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▶ インペリアル カレッジ イノベーションズ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-30
(45)【発行日】2023-09-07
(54)【発明の名称】単一粒子自動ラマン捕捉分析
(51)【国際特許分類】
G01N 15/02 20060101AFI20230831BHJP
G01N 21/65 20060101ALI20230831BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20230831BHJP
C07K 5/08 20060101ALN20230831BHJP
【ＦＩ】
G01N15/02 A
G01N21/65
G01N21/64 E
C07K5/08
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2020570740
(86)(22)【出願日】2019-06-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-14
(86)【国際出願番号】 EP2019066106
(87)【国際公開番号】W WO2019243375
(87)【国際公開日】2019-12-26
【審査請求日】2022-03-28
(31)【優先権主張番号】1810010.7
(32)【優先日】2018-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】522109157
【氏名又は名称】インペリアル カレッジ イノベーションズ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100090033
【弁理士】
【氏名又は名称】荒船 博司
(72)【発明者】
【氏名】スティーブンズ， モリ―
(72)【発明者】
【氏名】ペンデルス， イェレ
(72)【発明者】
【氏名】ペンス， アイザック
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０００４５５９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】欧州特許出願公開第０２９３０４９６（ＥＰ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２６０５１３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第０７５１５２６９（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】国際公開第２０１７／１４４８８６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Daniel P. Cherney, Travis E. Bridges, and Joel M. Harris，Optical Trapping of Unilamellar Phospholipid Vesicles： Investigation of the Effect of Optical Forces on the Lipd Membrane Shape by Confocal-Raman Microscopy，Analytical Chemistry，Analytical Chemistry，2004年09月01日，Vol.76、No.17，4920-4928
【文献】JellePenders, Isaac J. Pence, et al，Single Particle Automated Raman Trapping Analysis，Nature Communications，Nature Communications，2018年10月15日，Vol.9、Nr:1
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １５／０２
Ｇ０１Ｎ １５／００
Ｇ０１Ｎ ２１／６２～２１／７４
Ｃ０７Ｋ １／００～１９／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
粒子分析の自動化された方法であって、（ｉ）電磁放射ビームを粒子搬送媒体上に集束させて、前記ビーム内の候補粒子を捕捉するための粒子捕捉ゾーンを画定することと、
（ｉｉ）粒子捕捉を示す閾値を超える所定のスペクトルプロファイルの存在を検出するのに十分なラマン応答データ収集手順を実行することを含む、粒子捕捉をテストするための第１のデータ取得手順を実行することと、
（ｉｉｉ）粒子捕捉が検出されない場合、ステップ（ｉｉ）を繰り返すことと、
（ｉｖ）粒子捕捉が検出された場合、前記捕捉された粒子から粒子データを取得することと、
（ｖ）前記粒子を前記粒子捕捉ゾーンから放出するために、電磁放射ビーム強度をサブ捕捉レベルまで低減することと、
（ｖｉ）前記粒子搬送媒体中の連続する粒子に対してステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すことと、を含む方法。
【請求項2】
ステップ（ｉｖ）は、少なくとも１つの分析モダリティを使用して前記粒子データを捕捉するための第２のデータ取得手順を実行することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第２のデータ取得手順は、前記第１のデータ取得手順よりも大きな信号対雑音比を容易にするラマン応答データ収集手順を実行することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ステップ（ｉｖ）で取得された前記粒子データは、前記第１のデータ取得手順からのデータを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（ｖ）は、前記電磁放射ビーム強度をサブ捕捉レベルまで低減した後、以前に捕捉された粒子が前記粒子捕捉ゾーンから周囲の媒体に移送されるのに十分な遅延期間待機することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記第２のデータ取得手順は、より高い信号対雑音比のための長期間のデータ捕捉、スペクトル的に拡張されたデータの収集、前記第１のデータ取得手順とは異なるモダリティを使用するデータの収集、平均化のための複数の期間のデータ捕捉、信号対雑音比を増大するための変更されたレーザ出力によるデータの収集のうちのいずれか１つ以上を含むデータ収集手順を実行することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記異なるモダリティは、蛍光スペクトルおよび光吸収スペクトルのうちの１つ以上を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（ｉｉ）で使用された前記閾値を判定するための較正手順をさらに含み、前記較正手順は、（ｉ）前記ビームに対する標的粒子のラマン応答と（ｉｉ）前記ビームに対する標的粒子をともなわない前記粒子搬送媒体のラマン応答とを区別するスペクトル特徴を確立することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記較正手順は、前記区別を提供する前記ラマン応答の１つ以上のスペクトル特徴を判定することを含み、前記スペクトル特徴は、１つ以上のピーク振幅と、複数のピーク振幅と、前記ラマン応答スペクトルの１つ以上の部分下の領域と、前記ラマン応答スペクトルの少なくとも一部のプロファイルと、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（ｉｉ）で使用された前記閾値を判定するための較正手順をさらに含み、前記較正手順は、その中に粒子をともなわない前記粒子搬送媒体から基準スペクトルを取得することと、その中に粒子をともなう前記粒子搬送媒体からテストスペクトルを取得することと、前記基準スペクトルと前記テストスペクトルとの差を判定することと、前記差が前記基準スペクトルのノイズ閾値よりも大きい場合、粒子が捕捉されたと判定することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記ノイズ閾値よりも大きく、したがって（ｉ）前記ビームに対する標的粒子のラマン応答と（ｉｉ）前記ビームに対する標的粒子をともなわない前記粒子搬送媒体のラマン応答とを区別する前記テストスペクトルにおいてスペクトル特徴を確立することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
捕捉された粒子のサイズを判定するために、前記第１および／または第２のデータ取得手順で取得された前記第１のデータおよび／または前記第２のデータを使用することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項13】
捕捉された粒子のサイズを判定することは、粒子捕捉が検出されたときに、粒子をその中にともなわない前記粒子搬送媒体に特徴的なスペクトル応答信号の減少を判定することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
粒子をその中にともなわない前記粒子搬送媒体に特徴的な前記スペクトル応答信号は、前記粒子搬送媒体内に分散されたマーカからのスペクトル信号を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記マーカは、過塩素酸イオンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（ｉｖ）の後、捕捉された粒子において化学変化を開始し、かつステップ（ｉｖ）を繰り返すこと、またはステップ（ｖ）の後、前記粒子搬送媒体中の前記粒子において化学変化を開始し、かつステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すこと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
ステップ（ｉｖ）を繰り返すことにより、捕捉された粒子における化学変化をモニタリングすること、またはステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すことにより、前記粒子搬送媒体中の前記粒子における化学変化をモニタリングすること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
ステップ（ｖ）は、前記ビームを無効化または遮断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
粒子捕捉／データ取得装置であって、電磁放射ビームを生成するための電磁放射源と、
前記ビームを粒子捕捉ゾーンに向けるための集束素子と、
前記粒子捕捉ゾーンからの信号応答を検出するように構成された検出器と、
請求項１～１８のいずれかに記載の方法を実施するように構成された制御システムと、
を備える、粒子捕捉／データ取得装置。
【請求項20】
コンピュータプログラムであって、電子データ送信またはコンピュータ可読媒体によって配布可能であり、前記プログラムが粒子捕捉／データ取得装置にロードされるときに、前記装置に請求項１～１８のいずれか一項に記載の手順を実行させるように適合されたコンピュータプログラムコード手段を備える、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、捕捉された粒子からのデータ取得および捕捉された粒子の分析を可能にするための電磁ビームにおける粒子の捕捉および保持に関する。
【背景技術】
【0002】
溶液中のナノ粒子などの粒子の分析は、広範囲の研究分野のために重要なステップである。本開示の文脈における「粒子」という表現は、マイクロ粒子およびナノ粒子、ならびに電磁ビーム勾配力捕捉効果を使用して一般に捕捉することができる他の任意の物体、特にリポソームやポリマーソームなどの薬物送達システム用のポリマー粒子および小胞、ならびに細胞外小胞やエクソソームを包含することを意図する。
【0003】
粒子のサイジングと組成分析は、通常、ある範囲のレーザベース回折および分光技術を組み合わせることによって実現される。動的光散乱（ＤＬＳ）およびナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）は、一般に粒子集団サイズ分布１～３を判定するために採用されているが、組成分析は、粒子の種類およびサイズに応じて、とりわけ質量分析（ＭＳ）技術および（フーリエ変換）－赤外線（ＩＲ）分光法４～６を使用して実行することができる。サイジングと組成分析のための複数の技術への依存は、これらが濃度、調合、感度などの試料要件において異なるという欠点をもたらす。特にナノ粒子の場合、集団の不均一性はその機能と適用性に深刻な影響を与える可能性があり、これらの従来のバルク分析技術７、８では解決することができない。
【0004】
本発明の目的は、データ取得およびその後の分析のために粒子を捕捉および保持する能力の改善を容易にする方法および装置を提供することである。
【0005】
一態様によれば、本発明は、粒子分析の自動化された方法であって、
（ｉ）電磁放射ビームを粒子搬送媒体上に集束させて、ビーム内の候補粒子を捕捉するための粒子捕捉ゾーンを画定することと、
（ｉｉ）粒子捕捉をテストするための第１のデータ取得手順を実行することと、
（ｉｉｉ）粒子捕捉が検出されない場合、ステップ（ｉｉ）を繰り返すことと、
（ｉｖ）粒子捕捉が検出された場合、捕捉された粒子から粒子データを取得することと、
（ｖ）粒子を粒子捕捉ゾーンから放出するために、光ビーム強度をサブ捕捉レベルまで低減することと、
（ｖｉ）粒子搬送媒体中の連続する粒子に対してステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すことと、を含む方法を提供する。
（ｉ）電磁放射ビームを粒子搬送媒体上に集束させて、ビーム内の候補粒子を捕捉するための粒子捕捉ゾーンを画定することと、
（ｉｉ）粒子捕捉をテストするための第１のデータ取得手順を実行することと、
（ｉｉｉ）粒子捕捉が検出されない場合、ステップ（ｉｉ）を繰り返すことと、
（ｉｖ）粒子捕捉が検出された場合、捕捉された粒子から粒子データを取得することと、
（ｖ）粒子を粒子捕捉ゾーンから放出するために、光ビーム強度をサブ捕捉レベルまで低減することと、
（ｖｉ）粒子搬送媒体中の連続する粒子に対してステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すことと、を含む方法を提供する。
【0006】
ステップ（ｉｖ）は、少なくとも１つの分析モダリティを使用して粒子データを捕捉するための第２のデータ取得手順を実行することをさらに含み得る。ステップ（ｉｖ）で取得された粒子データは、第１のデータ取得手順からのデータを含み得る。第１のデータ取得手順は、粒子捕捉を示す閾値を超える所定のスペクトルプロファイルの存在を検出するのに十分なラマン応答データ収集手順を実行することを含み得る。ステップ（ｖ）は、光ビーム強度をサブ捕捉レベルまで低減した後、以前に捕捉された粒子が粒子捕捉ゾーンから周囲の媒体に移送されるのに十分な遅延期間待機することをさらに含み得る。第２のデータ取得手順は、第１のデータ取得手順よりも大きな信号対雑音比を容易にするラマン応答データ収集手順を実行することを含み得る。第２のデータ取得手順は、より高い信号対雑音比のための長期間のデータ捕捉、スペクトル的に拡張されたデータの収集、第１のデータ取得手順とは異なるモダリティを使用するデータの収集、平均化のための複数の期間のデータ捕捉、信号対雑音比を増大するための変更されたレーザ出力によるデータの収集のうちのいずれか１つ以上を含むデータ収集手順を実行することを含み得る。異なるモダリティは、蛍光スペクトルおよび光吸収スペクトのうちの１つ以上を含み得る。
【0007】
本方法は、ステップ（ｉｉ）で使用された閾値を判定するための較正手順をさらに含み得、較正手順は、（ｉ）ビームに対する標的粒子のラマン応答と（ｉｉ）ビームに対する標的粒子をともなわない粒子搬送媒体のラマン応答とを区別するスペクトル特徴を確立することとを含む。較正手順は、区別を提供するラマン応答の１つ以上のスペクトル特徴を判定することを含み、スペクトル特徴は、１つ以上のピーク振幅と、複数のピーク振幅と、ラマン応答スペクトルの１つ以上の部分下の領域と、ラマン応答スペクトルの少なくとも一部のプロファイルと、を含み得る。
【0008】
本方法は、ステップ（ｉｉ）で使用された閾値を判定するための較正手順をさらに含み得、較正手順は、その中に粒子をともなわない粒子搬送媒体から基準スペクトルを取得することと、その中に粒子をともなう粒子搬送媒体からテストスペクトルを取得することと、基準スペクトルとテストスペクトルとの差を判定することと、差が基準スペクトルのノイズ閾値よりも大きい場合、粒子が捕捉されたと判定することと、を含む。本方法は、ノイズ閾値よりも大きく、したがって（ｉ）ビームに対する標的粒子のラマン応答と（ｉｉ）ビームに対する標的粒子をともなわない粒子搬送媒体のラマン応答とを区別するテストスペクトルにおいてスペクトル特徴を確立することをさらに含み得る。
【0009】
本方法は、捕捉された粒子のサイズを判定するために、第１および／または第２のデータ取得手順で取得された第１のデータおよび／または第２のデータを使用することをさらに含み得る。捕捉された粒子のサイズを判定することは、粒子捕捉が検出されたときに、粒子をその中にともなわない粒子搬送媒体に特徴的なスペクトル応答信号の減少を判定することを含み得る。粒子搬送媒体のスペクトル信号特性は、粒子搬送媒体内に分散されたマーカからのスペクトル信号を含み得る。マーカは、過塩素酸イオンを含み得る。
【0010】
本方法は、ステップ（ｉｖ）の後、捕捉された粒子において化学変化を開始し、かつステップ（ｉｖ）を繰り返すこと、またはステップ（ｖ）の後、粒子搬送媒体中の粒子において化学変化を開始し、かつステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すこと、をさらに含み得る。
【0011】
本方法は、ステップ（ｉｖ）を繰り返すことにより、捕捉された粒子における化学変化をモニタリングすること、またはステップ（ｉ）～（ｖ）を繰り返すことにより、粒子搬送媒体中の粒子における化学変化をモニタリングすること、をさらに含み得る。
【0012】
ステップ（ｖ）は、ビームを無効化または遮断することを含み得る。
【0013】
別の態様によれば、本発明は、粒子捕捉／データ取得装置を提供し、粒子捕捉／データ取得装置は、
電磁放射ビームを生成するための電磁放射源と、
ビームを粒子捕捉ゾーンに向けるための集束素子と、
粒子捕捉ゾーンからの信号応答を検出するように構成された検出器と、
上記で定義された方法のいずれかを実施するように構成された制御システムと、を備える。
電磁放射ビームを生成するための電磁放射源と、
ビームを粒子捕捉ゾーンに向けるための集束素子と、
粒子捕捉ゾーンからの信号応答を検出するように構成された検出器と、
上記で定義された方法のいずれかを実施するように構成された制御システムと、を備える。
