特許7340144がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-30
(45)【発行日】2023-09-07
(54)【発明の名称】がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20230831BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230831BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20230831BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230831BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
A61P35/00
C12N5/0783 ZNA
C12N15/09 Z
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022101099
(22)【出願日】2022-06-23
(62)【分割の表示】P 2021076293の分割
【原出願日】2014-10-02
(65)【公開番号】P2022130537
(43)【公開日】2022-09-06
【審査請求日】2022-07-21
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）４月７日開催された米国癌学会（ＡＡＣＲ）の会議にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｙｔｉｍｅｓ．ｃｏｍ／２０１４／０５／０９／ｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｔｏｒｓ－ｕｓｅ－ｐａｔｉｅｎｔｓ－ｉｍｍｕｎｅ－ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ｓｈｒｉｎｋ－ｃａｎｃｅｒ－ｔｕｍｏｒｓ．ｈｔｍｌを通じて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｓｊ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｐａｔｉｅｎｔｓ－ｉｍｍｕｎｅ－ｓｙｓｔｅｍ－ｈａｒｎｅｓｓｅｄ－ｔｏ－ａｔｔａｃｋ－ｃａｎｃｅｒ－１３９９５７９９６５？ＫＥＹＷＯＲＤＳ＝Ｐａｔｉｅｎｔ％２７ｓ％２０Ｃｅｌｌｓ％２０Ｂａｔｔｌｅ％２０Ｔｕｍｏｒｓ＆ｍｇ＝ｒｅｎｏ６４－ｗｓｊ＆ｔｅｓｌａ＝ｙを通じて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓｃｅｎｔｅｒ／ｎｅｗｓｆｒｏｍｎｃｉ／２０１４／ＡＣＴｅｐｉｔｈｅｌｉａｌを通じて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｃｎｅｗｓ．ｃｏｍ／ｈｅａｌｔｈ／ｃａｎｃｅｒ／ｎｅｗ－ｉｍｍｕｎｅ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｐｐｒｏａｃｈ－ｔａｃｋｌｅｓ－ｗｏｍａｎｓ－ｒａｒｅ－ｃａｎｃｅｒ－ｎ１００８１１を通じて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月９日ｈｔｔｐ：／／ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４４／６１８４／６４１．ｆｕｌｌを通じて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）７月１日ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０／１３／３４０１．ｆｕｌｌ、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０／１３／３４０１．ｆｕｌｌ－ｔｅｘｔ．ｐｄｆを通じて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）７月１９日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｐａｃｔｊｏｕｒｎａｌｓ．ｃｏｍ／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｊｏｕｒｎａｌ＝ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ＆ｐａｇｅ＝ａｒｔｉｃｌｅ＆ｏｐ＝ｖｉｅｗ＆ｐａｔｈ％５Ｂ％５Ｄ＝２２３４を通じて発表
(73)【特許権者】
【識別番号】510002280
【氏名又は名称】アメリカ合衆国
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】トラン、エリック
(72)【発明者】
【氏名】ル、ヨング－チェン
(72)【発明者】
【氏名】ロビンズ、ポール エフ．
(72)【発明者】
【氏名】ロゼンバーグ、ステーヴン エー．
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１３３５６７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０２１８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０８８１１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Nat. Rev. Immunol. (2012) vol.12, no.4, p.269-281
【文献】日本免疫学会総会・学術集会記録 (2013) vol.42, p.12(S7-2)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／１７
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者におけるがんの治療又は予防のための医薬の製造方法であって、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；
患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；
患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；
（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、単離されたＴ細胞を提供すること；
選択された自己Ｔ細胞の数を増幅して、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ること；及び
該Ｔ細胞集団を該医薬へと製剤化し、該医薬は注入当たり１００万～１５００億Ｔ細胞を含むこと
を含む、方法。
【請求項2】
細胞の数を増幅することが、選択された細胞を、フィーダーＰＢＭＣ、インターロイキン（ＩＬ）－２、及びＯＫＴ３抗体と共に培養することを含む、請求項１の方法。
【請求項3】
がんが上皮がんである、請求項１又は２の方法。
【請求項4】
がんが胆管がん、黒色腫、結腸がん又は直腸がんである、請求項１又は２の方法。
【請求項5】
Ｔ細胞集団が患者に対して自己である、請求項１～４のいずれか１項の方法。
【請求項6】
患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することが、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドプールでＡＰＣをパルスすることを含み、プール中の各ペプチドは異なる突然変異アミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項の方法。
【請求項7】
患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することが、突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をＡＰＣに導入することを含む、請求項１～５のいずれか１項の方法。
【請求項8】
自己ＡＰＣに導入されるヌクレオチド配列がタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトであり、各ミニ遺伝子が異なる遺伝子を含み、各遺伝子が突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含む、請求項７の方法。
【請求項9】
医薬が、注入当たり１０００万～１３００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項10】
医薬が、注入当たり１億～１３００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項11】
医薬が、注入当たり５００万～１２００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項12】
医薬が、注入当たり２５００万～１０００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項13】
医薬が、注入当たり５億～８００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項14】
医薬が、注入当たり２０００万～１２００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項15】
医薬が、注入当たり３０００万～１１００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項16】
医薬が、注入当たり４０００万～１０００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項17】
医薬が、注入当たり１億２０００万～１１００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項18】
医薬が、注入当たり２億５０００万～１０００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項19】
医薬が、注入当たり３億５０００万～９００億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【請求項20】
医薬が、注入当たり４億５０００万～７５０億Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
電子提出された物件の参照による組み込み
本明細書と同時提出され、且つ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、参照により、本明細書中にその全体が組み込まれる：２０１４年９月３０日付ファイル名「７１８２９２ＳＴ２５．ＴＸＴ」、２９，５６８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
本明細書と同時提出され、且つ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、参照により、本明細書中にその全体が組み込まれる：２０１４年９月３０日付ファイル名「７１８２９２ＳＴ２５．ＴＸＴ」、２９，５６８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者において有益な臨床反応をもたらし得る。それにもかかわらず、がんや他の病気を、ＡＣＴを使用して首尾よく広範に治療することへの障害が残っている。例えば、がん抗原を特異的に認識するＴ細胞は、同定すること及び／又は患者から単離することが困難であり得る。従って、がん反応性Ｔ細胞を得る方法の改善についてのニーズがある。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者において有益な臨床反応をもたらし得る。それにもかかわらず、がんや他の病気を、ＡＣＴを使用して首尾よく広範に治療することへの障害が残っている。例えば、がん抗原を特異的に認識するＴ細胞は、同定すること及び／又は患者から単離することが困難であり得る。従って、がん反応性Ｔ細胞を得る方法の改善についてのニーズがある。
【発明の概要】
【0003】
発明の要旨
本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法であって、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；及び（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、単離されたＴ細胞を提供することを含む、方法を提供する。
本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法であって、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；及び（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、単離されたＴ細胞を提供することを含む、方法を提供する。
【0004】
本発明の別の実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を調製する方法であって、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択すること；及び選択された自己Ｔ細胞の数を増幅し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ることを含む、方法を提供する。
【0005】
本発明のさらなる実施形態は、関連する細胞集団、医薬組成物、及びがんを治療又は予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】図１Ａは、３７３７－ＴＩＬと、ＯＫＴ３、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＲＮＡ若しくは表示したタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトをトランスフェクションした樹状細胞（ＤＣ）との、２０時間の共培養後に、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって測定した、１ｘ１０３（１ｅ３）細胞あたりのスポット数を示すグラフである。「＞」は、１×１０３細胞あたり５００超のスポットを示す。モックトランスフェクションした細胞は、核酸の添加なしで、トランスフェクション試薬のみで処理した。図１Ｂは、ＯＫＴ３或いはＧＦＰ ＲＮＡ、ＴＭＧ－１、又は表示した野生型（ｗｔ）遺伝子ＡＬＫ、ＣＤ９３、ＥＲＢＢ２ＩＰ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＧＲＸＣＲ１、ＫＩＦ９、ＮＡＧＳ、ＮＬＲＰ２、若しくはＲＡＣ３をトランスフェクションしたＤＣとの共培養後の、ＯＸ４０＋である、ＣＤ４＋の３７３７－ＴＩＬのパーセンテージを示すグラフである。モックトランスフェクションした細胞は、核酸の添加なしで、トランスフェクション試薬のみで処理した。
【図2】図２Ａ～２Ｃは、何もなしでか、又は表示したＨＬＡ遮断抗体（ＭＨＣ－１、ＭＨＣ－ＩＩ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、若しくはＨＬＡ－ＤＲ）と前培養していた、ＴＭＧ－１をトランスフェクションしたＤＣ（Ａ）又は６２４－ＣＩＩＴＡ細胞（（Ｂ）及び（Ｃ））と共培養した３７３７－ＴＩＬ（Ａ）、ＤＭＦ５Ｔ細胞（Ｂ）、又はＴ４Ｔ細胞（Ｃ）について、２０時間目において、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した、１×１０３（１ｅ３）細胞あたりのスポット数を示すグラフである（Ａ～Ｃ）。図２Ｄは、ＤＭＳＯ、突然変異（ｍｕｔ）ＡＬＫ又はｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸（－ＡＡ）長ペプチドで一晩パルスした、自己ＤＱ－０３０１／－０６０１Ｂ細胞（灰色の棒）又はＨＬＡ－ＤＱ０５／０６０１遺伝子座（黒色の棒）若しくはＨＬＡ－ＤＱ－０２０１／０３０１遺伝子座（斜線なしの棒）において一部適合する同種異系ＥＢＶ－Ｂ細胞と共培養した３７３７－ＴＩＬについて、２０時間目においてＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した、１×１０３（１ｅ３）細胞あたりのスポット数を示すグラフである。ＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号５３）；図２Ｅは、ｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸ペプチドＴＳＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号７３）又は表示した、切断型ｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰペプチドＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号３０）、ＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号３１）、ＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号３２）、ＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号３３）、ＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮＬＥ（配列番号５３）、ＴＳＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬ（配列番号３４）、ＴＳＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮ（配列番号３５）、ＴＳＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮ（配列番号３６）、ＴＳＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹ（配列番号３７）、若しくはＴＳＦＬＳＩＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮＫＹＰＮ（配列番号３８）で一晩パルスした自己Ｂ細胞と共培養した３７３７－ＴＩＬについて、２０時間目において、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した１×１０３（１ｅ３）細胞あたりのスポット数を示すグラフである。
【図3】図３Ａは、生きている、ＣＤ４＋（陰影付き）Ｔ細胞又はＣＤ８＋（陰影なし）Ｔ細胞にゲートしたフローサイトメトリーによって測定した、３７３７－ＴＩＬ中の様々なＴＣＲＶβクローン型のパーセンテージを示すグラフである。図３Ｂは、３７３７－ＴＩＬの養子細胞移入０日目（矢印で表示）前後の、表示した日数で測定した、患者３７３７の血清サンプル中で検出したＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。図３Ｃは、細胞移入０日目（矢印で表示）に対する、表示した月数での全腫瘍負荷（丸）（前処置基準の％として測定）又は肺（三角）若しくは肝臓（四角）における腫瘍負荷を示すグラフである。図３Ｄは、フローサイトメトリーによって測定した、ＣＤ４＋Ｖβ２２－ＯＸ４０＋の３７３７－ＴＩＬにおける、種々のＴＣＲＶβクローン型のパーセンテージを示すグラフである。
【図4】図４Ａ及び４Ｂは、３７３７－ＴＩＬを用いた養子細胞移入前後（細胞移入前の腫瘍（菱形）及び細胞移入後の種々の腫瘍（Ｔｕ－１－Ｐｏｓｔ（四角）、Ｔｕ－２－Ｐｏｓｔ（▲）、及びＴｕ－３－Ｐｏｓｔ（▼）））の様々な時点で、患者３７３７の血液（丸）中の、２のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的ＴＣＲβ－ＣＤＲ３クローン型、Ｖβ２２＋（Ａ）及びＶβ５．２＋（Ｂ）の頻度を示すグラフである。陰影付きの棒は、移入細胞（３７３７－ＴＩＬ）における２のＥＲＢＢ２ＩＰ－突然変異特異的ＴＣＲβ－ＣＤＲ３クローン型、Ｖβ２２＋（Ａ）及びＶβ５．２＋（Ｂ）の頻度を示す。「Ｘ」は「検出なし」を示す。図４Ｃは、３７３７－ＴＩＬ（Ｔ細胞）及び種々の養子細胞移入前（Ｔｕ－Ｐｒｅ）及び後（Ｔｕ－１－ｐｏｓｔ、Ｔｕ－２－ｐｏｓｔ及びＴｕ－３－ｐｏｓｔ）の腫瘍における、ＡＣＴＢと比べたＥＲＢＢ２ＩＰの発現を示すグラフである。図４Ｄは、細胞移入（矢印で表示）に対する、表示した月数における全腫瘍負荷（丸）（前処置基準の％として測定）又は肺（三角）若しくは肝臓（四角）における腫瘍負荷を示すグラフである。
【図5A】図５Ａは、同定した、突然変異した６アミノ酸残基（そのＮ－及びＣ－末端に、両側の１２アミノ酸が隣接する）を含有するポリペプチドをコードするタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトの一例の模式図である。突然変異ＫＩＦ２Ｃ配列は、ＤＳＳＬＱＡＲＬＦＰＧＬＴＩＫＩＱＲＳＮＧＬＩＨＳ（配列番号５７）である。
【図5B】図５Ｂは、自己メラニン細胞又はＨＬＡ－Ａ＊０２０５及びＴＭＧコンストラクトＲＪ－１（図９Ａに示す構造）、ＲＪ－２、ＲＪ－３、ＲＪ－４、ＲＪ－５、ＲＪ－６、ＲＪ－７、ＲＪ－８、ＲＪ－９、ＲＪ－１０、ＲＪ－１１、ＲＪ－１２、若しくは空のベクターを共トランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞と一晩共培養したＴＩＬ２３５９Ｔ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図5C】図５Ｃは、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５及びＲＪ－１変異体をトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞と共培養したＴＩＬ２３５９によって分泌されたＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである（表中、「ｗｔ」と表示した遺伝子を、ＷＴ配列に再変換した）。ＫＩＦ２Ｃ ＷＴ配列はＤＳＳＬＱＡＲＬＦＰＧＬＡＩＫＩＱＲＳＮＧＬＩＨＳ（配列番号６５）である。
【図5D】図５Ｄは、ＨＬＡ ｃＤＮＡコンストラクト（左から右の各棒で特定される）：ＨＬＡ－Ａ＊０１０１（陰影なしの棒）、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（灰色の棒）、又はＨＬＡ－Ａ＊０２０５（黒色の棒）と共に、空のベクター、ＫＩＦ２Ｃ ＷＴ、又は突然変異ＫＩＦ２ＣのｃＤＮＡコンストラクトをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞と共培養したＴＩＬ２３５９によって分泌されたＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図5E】図５Ｅは、種々の濃度（μＭ）のＫＩＦ２Ｃ１０－１９ ＷＴ（ＲＬＦＰＧＬＡＩＫＩ；配列番号５８）（グラフ中の下の線）又は突然変異ＫＩＦ２Ｃ１０－１９（ＲＬＦＰＧＬＴＩＫＩ；配列番号５９）（グラフ中の上の線）でパルスした、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞と一晩共培養したＴＩＬ２３５９Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図6A】図６Ａは、自己メラニン細胞又は、空のベクター若しくはＤＷ－１～ＤＷ－３７から成る群から選択されたＴＭＧコンストラクトをトランスフェクションした、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞と共培養したＴＩＬ２５９１Ｔ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図6C】図６Ｃは、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１及びＤＷ－６変異体をトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞と共培養したＴＩＬ２５９１によって分泌されたＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである（表中、「ｗｔ」と表示した遺伝子を、ＷＴ配列に再変換した）。ＰＯＬＡ２ ＷＴ配列は、ＴＩＩＥＧＴＲＳＳＧＳＨＬＶＦＶＰＳＬＲＤＶＨＨＥ（配列番号６６）である。
