特許 7340879 肝がん再発予測用ＤＮＡメチル化マーカー及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-31

(45)【発行日】2023-09-08

(54)【発明の名称】肝がん再発予測用ＤＮＡメチル化マーカー及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20230901BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230901BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20230901BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68 ZNA

C12N15/11 Z

C12Q1/6886 Z

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2021550256

(86)(22)【出願日】2020-02-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-18

(86)【国際出願番号】 KR2020002727

(87)【国際公開番号】W WO2020175903

(87)【国際公開日】2020-09-03

【審査請求日】2021-08-27

(31)【優先権主張番号】10-2019-0024379

(32)【優先日】2019-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520181261

【氏名又は名称】レピディン・カンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ヨン・ジュン・キム

(72)【発明者】

【氏名】タ・ウォン・キム

(72)【発明者】

【氏名】テ・ユ・キム

(72)【発明者】

【氏名】クワン・ウォン・イ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・シル・ハ

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１５－００６１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０４６１９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／００９４３８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／１０２３７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Hepatology，2015年，Vol.61，pp.1945-1956

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）分析対象の肝組織試料からゲノムＤＮＡを分離する段階と、
（ｂ）配列番号１で表されるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを検出する段階と、
（ｃ）前記検出されたＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを正常肝組織で検出したメチル化レベルと比較する段階と、及び、
（ｄ）分析対象の肝組織で確認したＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルが正常肝組織のメチル化レベルの５０％以下の場合、肝がんの再発可能性が高いと判別する段階と、を含む、（医師による診断を除く）肝がんの再発予測方法。

【請求項2】

前記肝がんの再発予測方法は、段階（ｂ）において、配列番号２、配列番号３、又は、配列番号４によって表されるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化をさらに検出するものである、請求項１に記載の肝がんの再発予測方法。

【請求項3】

前記肝がんは、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である、請求項１に記載の肝がんの再発予測方法。

【請求項4】

前記方法は、肝がん患者の治療後、正常肝において肝がんの再発予後を予測するものである、請求項１に記載の肝がんの再発予測方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝がんの予後によってゲノムＤＮＡのメチル化レベルが異なる点を用いた肝がんの再発予測用ＤＮＡメチル化マーカー及びその用途に関し、具体的には、肝がん患者の治療後、正常肝組織において肝がんの再発の有無を予測するためのＤＮＡメチル化マーカーに関する。

【背景技術】

【0002】

肝がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）は、大きく肝細胞自体から発生した原発性肝がん（肝細胞がん；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｈｅｐａｔｏｍａ）と他の組織のがんが肝に転移してきた転移性肝がんに区分できる。肝がんの約９０％以上は、原発性肝がんであり、一般に肝がんとは、原発性肝がんを指すものと理解される。統計庁が２０１８年９月に発表した「２０１７死亡原因統計」によると、２０１７年人口１０万人あたり、がんで死亡した人は、１５３．９人で前年比１．０人（０．６％）増加した。がん死亡率は、肺がん（３５．１人）、肝がん（２０．９人）、大腸がん（１７．１人）、胃がん（１５．７人）、膵臓がん（１１．３人）の順で高かった。

【0003】

他のがんと同様に肝がんの治療も大きく根治的治療と保存的治療がある。ここで根治とは、がん自体を完全になくす治療を意味し、肝切除手術、肝移植、高周波熱治療などがある。また、このような治療が不可能な場合、頸動脈化学塞栓術、放射線治療、抗がん治療を行うことになる。しかし、このような治療によっては完治がほとんど難しいため、早期発見を通じて根治的治療をするのが検診の目的である。肝切除手術の場合、約５０％の患者においてがんの再発を経験することになるが、その理由は、切除されて残っている肝も正常な肝ではない肝炎にさらされているからである。