【0014】
別の態様によれば、本発明は、コンピュータプログラムを提供し、コンピュータプログラムは、電子データ送信またはコンピュータ可読媒体によって配布可能であり、プログラムが粒子捕捉／データ取得装置にロードされるときに、装置に上記で定義された方法のいずれか１つの手順を実行させるように適合されたコンピュータプログラムコード手段を備える。
【0015】
本発明の実施形態をこれより、例として、添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】粒子分析用の自動粒子捕捉システムの高レベルの概略図を示す。
【図5】図１のシステムを使用したリポソームおよびポリマーソームの組成分析の結果を示し、（ａ）は、ＤＰＰＣリポソーム（緑μ±σ、ｎ＝６４９）および５０％ｄーＤＰＰＣリポソーム（赤μ±σ、ｎ＝３４０）のオフセット平均ラマンスペクトル）である。（ｂ）は、期待値最大化に基づくガウス２成分混合分析であって、４４％がＤＰＰＣ、５６％がｄ－ＤＰＰＣとして分類された、ＤＰＰＣおよびｄ－ＤＰＰＣリポソーム（ｎ＝８２８）の５０－５０ｖ／ｖ％混合物のＣーＤピーク位置（２１０５ｃｍ－１）でのＣＣＤカウントのバイモーダルヒストグラムである。（ｃ）は、ＤＰＰＣおよびｄーＤＰＰＣリポソームの５０－５０ｖ／ｖ％混合物のウォード法クラスタリング樹状図（ｎ＝８２８）である。（ｄ）は、ＡＢＡポリマーソームの（赤、９９＝Ｎ）およびＡＢＡ－ヘパリンポリマーソーム（青、Ｎ＝９８）のオフセット平均ラマンスペクトルであり、挿入図は９３０および１０７０ｃｍ－１付近のヘパリン信号を示す矢印をともなう領域のクローズアップを示す。（ｅ）は、ＡＢＡおよびＡＢＡ－ヘパリンポリマーソーム（ｎ＝２６３）、成分１（上）および成分２（下）の５０－５０ｖ／ｖ％混合物の２成分ＰＣＡ分解分析である。（ｆ）は、ウォード法クラスタリング後のＰＣＡスコア（赤のＡＢＡ様、青のＡＢＡ－ヘパリン様）である。
【図6】図１のシステムを使用するポリスチレンナノ粒子の官能化分析の結果であって、（ａ）は、ＰＳナノ粒子（青の球体）の官能化パスの概略図である。アミン官能基粒子は、２－イミノチオラン（トラウト試薬）で処理され、スルフヒドリル官能基粒子になる（Ｉ）。５、５’－ジチオ－ビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を添加すると、ジスルフィド結合が形成され（ＩＩ）、システイン－チロシン－チロシン（ＣＹＹ）からなるトリペプチドと交換され得る（ＩＩＩ）。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）をジスルフィド含有粒子に添加すると、スルフヒドリル官能基が戻る。（ｂ）は、スルフヒドリル官能基（黒、ｎ＝２０１）、ジスルフィドおよびニトロ安息香酸（赤、ｎ＝１１９）、およびジスルフィドおよびＣＹＹ官能基粒子（青、ｎ＝１２２）をともなう捕捉されたＰＳ粒子の平均オフセットラマンスペクトルである。特徴的なＳ－Ｓストレッチ（４５２、５１２ｃｍ－１）、チロシンリング呼吸（Ｃ＝Ｃ８４０、８６０ｃｍ－１）、およびＳ－Ｈ曲げ（９３６ｃｍ－１）振動を示す帯域。（ｃ）は、ＴＣＥＰをジスルフィドおよびニトロ安息香酸官能基（オレンジ、ｎ＝１１９）、ならびにＣＹＹ官能基（緑、ｎ＝１１５）に添加した後のスルフヒドリルのスルフヒドリル官能基（黒、ｎ＝２０１）回復をともなう捕捉されたＰＳ粒子の平均オフセットラマンスペクトルである。
【図7】図１のシステムを使用した溶液マーカを介したサイジング分析の結果を示し、（ａ）は、溶液中の、５０ｎｍ（赤の円形）、１００ｎｍ（青の三角形）、２００ｎｍ（オレンジのひし形）のポリスチレン粒子、および５０ｍＭ過塩素酸ナトリウムを含むＰＢＳバックグラウンド（黒の四角）の１５０個の捕捉の過塩素酸比の散布図である。（ｂ）は、線形フィット（Ｒ２＝０．９９）が赤で示された、対数粒子体積に対する平均過塩素酸比である。（ｃ）は、５０ｎｍ（赤、５３．６±１３．１ｎｍ）、１００ｎｍ（青、８３．０±１５．７ｎｍ）、および２００ｎｍ（オレンジ、１６２．８±４１．５ｎｍ）のポリスチレン粒子のＤＬＳ数分布である。（ｄ～ｆ）は、ＤＬＳ（暗）によって測定され、５０ｎｍ（ｄ）、１００ｎｍ（ｅ）、および２００ｎｍ（ｆ）のポリスチレン粒子のそれぞれのガウスフィットを含むラマンスペクトル（明）からの較正曲線から計算された粒子サイズのヒストグラムである。
【図8】図１のシステムを使用するオンライン動的反応モニタリングからの結果であって、（ａ）は、プロパルギルアミンとのＥＤＣ－ＮＨＳ結合を介したアルキン部分をともなうＰＳナノ粒子の官能化およびその後のアジド酢酸とのＣｕＡＡＣ反応によるトリアゾール生成物の形成の概略図である。（ｂ）は、カルボン酸官能基（黒、ｎ＝１００）をともない、かつアルキン官能化後（青、ｎ＝１００）の捕捉されたＰＳ粒子のオフセット平均ラマンスペクトルである。２１２９ｃｍ－１において最大値をともなうアルキンピーク領域のクローズアップを示す挿入図。（ｃ）は、単一粒子捕捉集団の動態のアルキンピーク強度（青の球体、２１２９ｃｍ－１）、アジドピーク強度（赤の四角、２１１６ｃｍ－１）、およびトリアゾール生成物（黄色の三角形、１３３１ｃｍ－１）の経時的な動的トレースであり、（ｄ）は、単一粒子動態である。
【図12】ＳＰＡＲＴＡ（以下で定義）ポリマーソーム組成分析、ＰＬＳＤＡ分類の結果であり、ＡＢＡおよびＡＢＡ－ヘパリンポリマーソーム（ｎ＝２６３）の５０－５０ｖ／ｖ％混合物の３成分ＰＬＳＤＡ分類分析を示す。（ａ）は、ＰＬＳＤＡ成分１、２、および３（上から下）であり、（ｂ）は、成分１および２のＰＬＳＤＡスコア、ならびに純粋なＡＢＡ（赤、ｎ＝９９）およびＡＢＡ－ヘパリン（青、ｎ＝９８）捕捉実行を使用してモデル化した、ポリマーソーム様ＡＢＡ（赤）およびＡＢＡ－ヘパリン（青）の分類である。
【図13】捕捉数に対する分類結果を示す。ＰＣＡベースのウォード法クラスタリングによってＡＢＡ（赤）およびＡＢＡ－ヘパリン（青）の集団に分類された、ＡＢＡおよびＡＢＡ－ヘパリンポリマーソーム（ｎ＝２６３）の５０－５０ｖ／ｖ％混合物の捕捉数に対するＰＣＡ成分１。プロットは、経時的な両方の粒子の捕捉のランダムな分布を示す。
【図14】連続官能化中のポリスチレン粒子のＤＬＳ数分布の結果を示す。スルフヒドリル官能基（μ±σ）（黒、１５７．５±３４．９ｎｍ）、ジスルフィドおよびニトロ安息香酸（赤、１６６．１±４６．６ｎｍ）、ならびにジスルフィドおよびＣＹＹ官能基粒子（青、１５６．６±４３．５ｎｍ）をともなうＰＳ粒子に対するＤＬＳ数分布のガウスフィット、ジスルフィドおよびニトロ安息香酸官能基（オレンジ、１６２．１±３６．６ｎｍ）、ならびにＣＹＹ官能基（緑、１６０．３±４０．９ｎｍ）へのＴＣＥＰの添加後のスルフヒドリルの回復。
【図15】過塩素酸ラマンスペクトルの結果を示す。各々に５０ｍＭ過塩素酸ナトリウムを補った、ＰＢＳ（黒、ｎ＝２３４）および２００ｎｍポリスチレンビーズ（赤、ｎ＝３００）の平均ラマンスペクトル。過塩素酸は、９３８ｃｍ－１において単一の明確な溶液マーカピークを付与する。
【図16】クマリン色素クリックの蛍光分析結果を示す。３－アジド－７－ヒドロキシクマリン（Ａｂｓ／Ｅｍ＝４０４／４７７ｎｍ）とプロパルギルアミンで官能化された２００ｎｍポリスチレン粒子との銅触媒クリック反応により、トリアゾール生成物の形成時に蛍光が発生し、（ｎ＝３、μ±σ）クリック条件（青）、色素がない場合（赤）または硫酸銅がない場合（緑）、蛍光に変化はない。
【図17】合成後０、７、２５日目でのリポソーム、ハイブリッド小胞、ヤヌス型デンドリマーソーム（平均±標準偏差）のＳＰＡＲＴＡ分析結果を示し、複数の脂質およびポリマー成分で構成された粒子の経時的な安定性研究のためのＳＰＡＲＴＡの能力を示す。
【図18】個別に捕捉されたハイブリッド小胞の成分スコアを示すＳＰＡＲＴＡスペクトルの非負最小二乗分析を示す。合成直後および７日目に、集団の一貫したスコアが得られた。２５日目までに、これらの粒子は捕捉効率が低下するように見え、脂質とデンドリマーのスコア比が一貫して高くなった。これは、粒子の安定性の変化を示す。
【図19】非悪性乳房上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ（緑、ｎ＝１５１）および２つの乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（赤、ｎ＝８４）およびＪＩＭＴ１（青、ｎ＝１６９）に由来するＥＶのＳＰＡＲＴＡスペクトル（平均±標準偏差）を示す。
【図20】Ａ）非悪性乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ（緑、ｎ＝１５１）および２つの乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ２３１（赤、ｎ＝８４）およびＪＩＭＴ１（青、ｎ＝１６９）に由来するＥＶに対するＳＰＡＲＴＡ測定値のＰＬＳＤＡ多変量解析、およびＢ）ＰＬＳＤＡ成分の疑似スペクトルＬＶ１およびＬＶ２を示す。
【図21】可変ＰＡ／ＰＣ比（平均±標準偏差）をともなうキュボソームのＳＰＡＲＴＡ分析の結果を示し、これは、ＰＡ組成の増加とともに徐々に減少するＰＣからの７１８ｃｍ－１での第三次アミンピークの明確な存在を示す。
【図22】オンライン動的反応モニタリング機能の一部として、ＳＰＡＲＴＡを使用して酵素反応速度を測定する方法を示す。キュボソームに８０、４０、または２０Ｕ／ｍＬをスパイクした。変換は、エンドポイントコントロール（１５％ＰＣ～１５％ＰＡ）を含む、ＰＣからＰＡへの酵素濃度依存変換を示す単一粒子スケールでＳＰＡＲＴＡを使用して視覚化することができる。
【0017】
本明細書に記載されているのは、単一粒子ベースでサイズ分析および／または組成分析を提供するように構成されたラマン分光法に基づく包括的なナノ粒子分析システムまたはプラットフォームである。サイズ分析および組成分析は同時に実行され得る。ラマン分光法は、入射レーザ光子の非弾性散乱に基づく無標識組成データを提供し得る確立された特性化技術であり、複合３Ｄ画像化９を使用する場合に、単純な粉末から細胞までの試料に適用されてきた。得られたラマンスペクトルは、試料の化学成分の分子指紋を提供する。基板の寄与を交絡させることなく個々の粒子を調べるために、ラマン分光法を光捕捉と組み合わせて適用することができる。粒子は、レーザ集束によって生成された放射圧により浮揚または捕捉され得る１０、１１。レイリー限界（ｒ≪λ）におけるナノ粒子は、溶液と比較した粒子の分極率の違いにより捕捉され、それが双極子勾配力につながる。この力は、レーザ強度に比例し、焦点ボリュームからの距離が増加するにつれて減少し、レーザ１２の焦点で粒子を光捕捉に向ける。ラマン分光法の場合、これは理想的である。粒子トラップをもたらすレーザを同時に使用して、粒子のラマンスペクトルを取得することができるためである。これは、微小液滴１３、１４やシリコンナノ粒子１５などのさまざまなマイクロサイズおよびナノサイズの粒子を調査する幅広い研究のきっかけとなった。特に興味深いのは、ラマン分光法を使用して、リポソーム１２、１６やポリマーソーム１７、１８などの薬物送達システムのために配される小胞構造の組成および不均一性を分析することである。これらの粒子は、さまざまな組成、サイズ範囲、および物理的特性をともなう小胞を得るために、広範囲の両親媒性分子から作ることができる１６、１９。ラマン分光法を使用して、数マイクロメートルサイズのポリマーソームの組成を分析できることが以前に示されている２０。しかし、最近の進歩にもかかわらず、単一粒子分析のためにラマン分光法を使用することには、大きな制限がある。つまり、粒子をレーザ内に手動で捕捉するか、または基板から持ち上げる必要があるという事実である２１、２２。これにより、プロセスが遅く、かつ労働集約的であるため、分析し得る粒子の数が大幅に制限される。粒子スループットが非常に限られているため、十分な統計的検出力をともなう組成の不均一性の調査も妨げられる。
【0018】
粒子組成分析に加えて、以前の研究では、光学的に捕捉された粒子のスペクトルを長期間にわたってモニタリングすることにより、粒子表面で発生する動的なイベントまたは反応を調査する可能性が示された。例として、重合反応の観察２３、固相粒子支援ペプチド合成２４、またはリポソーム中の分析物濃度の測定２５が含まれる。捕捉された粒子のさらなる分析は、過塩素酸イオンなどの溶液マーカの添加によるマイクロメートルサイズのリポソームに対する光捕捉力の影響の調査を含む１２。加えて、過塩素酸イオンは、周囲の溶質濃度を測定するための内部標準として使用されており２５、脂質膜に対して不浸透性であることが示されている２６。
【0019】
単一ナノ粒子の大規模な積分サイズおよび組成特性化の必要不可欠性に対処するために、本発明者らは、単一粒子自動ラマン捕捉分析（本明細書では、ＳＰＡＲＴＡと称する）のための分析システムまたはプラットフォームを開発した。ＳＰＡＲＴＡは、粒子の標識付けや改変を必要とせずに、溶液中の個々のナノ粒子の高スループットルーチン分析を可能にする。ここでは、リポソームとポリマーソームシステムの組成の徹底分析、およびＳＰＡＲＴＡプラットフォームを使用して混合物を分離し、粒子の不均一性を調査する機能を実証する。粒子組成分析に加えて、ＳＰＡＲＴＡプラットフォームは、ポリスチレンナノ粒子の連続的な官能化のモニタリング、および粒子表面におけるクリック反応の動態の追跡に理想的であることを示す。最後に、高スループットの測定機能を活用することにより、過塩素酸の添加を根本的に新しい方法で使用し得、捕捉された粒子の単一粒子サイジングを可能にし得ることを実証する。ＳＰＡＲＴＡは、試料間および試料内の不均一性、複合混合物、オンライン反応モニタリング、および単一粒子の統合された同時サイジングを詳細に分析するための、多数のエキサイティングな新しい用途をもたらす。
【0020】
図１は、特にラマン分光分析に適用可能な、粒子分析用の自動粒子捕捉システムの高レベルの概略図を示す。システム１は、電磁放射線源２を備え、これは、本例では、光源であり、より好ましくはレーザである。二色性ミラー３は、集束素子８を介してレーザ放射線４を分析用の試料５に向ける。照射された試料５からの電磁放射線６は、二色性ミラー３を介して検出器７に向けられる。レーザビームの波長での試料５からの弾性散乱放射線は、検出器７で好適なフィルタ（図示せず）によってフィルタ除去され、ラマン散乱放射線は、検出器７の検出デバイスまで通過する。
【0021】
基板１０は、分析用の試料５を受容するために提供され、例えば、試料の蒸発を制限するために、好適なカバー１１で覆われてもよい。使用される場合、カバー１１は、電磁放射線４、６に対して透過的である。別の例では、カバーは、システムの対物レンズであり得る集束素子８を備え得、その結果、試料は、対物レンズと直接接触することができる（例えば、水浸）。試料５は、内部の分析用の粒子１５を搬送し得る任意の流体媒体１２を備える。「搬送し得る」という表現は、流体媒体１２自体の中またはそれによる粒子の移動または移送を可能にしながら、媒体内の粒子１５の懸濁液を提供し得る任意の流体媒体１２を包含することを意図する。例えば、粒子１５の移動／移送は、媒体１２内での拡散によるものであってもよく、もしくは媒体の流れまたは両方の組み合わせによるものであってもよい。図示の例では、試料５の体積が基板１０上で概して静的である場合、拡散は、衝突ビーム４に対する粒子１５の移動の主要なメカニズムであり得る。他の配置では、基板１０は、流体媒体１２およびその中に懸濁された粒子１５の移動をマイクロ流体制御するように構成され得、例えば、マイクロ流体チャネルを使用して、試料を所定の位置に移動させる。好ましくは、流体媒体１２は、液体である。液体は、水または少量の溶媒（例えば、エタノールまたはジメチルスルホキシド）の添加をともなってもよい水ベースの緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水または４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）などの「非不透明」または「非大量散乱」液体であり得る。
【0022】
制御システム１６は、レーザ２および検出器７に結合されて、以下に説明する機能を可能にする。
【0023】
図２に見られるように、集束された電磁放射ビーム（例えば、レーザビーム２０）は、粒子１５が懸濁している媒体１２を通過する。ビーム２０は、その焦点にウエスト部分２１を有し、これは、粒子１５が光捕捉効果または単一ビーム勾配力捕捉効果を使用して保持され得る粒子取り込みゾーン２２を画定する。高度に集束されたビーム２０は、例えば粒子１５などの微細な誘電体物体を物理的に保持および移動するために、例えば屈折率の不一致に依存する引力または反発力を提供する。捕捉ビームの波長よりも小さい直径のナノ粒子の場合、メカニズムは双極子吸収および光の再放射に基づくと理解することができる。
【0024】
重要な態様は、粒子捕捉、粒子の存在の検証、および捕捉された粒子１５からのデータ取得のための自動化されたプロセスを、個々の粒子だけでなく、数十、数百、または数千の粒子に対して連続して繰り返し提供する方法である。図３は、自動粒子捕捉およびデータ取得のプロセスフローを示し、図４は、プロセスフローにおけるさまざまな段階の概略図を示す。
【0025】
第１のステップでは、電磁放射ビーム２０（以下、「レーザビーム」２０として例示される）がオンに切り替えられ、試料５に焦点を合わせて、ビームウエスト２１における粒子捕捉ゾーン２２を画定する（ステップ３１）。第１のデータ取得手順（ステップ３２）において、ラマン散乱放射線信号６が、検出器７で検出される。このラマン信号の少なくとも一部（例えばスペクトル部分）は、粒子１５が捕捉されたかどうかを判定するために閾値に対してテストされる（ステップ３３）。粒子捕捉テストの詳細については、以下で考察する。ラマン信号から粒子が検出されない場合、および粒子捕捉が所定の回数を超えて失敗しなかった場合（ステップ３４）、プロセスが繰り返されて、閾値に対してラマン信号をテストする（ステップ３２）。第１のデータ取得手順（ステップ３２）が連続する間には短い捕捉待機期間（ステップ３５）があり得、粒子１５が、一般的な移送メカニズム、例えば媒体１２内の粒子１５の拡散によって、粒子捕捉ゾーン２２に移動する時間を与えることができる。
【0026】
ステップ３３で、粒子１５がラマン信号で検出された場合、第２のデータ取得手順が実行される（ステップ３６）。第２のデータ取得手順もまた、ラマン散乱放射線信号を検出することを含み得る。好ましくは、第２のデータ取得手順（ステップ３６）は、第１のデータ取得手順（ステップ３２）よりもはるかに高品質のデータ信号取得手順を含む。より高品質のデータ捕捉は、例えば、（ｉ）第１のデータ収集手順よりも高い信号対雑音比を得るための長期間のデータ捕捉、（ｉｉ）スペクトル的に拡張されたデータ、すなわち、より広い周波数帯域幅または周波数の選択にわたるデータの収集、（ｉｉｉ）異なるモダリティ、例えば、ラマン分光信号以外のモダリティを使用したデータの収集、（ｉｖ）平均化のための複数期間のデータ捕捉、（ｖ）信号対雑音比を高めるためのレーザ出力の変更、（ｖｉ）第１のデータ取得手順からのデータの信号対雑音比を改善するための、第１のデータ取得手順のデータに追加され、それと結合されたデータの収集のうちの任意の１つ以上を含み得る。そのような他のモダリティは、例えば、蛍光信号／スペクトル、吸収信号／スペクトル、および他の光学分光技術を含み得る。第２のデータ取得手順３６の間に取得されたデータは、続いて捕捉されたデータセットを用いて後で分析するために格納されてもよく（ステップ３６ａ）、またはリアルタイムもしくは疑似リアルタイムでオンザフライで処理／分析されてもよい。