【図6D】図６Ｄは、ＨＬＡ ｃＤＮＡコンストラクト（左から右の各バーで特定される）：ＨＬＡ－Ｃ＊０４０１（陰影なしの棒）、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１（灰色の棒）、又はＨＬＡ－Ｃ＊０７０２（黒色の棒）と共に、空のベクター、ＰＯＬＡ２ ＷＴ、又は突然変異ＰＯＬＡ２のｃＤＮＡコンストラクトをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞と共培養したＴＩＬ２５９１によって分泌されたＩＦＮ－γ量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0007】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法を提供する。本発明は多くの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、患者の全ＭＨＣ分子拘束性の多数の突然変異を、一度に迅速に評価し得、患者の突然変異反応性Ｔ細胞の全レパートリーを同定し得る。更に、本発明の方法は、免疫原性がん突然変異を、（ａ）がん特異的サイレント突然変異（突然変異アミノ酸配列をコードしない）及び（ｂ）非免疫原性アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異と区別することにより、Ｔ細胞によって標的とされ得る１以上のがん特異的突然変異アミノ酸配列を同定し得る。更に、本発明は、患者に特有のがん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を提供し得、それにより、例えば、患者のがんを治療又は予防するための養子細胞療法のための細胞を調製するのに有用であり得る、単離された、Ｔ細胞の「個人向け」集団（“ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ” ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する。本発明の方法はまた、例えばｃＤＮＡライブラリーを用いるもの等の、がん抗原を同定する従来の方法における固有の技術的バイアスを回避し得、それらの方法よりも時間と労力が少ない場合もある。例えば、本発明の方法は、Ｔ細胞と、特に上皮がん（例）に関して作製が困難であり得る腫瘍細胞株とを共培養することなく、突然変異応答性Ｔ細胞を選択し得る。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明の方法は、正常な非がん性細胞の破壊を最少化又は回避し、それによって毒性を低減又は除去しつつ、がん細胞の破壊を目的とするＴ細胞を同定及び単離し得ると考えられる。従って、本発明はまた、例えば、化学療法単独、外科手術又は放射線等の他のタイプの治療に反応しないがん等のがんを、首尾よく治療又は予防するＴ細胞を提供し得る。
本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法を提供する。本発明は多くの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、患者の全ＭＨＣ分子拘束性の多数の突然変異を、一度に迅速に評価し得、患者の突然変異反応性Ｔ細胞の全レパートリーを同定し得る。更に、本発明の方法は、免疫原性がん突然変異を、（ａ）がん特異的サイレント突然変異（突然変異アミノ酸配列をコードしない）及び（ｂ）非免疫原性アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異と区別することにより、Ｔ細胞によって標的とされ得る１以上のがん特異的突然変異アミノ酸配列を同定し得る。更に、本発明は、患者に特有のがん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を提供し得、それにより、例えば、患者のがんを治療又は予防するための養子細胞療法のための細胞を調製するのに有用であり得る、単離された、Ｔ細胞の「個人向け」集団（“ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ” ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する。本発明の方法はまた、例えばｃＤＮＡライブラリーを用いるもの等の、がん抗原を同定する従来の方法における固有の技術的バイアスを回避し得、それらの方法よりも時間と労力が少ない場合もある。例えば、本発明の方法は、Ｔ細胞と、特に上皮がん（例）に関して作製が困難であり得る腫瘍細胞株とを共培養することなく、突然変異応答性Ｔ細胞を選択し得る。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明の方法は、正常な非がん性細胞の破壊を最少化又は回避し、それによって毒性を低減又は除去しつつ、がん細胞の破壊を目的とするＴ細胞を同定及び単離し得ると考えられる。従って、本発明はまた、例えば、化学療法単独、外科手術又は放射線等の他のタイプの治療に反応しないがん等のがんを、首尾よく治療又は予防するＴ細胞を提供し得る。
【0008】
該方法は、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定することを含み得る。がん細胞は、腫瘍細胞又はがん細胞を含有するか、又は含有することが予想される患者由来の任意の身体試料から得られ得る。身体試料は、血液、原発腫瘍から若しくは転移腫瘍から得られた組織サンプル等の任意の組織サンプル、又は腫瘍若しくはがん細胞を含有する他の任意のサンプルであり得る。がん細胞の核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【0009】
がん特異的突然変異を同定するために、該方法は、正常な非がん性細胞のＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸を配列決定し、がん細胞の配列を正常な非がん性細胞の配列と比較することを更に含み得る。正常な非がん性細胞は、患者又は異なる個体から得られ得る。
【0010】
がん特異的突然変異は、突然変異アミノ酸配列（「非サイレント突然変異」とも言われる）をコードし、がん細胞において発現するが、正常の非がん性細胞ではしない任意の遺伝子における任意の突然変異であり得る。本発明の方法において同定され得るがん特異的突然変異の非限定的な例としては、ミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失、重複、フレームシフト及びリピート伸長変異（ｒｅｐｅａｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が挙げられる。本発明の一実施形態においては、該方法は、突然変異アミノ酸配列をコ
ードするがん特異的突然変異を含有する、少なくとも１の遺伝子を同定することを含む。しかし、本発明の方法を用いて同定され得る、かかるがん特異的突然変異を含有する遺伝子の数は限定されず、１超（例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）の遺伝子が挙げられ得る。同様に、本発明の一実施形態においては、該方法は、突然変異アミノ酸配列をコードする、少なくとも１のがん特異的突然変異を同定することを含む。しかし、本発明の方法を用いて同定され得る、かかるがん特異的突然変異の数は限定されず、１超（例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）のがん特異的突然変異が挙げられ得る。１超のがん特異的突然変異が同定される実施形態においては、がん特異的突然変異は、同一の遺伝子又は異なる遺伝子中に位置し得る。
ードするがん特異的突然変異を含有する、少なくとも１の遺伝子を同定することを含む。しかし、本発明の方法を用いて同定され得る、かかるがん特異的突然変異を含有する遺伝子の数は限定されず、１超（例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）の遺伝子が挙げられ得る。同様に、本発明の一実施形態においては、該方法は、突然変異アミノ酸配列をコードする、少なくとも１のがん特異的突然変異を同定することを含む。しかし、本発明の方法を用いて同定され得る、かかるがん特異的突然変異の数は限定されず、１超（例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）のがん特異的突然変異が挙げられ得る。１超のがん特異的突然変異が同定される実施形態においては、がん特異的突然変異は、同一の遺伝子又は異なる遺伝子中に位置し得る。
【0011】
一実施形態においては、がん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定することは、がん細胞の全エクソーム、全ゲノム、又は全トランスクリプトームを配列決定することを含む。配列決定は、当該技術分野で公知の、任意の好適な様態で行われ得る。本発明の方法において有用であり得る配列決定技術の例としては、次世代配列決定（ＮＧＳ）（「大規模並列配列決定技術」とも言われる）又は第３世代配列決定（Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられる。ＮＧＳは、非サンガーベースのハイスループットＤＮＡ配列決定技術を指す。ＮＧＳにより、数百万又は数十億のＤＮＡ鎖が並行して配列決定され得、相当に高いスループットをもたらし、ゲノムのサンガー配列決定によく用いられる、フラグメントクローニング法に対する必要性を最小限に抑える。ＮＧＳにおいては、ゲノム全体を小断片に分割することによって、核酸テンプレートが、ゲノム全体にわたって、並行してランダムに読み取られ得る。ＮＧＳは、好都合なことに、非常に短い期間、例、約１～約２週以内、好ましくは約１～約７日以内、又は、最も好ましくは２４時間未満の時間内に、ゲノム、エクソーム又はトランスクリプトーム全体の核酸配列情報を提供し得る。市販されているか、又は文献に記載されている複数のＮＧＳプラットフォームが、本発明の方法に関連して用いられ得る（例、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３８（３）：９５－１０９（２０１１）及びＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５：６４１－６５８（２００９）に記載されたもの）。
【0012】
ＮＧＳの技術及びプラットフォームの非限定的な例としては、（ＧＳ－ＦＬＸ ４５４
ゲノムシークエンサー，４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、若しくはＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱ ２０００ゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて（例）、又はＲｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（５３７５）：３６３－３６５（１９９８）（例）に記載の通りに、行われるような）１塩基合成（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（「パイロシークエンシング」としても知られる）、（ＳＯＬＩＤプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又はＰＯＬＯＮＡＴＯＲ Ｇ．００７プラットフォーム（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて（例）行われるような）シークエンシング・バイ・ライゲーション（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）、（ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）又はＨＥＬＩＳＣＯＰＥ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて（例）行われるような）単一分子配列決定、（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧＲＩＤＯＮプラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）によって開発されたハイブリダイゼーション・アシステッドナノポアシークエンンシング（ＨＡＮＳ）プラットフォーム、プローブ－アンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）と呼ばれるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）テクノロジーによる、リガーゼベースのＤＮＡ配列決定プラットフォームを用いて（例）行われるような）単一分子配列決定のための技術、単一分子配列決定のための電子顕微鏡ベースの技術、及びイオン半導体シークエンシングが挙げられる。
ゲノムシークエンサー，４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、若しくはＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱ ２０００ゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて（例）、又はＲｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（５３７５）：３６３－３６５（１９９８）（例）に記載の通りに、行われるような）１塩基合成（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（「パイロシークエンシング」としても知られる）、（ＳＯＬＩＤプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又はＰＯＬＯＮＡＴＯＲ Ｇ．００７プラットフォーム（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて（例）行われるような）シークエンシング・バイ・ライゲーション（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）、（ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）又はＨＥＬＩＳＣＯＰＥ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて（例）行われるような）単一分子配列決定、（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧＲＩＤＯＮプラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）によって開発されたハイブリダイゼーション・アシステッドナノポアシークエンンシング（ＨＡＮＳ）プラットフォーム、プローブ－アンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）と呼ばれるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）テクノロジーによる、リガーゼベースのＤＮＡ配列決定プラットフォームを用いて（例）行われるような）単一分子配列決定のための技術、単一分子配列決定のための電子顕微鏡ベースの技術、及びイオン半導体シークエンシングが挙げられる。
【0013】
該方法は、患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することを含み得る。ＡＰＣとしては、それらの細胞表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と関係して、タンパク質のペプチド断片を提示する任意の細胞が挙げられ得る。ＡＰＣとしては、例えば、マクロファージ、ＤＣ、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球及びＴ細胞のうちの任意の１以上が挙げられ得る。好ましくは、ＡＰＣはＤＣである。本発明の方法は、患者からの自己ＡＰＣを用いることによって、好都合なことに、患者に発現するＭＨＣ分子の関係で提示されるがん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を同定し得る。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲ分子が挙げられるが、これらに限定されない、患者によって発現される任意のＭＨＣ分子であり得る。本発明の方法は、例えば、いくつかのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を選択する（ａ ｓｅｌｅｃｔ ｆｅｗ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ）ためのみに有用であり得、突然変異反応性Ｔ細胞を選択するための試薬（例えば、ＭＨＣテトラマーの不完全なセット）の入手が限られていることによって制約され得る、ＭＨＣ分子又は突然変異アミノ酸配列を同定するためのエピトープ予測アルゴリズムを用いることなく、患者によって発現される任意のＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列を、好都合に同定し得る。従って、本発明の一実施形態においては、本発明の方法は、患者によって発現される任意のＭＨＣ分子の関係において提示される突然変異アミノ酸配列を、好都合に同定し、任意の特定のＭＨＣ分子に制限されない。好ましくは、自己ＡＰＣは、抗原陰性自己ＡＰＣである。
【0014】
患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することは、当該技術分野で公知の、任意の好適な方法を用いて行われ得る。本発明の一実施形態においては、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することは、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドプールで自己ＡＰＣをパルスすることを含み、プール中の各ペプチドは、異なる突然変異アミノ酸配列を含む。プール中の突然変異アミノ酸配列の各々は、がん特異的突然変異を含有する遺伝子によってコードされ得る。これに関して、自己ＡＰＣは、ＡＰＣがペプチド（複数可）を内在化させ、ＭＨＣ分子に結合した突然変異アミノ酸配列（複数可）を細胞膜上に提示するような様態で、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドのプールと共に培養され得る。１超の遺伝子が同定され、各遺伝子が突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する実施形態においては、該方法は、プール中の各ペプチドが異なる突然変異アミノ酸配列を含むペプチドプールで、自己ＡＰＣをパルスすることを含み得る。ＡＰＣをパルスする方法は、当該技術分野で公知であり、Ｓｏｌｈｅｉｍ（Ｅｄ．），Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，（２０１０）（例）に記載の通りである。ＡＰＣをパルスするために使用されるペプチド（複数可）としては、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸（複数可）が挙げられ得る。ペプチド（複数可）は、突然変異アミノ酸（複数可）のカルボキシル側及びアミノ側のそれぞれに、同定された遺伝子によってコードされる内因性タンパク質由来の、任
意の好適な数の、連続したアミノ酸を更に含み得る。突然変異の各側に隣接する、内在性タンパク質由来の連続したアミノ酸の数は限定されず、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲であり得る。好ましくは、ペプチド（複数可）は、突然変異アミノ酸（複数可）の各側に、内因性タンパク質由来の約１２の連続したアミノ酸を含む。
意の好適な数の、連続したアミノ酸を更に含み得る。突然変異の各側に隣接する、内在性タンパク質由来の連続したアミノ酸の数は限定されず、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲であり得る。好ましくは、ペプチド（複数可）は、突然変異アミノ酸（複数可）の各側に、内因性タンパク質由来の約１２の連続したアミノ酸を含む。
【0015】
本発明の一実施形態においては、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することは、突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、ＡＰＣに導入することを含む。ヌクレオチド配列はＡＰＣに導入され、ＡＰＣは突然変異アミノ酸配列を発現し、ＭＨＣ分子に結合させて、細胞膜上に提示する。突然変異アミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。ＡＰＣへのヌクレオチド配列の導入は、Ｓｏｌｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．（上記）（例）に記載の通りに、当該技術分野で公知の、異なる様々な方法のいずれかで行われ得る。ＡＰＣへのヌクレオチド配列の導入に有用な技術の非限定的な例としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。１超の遺伝子が同定される実施形態においては、該方法は、それぞれが、異なる遺伝子によってコードされる突然変異アミノ酸配列をコードする、１超のヌクレオチド配列を調製すること、及び各ヌクレオチド配列を自己ＡＰＣの、異なる集団に導入することを含み得る。これに関して、各集団が、異なる突然変異アミノ酸配列を発現し提示する、自己ＡＰＣの複数の集団が得られ得る。
【0016】
１超の遺伝子が同定され、各遺伝子が突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する実施形態においては、該方法は、１超の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を導入することを含み得る。これに関して、本発明の一実施形態においては、自己ＡＰＣに導入されるヌクレオチド配列は、ＴＭＧコンストラクトであり、各ミニ遺伝子は異なる遺伝子を含み、各遺伝子は突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含む。各ミニ遺伝子は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、本発明の方法によって同定された１の突然変異（突然変異の各側に、同定された遺伝子によってコードされる内在性タンパク質からの、任意の好適な数の連続したアミノ酸が隣接する）をコードし得る。コンストラクト中のミニ遺伝子の数は限定されず、例えば、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つにより規定される範囲が挙げられ得る。ＡＰＣは、ＴＭＧコンストラクトによってコードされる突然変異アミノ酸配列を発現し、ＭＨＣ分子に結合した突然変異アミノ酸配列を細胞膜上に提示する。一実施形態においては、該方法は、各コンストラクトが、異なる遺伝子によってコードされた突然変異アミノ酸配列の異なるセットをコードする、１超のＴＭＧコンストラクトを調製すること、及び各ＴＭＧコンストラクトを自己ＡＰＣの異なる集団に導入することを含む。これに関して、各集団が、異なるＴＭＧコンストラクトによってコードされる突然変異アミノ酸配列を発現し提示する、自己ＡＰＣの複数の集団が得られ得る。
【0017】
該方法は、患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを培養することを含み得る。Ｔ細胞は、腫瘍、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液が挙げられるがこれらに限定されない、患者中の多くのソースから得られ得る。Ｔ細胞には、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞（例、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、末梢血Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞が含まれ得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞であり得る。該方法は、自己Ｔ細胞が、ＡＰＣによって提示された突然変異アミノ酸配列に特異的に結合し、免疫学的に認識するような様態で、Ｔ細胞がＡＰＣに
よって提示される突然変異アミノ酸配列に遭遇するように、自己Ｔ細胞と自己ＡＰＣとを共培養することを含み得る。本発明の一実施形態においては、自己Ｔ細胞は、直接自己ＡＰＣに接触して共培養される。
よって提示される突然変異アミノ酸配列に遭遇するように、自己Ｔ細胞と自己ＡＰＣとを共培養することを含み得る。本発明の一実施形態においては、自己Ｔ細胞は、直接自己ＡＰＣに接触して共培養される。
【0018】
該方法は、（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択することを含み得る。語句「抗原特異性」は、本明細書で用いる場合、自己Ｔ細胞が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に特異的に結合し得、免疫学的に認識し得ることを意味する。選択することは、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を同定し、それらを、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＴ細胞から分離することを含み得る。突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することは、任意の好適な方法で行われ得る。本発明の一実施形態においては、該方法は、例えば、自己Ｔ細胞の選択に先立って、インターロイキン（ＩＬ）－２又はＩＬ－１５等のＴ細胞増殖因子と共培養することによって、又は本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りに、自己Ｔ細胞の数を増幅することを含む。本発明の一実施形態においては、該方法は、自己Ｔ細胞の選択に先立って、ＩＬ－２又はＩＬ－１５等のＴ細胞増殖因子で、自己Ｔ細胞の数を増幅することを含まない。
【0019】