【0004】

肝がんの予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）は、肝がんが診断された後に肝がんの完治の可能性、治療後の再発の可能性、患者の生存の可能性など肝がんによる患者の各種状態を予測することを意味し、これは疾病の深刻性、診断時点、治療経過などの様々な条件に依存して変わる。肝がんは、その予後によって適切に様々な治療方法が適用されなければ、効率的な治療が不可能である。例えば、予後が良好であると予測される患者に対しては、攻撃的な化学治療や手術、放射線治療など患者に深刻な副作用を引き起こす可能性のある危険な治療方法は、避ける必要があり、相対的に穏健で保存的かつ安全な治療方法を選択しなければならない。逆に、予後不良が予測される患者に対しては、化学治療や手術、放射線治療のような治療方法を積極的に動員し、生存期間や確率を高めるために試みなければならない。

【0005】

しかし、肝がん患者の予後を正確に予測するのは、従来の技術では非常に難しい。予後の正確な予測のためには、患者を危険群別に分類する分析方法が必要であるが、現在までは肝がんの予後を正確に予測できる手段なしに診断時の臨床病理学的な肝がんの段階と１次的外科治療のみに依存して予後を判断しいるのが現状である。

【0006】

本発明者らは、このような問題を解決しようと努力した結果、肝がん組織のＤＮＡメチル化データに基づいて肝がん患者の予後を予測できる方法を用意した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、ＤＮＡメチル化マーカーを含む肝がんの再発予測用組成物と、これを用いた肝がんの再発の可能性を予測する方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記目的を達成するため、本発明の一態様は、配列番号１～４で表されるＤＮＡメチル化マーカーからなる群から選ばれる１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーを含む肝がんの再発予測用組成物を提供する。

【0009】

本発明において、前記配列番号１～４で表されるＤＮＡメチル化マーカーは、それぞれＣＧ遺伝子座の記号（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ８５０Ｋビーズアレイ ＣｐＧ ＩＤ）で表されるＤＮＡメチル化マーカーであるｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４を意味する。

【0010】

本明細書で使用される用語の「肝がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）」とは、肝組織に発生するがんを総称する用語であり、肝細胞自体から発生した原発性肝がん（肝細胞がん；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｈｅｐａｔｏｍａ）と他の組織のがんが肝に転移してきた転移性肝がんに区分できる。肝がんの治療には、肝切除術、肝移植、高周波熱治療術、頸動脈化学塞栓術など様々な治療法が使用されているが、５年生存率が３３．６％（２０１１年～２０１５年の平均；保健福祉部の統計）に過ぎず、再発率も７０％に達する。他のがん種に比べて、肝がんは、５年生存率は低く、再発率はかなり高いので、再発するかどうかを予測できる方法が必要である。

【0011】

本明細書で使用される用語の「ＤＮＡメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」とは、ゲノムＤＮＡにおいてシトシン塩基のＣ５－位置にメチル基が共有結合したことを意味する。メチル化レベルは、例えば、すべてのゲノム領域及び一部の非－ゲノム領域内のＤＮＡ塩基配列に存在するメチル化の量を意味し、本発明では、配列番号１～４で表されるＤＮＡメチル化マーカーのメチル化程度を意味する。前記配列番号１～４のＤＮＡメチル化マーカーにおいて、メチル化は、配列全体にわたって起こりうる。

【0012】

本発明において、前記肝がんの再発予測用組成物は、前記ＤＮＡメチル化マーカーのうち１つ以上、２つ以上、３つ以上または４つを含む組成物であってもよい。具体的には、前記肝がんの再発予測用組成物は、前記ＤＮＡメチル化マーカーｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４をそれぞれ１つずつ含んでもよく、２つの組み合わせであるｃｇ２１３２５７６０及びｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ２１３２５７６０及びｃｇ０６７０２７１８、ｃｇ２１３２５７６０及びｃｇ１５９９７２０４、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ０６７０２７１８、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ１５９９７２０４、またはｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４の組み合わせを含んでもよい。また、前記肝がんの再発予測用組成物は、３つのＤＮＡメチル化マーカーを含んでもよく、例えば、ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ０６７０２７１８、ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ１５９９７２０４、ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４、またはｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４の組み合わせを含んでもよい。併せて、前記肝がんの再発予測用組成物は、ＤＮＡメチル化マーカーｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４をすべて含んでもよい。