【0027】
第２のデータ取得手順（ステップ３６）の後、ビーム２０は無効にされ（ステップ３７）、捕捉された粒子１５が、脱出待機期間または脱出遅延期間（ステップ３８）の間に粒子捕捉ゾーン２２から脱出することを可能にする。
【0028】
一配置では、第１のデータ取得手順（ステップ３２）は、１～２秒の期間のラマンスペクトルデータを収集することを含み、第２のデータ取得手順（ステップ３６）は、５～１０秒の期間のラマンスペクトルデータを収集することを含む。これらの時間は、さまざまな要因、例えば、組成またはサイズによる粒子のラマン散乱の強度、結果として生じるデータの必要な信号対雑音比、または結果として生じるデータの他の外部制約または要件を最適化するように調整することができる。
【0029】
より一般的には、第１のデータ取得手順（ステップ３２）は、粒子が存在しない状態で取得されるスペクトルプロファイルと比較して、閾値を超えるペクトルプロファイルを感知することによって、粒子の存在の検出を可能にするのに十分な程度（例えば、積分期間にわたって）にラマン応答信号を収集することを含み得る。スペクトルプロファイルは、１つのピークもしくは複数のピークの振幅および／もしくは形状、１つまたは１つ以上のピーク下の領域、ラマンスペクトルの１つ以上の部分下の領域、スペクトルの少なくとも一部の形状、またはいくつかの他の特徴を含み得る。
【0030】
プロセスループ（ステップ３１～３５）は、ステップ３４でテストされた、所定の回数ｉ（例えば、サンプリング期間の数にわたって）繰り返すことができる。許容される反復回数は、いくつかの要因に従って判定することができ、所定の反復回数（ステップ３９）内で粒子を検出できない場合、後で説明するように、プロセス全体または再較正プロセスの再開を引き起こす可能性がある。
【0031】
ステップ３７におけるビーム２０の無効化は、例えば、レーザのオンおよびオフにするためのレーザの直接制御によって、またはビームを遮断または他の方法で減衰させることによって達成され得る。これに関して、特にステップ３７において、ビーム２０を完全に遮断する必要はなく、単にビームをサブ捕捉レベル、すなわち、ビーム勾配力捕捉効果によって粒子捕捉ゾーン２２に粒子を保持するには不十分な強度レベルまで低減または減衰することに留意されたい。これは、例えば、レーザから出射し、ミラー３の前のビーム経路内に挿入される変調デバイス（図示せず）によって達成され得る（図１）。
【0032】
いくつかの場合において、第１のデータ収集手順中に捕捉されたデータは、第２のデータ収集手順の要件にも有用である、十分な信号対雑音比を有し得る。そのような場合、システムは、第２のデータ取得手順（ステップ３６）の代わりに、第１のデータ取得手順のデータを必要な高信号対雑音比データとして使用／取得し、後の分析またはリアルタイム処理のためにこのデータを保存するように構成され得る（ステップ３６ａ）。
【0033】
図４は、図３に示す手順のより詳細な態様を示す。画像４２は、媒体１２と、その中に分散された粒子１５と、を含む試料５を表す。画像４３は、粒子捕捉ゾーン２２において粒子を捕捉できなかったビーム２０を表す。この失敗は、検出器７によって検出されたラマン信号４３ａが、粒子の存在を示すであろうラマンスペクトル４３ａにおける所定の帯域４３ｃで所定の閾値４３ｂを達成できないことによって示される。対照的に、画像４４は、粒子捕捉ゾーン２２において粒子１５ａを捕捉したビーム２０を表し、これは、ラマンスペクトルの所定の帯域４４ｃで閾値４４ｂを超えて上昇するラマン信号４４ａの検出によって示される。画像４５は、第２のデータ取得手順３６を表し、その間に捕捉された粒子１５ａが粒子捕捉ゾーン２２内に長期間保持され、その間により高品質のデータ信号４５ａの取得が行われ、例えば、上で考察されたように、より高い信号対雑音比および／または他の特性を有する。画像４２に戻る制御パス４６は、レーザビーム２０の無効化、および最初に捕捉された粒子の放出後に新しい粒子を捕捉するための粒子捕捉プロセスへの回帰を表す。
【0034】
セットアップ／較正
粒子捕捉プロセスの開始前に、システム１は、ステップ３３の粒子捕捉検出条件を判定するための好適な較正手順でセットアップされ得る。このセットアップは、手動で実行されてもよく、自動化されたプロセスを使用して実行されてもよい。粒子捕捉検出条件は、ラマンスペクトルの単一の検出された特徴または複数の検出された特徴に依存し得る。図９に示すように、試料５に対して実行されるセットアップ／較正プロセスは、システム１にいくつかの収集パラメータを入力することから始まる（ステップ９１）。これらの収集パラメータは、（ｉ）迅速な収集統合期間、すなわち、ステップ３２の第１のデータ取得手順中のデータの収集のための期間（例えば、１～２秒）と、（ｉｉ）レーザ無効化時間、すなわちステップ３８の脱出待機または遅延期間（例えば、０．５秒）と、（ｉｉｉ）高ＳＮＲ積分時間、すなわち、ステップ３６の第２のデータ収集手順中のデータ収集の期間と、（ｉｖ）捕捉の試行回数、すなわち、ステップ３１～３５のループで許可された反復回数（例えば、１０）と、を含む。
粒子捕捉プロセスの開始前に、システム１は、ステップ３３の粒子捕捉検出条件を判定するための好適な較正手順でセットアップされ得る。このセットアップは、手動で実行されてもよく、自動化されたプロセスを使用して実行されてもよい。粒子捕捉検出条件は、ラマンスペクトルの単一の検出された特徴または複数の検出された特徴に依存し得る。図９に示すように、試料５に対して実行されるセットアップ／較正プロセスは、システム１にいくつかの収集パラメータを入力することから始まる（ステップ９１）。これらの収集パラメータは、（ｉ）迅速な収集統合期間、すなわち、ステップ３２の第１のデータ取得手順中のデータの収集のための期間（例えば、１～２秒）と、（ｉｉ）レーザ無効化時間、すなわちステップ３８の脱出待機または遅延期間（例えば、０．５秒）と、（ｉｉｉ）高ＳＮＲ積分時間、すなわち、ステップ３６の第２のデータ収集手順中のデータ収集の期間と、（ｉｖ）捕捉の試行回数、すなわち、ステップ３１～３５のループで許可された反復回数（例えば、１０）と、を含む。
【0035】
ついで、セットアップ捕捉シーケンスが開始され（ステップ９２）、そこで、システムは、粒子が捕捉されるまで、粒子の捕捉を繰り返し試みる。この捕捉は、例えば、標的粒子を示すことが先験的に知られているラマン応答スペクトルの一部において、得られたスペクトルの有意な変化を観察することによって検証することができる。これは、例えば、試料５のバックグラウンド信号とは大幅に異なるスペクトル信号／ピークの出現によって、または先験的に既知の／予想されたピーク（例えば、ポリスチレン粒子の捕捉を試みたときの既知のポリスチレンピークの出現）の認識によって検証することができる。ついで、スペクトルを検査して、最適なピーク（例えば、図４の４１ｃ）、または粒子捕捉ゾーン内の粒子の存在を最もよく特徴付ける他のスペクトル特徴、例えば特定のラマンスパイク４１ｃを判定することができる。換言すれば、選択されたスペクトル特徴は、ビーム２０に対する標的粒子のラマン応答と、ビームに対する標的粒子をともなわない粒子搬送媒体のラマン応答とを区別するものである。選択されたスペクトル特徴は、１つのピーク振幅、複数のピーク振幅、スペクトルの１つ以上の部分を下回る領域、スペクトルの少なくとも一部のプロファイル、または他のいくつかの特徴を含み得る（ステップ９３）。ついで、ベースラインより上の閾値レベル４１ｂが決定され（ステップ９４）、これは、粒子捕捉を示すピークの値と、粒子捕捉なしのスペクトル（例えば、スペクトル４３ａ）の通常レベルとの間にある。ついで、図３の自動捕捉シーケンスを開始することができる（ステップ９５）。
【0036】
粒子捕捉を検出するために複数の閾値を利用する代替のセットアップ／較正プロセスを図１０に示す。ボックス１００～１０４によって示されるプロセスステップは、ステップ９０～９４に対応する。このプロセスでは、ステップ１０４で第１の閾値を確立した後、レーザを無効にして（ステップ１０５）、第１のテスト粒子を放出し、新しい粒子を捕捉し（ステップ１０６）、粒子捕捉ゾーンにおける粒子の存在を特徴付ける、すなわち、ステップ１０３のものとは異なる粒子捕捉シグネチャを有する新しいスペクトル特徴を求めて選択する（ステップ１０８）。ついで、ベースラインを超える第２の閾値レベルがその特徴に対して判定され（ステップ１０９）、図３の自動捕捉シーケンスが開始され得る（ステップ９５）。
【0037】
代替の自動セットアップ／較正プロセスを図１１に示す。このプロセスでは、ステップ１１０、１１１は、図９のステップ９０および９１に対応する。この自動プロセスでは、粒子の捕捉を手動で検証する必要はない。ステップ１１２で捕捉シーケンスが開始され、スペクトルを取得するためにデータ取得手順が実行される（図３のステップ３１および３２と同様）。この取得されたスペクトルは、粒子をともなわない媒体の試料から以前に取得された基準スペクトルと比較される。取得されたスペクトルからの基準スペクトルの自動スペクトル減算が実行される（ステップ１１３）。スペクトル減算下の領域が基準スペクトルのノイズ閾値よりも大きい場合、成功した捕捉が想定され（ステップ１１４）、閾値４１ｂは、例えば、それが基準スペクトルと最も強度に異なる場合、取得されたスペクトルの一部またはすべてから確立され得る。ついで、図３の自動捕捉シーケンスを開始することができる（ステップ１１５）。
【0038】
図１を参照して上記で概説したように、システムは、自動単一粒子捕捉およびラマンスペクトルの取得のために、レーザ２、検出器（カメラおよび分光器）７が制御システム１６によって同時に制御されるハイエンド共焦点ラマン分光法セットアップに基づく。包括的な粒子分析のためのＳＰＡＲＴＡの適用を可能にするために、図２に概略的に示すように、３つの異なる操作モードを展開することができる。
【0039】
画像２４によって示される第１のモードは、溶液中の単一粒子の高品質ラマンスペクトルの取得による官能化および組成分析２４ａ、２４ｂを含み、粒子１５ｂ～１５ｇの範囲によって示されるそれらの組成の調査および特定の官能基の存在の検証を可能にするものであり、例えば１５ｂ、１５ｃ、１５ｄは、（異なる色で示すように）異なる組成を有し、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇは、コア組成が同じであるが、（異なる色のコロナで示すように）表面上の官能基が異なる。ＳＰＡＲＴＡシステム１は、従来の手動技術を使用して各粒子を捕捉する必要がある既存の手動システムと比較して、数百の粒子の自動分析を可能にするという重要な利点を有する。分析可能な粒子数の自動化およびスケールアップにより、単一粒子ベースおよび粒子の複合混合物の母集団レベルの両方で粒子分散を分析する手段が可能となる。
【0040】
画像２５によって示されるＳＰＡＲＴＡシステム１の第２のモードは、溶液マーカを媒介させたサイジング分析である。高スループット単粒子分析を過塩素酸イオン標準と組み合わせることにより、本発明者らは、その組成情報を取得するのと同時に、粒子捕捉ゾーン２２内の粒子１５のサイズを推定し得ることを示した。粒子捕捉ゾーン２２に入る粒子１５は、その過塩素酸イオン溶液の体積（媒体１２に対応する）を粒子捕捉ゾーン２２から変位させる。既知のサイズの捕捉粒子に対する、ラマンスペクトルの過塩素酸信号の減少を測定することにより、ビーム２０の共焦点体積よりも小さいという条件で、ラマンスペクトルの過塩素酸信号を粒子捕捉ゾーン２２の粒子１５のサイズに関連付けるための検量線を取得することができる。これにより、組成データを同時に収集しながら単一粒子ベースでの粒子のサイジングが可能になり、これまでいくつかの分析手法を組み合わせて使用する必要があり、サイズおよび組成を粒子ごとのベースで比較することができなかった粒子サイズおよび組成の直接取得および相関が可能になる。したがって、一般的な態様では、捕捉された粒子のサイズは、粒子捕捉が検出されたときに、内部に粒子をともなわない粒子搬送媒体に特徴的なスペクトル応答信号の減少を測定することによって判定することができる。内部に粒子をともなわない粒子搬送媒体に特徴的なスペクトル応答信号は、溶液マーカが標的粒子のスペクトル応答とは異なるスペクトル応答を有する、粒子搬送媒体内の溶液マーカのスペクトル応答信号を含み得る。
【0041】
画像２６に示すＳＰＡＲＴＡシステム１の第３のモードは、オンラインの動的反応モニタリングであり、単一粒子上の動的イベントの進行を追跡する。これは、反応の継続中に単一の粒子を粒子捕捉ゾーン内に保持するか、後続の時点で新しい粒子を捕捉して、粒子ごとに反応の進行を比較することによって実現し得る。この手法の単一粒子サンプリングの態様により、反応速度の調査が可能になり、触媒の利用可能性によって制限される反応の場合のように、反応が各粒子上で同じ速度で同時に発生するのか、特定の単一粒子で同時に発生するのかを特定することができる。これらの結果は、従来の方法で追跡できるバルクダイナミクスとさらに相関させることができる。
【0042】
前述のアプリケーション領域を容易にするために、図４に関連して前で考察されたように、捕捉プロセスに対する広範な制御が提供される。スペクトル取得の前に、ユーザーは、セットアップおよび／または較正手順の一部として、例えばソフトウェアインターフェースを通していくつかのパラメータを定義することができる。これらのパラメータは、必要とされる第２のデータ取得手順（ステップ３６）の取得の数（ｎａ）（例えば、データ捕捉が必要とされる粒子の数）と、粒子を捕捉するための反復の回数（すなわち、プロセスステップ３１～３５の反復の回数）と、第２のデータ収集手順のパラメータ（高ＳＮＲ取得の持続時間）と、各粒子捕捉間のレーザ無効化の持続期間（ステップ３７）と、を含み得る。
【0043】
自動粒子捕捉認識を可能にするために、画像４１（図４）に示す較正プロセスを実行することができる。初期粒子１５ａが捕捉され得、スペクトル４１ａにおける特徴的なピーク４１ｃが、その中央値の高さ、またはノイズ／バックグラウンドレベルを超える高さとともに、閾値４１ｂとして選択される。これにより、選択されたピーク４４ｃが反復取得中に閾値強度４４ｂを超える場合、粒子捕捉のテスト（ステップ３３）が提供される。次に、取得反復ループが開始される（ステップ３１～３５）。閾値化ピークが反復スペクトル４３ａの閾値強度４３ｂを超えていない場合、最大１０回の反復を実行することができる。これらの反復のいずれかの間にピーク信号４３ｃが選択された閾値４３ｂを超えられなかった場合、粒子捕捉は失敗として登録され、レーザは一時的に無効にされ得る（ステップ３５ａ）。成功した粒子捕捉が認識されると（画像４４）、捕捉された粒子１５の高ＳＮＲスペクトルを得る（ステップ３６）ために、より長い取得が行われる。レーザをオフにすることでビームを一時的に無効にして（ステップ３７）、粒子を拡散させる。この反復プロセスでは、粒子捕捉が成功した場合にのみ、より長い高ＳＮＲスペクトルの取得が許可されるため、捕捉の試行および取得のターンオーバーがはるかに高くなることを可能にする。捕捉された各粒子について、取得パラメータ、時間、および反復回数は、画像４７に示すように、検証および後処理に使用するために、高ＳＮＲスペクトルデータとともに捕捉ログファイルに記録することができる。反復回数は、反復回数チェックにおいて適切なレーザ無効化時間を検証するために使用される。閾値化強度の最初の設定が低すぎた場合は、スペクトルを閾値後処理にかけて、「誤検出」捕捉を拾い出すこともできる。宇宙スパイクの除去、ベースライン減算、および正規化を含む、従来のラマンスペクトル処理を後で実行することができる。
【0044】
適切なレーザ無効化時間（ステップ３７）により、粒子捕捉が一時的に解除され、粒子が拡散する。これは、粒子の重複分析を回避するために重要となり得る。図４ｂに見られるように、無効化時間３７が短すぎる場合、例えばレーザが点滅するだけの場合、成功した捕捉の９０％以上が第１の反復において発生することになる。これは、同じ粒子が拡散し得る前に繰り返し捕捉されている可能性が高いことを表す。０．５～１秒のレーザ無効化時間は、図４ｃに見られる０．５秒のレーザ無効化時間の場合のように、第１の反復回数で粒子捕捉の１％未満を確実に達成するのに十分であることがわかる。これは、文献２７で報告されている拡散速度と一致している。したがって、好ましいレーザ無効化時間は、少なくとも０．５秒である。図４ｃに見られるように、粒子捕捉のピーク確率は６回の捕捉試行で発生する。加えて、スペクトルを取得する反復回数は、例えば、レーザ出力の変動により、スペクトルのピーク強度に影響を与えないことが検証された。これは、図４ｄに見られるように、各反復回数における捕捉の１４５０ｃｍ－１（ＣＨ２振動）での特徴的なピークのピーク強度を比較することによって行われた。反復回数１の捕捉を除いて、成功した捕捉の反復回数によるピーク強度への大きな影響はない。
【0045】
官能化および組成分析
ＳＰＡＲＴＡシステムの主要な動作モードは、図２の画像２４、２４ａ、２４ｂに概略的に示す単一粒子の官能化および組成分析である。ここでは、さまざまな組成の粒子（粒子１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ）、または同じコア組成をともなうが、さまざまな表面官能基をともなう粒子（粒子１５ｅ、１５ｆ、１５ｇ）のいずれかが分析される。これは、１、２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）リポソーム、およびｄ－ＤＰＰＣリポソームと呼ばれるＤＰＰＣ含有量に対して５０％重水素化ＤＰＰＣを含むリポソームを捕捉することによって実証された。２つの試料のラマンスペクトル（図５ａ）では、ｄ－ＤＰＰＣリポソームのスペクトルにおける約２１０５ｃｍ－１付近で明確なＣ－Ｄ信号が観察され得るが、これはＤＰＰＣリポソームには存在しない。高スループットの自動操作により、粒子の混合物を分析および分離することができる。これを実証するために、ＤＰＰＣリポソームおよびｄ－ＤＰＰＣリポソームの５０－５０ｖ／ｖ％混合物を作った。ＳＰＡＲＴＡを用いて、数百の粒子を捕捉し、２１０５ｃｍ－１でのＣ－Ｄ振動の強度のヒストグラムに基づくガウス混合分析によってスペクトルを分析した。これにより、ＤＰＰＣおよびｄ－ＤＰＰＣの捕捉のそれぞれ４４％および５６％をカバーするヒストグラム（図５ｂ）の明確な二峰性分布が得られ、混合物を明確に分離し得ることが示された。代替的に、ウォードの樹状図（図５ｃ）に見られるように、混合物はクラスター分析によって分離することができ、重水素化されていない集団および重水素化された集団に関連するスペクトルの２つの主要なクラスターが示される。重水素化されていないクラスのスペクトルでは、小さな重水素信号が観察され、これは、重水素化されたリポソームと重水素化されていないリポソームとの間の脂質交換に起因する可能性がある。重水素含有分子は非常に強力なラマン散乱体２８であるため、検出可能なラマン信号を生成するために必要な重水素化分子の割合はごくわずかである。
