん細胞株の中で付着させて細胞傷害性を観察し、標的細胞（がん細胞株）およびエフェクター細胞（ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）の比を下表８に示した。

【表8】

【0148】

エフェクター細胞および標的細胞を接種されたプレートを３７±１℃で１日間培養し、抗がん活性はＩＬ－２により増大するかどうかを観察するために、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を実験群へ更に添加した。ネガティブコントロール群では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を添加せず、抗がん活性反応はなかった。

【0149】

培養１日後、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄して懸濁された形態で存在するＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除いてから、ウェル中に残っているがん細胞株を、カメラを使用して撮影した。

【0150】

結果として、図１３に示されているように、がん細胞株をＣＤ５６＋ＮＫ細胞のみ（－ＩＬ２）で治療した場合と比較して、がん細胞株をＩＬ－２と共に（＋ＩＬ２）治療した場合にがん細胞傷害性は増大した。

【0151】

次に、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を２４ウェルプレートに添加し、これにＡＧＳ（胃がん、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７３９（商標））細胞をがん細胞株の中で付着させて細胞傷害性を観察し、標的細胞（がん細胞株）およびエフェクター細胞（ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）の比を下表９に示した。

【表9】

【0152】

エフェクター細胞および標的細胞を接種されたプレートを３７±１℃で１日間培養し、抗がん活性はＩＬ－２により増大するかどうかを観察するために、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を実験群へ更に添加した。ネガティブコントロール群では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を添加せず、抗がん活性反応はなかった。

【0153】

培養１日後、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄して懸濁された形態で存在するＣＤ５６＋ＮＫ細胞を除いてから、ウェル中に残っているがん細胞株を、カメラを使用して撮影した。

【0154】

結果として、図１４に示されているように、がん細胞株をＣＤ５６＋ＮＫ細胞のみ（－ＩＬ２）で治療した場合と比較して、がん細胞株をＩＬ－２と共に（＋ＩＬ２）治療した場合にがん細胞傷害性は増大した。

【0155】

実験例１２．動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗がん効果の確認
大腸がん患者のＰＢＭＣを使用したことを除き、実施例１、２および比較例１、２の方法により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を１７日間で製造する。実施例１、２および比較例１、２によるＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、Ｔ２５培養フラスコ内の培養６日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養する。

【0156】

ヒトがんの動物モデルを、ヒトがん細胞株をマウスに異種移植することによって構築する。次のヒトがん細胞株を使用する：ＡＧＳ（胃がん）、ＭＩＡ－ＰＡＣＡ２（膵がん）、ＳＮＵ２４５（胆管がん）、ＨＣＴ１５（結腸がん）およびＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３（卵巣がん）、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳がん）。がんの異種移植後、マウスを無作為にグループ化し、マークする。コントロール群に対し、２００μＬのハルトマン溶液を尾静脈内に注射する。ＮＫ細胞治療（＋ＩＬ－２）群に対して、１×１０^７のＮＫ細胞／２００μＬおよび５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を、がん異種移植１週間後から２～３日間隔で５回尾静脈内に注射する。ＮＫ細胞治療（－ＩＬ－２）群に対して、１×１０^７のＮＫ細胞／２００μＬを、がん異種移植１週間後から２～３日間隔で５回尾静脈内に注射する。

【0157】

試験期間中腫瘍増殖を追跡するため、週３回体重および腫瘍量についてマウスを試験する。主軸および短軸の長さを、ノギスを使用して測定し、次式（式３）により腫瘍量を決定する。
式３
腫瘍量（ｍｍ^３）＝（主軸長さ（ｍｍ））×（短軸長さ（ｍｍ））^２×０．５

【0158】

ＮＫ細胞治療（－ＩＬ－２）群は、各がん型のルシフェラーゼ画像に基づいて、コントロール群と比較して、約５０％の治療８週間後に腫瘍増殖の減少を示す。ＮＫ細胞治療（＋ＩＬ－２）群は、各がん型に対し、コントロール群と比較して、約６０％の腫瘍増殖の更なる減少を示す。

【0159】

実験例１３．がん患者のＮＫ細胞の抗がん効果の確認
大腸がん患者のＰＢＭＣを使用したことを除き、実施例１、２および比較例１、２の方法により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を１８日間で製造する。実施例１、２および比較例１、２によるＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、Ｔ２５培養フラスコ内の培養６日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養する。