【0013】

本発明において、前記ＤＮＡメチル化マーカーｃｇ１５９９７２０４は、ＭＹＴ１Ｌ遺伝子に存在するマーカーであって、ＭＹＴ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｌｉｋｅ）遺伝子は、Ｃ－Ｃ－Ｈ－Ｃジンクフィンガータンパク質に属する転写因子をコードする。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）に公開されたデータによると、様々ながんにおいてＭＹＴ１Ｌが発現されるが、この遺伝子のメチル化レベルと肝がんの再発の有無の相関関係に対しては、まだ明確に知られていない。

【0014】

本発明において、前記ＤＮＡメチル化マーカーｃｇ２１３２５７６０は、ＭＡＧＥＬ２（ＭＡＧＥ（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｌ２）遺伝子に存在し、ＴＣＧＡのデータによると、精巣がんにおいて多く発現されるが、この遺伝子のメチル化レベルと肝がんの再発の有無との相関関係に対しては、まだ明確に知られていない。

【0015】

本発明の一具体例において、本発明者らは、肝がん組織からゲノムＤＮＡを分離した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ８５０Ｋビーズアレイでメチル化レベルを確認した。その結果、メチル化レベルによって肝がん組織が２つのグループに分類されることを確認し、前記両グループが肝がんの再発率において著しい差があることが分かった。以後、両グループにおいてメチル化レベルに著しい差のあるＤＮＡメチル化マーカーをランダムフォレストなどの機械学習技法で確認し、前記ＤＮＡメチル化マーカーを発掘した（表３参照）。また、１つのＤＮＡメチル化マーカーより４つのＤＮＡメチル化マーカーを併用する場合、肝がんの再発予測の正確度が１に収束することを確認し、本発明を完成した（図５及び表２）。

【0016】

本発明において、前記肝がんは、肝細胞自体から発生した肝細胞がんまたは他の組織のがんが肝に転移してきた転移性肝がんであってもよいが、好ましくは、肝細胞がんであってもよい。肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、肝で発生する悪性腫瘍の約９０％を占め、韓国と日本、東南アジア、中国などで多く発生する。ほとんどが肝硬変のある状態で発生するが、一部は、慢性Ｂ型またはＣ型肝炎により発生することもある。

【0017】

本明細書で使用される用語の「再発（ｒｅｌａｐｓｅ）」とは、肝がんの患者において肝がんを治療した後、肝で再び非正常な細胞増殖、すなわち、肝がんが発生することを意味する。前記肝がん患者の治療方法は、肝切除術、高周波熱治療術、頸動脈化学塞栓術、経皮的エタノール注入術などが使用されてもよいが、これに制限されない。

【0018】

本発明において、前記肝がんの予後予測用組成物は、ＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベル確認に必要な試薬などをさらに含む肝がんの再発予測用キットの形態で具現されてもよい。

【0019】

本発明の一態様は、下記段階を含む肝がんの再発予測方法を提供する。
（ａ）分析対象の肝組織からゲノムＤＮＡを分離する段階、
（ｂ）配列番号１～４で表されるＤＮＡメチル化マーカーからなる群から選ばれる１つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを検出する段階、及び
（ｃ）前記検出されたＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを正常肝組織で検出したＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルと比較する段階。

【0020】

本発明において、前記配列番号１～４で表されるＤＮＡメチル化マーカーは、それぞれＣＧ遺伝子座の記号（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ８５０ＫビーズアレイＣｐＧ ＩＤ）で表されるＤＮＡメチル化マーカーであるｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４を意味する。

【0021】

本発明の一具体例において、前記分析対象の肝組織は、分析対象個体から分離された肝がん組織、肝細胞がん組織、転移性肝がんまたは肝がんが転移した部位の転移がん組織であってもよく、好ましくは、肝細胞がん組織であってもよい。前記分析対象の肝組織を分析対象個体から分離する方法は、本発明が属する技術分野に知られている経皮生検、頸静脈生検などの方法を使用してもよい。