例えば、自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養の際に、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞は、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するこれらのＴ細胞を同定するために用いられ得る、様々なＴ細胞活性化マーカーのうちの任意の１以上を発現し得る。かかるＴ細胞活性化マーカーとしては、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ１０７ａが挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、本発明の一実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ１０７ａのうちの任意の１以上を発現するＴ細胞を選択することを含む。１以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞は、例えば、マーカーの発現に基づいて、Ｔｕｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０（２）：３３１－４３（２０１３）及びＧｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２４（５）：２２４６－５９（２０１４）（例）に記載の通りに、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）等の、当該技術分野で公知の、様々な技術のいずれかを用いて選別され得る。
【0020】
本発明の別の実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することが、（ｉ）突然変異アミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に際して、ネガティブコントロールによって分泌される１以上のサイトカインの量と比較して、より多くの量の１以上のサイトカインを分泌するか、又は（ｉｉ）突然変異アミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に際して、１以上のサイトカインを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、少なくとも２倍の多さの数のＴ細胞が１以上のサイトカインを分泌する、Ｔ細胞を選択することを含む。１以上のサイトカインは、Ｔ細胞によるその分泌がＴ細胞の活性化（例、突然変異アミノ酸配列に特異的に結合し免疫学的に認識する、Ｔ細胞に発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ））に特徴的である、任意のサイトカインを含み得る。分泌がＴ細胞活性化に特徴的であるサイトカインの非限定的な例としては、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２２が挙げられる。
【0021】
例えば、自己Ｔ細胞は、（ａ）ある濃度の、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド（例
、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ（例、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬ））でパルスした、抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣとの共培養の際に、ネガティブコントロールによって分泌されるＩＦＮ－γの量と比較して、Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γを、少なくとも２倍多く分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ネガティブコントロールは、例えば、（ａ）同濃度の関係性のないペプチド（例、野生型アミノ酸配列、又は突然変異アミノ酸配列と異なる配列を有する他の何らかのペプチド）でパルスした抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）関係性のないペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣと共培養された（例、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の）自己Ｔ細胞であり得る。自己Ｔ細胞はまた、突然変異アミノ酸を含む、より高濃度のペプチドでパルスした抗原陰性ＡＰＣと共培養した際、ネガティブコントロール（例えば上記のネガティブコントロール）と比較して、Ｔ細胞がより多くの量のＩＦＮ－γを分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有し得る。ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。
、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ（例、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬ））でパルスした、抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣとの共培養の際に、ネガティブコントロールによって分泌されるＩＦＮ－γの量と比較して、Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γを、少なくとも２倍多く分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ネガティブコントロールは、例えば、（ａ）同濃度の関係性のないペプチド（例、野生型アミノ酸配列、又は突然変異アミノ酸配列と異なる配列を有する他の何らかのペプチド）でパルスした抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）関係性のないペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣと共培養された（例、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の）自己Ｔ細胞であり得る。自己Ｔ細胞はまた、突然変異アミノ酸を含む、より高濃度のペプチドでパルスした抗原陰性ＡＰＣと共培養した際、ネガティブコントロール（例えば上記のネガティブコントロール）と比較して、Ｔ細胞がより多くの量のＩＦＮ－γを分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有し得る。ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。
【0022】
代替的に、又は追加的に、自己Ｔ細胞は、（ａ）ある濃度の突然変異アミノ酸配列を含むペプチドでパルスした抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）ＩＦＮ－γを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣとの共培養の際に、少なくとも２倍の多さの数のＴ細胞がＩＦＮ－γを分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ペプチド及びネガティブコントロールの濃度は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載された通りであり得る。ＩＦＮ－γを分泌する細胞の数は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ等の、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。
【0023】
本発明の一実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞は、（１）本明細書に記載の、任意の１以上のＴ細胞活性化マーカーの発現、（２）より多くの量の、本明細書に記載の通りの１以上のサイトカインの分泌、を両方し得るが、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞は、より多くの量の、１以上のサイトカインを分泌することなく、任意の１以上のＴ細胞活性化マーカーを発現し得るか、又は任意の１以上のＴ細胞活性化マーカーを発現することなく、より多くの量の、１以上のサイトカインを分泌し得る。
【0024】
本発明の別の実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することは、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択的に増殖させることを含む。これに関して、該方法は、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＴ細胞よりも、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の増殖が有利になるような様態で、自己Ｔ細胞と自己ＡＰＣとを共培養することを含み得る。従って、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＴ細胞と比較して、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の割合が高い、Ｔ細胞の集団が提供される。
【0025】
本発明の一実施形態においては、該方法は、複数の腫瘍断片を患者から得ること、該複数断片からの自己Ｔ細胞のそれぞれを別々に、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養すること、及び複数断片のそれぞれからのＴ細胞を、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに、突然変異アミノ酸配列に対する抗原特異性に関して別々に評価することを更に含む。
【0026】
Ｔ細胞が、複数の突然変異アミノ酸配列（例、ＴＭＧコンストラクトによってコードさ
れた複数の突然変異アミノ酸配列又は自己ＡＰＣ上にパルスされたペプチドプール中の複数の突然変異アミノ酸配列）を発現する自己ＡＰＣと共培養される本発明の実施形態においては、自己Ｔ細胞を選択することは、自己Ｔ細胞を、複数の各突然変異アミノ酸配列に対する抗原特異性に関して、別々に評価することを更に含み得る。例えば、本発明の方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り（例えば、各々が、コンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）異なる突然変異アミノ酸配列を提示する、別々のＡＰＣ集団を提供することにより）、患者の自己ＡＰＣを、コンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）各突然変異アミノ酸配列を提示するよう、別々に誘導することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、患者の自己Ｔ細胞と、各突然変異アミノ酸配列を提示する、異なる自己ＡＰＣ集団とを、別々に、共培養することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を、別々に選択することを更に含み得る。これに関して、該方法は、複数の突然変異アミノ酸配列をコードするＴＭＧコンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）どの突然変異アミノ酸配列が、自己Ｔ細胞によって免疫学的に（例、除去プロセスによって）認識されるのかを決定することを含み得る。
れた複数の突然変異アミノ酸配列又は自己ＡＰＣ上にパルスされたペプチドプール中の複数の突然変異アミノ酸配列）を発現する自己ＡＰＣと共培養される本発明の実施形態においては、自己Ｔ細胞を選択することは、自己Ｔ細胞を、複数の各突然変異アミノ酸配列に対する抗原特異性に関して、別々に評価することを更に含み得る。例えば、本発明の方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り（例えば、各々が、コンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）異なる突然変異アミノ酸配列を提示する、別々のＡＰＣ集団を提供することにより）、患者の自己ＡＰＣを、コンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）各突然変異アミノ酸配列を提示するよう、別々に誘導することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、患者の自己Ｔ細胞と、各突然変異アミノ酸配列を提示する、異なる自己ＡＰＣ集団とを、別々に、共培養することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を、別々に選択することを更に含み得る。これに関して、該方法は、複数の突然変異アミノ酸配列をコードするＴＭＧコンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）どの突然変異アミノ酸配列が、自己Ｔ細胞によって免疫学的に（例、除去プロセスによって）認識されるのかを決定することを含み得る。
【0027】
本発明の一実施形態においては、該方法は、選択された自己Ｔ細胞の数を増幅して、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ることを更に含む。選択された細胞の数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号；米国特許第８，３８３，０９９号；米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）；及びＲｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９－２０１（１９９０）に記載の通りの、当該技術分野で公知の、多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、Ｔ細胞数の増幅は、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、及びフィーダーのＰＢＭＣ（例、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣ）と共に培養することによって行われる。これに関して、本発明の方法は、好都合なことに、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、多数のＴ細胞を作製し得る。
【0028】
本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、養子細胞療法用の細胞を調製するために有用であり得る。これに関して、本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の集団を調製する方法を提供し、該方法は、該がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の集団を得るために、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、Ｔ細胞を単離すること、及び選択された自己Ｔ細胞の数を増幅することを含む。選択された細胞の数を増幅することは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに行われ得る。
【0029】
本発明の別の実施形態は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるいずれかの方法に従って調製された、単離された細胞集団を提供する。細胞集団は、少なくとも１の他の細胞（例、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＰＢＭＣ）又はＴ細胞以外の細胞（例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等）に加えて、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含む不均一集団であり得る。或いは、細胞集団は、集団が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を主に含む（例、実質的にそれからなる）、実質的に均一な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細
胞が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するように、集団の全細胞が単一のＴ細胞のクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載の通り、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含むクローン集団である。本発明の一実施形態においては、細胞集団のうちの約１％～約１００％、例えば約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲が、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含む。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を、高い割合で含む細胞集団では、好都合なことに、Ｔ細胞の機能（例、Ｔ細胞が、がん細胞の破壊を目的とする能力、及び／又はがんを治療若しくは予防する能力）を妨げ得る、不適切な細胞の割合が低い可能性があると考えられる。
胞が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するように、集団の全細胞が単一のＴ細胞のクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載の通り、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含むクローン集団である。本発明の一実施形態においては、細胞集団のうちの約１％～約１００％、例えば約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲が、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含む。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を、高い割合で含む細胞集団では、好都合なことに、Ｔ細胞の機能（例、Ｔ細胞が、がん細胞の破壊を目的とする能力、及び／又はがんを治療若しくは予防する能力）を妨げ得る、不適切な細胞の割合が低い可能性があると考えられる。
【0030】
本発明の細胞集団は、医薬組成物等の組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明は、本発明の細胞集団のいずれか及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明の細胞集団を、化学療法剤等、別の医薬的に活性な物質（複数可）又は薬剤（複数可）（例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）など）と組み合わせて含み得る。
【0031】
好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、考慮中の特定の本発明の細胞集団のために従来用いられているもののいずれかであり得る。かかる医薬的に許容可能な担体は、当業者に周知であり、公衆にとって容易に入手可能である。医薬的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【0032】
担体の選択は、特定の本発明の細胞集団によって、及び本発明の細胞集団を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。従って、多様な、本発明の医薬組成物の好適な製剤がある。好適な製剤としては、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内及び腹腔内投与のための、いずれかの製剤が挙げられ得る。本発明の細胞集団を投与するために、１超の経路が用いられ得、特定の例においては、特定の経路が、別の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。
【0033】
好ましくは、本発明の細胞集団は、注射により静脈内（例）に投与される。本発明の細胞集団が投与される場合、注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体は、任意の等張性の担体、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％ ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等が挙げられ得る。一実施形態においては、医薬的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミンが添加される。
【0034】
本発明の細胞集団及び医薬組成物は、がんを治療又は予防する方法において用いられ得ると考えられる。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明のＴ細胞は、細胞に発現するＴＣＲが、突然変異アミノ酸配列を発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介することができるように、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に、特異的に結合すると考えられる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法であって、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するための有効量の、本明細書に記載の医薬組成物又は細胞集団のいずれかを、哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
【0035】
用語「治療する」及び「予防する」並びにそれらの派生語は、本明細書で用いる場合、１００％の、又は完全な治療又は予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、任意のレベルの任意の量の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防を提供し得る。更に、本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防されている１以上の状態又はがんの症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退行を促進することを含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、がんの発症、又はその症状若しくは状態を遅延させることを包含し得る。
【0036】
本発明の目的のために、投与される本発明の細胞集団又は医薬組成物の量又は用量（例、本発明の細胞集団が投与される場合、細胞数）は、例えば、哺乳動物において、適切な期間にわたって治療的又は予防的反応をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本発明の細胞集団又は医薬組成物の用量は、がん特異的突然変異によりコードされる突然変異アミノ酸配列と結合するのに、又は、投与時から約２時間以上、例えば、１２～２４時間以上という期間でがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。いくつかの実施形態においては、該期間はもっと長くなり得る。用量は、投与される特定の本発明の細胞集団又は医薬組成物の有効性、及び動物（例、ヒト）の状態、及び治療される動物（例、ヒト）の体重によって決定される。
【0037】
投与量を決定するための多くのアッセイが、当該技術分野において公知である。本発明の目的のために、それぞれ異なる用量のＴ細胞を与えられる哺乳動物の１群のうちのある哺乳動物に、所与の用量のかかるＴ細胞を投与した際、標的細胞が溶解される程度、又は、Ｔ細胞によってＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが用いられ、哺乳動物に投与される開始用量が決定され得る。一定用量の投与の際の、標的細胞が溶解する程度、又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によりアッセイされ得る。
【0038】
本発明の細胞集団又は医薬組成物の用量はまた、本発明の特定の細胞集団又は組成物の投与に伴い得る、任意の不都合な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、年齢、体重、身体全体の健康、食事、性別、投与される本発明の細胞集団又は医薬組成物、投与経路、及び治療される状態の重症度等の種々の要因を考慮して、個々の患者のそれぞれを治療する、本発明の細胞集団又は医薬組成物の投与量を決定する。
【0039】
