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特許7339450新規なラクトバシラスプランタルム菌株、菌株由来多糖体及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-28
(45)【発行日】2023-09-05
(54)【発明の名称】新規なラクトバシラスプランタルム菌株、菌株由来多糖体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20230829BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20230829BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230829BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20230829BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230829BHJP
A61K 31/715 20060101ALI20230829BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230829BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20230829BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230829BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230829BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230829BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230829BHJP
C08B 37/00 20060101ALI20230829BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/20 E ZNA
C12P19/04 C
C12N5/0783
C12N5/0786
A23L33/135
A61K31/715
A61K35/17
A61K35/747
A61P37/02
A61P31/00
A61P37/04
A61P35/00
C08B37/00 P
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022542386
(86)(22)【出願日】2021-01-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-04
(86)【国際出願番号】 KR2021000351
(87)【国際公開番号】W WO2021141473
(87)【国際公開日】2021-07-15
【審査請求日】2022-09-07
(31)【優先権主張番号】10-2020-0003493
(32)【優先日】2020-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC KCTC 14337BP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522275407
【氏名又は名称】イミュノバイオーム インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＭＥ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】イム シンヒョク
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ ガリマ
(72)【発明者】
【氏名】パク スンヒ
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ アミット
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５１１８５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国登録特許第１０－１７６１１８６（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】特表２０１２－５３３３１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１５５８５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－０９０６０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３０７７９４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Microbial Cell Factories, 2012, 11:149, pp.1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／２０
Ｃ１２Ｐ １９／０４
Ａ６１Ｋ ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰの寄託番号を有するラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）。
【請求項2】
免疫賦活活性を有する請求項１に記載の菌株由来の莢膜多糖体（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）であって、下記化学式Ｉで表示される多糖体を含む、莢膜多糖体、
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ ｎ －
前記化学式Ｉにおいて、
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１以上の整数である。
【請求項3】
下記化学式Ｉで表示される多糖体：［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
前記化学式Ｉにおいて、
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１以上の整数である。
【請求項4】
前記Ａ及びＤのいずれか一つ以上のガラクトースがリン酸化されたことを特徴とする、請求項３に記載の多糖体。
【請求項5】
前記Ａの１位の炭素の水酸化基（－ＯＨ）がリン酸化されたことを特徴とする、請求項４に記載の多糖体。
【請求項6】
前記Ｄの６位の炭素の水酸化基（－ＯＨ）がリン酸化されたことを特徴とする、請求項４に記載の多糖体。
【請求項7】
ｎは２以上であり、反復単位のＡとＤがリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｌｉｎｋａｇｅ）で連結されたことを特徴とする、請求項３に記載の多糖体。
【請求項8】
前記化学式Ｉにおいて、ＤとＢ、及びＢとＩは、α－１，３－グリコシド結合で連結され、
ＩとＦは、β－１，６－グリコシド結合で連結され、
ＦとＧ、ＧとＣ、ＣとＥ、及びＥとＨは、α－１，２－グリコシド結合で連結され、
ＨとＡは、α－１，６－グリコシド結合で連結されたことを特徴とする、請求項３に記載の多糖体。
【請求項9】
下記化学式ＩＩの構造を有することを特徴とする、請求項３に記載の多糖体：［化学式ＩＩ］
【請求項10】
（ａ）請求項１に記載の菌株を培養する段階；及び（ｂ）培養された菌株から莢膜多糖体を取得する段階を含む、請求項３に記載の多糖体の生産方法。
【請求項11】
請求項１に記載の菌株又は請求項３～９のいずれか一項に記載の多糖体を有効成分として含む免疫調節用組成物。
【請求項12】
前記免疫調節は、免疫の増強であることを特徴とする、請求項１１に記載の免疫調節用組成物。
【請求項13】
請求項１に記載の菌株又は請求項３～９のいずれか一項に記載の多糖体を有効成分として含む、腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項14】
前記腫瘍は、黒色腫、乳癌、腎臓癌、肺癌、膀胱癌、及び直膓癌からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の薬学組成物。
【請求項15】
請求項１に記載の菌株又は請求項３～９のいずれか一項に記載の多糖体を有効成分として含む免疫増強用食品組成物。
【請求項16】
（ａ）抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に請求項１に記載の菌株又は請求項３～９のいずれか一項に記載の多糖体を処理してプライミングする段階；及び（ｂ）前記プライミングされた抗原提示細胞をＴ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階を含む炎症性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項17】
前記抗原提示細胞は、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）、ランゲルハンス細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項18】
前記炎症性Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項19】
マクロファージに請求項１に記載の菌株又は請求項３～９のいずれか一項に記載の多糖体を処理してマクロファージをＭ１表現型マクロファージに分化する段階；及び前記分化されたＭ１表現型マクロファージを取得する段階を含むＭ１表現型マクロファージの製造方法。
【請求項20】
前記Ｍ１表現型マクロファージは、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ２、及びＣＤ４０からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の発現が上方調節されたことを特徴とする、請求項１９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＩＭＢ１９菌株、菌株由来多糖体及びその用途に関し、特に、免疫刺激及び抗腫瘍活性を有する寄託番号ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰのラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株及び該菌株由来の多糖体、及びその免疫調節、抗腫瘍及び感染性疾患治療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
哺乳類は、免疫システムと絶え間なく相互作用する一連の微生物を保有している。共生微生物は宿主と共生関係を結び、消化、行動、免疫システムの成熟のような様々な過程において宿主と相互作用する（Ｃｅｒｆ－Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ Ｎ，Ｇａｂｏｒｉａｕ－Ｒｏｕｔｈｉａｕ Ｖ．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：ｆｒｉｅｎｄｓ ｏｒ ｆｏｅｓ？ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０；１０（１０）：７３５－４４．）。同様に、かびは人体に存在し、宿主の免疫システムに影響を与える（Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＬ，Ｌｉｍｏｎ ＪＪ，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＤＭ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ Ｆｕｎｇｉ：Ｄｅｔｅｎｔｅ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ２０１７；１２：３５９－８５．）。先天性免疫細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲｓ）のようなパターン認識受容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）により、多糖体を含むかび細胞表面の様々な病原菌関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ，ＰＡＭＰｓ）を検出する。信号を探知すると、先天性免疫細胞が遺伝子発現プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を変更し、後天的免疫を調停するためにサイトカインのような免疫信号分子を生産する（Ｉｌｉｅｖ ＩＤ，Ｌｅｏｎａｒｄｉ Ｉ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；１７（１０）：６３５－４６．，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＤＭ，Ｉｌｉｅｖ ＩＤ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１４（６）：４０５－１６．及びＢｒｕｂａｋｅｒ ＳＷ，Ｂｏｎｈａｍ ＫＳ，Ｚａｎｏｎｉ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５；３３：２５７－９０．）。
【0003】
ＷＨＯは、プロバイオティクスを適切な量で投与する場合に、宿主の健康に役立つ生きている微生物と定義する（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ１１，５０６－５１４（２０１４））。プロバイオティクスは、宿主の腸内微生物相（ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ）に対する補充剤の役割を担い、腸障壁機能を改善し、宿主の兔疫体系を調節することに効果的なものと報告された（Ｍｉｃｒｏｂ Ｅｃｏｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ２６，２５８７７（２０１５））。プロバイオティクスの大部分は、ファーミキューテス門（ｐｈｙｌｕｍ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に属し、これは、最大の単一バクテリア門であり、これらの大部分は、“Ｇ＋Ｃ”含有量が低いグラム陽性菌であり、主にＢａｃｉｌｌｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉａグループに分類される。ラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）は、ラクトバシラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科に属する乳酸菌（ＬＡＢ）である。ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）は、明確な生態学的地位を有する広く知られた微生物群集である。種々の乳酸菌は、伝統的に、牛乳、乳製品、発酵食品、ソーセージのような食品と関連していることが知られている。ラクトバシラスは、ＦＤＡによってＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）と認定された微生物グループであり、食品及びその他の産業分野において広く用いられている。ラクトバシラスは、条件嫌気性、非胞子形成、非運動性、棒形、グラム陽性細菌に分類され、一般に、カタラーゼ陰性と見なされる。ラクトバシラスは、同種発酵（ｈｏｍｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ）又は異種発酵（ｈｅｔｅｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ）特性を示すことができ、一次発酵の最終産物として乳酸を生産する（Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２，８６（２０１２））。ラクトバシラスは、滑らかで膨らんだコロニーを示す。
【0004】
ＬＡＢ同士の類似な生化学及び形態学的特性のため、個別菌株を同定するためには分子的同定方法が必要である。様々な乳酸菌が食品、特に発酵食品において分離及び特性化されている。発酵は一般に、微生物に起因する生化学的変化を意味する。韓国の伝統食品であるキムチは、主に白菜を発酵させた食べ物であり、栄養健康的に有益な効果を示す（Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｎｕｔｒ３４，１７５－２０３（１９９４））。キムチには独特の微生物群集が存在していると知られている。様々な報告によれば、主に乳酸菌がキムチに存在することが知られており、Ｗｅｉｓｅｌｌｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃは優占種として、特に、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株が最優占種として知られている（Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１９，６４１－６４６（２０１０））。ラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、菌株特異的プロバイオティックプロファイル及び食品産業において技術的応用によって最も多く研究された菌株の一つである。キムチ微生物群の大部分は培養が可能であり（Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１０２，１４３－１５０（２００５））、それらが健康上に及ぼす利点を研究するために個別微生物分離が必須である。
【0005】
一方、癌の成長及び増殖は、宿主免疫反応によって厳格に調節される。腫瘍細胞の成長及び増殖のためには、腫瘍細胞の初期死滅を誘導する免疫体系の監視を回避できる必要がある。腫瘍細胞は、サイトカインの分泌、細胞表面分子の発現など、様々な経路を通じて免疫抑制性腫瘍微細環境を形成して免疫システムを回避することによって成長及び増殖する。このような免疫回避機序を対象にする癌治療戦略として、免疫体系を誘導又は強化させようとする様々な努力が試みられた。腫瘍免疫治療法は、腫瘍が獲得した免疫抑制又は免疫回避機序を克服するために、兔疫体系の腫瘍認知能力又は破壊能力を回復又は強化させる治療方法であるといえる。２０１１年にイピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）が悪性黒色腫患者を成功的に治療した免疫治療剤として開発されて以来、ニボルマブ、ペンブロリズマブのような様々な免疫治療剤が開発されてきている。
【0006】
このような腫瘍免疫治療療法のツールとして、腸内微生物群（ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）の重要性及びその応用に対する報告及び事例が増加している。腸内微生物群は、宿主の局所及び全身免疫反応を形成するために必須の役割を担う（Ｓｃｉｅｎｃｅ３３０，１７６８－１７７３（２０１０）、Ｃｅｌｌ１４８，１２５８－１２７０（２０１２））。腸内微生物群の多様性及び構成は、化学療法に対する反応性にも影響を及ぼすことが見られた（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５５，１４７０－１４７９（２００６）；Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２，９７１－９７６（２０１３））。特に、特定の共生微生物は、自発的な抗腫瘍免疫の活性化と関連することが明らかにされ、実験（Ｓｃｉｅｎｃｅ３５０，１０８４－１０８９（２０１５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ３５０，１０７９－１０８４（２０１５））及びヒト癌（Ｓｃｉｅｎｃｅ３５９，９１－９７（２０１８）、Ｎａｔｕｒｅ４５３，６２０－６２５（２００８））において免疫治療剤の治療効能にシナジー効果を示すことが知られている。したがって、腸内微生物群のような特定菌株が粘膜外及び遠距離腫瘍の進行にも影響を及ぼし得るという点が明確にされつつある。このような様々な報告に基づき、腸内微生物群の変更は、効果的で且つ実行可能な臨床治療の一つのオプションとして見なされている。現在、大部分の研究は、プロバイオティクスの観点において特定菌株又は菌株の集団が宿主の免疫システム又は抗腫瘍免疫に及ぼす包括的な効果を立証したが、このような効果を示す具体的な菌株由来の有効成分及びその信号経路のようなメカニズムに関する情報はほとんど明らかにされたことがない。
【0007】
特に、このような微生物又はその代謝産物などを患者の治療に利用するために、一部の患者は過剰活性化された免疫反応（すなわち、アレルギー又は自己免疫疾患）を抑制しなければならないのに対し、一部の患者は免疫系を強化（すなわち、癌又はウイルス感染）させる必要がある。例えば、Ｔｈ１７－誘導プロバイオティクス菌であるビフィズス菌をリウマチ性関節炎動物モデルに投与した時に関節炎症状を悪化させた（Ｔｚｅ Ｇｕａｎ Ｔａｎ，１１３（５０）：Ｅ８１４１－Ｅ８１５０，２０１６）。したがって、有益な微生物の同定及びその作用因子のメカニズムを明らかにすることは、治療学的に非常に重要である。
【0008】
このような技術的背景下で、本発明者らは、微生物由来の多糖体の成分、構造、分子量などと免疫調節機能との明確な相関関係及びメカニズムを明らかにしようと鋭意努力した結果、韓国固有の食べ物であるキムチから顕著に高い免疫賦活活性を有する新規なラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する菌株を同定し、韓国生物資源センターにＫＣＴＣ １４３３７ＢＰの寄託番号で寄託した。また、前記新規菌株、ラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰを給与する場合に、エフェクターＴ細胞を顕著に増加させ、Ｔｒｅｇの生成を抑制し、宿主内で免疫システムを刺激し、腫瘍の成長及び増殖を抑制することを確認した。
【0009】
さらに、本発明者らは、新規な菌株の同定及び特性の他にも、前記新規菌株の莢膜多糖体、及びその特定の構造を有する分画（ＣＰＳ－１００）が、免疫刺激及び増進効果を示す有効分子であることを確認し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞機能の活性化、ＣＰＳ腫瘍内マクロファージ浸潤増加、マクロファージの炎症性表現型への分化／再プログラミングのような様々なメカニズムで抗腫瘍免疫反応を刺激することによって、腫瘍の成長を顕著に抑制できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0010】
本背景技術部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に既に知られた先行技術を形成する情報が含まれなくてもよい。
【発明の概要】
【0011】
本発明の目的は、免疫刺激活性を有する新規な菌株を提供することにある。
【0012】
本発明の他の目的は、免疫刺激活性を有する前記菌株由来の多糖体を提供することにある。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、前記菌株及び菌株由来多糖体の免疫調節用途、及び／又は腫瘍又は感染性疾患の予防、改善又は治療用途を提供することにある。
【0014】
前記目的を達成するために、本発明は、ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰの寄託番号を有するラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９）を提供する。
【0015】
本発明は、また、免疫賦活活性を有する前記菌株由来の莢膜多糖体を提供する。
【0016】
本発明は、また、前記菌株を培養する段階及び前記培養された菌株から莢膜多糖体を取得する段階を含む、免疫賦活活性を有する莢膜多糖体の生産方法を提供する。
【0017】
本発明は、また、下記化学式Ｉで表示される多糖体を提供する：
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
前記化学式Ｉにおいて、
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１～１０の整数である。
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
前記化学式Ｉにおいて、
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１～１０の整数である。
【0018】
本発明は、また、前記菌株及び／又は多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物を提供する。
【0019】
本発明は、また、前記菌株及び／又は多糖体を有効成分として含有する腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0020】
本発明は、また、前記菌株及び／又は多糖体を有効成分として含有する免疫増進用食品組成物を提供する。
【0021】
本発明は、また、前記菌株及び／又は多糖体を対象に投与する段階を含む腫瘍又は感染性疾患の予防、改善又は治療方法を提供する。
【0022】
本発明は、また、前記菌株及び／又は多糖体の免疫調節用途、及び／又は腫瘍又は感染性疾患の予防、改善又は治療用途を提供する。
【0023】
本発明は、また、免疫調節用組成物を製造するための前記菌株及び／又は多糖体の用途を提供する。
【0024】
本発明は、また、腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用薬学組成物を製造するための前記菌株及び／又は多糖体の用途を提供する。
【0025】
本発明は、また、免疫増進用食品組成物を製造するための前記菌株及び／又は多糖体の用途を提供する。
【0026】
本発明は、また、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又は化学式Ｉの多糖体でプライミングする段階；及び、プライミングされた抗原提示細胞をＴ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階を含む炎症性Ｔ細胞の製造方法を提供する。
【0027】
本発明は、また、マクロファージにＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又は化学式Ｉの多糖体を処理してＭ１表現型マクロファージに分化する段階；及び、前記分化されたＭ１表現型マクロファージを取得する段階を含むＭ１表現型マクロファージの製造方法を提供する。
【0028】
本発明は、また、前記方法で製造された炎症性Ｔ細胞及び／又は前記方法で製造されたＭ１表現型マクロファージを有効成分として腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用細胞治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】キムチ由来菌株処理時に脾臓細胞の炎症性又は抗炎症サイトカイン数値を示すものである。
【0030】
キムチ懸濁液の段階的希釈液を作り、ＭＲＳアガープレートにストリークし、３７℃で４８時間培養した後に１４個のコロニーから菌株を獲得し、ＭＲＳブロスで２４時間さらに培養した。脾臓細胞とそれぞれの菌株を１：１０に混合し、３７℃、５％ＣＯ２条件で４８時間培養した。脾臓細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡによって培養上澄液のサイトカイン数値を測定して評価した。前記データは、平均±ＳＥＭ値である（ｎ＝２）。統計的有意性は、一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によってＭｏｃｋに対して計算された。＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．００１
【0031】
【図2】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株の微生物学的及び生物学的特性を示す図である。
【0032】
図２のＡ：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株のＴＥＭ写真を示すものである。矢印は、細胞壁周囲の莢膜層を示す。
【0033】
図２のＢ：５％ヒツジ血液アガーで４８時間培養した後、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株の溶血活性、陽性対照群：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２７３４８
【0034】
図２のＣ：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株に対するゼラチン加水分解試験。陽性対照群：Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１１７７８
【0035】
【図3】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の系統図（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）を示すものである。
【0036】
系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ菌株間の差に基づいて構築された。平均ヌクレオチド指数（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｄｅｘ，ＡＮＩ）は、ＯｒｔｈＡＮＩアルゴリズムを計算した。距離は、ゲノムの差に正比例する。
【0037】
【図4】様々なラクトバシラスプランタルム菌株のＴｈ１７細胞生成を確認した結果である。
【0038】