【0022】

本発明の一具体例において、前記肝がんの予後予測方法は、段階（ｂ）において少なくとも２つ以上のＤＮＡメチル化マーカーのメチル化を確認する方法であってもよい。本発明者らは、肝がんが再発するかどうかを予測できる４つのＤＮＡメチル化マーカー（プローブ）を発掘し（表２参照）、マーカーの数による肝がん再発予測の性能を評価した。評価の結果、マーカーが２つ以上の場合、正確度、敏感度などの性能が０．９に収束し、マーカーの数が３つ以上の場合には、肝がん再発予測性能が１に収束することを確認した（図５）。

【0023】

この結果から、本発明のＤＮＡメチル化マーカーは、単一で使用されても肝がん予後予測性能に優れているが、複数個使用する場合には、その性能が著しく優れていることが分かる。したがって、本発明のＤＮＡメチル化マーカーは、単一または複数個が組み合わされて肝がん再発予測の用途で使用されてもよい。

【0024】

具体的には、本発明のＤＮＡメチル化マーカーは、ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４がそれぞれ単一のマーカーで使用されてもよく、２つのマーカーの組み合わせ（ｃｇ２１３２５７６０及びｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ２１３２５７６０及びｃｇ０６７０２７１８、ｃｇ２１３２５７６０及びｃｇ１５９９７２０４、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ０６７０２７１８、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ１５９９７２０４、またはｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４）または３つのマーカーの組み合わせ（ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ０６７０２７１８、ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ１０５４４５１０及びｃｇ１５９９７２０４、ｃｇ２１３２５７６０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４、またはｃｇ１０５４４５１０、ｃｇ０６７０２７１８及びｃｇ１５９９７２０４）で使用されてもよい。また、前記４つのマーカーをすべて組み合わせて使用してもよい。

【0025】

本発明の一具体例において、前記肝がんの予後予測方法は、段階（ｃ）以後、分析対象サンプルで確認したＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルが正常肝組織のメチル化レベルより低い場合、肝がんの再発可能性が高いと判別する段階をさらに含んでもよい。

【0026】

本発明において、ＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルを確認する方法は、当業界に知られているＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシークエンシング、商業的に販売されるチップなどで行われてもよいが、これに制限されるものではない。

【0027】

本発明者らは、肝がんが再発した患者（ＭＧ２）においては、前記ＤＮＡメチル化マーカーのメチル化レベルが正常肝組織（Ｎ）より著しく低いことを確認したところ（図３、７及び８）、前記ＤＮＡメチル化マーカーは、肝がんの再発予測の用途で有用に使用されてもよい。

【発明の効果】

【0028】

本発明の肝がん再発予測用ＤＮＡメチル化マーカーを使用すると、肝がんの再発の有無を容易に予測でき、肝がん再発のリスクの高い患者に、より個人化した治療法を提供し、不必要な過剰治療を避けるための臨床情報を提供しうる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、肝細胞がんサンプル（Ａ；ｎ＝１４０））及び正常肝サンプル（Ｂ；ｎ＝９６）から分離したＤＮＡのメチル化レベルを確認した結果を示す。

【図2】図２は、肝細胞がんサンプル（ｎ＝１４０）を予後によってメチル化グループ１（ＭＧ１；ｎ＝８１）及びメチル化グループ２（ＭＧ２；ｎ＝５９）に分類した後、ＤＮＡのメチル化パターンによって各サンプルをコンセンサスクラスタリング方法で分類した結果を示す。

【図3】図３は、メチル化グループ１（ＭＧ１）及びメチル化グループ２（ＭＧ２）の無－再発生存期間（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＲＦＳ）を確認した結果を示す。

【図4】図４は、メチル化グループ１（ＭＧ１）及びメチル化グループ２（ＭＧ２）において変数重要度のプロット（ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｐｌｏｔ、ｖａｒＩｍｐＰｌｏｔ）を確認した後（Ａ）、メチル化グループ分類に関与する上位５０個のプローブを選別する過程を示す（Ｂ）。