ＳＰＡＲＴＡシステムの主要な動作モードは、図２の画像２４、２４ａ、２４ｂに概略的に示す単一粒子の官能化および組成分析である。ここでは、さまざまな組成の粒子（粒子１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ）、または同じコア組成をともなうが、さまざまな表面官能基をともなう粒子（粒子１５ｅ、１５ｆ、１５ｇ）のいずれかが分析される。これは、１、２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）リポソーム、およびｄ－ＤＰＰＣリポソームと呼ばれるＤＰＰＣ含有量に対して５０％重水素化ＤＰＰＣを含むリポソームを捕捉することによって実証された。２つの試料のラマンスペクトル（図５ａ）では、ｄ－ＤＰＰＣリポソームのスペクトルにおける約２１０５ｃｍ－１付近で明確なＣ－Ｄ信号が観察され得るが、これはＤＰＰＣリポソームには存在しない。高スループットの自動操作により、粒子の混合物を分析および分離することができる。これを実証するために、ＤＰＰＣリポソームおよびｄ－ＤＰＰＣリポソームの５０－５０ｖ／ｖ％混合物を作った。ＳＰＡＲＴＡを用いて、数百の粒子を捕捉し、２１０５ｃｍ－１でのＣ－Ｄ振動の強度のヒストグラムに基づくガウス混合分析によってスペクトルを分析した。これにより、ＤＰＰＣおよびｄ－ＤＰＰＣの捕捉のそれぞれ４４％および５６％をカバーするヒストグラム（図５ｂ）の明確な二峰性分布が得られ、混合物を明確に分離し得ることが示された。代替的に、ウォードの樹状図（図５ｃ）に見られるように、混合物はクラスター分析によって分離することができ、重水素化されていない集団および重水素化された集団に関連するスペクトルの２つの主要なクラスターが示される。重水素化されていないクラスのスペクトルでは、小さな重水素信号が観察され、これは、重水素化されたリポソームと重水素化されていないリポソームとの間の脂質交換に起因する可能性がある。重水素含有分子は非常に強力なラマン散乱体２８であるため、検出可能なラマン信号を生成するために必要な重水素化分子の割合はごくわずかである。
【0046】
ＳＰＡＲＴＡを用いて、組成のより微妙な違いも検出することができる。これは、ナノ粒子分析、特にナノ材料の組成の正確な定義が最も重要であるが、しばしば実現が難しいナノ医療の分野で高い関連性がある。これを実証するために、ポリマーソームの２つの製剤を作った。１つは、ポリ（２－メチルオキサゾリン－ｂ－ジメチルシロキサン－ｂ－２－メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ－ｂ－ＰＤＭＳ－ｂ－ＰＭＯＸＡ）であって、ＡＢＡとも表記されるものであり、もう１つは、Ｎａｊｅｒらによって記載された２９ように調製された、ＡＢＡに２５重量％のＰＤＭＳ－ｂ－ヘパリンを補充したものであって、ＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームと称されるものである。粒子のＳＰＡＲＴＡ分析（図５ｄ）は、両方の調製物のＰＤＭＳ（表２）に起因すると考えられ得る特徴的なピークを示した。ＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームから得られたスペクトルでは、挿入図の矢印で示されているように、追加のピークが見られ、ヘパリンの糖単位に割り当てられる。さらに、４９０および７０９ｃｍ－１でのＰＤＭＳピークの正規化されたスペクトルの曲線下の平均面積（表２）は、ＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームの方が低く、ＡＢＡポリマーソームと比較して１：０．８９８の比率である。これは、ＰＭＯＸＡ－ｂ－ＰＤＭＳ－ｂ－ＰＭＯＸＡおよびＰＤＭＳ－ｂ－ヘパリンブロック共重合体の分子量および添加量から計算した、ＡＢＡおよびＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームのそれぞれ８３および７０重量％ＰＤＭＳに対応する１：０．８４３の理論比と極めてよく一致している。次に、ＡＢＡおよびＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームの５０－５０ｖ／ｖ％混合物を作り、ＳＰＡＲＴＡで分析した。これらの混合物は、主成分分析（ＰＣＡ）などの教師なし分類、または純粋な母集団からのデータを使用してモデルを構築し、続いて混合物中の粒子から得られたスペクトルを分類するために適用される主要最小二乗判別分析（ＰＬＳＤＡ）などの教師あり方法のいずれかによって分解することができる。２成分ＰＣＡモデル（図５ｅ）は、主にＰＤＭＳ組成の変動に基づいて、２つのクラスターに明確に区別されていることを示す。ＰＣＡベースのウォード法クラスタリングでは、スペクトルの４９％がＡＢＡ様ポリマーソームとして分類され、４７％がＡＢＡ－ヘパリン様ポリマーソームとして分類され、４％がこれらのクラスターのいずれにも属さないものとして分類された（図５ｆ）。ＰＬＳＤＡを使用して、ベネチアンブラインドクロス確認（１０分割）によってＡＢＡポリマーソームに対して１００％の感度および９７．９％の特異性を達成した純粋な粒子のモデルに基づいて、取得したスペクトルの３８％をＡＢＡポリマーソームとして、６２％をＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームとして分類した（図１２）。いずれかのタイプのポリマーソームが時間依存性なしにランダムに捕捉されたことを検証するために、ＰＣＡ成分１のスコアを捕捉数に対してプロットした。その結果、ポリマーソームクラスが経時的にランダムに分布し、どちらの組成でも経時的に偏りがないことが証明された（図１３）。
【0047】
ＳＰＡＲＴＡは、デンドリマー小胞などの機能性膜粒子の調査にも使用することができる。小胞膜中のポリマーおよび脂質成分の組み合わせは、それらが増大した強靭性、透過性および表面機能性を提供する薬物送達、感知または他の用途が可能な刺激応答性粒子に追加の可能性を与え得る。ハイブリッド小胞は、より伝統的な脂質とヤヌス型デンドリマーを組み合わせた膜特性の微調整を可能にする。異なる化学組成とサイズとの不一致によって、課題が生じる。さらに、そのような新規粒子を送達媒介物として使用することを目的として、安定性が重要である。
【0048】
ここでは、脂質小胞、ヤヌス型デンドリマー小胞、およびハイブリッド小胞はすべて、同一の捕捉パラメータを使用したＳＰＡＲＴＡシステムおよび手法で測定された。図１７のデータは、脂質およびポリマーの組み合わせを含む、さまざまな錯体製剤の個々の小胞の集団を捕捉することで、明確なスペクトルプロファイルが得られたことを実証する。分析は、捕捉効率がすべての小胞で最初の７日間維持されたが、デンドリマーおよびハイブリッド粒子では２５日間で大幅に低下したことを示す。これは、この時間枠での組成間の粒子安定性の検出可能な変化を示す。
【0049】
「捕捉効率」という用語は、閾値を超える捕捉信号をもたらし、かつ記録されている高ＳＮＲ捕捉スペクトルの取得をもたらした、開始された捕捉取得のパーセンテージを示すために使用される。この実験では、アルゴリズムは、高ＳＮＲ捕捉取得を開始する前に、粒子が安定して捕捉されているかどうかを検出する１０回の試行を開始した。信号が閾値を超えなかった場合、捕捉は記録されず、次の取得が試行された。したがって、捕捉効率は、開始された取得の過程で一貫したパラメータを使用して試料がどの程度確実に捕捉されたかを示す（通常は実行ごとに２００～３００）。
【0050】
同じ捕捉パラメータを使用して異なる時間に粒子を捕捉する効率を比較することにより、経時的な試料間の試料の安定性／一貫性を評価することができる。例として、２００の捕捉を開始し、１５０の捕捉が成功した場合（つまり、１０回の試行の１つで閾値を超え、高ＳＮＲスペクトルが記録された場合）、捕捉効率は７５％となる。これはシステムパラメータに大きく依存する（例えば、閾値が低いと、人為的に効率が高くなる可能性がある）ため、一貫性を比較するには、システムパラメータを同一にする必要がある。
【0051】
いくつかの化学的に異なる成分で構成された複合粒子を個別に測定し、粒子ごとに成分の特徴を抽出した。図１８では、信号は、既知のハイブリッド小胞成分の非負最小二乗（ＮＮＬＳ）フィッティングに基づいて成分フィットに分解される。フィッティングは、粒子ごとに、合成後に経時的に発生した安定性／組成の相対的な変化を示す。
【0052】
細胞外小胞（ＥＶ）も、ＳＰＡＲＴＡによって分析した。ＥＶは、実質上すべてのタイプの細胞から排出される脂質、タンパク質、および核酸の混合物からなる複合小胞であり、この例では、約３０～３００ｎｍのサイズ範囲（アポトーシス小体は最大１０００ｎｍ）のエクソソームおよび微小胞の混合物で構成される。非悪性乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）および２つの乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＪＩＭＴ１）を体外培養し、ウシ血清由来ＥＶによる汚染を避けるために、ＥＶを無血清条件下で生成および採取した。ＥＶは限外ろ過を介して濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィを使用して精製し、ＥＶ画分から可溶性タンパク質を除去した。約１Ｅ１１ｐ／ｍｌの濃度のＥＶをＳＰＡＲＴＡで分析した結果、図１９に示す個々のＥＶの詳細な組成スペクトルが得られた。
【0053】
部分最小二乗判別分析（ＰＬＳＤＡ）を使用して、ＥＶスペクトル母集団間の統計的差異を調査した。ＰＬＳＤＡを用いてモデルを構築して、割り当てられたＥＶ母集団を可能な限りクラスタリングかつ分類するようにし、試料ＥＶのスペクトルがクラスの１つ（特異性および感度）に該当するとどの程度良く予測し得るかを計算する。これらの計算は、ＭａｔｌａｂのＰＬＳツールボックス（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて実行された。ＰＬＳＤＡモデルは、潜在変数（ＬＶ１およびＬＶ２）として疑似スペクトルを構築し、スペクトルへのＬＶの関連する寄与に基づいて各試料スペクトルにスコアを割り当てることによって構築される。
【0054】
図２０に示すように、癌性（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＪＩＭＴ１）ＥＶと非癌性（ＭＣＦ１０Ａ）ＥＶとの間にクラスタリングおよび分離があり、癌性ＥＶ母集団内で明確な区別があった。図２０Ａでは、クラスターは十分に分離されており、ＭＦ１０Ａのスコアは、ＬＶ１およびＬＶ２で負、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ＬＶ１ではほとんど負で、ＬＶ２では正、ＪＩＭＴ１は、ＬＶ１では正で、ＬＶ２では混合される。ＬＶでの正のスコアは、試料スペクトルが図２０ＢにプロットされているＬＶ疑似スペクトルに似ていることを意味する。ＬＶでの負のスコアは、試料スペクトルがＬＶの逆（または負のピーク）に似ていることを意味する。このように、ＭＣＦ１０ＡとＭＤＡ－ＭＢ－２３１とのＥＶの違いは、ＬＶ２の負または正の寄与のいずれかにあることがわかる。この分析から、（例えば）試料がどの程度異なるか、試料がさまざまなクラスターにどの程度良く分類されるか、どのスペクトル特徴がこの違いに最も寄与するかを判断することができる。
【0055】
さらに、ＥＶクラスター間のクロス確認された感度および特異性は、＞９４％であった（表１）。これは、単一ＥＶの特性化のためのＳＰＡＲＴＡの機能を実証する。
【表1】
【0056】
感度および特異性は、ＰＬＳＤＡ分析から直接得られ、クラスター内の試料をどの程度良く区別することができるかを統計的に定量化する。感度は、真陽性（クラス１であり、かつクラス１として識別される）と偽陰性（クラス１であり、かつクラス１として識別されない）との比率であり、次のように計算される。
【数1】
【0057】
特異性は、真陰性（クラス１ではなく、かつクラス１として識別されない）と偽陽性（クラス１ではないが、クラス１として識別される）との比率であり、次のように計算される。
【数2】
【0058】
これらの数値（パーセンテージを示すために１００を掛けることもある）は、診断テストがどの程度良く機能するかを示すために、文献で頻繁に使用される。この場合、ＳＰＡＲＴＡは癌性ＥＶと非癌性ＥＶとをどの程度良く区別するか、かつ２つの癌タイプをどの程度良く区別するかに関連している。
【0059】
小胞系に加えて、多種多様な固体ナノ粒子の組成およびサイジングは、薬物送達から触媒作用までの幅広い用途で非常に重要である３０、３１。成功したナノ粒子官能化の分析および検証のためのＳＰＡＲＴＡプラットフォームの使用を有効にするために、ジスルフィド交換を介したポリスチレン（ＰＳ）ナノ粒子の順次官能化に基づくモデルシステムを考案した（図６ａ）。平均サイズが２００ｎｍの市販のアミン官能化ＰＳ粒子を、２－イミノチオランの添加によりスルフヒドリル官能化した。遠心分離および再懸濁による精製後、９３６ｃｍ－１付近のＳ－Ｈ曲げ振動から生じるスペクトルの信号からわかるように、スルフヒドリルの存在を検証するＳＰＡＲＴＡプラットフォームを用いて粒子を分析した（表２）（黒）（図６ｂ）。次に、スルフヒドリル官能化粒子と反応してジスルフィド結合を形成する超過量の５、５’－ジチオ－ビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を添加した。さらに精製した後、ラマンスペクトル（赤）は、ジスルフィド結合の明確な存在を示した。これらの結合は動的共有結合であるため、スルフヒドリル官能基を含む別の部分を添加すると交換可能である。ナノ粒子のペプチド官能化は、特に薬物送達の分野３２、３３で望ましく、かつ広く使用されている戦略であるため、システインおよび２つのチロシン（ＣＹＹ）からなるトリペプチドの添加によってこれを実証した。システイン残基は、スルフヒドリル官能基を提供し、チロシンは、芳香族Ｃ＝Ｃ結合により特徴的なラマンピークを呈示する。精製された粒子にペプチドを添加すると、溶液は、特徴的に黄色に変わり、２－ニトロ－５－チオベンゾエト－ジアニオン（ＴＮＢ２－）が形成されたことを実証した。これは、ジスルフィド交換が起こったことを示し、粒子へのトリペプチドの特定の結合を確認した。精製後、特徴的なチロシンピーク（青）の存在を示す、粒子のラマンスペクトルを取得した。サイクルを完了するために、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）をジスルフィド含有粒子溶液のいずれかに添加して、スルフヒドリル官能基を回復させることができる（図６ｃ）。各ステップで、粒子のサイズ分布がＤＬＳによって測定され、連続的な官能化および精製中の粒子の安定性が検証された（図１４）。
【表2】
【0060】
溶液マーカを介したサイジング分析
ＳＰＡＲＴＡシステムの第２のモードでは、高ＳＮＲ組成スペクトルの取得とともに、トラップ内の粒子サイズを同時に推定することができる。図２の画像２５に示すように、トラップに入る粒子は、共焦点ボリュームから、周囲の溶液のうちのそれ自体と同じボリュームを変位させ、それは、測定されたスペクトルにおける過塩素酸信号の減少につながる。過塩素酸は、９３８ｃｍ－１付近に単一の鋭いラマンピークがあるため、この用途に特に好適である（図１５）。ポリスチレン信号は、共焦点ボリューム内の粒子サイズが大きくなると増加するため、過塩素酸信号は、以下に従うスペクトルへの比率の寄与によって最もよく定量化される：過塩素酸の
。ここで、Ａｔは、スペクトルの曲線下の領域全体であり、Ａｐは、過塩素酸のピークのための領域である。Ａｐがゼロに近づくと、比率は増加し（トラップが粒子で完全に埋まる）、ＡｐがＡｔに近づくと、比率はゼロになる（粒子なし）。
ＳＰＡＲＴＡシステムの第２のモードでは、高ＳＮＲ組成スペクトルの取得とともに、トラップ内の粒子サイズを同時に推定することができる。図２の画像２５に示すように、トラップに入る粒子は、共焦点ボリュームから、周囲の溶液のうちのそれ自体と同じボリュームを変位させ、それは、測定されたスペクトルにおける過塩素酸信号の減少につながる。過塩素酸は、９３８ｃｍ－１付近に単一の鋭いラマンピークがあるため、この用途に特に好適である（図１５）。ポリスチレン信号は、共焦点ボリューム内の粒子サイズが大きくなると増加するため、過塩素酸信号は、以下に従うスペクトルへの比率の寄与によって最もよく定量化される：過塩素酸の
【数3】
【0061】
モデルシステムとして、溶液に５０ｍＭの過塩素酸ナトリウムを添加した後、ＳＰＡＲＴＡプラットフォームを用いて２００、１００、および５０ｎｍのポリスチレン粒子を分析した。過塩素酸の比率はさまざまなサイズ間で異なり、重複が最小限の帯域幅内にあることがわかった（図７ａ）。平均比は、対数粒子体積（メーカー指定のサイズから計算）に対してプロットすることができ、優れた線形相関（Ｒ２＝０．９９）が得られる（図７ｂ）。検量線の線形フィットを使用して、ＳＰＡＲＴＡシステムで捕捉された個々の粒子の粒子サイズを推定することができる。これらのサイズを、粒子の対応するＤＬＳ数分布（図７ｃ）と同一にビニングし、サイズ分布のヒストグラム（図７ｄ～７ｆ）を生成した。ＤＬＳおよびＳＰＡＲＴＡのサイズ測定値を比較する主な手段は、分布の広さである。これは、標準偏差（σ）および平均（μ）の商の２乗である多分散指数（ＰＤＩ）によって特徴付けることができる。各粒子サイズについて、ＳＰＡＲＴＡ溶液マーカを介したサイジング分析によって得られたＰＤＩは、ＤＬＳによって測定されたものよりも大幅に低く、正確な単一粒子サイジング分析に対するＳＰＡＲＴＡの能力を実証する。
【0062】
オンライン動的反応モニタリング
ＳＰＡＲＴＡプラットフォームの第３の用途は、図２の画像２６に概略的に示すように、反応のタイムスケール中の単一粒子上で、または母集団からのさまざまな単一粒子の連続サンプリングを介した、オンライン動的反応モニタリングの機能である。これにより、２つの異なる反応シナリオを区別することができる。この場合、母集団全体で反応が同時に均一に進行するシナリオ、および異なる粒子上で反応が順次開始されるシナリオである。
ＳＰＡＲＴＡプラットフォームの第３の用途は、図２の画像２６に概略的に示すように、反応のタイムスケール中の単一粒子上で、または母集団からのさまざまな単一粒子の連続サンプリングを介した、オンライン動的反応モニタリングの機能である。これにより、２つの異なる反応シナリオを区別することができる。この場合、母集団全体で反応が同時に均一に進行するシナリオ、および異なる粒子上で反応が順次開始されるシナリオである。
【0063】