本発明の細胞集団が投与される実施形態においては、投与される注入当たりの細胞数は、例えば、１００万～１０００億細胞の範囲で変わり得る；しかしながら、この例示的な範囲を下まわるか、又は上まわる量は、本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の１日用量は、約１００万～約１５００億細胞（例、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、約６００億細胞、約８００億細胞、約１０００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞、約１５００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範
囲）、好ましくは約１０００万～約１３００億細胞（例、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）、より好ましくは約１億細胞～約１３００億細胞（例、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞（又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）であり得る。
囲）、好ましくは約１０００万～約１３００億細胞（例、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）、より好ましくは約１億細胞～約１３００億細胞（例、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞（又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）であり得る。
【0040】
細胞集団が投与される、本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物に対して自己である。
【0041】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防において使用するための、単離された細胞集団又は医薬組成物のいずれかを提供する。
【0042】
がんは、好都合には、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣性横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰部のがん、胆管がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭がん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、大網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん、膀胱がん、固形腫瘍及び液性腫瘍を含む任意の腫瘍であり得る。好ましくは、がんは上皮がんである。一実施形態においては、がんは、胆管がん、黒色腫、結腸がん、又は直腸がんである。
【0043】
本発明の方法において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、及びウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物が、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含むネコ目由来であることが好ましい。好ましくは、哺乳動物は、ウシ科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科の動物（ウマ）を含むウマ目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）由来である。好ましくは、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄｓ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄｓ）目（サル）又は、類人（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）目（ヒト及び類人猿）である。より好ましい哺乳動物は、ヒトである。特に好ましい実施形態においては、哺乳動物は、がん特異的突然変異を発現する患者である。
【0044】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、もちろん、決してその範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【0045】
実施例１～７に関して、材料及び方法を以下に示す。
【0046】
全エクソーム配列決定
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０：２２８－２３１（２０１０）に記載の通り、凍結保存した腫瘍組織（ＯＣＴに包埋）及び正常末梢血細胞の全エクソーム配列決定を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＰＧＤｘ、Ｂ
ａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）により行った。配列の、それぞれの塩基での、明確で質の高い平均読み取り数は、腫瘍及び正常の（ＰＢＭＣの）ＤＮＡについて、それぞれ１５５及び１６０であった。
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０：２２８－２３１（２０１０）に記載の通り、凍結保存した腫瘍組織（ＯＣＴに包埋）及び正常末梢血細胞の全エクソーム配列決定を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＰＧＤｘ、Ｂ
ａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）により行った。配列の、それぞれの塩基での、明確で質の高い平均読み取り数は、腫瘍及び正常の（ＰＢＭＣの）ＤＮＡについて、それぞれ１５５及び１６０であった。
【0047】
患者の治療及び養子細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の作製
患者３７３７を、制度審査委員会（ＩＲＢ）承認のプロトコル：「転移性消化管がんにおけるリンパ球枯渇療法後の、短期間培養自己腫瘍浸潤リンパ球を用いた第ＩＩ相試験（治験登録ＩＤ：ＮＣＴ０１１７４１２１）」に登録した。該プロトコルは、消化管がん患者における、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅した自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入の安全性と有効性を評価するために計画した。
患者３７３７を、制度審査委員会（ＩＲＢ）承認のプロトコル：「転移性消化管がんにおけるリンパ球枯渇療法後の、短期間培養自己腫瘍浸潤リンパ球を用いた第ＩＩ相試験（治験登録ＩＤ：ＮＣＴ０１１７４１２１）」に登録した。該プロトコルは、消化管がん患者における、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅した自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入の安全性と有効性を評価するために計画した。
【0048】
患者の最初の治療に用いるＴＩＬを、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：２８３－２９２（２０１２）に記載の通り作製した。簡潔に述べると、切除した腫瘍を、約１～２ｍｍの断片に細かく刻み、個々の断片を、高用量ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍｌ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含有する２ｍｌの完全培地（ＣＭ）を含有する、２４ウェルプレートのウェルに入れた。ＣＭは、当所（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）１０％ヒト血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩから成っていた。更に、混合腫瘍消化物も、高用量のＩＬ－２と共にＣＭ中で培養した。Ｔ細胞の初期増殖（２～３週の間）の後、選択培養物からの５×１０６のＴ細胞を、放射線照射した同種異系ＰＢＭＣを用いて、ガス透過性Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコ中で、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した４００ｍｌの５０／５０培地中で、１対１００の比で急速増幅した。５０／５０培地は、ＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との１対１の混合物で構成されていた。全細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。注入に先立ち、細胞数を２週間急速増幅させた。患者３７３７は、高用量ＩＬ－２の４回投与と合わせて、全部で４２４億のＴ細胞を受容するのに先立ち、シクロホスファミド及びフルダラビンで構成される非骨髄破壊性リンパ枯渇療法（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）を受けた。
【0049】
２回目の患者治療に用いたＴＩＬは、最初の治療と同様の方法で、以下の変更を伴って作製した。最初の治療用生成物（患者３７３７－ＴＩＬ）は、５の個別ＴＩＬ培養物の組み合わで構成された。これら５培養物を、ＣＤ４及びＶβ２２の発現及び突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰに対する反応性について個々に評価し、１の培養物が、Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞に非常に富んでいることが見出された。次いで、この１のＴＩＬ培養物（高用量ＩＬ－２による初期増殖後）を上記の通り急速増幅させた。患者は、高用量ＩＬ－２の４回投与と合わせて、全部で１２６０億のＴ細胞を受容するのに先立ち、最初の治療と同じ非骨髄破壊的リンパ枯渇療法を受けた。
【0050】
ＴＭＧコンストラクトの作製
簡潔に述べると、全エクソーム配列決定によって同定された各非同義置換突然変異について、対応するアミノ酸の変異（野生型タンパク質配列の１２アミノ酸が隣接する）をコードする、「ミニ遺伝子」コンストラクトを作製した。複数のミニ遺伝子を遺伝学的に融合させて、ＴＭＧコンストラクトを作製した。これらのミニ遺伝子コンストラクトは、コドンを最適化し、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）として合成した。次いで、ＴＭＧを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。部位特異的突然変異誘発を用いて、９つの「野生型復帰」ＴＭＧ－１コンストラクト（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を作製した。標準的サンガー配列決定（Ｍａｃｒｏ
ｇｅｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ）により、全ＴＭＧのヌクレオチド配列を確認した。
簡潔に述べると、全エクソーム配列決定によって同定された各非同義置換突然変異について、対応するアミノ酸の変異（野生型タンパク質配列の１２アミノ酸が隣接する）をコードする、「ミニ遺伝子」コンストラクトを作製した。複数のミニ遺伝子を遺伝学的に融合させて、ＴＭＧコンストラクトを作製した。これらのミニ遺伝子コンストラクトは、コドンを最適化し、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）として合成した。次いで、ＴＭＧを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。部位特異的突然変異誘発を用いて、９つの「野生型復帰」ＴＭＧ－１コンストラクト（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を作製した。標準的サンガー配列決定（Ｍａｃｒｏ
ｇｅｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ）により、全ＴＭＧのヌクレオチド配列を確認した。
【0051】
自己ＡＰＣの作製
単球由来の未成熟ＤＣを、プラスチック付着法を用いて作製した。簡潔に述べると、自己フェレーシス試料を融解し、洗浄し、純粋なＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５～１０×１０６細胞／ｍｌに設定し、次いで、適切なサイズの組織培養フラスコ中、約１×１０６細胞／ｃｍ２で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。９０分後、非接着細胞を回収し、フラスコをＡＩＭ－Ｖ培地でしっかり洗浄し、次いでＡＩＭ－Ｖ培地で更に６０分間インキュベーションした。次いで、フラスコをＡＩＭ－Ｖ培地で再びしっかり洗浄し、次いで、付着細胞をＤＣ培地でインキュベーションした。ＤＣ培地は、５％ヒト血清（当所で回収、処理）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、８００ＩＵ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ並びに８００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４を含有するＲＰＭＩで構成されていた（培地サプリメントはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、サイトカインはＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）。３日目に、新しいＤＣ培地を培養物に加えた。フレッシュな、又は凍結／融解したＤＣを、最初の刺激後５～７日目の実験に用いた。全実験において、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲ（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）の発現について細胞を表現型解析し、細胞が、主に未成熟ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６＋、及びＨＬＡ－ＤＲ＋；データは示さず）であることを確認した。
単球由来の未成熟ＤＣを、プラスチック付着法を用いて作製した。簡潔に述べると、自己フェレーシス試料を融解し、洗浄し、純粋なＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５～１０×１０６細胞／ｍｌに設定し、次いで、適切なサイズの組織培養フラスコ中、約１×１０６細胞／ｃｍ２で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。９０分後、非接着細胞を回収し、フラスコをＡＩＭ－Ｖ培地でしっかり洗浄し、次いでＡＩＭ－Ｖ培地で更に６０分間インキュベーションした。次いで、フラスコをＡＩＭ－Ｖ培地で再びしっかり洗浄し、次いで、付着細胞をＤＣ培地でインキュベーションした。ＤＣ培地は、５％ヒト血清（当所で回収、処理）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、８００ＩＵ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ並びに８００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４を含有するＲＰＭＩで構成されていた（培地サプリメントはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、サイトカインはＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）。３日目に、新しいＤＣ培地を培養物に加えた。フレッシュな、又は凍結／融解したＤＣを、最初の刺激後５～７日目の実験に用いた。全実験において、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲ（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）の発現について細胞を表現型解析し、細胞が、主に未成熟ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６＋、及びＨＬＡ－ＤＲ＋；データは示さず）であることを確認した。
【0052】
抗原提示Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ－４刺激法を用いて作製した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、自己フェレーシス試料から陽性のＢ細胞を選択した。次いで、ＣＤ１９＋細胞を、ＣＤ４０Ｌ（３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌ）を安定に発現する放射線照射（６０００ｒａｄ）３Ｔ３細胞と共に、Ｂ細胞培地中で約１：１の比で培養した。Ｂ細胞培地は、７．５～１０％のヒト血清（当所）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成されていた。３日目からフレッシュなＢ細胞培地を加え、その後２～３日ごとに培地を添加又は交換した。放射線照射３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞も必要に応じて更に添加した。抗原提示Ｂ細胞は、通常、最初の刺激後２～３週の実験において用いた。
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成されていた。３日目からフレッシュなＢ細胞培地を加え、その後２～３日ごとに培地を添加又は交換した。放射線照射３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞も必要に応じて更に添加した。抗原提示Ｂ細胞は、通常、最初の刺激後２～３週の実験において用いた。
【0053】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ）ＲＮＡの生成
タンデムミニ遺伝子をコードするプラスミドを、制限酵素ＳａｃＩＩで線状化した。ＧＦＰをコードする、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯベクターを、ＮｏｔＩで線状化した。制限消化を、ＥＤＴＡ、酢酸ナトリウム及びエタノール沈殿で終結させた。プラスミドの完全消化を、標準的なアガロースゲル電気泳動によって確認した。ｍｅｓｓａｇｅ ｍａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造業者による指示の通り、約１μｇの線状化プラスミドを、ＩＶＴ ＲＮＡの生成に用いた。ＬｉＣｌ２法を用いてＲＮＡを沈殿させ、ＲＮＡの純度及び濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて評価した。次いで、ＲＮＡをマイクロチューブに等分し、使用するまで－８０℃で保存した。
タンデムミニ遺伝子をコードするプラスミドを、制限酵素ＳａｃＩＩで線状化した。ＧＦＰをコードする、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯベクターを、ＮｏｔＩで線状化した。制限消化を、ＥＤＴＡ、酢酸ナトリウム及びエタノール沈殿で終結させた。プラスミドの完全消化を、標準的なアガロースゲル電気泳動によって確認した。ｍｅｓｓａｇｅ ｍａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造業者による指示の通り、約１μｇの線状化プラスミドを、ＩＶＴ ＲＮＡの生成に用いた。ＬｉＣｌ２法を用いてＲＮＡを沈殿させ、ＲＮＡの純度及び濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて評価した。次いで、ＲＮＡをマイクロチューブに等分し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0054】
ＲＮＡトランスフェクション
ＡＰＣ（ＤＣ又はＢ細胞）を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いでＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０～３０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
ＩＶＴ ＲＮＡ（４μｇ又は８μｇ）をギャップ２ｍｍのエレクトロポレーションキュベットの底に等分して入れ（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ）、５０μｌ又は１００μｌのＡＰＣをキュベットに直接加えた。従って、エレクトロポレーションで使用するＲＮＡ終濃度は８０μｇ／ｍｌであった。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ－８３０矩形波エレクトロポレーターを用いて行った。ＤＣは１５０Ｖ、１０ミリ秒、１パルスでエレクトロポレーションし、Ｂ細胞は１５０Ｖ、２０ミリ秒、１パルスでエレクトロポレーションした。これらの設定を用いたトランスフェクション効率は、ＧＦＰ ＲＮＡで評価したところ、決まって７０～９０％の間であった（データ示さず）。全工程を室温で行った。エレクトロポレーション後直ちに、細胞を、適切なサイトカインを添加したＤＣ培地又はＢ細胞培地を含有するポリプロピレンチューブに移した。トランスフェクションした細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１２～１４時間）インキュベーションした。共培養アッセイにおける使用に先立ち、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。
ＡＰＣ（ＤＣ又はＢ細胞）を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いでＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０～３０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
ＩＶＴ ＲＮＡ（４μｇ又は８μｇ）をギャップ２ｍｍのエレクトロポレーションキュベットの底に等分して入れ（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ）、５０μｌ又は１００μｌのＡＰＣをキュベットに直接加えた。従って、エレクトロポレーションで使用するＲＮＡ終濃度は８０μｇ／ｍｌであった。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ－８３０矩形波エレクトロポレーターを用いて行った。ＤＣは１５０Ｖ、１０ミリ秒、１パルスでエレクトロポレーションし、Ｂ細胞は１５０Ｖ、２０ミリ秒、１パルスでエレクトロポレーションした。これらの設定を用いたトランスフェクション効率は、ＧＦＰ ＲＮＡで評価したところ、決まって７０～９０％の間であった（データ示さず）。全工程を室温で行った。エレクトロポレーション後直ちに、細胞を、適切なサイトカインを添加したＤＣ培地又はＢ細胞培地を含有するポリプロピレンチューブに移した。トランスフェクションした細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１２～１４時間）インキュベーションした。共培養アッセイにおける使用に先立ち、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。
【0055】
ペプチドパルス
自己Ｂ細胞を回収し、洗浄し、次いで、ＩＬ－４を添加したＢ細胞培地に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、次いで、１μｇ／ｍｌの２５マーペプチドで、一晩（１２～１４時間）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩パルスした後、次いで、Ｂ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでＴ細胞培地に再懸濁し、直ちに共培養アッセイに用いた。用いたペプチドは：突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰ（
自己Ｂ細胞を回収し、洗浄し、次いで、ＩＬ－４を添加したＢ細胞培地に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、次いで、１μｇ／ｍｌの２５マーペプチドで、一晩（１２～１４時間）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩パルスした後、次いで、Ｂ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでＴ細胞培地に再懸濁し、直ちに共培養アッセイに用いた。用いたペプチドは：突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰ（
【0056】
【化1】
【0057】
（配列番号７３））；野生型ＥＲＢＢ２ＩＰ（
【0058】
【化2】
【0059】