【図5】図５は、メチル化グループ分類に関与するプローブの個数による肝がん予後予測効率をＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）値で確認した結果を示す。

【図6】図６は、正常肝サンプル（Ｎ）、メチル化グループ１（ＭＧ１）及びメチル化グループ２（ＭＧ２）においてメチル化グループ分類に関与するプローブのメチル化レベルを確認した結果を示す。

【図7】図７は、メチル化グループ分類に関与するプローブで自体的に生産した肝がん検証コホートデータを分類した結果を示す。

【図8】図８は、メチル化グループ分類に関与するプローブでＴＣＧＡ（ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｔｌａｓ）に公開された肝がんデータを分類した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下、１つ以上の具体例を実施例を通じて、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、１つ以上の具体例を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0031】

実験方法
１．肝細胞がん患者の募集
本発明に関連して行われた研究は、ソウル大学校病院（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）検討委員会の承認を受け、すべての患者から書面同意書を得て行われた。２０１１年から２０１６年までソウル大学校病院の外科で肝細胞がん（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；以下、ＨＣＣと記載する）切除術を受けた１８４人の患者を募集し、手術後にＣＴスキャンにより、きれいな微細境界（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍａｒｇｉｎｓ）及び腫瘍の完全切除を確認した。前記患者は、定期的に病院を訪問して血清腫瘍マーカー、アルファ－胎児蛋白（α－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）数値、造影ＣＴスキャン（ｃｏｎｔｒａｓｔ ＣＴ ｓｃａｎｓ）または磁気共鳴画像（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ、ＭＲＩ）を含む標準プロトコルに基づいて、３ヶ月ごとに再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）の有無に対してモニタリングが行われた。再発の有無は、早期（

【化1】

１年）及び後期（>１年）再発に分類し、ＨＣＣ切除術後、１年以内に再発した患者は除外した。人口統計学的データと臨床病理学的特徴は、病院チャートで確認し、前記患者は、切除術後に死亡するまで追跡調査を受けた。１年以内に再発した患者を除いた理由は、早期再発の場合、ＨＣＣ切除術が失敗したり、または肝がん以外の理由で再発する場合が多く、がんの治療後、純粋に正常肝で新しいがんが再発するのに関与するマーカーを発掘するための本発明の目的に合致していないからである。

【0032】

２．メチル化データ生成
前記１８２人のＨＣＣ患者のうち、手術後１年以内にＨＣＣが再発した４２人は、分析から除外した。残り１４０人の患者から得られた冷凍ＨＣＣサンプルからメーカーの指示によってＭａｇＬｉｓｔｏ^ＴＭ ５ＭゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用してＤＮＡを抽出した。各サンプルごとに５００ｎｇのＤＮＡを使用し、メーカーの標準プロトコルに基づいてＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰＩＣ ８５０Ｋ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）分析を行った。前記Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐｓは、すべての単一のヌクレオチドの分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）のために８５万個以上のＣｐＧサイトに対するＤＮＡメチル化値を含む。

【0033】

３．ＤＮＡメチル化データ加工
前記２．でＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐｓにより得られたデータに対し、公開ソフトウェアであるＲプラットフォーム（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｂｉｎ／ｗｉｎｄｏｗｓ／ｂａｓｅ／；バージョン３．３．２）でｍｉｎｆｉ Ｒパッケージを使用してメチル化データに対する事前－加工（ｐｒｅ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を行った。具体的には、ＨＣＣサンプルの原本（ｒａｗ）ＩＤＡＴファイルを加工し、背景補正及び染料偏差を訂正した。以後、メチル化及び非メチル化（ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）プローブの信号強度を測定し、各プローブのＤＮＡメチル化値を０（非メチル化）～１（完全メチル化）範囲のｂ－値（ｂ－ｖａｌｕｅ）で定量化した。次に、すべてのサンプルに対してデータ品質管理を行い、１４０個のサンプルが全て品質管理基準を通過した。最後に、メチル化データは、バッチ効果問題（ｂａｔｃｈ ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｏｂｌｅｍ）を減らすため、機能的正規化方法（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して正規化させた。