【0160】

大腸がん患者を無作為にグループ化し、マークする。コントロール群に対して、ＮＫ細胞を注射しない。ＮＫ細胞治療（＋ＩＬ－２）群に対して、体重ｋｇ当たり１～３×１０^７のＮＫ細胞および５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を６週の間隔で静脈内に３回注射する。ＮＫ細胞治療（－ＩＬ－２）群に対して、体重ｋｇ当たり１～３×１０^７のＮＫ細胞を６週の間隔で静脈内に６回注射する。

【0161】

腫瘍増殖を、１、３、６、１２ヶ月でモニターする。１２ヶ月後、ＮＫ細胞治療（－ＩＬ－２）群は腫瘍サイズの全体的減少を示し、ＮＫ細胞治療（＋ＩＬ－２）群は腫瘍サイズの更なる全体的減少を示す。

【0162】

実験例１４．アルツハイマー病患者のＮＫ細胞の抗がん効果の確認
大腸がん患者のＰＢＭＣを使用したことを除き、実施例１、２および比較例１、２の方法により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を１８日間で製造する。実施例１、２および比較例１、２によるＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、Ｔ２５培養フラスコ内の培養６日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養する。

【0163】

アルツハイマー病患者を無作為にグループ化し、マークする。コントロール群に対して、ＮＫ細胞を注射しない。ＮＫ細胞治療群に対して、体重ｋｇ当たり１～３×１０^７のＮＫ細胞および５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を毎週の間隔で静脈内に６回注射する。

【0164】

患者の認知機能を、１、３、６、１２ヶ月でモニターする。１２ヶ月後、ＮＫ細胞治療群は、改善された認知機能を示す。

【0165】

実験例１５．自己免疫疾患患者のＮＫ細胞の抗がん効果の確認
大腸がん患者のＰＢＭＣを使用したことを除き、実施例１、２および比較例１、２の方法により、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を１８日間で製造する。実施例１、２および比較例１、２によるＣＯ_２インキュベーター内で培養されたＮＫ細胞のそれぞれに関して、Ｔ２５培養フラスコ内の培養６日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて３
５０ｍＬバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。培養１０日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種し、更に４日間培養する。そして、培養１４日目、１．０×１０^５～２．０×１０^６／ｍＬの細胞数に基づいて１Ｌバッグ中に細胞を接種してから、更に３～６日間培養する。

【0166】

多発性硬化症患者を無作為にグループ化し、マークする。コントロール群に対して、ＮＫ細胞を注射しない。ＮＫ細胞治療群に対して、体重ｋｇ当たり１～３×１０^７のＮＫ細胞および５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を毎週の間隔で静脈内に６回注射する。

【0167】

患者の認知機能を、１、３、６、１２ヶ月でモニターする。１２ヶ月後、ＮＫ細胞治療群は、改善された認知機能を示す。

【0168】

専門用語
例示的実施形態の前述の記載は例証および説明を目的のためだけに示されており、網羅的なものでも本発明を開示されている正確な形態に限定するものでもない。上記教示を踏まえると多くの修正および変化は可能である。上記開示されている実施形態の特定の特徴および態様の様々な組合せまたはサブコンビネーションを作製してもよく、なお、本発明の１つ以上の内である。更に、実施形態に関連していずれもの特定の特徴、態様、方法、特質、特性、質、性状、要素、または同種のものの本明細書における開示を、本明細書に記載されている全ての他の実施形態において使用することができる。したがって、開示されている本発明の様々な様式を形成するために、開示されている実施形態の様々な特徴および様相を、互いと組み合わせるまたは互いに置き換えることができる。したがって、本明細書に開示されている本発明の趣旨は、上記特定の開示されている実施形態によって限定されるべきでないものとする。さらに、本発明は様々な修正物を受け易いが、その代替物、特定の実施例は図面に示されており、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本発明は開示されている特定の形態または方法に限定されないものとするが、それとは反対に、本発明は記載されている様々な実施形態の趣旨および範囲内ならびに附属のクレーム内にある全ての修正物、均等物、および代替物を包含するものと理解されるべきである。本明細書に開示されているいずれもの方法は、記載されている順序で行う必要はない。本明細書に開示されている方法は、実行者により行われる特定の行為を包含するが、しかしながら、明示的あるいは暗示的にこれらの行為のいずれもの第三者の指示も含むことができる。本明細書に開示されている範囲は、そのいずれかおよび全ての重複部分、部分範囲、および組合せも包含する。