（配列番号４５））；ネガティブコントロールとして、突然変異ＡＬＫ（ＲＶＬＫＧＧＳＶＲＫＬＲＨＡＫＱＬＶＬＥＬＧＥＥＡ（配列番号４６））であった。突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドは異なる３ソース（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，Ｐｅｐｔｉｄｅ ２．０，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ及びＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸ）から購入し、全て同じｉｎ ｖｉｔｒｏの結果をもたらした。一方、野生型ＥＲＢＢ２ＩＰペプチド及び突然変異ＡＬＫペプチドはＰｅｐｔｉｄｅ ２．０から購入した。同種異系ＥＢＶ－Ｂ細胞を培養するためには、Ｂ細胞培地の代わりに、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ）並びに２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地を用いた。
【0060】
Ｔ細胞の選別、増幅、及びクローニング
細胞選別を必要とする全実験において、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ及びＢＤ ＦＡＣＳＪａｚｚを用いた。表示した実験においては、選別したＴ細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する５０／５０培地中の過剰放射線照射（４０００ｒａｄ）同種異系フィーダー細胞（ドナーが異なる３種類の白血球除去輸血サンプルのプール）を用いて増幅した。限界希釈クローニングを、９６ウェル丸底プレート中で、１ウェルあたり５ｅ４フィーダー細胞及び１ウェルあたり１～
２Ｔ細胞で、上記の刺激条件を用いて行った。培地を、刺激後約１週間から始めて、その後一日おきに、又は必要に応じて、交換した。細胞は、通常、最初の刺激の約２～３週後に、アッセイにおいて用いるか、又は更に増幅させた。
細胞選別を必要とする全実験において、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ及びＢＤ ＦＡＣＳＪａｚｚを用いた。表示した実験においては、選別したＴ細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する５０／５０培地中の過剰放射線照射（４０００ｒａｄ）同種異系フィーダー細胞（ドナーが異なる３種類の白血球除去輸血サンプルのプール）を用いて増幅した。限界希釈クローニングを、９６ウェル丸底プレート中で、１ウェルあたり５ｅ４フィーダー細胞及び１ウェルあたり１～
２Ｔ細胞で、上記の刺激条件を用いて行った。培地を、刺激後約１週間から始めて、その後一日おきに、又は必要に応じて、交換した。細胞は、通常、最初の刺激の約２～３週後に、アッセイにおいて用いるか、又は更に増幅させた。
【0061】
共培養アッセイ：ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡ、細胞表面活性化マーカーについてのフローサイトメトリー、及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
ＡＰＣとしてＤＣを使用する場合、９６ウェル平底又は丸底のプレート１ウェル当たり、約３．５×１０４～７×１０４のＤＣを用いた。ＡＰＣとしてＢ細胞を使用する場合、９６ウェル丸底プレート１ウェル当たり、約２×１０５の細胞を用いた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいては、１ウェルあたり１×１０３～１×１０４のエフェクターＴ細胞を用い、フローサイトメトリーアッセイにおいては、１ウェルあたり１×１０５のエフェクターＴ細胞を用いた。Ｔ細胞は、通常解凍し、ＩＬ－２を含有する５０／５０培地（３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２）中に２日間静置（ｒｅｓｔ）し、次いで、共培養アッセイに先立ち、ＰＢＳで（３回）洗浄した。共培養は、すべて、外的に添加されたサイトカインの非存在下で行った。すべてのアッセイについて、ポジティブコントロールとして、プレート結合ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）を用いた。
ＡＰＣとしてＤＣを使用する場合、９６ウェル平底又は丸底のプレート１ウェル当たり、約３．５×１０４～７×１０４のＤＣを用いた。ＡＰＣとしてＢ細胞を使用する場合、９６ウェル丸底プレート１ウェル当たり、約２×１０５の細胞を用いた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいては、１ウェルあたり１×１０３～１×１０４のエフェクターＴ細胞を用い、フローサイトメトリーアッセイにおいては、１ウェルあたり１×１０５のエフェクターＴ細胞を用いた。Ｔ細胞は、通常解凍し、ＩＬ－２を含有する５０／５０培地（３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２）中に２日間静置（ｒｅｓｔ）し、次いで、共培養アッセイに先立ち、ＰＢＳで（３回）洗浄した。共培養は、すべて、外的に添加されたサイトカインの非存在下で行った。すべてのアッセイについて、ポジティブコントロールとして、プレート結合ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）を用いた。
【0062】
ＨＬＡ遮断抗体を含む実験においては、以下の抗体を用いた：汎クラスＩＩ（クローン：ＩＶＡ１２）、汎クラスＩ（クローン：Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－ＤＲ（クローン：ＨＢ５５）、ＨＬＡ－ＤＰ（クローン：Ｂ７／２１）、及びＨＬＡ－ＤＱ（クローン：ＳＰＶ－Ｌ３）。Ｔ細胞との共培養に先立ち、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１～２時間、表示した抗体２０～５０μｇ／ｍｌでブロッキングした。Ｔ４は、チロシナーゼ中のエピトープに対して反応性である、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ＴＣＲで形質導入したＴ細胞である。ＤＭＦ５は、ＭＡＲＴ－１に対して反応性のＨＬＡ－Ａ２拘束性Ｔ細胞株である。６２４－ＣＩＩＴＡは、ＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ、ＭＨＣ、トランスアクチベーター）の異所的発現によりＭＨＣ－ＩＩを安定に発現する、ＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－ＤＲ４陽性黒色腫細胞株であり、ＭＡＲＴ－１及びチロシナーゼの発現について陽性である。
【0063】
ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに関しては、簡潔に述べると、ＥＬＩＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＩＰＳＷＵ）を１ウェルあたり５０μｌの７０％エタノールで２分間前処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５０μｌの１０μｇ／ｍｌ ＩＦＮ－γ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、クローン：１－Ｄ１Ｋ）でコーティングし、冷蔵庫中で一晩インキュベーションした。ＯＫＴ３コントロールについては、ウェルを、ＩＦＮ－γ捕捉抗体（１０μｇ／ｍｌ）及びＯＫＴ３（１μｇ／ｍｌ）の混合物でコーティングした。共培養に先立ち、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、続いて、５０／５０培地で、室温（ＲＴ）で少なくとも１時間、ブロッキングした。２０～２４時間共培養後、プレートをはじいて細胞を取り出し（ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｌｉｃｋｅｄ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅ）、ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）添加）で６回洗浄し、次いで、室温で２時間、１００μｌ／ウェルの、０．２２μｍで濾過した１μｇ／ｍｌビオチン化抗ヒトＩＦＮ－γ検出抗体溶液（Ｍａｂｔｅｃｈ，クローン：７－Ｂ６－１）でインキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン－ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｃｉｎｃｉｎａｔｔｉ、ＯＨ、１：３０００に希釈）で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳで６回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルの、０．４５μｍで濾過したＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）で発色させた。冷水道水で十分にすすぐことにより反応を停止させた。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔプレートリーダー及び関連ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を用いてスキャンし、計数した。
【0064】
Ｔ細胞活性化マーカーＯＸ４０及び４－１ＢＢの発現を、フローサイトメトリーにより
、刺激後約ｔ＝２２～２６時間で評価した。簡潔に述べると、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した１×ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、暗所中４℃で約３０分間、適切な抗体で染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターでの取得に先立ち、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で少なくとも１回洗浄した。データは、すべて、生きている単細胞（ＰＩ陰性）にゲートした。
、刺激後約ｔ＝２２～２６時間で評価した。簡潔に述べると、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した１×ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、暗所中４℃で約３０分間、適切な抗体で染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターでの取得に先立ち、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で少なくとも１回洗浄した。データは、すべて、生きている単細胞（ＰＩ陰性）にゲートした。
【0065】
サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーを用いて評価した。簡潔に述べると、標的細胞及びエフェクター細胞を、９６ウェルプレートのウェル中に混合した後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及びＧｏｌｇｉＰｌｕｇの両方を培養物に添加した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及びＧｏｌｇｉＰｌｕｇは、製造業者が推奨する濃度の１／２で用いた。刺激のｔ＝６時間後に、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示書に従って細胞を処理した。簡潔に述べると、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで細胞表面マーカー（上記）について染色した。次いで、固定及び透過処理に先立ち、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で洗浄し、暗所中４℃で３０分間、サイトカインに対する抗体で染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターでの取得に先立って、細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータは、すべて、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ
Ｉｎｃ）を用いて解析した。
Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【0066】
ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて、血清試料中のＩＦＮ－γを、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の指示通りに検出した。
【0067】
フローサイトメトリー抗体
力価を測定した、以下の抗ヒト抗体を細胞表面染色に用いた：ＣＣＲ７－ＦＩＴＣ（クローン：１５０５０３）、ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＵＣＨＬ１）、ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（クローン：ＤＲＥＧ－５６）、ＣＤ２７－ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：Ｍ－Ｔ２７１）、ＣＤ４－ｅｆｌｕｏｒ ６０５ＮＣ（クローン：ＯＫＴ４）、ＣＤ５７－ＦＩＴＣ（クローン：ＮＫ－１）、ＣＤ２８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＣＤ２８．２）、ＣＤ１２７－ＡＰＣ（クローン：ｅＢｉｏＲＤＲ５）、ＣＤ３－ＡＦ７００（クローン：ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：ＳＫ３）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＳＫ１）、Ｖβ２２－ＰＥ（クローン：ＩＭＭＵ ５４６）、Ｖβ５．２－ＰＥ（クローン：３６２１３）、ＯＸ４０－ＰＥ－Ｃｙ７又はＦＩＴＣ（クローン：Ｂｅｒ－ＡＣＴ３５）、４－１ＢＢ－ＡＰＣ（クローン：４Ｂ４－１）、及びＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：Ｈ４Ａ３）。ＣＤ４－ｅｆｌｕｏｒ６０５ＮＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖβ２２－ＰＥ及びＶβ５．２－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）並びに４－１ＢＢ－ＡＰＣ及びＯＸ４０－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を除いて、抗体はすべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であった。細胞内サイトカイン染色のために、適切に力価測定した、以下：ＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣ（クローン：４Ｓ．Ｂ３）、ＩＬ－２－ＡＰＣ（クローン：ＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＴＮＦ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５又はＡＰＣ（クローン：ＭＡｂ１１）、ＩＬ－１７－ＰＥ（クローン：ｅＢｉｏ６４ＤＥＣ１７）、及びＩＬ－４－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：８Ｄ４－８）の抗ヒト抗体を用いた。ＩＬ－４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外のＩＣＳ抗体は、すべて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来であった。ＩＯ Ｍａｒｋ Β Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖ ｋｉｔを用いて、ＴＣＲ－Ｖβのレパートリーを評価した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
力価を測定した、以下の抗ヒト抗体を細胞表面染色に用いた：ＣＣＲ７－ＦＩＴＣ（クローン：１５０５０３）、ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＵＣＨＬ１）、ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（クローン：ＤＲＥＧ－５６）、ＣＤ２７－ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：Ｍ－Ｔ２７１）、ＣＤ４－ｅｆｌｕｏｒ ６０５ＮＣ（クローン：ＯＫＴ４）、ＣＤ５７－ＦＩＴＣ（クローン：ＮＫ－１）、ＣＤ２８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＣＤ２８．２）、ＣＤ１２７－ＡＰＣ（クローン：ｅＢｉｏＲＤＲ５）、ＣＤ３－ＡＦ７００（クローン：ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：ＳＫ３）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＳＫ１）、Ｖβ２２－ＰＥ（クローン：ＩＭＭＵ ５４６）、Ｖβ５．２－ＰＥ（クローン：３６２１３）、ＯＸ４０－ＰＥ－Ｃｙ７又はＦＩＴＣ（クローン：Ｂｅｒ－ＡＣＴ３５）、４－１ＢＢ－ＡＰＣ（クローン：４Ｂ４－１）、及びＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：Ｈ４Ａ３）。ＣＤ４－ｅｆｌｕｏｒ６０５ＮＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖβ２２－ＰＥ及びＶβ５．２－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）並びに４－１ＢＢ－ＡＰＣ及びＯＸ４０－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を除いて、抗体はすべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であった。細胞内サイトカイン染色のために、適切に力価測定した、以下：ＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣ（クローン：４Ｓ．Ｂ３）、ＩＬ－２－ＡＰＣ（クローン：ＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＴＮＦ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５又はＡＰＣ（クローン：ＭＡｂ１１）、ＩＬ－１７－ＰＥ（クローン：ｅＢｉｏ６４ＤＥＣ１７）、及びＩＬ－４－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：８Ｄ４－８）の抗ヒト抗体を用いた。ＩＬ－４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外のＩＣＳ抗体は、すべて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来であった。ＩＯ Ｍａｒｋ Β Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖ ｋｉｔを用いて、ＴＣＲ－Ｖβのレパートリーを評価した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【0068】
ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異の配列決定
サンガー配列決定を用いて、全エクソーム配列決定によって見出されたＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異を検証した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、スナップ凍結したＴ細胞又は腫瘍組織（ＯＣＴブロック）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いで、正常ｃＤＮＡ及び腫瘍ｃＤＮＡを、突然変異に隣接する以下のＥＲＢＢ２ＩＰプライマー：ＥＲＢＢ２ＩＰ Ｓｅｑ Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧ－３’（配列番号４７）及びＥＲＢＢ２ＩＰ Ｓｅｑ Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＧ－３’（配列番号４８）を用いたＰＣＲにおいて、鋳型として用いた。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、推奨される３ステッププロトコル（５８℃のアニーリング温度（１５秒）及び７２℃の伸長（３０秒）を伴う）で用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＰＣＲ産物を単離した。同一のＰＣＲプライマー（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を用いて、産物を直接配列決定した。
サンガー配列決定を用いて、全エクソーム配列決定によって見出されたＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異を検証した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、スナップ凍結したＴ細胞又は腫瘍組織（ＯＣＴブロック）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いで、正常ｃＤＮＡ及び腫瘍ｃＤＮＡを、突然変異に隣接する以下のＥＲＢＢ２ＩＰプライマー：ＥＲＢＢ２ＩＰ Ｓｅｑ Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧ－３’（配列番号４７）及びＥＲＢＢ２ＩＰ Ｓｅｑ Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＧ－３’（配列番号４８）を用いたＰＣＲにおいて、鋳型として用いた。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、推奨される３ステッププロトコル（５８℃のアニーリング温度（１５秒）及び７２℃の伸長（３０秒）を伴う）で用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＰＣＲ産物を単離した。同一のＰＣＲプライマー（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を用いて、産物を直接配列決定した。
【0069】
定量的ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、スナップ凍結したＴ細胞又は腫瘍組織（ＯＣＴブロック）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、全ＲＮＡを、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプライマー並びに、ヒトβ－アクチン（カタログ番号：４０１８４６）及びＥＲＢＢ２ＩＰ（カタログ番号：４３３１１８２）に対するプローブセットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。定量的ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機を用い、ＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）を用いて行った。標準的なアガロースゲル電気泳動により、増幅産物の特異性を確認した。算出された閾値サイクル（Ｃｔ）はすべて３０以下であった。
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、スナップ凍結したＴ細胞又は腫瘍組織（ＯＣＴブロック）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、全ＲＮＡを、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプライマー並びに、ヒトβ－アクチン（カタログ番号：４０１８４６）及びＥＲＢＢ２ＩＰ（カタログ番号：４３３１１８２）に対するプローブセットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。定量的ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機を用い、ＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）を用いて行った。標準的なアガロースゲル電気泳動により、増幅産物の特異性を確認した。算出された閾値サイクル（Ｃｔ）はすべて３０以下であった。
【0070】
ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシング
ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、末梢血、Ｔ細胞及び凍結した腫瘍組織から単離したゲノムＤＮＡに対して、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ，Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）により、ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシングを行った。サンプル当たりの、実益性のある（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）ＴＣＲの読み取り総数は、２７９，４８２～９３４，６７２の範囲であった。ＴＣＲ頻度の算出においては、ＴＣＲの、実益性のある再配列のみを用いた。
ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、末梢血、Ｔ細胞及び凍結した腫瘍組織から単離したゲノムＤＮＡに対して、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ，Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）により、ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシングを行った。サンプル当たりの、実益性のある（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）ＴＣＲの読み取り総数は、２７９，４８２～９３４，６７２の範囲であった。ＴＣＲ頻度の算出においては、ＴＣＲの、実益性のある再配列のみを用いた。
【0071】
ＴＣＲ配列決定及びＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性ＴＣＲの構築
Ｔ細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。次いで、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常プライマーを用いて、全ＲＮＡで、製造業者（ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による指示通りに、５’ＲＡＣＥを行った。キットのプログラム１を、伸長時間を変更（３分ではなく２分）して、ＰＣＲに用いた。α鎖及びβ鎖定常プライマーの配列は、ＴＣＲ－α、５’－ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＡＧＴ ＣＣ－３’（配列番号４９）；ＴＣＲ－β、５’－ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＡＧ－３（配列番号５０）である。次いで、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＴＣＲのＰＣＲ産物を単離した。その後、産物は直接配列決定したか、又はＴＯＰＯ－ＴＡクローニングした後、個々のコロニーの配列決定を行った（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。既知のＶβ２２＋Ｔ細胞クローンの配列決定のために、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（
Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。次いで、これらのｃＤＮＡを、ＴＣＲ－β定常プライマー（上記）及びＶβ２２特異的プライマー：５’－ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＣＧＴ ＡＴＧ Ｃ－３’（配列番号５１）を用いるＰＣＲにおいて鋳型として用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＰＣＲ産物を単離した。ＴＣＲ－β定常鎖のネステッドプライマー：５’－ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ－３’（配列番号５２）を用いて、産物を直接配列決定した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。
Ｔ細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。次いで、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常プライマーを用いて、全ＲＮＡで、製造業者（ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による指示通りに、５’ＲＡＣＥを行った。キットのプログラム１を、伸長時間を変更（３分ではなく２分）して、ＰＣＲに用いた。α鎖及びβ鎖定常プライマーの配列は、ＴＣＲ－α、５’－ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＡＧＴ ＣＣ－３’（配列番号４９）；ＴＣＲ－β、５’－ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＡＧ－３（配列番号５０）である。次いで、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＴＣＲのＰＣＲ産物を単離した。その後、産物は直接配列決定したか、又はＴＯＰＯ－ＴＡクローニングした後、個々のコロニーの配列決定を行った（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。既知のＶβ２２＋Ｔ細胞クローンの配列決定のために、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（
Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。次いで、これらのｃＤＮＡを、ＴＣＲ－β定常プライマー（上記）及びＶβ２２特異的プライマー：５’－ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＣＧＴ ＡＴＧ Ｃ－３’（配列番号５１）を用いるＰＣＲにおいて鋳型として用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＰＣＲ産物を単離した。ＴＣＲ－β定常鎖のネステッドプライマー：５’－ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ－３’（配列番号５２）を用いて、産物を直接配列決定した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。
【0072】
Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ－突然変異ＴＣＲの構築は、Ｖβ２２＋ＴＣＲ－αのＶ－Ｄ－Ｊ領域を、マウスＴＣＲ－α定常鎖に、及びＶβ２２＋ＴＣＲ－β－Ｖ－Ｄ－Ｊ領域を、マウスＴＣＲ－β定常鎖に融合させることにより行った。α及びβ鎖は、フリンＳＧＳＧ Ｐ２Ａリンカー（ｆｕｒｉｎ ＳＧＳＧ Ｐ２Ａ ｌｉｎｋｅｒ）によって隔てた。マウスＴＣＲ定常領域の使用により、導入ＴＣＲの対形成が促進され、フローサイトメトリーによる、マウスＴＣＲ－β鎖に特異的な抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた、確かに形質導入されたＴ細胞の同定が容易になる。ＴＣＲコンストラクトを合成し、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクター（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ）にクローニングした。
【0073】
末梢血Ｔ細胞のＴＣＲ形質導入
自己フェレーシス試料を解凍し、５％の当所ヒト血清、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）並びに２ｍＭ Ｌ－グルタミン（いずれもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）を添加した、ＲＰＭＩ及びＡＩＭ－Ｖ培地の５０／５０混合物からなるＴ細胞培地中、２×１０６細胞／ｍｌに設定した。２×１０６細胞（１ｍｌ）を、レトロウイルスによる形質導入前の２日間、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＯＫＴ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び３００ＩＵ／ｍｌ ｒｈｕ ＩＬ－２（Ｃｈｉｒｏｎ）を含む２４ウェルプレート中で刺激した。一過性レトロウイルス上清を生成するために、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｖβ２２陽性ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターＭＳＧＶ１（１．５μｇ／ウェル）及びエンベロープをコードするプラスミドＲＤ１１４（０．７５μｇ／ウェル）を、レトロウイルスパッケージング細胞株２９３ＧＰ（６ウェルのポリ－Ｄ－リジンコーティングプレート１ウェル当たり１×１０６細胞、トランスフェクションの前日にプレーティング）に共トランスフェクションした。トランスフェクション後４２～４８時間で、レトロウイルス上清を回収し、ＤＭＥＭ培地で１：１に希釈し、レトロネクチンでコーティングした（１０μｇ／ｍｌ，Ｔａｋａｒａ）非組織培養処理６ウェルプレートに向けて、３２℃で２時間、２，０００ｇで遠心分離した。次いで、活性化Ｔ細胞（ウェル当たり２×１０６、ＩＬ－２を含有するＴ細胞培地中０．５×１０６細胞／ｍｌ）を、レトロウイルスプレートへ、３００ｇで１０分間スピンした。活性化Ｔ細胞を、一晩形質導入し、プレートから取り出し、ＩＬ－２を含有するＴ細胞培地中で更に培養した。ＧＦＰ及びモックの形質導入コントロールを、形質導入実験に含めた。細胞は、通常、レトロウイルス形質導入の１０～１４日後にアッセイした。
自己フェレーシス試料を解凍し、５％の当所ヒト血清、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）並びに２ｍＭ Ｌ－グルタミン（いずれもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）を添加した、ＲＰＭＩ及びＡＩＭ－Ｖ培地の５０／５０混合物からなるＴ細胞培地中、２×１０６細胞／ｍｌに設定した。２×１０６細胞（１ｍｌ）を、レトロウイルスによる形質導入前の２日間、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＯＫＴ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び３００ＩＵ／ｍｌ ｒｈｕ ＩＬ－２（Ｃｈｉｒｏｎ）を含む２４ウェルプレート中で刺激した。一過性レトロウイルス上清を生成するために、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｖβ２２陽性ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターＭＳＧＶ１（１．５μｇ／ウェル）及びエンベロープをコードするプラスミドＲＤ１１４（０．７５μｇ／ウェル）を、レトロウイルスパッケージング細胞株２９３ＧＰ（６ウェルのポリ－Ｄ－リジンコーティングプレート１ウェル当たり１×１０６細胞、トランスフェクションの前日にプレーティング）に共トランスフェクションした。トランスフェクション後４２～４８時間で、レトロウイルス上清を回収し、ＤＭＥＭ培地で１：１に希釈し、レトロネクチンでコーティングした（１０μｇ／ｍｌ，Ｔａｋａｒａ）非組織培養処理６ウェルプレートに向けて、３２℃で２時間、２，０００ｇで遠心分離した。次いで、活性化Ｔ細胞（ウェル当たり２×１０６、ＩＬ－２を含有するＴ細胞培地中０．５×１０６細胞／ｍｌ）を、レトロウイルスプレートへ、３００ｇで１０分間スピンした。活性化Ｔ細胞を、一晩形質導入し、プレートから取り出し、ＩＬ－２を含有するＴ細胞培地中で更に培養した。ＧＦＰ及びモックの形質導入コントロールを、形質導入実験に含めた。細胞は、通常、レトロウイルス形質導入の１０～１４日後にアッセイした。
【0074】
実施例１
本実施例は、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定する方法を実例で示す。
本実施例は、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定する方法を実例で示す。
【0075】
複数の化学療法レジメンを通して進行した広範転移性胆管がんを伴った、４３歳の女性（患者（Ｐｔ．）３７３７）を、消化管（ＧＩ）がん患者のための、ＴＩＬベースの養子
細胞療法（ＡＣＴ）プロトコルに登録した。患者３７３７の臨床的特徴を表１に示す。
細胞療法（ＡＣＴ）プロトコルに登録した。患者３７３７の臨床的特徴を表１に示す。
【0076】
【表1】
【0077】
肺転移を切除し、全エクソーム配列決定用及び治療用Ｔ細胞作製用のソースとして用いた。表２は、患者３７３７からの転移性肺結節の全エクソーム配列決定によって同定された体細胞突然変異を示す。腫瘍結節は、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色切片の病理学的解析により、約７０％が腫瘍であると推定された。全エクソーム配列決定により、２６の非同義突然変異が明らかになった（表２）。
【0078】
【表2-1】
【0079】
【表2-2】
【0080】
実施例２
本実施例は、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導する方法；患者の自己Ｔ細胞集団と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養する方法；及び（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択する方法を実例で示す。
本実施例は、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導する方法；患者の自己Ｔ細胞集団と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養する方法；及び（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択する方法を実例で示す。
【0081】
実施例１で同定された各突然変異について、内因性タンパク質由来の１２アミノ酸が各側に隣接する、突然変異アミノ酸をコードするミニ遺伝子コンストラクトを設計した。複数のミニ遺伝子をタンデムで合成し、タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトを作製した（表３）。表３において、下線は、点突然変異又はヌクレオチドの挿入若しくは欠失によってコードされる突然変異アミノ酸及び新規配列を示す。スプライス部位ドナー突然変異（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｉｔｅ ｄｏｎｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＨＬＡ－ＤＯＡ及びＬＯＮＲＦ３）については、その部位で突然変異がスプライシングを妨げるという仮定に基づいて、下流のイントロンに入って次の終止コドンまで続く突然変異ミニ遺伝子転写産物を設計した。ＤＩＰ２Ｃにおけるスプライス部位アクセプター突然変異（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｉｔｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は評価しなかった。
【0082】
【表3】
【0083】
次いで、ＴＭＧコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡの生成用の鋳型として用いた。次いで、これらのＩＶＴ ＴＭＧ ＲＮＡの各々を、自己ＡＰＣ（ＤＣ）に個別にトランスフェクションし、続いてＴＩＬとの共培養を行い、処理され、提示された突然変異抗原のいずれがＴＩＬによって認識されたかを決定した。３７３７－ＴＩＬは、ＴＭＧ－１に存在するが、ＴＭＧ－２やＴＭＧ－３には存在しない突然変異抗原に対して反応性であることが観察された（図１Ａ）。更に、活性化マーカーＯＸ４０及び４－１ＢＢの上方制御により実証される通り（表４Ａ及び４Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において反応性が優勢であった。表４Ａ及び４Ｂは、非特異的刺激剤ＯＫＴ３と共に培養した
ＤＣ、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＲＮＡ若しくは、全エクソーム配列決定によって同定された種々の突然変異をコードする、表示したタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトをトランスフェクションしたＤＣとの共培養後に、フローサイトメトリーによる検出で、表示した表現型を有するとされた３７３７－ＴＩＬのパーセンテージを示す。モックトランスフェクションした細胞は、核酸の添加なしで、トランスフェクション試薬のみで処理した。データを、生きているＣＤ３＋細胞にゲートした。
ＤＣ、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＲＮＡ若しくは、全エクソーム配列決定によって同定された種々の突然変異をコードする、表示したタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトをトランスフェクションしたＤＣとの共培養後に、フローサイトメトリーによる検出で、表示した表現型を有するとされた３７３７－ＴＩＬのパーセンテージを示す。モックトランスフェクションした細胞は、核酸の添加なしで、トランスフェクション試薬のみで処理した。データを、生きているＣＤ３＋細胞にゲートした。
【0084】
【表4】
【0085】
【表5】
【0086】
ＣＤ４陰性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞集団で、いくらかの４－１ＢＢ上方制御が観察されたが、これらの細胞は、選別されるも、ＴＭＧに対する反応性は見出されなかった。ＴＭＧ－１における９突然変異のうち、いずれが３７３７－ＴＩＬによって認識されていたかを決定するために、それぞれが、野生型配列へ復帰させた突然変異のうちの１つを含有する、ＴＭＧ－１の更なる９コンストラクトを合成した。ＥＲＢＢ２相互作用タンパク質（ＥＲＢＢ２ＩＰ）突然変異が野生型配列に復帰した場合にのみ、３７３７－ＴＩＬのＴＭＧ－１への反応性が消滅し、ＴＩＬが、ＥＲＢＢ２ＩＰＥ８０５Ｇ突然変異を特異的に認識することが示された（図１Ｂ）。
【0087】
ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞応答を、分子的に特性解析した。ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、２０時間目に結果を測定した。患者３７３７－ＴＩＬと、何も添加しないでか、又は表示した（ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、又はＨＬＡ－ＤＲに対する）ＨＬＡ遮断抗体を添加してプレインキュベーションした、ＴＭＧ－１をトランスフェクションしたＤＣとを共培養した（図２Ａ）。抗体ブロッキングに対するコントロールとして、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＭＡＲＴ反応性Ｔ細胞ＤＭＦ５（図２Ｂ）及びＨＬＡ－ＤＲ拘束性チロシナーゼ反応性Ｔ細胞Ｔ４（図２Ｃ）と、何も添加しないでか、又は表示されたＨＬＡ遮断抗体を添加してプレインキュベーションした、ＭＡＲＴ及びチロシナーゼ陽性６２４－ＣＩＩＴＡ黒色腫細胞株とを共培養した。３７３７－ＴＩＬの応答は、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体によって遮断された（図２Ａ）。
【0088】
別のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、２０時間目に結果を測定した。患者３７３７－ＴＩＬと、ＤＭＳＯ、突然変異（ｍｕｔ）ＡＬＫ又は突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした、自己Ｂ細胞又はＨＬＡ－ＤＱ遺伝子座が一部適合する、同種異系ＥＢＶ－Ｂ細胞とを共培養した（図２Ｄ）。
【0089】
別のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、２０時間目で結果を測定した。患者３７３７－ＴＩＬと、ｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰ ２５アミノ酸ペプチド又は表示した切断型ｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを共培養した（図２Ｅ）。
【0090】
図２Ａ～２Ｅに示す通り、３７３７－ＴＩＬの応答はＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１対立遺伝子拘束性であり、最小エピトープは１３アミノ酸配列、ＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮ（配列番号２９）内に位置した。
【0091】
実施例３
本実施例は、実施例２で同定したＥＲＢＢ２ＩＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ－Ｖβ２２鎖で（そのα鎖と対応させて）遺伝的に改変した自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｐｅｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）が、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドに対する特異的反応性を付与したことを示す。
本実施例は、実施例２で同定したＥＲＢＢ２ＩＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ－Ｖβ２２鎖で（そのα鎖と対応させて）遺伝的に改変した自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｐｅｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）が、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドに対する特異的反応性を付与したことを示す。
【0092】
活性化マーカーとしてＯＸ４０を用い、実施例２で同定した、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のクローン性を、それらを抗原特異的活性化後に選別することにより特性解析した。次いで、これらの細胞を、バルクで増幅し、限界希釈によりクローニングした。フローサイトメトリーに基づく、ＴＣＲ－Ｖβレパートリーの調査により、バルク増幅集団の＞９５％がＶβ２２＋であり、評価したクローンの１０／１１が、純粋にＶβ２２＋であることが実証された。ＴＣＲ配列解析により、試験したＶβ２２＋クローンの６／６において、ＴＣＲβＶ－Ｄ－Ｊ配列が同一なことを明らかにし（表５）、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞の大部分が、支配的なＶβ２２＋Ｔ細胞クローンから構成されることが示された。
【0093】
【表6】
【0094】
このＶβ２２ ＴＣＲを発現するＴ細胞クローンは、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドによる刺激に際して、サイトカインＩＦＮ－γを特異的に産生した（表６）。ＣＤ４＋Ｖβ２２＋クローンと、ＯＫＴ３又は野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異（ｍｕｔ）ＡＬＫ、若しくはｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。表６は、フローサイトメトリーによって測定した、共培養後に細胞内ＩＦＮ－γを産生する（ＩＦＮ－γ＋）か、又は細胞内ＩＦＮ－γを産生しない（ＩＦＮ－γ－）、ＣＤ４＋でＶβ２２＋及びＶβ２２－のクローンのパーセンテージを示す。データは、同一のＴＣＲ－Ｖβ配列を共に有する２クローンのうちの代表例である。
【0095】
【表7】
【0096】
更に、このＴＣＲ－Ｖβ２２鎖を、そのα鎖（表７）と対応させて遺伝学的に改変した自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞は、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチド（表８Ａ及び８Ｂ）に対する特異的反応性を付与した。このことは、このＴＣＲが、ＥＲＢＢ２ＩＰＥ８０５Ｇ突然変異を特異的に認識することを実証した。自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞を、Ｖβ２２＋クローン由来のＴＣＲで形質導入（Ｔｄ）し（表８Ａ）、又は核酸の添加なしで形質導入試薬のみで処理し（Ｍｏｃｋ）（表８Ｂ）、次いで、反応性に関して、表６に記載の通り評価した。内因性Ｖβ２２＋ＴＣＲ定常領域を、マウス定常領域と交換し、マウスＴＣＲβ定常領域（ｍＴＣＲβ）に対する抗体を用いた導入ＴＣＲの検出を可能にした。全てのアッセイにおいて、プレート結合ＯＫＴ３をコントロールとして用いた。表８Ａ及び８Ｂは、フローサイトメトリーによって測定される、細胞内ＩＦＮ－γを産生する（ＩＦＮ－γ＋）か、又は細胞内ＩＦＮ－γを産生しない（ＩＦＮ－γ－）、ｍＴＣＲβ＋及びｍＴＣＲβ－の細胞のパーセンテージを示す。