未成熟（ｎａｉｖｅ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ３１０５、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ３１０６、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ３１０７の効果を示した流動細胞分析データである。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９でプライミングされた樹状細胞を未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞、抗ＣＤ３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）と共に培養した。
【0039】
図４のＡにおけるｉは、Ｔｈ１７細胞の生成を描写するＦＡＣＳプロットである。細胞は、生きている（ｌｉｖｅ）ＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ Ｔ細胞でゲートされた。
【0040】
図４のＡにおけるｉｉは、生きているライブ（ｌｉｖｅ Ｌｉｖｅ）ＣＤ４＋ ＲＯＲγ＋ Ｔ細胞でゲートされたＴｈ１７細胞に対する平均細胞数を示す棒グラフである。
【0041】
図４のＢは、ライブＣＤ４＋ Ｔ－ｂｅｔ＋ Ｔ細胞でゲートされたＴｈ１細胞である。
【0042】
図４のＣは、ライブＣＤ４＋ＧＡＴＡ３＋ Ｔ細胞でゲートされたＴｈ２細胞である。
【0043】
図４のＤは、ライブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞でゲートされたＴｒｅｇである。
【0044】
データは、平均±ＳＤで示し、統計的有意性は、一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によってＭｏｃｋに対して計算された。＊＊ｐ＜０．０１
【0045】
【図5】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のＴｒｅｇ抑制及びＴｈ１７細胞誘導能を示すものである。
【0046】
図５のＡにおけるｉは、Ｔｈ１７細胞の生成に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の効果を示す代表的なＦＡＣＳプロット及び棒グラフである。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９プライミングされた樹状細胞を未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞、抗ＣＤ３（０．１ｕｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ－β（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１－β（２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、抗ＩＬ４（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＩＦＮγ（１０μｇ／ｍｌ）と共に共同培養した。細胞は、ライブＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ Ｔ細胞でゲートされた。
【0047】
図５のＡにおけるｉｉは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９で生成されたＴｈ１７細胞においてインターロイキン－１７のレベルを示す代表的なＦＡＣＳプロット及び棒グラフである。細胞は、ライブＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ＩＬ－１７＋ Ｔ細胞でゲートされた。
【0048】
図５のＢは、試験管内Ｔｒｅｇ細胞生成に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の抑制効果を示す代表的なＦＡＣＳプロット及び棒グラフである。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９プライミングされた樹状細胞は、抗ＣＤ３（０．１ｕｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）及び様々な濃度のＴＧＦ－βと共に未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共同培養した。データは、平均±ＳＥＭで表示した。統計的有意性は、一般の一元分散分析で分析された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１
【0049】
【図6】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９によって強化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を用いた抗腫瘍免疫反応を示すものである。
【0050】
図６のＡは、脾臓細胞－バクテリア共同培養上澄液のＥＬＩＳＡを用いたサイトカイン分析結果である。
【0051】
図６のＢは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９又はＬ．ｍｕｒｉｎｕｓでプライミングされた脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞及び未成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞の共同培養物から、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の定量結果である。
【0052】
図６のＣは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９でプライミングされたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージ及び未成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞の共同培養物からＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を定量した結果である。
【0053】
図６のＤは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９でプライミングされた脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞、未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβの共同培養物からＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞を定量した結果である。
【0054】
前記データは、平均±ＳＥＭ値であり、Ｂは、テューキーの（Ｔｕｋｅｙ’ｓ）多重比較と共に一般の一元分散分析で分析された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１
【0055】
図６のＥは、ｉｎ ｖｉｖｏ ＯＶＡ発現リステリアモノサイトゲネス（ＬＭ－ＯＶＡ）細胞毒成分析を概略的に示すものである。
【0056】
図６のＦは、ＬＭ－ＯＶＡで感染されたマウスにおいてＯＶＡ＋脾臓細胞に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９媒介されたＣＤ８＋ Ｔ細胞特異的細胞傷害性を示すものである。
【0057】
図６のＧは、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫マウスモデルを概略的に示すものである。
【0058】
図６のＨは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９又はＬ．ｍｕｒｉｎｕｓで処理又は非処理されたＣ５７／ＢＩ６無菌（ｇｅｒｍ－ｆｒｅｅ）マウスにおいてＢ１６．Ｆ１０黒色腫成長動力学（Ｂ１１６．Ｆ１０ ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示すものである。
【0059】
図６におけるｉは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９又はＬ．ｍｕｒｉｎｕｓで処理又は非処理されたＣ５７／ＢＩ６ＳＰＦマウスにおいてＢ１６．Ｆ１０黒色腫成長動力学（Ｂ１１６．Ｆ１０ ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示すものである。
【0060】
前記データは、平均±ＳＥＭ値であり、図６のＦは、非パラメトリック両側検定（ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）であり、図６のＨ及びＩは、ダネットの（Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ）多重比較と共に二元分散分析で分析された。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１
【0061】
【図7】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する容量依存的効果を示すものである。
【0062】
図７のＡ及びＢは、異なる比率のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９でプライミングされた脾臓（図７のＡ）又はｍＬＮ（図７のＢ）ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞と未成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞の共同培養物においてＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を定量化したものである。
【0063】
図７のＣは、１００ｎｇ／ｍｌのｇｐ－１００の存在下に、異なる比率のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９でプライミングされた脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞と未成熟ｐｍｅｌ ＴＣＲ移植ＣＤ８＋ Ｔ細胞の共同培養物においてＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を定量化したものである。データは、平均±ＳＥＭであり、テューキーの多重比較と共に一般の一元分散分析で分析された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１
【0064】
【図8】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のインターロイキン－６生産を用いた調節Ｔ細胞の成長抑制を示すものである。
【0065】
図８のＡは、異なるＴＧＦβ濃度においてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９プライミングされた脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞と未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共同培養物においてＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞を定量化したものである。
【0066】
図８のＢは、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ濃度においてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９プライミングされた脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞と未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共同培養物においてサイトカインを定量化したものであり、総ＣＤ４＋ Ｔ細胞でゲートされた。
【0067】
図８のＣは、ＩＬ－６－／－脾臓ＤＣ及び０．０１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ濃度においてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９プライミングされた脾臓ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞と未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共同培養物においてＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞を定量化したものである。
【0068】
データは、平均±ＳＥＭであり、テューキーの多重比較と共に一般の一元分散分析で分析された。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない
【0069】
【図9】微生物多様性の変化無しでＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９が腫瘍免疫に及ぼす効果を示すものである。
【0070】
【0071】
図９のＢ及びＣは、図６のＨにおけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を給与した腫瘍保有マウスの糞便サンプルに現れたバクテリアβ－多様性のアルファ（α）多様性分析（Ｂ）及び主座標分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示すものである。データは、２回の独立試験値を示す。
【0072】
【図10】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真である。
【0073】
図１０のａは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９バクテリア群集であり、矢印は個別バクテリアを示す。
【0074】
図１０のｂは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９であり、矢印は、細胞壁周囲の厚い莢膜層（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｌａｙｅｒ）を示す。
【0075】
【図11】ＨＦ処理無しで（ａ）又はＨＦ処理して（ｂ）試料を脱リン酸化させたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９から抽出されたＣＰＳ由来のアセチル化されたメチルグリコシドのＧＣ－ＭＳプロファイルを示すものである。“ｉ”は不純物を表す。
【0076】
【図12】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９から抽出されたＣＰＳのアセチル化２－（－）－オクチル誘導体（２－（－）－ｏｃｔｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）（ａ）、ラムノース（ｂ）、ブドウ糖（ｃ）及びガラクトースアセチル化２－（－）－オクチルグリコシド標準（ｄ）のＧＣ－ＭＳプロファイルを示すものである。“ｉ”は不純物を表す。
【0077】
【図13】未精製ＣＰＳをイオン交換クロマトグラフィーで精製して得た分画の陽性子スペクトルを示すものである（６００ＭＨｚ、２９８Ｋ）：ＣＰＳ（ａ）、ＣＰＳ－１０（ｂ）、ＣＰＳ－１００（ｃ）、ＣＰＳ－２００（ｄ）、ＣＰＳ－４００（ｅ）、ＣＰＳ－７００（ｆ）及びＣＰＳ７－１０００（ｇ）。括弧中の数字は、２８ｍｇの未精製ＣＰＳを基準に各分画の収率（ｍｇ／ｍｇ）を表す。
【0078】
【0079】
【図15】ＨＦを処理してサンプルを脱リン酸化した後、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９から抽出したＣＰＳ－４００のアセチル化メチルグリコシドのＧＣ－ＭＳプロファイル。“ｉ”は不純物を表し、ＭｕｒＡは、バクテリアのペプチドグリカンの構成要素であるムラミン酸（ｍｕｒａｍｉｃ ａｃｉｄ）を表す。
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
【図20】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の莢膜多糖体、ＣＰＳ－１００の反復単位の構造を示すものである。４は、計算された平均重合度を示す。Ｄの６’炭素残基の酸素に置換されたリン酸基（Ｐ）は、Ａの１’炭素と連結されて重合された多糖体の反復単位間ＡとＤのリン酸ジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合を表す。
【0085】
【図21】溶媒単独注入（ａ）；ＣＰＳ－１００（ｂ）；ＣＰＳ－４００（ｃ）のＨＰＳＥＣプロファイルを示すものである。１３．６及び１４．７４分におけるピークは、単独注入された溶媒のプロファイル（ａ）から見られるように、溶媒で誘発されたアーティファクトである。
【0086】
【図22】ＣＰＳ－４００に対して記録されたＮＭＲスペクトルを示すものである（６００ＭＨｚ、３１０Ｋ）：（ａ）ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ（黒）及びＨＳＱＣ（青緑）のオーバーレイ；（ｂ）ＨＭＢＣ（黒）及びＨＳＱＣ（青緑）のオーバーレイ；（ｃ）ＨＳＱＣ；（ｄ）ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ；（ｅ）～（ｈ）異なる領域のＴＯＣＳＹスペクトル。“＊”は、未確認されたマイナーモチーフに属する密度。構造単位の標識及び描写は、表４に開示した。
【0087】
【図23】リビトールＧの密度を描写するＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ（黒色／灰色）及びＨＳＱＣ（青緑／赤）の拡張を示すものである。Ｇ１及びＧ５からのＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ相関関係は、灰色点線で立証される。構造単位の標識及び描写は、表４に開示した（６００ＭＨｚ、３１０Ｋ）。
【0088】
【図24】精製された分画の莢膜多糖体の免疫刺激活性を確認するためにサイトカインのレベルを確認した結果である。脾臓細胞は、図２４に、すなわち、培地（対照群）、ＣＰＳ分画（ＣＰＳ－４００及びＣＰＳ－１００、５０μｇ／ｍＬ）、全体ＣＰＳ（５０μｇ／ｍＬ）及び脂質多糖体（Ｅ．Ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４由来ＬＰＳ、０．１μｇ／ｍＬ）の存在下に脾臓細胞を培養した。サイトカイン生産の評価のために、細胞培養上澄液をＥＬＩＳＡで分析した。（ａ）ＩＦＮγ；（ｂ）ＩＬ－１０；（ｃ）ＴＮＦ－α；（ｄ）ＩＬ－６；（ｅ）ＩＬ－１２；（ｆ）ＩＦＮγの生産に対するＣＰＳ－１００の容量反応曲線（Ｄｏｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ）。（ｆ）において、ＥＣ５０（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は３．１６μＭと計算された。データは、類似の結果の２～３回の独立実験値であり、全ての棒グラフは、平均±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（多重比較のための事後ダネットの検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔ’ ｔｅｓｔ）を用いた一元分散分析）；ＮＤ、検出無し。
【0089】
【図25】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９及びＣＰＳのＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化及び腫瘍内浸潤向上を用いた腫瘍成長抑制効果を示すものである。
【0090】
図２５のＡは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９又はＣＰＳで処理又は非処理されたＣ５７／Ｂｉ６ ＳＰＦマウスにおけるＢ１６．Ｆ１０黒色腫成長動力学を示すものである。
【0091】
図２５のＢは、マウスから分離された腫瘍を示す写真である。
【0092】
図２５のＣ及びＤは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ｃ）又はＣＰＳ（Ｄ）処理の開始１６～１８日後に流動細胞分析で決定された腫瘍浸潤ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の比率を示すものである。
【0093】
データは平均±ＳＥＭ値である。データは、ダネットの多重比較を用いた二元分散分析（Ａ）又は非パラメトリック両側検定（ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）（Ｃ－Ｄ）で分析された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１．
【0094】
図２５のＥ及びＦは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ｅ）又はＣＰＳ（Ｆ）で処理又は非処理時に、腫瘍浸潤ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞の平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）の量を示すものである。図２５のＧ及びＨは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ｇ）又はＣＰＳ（Ｈ）で処理又は非処理時に、ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度を示すものである。データは平均±ＳＥＭ値である。データは、非パラメトリック両側検定（ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）で分析された。＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ：無意義。
【0095】
【図26】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９及びＣＰＳが腫瘍内調節Ｔ細胞集団を変更させないことを示すものである。
【0096】
図２６のＡ及びＢは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ａ）又はＣＰＳ（Ｂ）の処理時に、腫瘍浸潤されたリンパ球内腫瘍浸潤ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞の百分率を示すものである。データは、非パラメトリック両側検定（ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）で分析された。＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ：無意義。
【0097】
【図27】Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のＥＭＴ乳癌の腫瘍成長抑制活性を示すものである。
【0098】
図２７のＡは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９処理又は非処理されたＢａｌｂ／ｃ ＳＰＦマウスにおけるＥＭＴ－６乳癌成長動力学を示すものである。データは平均±ＳＥＭであり、ダネットの多重比較と共に二元分散分析で分析された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0099】
【図28】ＣＰＳのＢ１６．Ｆ１０黒色腫において炎症性マクロファージのＣＰＳの腫瘍内浸潤向上活性を示すものである。
【0100】
図２８のＡは、腫瘍接種４０時間後に、ＣＰＳ処理時のＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋腫瘍浸潤マクロファージの数及び百分率を示すものである。
【0101】
図２８のＢ及びＣは、ＣＰＳ処理時に、腫瘍浸潤マクロファージ（Ｂ）及び樹状細胞（Ｃ）上の活性マーカー、ＣＤ１１ｂ、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８６及びＣＤ４０を示すものである。
【0102】
図２８のＤは、ＣＰＳ処理時に、腫瘍流れ込みリンパ節（Ｔｕｍｏｒ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）においてＣＤ８＋ＣＤ６９＋ Ｔ細胞の百分率を示すものである。データは平均±ＳＥＭであり、ダネットの多重比較と共に二元分散分析（Ａ）又は非パラメトリック両側検定（ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）（Ｂ）で分析された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0103】
図２８のＥ及びＦは、分離して直後（Ｅ）又は２４時間のＩＬ－４処理後（Ｆ）に、生体外でＣＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）処理されたマウス腹膜マクロファージ上の活性マーカー、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ｉＮＯＳ２、ＣＤ６８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６を示すものである。
【0104】
図２８のＧは、腫瘍接種４０時間後に分離されたＣＰＳ又はＰＢＳ処理された腫瘍由来マクロファージにおける豊富化したＭ１マクロファージ遺伝子シグネチャーをダビッド（ＤＡＶＩＤ）経路分析で分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0105】
特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野によく知られており、通常使われるものである。
【0106】
共生微生物がヒトのような宿主の免疫調節反応に深く関与することが知られることにより、免疫増進又は抑制能を有する共生微生物、すなわち、プロバイオティクスに対する研究が活発に行われている。ヒトと進化的に共存する数多い微生物種のうち、免疫調節能力を有するものと明らかにされた微生物種はごく少数に過ぎず、同じ種の微生物においても菌株によって免疫調節活性が顕著に異なるか、ひいては相反する効果を示す。微生物が保有する活性は、各微生物ごとに非常に多様で且つ異なるため、近年、免疫調節能力を有する微生物が生産する有用な代謝産物、又は有効分子のようなポストバイオティクスに対する関心が急増している。特に、マンノース、ベータ－グルカンと微生物由来の多糖体は、宿主の免疫システムに様々な影響を及ぼすものと知られている。しかしながら、微生物由来の多糖体もその種類及び構造によって様々な活性を有し、ザイモサンのような多糖体は、免疫増進及び抑制の両面性を同時に示すこともあることが報告された。したがって、プロバイオティクス由来の多糖体を、対象の免疫調節、特にヒトの臨床的治療用途に使用するためには、各多糖体の免疫調節メカニズムを明らかにすることが非常に重要である。しかしながら、多糖体の構造と免疫調節活性との連関性に対する報告はほとんどなされたことがない。
【0107】
本発明者らは、ポストバイオティクスの観点から、多糖体の構造と免疫調節活性との連関性を明らかにしようと鋭意努力してきており、免疫調節能を示すビフィスズ菌、酵母のような様々な菌株由来の多糖体の構造と免疫調節能の連関性及びメカニズムを明らかにし、特許出願したことがある（大韓民国特許出願第２０１８－００６７５３５号（登録予定）、第２０１９－００９１９０８号など）。
【0108】
本発明の一実施例において、本発明者らは、韓国の伝統発酵食品であるキムチから、高い免疫刺激活性を示す新規なラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＩＭＢ１９菌株を同定し、韓国生物資源センターに寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰ）。
【0109】
本発明の他の実施例において、先天的免疫システムと適応免疫システムの両方を含むように設計した共同培養システムにおいて、前記菌株が免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）の増加及び抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）を抑制させ、エフェクターＴ細胞を顕著に増加させ、Ｔｒｅｇの生成を抑制することにより、宿主内で免疫システムを刺激し、腫瘍の成長及び増殖を抑制することを確認した。
【0110】
したがって、本発明は、一観点において、ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰの寄託番号を有するラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９）に関する。
【0111】
本発明のラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９）は、優れた免疫賦活活性及び抗腫瘍活性を示すことを特徴とし得る。より具体的に、本発明の菌株は、ｉ）ヘルパーＴ細胞の誘導及びＴｒｅｇ細胞の分化抑制のような炎症性表現型へのＴ細胞分化誘導、ｉｉ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激、活性向上及び腫瘍内浸潤向上、ｉｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞活性抑制、ｉｖ）腫瘍内マクロファージ浸潤増加、ｖ）マクロファージの炎症性細胞への活性化、及びＭ２からＭ１マクロファージへの再プログラミングのような様々な免疫賦活活性及び／又は抗腫瘍活性を示すことを特徴とし得る。