モデルシステムを使用して、銅触媒によるアジドーアルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応のダイナミクスを調査した。これは、ナノ粒子の官能化に頻繁に採用されるクリック反応の一種である３４、３５。ＥＤＣーＮＨＳを介したプロパルギルアミンと平均サイズ２００ｎｍのカルボキシル化ＰＳ粒子との結合を介して、アルキン官能基をともなうポリスチレン粒子が得られた。続いて、このアルキンを銅触媒の存在下でアジド含有部分と反応させ、トリアゾール環を形成させた（図８ａ）。ＳＰＡＲＴＡによって、２１２９ｃｍ－１において特徴的なラマンピークを示すポリスチレン粒子のアルキン官能化の成功を検証した（図８ｂ）。続いて、単一粒子を順次捕捉するか、単一粒子をトラップ内に連続的に保持しながら、ＣｕＡＡＣ反応を実施した。反応物のアルキンおよびアジドの両方の信号は、経時的に明らかに減少し、トリアゾール生成物のピーク強度は逆の傾向で増加する（図８ｃ）。約８分後に、反応を観察した。代わりにトラップ内に単一の粒子を保持し、反応の継続期間中連続的にスペクトル変化をモニタリングするようにシステムを適応させると、同様の反応の傾向がもたらされたが、触媒の活性化と約３０～６０秒の第１のスペクトルの取得との間の追加のリードタイムを考慮すると、２分以内に反応が完了することを示した。さらに、アルキン官能化粒子での反応が成功したことを検証するために、３－アジド－７－ヒドロキシクマリンのトリアゾール生成物は特徴的な蛍光発光（Ａｂｓ／Ｅｍ＝４０４／４７７ｎｍ）をもたらすので、ＵＶ－ＶＩＳ蛍光によって３－アジド－７－ヒドロキシクマリンと粒子との反応をモニタリングした。色素および反応条件の存在下では、蛍光は徐々に増加し、３０分以内に横ばいになり始める（図１６）。
【0064】
ＳＰＡＲＴＡは、キュボソーム小胞の分析にも使用された。キュボソームは、コレステロール、モノオレイン、およびさまざまな比率のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）で構成される立方相脂質ナノ粒子である。図２１に示すように、このＰＡ／ＰＣの比率は、ＳＰＡＲＴＡを使用して単一粒子ベースで明確に視覚化された。主な違いは、ＰＣヘッドグループに起因する７１８ｃｍー１における第三級アミンピークの変化であり、ＰＡ／ＰＣ比の増加とともに減少した。
【0065】
さまざまなキュボソーム製剤の組成分析に加えて、ＳＰＡＲＴＡを使用して、酵素を介したＰＣの加水分解のダイナミクスを追跡してＰＡヘッドグループを形成した。対照試料および試料を加水分解する酵素をスパイクした試料を測定し、酵素活性の反応速度をナノ粒子基板上で測定した。ここでは、個々の粒子が捕捉され、測定され、放出された。ついで、粒子を捕捉ボリュームの外側に拡散させてから、別の粒子を引き続き捕捉して測定した。図２２の結果は、酵素の濃度が異なると、個々の粒子上で測定された反応速度が大幅に変化したことを示す。このように個々の粒子を追跡することにより、試料内の不均一性および時間の関数としてのキュボソーム／ナノ粒子の組成に対する酵素（または潜在的に他の活性因子）の活性を理解することができる。
【0066】
考察
ＳＰＡＲＴＡプラットフォームは、回折限界よりも小さい粒子の同時無標識多重パラメータ、非破壊特性化を可能にする。これは、光捕捉の効率と、組成および官能化を測定するためのラマン分光法の確立された感度、ならびに自動化による高スループットとを兼ね備える。さまざまなリポソームおよびポリマーソームの組成を含む複数のナノ粒子製剤の効率的な捕捉およびスペクトル分析、ならびにポリスチレン粒子の連続的な化学的官能化を実証した。同時に、溶液マーカとして過塩素酸を添加することにより、単一粒子のラマン散乱のみに基づいて粒子サイズおよび分布を評価することが初めて可能となった。さらに、母集団試料または個々のナノ粒子のいずれかの表面上で発生する銅化学クリック反応をモニタリングすることにより、このプラットフォームの時間分析機能を実証した。これらの粒子の大きな試料の自動評価は、ナノ粒子システムの不均一性への新しい洞察を提供し、亜集団を調査し、無数の試料設計の動的組成変化をモニタリングすることができる。
ＳＰＡＲＴＡプラットフォームは、回折限界よりも小さい粒子の同時無標識多重パラメータ、非破壊特性化を可能にする。これは、光捕捉の効率と、組成および官能化を測定するためのラマン分光法の確立された感度、ならびに自動化による高スループットとを兼ね備える。さまざまなリポソームおよびポリマーソームの組成を含む複数のナノ粒子製剤の効率的な捕捉およびスペクトル分析、ならびにポリスチレン粒子の連続的な化学的官能化を実証した。同時に、溶液マーカとして過塩素酸を添加することにより、単一粒子のラマン散乱のみに基づいて粒子サイズおよび分布を評価することが初めて可能となった。さらに、母集団試料または個々のナノ粒子のいずれかの表面上で発生する銅化学クリック反応をモニタリングすることにより、このプラットフォームの時間分析機能を実証した。これらの粒子の大きな試料の自動評価は、ナノ粒子システムの不均一性への新しい洞察を提供し、亜集団を調査し、無数の試料設計の動的組成変化をモニタリングすることができる。
【0067】
ＳＰＡＲＴＡプラットフォームは、粒子上の動的プロセスを追跡するための無標識の化学的および時間的分解能をともなう単一モダリティ内のナノ粒子の化学組成、官能化、およびサイズを研究する最初の自動化システムを表す。ＳＰＡＲＴＡプラットフォームは、ポリマーおよび脂質システムに最適であるが、独自の振動スペクトルをともなう広範囲の粒子製剤に合わせて拡張することができる。本明細書に記載の技術は、基本的な特性によって制限される。この技術は、粒子捕捉力勾配を生成するための濁度の低い試料、重複しないスペクトル特性をともなう組成、数分から数時間までの間に発生する動的プロセス、および低レベルのバックグラウンドが捕捉された粒子の測定に寄与するように十分に低い試料濃度に特に適している。これらの考慮事項の各々は、評価のためのナノ粒子システムの慎重な選択および準備によって軽減することができる。
【0068】
複合ナノ粒子用のＳＰＡＲＴＡプラットフォームの展開は、これらのシステムの複雑な構成、サイズ、および動的プロセスに関する多重化された情報を提供し、基本的な理解を向上させる。実際、ＳＰＡＲＴＡプラットフォームは、自動化された方法で、１回の実験で個別に捕捉された数百の粒子からの豊富なラマンスペクトルを提供する。要するに、粒子の組成、官能化、サイズ、および動態に関して、多面的なＳＰＡＲＴＡプラットフォームから得られる補足情報は、薬物の開発および送達、材料科学、ならびに細胞生物学をはじめとする分野に重大な影響を与える多大な可能性を秘めている。
【0069】
方法および装置は、特にレーザビームを含む電磁放射ビームを使用するものとして説明されてきたが、可視スペクトルまたはそれを超える、赤外線またはＵＶスペクトルなどの他の光源を使用してもよい。使用する光源に応じて、最大５０ｎｍ、１００ｎｍ、３００ｎｍ、５００ｎｍ、または１ミクロンの粒子サイズを捕捉して分析することができる。ラマンベースの検出モダリティの場合、波長７８５ｎｍの電磁放射源を最適に使用して、例えば５０～３００ｎｍの範囲の粒子サイズを分析することができる（ただし、これらは厳しい制限ではない）。一般に、粒子は、捕捉されたときに好適に検出可能なラマン信号を生成するのに十分な大きさである必要があるが、ビームによって捕捉されないほど大きくてはならない。粒子サイズの下限は、半径とともに急速に低下する共焦点ボリュームの相対的な占有によって決定される。この制限を下回ると、周囲の粒子からの信号に大きく寄与する可能性があるためである。粒子サイズの上限は、共焦点ピンホールによって決定される。本明細書に記載の実験は、５００ｎｍ付近の共焦点体積幅で実施されたが、これは、より大きなピンホールをとることによって拡張してもよく、したがって、より大きな粒子から全粒子スペクトルの取得が可能になる。いくつかの大きな粒子（例えば、１ミクロンの粒子）は、依然としてビームで捕捉され得るが、ウエスト部分２１の共焦点ボリューム内に完全には収まっていない場合があり、粒子全体が分析されない状態をもたらす可能性がある。したがって、状況によっては、単一粒子分析をビームウエスト直径と一致するサイズ、例えば３００ｎｍに制限することが望ましい場合がある。粒子からのラマン応答信号を不明瞭にする応答信号を生成しないという条件で、任意の好適な粒子搬送媒体を使用することができる。粒子搬送媒体は、特にオンライン動的反応モニタリングの例において、粒子との反応のための活性成分を含み得る。
【0070】
他の実施例は意識的に添付の特許請求の範囲に含まれるものとなっている。
参考文献
１．Ｄｒａｇｏｖｉｃ、Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｎｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７、７８０－７８８（２０１１）．
２．Ｆｉｌｉｐｅ、Ｖ．、Ｈａｗｅ，Ａ．＆Ｊｉｓｋｏｏｔ、Ｗ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）ｂｙ ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２７、７９６－８１０（２０１０）．
３．Ｄｏｍｉｎｇｏｓ、Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ｍｕｌｔｉｍｅｔｈｏｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４３、７２７７－７２８４（２００９）．
４．Ｃｈｉａｎｇ、Ｃ．－Ｋ．、Ｃｈｅｎ、Ｗ．－Ｔ．＆Ｃｈａｎｇ、Ｈ．－Ｔ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４０、１２６９－１２８１（２０１１）．
５．Ｋｉｍ、Ｊ．－Ｈ．、Ｂｒｙａｎ、Ｗ．Ｗ．＆Ｒａｎｄａｌｌ Ｌｅｅ、Ｔ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｇｏｌｄ、Ｓｉｌｖｅｒ，ａｎｄ Ｇｏｌｄ－Ｓｉｌｖｅｒ Ａｌｌｏｙ Ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｓｉｌｉｃａ Ｃｏｒｅｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２４、１１１４７－１１１５２（２００８）．
６．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．＆Ｚｈｕｏ、Ｒ．－ｘ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ａｎｄ ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６、６７３６－６７４２（２００５）．
７．Ｍｕｌｌｅｎ、Ｄ．Ｇ．＆Ｈｏｌｌ、Ｍ．Ｍ．Ｂ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｌｉｇａｎｄ－ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ：ａ ｍａｊｏｒ ｏｂｓｔａｃｌｅ ｔｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４４、１１３５－１１４５（２０１１）．
８．Ａｄｊｅｉ、Ｉ．Ｍ．、Ｐｅｅｔｌａ、Ｃ．＆ Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ、Ｖ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）９、２６７－２７８（２０１４）．
９．Ｋａｌｌｅｐｉｔｉｓ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ Ｒａｍａｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８、１４８４３（２０１７）．
１０．Ａｓｈｋｉｎ、Ａ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．２４、１５６－１５９（１９７０）．
１１．Ａｓｈｋｉｎ、Ａ．、Ｄｚｉｅｄｚｉｃ、Ｊ．Ｍ．、Ｂｊｏｒｋｈｏｌｍ、Ｊ．Ｅ．＆Ｃｈｕ、Ｓ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｂｅａｍ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｏｒｃｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐ ｆｏｒ ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．１１、２８８－２９０（１９８６）．
１２．Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｄ．Ｐ．、Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｔ．Ｅ．＆Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｏｒｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｈａｐｅ ｂｙ Ｃｏｎｆｏｃａｌ－Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６、４９２０－４９２８（２００４）．
１３．Ａｊｉｔｏ、Ｋ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ ａｎｄ Ｌａｓｅｒ Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ ｉｎ Ｗａｔｅｒ．Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．５２、３３９－３４２（１９９８）．
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１５．Ｍａｒｉａ、Ｇ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２、５０５７０４（２０１１）．
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１８．Ｐａｌｉｖａｎ、Ｃ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４５、３７７－４１１（２０１６）．
１９．Ｄｉｓｃｈｅｒ、Ｂ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ：Ｔｏｕｇｈ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｄｉｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４、１１４３（１９９９）．
２０．Ｘｕｅ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｉｎａｒｙ ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ．Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ ４３６、１００７－１０１２（２０１３）．
２１．Ｓｔｒｅｍｅｒｓｃｈ、Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｌｉｋｅ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｓｍａｌｌ １２、３２９２－３３０１（２０１６）．
２２．Ｓｍｉｔｈ、Ｚ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ａｍｏｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；Ｖｏｌ ４（２０１５）ｉｎｃｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（２０１５）．
２３．Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｊ．Ｊ．、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ａ．Ｃ．、Ｐｏｒｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．＆Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｔｒａｐｐｅｄ Ｖｉｎｙｌ－Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．６８、６３３－６４１（２０１４）．
２４．Ｈｏｕｌｎｅ、Ｍ．Ｐ．、Ｓｊｏｓｔｒｏｍ、Ｃ．Ｍ．、Ｕｉｂｅｌ、Ｒ．Ｈ．、Ｋｌｅｉｍｅｙｅｒ、Ｊ．Ａ．＆Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｔｒａｐｐｅｄ、Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４、４３１１－４３１９（２００２）．
２５．Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅ、Ｃ．Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｐＨ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｔｒａｐｐｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８７、７９７９－７９８６（２０１５）．
２６．Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｄ．Ｐ．、Ｃｏｎｂｏｙ、Ｊ．Ｃ．＆ Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｏｐｔｉｃａｌ－Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５、６６２１－６６２８（２００３）．
２７．Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｄ．Ｐ．＆ Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌ－Ｔｒａｐｐｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３、２７７－２９７（２０１０）．
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３３．Ａｌｍｅｉｄａ、Ｃ．Ｓ．、Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｉ．Ｋ．、Ｈｏｗｅｓ、Ｐ．Ｄ．＆Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｍ．Ｍ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２７、６８７９－６８８９（２０１５）．
３４．Ｌｕｏｎｇｏ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ａ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｔｉｆｏｕｌｉｎｇ Ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ．ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ９、４００５９－４００６９（２０１７）．