【0097】
【表8】
【0098】
【表9】
【0099】
【表10】
【0100】
実施例４
本実施例は、実施例２で同定した自己細胞を用いて、がんを治療する方法を実例で示す。
本実施例は、実施例２で同定した自己細胞を用いて、がんを治療する方法を実例で示す。
【0101】
患者３７３７は、ＣＤ４＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞を含有する４２４億のＴＩＬを養子移入後、Ｔ細胞の増殖及び機能を増強するために、ＩＬ－２の投与を４回受けた。患者３７３７は、治療のために肺病変の切除を受けた。次いで、腫瘍を小断片に細かく切り、高用量のＩＬ－２でインキュベーションして、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増幅した。ＩＬ－２中での、最初の細胞数の増幅後、選択したＴＩＬ培養物の数を、放射線照射同種異系末梢血フィーダー細胞、ＯＫＴ３及びＩＬ－２を含む急速増幅プロトコル（ＲＥＰ）を用いて、更に２週間増幅した。細胞注入に先立ち、患者を、シクロホスファミド（ＣＴＸ：６０ｍｇ／ｋｇ，１日１回２日間）、続いてフルダラビン（Ｆｌｕ：２５ｍｇ／ｍ２、５日間）でプレコンディショニングした。患者３７３７－ＴＩＬは、１００億（２５％）超のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞を含有する４２４億のＴＩＬを含み、０日目に投与し、続いてＩＬ－２（アルデスロイキン，７．２ｅ５ＩＵ／ｋｇ）を８時間ごとに投与した。患者はＩＬ－２の投与を合計４回受けた。
【0102】
３７３７－ＴＩＬと、ＴＭＧ－１又は野生型（ｗｔ）復帰ＥＲＢＢ２ＩＰをコードするＴＭＧ－１をトランスフェクションしたＤＣとを共培養し、フローサイトメトリーを用いて、刺激後２４時間で、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０及びＶβ２２の発現を評価した。プレート結合ＯＫＴ３の刺激をポジティブコントロールとして用いた。フローサイトメトリー解析により、投与した３７３７－ＴＩＬ産物全体の約２５％が、Ｖβ２２＋突然変異反応性Ｔ細胞で構成され（図３Ａ、表９）、１００億超のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の注入に等しいことが実証された。表９は、フローサイトメトリーにより測定した、ＯＸ４０を発現する（ＯＸ４０＋）か、又はＯＸ４０を発現しない（ＯＸ４０－）Ｖβ２２＋及びＶβ２２－の細胞のパーセンテージを示す。
【0103】
３７３７－ＴＩＬの養子細胞移入前及び後に、患者３７３７の血清試料に対して、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示す通り、患者血清において、細胞注入後最初の５日間に、ＩＦＮ－γのレベル上昇が検出された。
【0104】
患者は、細胞注入前には、明らかな進行性疾患の兆候を有していたが、２ヶ月の追跡調査により腫瘍退縮が観察され、肺及び肝臓の標的病変は、全て退行し続け、治療７ヶ月後には、最大の３０％減退に達した（図３Ｃ）。患者は、細胞注入後約１３ヶ月間、疾患の安定化を経て、その後、疾患の進行は肺のみで認められ、肝臓では認められなかった。
【0105】
【表11】
【0106】
実施例５
本実施例は、実施例４の細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏの表現型及び機能を実例で示す。
本実施例は、実施例４の細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏの表現型及び機能を実例で示す。
【0107】
ＣＤ４＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞が、疾患の安定化における役割を果たす証拠があるか否かを判定するために、細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏの表現型及び機能を評価した。３７３７－ＴＩＬと、野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ又はｍｕｔ ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、ＣＤ４＋集団におけるＩＦＮ－γ（表１０Ａ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（表１０Ｂ）、及びＩＬ－２（表１０Ｃ）の細胞内産生を検出した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１０Ａ～１０Ｃに示す。表１０Ｄは、表示した数のサイトカインを発現したＶβ２２＋細胞のパーセンテージを示す。突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドによる刺激は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ及びＩＬ－２の確固とした共発現を誘導した（表１０Ａ～１０Ｃ）が、ＩＬ－４又はＩＬ－１７はほとんど又は全くされなかったので、Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、多機能性Ｔｈ１細胞であることが見出された。
【0108】
【表12】
【0109】
【表13】
【0110】
【表14】
【0111】
【表15】
【0112】
表現型の更なる特性解析により、これらの細胞が、主に、細胞溶解能を有するエフェクター記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞であることが明らかとなった（表１１及び１２）。Ｖβ２２（ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞に相当する）及びＴ細胞分化マーカーＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２７の発現について、患者３７３７－ＴＩＬを、フローサイトメトリーにより評価した。データを、生きているＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲートした。アイソタイプ染色した細胞又は非染色細胞を用いて、正及び負の象限ゲートを設定した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１１に示す。ヒト末梢血細胞（すべての分化段階のＴ細胞を含有する）を実験に含め、抗体が作用していることを確認した。
【0113】
【表16】
【0114】
患者３７３７－ＴＩＬと、ＯＫＴ３又は野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ若しくはｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。共培養開始時に、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａに対して特異的な抗体を加えた。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、ＣＤ１０７ａの細胞表面移動化（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を検出した。データをＣＤ４＋集団にゲートした。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１２に示す。
【0115】
【表17】
【0116】
３７３７－ＴＩＬ中に存在する、多機能性、Ｖβ２２陰性で、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異
反応性の、少数のＣＤ４＋Ｔ細胞集団もあるようであった（表９及び１０）。これらのＶβ２２陰性細胞を、野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ又はｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰ ２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞と共培養する前に、ＦＡＣＳで選別し、次いで、ＩＬ－２含有培地中で２日間静置した（ｒｅｓｔ）。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、刺激後６時間（ｈ）の、ＣＤ４＋集団におけるＩＬ－２（表１３Ｃ）、ＴＮＦ（表１３Ｂ）、及びＩＦＮ－γ（表１３Ａ）の細胞内産生を検出した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１３Ａ～１３Ｃに示す。
反応性の、少数のＣＤ４＋Ｔ細胞集団もあるようであった（表９及び１０）。これらのＶβ２２陰性細胞を、野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ又はｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰ ２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞と共培養する前に、ＦＡＣＳで選別し、次いで、ＩＬ－２含有培地中で２日間静置した（ｒｅｓｔ）。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、刺激後６時間（ｈ）の、ＣＤ４＋集団におけるＩＬ－２（表１３Ｃ）、ＴＮＦ（表１３Ｂ）、及びＩＦＮ－γ（表１３Ａ）の細胞内産生を検出した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１３Ａ～１３Ｃに示す。
【0117】
【表18】
【0118】
【表19】
【0119】
【表20】
【0120】
フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４＋集団におけるＯＸ４０及びＶβ２２の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＯＸ４０ ａｎｄ Ｖβ２２）を、刺激後２４時間目に評価した。ＯＸ４０を上方制御した細胞を選別し、細胞の数を増幅し、ＴＣＲ－Ｖβレパートリーを、フローサイトメトリーにより解析した。結果を図３Ｄに示す。Ｖβ２２陰性細胞を選別し、続いてこれらの細胞を活性化すると、３７３７－ＴＩＬ中に、このエピトープに対して反応性の更なるクローン型が１以上存在し（表１３Ａ～１３Ｃ）、そのうち最も優占的なクローン型が、Ｖβ５．２である（図３Ｄ）ことが明らかになった。
【0121】
選別された、図３Ｄに記載の細胞と、ｗｔＥＲＢＢ２ＩＰ、ｍｕｔ ＡＬＫ又はｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ５．２の発現を評価し、ＣＤ４＋集団におけるＩＬ－２（表１４Ｃ）、ＴＮＦ（表１４Ｂ）、及びＩＦＮ－γ（表１４Ａ）の細胞内産生を検出した。表１５は、表示した数のサイトカインを発現したＶβ５．２＋細胞のパーセンテージを示す。
【0122】
【表21】
【0123】
【表22】
【0124】
【表23】
【0125】
【表24】
【0126】
突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰによる刺激に際して、ＯＸ４０を上方制御したＶβ２２陰性細胞を選別し、細胞数を増幅した。次いで、これらの細胞からのＲＮＡを単離し、ＴＣＲ－β定常鎖プライマーを用いて５’相補的ＤＮＡ末端の迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）を行って、発現したＴＣＲ－Ｖβ配列を同定した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物に対してＴＯＰＯ－ＴＡクローニングを行い、次いで、個々のコロニーで配列決定した。フローサイトメトリーは、これらのＴ細胞の４０～５０％がＶβ５．２（ＴＲＢＶ５－６）であることを実証した。サンガー配列決定によると、ＴＯＰＯ－ＴＡコロニーの３／７が、表１６に示す配列を有するＶβ５．２（ＴＲＢＶ５－６）であった。表１６に、Ｖβ２２陰性ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞の、最も高頻度なＴＣＲβＶ－Ｄ－Ｊ配列を示す。
【0127】
【表25】
【0128】
大部分のＶβ５．２＋細胞が、抗原特異的様態で、複数のサイトカインを産生した（表１４Ａ～１４Ｃ、１５及び１６）。突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰを認識する、少数の、Ｖβ５．２陰性（及びＶβ２２陰性）ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団も存在するようであった（表１４Ａ～１４Ｃ及び１５）。従って、患者３７３７を治療するために用いたＴＩＬは、ＥＲＢＢ２ＩＰにおいて同一の突然変異を認識する、異なる多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞を少なくとも３クローン含有し、この突然変異が、高度に免疫原性であることを示した。
【0129】
実施例６
本実施例は、実施例４の細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を実証する。
本実施例は、実施例４の細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を実証する。
【0130】
ＣＤ４＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞が、疾患の安定化における役割を果たす証拠があるか否かを判定するために、細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を評価した。ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシングにより、これらのクローン型は、ＡＣＴの前では末梢血においてまれであるか、又は検出されないことが明らかとなった（図４Ａ及び４Ｂ）。ＡＣＴの１０日後、両クローンは、末梢血中の全Ｔ細胞の２％超存在したが、細胞注入後３４日目までに０．３％未満に減少した（図４Ａ及び４Ｂ）。ＡＣＴの約１年半後に切除された３例の肺転移は、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞によって浸潤されており（図４Ａ及び４Ｂ）、これらの細胞が、がんの退縮及び疾患の安定化に寄与することが示された。Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性クローンは、腫瘍結節３（Ｔｕ－３－Ｐｏｓｔ）で検出された、最も高頻度なクローンであり、腫瘍中の全Ｔ細胞の約８％に相当した（図４Ａ及び４Ｂ）が、このクローンは、腫瘍結節１及び２中、頻度の高さがそれぞれ２番目及び１２番目だった。Ｖβ５．２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性クローンも、その血中頻度と比較して、３腫瘍結節全てにおいて濃縮されていた（図４Ａ及び４Ｂ）。従って、患者３７３７は、転移病巣に浸潤して持続する１００億超のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的多機能性Ｔｈ１細胞を受容した後、１年超の間、疾患の安定化を伴う腫瘍退縮を経た。
【0131】
患者３７３７－ＴＩＬ（Ｔ細胞）、及び養子細胞移入の前（Ｔｕ－Ｐｒｅ）後の腫瘍中の、ＥＲＢＢ２ＩＰ発現の定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）解析を行った。細胞注入の約１７ヶ月後に、肺の、転移性の別個の３病変（Ｔｕ－１、－２、－３－Ｐｏｓｔ）を切除した。結果を、β－アクチン（ＡＣＴＢ）と相対的に、図４Ｃに示す。突然変異を含有する、ＥＲＢＢ２ＩＰ遺伝子の３５０塩基対（ｂｐ）セグメントを、図４Ｃに記載したｃＤＮＡサンプルからＰＣＲ増幅し、サンガー配列決定した。突然変異の位置は、アミノ酸配列の８０５位の変化に対応する、コード配列の２４１４位のヌクレオチドであ
った。定量的ＲＴ－ＰＣＲによって決定された通り、元の肺病変及び再発肺病変の両方において、比較的高レベルのＥＲＢＢ２ＩＰ発現が観察され（図４Ｃ）、サンガー配列決定により、すべての腫瘍病変において、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異の存在が確認された。
った。定量的ＲＴ－ＰＣＲによって決定された通り、元の肺病変及び再発肺病変の両方において、比較的高レベルのＥＲＢＢ２ＩＰ発現が観察され（図４Ｃ）、サンガー配列決定により、すべての腫瘍病変において、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異の存在が確認された。
【0132】
ＡＣＴ前後のＴ細胞浸潤及びＭＨＣ発現の、免疫組織化学的解析を行った。ＡＣＴ後の腫瘍は、最初のＡＣＴの約１７ヶ月後に回収した。陽性対照（扁桃）を全ての染色についてに含めた。ｉｎ ｓｉｔｕでの、腫瘍のＴ細胞浸潤及びＭＨＣ発現を、それぞれ表１７及び１８に要約する。
【0133】
【表26】
【0134】
【表27】
【0135】
実施例７
本実施例は、突然変異反応性Ｔｈ１細胞の、実施例４の抗腫瘍応答への寄与を実証する。
本実施例は、突然変異反応性Ｔｈ１細胞の、実施例４の抗腫瘍応答への寄与を実証する。
【0136】
突然変異反応性Ｔｈ１細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答への寄与を特異的に評価するために、＞９５％がＶβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔｈ１細胞（約１２００億の突然変異反応性細胞）で構成されるＴＩＬ産物を作製し、患者３７３７に養子移入した。
【0137】
再治療に用いたＴＩＬ産物のフローサイトメトリー解析を行った。表１９は、ＣＤ３にゲートした後、９７％がＣＤ４＋／ＣＤ８－であり、これらのうち９８％が、ＣＤ４＋細
胞に更にゲートした後にＶβ２２＋であったことを示す（表２０）。再治療ＴＩＬと、野生型（ｗｔ）又は突然変異型（ｍｕｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４＋の集団における細胞内ＴＮＦ産生を検出した（表２０）。
胞に更にゲートした後にＶβ２２＋であったことを示す（表２０）。再治療ＴＩＬと、野生型（ｗｔ）又は突然変異型（ｍｕｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４＋の集団における細胞内ＴＮＦ産生を検出した（表２０）。
【0138】
【表28】
【0139】
【表29】
【0140】
患者は、再度標的病変の減少を経たが、最初の治療とは異なり、腫瘍退縮が、最初の１ヶ月目の追跡調査でも認められ、２回目の治療後４ケ月目の追跡調査において続いていた（図４Ｄ）。２回目の治療後８ケ月目の追跡調査時に、腫瘍退縮が継続していた。
【0141】
突然変異反応性細胞の２回目の投与後６ヶ月に、患者３７３７の、肺のコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを撮影した。得られた画像を図７Ａ～Ｃに示す。これらの画像を、突然変異反応性細胞の第２回投与に先立って撮影したもの（図７Ｄ～７Ｆ）と比較した。図７Ａ～７Ｆに示す通り、約３６％のがん性病変の減少が観察され、固形がんの治療効果判定のための（ＲＥＣＩＳＴ）基準に基づく、部分反応（ＰＲ）がもたらされた。
【0142】
２回目の、突然変異反応性細胞投与の８ヶ月後、患者３７３７の、肝臓及び肺の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを撮影した。標的病変の継続的な収縮が観察された。腫瘍の代謝活性を測定するために、放射性標識グルコースアナログ、ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を投与して、腫瘍によるグルコースの取り込みを評価した。ＰＥＴスキャンでは、肝臓の２病変ではグルコース取り込みが示されず、肺病変では一部の取り込みが示されたのみであった。
【0143】
実施例８～１０
実施例８～１０についての材料及び方法を以下に示す。
実施例８～１０についての材料及び方法を以下に示す。
【0144】
患者材料及び細胞株
すべての患者の材料は、国立がん研究所の施設内治験審査委員会が承認した臨床試験の過程で得た。患者２３５９及び患者２５９１を、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２６：５２３３－９（２００８）に記載されている臨床試験（それぞれ、試験登録ＩＤ：ＮＣＴ０００９６３８２及びＩＤ：ＮＣＴ００３３５１２７）に登録した。患者に切除術を施し、それからＴＩＬ株と腫瘍細胞株の両方を樹立した。本研究に使用するＴＩＬは、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）に記載の方法により作製した。簡潔に述べると、腫瘍断片を切除し、ＩＬ－２含有培地中で培養した。増幅したＴＩＬ培養物の数を、自己又はＨＬＡ適合腫瘍の認識についてスクリーニングし、急速増幅プロトコル（ＲＥＰ）（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８－４１（１９９２））を用いて、反応性ＴＩＬの数を、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び放射線照射したフィーダー細胞により、患者注入用に大量増幅した（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８－４１（１９９２））。一部少数のＴＩＬに第２のＲＥＰを施した。Ｔ細胞及び
腫瘍細胞を、共培養アッセイ用に、２００μＬの培地（５％ヒト血清を添加したＡＩＭ－Ｖ培地）を含む９６ウェルプレート中１：１の割合で、１６時間（ｈｒ）培養した。
すべての患者の材料は、国立がん研究所の施設内治験審査委員会が承認した臨床試験の過程で得た。患者２３５９及び患者２５９１を、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２６：５２３３－９（２００８）に記載されている臨床試験（それぞれ、試験登録ＩＤ：ＮＣＴ０００９６３８２及びＩＤ：ＮＣＴ００３３５１２７）に登録した。患者に切除術を施し、それからＴＩＬ株と腫瘍細胞株の両方を樹立した。本研究に使用するＴＩＬは、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）に記載の方法により作製した。簡潔に述べると、腫瘍断片を切除し、ＩＬ－２含有培地中で培養した。増幅したＴＩＬ培養物の数を、自己又はＨＬＡ適合腫瘍の認識についてスクリーニングし、急速増幅プロトコル（ＲＥＰ）（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８－４１（１９９２））を用いて、反応性ＴＩＬの数を、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び放射線照射したフィーダー細胞により、患者注入用に大量増幅した（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８－４１（１９９２））。一部少数のＴＩＬに第２のＲＥＰを施した。Ｔ細胞及び
腫瘍細胞を、共培養アッセイ用に、２００μＬの培地（５％ヒト血清を添加したＡＩＭ－Ｖ培地）を含む９６ウェルプレート中１：１の割合で、１６時間（ｈｒ）培養した。
【0145】
臨床活性を有するＴＩＬの抗原反応性を評価するために、養子ＴＩＬ療法による持続的完全寛解を経た、２名の転移性黒色腫患者を調査した。患者２３５９は、右膝に、大腿、腸骨及び鼠径リンパ節に転移した、原発性皮膚黒色腫を有していた。この個人は、治療後８年間超にわたって進行中であった、自己ＴＩＬの移入に反応して、全転移性病変の完全退縮を経た。患者２５９１は、腹壁、腸間膜リンパ節、右結腸及び鎖骨上リンパ節に転移した原発性背部黒色腫（ｂａｃｋ ｍｅｌａｎｏｍａ）を有していた。この個人は、自己ＴＩＬ移入に反応して、全転移性病変の完全退縮を経、治療後９年間無疾患であった。
【0146】
全エクソーム配列決定
該方法は、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９：７４７－５２（２０１３）に記載されている。ゲノムＤＮＡ精製、ライブラリー構築、約２０，０００のコード遺伝子のエクソーム捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）、並びに腫瘍試料及び正常試料の次世代配列決定を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で行った。要約すると、腫瘍試料及び正常試料由来のゲノムＤＮＡを断片化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＳＥＱ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に用いた。エクソン領域は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴ ５０Ｍｂ ｋｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３）を、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従って溶液中に捕捉した。ＨＩＳＥＱ ２０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、各フラグメントの各末端から１００塩基を得るペアエンド配列決定を行った。配列データを、参照用のヒトゲノム配列にマッピングし、配列改変を、５，０００万塩基超の腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡの比較によって決定した。各試料について８０億塩基超の配列データを得たが、該塩基の多くは、捕獲されたコード領域由来であった。腫瘍試料及び正常試料において、４３００万塩基超の標的ＤＮＡを解析し、正常ＤＮＡ試料及び腫瘍ＤＮＡ試料における各塩基で、平均４２～５１の読み取りを得た。