【0112】
本発明のラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株（以下、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９と略称する。）は、キムチから分離されており、１６Ｓ ｒＲＮＡ分析、ｒｅｃＡ増幅／バンド比較及び全体遺伝子配列分析及び系統学的、形態学的、生理学的分析を通じて新規な菌株と同定され、寄託された。
【0113】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、発酵食品、例えば、キムチに由来するものであることを特徴とし得る。
【0114】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は小さくて滑らかな円形の半透明なコロニーを示すことを特徴とし得る。
【0115】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、無鞭毛性（ｎｏｎ－ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｄ）であることを特徴とし得る。
【0116】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、棒形（ｒｏｄ－ｓｈａｐｅｄ）コロニーを示すことを特徴とし得る。
【0117】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、莢膜層（ｃａｐｓｕｌａｒ ｌａｙｅｒ）を有することを特徴とし得る。
【0118】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、非溶血性（ｎｏｎ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）又はγ－溶血性（γ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）であることを特徴とし得る。
【0119】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、ゼラチナーゼ活性に陰性であることを特徴とし得る。
【0120】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）及び／又はプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）のような生体アミン（ｂｉｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｅ）を生成しないことを特徴とし得る。
【0121】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、カナマイシンに耐性を有することを特徴とし得る。
【0122】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、免疫増進及び／又は抗腫瘍活性を有することを特徴とし得る。より具体的な例に、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、ｉ）ヘルパーＴ細胞の誘導及びＴｒｅｇ細胞の分化抑制のような炎症性表現型へのＴ細胞分化誘導、ｉｉ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激、活性向上及び腫瘍内浸潤向上、ｉｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞活性抑制、ｉｖ）腫瘍内マクロファージ浸潤増加、ｖ）マクロファージの炎症性細胞への活性化及びＭ２からＭ１マクロファージへの再プログラミングのような様々な免疫増進及び抗腫瘍活性を有することができるが、これに制限されるものではない。
【0123】
本発明において、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、腫瘍の成長を抑制することを特徴とし得る。
【0124】
本発明の一実施例において、前記菌株を給与した動物腫瘍モデルにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激、マクロファージでの分化、表現型誘導、Ｔｒｅｇの抑制、免疫細胞の腫瘍浸潤向上などの様々なメカニズムを通じて顕著な免疫増進効果及び抗腫瘍活性を示すことを確認した。
【0125】
また、本発明の他の実施例において、ＣＰＳを処理時に腫瘍の成長が顕著に抑制されることを確認した。
【0126】
したがって、本発明は、他の観点において、前記菌株及び／又はその培養液を有効成分として含有する免疫調節用組成物に関する。
【0127】
本発明は、さらに他の観点において、前記菌株及び／又はその培養液を対象に投与する段階を含む免疫調節方法に関する。
【0128】
本発明は、さらに他の観点において、前記菌株及び／又はその培養液の免疫調節用途に関する。
【0129】
本発明は、さらに他の観点において、免疫調節用組成物を製造するための前記菌株及び／又はその培養液の用途に関する。
【0130】
本発明の用語“免疫調節”とは、血液内免疫アンバランスを解消し、免疫恒常性を維持することを意味する。免疫恒常性の維持は、免疫を抑制させる免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と免疫を増進させる免疫反応（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）とのバランスを取る状態をいい、このような状態の維持は、腫瘍及び癌を含む大部分の疾患の治療において必須の要素である。本発明において、前記組成物は、免疫刺激用途に用いられることが好ましい。
【0131】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、免疫刺激用途に用いられてよい。
【0132】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、免疫刺激用又は免疫増進用組成物であることを特徴とし得る。
【0133】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、プロバイオティクス組成物であることを特徴とし得る。
【0134】
本発明の用語プロバイオティクスは、適切な量で投与する場合に、宿主の健康に役立つ生きている微生物を意味する（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １１，５０６－５１４（２０１４））。プロバイオティクスは、宿主の腸内微生物相（ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ）に対する補充剤の働きをし、腸障壁機能を改善し、宿主の兔疫体系を調節することを特徴とし得る。
【0135】
本発明において、前記プロバイオティクス組成物は、プレバイオティクスをさらに含むことができる。
【0136】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、腫瘍、感染性疾患、免疫減少／抑制を原因又は症状とする免疫疾患の予防、改善又は治療のための目的で、薬学組成物又は食品組成物などとして使用されてよく、このとき、使用量及び使用形態は、目的に応じて適切に調節可能である。
【0137】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、他の薬学組成物又は食品組成物と併用して又は補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）として使用されてよい。例えば、前記他の薬学組成物は、免疫療法と関連した免疫治療剤、免疫細胞治療剤などがあるが、これに制限されるものではない。例えば、前記他の食品組成物は、発酵食品、発酵食品の製造のための発酵スターター、栄養剤のような健康機能食品などでよいが、これに制限されるものではない。
【0138】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又はその培養液の他にも、別のプロバイオティック菌株、化合物、補助剤、添加剤、担体、賦形剤などをさらに含むことができる。
【0139】
本発明の用語“その培養液”は、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株を含む培養原液でよく、その破砕物、遠心分離上澄液又はペレット、濃縮液、乾燥物などを全て含む包括的な意味で使われる。本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、通常のラクトバシラス菌株の培養方法によって培養できる。本発明の菌株の培養方法は、実施例の一例として記載した。培地としては天然培地又は合成培地などを使用することができる。培地の炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、デキストリン、グリセロールなどが使用されてよく、窒素源としては、ペプトン、肉類抽出物、酵母、大豆、アンモニウム塩、ナイトレート及びその他有機又は無機窒素含有化合物が使用されてよいが、これに限定されるものではない。培地に含まれる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カリウムなどが使用されてよいが、これに限定されるものではない。前記炭素源、窒素源及び無機塩の成分の他にもアミノ酸、ビタミン、核酸などが添加されてよい。
【0140】
本発明において、前記培養液は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株由来の免疫調節活性を有する有効成分（例えば、多糖体）を含有することを特徴とし得る。菌株の状態は液体状態又は乾燥状態であってよく、乾燥方法は、例えば、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥などがあるが、これに制限されるものではない。
【0141】
本発明は、さらに他の観点において、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株又はその培養液を有効成分として含有する腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【0142】
本発明は、さらに他の観点において、前記菌株及び／又はその培養液を対象に投与する段階を含む腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療方法に関する。
【0143】
本発明は、さらに他の観点において、前記菌株及び／又はその培養液の腫瘍又は感染性疾患の予防、改善又は治療用途に関する。
【0144】
本発明は、また、腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用薬学組成物を製造するための前記菌株及び／又はその培養液の用途に関する。
【0145】
本発明の用語“腫瘍”は、生体調節機構から離脱して細胞が自律性をもって過剰増殖する現象又はこれによって生成された新生物、又は過形成物のいずれをも含む。前記腫瘍は、例えば、良性、前悪性、悪性腫瘍のいずれをも含み、より具体的な例に、組織細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨腫、各種癌、例えば、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、胃腸管癌、腸癌、結腸癌、直膓癌、膵癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、膵癌、脳癌、肉腫、骨肉腫、黒色腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、ＦＬ、ＭＣＬ、ＭＺＢＬ、ＣＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬなど）、血液癌、白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害、粥状硬化症などを含むことができ、好ましくは、黒色腫、乳癌、腎臓癌、肺癌、膀胱癌、直膓癌であってよいが、これに制限されるものではない。
【0146】
本発明の用語“感染性疾患”は、様々な病原体の感染によって誘発又は悪化する病原体関連疾患を意味する。例えば、前記感染性疾患は、ウイルス、バクテリア、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、又はタンパク質凝集体などに感染されて誘発又は悪化する疾患であってよいが、これに制限されるものではない。
【0147】
本発明で使われる用語“予防”は、本発明に係る薬学組成物の投与によって疾患を抑制させるか、疾患の発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。
【0148】
本発明で使われる用語“治療”は、本発明に係る薬学組成物の投与によって疾患に対する症状が好転するか或いは有益に変更されるあらゆる行為を意味する。
【0149】
本発明の薬学組成物は、その有効成分の上述した免疫増進効果及び／又は抗腫瘍効果によって様々な疾患に対する予防又は治療及び抗炎症効果を示す。
【0150】
前記薬学組成物は、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株又はその培養液を含有する他、一般に薬学組成物に使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【0151】
前記組成物に含み得る担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエイト、プロピルヒドロキシベンゾエイト、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調合される。
【0152】
本発明に係る薬学組成物は、通常の方法によって様々な形態で剤形化して使用可能である。適宜の剤形には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、硬質又は軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤又は乳化液剤、注射剤、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液などがあるが、これに限定されるものではない。
【0153】
本発明に係る薬学組成物は、薬学的に不活性である有機又は無機担体を用いて適切な剤形とすることができる。すなわち、剤形が錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠及び硬質カプセル剤である場合に、ラクトース、スクロース、澱粉又はその誘導体、タルク、カルシウムカーボネート、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩を含むことができる。また、剤形が軟質カプセル剤である場合には、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固体及び液体のポリオールを含むことができる。また、剤形が溶液又はシロップ形態である場合に、水、ポリオール、グリセロール、及び植物性オイルなどを含むことができる。
【0154】
本発明に係る薬学組成物は、前記の担体の他にも、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、甘味剤、着色剤、滲透圧調節剤、酸化防止剤などをさらに含むことができる。
【0155】
本発明に係る薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、“薬学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されてよい。本発明に係る薬学組成物は、個別治療剤として投与されるか、別の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよく、単一又は多重投与されてよい。上記の要素を全て考慮し、副作用無しで最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されてよい。
【0156】
本発明の薬学組成物は、個体に様々な経路で投与されてよい。投与の方式は、例えば、皮下、静脈、筋肉又は子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与されてよい。本発明の薬学組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。
【0157】
本発明に係る薬学組成物の投与方法は、剤形によって容易に選択されてよく、経口又は非経口投与されてよい。投与量は、患者の年齢、性別、体重、病症の程度、投与経路によって変わってよい。
【0158】
本発明の組成物は、他の治療療法又は治療剤と併用して投与されてよい。腫瘍の予防又は治療用途に用いられる場合に、好ましくは、前記他の治療療法又は治療剤は、免疫療法又は免疫細胞治療剤であってよいが、これに制限されず、臨床医の判断によって様々に組合わせて使用されてよい。
【0159】
本発明は、さらに他の観点において、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株又はその培養液を有効成分として含有する免疫増進用食品組成物に関する。
【0160】
本発明は、さらに他の観点において、免疫増進用食品組成物を製造するための前記菌株及び／又はその培養液の用途に関する。
【0161】
本発明の食品組成物は、免疫活性を増強又は改善して免疫機能の恒常性を維持させることができる。
【0162】
本発明の食品組成物は、腫瘍又は感染性疾患の予防又は改善効果を示す健康機能食品であることを特徴とし得る。
【0163】
本発明の用語“食品”は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スネック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、プレバイオティクス、プロバイオティクス、ポストバイオティクス、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味の如何なる食品も含む。
【0164】
前記健康機能（性）食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ，ＦｏＳＨＵ）と同じ意味の用語であり、栄養供給の他にも生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで、“機能（性）”とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界で通常用いられる方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造できる。また、前記食品の剤形も、食品として認定される剤形であれば制限なく製造されてよく、本発明に係る健康機能食品は、粉末、顆粒錠剤、カプセル又は飲料の形態であってよい。
【0165】
前記健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）は、一般食品に比べて積極的な健康維持又は増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｏｄ）は、健康補助目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は、同一の意味で使われてよい。
【0166】
前記食品組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野において通常使用される担体であればいずれも使用可能である。
【0167】
また、前記組成物は、食品組成物に通常使用され、臭い、味、視覚などを向上させることができる追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ニアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【0168】
また、前記組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、ベンゾ酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、バブル抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含むことができる。前記添加物は、食品の種類によって選別され、適切な量で使用されてよい。
【0169】
本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株又はその培養液と共に食品学的に許容可能な食品補助添加剤をさらに含むことができ、他の食品又は食品成分と共に使用されてよく、通常の方法によって適切に使用されてよい。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）によって適切に決定されてよい。
【0170】
本発明の一実施例において、莢膜多糖体（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）が本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の免疫賦活活性を示す有効成分であることを確認した。
【0171】
また、本発明の他の実施例では、前記分離した莢膜多糖体がＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株と同様に、ｉ）ヘルパーＴ細胞の誘導及びＴｒｅｇ細胞の分化抑制のような炎症性表現型へのＴ細胞分化誘導、ｉｉ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激、活性向上及び腫瘍内浸潤向上、ｉｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞活性抑制、ｉｖ）腫瘍内マクロファージ浸潤増加、ｖ）マクロファージの炎症性細胞への活性化及びＭ２からＭ１マクロファージへの再プログラミングのような様々なメカニズムにより、優れた免疫賦活活性及び抗腫瘍活性を示すことを確認した。
【0172】
本発明の他の実施例において、前記莢膜多糖体は、ＮＭＲで構造的に分析された。
【0173】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、免疫賦活活性を有するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株由来の莢膜多糖体（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ＣＰＳ）に関する。
【0174】
本発明において、前記莢膜多糖体は、下記化学式Ｉの多糖体を含むことを特徴とし得る：
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１以上の整数である。
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１以上の整数である。
【0175】
本発明において、前記化学式Ｉの多糖体は、化学式Ｉにおいて［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］で表示される反復単位の重合体構造である。
【0176】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、前記反復単位は直接の共有結合の他にも様々な方法で制限なく連結されてよい。例えば、前記反復単位は、グリコシド結合、ホスホジエステル結合のような化学的結合によって連結されてよく、リンカーを媒介で連結されてよい。
【0177】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、反復単位（［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］）は、ＡとＤのグリコシド結合（－Ｏ－）で連結されたことを特徴とし得る。
【0178】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、反復単位（［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］）は、ＡとＤ間のリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｌｉｎｋａｇｅ）で連結されたことを特徴とし得る。
【0179】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、反復単位のＡの１位の炭素と他の反復単位のＤの６位の炭素とがリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｌｉｎｋａｇｅ）で連結されたことを特徴とし得る。
【0180】
本発明において、前記化学式ＩのＡ及びＤのいずれか一つ以上がリン酸化されたことを特徴とし、好ましくは、Ａの場合、１位の炭素の水酸化基がリン酸化されたことを特徴とし、Ｄの場合、６位の炭素の水酸化基がリン酸化されたことを特徴とし得る。
【0181】
本発明において、前記ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）は、自然系に一般に存在するガラクトース又はその誘導体を含む意味で使われる。例えば、本発明において、前記ガラクトースは異性質体であって、α型（α ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はβ型（β ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）、Ｄ型（Ｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はＬ型（Ｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）であってよく、好ましくはα－ガラクトース、より好ましくはα－Ｄ－ガラクトースであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0182】
本発明において、前記ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）は、自然系に一般に存在するラムノース又はその誘導体のいずれをも含む意味で使われる。例えば、本発明において、前記ラムノースは異性質体であって、α型（α ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はβ型（β ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）、Ｄ型（Ｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はＬ型（Ｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）であってよく、好ましくはα－ラムノース、より好ましくはα－Ｌ－ラムノースであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0183】
本発明において、本発明において、前記Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）は、Ｎ－アセチルグルコサミン及びその誘導体のいずれをも含む意味で使われる。
【0184】
本発明において、前記ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）は、一般のブドウ糖又はその誘導体のいずれをも含む意味で使われる。例えば、本発明において、前記ブドウ糖は異性質体であって、α型又はβ型、Ｄ型又はＬ型であってよく、好ましくは、β型配列を有するブドウ糖、より好ましくはＤ－ブドウ糖であることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0185】
本発明において、ＤとＢ（Ｄ－Ｂ）、及びＢとＩ（Ｂ－Ｉ）は、α－１，３－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0186】
本発明において、前記ＩとＦ（Ｉ－Ｆ）は、β－１，６－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0187】
本発明において、前記ＦとＧ（Ｆ－Ｇ）、ＧとＣ（Ｇ－Ｃ）、ＣとＥ（Ｃ－Ｅ）、及びＥとＨ（Ｅ－Ｈ）は、α－１，２－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0188】
本発明において、前記ＨとＡ（Ｈ－Ａ）は、α－１，６－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0189】
本明細書において、前記グリコシド結合は、結合配向によってα又はβで表示しており、続く数字はそれぞれ、２つの単糖類において、グリコシド結合（－Ｏ－）で連結された炭素番号を意味する。例えば、前記“ＩとＦ（Ｉ－Ｆ）はβ－１，６－グリコシド結合で連結された”とは、Ｉの１位の炭素とＦの６位の炭素がＩを基準にβ－配列のグリコシド結合で連結されたことを意味する。
【0190】
本発明において、前記莢膜多糖体は、ｎが１以上の整数である化学式Ｉの多糖体を含むことができ、様々なｎで重合された多数の化学式Ｉの多糖体を含むことができる。好ましくは、前記化学式Ｉの唐体は、ｎが１～１０であることを特徴とし得る。
【0191】
本発明の一実施例において、莢膜多糖体に含まれた化学式Ｉの多糖体の平均重合度は約４であり、平均分子量は約６．０ｋＤａと確認された。各反復単位（［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］）は、約１．５ｋＤａの分子量（ＭＷ）と確認された。
【0192】
本発明において、前記莢膜多糖体に含まれた化学式Ｉの多糖体の‘平均重合度（ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｎ）’は、好ましくは１～１０、最も好ましくは約４であることを特徴とし得る。