【0169】

本発明の原理および本発明および他の当業者が様々な実施形態ならびに考えられる特定の使用に適した様々な修正と共に利用するように活発になるようにこれらの実際的応用を説明するために実施形態を選択し記載した。代替の実施形態は、前述の記載およびその中に記載されている例示的実施形態よりむしろ、附属された特許請求の範囲によって規定された本発明の当業者に明白になるだろう。

【0170】

「できる（ｃａｎ）」、「できる（ｃｏｕｌｄ）」、「してもよい（ｍｉｇｈｔ）」、または「してもよい（ｍａｙ）」などの条件言語は、特に別段に指定されない限り、または使用される文脈内で別段に理解されない限り、他の実施形態は含まないが、特定の実施形態は特定の特徴、要素、および／またはステップを含むと伝えることを通常目的とする。したがって、かかる条件言語は、特徴、要素、および／またはステップが１つ以上の実施形態を多少なりとも必要とすることを暗示することを通常目的としない。

【0171】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｈａｖｉｎｇ）」などは同義語であり、オープンエンド様式で包含的に使用され、追加の要素、特徴、行為、操作などを排除しない。用語「または（ｏｒ）」は、例えば、要素一
覧を接続するために使用される場合、用語「または（ｏｒ）」は、一覧中の要素の１つ、または全てを意味するように、その包含的意味（その排他的意味でない）で使用される。

【0172】

本明細書に開示されている範囲は、そのいずれかおよび全ての重複部分、部分範囲、および組合せも包含する。「まで（ｕｐ ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」、「より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、「未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」、および同種のものなどの言語は、記載された数を含む。

【0173】

本明細書で使用されるとき、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、および「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」などの用語から始まる数は記載された数（例えば、約１０％＝１０％）を含み、なお所望の機能を行うかまたは所望の結果を達成する定められた量に近い量を表す。例えば、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、および「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、定められた量の１０％未満内、５％未満内、１％未満内、０．１％未満内、および０．０１％未満内である量を表す。

【0174】

本明細書で使用されるとき、用語「通常（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ）」は、特定の値、量、または特性値を主に含むかまたは傾向である値、量、または特性値を表す。例として、特定の実施形態では、用語「ほぼ均一（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｕｎｉｆｏｒｍ）」は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、および０．０１％未満だけ正確に均一から逸脱する値、量、または特性値を表す。

【0175】

本明細書に開示されている範囲は、そのいずれかおよび全ての重複部分、部分範囲、および組合せも包含する。「まで（ｕｐ ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」、「より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、「未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」、および同種のものなどの言語は、記載された数を含む。「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの用語から始まる数は、記載された数を含む。例えば、「約５．０ｃｍ」は、「５．０ｃｍ」を含む。

【0176】

いくつかの実施形態は、概略図と関連して説明されている。しかしながら、概略図は尺度通りに図示されていないと理解されるべきである。距離は単に例証であり、実際の寸法および図示されているデバイスのレイアウトとの正確な関係性を必ずしも有していない。

【0177】

本開示の目的のため、特定の態様、利点、および新規特徴を本明細書に記載している。必ずしも全てのかかる利点をいずれかの特定の実施形態により達成することができるとは限らないと理解されるべきである。したがって、例えば、本明細書に教示または示唆されているように必ずしも他の利点を達成しないで本明細書に教示された１つの利点または一群の利点を達成する方法で、本開示を具体化または実行してもよいと、当業者は認識するだろう。

【0178】

さらに、例証的実施形態を本明細書に記載しているが、均等な要素、修正、省略、組合せ（例えば、様々な実施形態にわたる態様の）、適応および／または変更を有するいずれかおよび全ての実施形態の範囲は、本開示に基づいて当業者により理解されるであろう。クレームにおける限定は、クレーム中に使用される言語に基づいて広義に解釈されるべきであり、本明細書に記載されている実施例または本願の審査中に限定されず、この実施例は非排他的と解釈されるべきである。更に、開示されている方法（ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）および方法（ｍｅｔｈｏｄｓ）の行為は、順序付け行為および／または挿入追加行為および／または削除行為を含むいずれの方法でも修正してもよい。したがって、クレームに示されている真の範囲および趣旨ならびに均等物の完全な範囲で、本明細書および実施例はほんの例証にすぎないと理解されるものとする。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】