該方法は、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９：７４７－５２（２０１３）に記載されている。ゲノムＤＮＡ精製、ライブラリー構築、約２０，０００のコード遺伝子のエクソーム捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）、並びに腫瘍試料及び正常試料の次世代配列決定を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で行った。要約すると、腫瘍試料及び正常試料由来のゲノムＤＮＡを断片化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＳＥＱ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に用いた。エクソン領域は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴ ５０Ｍｂ ｋｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３）を、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従って溶液中に捕捉した。ＨＩＳＥＱ ２０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、各フラグメントの各末端から１００塩基を得るペアエンド配列決定を行った。配列データを、参照用のヒトゲノム配列にマッピングし、配列改変を、５，０００万塩基超の腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡの比較によって決定した。各試料について８０億塩基超の配列データを得たが、該塩基の多くは、捕獲されたコード領域由来であった。腫瘍試料及び正常試料において、４３００万塩基超の標的ＤＮＡを解析し、正常ＤＮＡ試料及び腫瘍ＤＮＡ試料における各塩基で、平均４２～５１の読み取りを得た。
【0147】
生物情報科学的解析は、ワシントン大学医学部の個人ゲノム診断及びゲノム技術アクセスセンター、ゲノミクス及び病理学部門が行った。タグを、ＣＡＳＡＶＡ １．６ソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＥＬＡＮＤアルゴリズムを用いて、ヒトゲノム参照用配列（ｈｇ１８）と整列させた。その後の解析用の配列読み取りを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢＡＳＥＣＡＬＬ ｓｏｆｔｗａｒｅの純度フィルターを用いて選択した。次いで、ＣＡＳＡＶＡ１．６ソフトウェアのＥＬＡＮＤｖ２ ａｌｇｏｒｉｔｈｍを適用して、点突然変異及び小規模な挿入及び欠失を同定した。ｄｂＳＮＰに記録された既知の多型を、解析から除外した。起こり得る体細胞突然変異を、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０：２２８－３１（２０１０）に記載の通りにフィルターにかけ、目視で検証した。
【0148】
タンデムミニ遺伝子ライブラリーの構築
黒色腫試料由来の非同義突然変異を、全エクソーム配列決定データから同定した。同定された突然変異アミノ酸６残基（そのＮ－及びＣ－末端両側に、両側の１２アミノ酸が隣接する）を含有するポリペプチドをコードするタンデムミニ遺伝子コンストラクトを合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、次いで、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、製造業者の指示書に従って、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。
黒色腫試料由来の非同義突然変異を、全エクソーム配列決定データから同定した。同定された突然変異アミノ酸６残基（そのＮ－及びＣ－末端両側に、両側の１２アミノ酸が隣接する）を含有するポリペプチドをコードするタンデムミニ遺伝子コンストラクトを合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、次いで、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、製造業者の指示書に従って、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。
【0149】
ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
腫瘍細胞株及びペプチドでパルスした標的細胞に対する応答を、１５μｇ／ｍｌの抗Ｉ
ＦＮ－γモノクローナル抗体１Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）でコーティングした９６ウェルＰＶＤＦ膜フィルタープレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで定量した。結合したサイトカインを、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩＦＮ－γ抗体７－Ｂ６－１（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いて検出した。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５又はＨＬＡ－Ｃ＊０７０１を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ペプチドで、３７℃で２時間パルスした。以下のペプチド：ＭＡＲＴ－１：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５４）、突然変異ＫＩＦ２Ｃ：ＲＬＦＰＧＬＴＩＫＩ（配列番号５５）、突然変異ＰＯＬＡ２：ＴＲＳＳＧＳＨＦＶＦ（配列番号５６）を使用した。Ｔ細胞を、標的細胞又は５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ及び１μＭイオノマイシンを含有する培地（ＰＭＡ／Ｉ）と一晩共培養した。１０５Ｔ細胞あたりのスポット数を算出した。
腫瘍細胞株及びペプチドでパルスした標的細胞に対する応答を、１５μｇ／ｍｌの抗Ｉ
ＦＮ－γモノクローナル抗体１Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）でコーティングした９６ウェルＰＶＤＦ膜フィルタープレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで定量した。結合したサイトカインを、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩＦＮ－γ抗体７－Ｂ６－１（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いて検出した。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５又はＨＬＡ－Ｃ＊０７０１を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ペプチドで、３７℃で２時間パルスした。以下のペプチド：ＭＡＲＴ－１：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５４）、突然変異ＫＩＦ２Ｃ：ＲＬＦＰＧＬＴＩＫＩ（配列番号５５）、突然変異ＰＯＬＡ２：ＴＲＳＳＧＳＨＦＶＦ（配列番号５６）を使用した。Ｔ細胞を、標的細胞又は５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ及び１μＭイオノマイシンを含有する培地（ＰＭＡ／Ｉ）と一晩共培養した。１０５Ｔ細胞あたりのスポット数を算出した。
【0150】
実施例８
本実施例は、ＴＩＬ２３５９が、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングによって評価される通り、突然変異抗原を認識することを実例で示す。
本実施例は、ＴＩＬ２３５９が、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングによって評価される通り、突然変異抗原を認識することを実例で示す。
【0151】
ＴＩＬ２３５９の反応性を、腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡのエクソーム解析によって同定された非同義突然変異に基づき作製したＴＭＧコンストラクトを用いて評価した。各ＴＭＧコンストラクトは、正常遺伝子産物中に存在する更なる１２コドンがいずれの側にも隣接する突然変異コドンに対応する、個別のミニ遺伝子断片を、最大６つコードした。１例を図５Ａに示す。
【0152】
Ｍｅｌ２３５９から同定された非同義点突然変異を含有するエクソームＤＮＡ配列に基づいた７１ミニ遺伝子をコードする、タンデムの１２ミニ遺伝子群の個々の１つを、別々に、ＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションした。これらのＣＯＳ－７細胞に、このＴＩＬによる自己腫瘍細胞認識用に用いられる支配的なＨＬＡ拘束性要素である、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５もトランスフェクションした。これらのトランスフェクタントとＴＩＬ２３５９との共培養により、ＴＭＧの１２コンストラクトのうちの１つ、ＲＪ－１の認識がもたらされた（図５Ｂ）。図５Ａに示す通り、ＲＪ－１は、ＥＰＨＢ２、ＫＩＦ２Ｃ、ＳＬＣ４４Ａ５、ＡＢＣＡ４、ＤＥＮＮＤ４Ｂ、及びＥＰＲＳ遺伝子の突然変異断片をコードしていた。続いて、ＲＪ－１変異体の６コンストラクト（各々が、６ミニ遺伝子のうちの１つにおいて、存在する突然変異残基の代わりに、ＷＴをコードする）を作製した（図５Ｃ）。ＴＩＬ２３５９は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５と、個別にトランスフェクションされたＲＪ－１の６変異体のうちの５つとを共トランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を認識したが、ＷＴ ＫＩＦ２Ｃ配列をコードする変異体では認識できなかった。このことは、このミニ遺伝子が、ＴＩＬ２３５９が認識した突然変異エピトープをコードすることを示した（図５Ｃ）。この観察を更に検証するために、ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊０２０５のｃＤＮＡのいずれかとともに、Ｍｅｌ２３５９から増幅されたＷＴ又は突然変異全長ＫＩＦ２Ｃ ｃＤＮＡ転写産物のいずれかを共トランスフェクションした。共培養実験により、ＴＩＬ２３５９Ｔ細胞は、突然変異ＫＩＦ２Ｃ遺伝子産物と共トランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５拘束性様態で認識するが、ＷＴ ＫＩＦ２Ｃ遺伝子産物とではそうしないことを示した（図５Ｄ）。
【0153】
突然変異ＫＩＦ２Ｃコード領域は、天然のＫＩＦ２Ｃタンパク質中の１６位のアラニンの、トレオニンへの置換をもたらす、ヌクレオチド４６での、ＣからＡへのシングルトランスバージョンを含有していた。エクソーム配列決定の結果により、Ｍｅｌ２３５９由来のＤＮＡは、４６位で、もっぱら突然変異残基に合致するが、正常な残基にはしないことが示され、Ｍｅｌ２３５９ ＤＮＡの直接的サンガー配列決定により、結果を確認した。このことにより、この遺伝子座でのヘテロ接合性の喪失が示された。ＴＩＬ２３５９によ
って認識される突然変異ＫＩＦ２Ｃエピトープを同定するための試みにおいて、高親和性でＨＬＡ－Ａ＊０２０５に結合すると予測された、ＫＩＦ２Ｃ突然変異を包含するペプチドを合成し（Ｈｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１：１－１３（２００９））、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞にパルスした（表２１）。残基１０～１９に対応するデカマーでパルスしたＨＥＫ２９３－Ａ＊０２０５細胞は、ＴＩＬ２３５９ Ｔ細胞から多量のＩＦＮ－γの放出を促進し、該ペプチドは、最低濃度０．１ｎＭで認識された。対照的に、対応するＷＴペプチドは、１０μＭで、有意なＩＦＮ－γ放出を誘導しなかった（図５Ｅ）。
って認識される突然変異ＫＩＦ２Ｃエピトープを同定するための試みにおいて、高親和性でＨＬＡ－Ａ＊０２０５に結合すると予測された、ＫＩＦ２Ｃ突然変異を包含するペプチドを合成し（Ｈｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１：１－１３（２００９））、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞にパルスした（表２１）。残基１０～１９に対応するデカマーでパルスしたＨＥＫ２９３－Ａ＊０２０５細胞は、ＴＩＬ２３５９ Ｔ細胞から多量のＩＦＮ－γの放出を促進し、該ペプチドは、最低濃度０．１ｎＭで認識された。対照的に、対応するＷＴペプチドは、１０μＭで、有意なＩＦＮ－γ放出を誘導しなかった（図５Ｅ）。
【0154】
【表30】
【0155】
実施例９
本実施例は、ＴＩＬ２５９１が、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングにより同定された突然変異抗原を認識することを実例で示す。
本実施例は、ＴＩＬ２５９１が、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングにより同定された突然変異抗原を認識することを実例で示す。
【0156】
ＴＩＬ２５９１によって認識される突然変異Ｔ細胞抗原は、Ｍｅｌ２５９１から同定された非同義点突然変異を含有するエクソームＤＮＡ配列に基づいて、２１７ミニ遺伝子をコードする３７個のＴＭＧコンストラクトを合成することによって同定した。ＴＩＬ２５９１は、複数のＨＬＡ拘束性エレメントとの関係で自己腫瘍細胞を認識した。従って、Ｍｅｌ２５９１から単離したＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ６分子のそれぞれを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株に、３７のＴＭＧコンストラクトを個別に、一過的にトランスフェクションし、続いてＴＩＬ２５９１との一晩の共培養を行った。初期の結果により、ＴＩＬ２５９１が、ミニ遺伝子ＤＷ－６を一過的にトランスフェクションしたＨＬＡ－Ｃ＊０７０１＋ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－Ｃ＊０７０１）（ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１＋ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ（ＨＥＫ２９３－Ｃ＊０７０１）ｃｅｌｌｓ）を認識するが、他のミニ遺伝子コンストラクトには有意に反応しないことが示された（図６Ａ）。次いで、ＤＷ－６タンデムコンストラクト（図６Ｂ）における個々の突然変異６ミニ遺伝子のそれぞれを、別々にＷＴ配列に復帰させた（図６Ｃ）。ＷＴ変異体に対する応答の評価により、ＴＩＬ２５９１が、ＤＷ－６変異体の各々（ＷＴ ＰＯＬＡ２断片をコードするコンストラクトを除く）をトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を認識することが示された（図６Ｃ）。これらの知見を検証するために、ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ｃ＊０４０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１又はＨＬＡ－Ｃ＊０７０２ ｃＤＮＡと共に、ＷＴ又は突然変異の全長ＰＯＬＡ２ ｃＤＮＡコンストラクトのいずれかをトランスフェクションした。ＴＩＬ２５９１ Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１と突然変異ＰＯＬＡ２コンストラクトをトランスフェクションした標的細胞のみを認識し、対応するＷＴ転写産物ではしなかった（図６Ｄ）。ＰＯＬＡ２コード領域のヌクレオチド１２５８における、ＣからＴへのシングルの変化により、ＷＴ ＰＯＬＡ２タンパク質の４２０位での、フェニルアラニンのロイシンへの置換がもたらされた。サンガー配列決定により、ゲノムＤＮＡ及びＭｅｌ２５９
１ ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの両方が、１２５８位にＷＴ及び突然変異ヌクレオチドの両方を含有する一方、患者２５９１のＰＢＭＣから単離したゲノムＤＮＡは、ＷＴ配列に対応することが示された、このことにより、これが、Ｍｅｌ２５９１細胞におけるヘテロ接合性体細胞突然変異を表すことが示された。
１ ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの両方が、１２５８位にＷＴ及び突然変異ヌクレオチドの両方を含有する一方、患者２５９１のＰＢＭＣから単離したゲノムＤＮＡは、ＷＴ配列に対応することが示された、このことにより、これが、Ｍｅｌ２５９１細胞におけるヘテロ接合性体細胞突然変異を表すことが示された。
【0157】
次いで、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１結合アルゴリズムを用いて、４２０位の突然変異ロイシン残基とオーバーラップするＰＯＬＡ２ペプチドの候補を同定した（表２２）。共培養の結果により、突然変異ＰＯＬＡ２の残基４１３～４２２に対応するデカマーでパルスしたＨＬＡ－Ｃ＊０７０１＋ＨＥＫ２９３細胞が、最低濃度１０ｎＭで、ＴＩＬ２５９１Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの放出を刺激することが示された。対照的に、対応するＷＴペプチドでは、高濃度１０μＭで、有意なＩＦＮ－γ放出が誘導されなかった（図６Ｅ）。
【0158】
【表31】
【0159】
次いで、ＴＩＬ２３５９及び２５９１における、突然変異したＫＩＦ２Ｃ及びＰＯＬＡ２をそれぞれ認識するＴ細胞の割合を、ＩＦＮ－γ酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて推定した。ＴＩＬ２３５９は、自己黒色腫に応答して観察されたのと同様、突然変異ＫＩＦ２ＣエピトープでパルスしたＨＬＡ－Ａ＊０２０５＋細胞に応答して、１００，０００Ｔ細胞あたり約２，０００スポットを生成した（表２３）。ＴＩＬ２５９１は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＭＡＲＴ－１エピトープに応答して７０００超のスポットを生成したが、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１拘束性突然変異ＰＯＬＡ２エピトープに対して反応したＴ細胞はほんのわずかであった（表２３）。
【0160】
【表32】
【0161】
実施例１０
本実施例は、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングにより同定した、消化管（ＧＩ）がんに存在する突然変異抗原に対して反応性のＴ細胞を同定する方法を実例で示す。
本実施例は、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングにより同定した、消化管（ＧＩ）がんに存在する突然変異抗原に対して反応性のＴ細胞を同定する方法を実例で示す。
【0162】
ＧＩがん患者からの転移性病変について、全エクソーム配列決定を行って突然変異を同定した。次に、各突然変異をコードするミニ遺伝子コンストラクトを作製し、自己ＡＰＣにトランスフェクションして、腫瘍に発現するすべての突然変異のプロセシング及び提示を可能にした。次いで、これらのＡＰＣと腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とを共培養し、突然変異に対するＴ細胞反応性を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ及びフローサイトメトリーに基づく、４－１ＢＢ及びＯＸ４０上方制御によって測定した。
【0163】
１結腸がん患者において、１１９の突然変異を、突然変異反応性について評価した。全てではないが、いくつかのＴＩＬ培養物が、割合が非常にばらついた、ＣＡＳＰ８（６７Ｆ→Ｖ）での突然変異を特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を含有することが見出された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで更に増幅する際には、培養物中の他の細胞が、これらの突然変異反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも、著しく増殖した。約０．３１％（約１億２７００万）の突然変異反応性細胞を含有すると推定された４０．３ｘ１０９ＴＩＬの、患者への投与によっては、細胞の投与後約６週間の、最初の追跡において、臨床反応がもたらされなかった。患者は約６週間後に死亡した。特定の理論又はメカニズムに縛られることはないが、治療前に、疾患が非常に後期の段階であること、患者の全体的な状態が不良であること、及び患者の、養子細胞療法に先立って施されるリンパ球枯渇化学療法への耐性が不良なことのいずれか１以上が、患者の死因に寄与した可能性があると考えられる。突然変異したＣＡＳＰ８に対して反応性のＴＣＲをＴＩＬから単離し、該ＴＣＲを発現するよう形質導入したＴ細胞は、突然変異ＣＡＳＰ８でパルスしたＤＣに対して反応性であった。
【0164】
別の直腸がん患者においては、突然変異反応性について、１５５の突然変異を評価した。少なくとも３通りの、異なる突然変異反応性が見出され、２通りが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、１通りがＣＤ４＋応答を含んでいた。患者への、突然変異反応性ＴＩＬの投与により、最初は、治療後約１．５ヶ月で混合応答が生じたが、その後、治療後約３．５ヶ月で、患者は進行性疾患を発症した。ＣＤ４＋ＴＩＬ及びＣＤ８＋ＴＩＬから、突然変異反応性ＴＣＲの候補を単離した。
【0165】
第３の患者（胆管がん）においては、試験した３８の突然変異に対して、反応性のＴ細胞は検出されなかった。この患者については、「突然変異コール」の閾値が低下したので、更に１２５の推定突然変異（ａｎ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ １２５ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が評価される。「突然変異コール」は、配列が、生物情報学を用いて突然変異として同定される、任意に設定された閾値である。この場合、第１パスとしては、閾値は比較的高かった（例えば、同定された突然変異が真の突然変異であるという、高水準の信頼性を提供した）。次いで、閾値が低下し、同定された突然変異が真の突然変異であるという信頼性の水準は低くなったが、同定された突然変異が真の突然変異である可能性は残った。
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が評価される。「突然変異コール」は、配列が、生物情報学を用いて突然変異として同定される、任意に設定された閾値である。この場合、第１パスとしては、閾値は比較的高かった（例えば、同定された突然変異が真の突然変異であるという、高水準の信頼性を提供した）。次いで、閾値が低下し、同定された突然変異が真の突然変異であるという信頼性の水準は低くなったが、同定された突然変異が真の突然変異である可能性は残った。
【0166】
これらのデータにより、転移性消化管がんにおける体細胞突然変異に対してＴ細胞応答を開始するヒト免疫系の能力は、珍しいイベントではない可能性があることが示される。この研究は進行中である。
【0167】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【0168】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１の」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１の」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１の」）は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項（Ａ若しくはＢ）から選択された１の事項又は列挙した事項（Ａ及びＢ）のうち２以上の任意の組み合わせを意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【0169】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7】
【配列表】