【0193】
本発明において、前記莢膜多糖体に含まれた化学式Ｉの多糖体の平均分子量は、１．５～１５ｋＤａ、好ましくは約６．０ｋＤａであることを特徴とし得る。
【0194】
本発明の一実施例において、前記莢膜多糖体に含まれた化学式Ｉの多糖体は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株由来の莢膜多糖体（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ＣＰＳ）を、約１００ｍＭのＮａＣｌを溶離液として用いてイオン交換クロマトグラフィー方法で分離した。詳細な分離方法は実施例に詳細に記載されているが、これに制限されず、本発明に記載の化学式Ｉの多糖体構造及び特徴に基づき、従来に知られた様々な精製方法で取得できる。
【0195】
本発明において、前記莢膜多糖体は、テイコ酸（ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）をさらに含むことができる。
【0196】
本発明の一実施例から確認されるように、本発明において、前記莢膜多糖体は、２個以上のテイコ酸をさらに含むことができる。
【0197】
本発明において、前記テイコ酸は、Ｇｒｏタイプ又はＲｂｏタイプであってよく、莢膜多糖体が２個以上のテイコ酸をさらに含む場合に、単一タイプの形態で、又は２種のタイプが混合して含まれてよい。
【0198】
本発明において、前記莢膜多糖体は、化学式Ｉの多糖体及び／又はテイコ酸の他にも、他の多糖体又は脂質のような生体分子をさらに含むことを特徴とし得る。
【0199】
本発明は、さらに他の観点において、
（ａ）上記の菌株を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された菌株から莢膜多糖体を取得する段階を含む、免疫賦活活性を有する多糖体の生産方法に関する。
（ａ）上記の菌株を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された菌株から莢膜多糖体を取得する段階を含む、免疫賦活活性を有する多糖体の生産方法に関する。
【0200】
本発明において、
（ｃ）取得された莢膜多糖体にイオン交換クロマトグラフィーを行い、免疫賦活活性を有する有効多糖体分画を取得する段階をさらに含むことを特徴とし得る。
（ｃ）取得された莢膜多糖体にイオン交換クロマトグラフィーを行い、免疫賦活活性を有する有効多糖体分画を取得する段階をさらに含むことを特徴とし得る。
【0201】
本発明の莢膜多糖体生産方法及び免疫賦活活性を有する有効多糖体分画を取得する段階は、一例として、本発明の実施例に詳細に記載されているが、これに制限されるものではない。
【0202】
本発明の実施例では、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株由来の莢膜多糖体（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ＣＰＳ）を様々な濃度のＮａＣｌ溶離液を使用したイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、各分画に含まれた多糖体の構造をＮＭＲで分析した。
【0203】
本発明の他の実施例では、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株由来の莢膜多糖体（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ＣＰＳ）の様々な分画のうち、１００ｍＭのＮａＣｌを使用して精製したＣＰＳ－１００においてのみ、顕著なレベルのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１２を生成し、且つ無視できるレベルのＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＬ１－β生産を示すのに対し、他の分画（ＣＰＳ－４００（テイコ酸を含む。）など）は有意義なサイトカイン生産が検出されず、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株の免疫賦活活性を示す有効分子が、ＣＰＳ－１００に含まれた特定反復単位のポリマー構造を有する多糖体（化学式Ｉ）であることを確認した。
【0204】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、下記化学式Ｉで表示される多糖体に関する。
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
前記化学式Ｉにおいて、
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１以上の整数である。
［化学式Ｉ］
－［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］ｎ－
前記化学式Ｉにおいて、
Ａ及びＤは、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）であり、
Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨは、ラムノース（Ｒｈａｍｎｏｓｅ）であり、
Ｆは、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）であり、
Ｉは、ブドウ糖であり、
ｎは、１以上の整数である。
【0205】
本発明において、前記化学式Ｉの多糖体は、化学式Ｉにおいて［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］で表示される反復単位の重合体構造である。
【0206】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、前記反復単位は、直接の共有結合の他にも様々な方法で制限なく連結されてよい。例えば、前記反復単位は、グリコシド結合、ホスホジエステル結合のような化学的結合によって連結されてよく、リンカーを媒介で連結されてよい。
【0207】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、反復単位（［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］）は、ＡとＤのグリコシド結合（－Ｏ－）で連結されたことを特徴とし得る。
【0208】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、反復単位（［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］）は、ＡとＤ間のリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｌｉｎｋａｇｅ）で連結されたことを特徴とし得る。
【0209】
本発明において、前記化学式Ｉのｎが２以上である場合に、反復単位のＡの１位の炭素と他の反復単位のＤの６位の炭素とがリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｌｉｎｋａｇｅ）で連結されたことを特徴とし得る。
【0210】
本発明において、前記化学式ＩのＡ及びＤのいずれか一つ以上がリン酸化されたことを特徴とし、好ましくは、Ａの場合、１位の炭素の水酸化基がリン酸化されたことを特徴とし、Ｄの場合、６位の炭素の水酸化基がリン酸化されたことを特徴とし得る。
【0211】
本発明において、前記ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）は、自然系に一般に存在するガラクトース又はその誘導体を含む意味で使われる。例えば、本発明において、前記ガラクトースは異性質体であって、α型（α ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はβ型（β ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）、Ｄ型（Ｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はＬ型（Ｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）であってよく、好ましくはα－ガラクトース、より好ましくはα－Ｄ－ガラクトースであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0212】
本発明において、前記ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）は、自然系に一般に存在するラムノース又はその誘導体のいずれをも含む意味で使われる。例えば、本発明において、前記ラムノースは異性質体であって、α型（α ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はβ型（β ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）、Ｄ型（Ｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）又はＬ型（Ｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）であってよく、好ましくはα－ラムノース、より好ましくはα－Ｌ－ラムノースであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0213】
本発明において、前記Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）は、自然系に一般に存在するＮ－アセチルグルコサミン又はその誘導体のいずれをも含む意味で使われる。
【0214】
本発明において、前記ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）は、一般のブドウ糖又はその誘導体のいずれをも含む意味で使われる。例えば、本発明において、前記ブドウ糖は異性質体であって、α型又はβ型、Ｄ型又はＬ型であってよく、好ましくは、β型配列を有するブドウ糖、より好ましくは、Ｄ－ブドウ糖であることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0215】
本発明の用語“誘導体”とは、化合物の構造が、本願に開示された化合物の構造と十分に類似であり、その類似性を基準に請求された化合物と同一又は類似の活性及び用途を示すか、或いは、前駆体として、請求された化合物と同一又は類似の活性及び用途を誘導することが予想される親化合物（例えば、本願に記載された化合物、化学式Ｉの多糖体）の構造に由来する構造を有する化合物を意味する。例えば、前記誘導体は、親化合物の塩、異性質体、エステル、アミド、エステル又はアミドの塩、Ｎ－酸化物などを含むが、これに制限されるものではない。
【0216】
本発明において、前記化学式ＩのＤとＢ（Ｄ－Ｂ）、及びＢとＩ（Ｂ－Ｉ）は、α－１，３－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0217】
本発明において、前記化学式ＩのＩとＦ（Ｉ－Ｆ）は、β－１，６－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0218】
本発明において、前記化学式ＩのＦとＧ（Ｆ－Ｇ）、ＧとＣ（Ｇ－Ｃ）、ＣとＥ（Ｃ－Ｅ）、及びＥとＨ（Ｅ－Ｈ）は、α－１，２－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0219】
本発明において、前記化学式ＩのＨとＡ（Ｈ－Ａ）は、α－１，６－グリコシド結合で連結されたことを特徴とし得る。
【0220】
本明細書において、前記連結は、結合配向によってα又はβで表示し、続く数字は２つの単糖類の（－Ｏ－）結合された炭素番号を意味する。
【0221】
本発明において、前記化学式Ｉのｎは、１以上の整数であり、好ましくは１～１０の整数、より好ましくはｎは４であることを特徴とし得る。
【0222】
本発明において、前記多糖体は、下記化学式ＩＩの構造を有することを特徴とし得る：
［化学式ＩＩ］
［化学式ＩＩ］
【0223】
本発明において、前記化学式ＩＩのｎは、好ましくは１～１０の整数、より好ましくは、ｎは４であることを特徴とし得る。
【0224】
本発明の一実施例において、莢膜多糖体の有効分画であるＣＰＳ－１００に含まれた化学式Ｉの多糖体の平均重合度は、約４であり、平均分子量は、約６．０ｋＤａと確認された。各反復単位（［－Ｄ－Ｂ－Ｉ－Ｆ－Ｇ－Ｃ－Ｅ－Ｈ－Ａ－］）は、約１．５ｋＤａの分子量（ＭＷ）と確認された。
【0225】
本発明において、前記化学式Ｉの多糖体は、重合度、リン酸化程度などによって、少なくとも約１．５ｋＤａ、好ましくは約１．５ｋＤａ～約１５ｋＤａ、より好ましくは約４ｋＤａの分子量を有することを特徴とし得る。
【0226】
本発明において、前記多糖体は、ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰの寄託番号を有するラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＩＭＢ１９菌株由来であることを特徴とし得る。
【0227】
本発明において、前記化学式Ｉの多糖体は、免疫増進及び／又は抗腫瘍活性を有することを特徴とし得る。より具体的な例として、前記Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株は、ｉ）ヘルパーＴ細胞の誘導及びＴｒｅｇ細胞の分化抑制のような炎症性表現型へのＴ細胞分化誘導、ｉｉ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激、活性向上及び腫瘍内浸潤向上、ｉｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞活性抑制、ｉｖ）腫瘍内マクロファージ浸潤増加、ｖ）マクロファージの炎症性細胞への活性化及びＭ２からＭ１マクロファージへの再プログラミングのような様々な免疫増進及び抗腫瘍活性を有してよいが、このようなメカニズムに制限されるものではない。
【0228】
本発明において、前記化学式Ｉの多糖体は、腫瘍の成長を抑制することを特徴とし得る。
【0229】
本発明において、通常の技術者らは、前記多糖体を、本発明の菌株を用いて生産／分離でき、その他の化学的又は生物学的方法で本発明の多糖体を誘導又は合成することができる。
【0230】
さらに、本発明の多糖体の薬動学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）及び／又は薬理学的（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）特性の改善又は臨床的剤形化（例えば、可溶性）のためのＣＰＳの構造の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が行われてよいことは自明である。例えば、ｉ）一つ以上の官能基の追加、ｉｉ）炭素鎖の変形、ｉｉｉ）一つ以上の水素又は水酸化基の添加、ｉｖ）末端基の変形（例えば、染料などのようなシグナル分子の追加）、ｖ）他の知られた糖分子との結合（例えば、経口又は全身伝達のための剤形など）などが行われてよいが、これに制限されるものではない。
【0231】
したがって、本発明の多糖体は、前記化学式Ｉ又は化学式ＩＩの多糖体に限定されるものでなく、本発明の免疫刺激、免疫増進効果を有する限り、前記化学式Ｉ又は化学式ＩＩの変形体、誘導体、類似体などのいずれをも含む概念として解釈されるべきである。
【0232】
したがって、本発明は、他の観点において、前記化学式Ｉの多糖体を有効成分として含有する免疫調節用組成物に関する。
【0233】
本発明は、さらに他の観点において、前記多糖体を対象に投与する段階を含む免疫調節方法に関する。
【0234】
本発明は、さらに他の観点において、前記多糖体の免疫調節用途に関する。
【0235】
本発明は、さらに他の観点において、免疫調節用組成物を製造するための多糖体の用途に関する。
【0236】
以下において、用語に関して特に断りのない限り、通常の技術者によって理解される意味又は本発明の他の観点で定義した意味と同一に理解されるであろう。
【0237】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、免疫刺激又は免疫増進用途に使用されてよい。
【0238】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、免疫刺激用又は免疫増進用組成物であることを特徴とし得る。
【0239】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、腫瘍、感染性疾患の他にも、免疫減少／抑制を原因又は症状とする免疫疾患の予防、改善又は治療のための目的で、薬学組成物又は食品組成物などの形態で製造及び使用されてよく、このとき、使用量及び使用形態は目的に応じて適切に調節できる。
【0240】
本発明の一実施例において、多糖体の５０％効果濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＥＣ５０）は、３．１６μＭと確認された。したがって、好ましくは、本発明の免疫調節用組成物は、少なくとも３．１６μＭ以上の多糖体を含むことを特徴とし得る。
【0241】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、他の薬学組成物又は食品組成物と併用して又は補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）として使用されてよい。例えば、前記他の薬学組成物は、免疫療法と関連した免疫治療剤、免疫細胞治療剤などがあるが、これに制限されるものではない。例えば、前記他の食品組成物は、発酵食品、栄養剤のような健康機能食品などでよいが、これに制限されるものではない。
【0242】
本発明において、前記免疫調節用組成物は、本発明の多糖体の他にも、他のプロバイオティック菌株、化合物、補助剤、添加剤、担体、賦形剤などをさらに含むことができる。
【0243】
本発明は、さらに他の観点において、本発明の化学式Ｉの多糖体を有効成分として含有する腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【0244】
本発明は、さらに他の観点において、前記多糖体を対象に投与する段階を含む腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療方法に関する。
【0245】
本発明は、さらに他の観点において、前記多糖体の腫瘍又は感染性疾患の予防、改善又は治療用途に関する。
【0246】
本発明は、また、腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用薬学組成物を製造するための前記多糖体の用途に関する。
【0247】
本発明の用語“腫瘍”は、生体調節機構から離脱して細胞が自律性をもって過剰増殖する現象又はこれによって生成された新生物、又は過形成物のいずれをも含む。前記腫瘍は、例えば、良性、前悪性、悪性腫瘍のいずれをも含み、より具体的な例として、組織細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨腫、各種癌、例えば、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、胃腸管癌、腸癌、結腸癌、直膓癌、膵癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、膵癌、脳癌、肉腫、骨肉腫、黒色腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、ＦＬ、ＭＣＬ、ＭＺＢＬ、ＣＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬなど）、血液癌、白血病、乾癬、骨疾患、線維増殖性障害、粥状硬化症などを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【0248】
本発明の用語“感染性疾患”は、様々な病原体の感染によって誘発又は悪化する病原体関連疾患を意味する。例えば、前記感染性疾患は、ウイルス、バクテリア、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、又はタンパク質凝集体などに感染されて誘発又は悪化する疾患でよいが、これに制限されるものではない。
【0249】
本発明の薬学組成物は、その有効成分である化学式Ｉの多糖体の上述した免疫増進効果及び／又は抗腫瘍効果によって様々な疾患に対する予防又は治療及び抗炎症効果を示す。
【0250】
前記薬学組成物は、その有効成分である化学式Ｉの多糖体を含有する他に、通常薬学組成物に使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【0251】
前記組成物に含み得る担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエイト、プロピルヒドロキシベンゾエイト、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調合される。
【0252】
本発明に係る薬学組成物は、通常の方法によって様々な形態で剤形化して使用されてよい。適宜の剤形には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、硬質又は軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤又は乳化液剤、注射剤、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液などがあるが、これに限定されるものではない。
【0253】
本発明に係る薬学組成物は、薬学的に不活性である有機又は無機担体を用いて適切な剤形で製造できる。すなわち、剤形が錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠及び硬質カプセル剤である場合に、ラクトース、スクロース、澱粉又はその誘導体、タルク、カルシウムカーボネート、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩を含むことができる。また、剤形が軟質カプセル剤である場合には、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固体及び液体のポリオールを含むことができる。また、剤形が溶液又はシロップ形態である場合に、水、ポリオール、グリセロール、及び植物性オイルなどを含むことができる。
【0254】
本発明に係る薬学組成物は、上記の担体の他にも、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、甘味剤、着色剤、滲透圧調節剤、酸化防止剤などをさらに含むことができる。
【0255】
本発明に係る薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、“薬学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されてよい。本発明に係る薬学組成物は、個別治療剤として投与するか、或いは他の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよく、単一又は多重投与されてよい。上記の要素を全て考慮し、副作用無しで最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されてよい。
【0256】
本発明の薬学組成物は、個体に様々な経路で投与されてよい。投与の方式は、例えば、皮下、静脈、筋肉又は子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与されてよい。本発明の薬学組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。
【0257】
本発明に係る薬学組成物の投与方法は、剤形によって容易に選択されてよく、経口又は非経口で、局所又は全身で投与されてよい。投与量は、患者の年齢、性別、体重、病症の程度、投与経路によって異なってよい。
【0258】
本発明の組成物は、他の治療療法又は治療剤と併用して投与されてよい。腫瘍の予防又は治療用途に使用される場合に、好ましくは、前記他の治療療法又は治療剤は免疫療法又は、免疫細胞治療剤であってよいが、これに制限されず、臨床医の判断によって様々に組合わせて使用されてよい。
【0259】
本発明は、さらに他の観点において、前記化学式Ｉの多糖体を有効成分として含有する免疫増進用食品組成物に関する。
【0260】
本発明は、さらに他の観点において、免疫増進用食品組成物を製造するための前記多糖体の用途に関する。
【0261】
本発明の食品組成物は、免疫活性を増強又は改善して免疫機能の恒常性を維持させることができる。
【0262】
本発明の食品組成物は、腫瘍又は感染性疾患の予防又は改善効果を示す健康機能食品であることを特徴とし得る。
【0263】
前記食品組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に制限されず、当該技術の分野において通常使用される担体であればいずれも使用可能である。
【0264】
また、前記組成物は、食品組成物に通常使用され、臭い、味、視覚などを向上させることができる追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ニアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【0265】
また、前記組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、ベンゾ酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、バブル抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含むことができる。前記添加物は、食品の種類によって選別され、適切な量で使用されてよい。
【0266】
本発明の食品組成物は、その有効成分である化学式Ｉの多糖体と共に食品学的に許容可能な食品補助添加剤をさらに含むことができ、他の食品又は食品成分と共に使用されてよく、通常の方法によって適切に使用されてよい。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）によって適切に決定されてよい。
【0267】
本発明の一実施例において、本発明の菌株及び菌株由来多糖体は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏを問わず、細胞においてＩＦＮ－γの発現を誘導し、ＩＬ－１０発現を抑制することによって、免疫反応を刺激して増進させることを確認した。
【0268】
本発明の他の実施例において、前記菌株及び菌株由来多糖体は、ＤＣを媒介してＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化できることを確認した。また、ＭｙＤ８８信号伝達体系が欠乏している場合にも、ＣＤ＋８ Ｔ細胞の活性化が顕著に減少することを確認した。
【0269】
本発明のさらに他の実施例では、前記菌株及び菌株由来多糖体でプライミングされたＤＣと未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞の共培養によってＴｈ１７細胞を誘導できることを確認した。
【0270】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、
（ａ）抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又は前記化学式Ｉの多糖体を処理してプライミングする段階；及び
（ｂ）プライミングされた抗原提示細胞をＴ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階を含む炎症性Ｔ細胞の製造方法に関する。
（ａ）抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又は前記化学式Ｉの多糖体を処理してプライミングする段階；及び
（ｂ）プライミングされた抗原提示細胞をＴ細胞と共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する段階を含む炎症性Ｔ細胞の製造方法に関する。
【0271】
本発明の用語“抗原提示細胞”とは、抗原を取り込んで処理した後、抗原由来切片をＭＨＣ ｃｌａｓｓ±分子のような抗原提示分子と共にＴ細胞に提示して分化を誘導する細胞を意味する。例えば、前記抗原提示細胞は、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）、ランゲルハンス細胞などがあるが、これに限定されるものではない。
【0272】
本発明において、前記（ｂ）段階のＴ細胞は、未成熟Ｔ細胞であることが好ましく、より好ましくは、未成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞又は未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞でよいが、これに制限されるものではない。
【0273】
本発明の用語“炎症性Ｔ細胞”とは、免疫反応に直接に、又は炎症前段階で免疫反応を誘導又は支援するＴ細胞を意味する。好ましくは、前記炎症性Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ ｃｅｌｌ）であってよく、より好ましくは、ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ Ｔｈ１７細胞であることを特徴とし得る。
【0274】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記方法で製造された炎症性Ｔ細胞を有効成分として含有する腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用細胞治療剤に関する。
【0275】
本発明の一実施例において、脾臓マクロファージ又はＭ２表現型マクロファージをＣＰＳに露出する場合に、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ２及びＣＤ４０が顕著に上方調節され、腫瘍微細環境において免疫を抑制するＭ２表現型マクロファージをＭ１表現型マクロファージに再プログラミングできることを確認した。