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参考文献
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４．Ｃｈｉａｎｇ、Ｃ．－Ｋ．、Ｃｈｅｎ、Ｗ．－Ｔ．＆Ｃｈａｎｇ、Ｈ．－Ｔ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４０、１２６９－１２８１（２０１１）．
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６．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．＆Ｚｈｕｏ、Ｒ．－ｘ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ａｎｄ ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６、６７３６－６７４２（２００５）．
７．Ｍｕｌｌｅｎ、Ｄ．Ｇ．＆Ｈｏｌｌ、Ｍ．Ｍ．Ｂ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｌｉｇａｎｄ－ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ：ａ ｍａｊｏｒ ｏｂｓｔａｃｌｅ ｔｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４４、１１３５－１１４５（２０１１）．
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９．Ｋａｌｌｅｐｉｔｉｓ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ Ｒａｍａｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８、１４８４３（２０１７）．
１０．Ａｓｈｋｉｎ、Ａ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．２４、１５６－１５９（１９７０）．
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１５．Ｍａｒｉａ、Ｇ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２、５０５７０４（２０１１）．
１６．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍ．＆Ｗａｒｄ、Ａ．Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｒａｍａｎ ｔｗｅｅｚｅｒｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２０－１１２１（２００４）．
１７．Ｍｅｎｇ、Ｆ．、Ｚｈｏｎｇ、Ｚ．＆ Ｆｅｉｊｅｎ、Ｊ．Ｓｔｉｍｕｌｉ－Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １０、１９７－２０９（２００９）．
１８．Ｐａｌｉｖａｎ、Ｃ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４５、３７７－４１１（２０１６）．
１９．Ｄｉｓｃｈｅｒ、Ｂ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ：Ｔｏｕｇｈ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｄｉｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４、１１４３（１９９９）．
２０．Ｘｕｅ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｉｎａｒｙ ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ．Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ ４３６、１００７－１０１２（２０１３）．
２１．Ｓｔｒｅｍｅｒｓｃｈ、Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｌｉｋｅ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｓｍａｌｌ １２、３２９２－３３０１（２０１６）．
２２．Ｓｍｉｔｈ、Ｚ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ａｍｏｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；Ｖｏｌ ４（２０１５）ｉｎｃｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（２０１５）．
２３．Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｊ．Ｊ．、Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ａ．Ｃ．、Ｐｏｒｔｅｒ、Ｍ．Ｄ．＆Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｔｒａｐｐｅｄ Ｖｉｎｙｌ－Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．６８、６３３－６４１（２０１４）．
２４．Ｈｏｕｌｎｅ、Ｍ．Ｐ．、Ｓｊｏｓｔｒｏｍ、Ｃ．Ｍ．、Ｕｉｂｅｌ、Ｒ．Ｈ．、Ｋｌｅｉｍｅｙｅｒ、Ｊ．Ａ．＆Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｔｒａｐｐｅｄ、Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４、４３１１－４３１９（２００２）．
２５．Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅ、Ｃ．Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｐＨ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｔｒａｐｐｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８７、７９７９－７９８６（２０１５）．
２６．Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｄ．Ｐ．、Ｃｏｎｂｏｙ、Ｊ．Ｃ．＆ Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｏｐｔｉｃａｌ－Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５、６６２１－６６２８（２００３）．
２７．Ｃｈｅｒｎｅｙ、Ｄ．Ｐ．＆ Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｍ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｒａｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌ－Ｔｒａｐｐｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３、２７７－２９７（２０１０）．
２８．Ｙａｍａｋｏｓｈｉ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｌｋｙｎｅ－Ｔａｇ Ｒａｍａｎ Ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｂｉｌｅ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４、２０６８１－２０６８９（２０１２）．
２９．Ｎａｊｅｒ、Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｍｉｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｅ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｍａｌａｒｉａ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ８、１２５６０－１２５７１（２０１４）．
３０．Ｃｈｏ、Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ、ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１０、２０９３－２１１０（２０１３）．
３１．Ｗｅｉ、Ｈ．＆Ｗａｎｇ、Ｅ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｋｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（ｎａｎｏｚｙｍｅｓ）：ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４２、６０６０－６０９３（２０１３）．
３２．Ｔｏｄｏｒｏｖａ、Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＴＡＴ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１４、５２２９－５２３７（２０１４）．
３３．Ａｌｍｅｉｄａ、Ｃ．Ｓ．、Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｉ．Ｋ．、Ｈｏｗｅｓ、Ｐ．Ｄ．＆Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｍ．Ｍ．Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２７、６８７９－６８８９（２０１５）．
３４．Ｌｕｏｎｇｏ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ａ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｔｉｆｏｕｌｉｎｇ Ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ．ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ９、４００５９－４００６９（２０１７）．
３５．Ａｌｇａｒ、Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ａ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｓｕｉｔｅｄ ｔｏ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２２、８２５－８５８（２０１１）．
【0071】
本明細書で明らかに先に公表された文献のリストまたは考察は、その文献が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものと必ずしも解釈されるべきではない。
【0072】
他の方法
ＳＰＡＲＴＡラマン顕微分光器
共焦点ラマンスペクトル取得を、ラマン顕微分光器（ａｌｐｈａ３００Ｒ＋、ＷＩＴｅｃ、ウルム、ドイツ）で実施した。使用した光源は、６３×／１．０ＮＡの水浸顕微鏡対物レンズ（Ｗ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ、Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）をともなう７８５ｎｍレーザ（Ｔｏｐｔｉｃａ ＸＴＲＡ ＩＩ）であった。散乱光は、６００ｇ／ｍｍ回折格子分光器（ＵＨＴＳ ３００、ＷＩＴｅｃ、ウルム、ドイツ）をともなう１００μｍファイバを介して収集し、スペクトルは、試料に対して３ｃｍ－１のスペクトル分解能および８５ｍＷのレーザ出力をともなう熱電冷却された背面照明ＣＣＤカメラ（ｉＤｕｓ ＤＵ４０１－ＤＤ、Ａｎｄｏｒ、ベルファスト、英国）を使用して取得した。レーザ制御は、直列接続およびカスタムＭａｔｌａｂ（２０１６ｂ）スクリプトを介して遠隔制御で行った。
ＳＰＡＲＴＡラマン顕微分光器
共焦点ラマンスペクトル取得を、ラマン顕微分光器（ａｌｐｈａ３００Ｒ＋、ＷＩＴｅｃ、ウルム、ドイツ）で実施した。使用した光源は、６３×／１．０ＮＡの水浸顕微鏡対物レンズ（Ｗ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ、Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）をともなう７８５ｎｍレーザ（Ｔｏｐｔｉｃａ ＸＴＲＡ ＩＩ）であった。散乱光は、６００ｇ／ｍｍ回折格子分光器（ＵＨＴＳ ３００、ＷＩＴｅｃ、ウルム、ドイツ）をともなう１００μｍファイバを介して収集し、スペクトルは、試料に対して３ｃｍ－１のスペクトル分解能および８５ｍＷのレーザ出力をともなう熱電冷却された背面照明ＣＣＤカメラ（ｉＤｕｓ ＤＵ４０１－ＤＤ、Ａｎｄｏｒ、ベルファスト、英国）を使用して取得した。レーザ制御は、直列接続およびカスタムＭａｔｌａｂ（２０１６ｂ）スクリプトを介して遠隔制御で行った。
【0073】
ＳＰＡＲＴＡ標準試料の調製
ＳＰＡＲＴＡ分析では、通常２００μｌの粒子溶液が必要とされ、測定時間にもよるが、そのうちの約半分を定常的に回収した。理想的な粒子濃度は、１ミリリットルあたり１・１０１０～１・１０１２粒子、またはポリスチレン粒子の場合は、固形分０．１～０．０１％程度であると判定された。試料溶液を２２ｍｍのカバーガラスに置き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１滴加えた標準的な顕微鏡スライドに取り付けた。試料は、測定のために水浸対物レンズの下に置いた。
ＳＰＡＲＴＡ分析では、通常２００μｌの粒子溶液が必要とされ、測定時間にもよるが、そのうちの約半分を定常的に回収した。理想的な粒子濃度は、１ミリリットルあたり１・１０１０～１・１０１２粒子、またはポリスチレン粒子の場合は、固形分０．１～０．０１％程度であると判定された。試料溶液を２２ｍｍのカバーガラスに置き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１滴加えた標準的な顕微鏡スライドに取り付けた。試料は、測定のために水浸対物レンズの下に置いた。
【0074】
ＳＰＡＲＴＡ標準データ分析
次の前処理手順は、ＳＰＡＲＴＡプラットフォームを用いて取得されたすべてのスペクトルに適用された。取得中のスペクトルの中心は、１０００ｃｍ－１に標準設定し、生データは、励起信号を省略するために、３５０～１８２５ｃｍ－１の範囲に切り捨てた。アルキン修飾を含む測定では、スペクトルの中心を１５００ｃｍ－１にシフトし、測定範囲は６０６～２２５４ｃｍ－１となった。ピーク振幅および第二派生物に基づく自動スクリプトを採用して、宇宙スパイクを除去し、続いて、手動の目視検査を行った。スペクトルバックグラウンドは曲線適合（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒフィルタ、λ＝１００，０００）を介して減算し、ノイズはＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタ（３ポイント、１次）を使用して平滑化した。得られたスペクトルは、過塩素酸比の計算を介して組み込まれるＳＰＡＲＴＡサイジング分析を除いて、曲線下の領域を介して正規化した。その後の統計分析（階層クラスター分析、主成分分析、多変量曲線回帰、部分最小二乗判別分析）は、ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．）を使用して実施された。
次の前処理手順は、ＳＰＡＲＴＡプラットフォームを用いて取得されたすべてのスペクトルに適用された。取得中のスペクトルの中心は、１０００ｃｍ－１に標準設定し、生データは、励起信号を省略するために、３５０～１８２５ｃｍ－１の範囲に切り捨てた。アルキン修飾を含む測定では、スペクトルの中心を１５００ｃｍ－１にシフトし、測定範囲は６０６～２２５４ｃｍ－１となった。ピーク振幅および第二派生物に基づく自動スクリプトを採用して、宇宙スパイクを除去し、続いて、手動の目視検査を行った。スペクトルバックグラウンドは曲線適合（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒフィルタ、λ＝１００，０００）を介して減算し、ノイズはＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタ（３ポイント、１次）を使用して平滑化した。得られたスペクトルは、過塩素酸比の計算を介して組み込まれるＳＰＡＲＴＡサイジング分析を除いて、曲線下の領域を介して正規化した。その後の統計分析（階層クラスター分析、主成分分析、多変量曲線回帰、部分最小二乗判別分析）は、ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．）を使用して実施された。
【0075】
ＤＰＰＣおよびｄ－ＤＰＰＣリポソームの調製
以下の標準的な手順に従ってリポソームを調製した。脂質の５ｍｇ／ｍｌストック溶液（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２－ジパルミトイル－ｄ６２－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ－ｄ６２、ここではｄ－ＤＰＰＣと称する）、（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．アラバマ、米国）、およびコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）をクロロホルムで製造し、使用前にアルゴン下で２０℃で保存した。ＤＰＰＣリポソームの場合、脂質膜は、５００μｌのＤＰＰＣストック溶液および４３μｌのコレステロール保存溶液を１０ｍｌの丸底フラスコに加えて作り、８５：１５ｍｏｌ％のＤＰＰＣ：コレステロールのモル比となった。ｄ－ＤＰＰＣリポソームの場合、２５０μｌのＤＰＰＣストックおよび２５０μｌのｄ－ＤＰＰＣストックを使用した結果、４２．５：４２．５：１５ｍｏｌ％／／ＤＰＰＣ：ｄ－ＤＰＰＣ：コレステロールの比率となった。クロロホルムを窒素流下で蒸発させて脂質薄膜を形成した。再水和の前に、脂質フィルムを凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ、米国）で一晩凍結乾燥した。フィルムを１ｍｌのＰＢＳで水和し、１分間振とうし、１分間超音波処理した。ついで、溶液を、６０℃でメッシュサイズ２００ｎｍのポリカーボネート膜（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．アラバマ、米国）を通して３１回押し出した。リポソームサイズ分布および粒子濃度は、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を介して判定した。