【0276】
したがって、本発明は、他の観点において、マクロファージにＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び／又は化学式Ｉの多糖体を処理してＭ１表現型マクロファージに分化する段階；及び前記活性化されたＭ１表現型マクロファージを取得する段階を含む、Ｍ１表現型マクロファージの製造方法に関する。
【0277】
本発明の用語“マクロファージ”は、白血球の一類型であって、病原体、外部物質、微生物、癌細胞、異常タンパク質などを飲み込んで分解する食作用をし、このような先天的免疫反応の他に適応免疫の抗原提示細胞としても働く。
【0278】
マクロファージは、炎症性マクロファージであるＭ１表現型マクロファージ、又は抗炎症性マクロファージであるＭ２表現型マクロファージに分類され、免疫の刺激及び抑制のバランスに関与する。特に、Ｍ２表現型マクロファージは、腫瘍の成長に寄与するものと報告されたことがある（Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ２８，ｘｉｉ１８－ｘｉｉ３２（２０１７）；Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９，４２１（２０１９））。前記Ｍ１表現型マクロファージは、ＮＫ細胞又はＴｈ１によって分泌されるＩＦＮ－γ、ＴＬＲのＰＡＭＰｓ認識によるＭｙＤ８８経路などを通じて活性化され、抗原提示、炎症遺伝子及び炎症性ケモカイン分泌誘導などのような免疫反応を刺激及び誘導するマクロファージを総称し、Ｍ２表現型マクロファージ（免疫抑制性マクロファージ）は、ＩＬ－４、ＩＬ－１３などによって分化されたマクロファージであり、免疫抑制能を示し、組織再建及び傷治癒に関与する。
【0279】
本発明において、前記（ａ）段階のマクロファージは、未成熟マクロファージ（ｎａｉｖｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）又はＭ２表現型マクロファージであってよい。
【0280】
本発明において、Ｍ１表現型マクロファージは、免疫反応を刺激又は誘導する炎症性表現型に活性化された如何なるマクロファージも含む。前記Ｍ１表現型マクロファージは、遺伝子発現プロファイルの変化によって分類が可能であり、例えば、前記Ｍ１表現型マクロファージは、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ２、及びＣＤ４０からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の発現が上方調節されたことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0281】
本発明の用語、“マクロファージの分化”とは、マクロファージの既存遺伝子発現プロファイルにおいて、他の遺伝子発現プロファイルを示す表現型へと活性化又は転換されることを意味する。前記分化は未成熟マクロファージの活性化又は分極化の他、既に活性化されて特定表現型（例えば、Ｍ１表現型又はＭ２表現型）を示すマクロファージの再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）も含む意味で使われる。
【0282】
本発明の用語“上方調節”とは、マクロファージの転換前の表現型と比較して、特定の遺伝子又はタンパク質の発現が向上していることを意味する。
【0283】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記方法で製造された炎症性マクロファージを有効成分として含有する腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療用細胞治療剤に関する。
【0284】
実施例
【0285】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0286】
実施例１：材料及び方法
１．バクテリア培養及び同定
キムチを均質化し、懸濁液を収集した。その後、連続希釈し、ＭＲＳブロス及び寒天にストリークして３７℃で４８時間培養してコロニーを分離し、様々な分析のために追加培養した。
１．バクテリア培養及び同定
キムチを均質化し、懸濁液を収集した。その後、連続希釈し、ＭＲＳブロス及び寒天にストリークして３７℃で４８時間培養してコロニーを分離し、様々な分析のために追加培養した。
【0287】
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９）は、一般に、２４～３６時間、３７℃でＭＲＳブロスで培養した。ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）のために、バクテリアを培養した後、ＭＲＳ－１．５％寒天（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）にストリークし、２４～３０時間培養した。バクテリアコロニーは、２０００メッシュグラフェンコーティング銅グリッドにドロップキャスティングした。ＴＥＭイメージングは、ＪＥＯＬ１２２０及びＨｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００を用いて８０ｋＶで行った。
【0288】
同定のために、選別された分離菌株の細胞の形態を顕微鏡で調べ、遺伝的特性分析はゲノムＤＮＡを用いて行い、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（韓国）で１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析を行った。
【0289】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、正方向（２７Ｆプライマー）５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’、及び逆方向（１４９２Ｒプライマー）５’－ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’の汎用プライマーを用いて直接ＰＣＲによって増幅された。
【0290】
２．一次細胞ベースの試験
２－１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ脾臓細胞刺激
全ての動物実験及び手順は、ポハン工科大学動物管理及び使用委員会の倫理規定及び承認に従って行われた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、病原体のない動物障壁施設で飼育及び施設内繁殖され、６～８週齢で使用された。脾臓を収穫し、滑らかに粉砕して脾臓細胞を放出した。細胞懸濁液をアンモニウムクロリドバッファーを用いてＲＢＣ溶解させ、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙ－Ｃｌｏｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｓ．Ｋｏｒｅａ）に再懸濁させた。細胞を９６ウェルプレートで、抗ＣＤ３（Ｂｉｏ－Ｘｃｅｌｌ，ＵＳＡ）１０ｎｇ／ｍＬ及びＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）２．５ｎｇ／ｍＬを含有する２００μＬの培地／ウェルに２００ｋ／ウェルの密度でプレーティングした。分画されたＣＰＳ－１００、分画されていない全体ＣＰＳ（ｔＣＰＳ）、ＬＰＳ（Ｅ－ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４由来の脂糖類（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）及び培地を必要に応じて添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件で４８時間培養した。メーカーの指針に従い、遠心分離後に上澄液を収集し、酵素連結免疫吸着分析（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）；ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅａｄｙ ｓｅｔ ｇｏ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ）を用いてサイトカイン推定のために冷凍させた。
２－１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ脾臓細胞刺激
全ての動物実験及び手順は、ポハン工科大学動物管理及び使用委員会の倫理規定及び承認に従って行われた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、病原体のない動物障壁施設で飼育及び施設内繁殖され、６～８週齢で使用された。脾臓を収穫し、滑らかに粉砕して脾臓細胞を放出した。細胞懸濁液をアンモニウムクロリドバッファーを用いてＲＢＣ溶解させ、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙ－Ｃｌｏｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｓ．Ｋｏｒｅａ）に再懸濁させた。細胞を９６ウェルプレートで、抗ＣＤ３（Ｂｉｏ－Ｘｃｅｌｌ，ＵＳＡ）１０ｎｇ／ｍＬ及びＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）２．５ｎｇ／ｍＬを含有する２００μＬの培地／ウェルに２００ｋ／ウェルの密度でプレーティングした。分画されたＣＰＳ－１００、分画されていない全体ＣＰＳ（ｔＣＰＳ）、ＬＰＳ（Ｅ－ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４由来の脂糖類（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＵＳＡ）及び培地を必要に応じて添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件で４８時間培養した。メーカーの指針に従い、遠心分離後に上澄液を収集し、酵素連結免疫吸着分析（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）；ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅａｄｙ ｓｅｔ ｇｏ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ）を用いてサイトカイン推定のために冷凍させた。
【0291】
２－２．免疫細胞共同培養システム
上述したように脾臓細胞の分離を行った。ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）及び未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ－ｃｅｌｌｓ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、メーカーのプロトコルに従って分離された。ＡＰＣは、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２０時間プロバイオティック菌株と共に培養された。その後、プロバイオティック菌株を洗浄し、プライミングされたＡＰＣ及びＣＤ４＋ Ｔ細胞を特定条件で共に共同培養した。
上述したように脾臓細胞の分離を行った。ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）及び未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ－ｃｅｌｌｓ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、メーカーのプロトコルに従って分離された。ＡＰＣは、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２０時間プロバイオティック菌株と共に培養された。その後、プロバイオティック菌株を洗浄し、プライミングされたＡＰＣ及びＣＤ４＋ Ｔ細胞を特定条件で共に共同培養した。
【0292】
３．安全性評価（Ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）
３－１．溶血テスト（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ Ｔｅｓｔ）
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を最適の成長条件で成長させた後、５％のヒツジ血液寒天（Ｈａｎｉｌ，Ｋｏｍｅｄ）にストリークして４８時間培養した。アルファ（α）２溶血は、赤血球のヘモグロビンの部分分解と見なし（実際に溶血を示さない。）、寒天プレートにおいて透明領域として観察されるベータ（β）溶血は、赤血球のヘモグロビンの完全な分解と見なし、ガンマ（γ）溶血は溶血不足と見なした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２７３４８を陽性対照群として使用した。
３－１．溶血テスト（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ Ｔｅｓｔ）
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を最適の成長条件で成長させた後、５％のヒツジ血液寒天（Ｈａｎｉｌ，Ｋｏｍｅｄ）にストリークして４８時間培養した。アルファ（α）２溶血は、赤血球のヘモグロビンの部分分解と見なし（実際に溶血を示さない。）、寒天プレートにおいて透明領域として観察されるベータ（β）溶血は、赤血球のヘモグロビンの完全な分解と見なし、ガンマ（γ）溶血は溶血不足と見なした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２７３４８を陽性対照群として使用した。
【0293】
３－２．ゼラチン分解試験
基本プロトコルは、ＡＳＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ（Ｄｅｌａ Ｃｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に従って行った。最適の成長条件で成長したＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９をゼラチン培地に接種ループで接種し、３０℃で最大で５日間培養し、ゼラチン液化及びバクテリア成長を毎日確認した。ゼラチンは一般に２８℃以上で液化される。液化がゼラチン分解酵素活性によるものか否かを確認するために、チューブを冷蔵庫に３０分間保管した。その後、チューブを傾け、ゼラチンが分解されたか観察した。ゼラチンが分解された場合に、低温の露出後にも液化培地として現れる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１１７７８を陽性対照群として使用した。
基本プロトコルは、ＡＳＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ（Ｄｅｌａ Ｃｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に従って行った。最適の成長条件で成長したＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９をゼラチン培地に接種ループで接種し、３０℃で最大で５日間培養し、ゼラチン液化及びバクテリア成長を毎日確認した。ゼラチンは一般に２８℃以上で液化される。液化がゼラチン分解酵素活性によるものか否かを確認するために、チューブを冷蔵庫に３０分間保管した。その後、チューブを傾け、ゼラチンが分解されたか観察した。ゼラチンが分解された場合に、低温の露出後にも液化培地として現れる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１１７７８を陽性対照群として使用した。
【0294】
３－３．生体アミン生産分析（ｂｉｏｌｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、最適の成長条件で成長し、Ｂｏｖｅｒ－Ｃｉｄ及びＨｏｌｚａｐｆｅｌ（Ｂｏｖｅｒ－Ｃｉｄ ｅｔ ａｌ，１９９９）によってヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）及びプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）の前駆体が含まれた特殊培地にストリークして３７℃、３０℃及び２３℃で４日間培養した。その後、培地色相の変化を確認し、陽性及び陰性を決定した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２を陽性対照群として使用した。培養は、ブロモクレゾールパープル指示薬（ｂｒｏｍｏ ｃｒｅｓｏｌ ｐｕｒｐｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）と共に、オルニチン、リジン、チロシン、ヒスチジンのいずれか一つの塩基性培養培地を用いて寒天上で行った。
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、最適の成長条件で成長し、Ｂｏｖｅｒ－Ｃｉｄ及びＨｏｌｚａｐｆｅｌ（Ｂｏｖｅｒ－Ｃｉｄ ｅｔ ａｌ，１９９９）によってヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）及びプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）の前駆体が含まれた特殊培地にストリークして３７℃、３０℃及び２３℃で４日間培養した。その後、培地色相の変化を確認し、陽性及び陰性を決定した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２を陽性対照群として使用した。培養は、ブロモクレゾールパープル指示薬（ｂｒｏｍｏ ｃｒｅｓｏｌ ｐｕｒｐｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）と共に、オルニチン、リジン、チロシン、ヒスチジンのいずれか一つの塩基性培養培地を用いて寒天上で行った。
【0295】
３－４．抗生剤耐性試験
基本プロトコルは、ＩＳＯ推奨事項（ＩＳＯ－１０９３２，２０１０）に基づいて行った。抗生剤に対する菌株の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を評価するために、ブロス希釈方法を用いた。
基本プロトコルは、ＩＳＯ推奨事項（ＩＳＯ－１０９３２，２０１０）に基づいて行った。抗生剤に対する菌株の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を評価するために、ブロス希釈方法を用いた。
【0296】
培養液微細希釈において試験有機体は培養液培地で純粋に培養し、全ての有機体を１Ｘ ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで洗浄されたバクテリア溶液を、０．０１～０．０２の６００ｎｍ光学密度（ＯＤ）単位で調整した。菌株１０μＬ（１～２×１０５ＣＦＵ）を抗生剤と共に、２００μＬのＬＳＭブロス培地を含む９６ウェルプレートに接種した。
【0297】
菌株は、ヨーロッパ食品安全庁（ＥＦＳＡ，２０１８）で設定したパラメータによって設定されたカット－オフ値と同一であるか或いは低い特定抗生剤に対する濃度で抑制された時に感受性と見なされ、規定によって設定されたカット－オフ値よりも高い特定抗生剤濃度で抑制されないと、耐性があると見なされた。
【0298】
４．未精製莢膜多糖体（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＰＳ）の分離
未精製莢膜多糖体（ＣＰＳ）の分離は、以前に記述された方法を変形して行われた（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。細菌培養液を遠心分離し、１０％振幅及び１０秒のパルスで１５分間Ｂｒａｎｓｏｎデジタル超音波処理器で超音波処理した。上澄液は、トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（０．５％ ｗ／ｖ））で４℃で一晩処理された。サンプルを６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、１００％エタノールを３：１の比率で上澄液に添加し、未精製多糖体を－２０℃で沈殿させた。沈殿物を、耐毒素のない蒸留水に準備されたマグネシウムクロリド（２０ｍＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びカルシウムクロリド（２０ｍＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するトリスバッファー（１００ｍＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に再懸濁し、ＤＮＡｓｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＲＮＡｓｅ（０．４ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で３７℃で４～６時間処理した。タンパク質汚染物質を分解するために、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ，０．３ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に添加して４℃で一晩培養した。サンプルに３７℃で３０分間トリクロロ酢酸（１～２％ ｗ／ｖ）を処理し、添加された酵素を含む総タンパク質を除去した。タンパク質の除去されたサンプルの総多糖体は、エタノール沈殿によって再び沈殿された。ペレットを耐毒素のない水に再懸濁し、４℃で４８時間１日に２回で水を入れ替えながら透析した（ＭＷ ｃｕｔ－ｏｆｆ １２，０００Ｄａ）。総ＣＰＳ分画は、培養物リットルにつき２０ｍｇの最終収率で凍結乾燥させて取得した。
未精製莢膜多糖体（ＣＰＳ）の分離は、以前に記述された方法を変形して行われた（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。細菌培養液を遠心分離し、１０％振幅及び１０秒のパルスで１５分間Ｂｒａｎｓｏｎデジタル超音波処理器で超音波処理した。上澄液は、トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（０．５％ ｗ／ｖ））で４℃で一晩処理された。サンプルを６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、１００％エタノールを３：１の比率で上澄液に添加し、未精製多糖体を－２０℃で沈殿させた。沈殿物を、耐毒素のない蒸留水に準備されたマグネシウムクロリド（２０ｍＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びカルシウムクロリド（２０ｍＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するトリスバッファー（１００ｍＭ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に再懸濁し、ＤＮＡｓｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＲＮＡｓｅ（０．４ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で３７℃で４～６時間処理した。タンパク質汚染物質を分解するために、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ，０．３ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に添加して４℃で一晩培養した。サンプルに３７℃で３０分間トリクロロ酢酸（１～２％ ｗ／ｖ）を処理し、添加された酵素を含む総タンパク質を除去した。タンパク質の除去されたサンプルの総多糖体は、エタノール沈殿によって再び沈殿された。ペレットを耐毒素のない水に再懸濁し、４℃で４８時間１日に２回で水を入れ替えながら透析した（ＭＷ ｃｕｔ－ｏｆｆ １２，０００Ｄａ）。総ＣＰＳ分画は、培養物リットルにつき２０ｍｇの最終収率で凍結乾燥させて取得した。
【0299】
５．ＧＣ－ＭＳ分析条件
全ての化学誘導体は、質量選択検出器５９７３Ｎ及びＺｅｂｒｏｎ ＺＢ－５毛細管カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、フィルム厚０，２５μｍ、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、キャリアガスとしてＨｅ）が装着された気体－液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ－ＭＳ）Ａｇｉｌｅｎｔ ７８２０Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析された。電子衝撃質量スペクトルは、７０ｅＶのイオン化エネルギー及び０．２ｍＡのイオン化電流で記録された。使用された温度プログラムは、次の通りである：１５０℃で５分、１０℃／ｍｉｎで１５０℃で３００℃まで、３００℃で１２分。
全ての化学誘導体は、質量選択検出器５９７３Ｎ及びＺｅｂｒｏｎ ＺＢ－５毛細管カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、フィルム厚０，２５μｍ、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、キャリアガスとしてＨｅ）が装着された気体－液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ－ＭＳ）Ａｇｉｌｅｎｔ ７８２０Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析された。電子衝撃質量スペクトルは、７０ｅＶのイオン化エネルギー及び０．２ｍＡのイオン化電流で記録された。使用された温度プログラムは、次の通りである：１５０℃で５分、１０℃／ｍｉｎで１５０℃で３００℃まで、３００℃で１２分。
【0300】
６．ＮＭＲ収集媒介変数
分離された多糖体の構造的分析のために、Ｚ軸に沿って勾配が形成された逆クライオ－プローブ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｙｏ－ｐｒｏｂｅ）付きＢｒｕｋｅｒ ６００ＭＨｚ分光器を用いてＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏに記録した。スペクトルは２９８Ｋ又は３１０Ｋで測定し、内部標準として、アセトン（１Ｈ ２．２２５ｐｐｍ；１３Ｃ ３１．４５ｐｐｍ）で補正し、Ｔｏｐｓｐｉｎ ２．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）で獲得し、Ｔｏｐｓｐｉｎ ３．６で処理及び研究した。１Ｈ－１Ｈ ＤＱ－ＣＯＳＹ（二重量子ＣＯＺＹスペクトル；以下、ＣＯＳＹ）、ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルは、２０４８×５１２ポイントのデータセット（ｔ１×ｔ２）及びＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルの場合にそれぞれ１００ｍｓ及び２００ｍｓの混合時間が設定された２４回のスキャンで収集した。異種核１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹスペクトルは、２０４８×５１２ポイントのデータセットを用いた１Ｈ－検出モードで行われた。ＨＳＱＣ及びＨＳＱＣ－ＴＯＳＣＹは、“ＣＨ２”密度を他の密度と区別するために、選択段階で多重編集によって行われた。ＨＭＢＣは、一結合（ｏｎｅ－ｂｏｎｄ）相関関係を抑制するために、低域通過Ｊフィルターを用いて長距離カップリング定数に最適化され、長距離相関関係の進化には６０ｍｓ遅延が用いられた。ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹは、混合時間を１００ｍｓに設定した。全ての二次元試験において、データマトリックスは４０９２×２０４８ポイントに拡張され、ｑｓｉｎｅ又はｓｉｎｅ窓関数を適用して変換した。
分離された多糖体の構造的分析のために、Ｚ軸に沿って勾配が形成された逆クライオ－プローブ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｙｏ－ｐｒｏｂｅ）付きＢｒｕｋｅｒ ６００ＭＨｚ分光器を用いてＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏに記録した。スペクトルは２９８Ｋ又は３１０Ｋで測定し、内部標準として、アセトン（１Ｈ ２．２２５ｐｐｍ；１３Ｃ ３１．４５ｐｐｍ）で補正し、Ｔｏｐｓｐｉｎ ２．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）で獲得し、Ｔｏｐｓｐｉｎ ３．６で処理及び研究した。１Ｈ－１Ｈ ＤＱ－ＣＯＳＹ（二重量子ＣＯＺＹスペクトル；以下、ＣＯＳＹ）、ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルは、２０４８×５１２ポイントのデータセット（ｔ１×ｔ２）及びＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルの場合にそれぞれ１００ｍｓ及び２００ｍｓの混合時間が設定された２４回のスキャンで収集した。異種核１Ｈ－１３Ｃ ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹスペクトルは、２０４８×５１２ポイントのデータセットを用いた１Ｈ－検出モードで行われた。ＨＳＱＣ及びＨＳＱＣ－ＴＯＳＣＹは、“ＣＨ２”密度を他の密度と区別するために、選択段階で多重編集によって行われた。ＨＭＢＣは、一結合（ｏｎｅ－ｂｏｎｄ）相関関係を抑制するために、低域通過Ｊフィルターを用いて長距離カップリング定数に最適化され、長距離相関関係の進化には６０ｍｓ遅延が用いられた。ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹは、混合時間を１００ｍｓに設定した。全ての二次元試験において、データマトリックスは４０９２×２０４８ポイントに拡張され、ｑｓｉｎｅ又はｓｉｎｅ窓関数を適用して変換した。
【0301】
７．動物及びマウス腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ／６＆Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ポハン工科大学校動物施設で確保及び維持した。Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲトランスジェニック、ＭｙＤ８８－／－及びＩＬ－６－／－マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから得てＰＯＳＴＥＣＨ動物施設で維持された。Ｃ５７ＢＬ／６－由来黒色腫細胞株Ｂ１６．Ｆ１０及びＢａｌｂ／ｃ由来乳癌細胞株ＥＭＴ－６は、ＡＴＣＣから調達して提供されたプロトコルによって維持された。共通遺伝子腫瘍モデル（Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ）は、２０万個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞又は５０万個のＥＭＴ－６細胞を皮下注射して生成した。終点まで隔日で腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を長さ×広さ２×０．５で計算した。先天性免疫細胞の初期浸潤分析のために、腫瘍細胞を５ｍｉｌｌ／マウスに皮下注射し、４０時間後に腫瘍細胞を分析した。全ての実験動物手順は、ポハン工科大学校動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けて行われた。
Ｃ５７ＢＬ／６＆Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ポハン工科大学校動物施設で確保及び維持した。Ｐｍｅｌ－１ ＴＣＲトランスジェニック、ＭｙＤ８８－／－及びＩＬ－６－／－マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから得てＰＯＳＴＥＣＨ動物施設で維持された。Ｃ５７ＢＬ／６－由来黒色腫細胞株Ｂ１６．Ｆ１０及びＢａｌｂ／ｃ由来乳癌細胞株ＥＭＴ－６は、ＡＴＣＣから調達して提供されたプロトコルによって維持された。共通遺伝子腫瘍モデル（Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ）は、２０万個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞又は５０万個のＥＭＴ－６細胞を皮下注射して生成した。終点まで隔日で腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を長さ×広さ２×０．５で計算した。先天性免疫細胞の初期浸潤分析のために、腫瘍細胞を５ｍｉｌｌ／マウスに皮下注射し、４０時間後に腫瘍細胞を分析した。全ての実験動物手順は、ポハン工科大学校動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を受けて行われた。
【0302】
８．細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析方法
脾臓及び／又はリンパ節から採取した総細胞を、全体脾臓細胞培養に使用するか又は磁性ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に適用し、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞、未成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌ）又は未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞を豊富にさせた。総脾臓細胞（２０万個／ウェル）を９６プレートにバクテリアと１：１の比率で培養し、４８時間目に上澄液を収穫し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ ｓｅｔ Ｇｏ ｋｉｔｓ）に使用した。ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（２０万個／ウェル）を適切な比率のバクテリアで１８～２０時間プライミングし洗浄した後、Ｔ細胞（２０万個／ウェル）を添加して７２時間培養した。指示されたように、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激のためにａｎｔｉ－ＣＤ３＠０．０１μｇ／ｍｌ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ＠２．５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の刺激のためにａｎｔｉ－ＣＤ３＠０．１μｇ／ｍｌ、ＧＭ－ＣＳＦ＠１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ２＠１００Ｕ／ｍｌ及びＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。
脾臓及び／又はリンパ節から採取した総細胞を、全体脾臓細胞培養に使用するか又は磁性ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に適用し、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞、未成熟ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌ）又は未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞を豊富にさせた。総脾臓細胞（２０万個／ウェル）を９６プレートにバクテリアと１：１の比率で培養し、４８時間目に上澄液を収穫し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ ｓｅｔ Ｇｏ ｋｉｔｓ）に使用した。ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（２０万個／ウェル）を適切な比率のバクテリアで１８～２０時間プライミングし洗浄した後、Ｔ細胞（２０万個／ウェル）を添加して７２時間培養した。指示されたように、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激のためにａｎｔｉ－ＣＤ３＠０．０１μｇ／ｍｌ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ＠２．５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の刺激のためにａｎｔｉ－ＣＤ３＠０．１μｇ／ｍｌ、ＧＭ－ＣＳＦ＠１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ２＠１００Ｕ／ｍｌ及びＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。
【0303】
腹膜マクロファージは、２％ ＢＩｏｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を腹腔内注射して５日後に細胞を収穫し、組換えネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＣＳＦ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した。選択的に活性化されたマクロファージの分極化（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のために、ＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２４時間添加した後、ＣＰＳ、ＬＰＳ（Ｅ－ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４由来脂質多糖体、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）又はＰａｍ３ＣＳｋ４（Ｓｉｇｍａ）で処理した。
【0304】
９．メタ遺伝体（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）分析及び全体遺伝子配列分析（Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
腫瘍を保有しているＳＰＦマウスの大便ペレットを、メタ遺伝体分析を委託した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｓ．Ｋｏｒｅａ）。バクテリアの全体遺伝子配列分析は、イルミナプラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｓ．Ｋｏｒｅａ）で行われ；バクテリア培養サンプルを、分析のために直接送付した。生物情報学的分析も、Ｍａｃｒｏｇｅｎに委託して行った。
腫瘍を保有しているＳＰＦマウスの大便ペレットを、メタ遺伝体分析を委託した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｓ．Ｋｏｒｅａ）。バクテリアの全体遺伝子配列分析は、イルミナプラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｓ．Ｋｏｒｅａ）で行われ；バクテリア培養サンプルを、分析のために直接送付した。生物情報学的分析も、Ｍａｃｒｏｇｅｎに委託して行った。
【0305】
１０．腫瘍浸潤マクロファージの分類及び遺伝子発現プロファイル分析
マウスに５００μｇのＣＰＳを２４時間間隔で２回注入した後、５×１０６個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞を皮下に接種した。腫瘍移植４０時間後に、浸潤免疫細胞を含む全体腫瘍をリベラーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）において単一細胞懸濁液で消化させた。同じ処理グループにおいて５～１０匹のマウスサンプルを募集し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ－ｅｆ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５－ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｏｅｇｅｎｄ，３０－Ｆ１１）、ＣＤ３－ｅｆ４５０（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ１９－ＰＢ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１Ｄ３）、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－ＰＥＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１１ｃ－ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ４１８）及びＣＤ１１ｂ－ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（ＢＤ，Ｍ１／７０）で染色した。生きているＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＭＨＣＩＩｈｉＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージを、ＦＢＳ補充された培地で分類し、遠心分離してトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ，Ｓｉｇｍａ）に保管した。サンプルは、Ｍａｃｒｏｇｅｎで遺伝子発現プロファイルを分析し、処理群間の遺伝子転写体の数週の平均フォールドチェンジを計算し、両比較においてフォールド－チェンジが１．５以上である遺伝子を、経路分析のためにＤＡＶＩＤ ｖ６．７（Ｔｈｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖ６．７）に入力した。免疫機能が顕著に強化されたと決定された遺伝子を、ヒートマップに表示した（ｐ＜０．０５）。
マウスに５００μｇのＣＰＳを２４時間間隔で２回注入した後、５×１０６個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞を皮下に接種した。腫瘍移植４０時間後に、浸潤免疫細胞を含む全体腫瘍をリベラーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）において単一細胞懸濁液で消化させた。同じ処理グループにおいて５～１０匹のマウスサンプルを募集し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ－ｅｆ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５－ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｏｅｇｅｎｄ，３０－Ｆ１１）、ＣＤ３－ｅｆ４５０（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ１９－ＰＢ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１Ｄ３）、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－ＰＥＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１１ｃ－ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ４１８）及びＣＤ１１ｂ－ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（ＢＤ，Ｍ１／７０）で染色した。生きているＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＭＨＣＩＩｈｉＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージを、ＦＢＳ補充された培地で分類し、遠心分離してトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ，Ｓｉｇｍａ）に保管した。サンプルは、Ｍａｃｒｏｇｅｎで遺伝子発現プロファイルを分析し、処理群間の遺伝子転写体の数週の平均フォールドチェンジを計算し、両比較においてフォールド－チェンジが１．５以上である遺伝子を、経路分析のためにＤＡＶＩＤ ｖ６．７（Ｔｈｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖ６．７）に入力した。免疫機能が顕著に強化されたと決定された遺伝子を、ヒートマップに表示した（ｐ＜０．０５）。
【0306】
１１．リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒成分析
従来知られた方法で分析を行った。具体的に、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにＯＶＡペプチド（ＬＭ－ＯＶＡ）を発現させるリステリアモノサイトゲネスを５０００ＣＦＵ／ｍｉｃｅで注入した。マウスに隔日でＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株を給与した。６日目に、未成熟Ｃ５７／ｂｌ６マウスの脾臓細胞をＯＶＡペプチドパルスし、ペプチドパルスされているかされていない細胞をＣＦＳＥ又はＣＴＶで染色し、１：１の比率で混合し、感染されたマウスの静脈内に投与した。ＬＭ－ＯＶＡに感染されたマウスを２時間後に犠牲させ、脾臓細胞／リンパ節を収穫し、流動細胞分析を用いてペプチドパルスされた脾臓細胞の細胞死滅率を検出した。
従来知られた方法で分析を行った。具体的に、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにＯＶＡペプチド（ＬＭ－ＯＶＡ）を発現させるリステリアモノサイトゲネスを５０００ＣＦＵ／ｍｉｃｅで注入した。マウスに隔日でＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株を給与した。６日目に、未成熟Ｃ５７／ｂｌ６マウスの脾臓細胞をＯＶＡペプチドパルスし、ペプチドパルスされているかされていない細胞をＣＦＳＥ又はＣＴＶで染色し、１：１の比率で混合し、感染されたマウスの静脈内に投与した。ＬＭ－ＯＶＡに感染されたマウスを２時間後に犠牲させ、脾臓細胞／リンパ節を収穫し、流動細胞分析を用いてペプチドパルスされた脾臓細胞の細胞死滅率を検出した。
【0307】
１２．クロマトグラフィーを使用した精製
分離された全体莢膜多糖体（ｔＣＰＳ２８ｍｇ）は、陰イオン交換Ｑ－セファロース高速フロー方法で精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｖ＝４．４ｍＬ，ｆｌｏｗ １６ｍＬ／ｈ）。樹脂はパッキングされ、１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、１０体積のＮａＣｌ １０ｍＭで平衡化された。その後、全体莢膜多糖体（ｔＣＰＳ）を１０ｍＭ ＮａＣｌ（５ｍＬ）に溶解させ、樹脂に吸着させた。溶出は、１６ｍＬのＮａＣｌ（それぞれ１０、１００、２００、４００、７００及び１０００ｍＭ）を順次に添加して段階的に行われた。各濃度のＮａＣｌで溶出された溶出液を収集し、透析（Ｃｕｔ－ｏｆｆ１ｋＤａ）によって脱塩及び凍結乾燥させた。各濃度のＮａＣｌから溶出された６個の分画を、ＣＰＳ－Ｘ（Ｘは溶出に使用されたＮａＣｌ濃度，ｍＭ）で標識した。
分離された全体莢膜多糖体（ｔＣＰＳ２８ｍｇ）は、陰イオン交換Ｑ－セファロース高速フロー方法で精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｖ＝４．４ｍＬ，ｆｌｏｗ １６ｍＬ／ｈ）。樹脂はパッキングされ、１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、１０体積のＮａＣｌ １０ｍＭで平衡化された。その後、全体莢膜多糖体（ｔＣＰＳ）を１０ｍＭ ＮａＣｌ（５ｍＬ）に溶解させ、樹脂に吸着させた。溶出は、１６ｍＬのＮａＣｌ（それぞれ１０、１００、２００、４００、７００及び１０００ｍＭ）を順次に添加して段階的に行われた。各濃度のＮａＣｌで溶出された溶出液を収集し、透析（Ｃｕｔ－ｏｆｆ１ｋＤａ）によって脱塩及び凍結乾燥させた。各濃度のＮａＣｌから溶出された６個の分画を、ＣＰＳ－Ｘ（Ｘは溶出に使用されたＮａＣｌ濃度，ｍＭ）で標識した。
【0308】
分子量測定は、溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）として５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化されたＴＳＫ Ｇ－５０００ＰＷＸＬサイズ排除カラム（３０ｃｍ×７．８ｍｍ）を使用するＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００を用いてＣＰＳ－１００に対して推論され（ｆｌｏｗ＝０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、溶出液を屈折率検出器（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）でモニタリングした。カラムは、知られた分子量（それぞれ１２、５０、１５０及び６７０ｋＤａ）のデキストラン標準（１ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬ）を注入して補正した。分子量のログは、溶出体積に対してプロットされ、確立された線形関係（ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ＬｏｇＰＭ＝－０．８１１ｍＬ＋１１．７；Ｒ２＝０．９８）を用いて多糖体のＭＷを計算した。
【0309】
１３．統計分析
腫瘍成長曲線は、２グループの比較のためのシダックの（Ｓｉｄａｋ’ｓ）多重比較事後－検定、様々なグループと対照群間の比較のためのダネットの多重比較事後－検定、又は２つ以上のグループのそれぞれの比較のためのテューキーの多重比較事後－検定を用いた両方向ＡＮＯＶＡによって分析した。他の比較では、２グループを比較する時に独立スチューデントのｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）を用い、２グループ以上を比較する時は、多重検定のためのＢｏｎＦｅｒｒｏｎｉ補正と一元分散分析が用いられた。Ｐ＜０．０５は統計的に有意義であると見なした（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ８．０を用いて統計分析を行った。Ｆｌｏｗ－ｊｏソフトウェアｖ１０．１を用いて流動細胞分析データを分析した。
腫瘍成長曲線は、２グループの比較のためのシダックの（Ｓｉｄａｋ’ｓ）多重比較事後－検定、様々なグループと対照群間の比較のためのダネットの多重比較事後－検定、又は２つ以上のグループのそれぞれの比較のためのテューキーの多重比較事後－検定を用いた両方向ＡＮＯＶＡによって分析した。他の比較では、２グループを比較する時に独立スチューデントのｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）を用い、２グループ以上を比較する時は、多重検定のためのＢｏｎＦｅｒｒｏｎｉ補正と一元分散分析が用いられた。Ｐ＜０．０５は統計的に有意義であると見なした（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ８．０を用いて統計分析を行った。Ｆｌｏｗ－ｊｏソフトウェアｖ１０．１を用いて流動細胞分析データを分析した。
【0310】
実施例２：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の分離及び同定
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９）は、主に原料由来微生物によって発酵された家庭用キムチから分離された。ラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のコロニーを誘導するために、連続希釈したキムチ懸濁液をＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ ｂｒｏｔｈ，Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）プレートにストリークした。培養した単一コロニーを分離し、ＭＲＳブロスでさらに培養した。コロニーの形態がそれぞれの個別菌株を区分するのに十分でなかったため、１４個の分離されたバクテリアをＰＣＲ及び１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析し、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて配列の類似性を確認した。分離されたバクテリアはいずれも乳酸菌（ＬＡＢ）に属するものと判明された。分離されたバクテリアのうち、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍと９９％以上の類似性を有する菌株を同定し、その他にも、多くの分離されたバクテリア寒天Ｗｅｉｓｓｅｌｌｉａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓと９９％類似することを確認した。このような結果は、キムチの優占種がＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍとＷｅｉｓｓｅｌｌｉａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓであるという既存の報告と一致する。
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９）は、主に原料由来微生物によって発酵された家庭用キムチから分離された。ラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のコロニーを誘導するために、連続希釈したキムチ懸濁液をＭＲＳブロス（Ｄｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ ｂｒｏｔｈ，Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）プレートにストリークした。培養した単一コロニーを分離し、ＭＲＳブロスでさらに培養した。コロニーの形態がそれぞれの個別菌株を区分するのに十分でなかったため、１４個の分離されたバクテリアをＰＣＲ及び１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析し、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて配列の類似性を確認した。分離されたバクテリアはいずれも乳酸菌（ＬＡＢ）に属するものと判明された。分離されたバクテリアのうち、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍと９９％以上の類似性を有する菌株を同定し、その他にも、多くの分離されたバクテリア寒天Ｗｅｉｓｓｅｌｌｉａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓと９９％類似することを確認した。このような結果は、キムチの優占種がＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍとＷｅｉｓｓｅｌｌｉａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓであるという既存の報告と一致する。
【0311】
分析されたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列情報は、次の通りである。
【0312】
【0313】
【0314】
実施例３：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の選別
分離されたバクテリアの免疫細胞に対する免疫刺激効果を確認するために、バクテリア培養分離物がネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）の脾臓細胞に及ぼす影響をテストし、免疫細胞に対する刺激効果があるバクテリアを確認した。全体脾臓細胞を、分離されたバクテリアと４８時間培養した後、培養上澄液でサイトカインのレベルを測定した。よく知られた炎症マーカーであるＩＦＮ－γと抗炎症サイトカインであるＩＬ－１０を用いて、前記分離されたバクテリアが免疫細胞に及ぼす影響を評価した。全ての分離されたバクテリアのうち、無視可能なレベルのＩＬ－１０と非常に高い量のＩＦＮ－γを誘導する新規なラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株を選別し、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９と命名した（図１、ｃｏｌｏｎｙ １）。
分離されたバクテリアの免疫細胞に対する免疫刺激効果を確認するために、バクテリア培養分離物がネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）の脾臓細胞に及ぼす影響をテストし、免疫細胞に対する刺激効果があるバクテリアを確認した。全体脾臓細胞を、分離されたバクテリアと４８時間培養した後、培養上澄液でサイトカインのレベルを測定した。よく知られた炎症マーカーであるＩＦＮ－γと抗炎症サイトカインであるＩＬ－１０を用いて、前記分離されたバクテリアが免疫細胞に及ぼす影響を評価した。全ての分離されたバクテリアのうち、無視可能なレベルのＩＬ－１０と非常に高い量のＩＦＮ－γを誘導する新規なラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株を選別し、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９と命名した（図１、ｃｏｌｏｎｙ １）。
【0315】
実施例４：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の微生物学的及び生化学的特性分析
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのコロニー形態は小さくて滑らかな円形であり、半透明な様子を示す。低温切片（Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）ＴＥＭを用いてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの無鞭毛（ｎｏｎ－ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｄ）、棒形の微生物コロニーを確認した（図２のＡ）。個別バクテリアの厚い莢膜層が一般的に明らかに確認された。ヒツジ血液寒天（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ）で培養する場合には、透明であるか、緑色光の領域がないため、当該菌株が他のラクトバシラスと類似に非溶血性（ｎｏｎ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）又はγ－溶血性（γ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）と確認された（図２のＢ）。陽性対照群として使用されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １１７７８に対して最大５日までゼラチナーゼ活性に陰性と現れた（図２のＣ）。また、特化された培地で前記菌株の４つの生体アミン生成をテストした（ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）及びプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ））。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、Ｅ－ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２とは違い、生体アミンを生成しないものと確認された（表１）。