以下の標準的な手順に従ってリポソームを調製した。脂質の５ｍｇ／ｍｌストック溶液（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１，２－ジパルミトイル－ｄ６２－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ－ｄ６２、ここではｄ－ＤＰＰＣと称する）、（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．アラバマ、米国）、およびコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）をクロロホルムで製造し、使用前にアルゴン下で２０℃で保存した。ＤＰＰＣリポソームの場合、脂質膜は、５００μｌのＤＰＰＣストック溶液および４３μｌのコレステロール保存溶液を１０ｍｌの丸底フラスコに加えて作り、８５：１５ｍｏｌ％のＤＰＰＣ：コレステロールのモル比となった。ｄ－ＤＰＰＣリポソームの場合、２５０μｌのＤＰＰＣストックおよび２５０μｌのｄ－ＤＰＰＣストックを使用した結果、４２．５：４２．５：１５ｍｏｌ％／／ＤＰＰＣ：ｄ－ＤＰＰＣ：コレステロールの比率となった。クロロホルムを窒素流下で蒸発させて脂質薄膜を形成した。再水和の前に、脂質フィルムを凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ、米国）で一晩凍結乾燥した。フィルムを１ｍｌのＰＢＳで水和し、１分間振とうし、１分間超音波処理した。ついで、溶液を、６０℃でメッシュサイズ２００ｎｍのポリカーボネート膜（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．アラバマ、米国）を通して３１回押し出した。リポソームサイズ分布および粒子濃度は、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を介して判定した。
【0076】
ポリマーソームの調製
ＰＭＯＸＡ－ｂ－ＰＤＭＳ－ｂ－ＰＭＯＸＡポリマーソーム（さらにＡＢＡと表記）は、ポリ（２－メチルオキサゾリン－ｂ－ジメチルシロキサン－ｂ－２－メチルオキサゾリン）（Ｍｎ・１０３＝０．５－ｂ－４．８－ｂ－０．５）トリブロック共重合体（Ｐ１８１４０Ｄ－ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．、ケベック、カナダ）から調製した。エタノール中のトリブロック共重合体の６ｍｇ／ｍｌストック溶液の１ｍｌを、５ｍｌ丸底フラスコに加えた。ＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームは、以前Ｎａｊｅｒらによって記載されたように（Ｎａｊｅｒ、Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｍｉｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｅ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｍａｌａｒｉａ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ８、１２５６０－１２５７１（２０１４））合成した２５重量％のＰＤＭＳ－ｂ－ヘパリン（Ｍｗ＝５ｋＤａ－ｂ－１１ｋＤａ）ブロック共重合体を配合することによって作った。５ｍｌの丸底フラスコ内で、６ｍｇ／ｍｌ ＡＢＡストックの１ｍｌを、エタノール中のＰＤＭＳ－ｂ－ヘパリンブロックコポリマーの４ｍｇ／ｍｌストックの０．５ｍｌと混合した。ポリマー溶液を、ロータリーエバポレータで５０℃および２０ｍｂａｒで約１５分間乾燥させた。続いて、ポリマーフィルムを、激しく撹拌しながら、１．２ｍｌのＰＢＳ中で７２時間再水和した。ポリマー溶液を、０．４５μｍシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ １３ｍｍ ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ドイツ）でろ過し、メッシュサイズ２００ｎｍのポリカーボネート膜（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．アラバマ、米国）で５回押し出した。続いて、メッシュサイズ１００ｎｍのポリカーボネート膜を３１回通過させた。ポリマーソームは、ＰＢＳ中のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）を充填した１０×３００ｍｍカラム）によってさらに精製し、１ｍｌの留分を収集した。ポリマーソームのサイズ分布は、ＤＬＳおよびＮＴＡによって分析された。
ＰＭＯＸＡ－ｂ－ＰＤＭＳ－ｂ－ＰＭＯＸＡポリマーソーム（さらにＡＢＡと表記）は、ポリ（２－メチルオキサゾリン－ｂ－ジメチルシロキサン－ｂ－２－メチルオキサゾリン）（Ｍｎ・１０３＝０．５－ｂ－４．８－ｂ－０．５）トリブロック共重合体（Ｐ１８１４０Ｄ－ＭＯＸＺＤＭＳＭＯＸＺ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．、ケベック、カナダ）から調製した。エタノール中のトリブロック共重合体の６ｍｇ／ｍｌストック溶液の１ｍｌを、５ｍｌ丸底フラスコに加えた。ＡＢＡ－ヘパリンポリマーソームは、以前Ｎａｊｅｒらによって記載されたように（Ｎａｊｅｒ、Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｍｉｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｅ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｍａｌａｒｉａ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ８、１２５６０－１２５７１（２０１４））合成した２５重量％のＰＤＭＳ－ｂ－ヘパリン（Ｍｗ＝５ｋＤａ－ｂ－１１ｋＤａ）ブロック共重合体を配合することによって作った。５ｍｌの丸底フラスコ内で、６ｍｇ／ｍｌ ＡＢＡストックの１ｍｌを、エタノール中のＰＤＭＳ－ｂ－ヘパリンブロックコポリマーの４ｍｇ／ｍｌストックの０．５ｍｌと混合した。ポリマー溶液を、ロータリーエバポレータで５０℃および２０ｍｂａｒで約１５分間乾燥させた。続いて、ポリマーフィルムを、激しく撹拌しながら、１．２ｍｌのＰＢＳ中で７２時間再水和した。ポリマー溶液を、０．４５μｍシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ－ＨＶ １３ｍｍ ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ドイツ）でろ過し、メッシュサイズ２００ｎｍのポリカーボネート膜（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．アラバマ、米国）で５回押し出した。続いて、メッシュサイズ１００ｎｍのポリカーボネート膜を３１回通過させた。ポリマーソームは、ＰＢＳ中のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）を充填した１０×３００ｍｍカラム）によってさらに精製し、１ｍｌの留分を収集した。ポリマーソームのサイズ分布は、ＤＬＳおよびＮＴＡによって分析された。
【0077】
ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）
ナノ粒子追跡分析（ＮＳ３００、５３２ｎｍレーザ、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）は、ＰＢＳ中の１ｍｌ試料の３０秒動画を３回取得することによって実行された。カメラレベルは１３～１４の間に保ち、画面ゲインは１、検出閾値は５に設定された。試料を測定のためにミリリットル当たり１×１０８～１×１０９粒子の最適測定範囲内まで希釈した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＴＡ ３．０ソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国、２０１４年）を使用して測定値を分析した。
ナノ粒子追跡分析（ＮＳ３００、５３２ｎｍレーザ、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）は、ＰＢＳ中の１ｍｌ試料の３０秒動画を３回取得することによって実行された。カメラレベルは１３～１４の間に保ち、画面ゲインは１、検出閾値は５に設定された。試料を測定のためにミリリットル当たり１×１０８～１×１０９粒子の最適測定範囲内まで希釈した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＴＡ ３．０ソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国、２０１４年）を使用して測定値を分析した。
【0078】
動的光散乱（ＤＬＳ）
動的光散乱（ＺＥＮ３６００ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、マルヴァーン、英国）は、４００μｌの溶液をともなう使い捨てのセミマイクロキュベット（Ｂｒａｎｄ ＧＭＢＨ、ドイツ）内で、１７３°の散乱角でＮＩＢＳによる３回の測定値（各々１０～１５回の取得）の取得と平均化によって実行された。測定値は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．７．０２（マルヴァーン、英国、２０１３年）を使用して取得した。数値分布を使用して、粒子サイズ分布を検証および比較した。
動的光散乱（ＺＥＮ３６００ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、マルヴァーン、英国）は、４００μｌの溶液をともなう使い捨てのセミマイクロキュベット（Ｂｒａｎｄ ＧＭＢＨ、ドイツ）内で、１７３°の散乱角でＮＩＢＳによる３回の測定値（各々１０～１５回の取得）の取得と平均化によって実行された。測定値は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．７．０２（マルヴァーン、英国、２０１３年）を使用して取得した。数値分布を使用して、粒子サイズ分布を検証および比較した。
【0079】
システインーチロシンーチロシン（ＣＹＹ）トリペプチドの調製
ＣＹＹトリペプチドは、リンクアミドＭＢＨＡ樹脂ならびに保護されたシステインおよびチロシンアミノ酸（ＡＧＴＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）上でＦｍｏｃ保護基化学を使用した標準的な固相ペプチド合成によって合成した。簡単に説明すると、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の２０ｖ％ピペリジンで１０分間行い、続いてＤＭＦとＤＣＭで２回洗浄した。アミノ酸結合を、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）、ＨＢＴＵ（３．７５当量）、およびＤＩＥＡ（６当量）を用いて２時間行い、このプロセスをシーケンスに従って繰り返した。ペプチドを樹脂から切断し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％、トリイソプロピルシラン２．５％、および水２．５％で４時間脱保護した。ロータリーエバポレータを使用してＴＦＡを除去し、ペプチドを沈殿させ、冷ジエチルエーテル２００ｍＬおよび２×５０ｍＬで洗浄した。精製のために、ペプチドを０．１％ＴＦＡをともなう超純水中の４．９％ＡＣＮの溶液に溶解し、５μｍの孔径と１００Åの粒子サイズをともなうＣ１８ Ｇｅｍｉｎｉ １５０×２１．２ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア、米国）をともなう逆相分取高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所、日本）を使用して精製した。移動相は、１５ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡを含む超純水であり、１５分間の分析中に、移動相中の０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮの濃度は、０～３分で０％、３～１２分で０～１００％、１２～１３分で１００％、１３～１５分で０％であった。液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア、米国）を使用して、ＨＰＬＣ留分の正しい質量をチェックし（観測ＭＷ＝４４７．２、予測［ＣＹＹ］Ｈ＋＝４４７．１６）、純粋なペプチド留分を混合し、回転蒸発させてＡＣＮを除去し、凍結乾燥（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ、ＵＳＡ）によって凍結乾燥した。
ＣＹＹトリペプチドは、リンクアミドＭＢＨＡ樹脂ならびに保護されたシステインおよびチロシンアミノ酸（ＡＧＴＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）上でＦｍｏｃ保護基化学を使用した標準的な固相ペプチド合成によって合成した。簡単に説明すると、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の２０ｖ％ピペリジンで１０分間行い、続いてＤＭＦとＤＣＭで２回洗浄した。アミノ酸結合を、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）、ＨＢＴＵ（３．７５当量）、およびＤＩＥＡ（６当量）を用いて２時間行い、このプロセスをシーケンスに従って繰り返した。ペプチドを樹脂から切断し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％、トリイソプロピルシラン２．５％、および水２．５％で４時間脱保護した。ロータリーエバポレータを使用してＴＦＡを除去し、ペプチドを沈殿させ、冷ジエチルエーテル２００ｍＬおよび２×５０ｍＬで洗浄した。精製のために、ペプチドを０．１％ＴＦＡをともなう超純水中の４．９％ＡＣＮの溶液に溶解し、５μｍの孔径と１００Åの粒子サイズをともなうＣ１８ Ｇｅｍｉｎｉ １５０×２１．２ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア、米国）をともなう逆相分取高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所、日本）を使用して精製した。移動相は、１５ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡを含む超純水であり、１５分間の分析中に、移動相中の０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮの濃度は、０～３分で０％、３～１２分で０～１００％、１２～１３分で１００％、１３～１５分で０％であった。液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア、米国）を使用して、ＨＰＬＣ留分の正しい質量をチェックし（観測ＭＷ＝４４７．２、予測［ＣＹＹ］Ｈ＋＝４４７．１６）、純粋なペプチド留分を混合し、回転蒸発させてＡＣＮを除去し、凍結乾燥（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ、ＵＳＡ）によって凍結乾燥した。
【0080】
ポリスチレン粒子の連続官能化
アミンで官能化された０．２μｍのポリスチレン粒子（ＰｏｌｙｂｅａｄＡｍｉｎｏ ０．２０μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を、２－イミノチオランを用いてさらに官能化した。ＰＢＳ中の２ミリモルＥＤＴＡの反応緩衝液を作り、２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整し、そこから２－イミノチオランの６ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。官能化のために、７８０μｌの反応バッファを、２００μｌの０．２０μｍポリスチレン粒子（２．６％固形分（ｗ／ｖ））および２０μｌの２－イミノチオラン溶液と混合し、室温で一晩反応させた。これにより、スルフヒドリル官能化粒子の０．５％固形分（ｗ／ｖ）溶液が得られ、これをさらにＰＢＳで１０倍に希釈し、精製した。特に明記しない限り、精製は、１４，０００ｒｃｆで１０分間の遠心分離によって行い、その後ペレットをＰＢＳに再分散させた。再分散は、３０秒間のボルテックスと、１分間の超音波処理によって促進され、透明な溶液を得た。各精製ステップの後、ＳＰＡＲＴＡの前に、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を実行して、凝集がないことを検証した。ＳＰＡＲＴＡ実験パラメータを、１秒の反復取得時間、１０秒の高ＳＮＲ取得時間、および１秒のレーザ無効化時間に設定して、最低１００個の成功した捕捉スペクトルを取得した。粒子をさらに１０ｍｇの５，５－ジチオ－ビス－（２－ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を用いて処理して、スルフヒドリル官能基とＴＮＢアニオンとの間にジスルフィド結合を形成した。粒子を精製し、ＳＰＡＲＴＡを実行してジスルフィド結合の形成を検証した。トリペプチド官能基は、ＴＮＢ官能化粒子を２ｍｇのＣＹＹ（Ｍｗ＝４４６．１６ｇ／ｍｏｌ、４．５ｍＭ）で処理することによって得られた。トリペプチド官能基を観察するために、精製後にＳＰＡＲＴＡを実行した。官能化の可逆性を実証するために、１００μｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、０．５Ｍ、中性ｐＨ Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＴＮＢ官能化粒子に添加し、ジスルフィド結合の切断を示す溶液を明るい黄色に変えた。同様に、粒子とトリペプチドとの間のジスルフィド結合を切断した。精製後、スルフヒドリル官能基の回復をＳＰＡＲＴＡによって検証した。