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのコロニー形態は小さくて滑らかな円形であり、半透明な様子を示す。低温切片（Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）ＴＥＭを用いてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの無鞭毛（ｎｏｎ－ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｄ）、棒形の微生物コロニーを確認した（図２のＡ）。個別バクテリアの厚い莢膜層が一般的に明らかに確認された。ヒツジ血液寒天（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ）で培養する場合には、透明であるか、緑色光の領域がないため、当該菌株が他のラクトバシラスと類似に非溶血性（ｎｏｎ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）又はγ－溶血性（γ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）と確認された（図２のＢ）。陽性対照群として使用されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １１７７８に対して最大５日までゼラチナーゼ活性に陰性と現れた（図２のＣ）。また、特化された培地で前記菌株の４つの生体アミン生成をテストした（ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）及びプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ））。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、Ｅ－ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２とは違い、生体アミンを生成しないものと確認された（表１）。
【0316】
【表1】
【0317】
抗生剤感受性テスト結果は、下記表２のように、大部分のラクトバシラス種と同様に、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を除いて大部分の臨床関連抗生剤に感受性を示すことが確認された（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８５，（２０１９））。
【0318】
【表2】
【0319】
＊ＥＦＳＡ＝ヨーロッパ食品安全処（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）、Ａｍｐ＝Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、Ｅｒｙ＝Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｇｅｎ＝Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、Ｔｅｔ＝Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、Ｓｔｒ＝Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｃｈｌ＝Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ、Ｃｌｉ＝Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ、Ｋａｎ＝Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、Ｖａｎ＝Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、ｎ．ｒ＝ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ、Ｑ．Ｃ＝Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ。
【0320】
実施例５：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の遺伝学的特性分析
【0321】
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列分析に基づく配列類似性比較は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種間の同一性を確認した。また、ＰＣＲによるｒｅｃＡ遺伝子分析により、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ及びＬ．ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍのような遺伝的に密接した他の種と区分した（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６７，３４５０－３４５４（２００１））。
【0322】
ＤＮＡ分離、Ｐａｃ－Ｂｉｏ ＆ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ－ｓｅｑ配列分析及び生物情報学に基づく分析が行われた（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、韓国）。
【0323】
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、ｒｅｃＡ遺伝子由来プライマーを用いてｒｅｃＡ遺伝子を増幅及びバンドを比較し、他の遺伝的に密接に関連した種と区別した。いくつかのＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ菌株は、全体ゲノムにおいて類似性を有するものと知られているので、平均ヌクレオチド指数（ＯｒｔｈｏＡＮＩ）に基づいて系統発生分析を行い、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を固有の菌株として同定した（図３）。４個の知られた菌株に対する病原性遺伝子配列相同性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）に基づき、Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０を用いて推定される病原性遺伝子の存在を確認した。９０％ヌクレオチドカット－オフを用いて病原性遺伝子に対するいかなる有意味なヒットも見られなかった。ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２，１５０１－１５１０（２０１４））から確認できるように、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の全体ゲノムには抗生剤耐性遺伝子がないことが確認された。
【0324】
前記実施例に開示されているように、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、既存に報告されたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ菌株と異なる特徴を有する新規な菌株であり、２０２０年１０月２１日に韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １４３３７ＢＰで寄託した。
【0325】
実施例６：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）Ｔ細胞に対する免疫刺激効果
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍに属する様々な菌株の宿主免疫及び健康に及ぼす有益な効果は、従来に報告されたことがあり（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１８，９３６１６１４（２０１８））、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）免疫細胞に対する直接的な効果を確認した。本発明者らは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるバクテリア抗原の吸収が活性化状態を変更させることができ、これにより、他の免疫細胞をプライミングし、結果的に免疫システムの調節が可能であると予想した。したがって、それぞれ先天的免疫システム及び適応免疫システムを示すＡＰＣ及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の両方を含む共同培養システムを設計した。ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣをバクテリアに２０時間露出させた（ＡＰＣ：バクテリア＝１：１００）。このようなＡＰＣは、免疫表現型を歪めず、サブオプティマルな外部刺激下で未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ）と共同培養した。Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７又は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を確認するために、他の転写因子、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲγ及びＦｏｘｐ３を分析した。特別な外部の影響無しで、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、他の３つの菌株と比較して、ＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ Ｔｈ１７細胞の生成を顕著に誘導した（図４のＡ）。他のＴｈ細胞のサブタイプの有意味な生成の有無は明確にされておらず、他のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ菌株と類似に現れた（図４のＢ）。
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍに属する様々な菌株の宿主免疫及び健康に及ぼす有益な効果は、従来に報告されたことがあり（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１８，９３６１６１４（２０１８））、本発明のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９のネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）免疫細胞に対する直接的な効果を確認した。本発明者らは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるバクテリア抗原の吸収が活性化状態を変更させることができ、これにより、他の免疫細胞をプライミングし、結果的に免疫システムの調節が可能であると予想した。したがって、それぞれ先天的免疫システム及び適応免疫システムを示すＡＰＣ及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の両方を含む共同培養システムを設計した。ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣをバクテリアに２０時間露出させた（ＡＰＣ：バクテリア＝１：１００）。このようなＡＰＣは、免疫表現型を歪めず、サブオプティマルな外部刺激下で未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ）と共同培養した。Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７又は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を確認するために、他の転写因子、Ｔｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲγ及びＦｏｘｐ３を分析した。特別な外部の影響無しで、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、他の３つの菌株と比較して、ＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ Ｔｈ１７細胞の生成を顕著に誘導した（図４のＡ）。他のＴｈ細胞のサブタイプの有意味な生成の有無は明確にされておらず、他のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ菌株と類似に現れた（図４のＢ）。
【0326】
前記結果の検証のために、Ｔｈ１７細胞の最小生成条件で、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９によるＴｈ１７細胞の生成をテストした。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、相当な量のＩＬ－１７を生産するＣＤ４＋ＲＯＲγ＋ Ｔｈ１７の生成を顕著に増加させた（図５のＡ）。
【0327】
一方、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、中性条件で相当な量のＦｏｘｐ３を誘導しておらず（図５のＢ）、よって、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９が十分な濃度のＴＧＦ－βで未成熟ＣＤ４＋ Ｔ細胞からＴｒｅｇを生成できるかどうか確認した結果、ＴＧＦ－βの濃度増加下でむしろＴｒｅｇの生成を顕著に抑制することが確認された。
【0328】
実施例７：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の生体内で抗腫瘍免疫反応の促進効果確認
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び対照群として様々なラクトバシラス菌株（１４種）を脾臓細胞と共に培養して、免疫細胞によるサイトカイン生産の変更有無を比較した。その結果、他のラクトバシラス菌株に比べてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は顕著に高いＩＦＮ－γレベル及び顕著に低いＩＬ－１０レベルを示した（図６のＡ）。参考として、他の菌株であるラクトバチルスムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）は、最も高いＩＬ－１０誘導能を示し、低いＩＦＮ－γ生産を示した（図６のＡ）。
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株及び対照群として様々なラクトバシラス菌株（１４種）を脾臓細胞と共に培養して、免疫細胞によるサイトカイン生産の変更有無を比較した。その結果、他のラクトバシラス菌株に比べてＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は顕著に高いＩＦＮ－γレベル及び顕著に低いＩＬ－１０レベルを示した（図６のＡ）。参考として、他の菌株であるラクトバチルスムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）は、最も高いＩＬ－１０誘導能を示し、低いＩＦＮ－γ生産を示した（図６のＡ）。
【0329】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞が主要抗腫瘍エフェクター細胞のために分離された前記２菌株のＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激能力を確認した。バクテリアでプライミングされた樹状細胞（ＤＣ）及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の共同培養において、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を処理する場合にＩＦＮ－γレベルの増加を確認し、特に、ラクトバチルスムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）を処理した場合に比べて顕著に増加した（図１のＢ）。脾臓及び腸間膜リンパ節抗原提示細胞と共同培養時に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化は、バクテリアの濃度に依存的に変化した（図７のＡ及びＢ）。
【0330】
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、樹状細胞がない場合には、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を直接刺激しなかった。マウス黒色腫特異的抗原Ｐｍｅｌ－１に対するＴＣＲ運搬ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化は、抗原ｇｐ－１００の存在下に類似に活性化された（図７のＣ）。ＤＣの他にもマクロファージは腫瘍の成長及び抑制に重要な役割を担うものと知られたＡＰＣであるので、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージを用いたＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の効果を確認した。樹状細胞と類似に、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、マクロファージ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞共同培養時に、ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率を大きく増加させた（図６のＣ）。
【0331】
ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、腫瘍に蓄積され、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びその他免疫細胞のエフェクター機能を抑制して腫瘍進行を増加させる。また、Ｔｒｅｇ生成を促進する様々なバクテリアが報告されたことがある（Ｎａｔｕｒｅ ４５３，６２０－６２５（２００８）；Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３，（２０１８））。したがって、本発明者らは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９がＣＤ１１ｃ＋ＤＣ及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の共同培養時にＴｒｅｇ誘導に影響を及ぼすかどうか確認した。高度なＴｒｅｇ歪み培養条件でＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、ＴＧＦ－βの存在下でＴｒｅｇ生成の相当な抑制を示した（図６のＤ）。この効果は、より低いレベルのＴＧＦ－βにおいても持続され、テストされた条件のいずれにおいてもＴｒｅｇ生成が観察されなかった（図８のＡ）。一方、インターロイキン－１７Ａ（ＩＬ－１７Ａ）は増加し（図８のＢ）、これは、Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ－１７細胞（Ｔｈ１７）の生成を意味する。インターロイキン－６（ＩＬ－６）は、Ｔｈ１７生成に必須であり、ＴＧＦ－βの存在下にＴｒｅｇ生成を抑制する（Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０，１８３０－１８３５（２０１０））。これにより、ＩＬ－６欠乏ＤＣは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞共同培養でＴｒｅｇｓを生成した。したがって、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９プライミングＤＣによるＩＬ－６生産は、Ｔｒｅｇ歪み培養条件下でＴｒｅｇ生成を抑制する。
【0332】
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９によって活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞が機能的に細胞傷害性であるか否かをテストするために、ＯＶＡ抗原（ＬＭ－ＯＶＡ）を発現させる急性リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）感染モデルを使用した細胞傷害性を試験した（図６のＥ）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を給与したＬＭ－ＯＶＡ感染マウスは、生体内でＯＶＡ ｐｕｌｓｅｄ ＣＦＳＥがロードされた標的細胞の溶解において顕著な増加を示した（図６のＦ）。また、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）及びＧＦ（Ｇｅｒｍ ｆｒｅｅ）マウスの両方で皮下移植されたＢ１６．Ｆ１０黒色種に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の効果を評価した（図６のＧ）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９は、Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓと比較してＳＰＦ及びＧＦマウスの両方において黒色腫成長の顕著な抑制を示した（図６のＨ及びＩ）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９が抗腫瘍効果を招く全ての群集崩壊（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）を誘導するか否かを評価するために、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９を給与した腫瘍保有動物の大便サンプルに対して１６ｓリポソームＲＮＡシーケンシングを行った。しかしながら、ＰＢＳ対照群と比較して、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９給餌マウスの大便から、微生物多様性において重要な変化が見られなかった（図９のＡ～Ｃ）。これは、抗腫瘍免疫のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９媒介調節は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９特異的な効果に該当し、群集崩壊の結果でないことを意味する。総合的に、本実施例のデータは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９が生体内で細胞傷害性Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫反応の陽性調節子であることを示す。
【0333】
実施例８：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９由来未精製多糖体分画の化学的特性分析
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析の結果、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の細胞は、ラムノース、ガラクトース、ブドウ糖及びグルコサミンで構成された炭水化物組成、及び少量のグリセロール及びリビトールを含有する莢膜物質の層で囲まれていることが確認された（図１０及び図１１のＡ）。２つのポリオールは、一般に、ホスホジエステル結合で相互連結されるテイコ酸（ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄｓ）の存在と関連がある（Ｔｏｍｉｔａ，Ｔａｎａｋａ，＆ Ｏｋａｄａ，２０１７）。一般に、メタノール分解（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）は、ホスホジエステル結合を完全に切断できないため、このようなポリオールの検出が非常に難しい。したがって、メタノール分解及びアセチル化前に水性ＨＦで試料を脱リン酸化してＧＣ－ＭＳ分析を反復し、２つのポリオールの量が増加することに基づいてテイコ酸の存在を確認した。単糖類では、ラムノースはＬ絶対配列を、グルコースとガラクトースはＤ配列（図１２）を有する。一方、グルコサミンでは、Ｄ配列は立体異性質体の独占的存在に基づいて仮定された。
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析の結果、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の細胞は、ラムノース、ガラクトース、ブドウ糖及びグルコサミンで構成された炭水化物組成、及び少量のグリセロール及びリビトールを含有する莢膜物質の層で囲まれていることが確認された（図１０及び図１１のＡ）。２つのポリオールは、一般に、ホスホジエステル結合で相互連結されるテイコ酸（ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄｓ）の存在と関連がある（Ｔｏｍｉｔａ，Ｔａｎａｋａ，＆ Ｏｋａｄａ，２０１７）。一般に、メタノール分解（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）は、ホスホジエステル結合を完全に切断できないため、このようなポリオールの検出が非常に難しい。したがって、メタノール分解及びアセチル化前に水性ＨＦで試料を脱リン酸化してＧＣ－ＭＳ分析を反復し、２つのポリオールの量が増加することに基づいてテイコ酸の存在を確認した。単糖類では、ラムノースはＬ絶対配列を、グルコースとガラクトースはＤ配列（図１２）を有する。一方、グルコサミンでは、Ｄ配列は立体異性質体の独占的存在に基づいて仮定された。
【0334】
実施例９：未精製多糖体の精製
炭水化物成分の化学的分析結果は、ＣＰＳが重合体の混合物であることを示唆している。そこで、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＣＰＳを精製して得た６個の分画を、使用された溶出液の濃度（Ｘ）によってＣＰＳ－Ｘで表示した。精製によって得た収率は次の通りである：ＣＰＳ－１０ １１％、ＣＰＳ－１００ １３％、ＣＰＳ－２００ ９．０％、ＣＰＳ－４００ ５１％、ＣＰＳ－７００ ７．０％、及びＣＰＳ－１０００ ７．９％。各分画は、１Ｈ ＮＭＲ分析を用いて元来の混合物（ＣＰＳ）のスペクトルプロファイルと比較した（図１３）。
炭水化物成分の化学的分析結果は、ＣＰＳが重合体の混合物であることを示唆している。そこで、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＣＰＳを精製して得た６個の分画を、使用された溶出液の濃度（Ｘ）によってＣＰＳ－Ｘで表示した。精製によって得た収率は次の通りである：ＣＰＳ－１０ １１％、ＣＰＳ－１００ １３％、ＣＰＳ－２００ ９．０％、ＣＰＳ－４００ ５１％、ＣＰＳ－７００ ７．０％、及びＣＰＳ－１０００ ７．９％。各分画は、１Ｈ ＮＭＲ分析を用いて元来の混合物（ＣＰＳ）のスペクトルプロファイルと比較した（図１３）。
【0335】
具体的に、各分画は、次の通りである（図１３）。
【0336】
ＣＰＳ－１００（図１３のｂ）：ＣＰＳ－１０は、多少異質的なスペクトルを示した。ＣＰＳ－１０のアノマー領域は、炭水化物と異なる物質と関連した４．２及び１．３ｐｐｍの強い信号を有する２個の主要信号を含む。
【0337】
ＣＰＳ－１００（図１３のｃ）：ＣＰＳ－１００のアノマー領域（５．６～４．５ｐｐｍ）は、α－配列（３ＪＨ１，Ｈ２＝３．４Ｈｚ）及びリン酸化（３ＪＨ１，Ｐ＝７．０Ｈｚ）された残基を示す５．５ｐｐｍにおける二重ダブレット（図１４）を有する９個の主要信号を含む。また、それぞれＮ－アセチルグルコサミン及びラムノースユニットの存在と一致するアセチル基（２．０６ｐｐｍでのメチル基）及びジオキシ残基（１．３ｐｐｍ）の様々なメチル基を含む強い信号を確認した。
【0338】
ＣＰＳ－２００（図１３のｄ）：ＣＰＳ－２００は、ＣＰＳ－１００とＣＰＳ－４００との混合物として示され、アノマー領域において４個の多少広い信号を示し、１．６ｐｐｍ（ラムノースのメチルＫと一致しない値）と混雑なカルビノール領域（４．４～３．２ｐｐｍ）において強烈なメチル信号を示した。
【0339】
積分によってアノマー陽性子及びカルビノール陽性子間の比率は、１．０：１２と示され、一般に、予想される比率は１：６又はそれ以下であり、これは、ＣＰＳ－４００が多糖体の典型的な構造を有していないことを意味し、比率の増加は、化学的分析によって確認されたように、リビトール及びグリセロールユニットの存在のためである（図１５）。また、グルコースは、最も豊富な単糖類であり、その次にペプチドグリカンの特徴として、少量のグルコサミン（ＧｌｃＮ）及びムラミン酸（ＭｕｒＡ）の２単糖類が豊富に見られた。
【0340】
このような観察は、ＣＰＳ－４００がテイコ酸（ＴＡ）であることを意味する。
【0341】
ＣＰＳ－７００及びＣＰＳ－１０００（図１３のｆ及びｇ）：アノマー領域は、ＣＰＳ－４００で発見される信号の一部のみが含まれており、２分画ともアノマー陽性子及びカルビノール陽性子間の比率は、不定形的であった。不炭水化物物質の信号もさらに確認された。
【0342】
ＣＰＳにおいてＣＰＳ－１０、ＣＰＳ－７００及びＣＰＳ－１０００の量が豊富でないため、少量しか獲得されなかった。
【0343】
実施例１０：ＣＰＳ－１００のＮＭＲ分析
莢膜多糖体の構造は、３１０Ｋで記録された１Ｈ－１Ｈ同種核（ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ）及び１Ｈ－１３Ｃ異種核（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ）２Ｄ ＮＭＲスペクトルの完全なセットを分析して決定された（表３）。
莢膜多糖体の構造は、３１０Ｋで記録された１Ｈ－１Ｈ同種核（ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ）及び１Ｈ－１３Ｃ異種核（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ）２Ｄ ＮＭＲスペクトルの完全なセットを分析して決定された（表３）。
【0344】
【表3】
【0345】
＊Ｃ及びＥのＣ－３はオーバーラップされ、これらの正確な化学的移動は確実に決定されていない。
【0346】
＊＊Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨのＣ－５はオーバーラップされ、それらの正確な化学的移動は確実に決定されていない。
【0347】
【0348】
ＨＳＱＣスペクトル（図１４）は、大文字Ａ－Ｉ、図１４のａ、表３で表示された１Ｈ５．６～４．５において９個の主要アノマー密度を示し、該当する陽性子はいずれも類似の比率を有している。ＮＭＲ分析は、ＣＯＳＹスペクトルの３．８５ｐｐｍと共通に、ＴＯＣＳＹスペクトルにおいて３つの相関関係を示すＡのＨ－１（５．５１ｐｐｍ）で（図１６）始まった。したがって、この密度は、Ｈ－２に割り当てられ、類似の接近方式によってＨ－３（３．９１ｐｐｍ）及びＨ－４（４．０４ｐｐｍ）も割り当てられた。Ｈ－１との追加の相関関係がないので、Ａをガラクトースユニットと確認した。Ｈ－５は、強いＨ－４／Ｈ－５相関関係によってＮＯＥＳＹスペクトルで識別され（図１７）、該当するＣＯＺＹ相関関係によって２つのＨ－６を確認した（図１６及び図１７）。
【0349】
ＨＳＱＣ及びＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹスペクトル（図１８のａ）は、Ｃ－６（６７．１ｐｐｍ）の高い化学的移動に基づいてＯ－６に連結されたα－ガラクトースユニットであるＡ（表３）の全ての炭素化学的移動を定義した。ＤのＨ－１（５．１２ｐｐｍ）で発生するＴＯＣＳＹスペクトルの相関関係は、Ａと同じパターンを有しているので、Ｄはガラクトースであり、αは、３ＪＨ１，Ｈ２（３．９Ｈｚ）値に基づいて構成され、Ｈ－６ｓ／Ｃ－６（４．０４－４．０２／６５．６ｐｐｍ）の化学的移動は、この位置の以前文献のデータと一致し、リン酸化されていることを意味する（Ｓｅｃｈｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。したがって、Ｄは、６Ｐ－α－Ｇａｌであったし、他の全ての炭素化学移動の高いフィールド値に基づいてそれ以上分岐されなかった。
【0350】
Ｂにおいて、Ｈ－１（５．２４ｐｐｍ）は、Ｈ－２（４．２５ｐｐｍ）に最も強い２つのＴＯＣＳＹ相関関係を示し、これは、ＣＯＺＹ密度と一致している（図１６）。この２番目の陽性子（図１６）においてＴＯＣＳＹを判読した結果、ラムノース残基のパターン全体診断である１．２８ｐｐｍにおいてメチルを含むユニットの他の全ての陽性子を確認した。したがって、Ｂは、そのＣ－５値（約７０．５ｐｐｍ）と参照グリコシド（α又はβメチルグリコシドの場合にそれぞれ６９．４又は７３．６ｐｐｍ、Ｂｏｃｋ ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９８３）の類似性に基づき、アノマー中心においてα－配列されたラムノースであり、当該炭素において経験したグリコシル化移動から定義されたのと同様に３－置換された。残基Ｃ、Ｅ、Ｇ及びＨ（それぞれ、５．１４、５．１０、４．９７、４．８８ｐｐｍにおいてＨ－１）のＴＯＣＳＹパターンは、Ｂのものと類似であり、α－ラムノースユニットであったし、参照値（７１．０ｐｐｍ，Ｂｏｃｋ ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９８３）と比較して、Ｃ－２（７７．８～７９．６ｐｐｍ）の低いフィールド値は、Ｏ－２において置換されたことを意味する。
【0351】
Ｆにおいて、Ｈ－１（５．０１ｐｐｍ）は、４個のＴＯＣＳＹ相関関係を有しており（図１６）、これは、ＣＯＳＹスペクトルにおいてＨ－２～Ｈ－５に起因したものであり、グルコ構成残基（ｇｌｕｃｏ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ）のパターンである。Ｈ－５のＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ分析により６９．５ｐｐｍでの密度と相関関係を確認し、これは、Ｃ－６に起因し、次第にＨ－６ｓと関連した（４．１４及び３．９６ｐｐｍ）。したがって、Ｆは、Ｃ－２（５４．９ｐｐｍ）及びＨ－２（３．９３ｐｐｍ）値に基づくＮ－アセチルグルコサミンであり、Ｃ－６（６９．４ｐｐｍ）において置換された。α配列は、アノマーシグナル形状（ｂｒｏａｄ ｓｉｎｇｌｅｔ）とＣ－３値（７１．８ｐｐｍ）によって推論され、これは、参照α－グリコシド（７２．０ｐｐｍ，Ｂｏｃｋ ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９８３）と非常に類似している。最後に、ＩのＨ－１（４．５０ｐｐｍ）は、ユニットの全ての陽性子を示すＴＯＣＳＹパターンを有している。したがって、１３Ｃ化学的移動に基づき、ＩはＣ－３（８２．８ｐｐｍ）において置換され、３ＪＨ１，Ｈ２値（７．９Ｈｚ）に基づいてβ－配列されたブドウ糖である。
【0352】
残基間の配列は、ＨＭＢＣ（図５のＢ）とＮＯＥＳＹ（図４）スペクトルを分析して推論した。最初に、ＢのＨ－１とＩのＣ－３が連結されたＨＭＢＣの相関関係と当該密度は、Ｂ１Ｉ３と表示した（図１８のｂ）。同じ形式でＣ１Ｅ２、Ｄ１Ｂ３、Ｆ１Ｇ２、Ｈ１Ａ６及びＩ１Ｆ６のような別の相関関係が発見された。また、ＥのＨ－１とＧのＨ－１は、Ｃ及びＨのＣ－２と類似の値である約７９ｐｐｍにおける炭素と長距離相関関係を示した。Ｅ１Ｈ２及びＧ１Ｃ２へのこのような密度の正確な割り当ては、ＥのＨ－１とＨのＨ－２、及びＧのＨ－１とＣのＨ－２が関連しているＮＯＥＳＹスペクトル（図１７）を分析して推論した。このような属性は、異なるラムノースユニットのＨ－２陽性子の拡張に詳細に示された逆相関関係を観察して確認された（図１９）。
【0353】
最後に、ＡとＤがそれぞれＯ－１とＯ－６においてホスホジエステル結合でリン酸化されたという情報は、何故、ＡのＨ－１とＤのＣ－６、又はＤのＨ－６及びＡのＣ－１に対してＨＭＢＣ連結が現れなかったか、又は何故、これらの陽性子が残基間のＮＯＥ相関関係を有しないかを説明する。ＨＭＢＣスペクトルは、実際に、このシーケンスの限界（３個連結）を超えるＡのＨ－１（又は、Ｃ－１）とＤのＣ－６（又は、Ｈ－６）間の結合数が多いために（５個連結）、両ユニット間のいかなる相関関係も検出することができなかった。類似に、ＡとＤ間のリン酸塩部分の密度は、検出可能なＮＯＥ効果を提供するために、それらのユニットの陽性子を非常に遠く離す。したがって、ＣＰＳ－１００の反復単位構造は、図２０に報告されているように、ｎｏｎ－ａｓａｃｃｈａｒｉｄｅである。
【0354】
また、その特性を理解するために、マイナーなＮＭＲ信号を調査した。ＨＳＱＣスペクトル（図１４）において、Ｇａｌα及びＧａｌβ（それぞれ１Ｈ／１３Ｃ ５．２６／９３．５及び４．５７／９７．８ｐｐｍ）で表示された密度の炭素化学的移動は、自由還元形態のα又はβ残基を示す。Ｈ－１においてＴＯＣＳＹスペクトル（図１６）は、ガラクト（ｇａｌａｃｔｏ）構成糖の典型的なパターンが示された（すなわち、Ｇａｌαの場合、３番目の密度は、ＣＯＺＹ密度とほとんどオーバーラップされる。）。このような発見は、ＣＰＳの分離のための超音波処理及びトリクロロ酢酸処理が含まれており、上記の２つの処理過程において、特に、ガラクトースＡのアノマーリン酸塩において、ホスホジエステル結合の極度の柔軟性によってそれら結合の一部の切断を誘導できるという点から説明される。したがって、強い信号の傍におけるマイナーな信号（図１４、“＊”で表示）は、最初の反復残基に属し、自由還元形態でガラクトースに連結されていると予想された。しかしながら、それらの低い強度と、カルビノール領域（ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）の密集は、正確な属性の把握を妨害した。最後に、ＨＳＱＣスペクトル（図１４のａ）において、アノマー密度を統合すると、サンプルの平均重合度は４であり、平均ＭＷは約６ｋＤａ（反復単位のＭＷは１５００Ｄａ）であって、ＨＰＳＥＣによって計算された１１ｋＤａは多少過大評価された値と類似の値である（図２１）。
【0355】
実施例１１：ＣＰＳ－４００のＮＭＲ分析
前記実施例において説明されたのと類似の方式でＣＰＳ－４００の構造的特徴を分析した（表４）。
前記実施例において説明されたのと類似の方式でＣＰＳ－４００の構造的特徴を分析した（表４）。
【0356】
第一に、ＨＳＱＣスペクトルのアノマー領域（図２２のａ及びｂ）は、いくつかの残基を示しているが、１Ｈ ５．３－５．１ｐｐｍにおける信号は、単糖類残基で発生したのに対し、１Ｈ／１３Ｃ ５．３９／７５．５ｐｐｍは、アノマー信号ではなくＡで表示されたグリセロールユニット（Ｇｒｏ）のＣ－２であり、アシル化によって低いフィールドへと移動した。Ｏ－２における置換基はアラニン（Ａｌａ）であり、１Ｈ／１３Ｃ １．６４／１６．５ｐｐｍで確認されたメチル及び４．３０／５０．２ｐｐｍにおけるＨα／Ｃαによって確認された。また、ＡのＨ－１／Ｃ－１及びＨ－３／Ｃ－３は同等であり、当該ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ（図２２のａ）及びＴＯＣＳＹ（図２２のｇ）の相関関係に基づいて４．１１／６５．０ｐｐｍで確認された。
【0357】
最後に、Ｃ－１（又は、Ｃ－３）値は、Ｇｒｏ型テイコ酸の場合のように、Ａが両末端でリン酸化されていることを示す。Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８を参照したＨＳＱＣ分析において、２番目の１，３－二リン酸化Ｇｒｏユニット（Ｂ）、及び１，５－二リン酸化されたリビトールユニット（Ｒｂｏ，Ｃ）を確認し、このような最後の残基は、リビトール－ホスフェートバックボーンに基づくさらに他のテイコ酸の存在を意味する。単糖類ユニットにおいて、分析は、ＴＯＣＳＹスペクトルのアノマー信号において最大Ｈ－６まで磁化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）の効率的な伝播に基づいてα－グルコースユニットとして確認された最も強い信号（Ｄ、Ｅ、Ｆ’及びＦ）に集中した。このようなＧｌｃユニットは、１３Ｃ化学的移動の類似性に基づいてそれ以上置換されなかった（Ｂｏｃｋ ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，１９８３）。
【0358】
このようなユニットの位置は、ＨＭＢＣスペクトル分析及び参照文献のデータとの比較から推論した。実際に、Ｅは、Ｇｒｏユニット（Ｈ）のＯ－２に連結されたのに対し（Ｓｈａｓｈｋｏｖ，Ｐｏｔｅｋｉｎａ，Ｓｅｎｃｈｅｎｋｏｖａ，＆ Ｋｕｄｒｙａｓｈｏｖａ，２００９）、Ｆ’は、Ｒｂｏユニット（Ｉ）のＯ－４に連結された（Ｓｔｒｅｓｈｉｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。Ｄにおいて、Ｈ－１は、陽性子（４．３０ｐｐｍ）がＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹスペクトルにおいて６９．９ｐｐｍで“ＣＨ２”に連結された７８．３ｐｐｍにおける炭素（図１８のｂ）と長距離相関関係を有している（図２３）。このような新しいユニットはＧと表示され、１Ｈ／１３Ｃ ４．３０／７８．３及び４．１４／６６．９ｐｐｍにおける密度は、Ｇ４及びＧ５と割り当てられた（図１８のｃ及び図２３）。Ｇは、リビトールと識別され、ＨＳＱＣ－ＴＯＳＣＹスペクトル分析によって他の信号を探した。実際に、１Ｈ／１３Ｃ ４．１６／６７．７ｐｐｍにおいて“ＣＨ２”密度は、Ｇ４を示す信号と３つの相関関係を有しており、この密度はＧ１と表示した。また、ＧのＣ－１（６７．７ｐｐｍ）は、Ｉに対して報告されたように、隣接位置でグリコシル化されず、リン酸化された炭素を表す。このような情報は、残り２つのＨＳＱＣ－ＴＯＳＣＹ相関関係をＣ－２（７０．５ｐｐｍ）及びＣ－３（８０．６ｐｐｍ）に割り当てるようにし、ＨＳＱＣスペクトルにおいて順にそれに相応するＨ－２（４．１５ｐｐｍ）及びＨ－３（３．９７ｐｐｍ）を識別した（図１８、図２３、表４）。したがって、Ｇは、付着した２つのユニット、Ｆ及びＤと共に、Ｏ－３及びＯ－４でグリコシル化されたＲｂｏである（図２２のｂにおけるＨＭＢＣ）。
【0359】
このような類型の置換は、他のラクトバシラスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株から確認されたことがあるが、そのＮＭＲデータは、リン酸塩がないＲｂｏユニットを報告しており、このような化学的移動と本発明のデータは比較できない（Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、我々の結果は、Ｃ－２及びＣ－３に連結されたグルコースユニットを有するリビトールの逆置換パターンを提案したビフィスズ菌のテイコ酸のもの（Ｖａｌｕｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）と類似であった。興味深くに、Ｖａｌｕｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に報告された脱リン酸化形態のＮＭＲデータは、Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００９）で報告された３，４－二グルコシル化リビトールのＮＭＲデータと一致している。したがって、このようなリビトールユニットの置換パターン（２，３又は３，４）は、まだ明確に定義されずにいる。したがって、本発明のＮＭＲデータは、ＣＰＳ－４００がＧｒｏ－及びｒｂｏ－型の２つのテイコ酸の混合物であることを示し、それぞれ、非化学量論的方式でいくつかの置換基の存在を示した。Ｇｒｏ－型ＴＡにおいて、非化学量論的置換基は、アラニン及びα－グルコースであった。Ｒｂｏ－型ＴＡにおいて、α－グルコースは、リビトールのＯ３及びＯ４の両方、Ｏ４単独で発生するか、又はいずれの位置でも発生しなかった。サイズ排除クロマトグラフィーによって２つのＴＡの分離を試みたが、ＣＰＳ－４００は約４５ｋＤａ（図２１）の対称ピークとして現れ、それ以上分離されなかった。
【0360】
実施例１２：ＣＰＳ－１００及びＣＰＳ－４００の免疫刺激活性
前記ＣＰＳ－１００及びＣＰＳ－４００の免疫反応に対する活性を確認した。
前記ＣＰＳ－１００及びＣＰＳ－４００の免疫反応に対する活性を確認した。
【0361】
全ての免疫細胞を生理学的な比率で混合した脾臓細胞を使用し、免疫システムに対するＣＰＳの効果を確認した。終点分析（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ＥＬＩＳＡにより、個別のサイトカインをテストして行った。サイトカインは、生体内で炎症性又は寛容性免疫反応を媒介し調節する細胞信号伝達に関与する分泌性ペプチド／糖タンパク質グループを意味する。したがって、ＣＰＳに露出される時に、免疫細胞プールにおいてサイトカインの歪みは生体内で類似の役割を担うことを意味する。ＣＰＳ－１００及びＣＰＳ－４００によって生成された免疫反応を確認するために、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を炎症性マーカーとし、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）を調節性サイトカインとして分析した。研究結果によれば、ＣＰＳ－１００は、高いＩＦＮ－γ及び無視できるレベルのＩＬ－１０生産で現れたように、免疫刺激性であることを示す（図２４のａ及びｂ）。一方、ＴＡ分画であるＣＰＳ－４００では、ＩＦＮ－γのレベルが検出されなかった（図２４のａ）。類似の条件において、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、ＩＬ－６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６）、ＩＬ－１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １２）、ＩＬ－１７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７）及びＩＬ１－β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １β）を含む他のサイトカインを評価した。
【0362】
ＣＰＳ－１００は細胞を刺激し、顕著に高いレベルのＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１２の生成を示すのに対し（図２４のｃ～ｅ）、ＩＬ－１７及びＩＬ１－βは検出されなかった。一方、ＣＰＳ－４００は、測定された如何なるサイトカインでも明確な増加が見られなかった（図２４のｃ及ｅ）。ＩＦＮ－γは、様々な類型の免疫細胞で生成される一次免疫刺激マーカーであるので、ＣＰＳの免疫刺激反応の特異性を確認するために、ＩＦＮ－γの生産がＣＰＳ－１００の濃度に依存的であるかどうかを確認した。４８時間のＩＦＮ－γ誘導においてＣＰＳ－１００のＥＣ５０（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は３．１６μＭ（図２４のｆ）であって、ＣＰＳ－１００が効率的な免疫刺激剤として使用され得ることを意味する。
【0363】
結果的に、ＣＰＳ－１００は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株と類似の免疫刺激特性を示し、これは、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９菌株の免疫賦活活性を示す有効分子がＣＰＳ－１００であることを意味する。
【0364】
実施例１３：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９及びＣＰＳのＣＤ８＋ Ｔ細胞機能の向上及び抗腫瘍免疫効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫刺激剤としてのＣＰＳ活性が生体内で腫瘍抑制活性へとつながり得るかを確認した。経口投与されたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９及び腹腔内投与されたＣＰＳ治療グループは、皮下黒色腫の成長が顕著に減少したことが確認された（図２５のＡ及びＢ）。両グループにおいて、腫瘍成長の遅延はＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤と関連している（図２５のＣ）。腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの生成と頻度の増加は、前記投与によってＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞傷害性活性が顕著に向上したことを意味する（図２５のＥ及びＦ）。腫瘍内ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、また、両投与グループにおいて、ＩＦＮ－γ生産の上方調節を示している（図２５のＧ及びＨ）。一方、ＰＢＳ投与グループと比較して、腫瘍内Ｔｒｅｇ集団の差は見られなかった（図２６のＡ及びＢ）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の経口投与は、ＥＭＴ－６乳癌において腫瘍成長を調節した（図２７）。結果的に、前記データは、ＣＰＳ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９が癌成長を抑制する抗腫瘍免疫活性を向上させるということを意味する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫刺激剤としてのＣＰＳ活性が生体内で腫瘍抑制活性へとつながり得るかを確認した。経口投与されたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９及び腹腔内投与されたＣＰＳ治療グループは、皮下黒色腫の成長が顕著に減少したことが確認された（図２５のＡ及びＢ）。両グループにおいて、腫瘍成長の遅延はＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤と関連している（図２５のＣ）。腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの生成と頻度の増加は、前記投与によってＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞傷害性活性が顕著に向上したことを意味する（図２５のＥ及びＦ）。腫瘍内ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、また、両投与グループにおいて、ＩＦＮ－γ生産の上方調節を示している（図２５のＧ及びＨ）。一方、ＰＢＳ投与グループと比較して、腫瘍内Ｔｒｅｇ集団の差は見られなかった（図２６のＡ及びＢ）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９の経口投与は、ＥＭＴ－６乳癌において腫瘍成長を調節した（図２７）。結果的に、前記データは、ＣＰＳ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＩＭＢ１９が癌成長を抑制する抗腫瘍免疫活性を向上させるということを意味する。
【0365】
実施例１４：ＣＰＳの腫瘍内マクロファージ浸潤増加
ＣＰＳは、腫瘍においてマクロファージの浸潤を増加させる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応を調節する特定ＡＰＣ類型を確認するために、ＣＰＳの腹膜内投与と共に、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞を移植し、初期腫瘍においてＡＰＣの浸潤を評価した。ＣＰＳは主に、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣに比べて、腫瘍においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの頻度を増加させた（図２８のＡ）。流動細胞計測法によって確認した結果、マクロファージの数は、ＣＰＳ投与されたマウスにおいて顕著に高く現れた（図２８のＡ）。同じ条件で、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージとＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の活性化マーカーを確認した。驚くことに、ＣＰＳ処理された樹状細胞の活性化状態は、対照群と有意味な差を示さなかった（図２８のＣ）。しかしながら、マクロファージは、より活性化されており、ＣＤ１１ｂ、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８６及びＣＤ４０のより高い発現を示した（図２８のＢ）。同じマウスにおいて全身的な適応免疫システムの活性化を確認するために、排水リンパ節においてＣＤ８＋ Ｔ細胞早期活性化マーカーであるＣＤ６９を確認した。対照群と比較して、ＣＤ６９は、ＣＰＳ投与によって明確且つ有意に上方調節された（図２８のＤ）。このようなデータは、ＣＰＳがマクロファージの活性化に重要な働きをし、腫瘍成長を制限できることを意味する。
ＣＰＳは、腫瘍においてマクロファージの浸潤を増加させる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応を調節する特定ＡＰＣ類型を確認するために、ＣＰＳの腹膜内投与と共に、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞を移植し、初期腫瘍においてＡＰＣの浸潤を評価した。ＣＰＳは主に、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣに比べて、腫瘍においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの頻度を増加させた（図２８のＡ）。流動細胞計測法によって確認した結果、マクロファージの数は、ＣＰＳ投与されたマウスにおいて顕著に高く現れた（図２８のＡ）。同じ条件で、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージとＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の活性化マーカーを確認した。驚くことに、ＣＰＳ処理された樹状細胞の活性化状態は、対照群と有意味な差を示さなかった（図２８のＣ）。しかしながら、マクロファージは、より活性化されており、ＣＤ１１ｂ、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ８６及びＣＤ４０のより高い発現を示した（図２８のＢ）。同じマウスにおいて全身的な適応免疫システムの活性化を確認するために、排水リンパ節においてＣＤ８＋ Ｔ細胞早期活性化マーカーであるＣＤ６９を確認した。対照群と比較して、ＣＤ６９は、ＣＰＳ投与によって明確且つ有意に上方調節された（図２８のＤ）。このようなデータは、ＣＰＳがマクロファージの活性化に重要な働きをし、腫瘍成長を制限できることを意味する。
【0366】
実施例１５：ＣＰＳによるマクロファージの炎症性マクロファージへの分化及びＭ２マクロファージのＭ１表現型への再プログラミング
マクロファージに対するＣＰＳの効果を特性化するために、マクロファージをＣＰＳに露出する場合に表現型の変化を確認した。腹膜ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージは、ＣＰＳを処理した場合に活性化された表現型を示しており、ＬＰＳ又はＰａｍ３ＣＳＫ４処理された場合に比べて、ＣＰＳ処理されたマクロファージにおいてＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ２、及びＣＤ４０の顕著な上方調節を示し（図２８のＥ）、Ｍ１表現型又はマクロファージの炎症性表現型を示した。特に、Ｐａｍ３ＣＳＫ４と類似に、ＴＬＲ２はＣＰＳ処理時に上方調節され、ＣＰＳがＴＬＲ２リガンドであることを意味する。しかしながら、生体内実験とは対照的に、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は変更されなかった（図２８のＥ）。
マクロファージに対するＣＰＳの効果を特性化するために、マクロファージをＣＰＳに露出する場合に表現型の変化を確認した。腹膜ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージは、ＣＰＳを処理した場合に活性化された表現型を示しており、ＬＰＳ又はＰａｍ３ＣＳＫ４処理された場合に比べて、ＣＰＳ処理されたマクロファージにおいてＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ２、及びＣＤ４０の顕著な上方調節を示し（図２８のＥ）、Ｍ１表現型又はマクロファージの炎症性表現型を示した。特に、Ｐａｍ３ＣＳＫ４と類似に、ＴＬＲ２はＣＰＳ処理時に上方調節され、ＣＰＳがＴＬＲ２リガンドであることを意味する。しかしながら、生体内実験とは対照的に、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は変更されなかった（図２８のＥ）。
【0367】
代案として、活性化されたマクロファージ又はＭ２表現型マクロファージは、免疫抑制に大きく寄与し、腫瘍の成長を向上させる（Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２８，ｘｉｉ１８－ｘｉｉ３２（２０１７））（Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９，４２１（２０１９））。したがって、前記結果は、腫瘍においてＣＰＳがＭ２マクロファージをＭ１表現型に再プログラミングし得ることを示す。実際に、ＩＬ－４誘導Ｍ２表現型腹膜マクロファージは、ＬＰＳ及びＰａｍ３ＣＳＫ４と比較して、ＣＰＳを処理する場合に顕著に増加した（図２８のＦ）。また、炎症性マクロファージマーカーｉＮＯＳ２は、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ４０及びＣＤ６８とは別に、有意に上方調節された（図５のＦ）。このようなデータは、ＣＰＳの処理が炎症性マクロファージを生成し、免疫抑制性マクロファージを免疫刺激性表現型に再プログラミングすることを意味する。
【0368】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【産業上の利用可能性】
【0369】
本発明の新規ラクトバシラスプランタルムＩＭＢ１９菌株及び前記菌株由来の多糖体は、優れたＣＤ８＋ Ｔ細胞活性の刺激能力及びＴｒｅｇ細胞の抑制活性を示し、ＣＰＳ腫瘍内マクロファージ浸潤増加、マクロファージの炎症性（Ｍ１）表現型への分化／再プログラミングのような様々なメカニズムによって抗腫瘍免疫反応を刺激及び向上させる。したがって、本発明の菌株及び菌株由来多糖体は、対象における免疫の調節、特に免疫増進のために有用に使用されてよく、抗腫瘍免疫反応を誘導及び向上させ、腫瘍の成長を抑制させることができる。本発明の新規菌株及び菌株由来の多糖体は、例えば、腫瘍、感染性疾患、免疫機能異常を原因又は症状とする様々な免疫疾患の予防、改善又は治療に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】