アミンで官能化された０．２μｍのポリスチレン粒子（ＰｏｌｙｂｅａｄＡｍｉｎｏ ０．２０μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を、２－イミノチオランを用いてさらに官能化した。ＰＢＳ中の２ミリモルＥＤＴＡの反応緩衝液を作り、２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整し、そこから２－イミノチオランの６ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。官能化のために、７８０μｌの反応バッファを、２００μｌの０．２０μｍポリスチレン粒子（２．６％固形分（ｗ／ｖ））および２０μｌの２－イミノチオラン溶液と混合し、室温で一晩反応させた。これにより、スルフヒドリル官能化粒子の０．５％固形分（ｗ／ｖ）溶液が得られ、これをさらにＰＢＳで１０倍に希釈し、精製した。特に明記しない限り、精製は、１４，０００ｒｃｆで１０分間の遠心分離によって行い、その後ペレットをＰＢＳに再分散させた。再分散は、３０秒間のボルテックスと、１分間の超音波処理によって促進され、透明な溶液を得た。各精製ステップの後、ＳＰＡＲＴＡの前に、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を実行して、凝集がないことを検証した。ＳＰＡＲＴＡ実験パラメータを、１秒の反復取得時間、１０秒の高ＳＮＲ取得時間、および１秒のレーザ無効化時間に設定して、最低１００個の成功した捕捉スペクトルを取得した。粒子をさらに１０ｍｇの５，５－ジチオ－ビス－（２－ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を用いて処理して、スルフヒドリル官能基とＴＮＢアニオンとの間にジスルフィド結合を形成した。粒子を精製し、ＳＰＡＲＴＡを実行してジスルフィド結合の形成を検証した。トリペプチド官能基は、ＴＮＢ官能化粒子を２ｍｇのＣＹＹ（Ｍｗ＝４４６．１６ｇ／ｍｏｌ、４．５ｍＭ）で処理することによって得られた。トリペプチド官能基を観察するために、精製後にＳＰＡＲＴＡを実行した。官能化の可逆性を実証するために、１００μｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、０．５Ｍ、中性ｐＨ Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＴＮＢ官能化粒子に添加し、ジスルフィド結合の切断を示す溶液を明るい黄色に変えた。同様に、粒子とトリペプチドとの間のジスルフィド結合を切断した。精製後、スルフヒドリル官能基の回復をＳＰＡＲＴＡによって検証した。
【0081】
ポリスチレン粒子に対する動的クリック反応
カルボキシル官能化０．２μｍポリスチレン粒子（Ｐｏｌｙｂｅａｄカルボキシレート０．２０μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を、ＥＤＣ－ＮＨＳ結合を使用してプロパルギルアミンで官能化した。ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび２０ｍｇ／ｍｌのｎ－ヒドロキシスクシンイミドの溶液を作り、各々の４０μｌを、２００μｌのポリスチレン粒子（２．６％固形分）および８００μｌのＰＢＳに添加した。溶液をサーモミキサー上で室温で振とうし、３０分後に２０μｌのニートプロパルギルアミンを加えた。一晩連続的に振とうしながら反応を進行させた。合成液を１０倍に希釈して精製した。１４，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して精製を行い、その後ペレットをＰＢＳ中に再分散させた。再分散は、３０秒間のボルテックスおよび１分間の超音波処理によって支援された。精製後、ＳＰＡＲＴＡの前に、凝集がないことを検証するためにＤＬＳトレースを取得した。溶液は、ＰＢＳ中の１００ｍＭ硫酸銅、１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、および０．５Ｍ重炭酸カリウムで作られた。２ーアジド酢酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）と同等のモル濃度の水酸化ナトリウムの１Ｍ溶液を添加することによって、アジドアセテートを作った。母集団クリック反応は、ＰＢＳ中で１００倍に希釈した２００μｌのアルキン官能化ポリスチレン粒子に、２．８８μｌの１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１．８０μｌの１００ｍＭ硫酸銅、および０．５μｌのニートアジド酢酸を添加してトリアゾールを形成することにより実施された。ｐＨを７に調整するために、ＫＨＣＯ３の０．５Ｍ溶液の液滴を加えた。単一粒子ホールドクリック反応は、７．４６μｌのアジドアセテート（０．５μｌのニートアジド酢酸に等しい）を添加して実行し、それ以上のｐＨ調整は必要なかった。
カルボキシル官能化０．２μｍポリスチレン粒子（Ｐｏｌｙｂｅａｄカルボキシレート０．２０μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を、ＥＤＣ－ＮＨＳ結合を使用してプロパルギルアミンで官能化した。ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび２０ｍｇ／ｍｌのｎ－ヒドロキシスクシンイミドの溶液を作り、各々の４０μｌを、２００μｌのポリスチレン粒子（２．６％固形分）および８００μｌのＰＢＳに添加した。溶液をサーモミキサー上で室温で振とうし、３０分後に２０μｌのニートプロパルギルアミンを加えた。一晩連続的に振とうしながら反応を進行させた。合成液を１０倍に希釈して精製した。１４，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して精製を行い、その後ペレットをＰＢＳ中に再分散させた。再分散は、３０秒間のボルテックスおよび１分間の超音波処理によって支援された。精製後、ＳＰＡＲＴＡの前に、凝集がないことを検証するためにＤＬＳトレースを取得した。溶液は、ＰＢＳ中の１００ｍＭ硫酸銅、１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、および０．５Ｍ重炭酸カリウムで作られた。２ーアジド酢酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）と同等のモル濃度の水酸化ナトリウムの１Ｍ溶液を添加することによって、アジドアセテートを作った。母集団クリック反応は、ＰＢＳ中で１００倍に希釈した２００μｌのアルキン官能化ポリスチレン粒子に、２．８８μｌの１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１．８０μｌの１００ｍＭ硫酸銅、および０．５μｌのニートアジド酢酸を添加してトリアゾールを形成することにより実施された。ｐＨを７に調整するために、ＫＨＣＯ３の０．５Ｍ溶液の液滴を加えた。単一粒子ホールドクリック反応は、７．４６μｌのアジドアセテート（０．５μｌのニートアジド酢酸に等しい）を添加して実行し、それ以上のｐＨ調整は必要なかった。
【0082】
ＵＶ－Ｖｉｓ分析によるクリック反応モニタリング
３－アジド－７－ヒドロキシクマリン（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、アルキン官能化ポリスチレンナノ粒子上でＣｕＡＡＣ反応が発生するかどうかを確認した。これを行うために、得られたトリアゾール生成物（Ａｂｓ／Ｅｍ＝４０４／４７７ｎｍ）の蛍光をＵＶ－Ｖｉｓ分光法でモニタリングした。９６ウェルプレートで、ＰＢＳ中の精製アルキン官能化ポリスチレン粒子の１０００倍希釈液２００μｌを、水中の２．８８μｌの１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１．８０μｌの１００ｍＭ硫酸銅、および５μｌの３－アジド－７－ヒドロキシクマリン１μＭと混合した。対照として、３－アジド－７－ヒドロキシクマリンまたは硫酸銅を除いて、同時に測定を行った。蛍光を３０分以上モニタリングし、１５秒間隔で測定した。
３－アジド－７－ヒドロキシクマリン（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、アルキン官能化ポリスチレンナノ粒子上でＣｕＡＡＣ反応が発生するかどうかを確認した。これを行うために、得られたトリアゾール生成物（Ａｂｓ／Ｅｍ＝４０４／４７７ｎｍ）の蛍光をＵＶ－Ｖｉｓ分光法でモニタリングした。９６ウェルプレートで、ＰＢＳ中の精製アルキン官能化ポリスチレン粒子の１０００倍希釈液２００μｌを、水中の２．８８μｌの１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１．８０μｌの１００ｍＭ硫酸銅、および５μｌの３－アジド－７－ヒドロキシクマリン１μＭと混合した。対照として、３－アジド－７－ヒドロキシクマリンまたは硫酸銅を除いて、同時に測定を行った。蛍光を３０分以上モニタリングし、１５秒間隔で測定した。
【0083】
ＳＰＡＲＴＡによるハイブリッド小胞分析
ハイブリッド小胞、ヤヌス型デンドリマーソーム、およびスフィンゴミエリンーコレステロールリポソームを、ＤＰＢＳでの薄膜水和法を介して、必要に応じて精製のために順次ボルテックスおよびその後のサイズ排除を介して調製した。室温での安定性アッセイは、１ヶ月間にわたる安定性を示す。ナノ粒子トラッキング分析を使用して試料濃度を測定し、測定まで４℃で保存した。
ハイブリッド小胞、ヤヌス型デンドリマーソーム、およびスフィンゴミエリンーコレステロールリポソームを、ＤＰＢＳでの薄膜水和法を介して、必要に応じて精製のために順次ボルテックスおよびその後のサイズ排除を介して調製した。室温での安定性アッセイは、１ヶ月間にわたる安定性を示す。ナノ粒子トラッキング分析を使用して試料濃度を測定し、測定まで４℃で保存した。
【0084】
ＳＰＡＲＴＡプロトコルでは、ＰＢＳ中の１５０μＬの試料を約１０１３粒子／ｍＬで利用した。捕捉評価時間を１．５秒に設定し、その後、閾値を超える捕捉が１０秒の積分時間で記録され、高ＳＮＲスペクトルが得られた。捕捉シーケンスは概して、２００個の捕捉で開始し、完了するまで自動的に進行した。取得したスペクトルは、宇宙スパイクの除去、バックグラウンド減算、平滑化、および正規化のためのカスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（２０１６ａ／ｂ）スクリプトを使用して処理した。ＮＮＬＳフィッティングは、ネイティブおよびカスタムの両方のＭａｔｌａｂスクリプトを介して、個々の成分から取得された純粋なスペクトルに基づいて実行した。
【0085】
ＳＰＡＲＴＡによるキュボソーム分析
モノオレイン、コレステロール、およびホスファチジルコリンとホスファチジン酸との組み合わせを含む組成物は、超音波処理および均質化法を利用して形成された。簡単に説明すると、超音波処理を介したキュボソームの形成には、所望の組成の脂質を溶媒に共溶解し、窒素下で溶媒を蒸発させ、凍結乾燥機を使用して過剰な水分を除去して、脂質膜を作成することが含まれる。これに、所望の緩衝液中での水和、事前に溶解された安定化ポリマーの添加、および分散液を形成するためのチップ超音波処理／均質化が続く。容量制限のため、少量の超音波処理チップを利用する。ＳＰＡＲＴＡ分析の前に、キュボソームを室温で保った。ホスホリパーゼＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ由来）を、使用前に－８０℃で冷凍保存した。個々の実験では、試料２５０μＬあたりの総脂質濃度は０．１ｍｇ／ｍＬで、適切な量のＭｇ／Ｃａ緩衝ＤＰＢＳおよび既知の濃度のＰＬＤと混合して、酵素活性、１つのキュボソーム組成、および脂質変換をモニタリングした。
モノオレイン、コレステロール、およびホスファチジルコリンとホスファチジン酸との組み合わせを含む組成物は、超音波処理および均質化法を利用して形成された。簡単に説明すると、超音波処理を介したキュボソームの形成には、所望の組成の脂質を溶媒に共溶解し、窒素下で溶媒を蒸発させ、凍結乾燥機を使用して過剰な水分を除去して、脂質膜を作成することが含まれる。これに、所望の緩衝液中での水和、事前に溶解された安定化ポリマーの添加、および分散液を形成するためのチップ超音波処理／均質化が続く。容量制限のため、少量の超音波処理チップを利用する。ＳＰＡＲＴＡ分析の前に、キュボソームを室温で保った。ホスホリパーゼＤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ由来）を、使用前に－８０℃で冷凍保存した。個々の実験では、試料２５０μＬあたりの総脂質濃度は０．１ｍｇ／ｍＬで、適切な量のＭｇ／Ｃａ緩衝ＤＰＢＳおよび既知の濃度のＰＬＤと混合して、酵素活性、１つのキュボソーム組成、および脂質変換をモニタリングした。
【0086】
ＳＰＡＲＴＡ測定は、１０秒の高ＳＮＲ積分時間、１秒の反復時間、および１秒のレーザ無効化時間で、酵素スパイクキュボソーム試料の２００μｌ試料で実行された。概して、２００個の捕捉が開始されたが、この数は、試料に追加された酵素の予想される活性および濃度に応じて変更した。スペクトルは、キャッチアンドリリース（母集団サンプリング）および捕捉アンドホールド（単一粒子経時変化）の両方の方法で取得され、酵素反応速度のモニタリングが可能になった。取得したスペクトルは、宇宙スパイクの除去、バックグラウンド減算、平滑化、および正規化のためのカスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（２０１６ａ／ｂ）スクリプトを使用して処理された。
【0087】
ＳＰＡＲＴＡによる細胞外小胞分析
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ１０Ａ細胞株は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）から取得した。ＪＩＭＴ－１は、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から取得した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＪＩＭＴ－１細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＵＫ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。ＭＣＦ１０Ａ細胞を、５％（ｖ／ｖ）馬血清（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍＬコレラを毒素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で培養し、２日ごとに培地を交換した。ＥＶ分離の前に、細胞を無血清培地で２日間コンフルエントになるまで培養した後、馴化培地を収集し、１５００ｘｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍボトルトップフィルタを使用してろ過した。スピンろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、１００ｋＤａ）を使用して培地を約５００～１０００倍に濃縮し、５００μＬを直径１ｃｍ、長さ３０ｃｍのＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ２Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＵＫ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。１ｍＬのカラム留分を収集し、ナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用してＥＶ含有留分を判定し、これとＢＣＡタンパク質定量アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＵＫ）との相関を調べた。ＳＰＡＲＴＡ分析の前に、ＥＶは－８０℃で冷凍保存した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ１０Ａ細胞株は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）から取得した。ＪＩＭＴ－１は、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から取得した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＪＩＭＴ－１細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＵＫ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。ＭＣＦ１０Ａ細胞を、５％（ｖ／ｖ）馬血清（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍＬコレラを毒素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で培養し、２日ごとに培地を交換した。ＥＶ分離の前に、細胞を無血清培地で２日間コンフルエントになるまで培養した後、馴化培地を収集し、１５００ｘｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍボトルトップフィルタを使用してろ過した。スピンろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、１００ｋＤａ）を使用して培地を約５００～１０００倍に濃縮し、５００μＬを直径１ｃｍ、長さ３０ｃｍのＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ２Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＵＫ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。１ｍＬのカラム留分を収集し、ナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用してＥＶ含有留分を判定し、これとＢＣＡタンパク質定量アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＵＫ）との相関を調べた。ＳＰＡＲＴＡ分析の前に、ＥＶは－８０℃で冷凍保存した。
【0088】
ＳＰＡＲＴＡ測定は、２０秒の高信号対雑音比積分時間、１秒の反復時間、および１秒のレーザ無効化時間で精製されたＥＶの２００μＬ試料で実行された。２００個の捕捉を開始し、各測定日に１０回の測定のためにＰＢＳバックグラウンドを収集した。取得したスペクトルは、宇宙スパイクの除去、バックグラウンド減算、平滑化、および正規化のためのカスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（２０１６ａ／ｂ）スクリプトを使用して処理された。ＰＬＳＤＡモデリングは、ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して実行された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図7f】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