【0034】

４．ＤＮＡメチル化値（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ）
メチル化ｂ－値は、統計分析のために下記式１によりＭ－値に変換させた。

【0035】

[式１]
Ｍ－値＝ｌｏｇ（（ｂ－値）／（１－（ｂ－値）））

【0036】

Ｍ－値は、コンセンサスクラスタリング（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に使用し、ｂ－値は、ヒートマップ視覚化及びボックスプロットの生成に使用した。

【0037】

５．コンセンサスクラスタリング
コンセンサスクラスタリングは、ＣｏｎｃｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ（ｈｔｔｐｓ:／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｖｉｇｎｅｔｔｅｓ／ＣｏｎｃｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ／ｉｎｓｔ／ｄｏｃ／ＣｏｎｃｅｎｓｕｓＣｌｕｓｔｅｒＰｌｕｓ．ｐｄｆ）を使用してＨＣＣ小グループを確認するために行った。入力値（ｉｎｐｕｔ）としては、上位３,０００個の最も可変的なプローブ（中央値絶対偏差（ｍｅｄｉａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、ＭＡＤ））(ＭＡＤ ３Ｋ）を使用した。

【0038】

６．予後マーカー（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）選別
ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ）方法は、非線形効果（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ）をモデリングするために開発された機械学習アルゴリズムを基盤とする。本発明者らは、ＲプラットフォームのランダムフォレストＲパッケージを使用して良いか悪い予後を持つＨＣＣグループを区別できるプローブを発掘し、ＨＣＣ腫瘍サンプルを４つのトレーニングコホート（ｃｏｈｏｒｔ）と１つのテストコホートにランダムに分けて５倍交差検証（ｆｉｖｅ－ｆｏｌｄ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行った。その結果、本発明者らは、ランダムフォレストモデルを構築し、各グループの予想比率は、混同行列（ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ）（予測されたサンプルｖｓ観察されたサンプル）によって予測され、各モデルの性能は、曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）、敏感度及び特異度値に基づいて測定した。

【0039】

本発明者らは、ジニインデックス（Ｇｉｎｉ ｉｎｄｅｘ）、プローブ不純度（ｉｍｐｕｒｉｔｙ）の全体的減少及びランダムフォレストで測定した変数の重要度のドットチャートを考慮し、各プローブの重要度値を測定した。その結果、本発明者らは、ＨＣＣサンプルをメチル化グループ１及び２（以下、それぞれＭＧ１及びＭＧ２と記載する）に分類できる上位５０個のプローブを発掘した（図４）。以後、１つのプローブと上位５０個のプローブの性能効率を比較するとともに、ＡＵＣ値を考慮して最大効率を持つプローブの最小個数を確認した。

【0040】

７．遺伝子オントロジー及び経路分析（Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）
本発明者らは、ｉｎｎａｔｅＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｎａｔｅｄｂ．ｃｏｍ／）を使用して様々な経路検索及び遺伝子オントロジー分析を行った。前記ｉｎｎａｔｅＤＢでは、遺伝子オントロジー生物学的過程（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びリエクトムリソース（Ｒｅａｃｔｏｍｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を使用した。有意義なカットオフ基準は、ｐ－値＜０．０５であった。

【0041】

９．統計分析
カテゴリ変数（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ）の統計分析は、ピアソンカイ（χ^２）検定またはフィッシャー正確検証を使用して行った。無－再発生存（ｒｅｌａｐｓｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＲＦＳ）の中間期間は、カプラン－マイヤー法で計算し、互いに異なるグループ間の比較は、ログランク検定（ｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔｓ）で行った。

【0042】

実験結果
１．患者選別及び基本特性
１８２人のＨＣＣ患者のうち手術後１年以内にＨＣＣが再発した４２人は、分析から除外した。１４０個のＨＣＣサンプルのメチル化を確認した結果、ＨＣＣサンプルは、サンプル間でメチル化の変化が大きい反面、正常組織は、メチル化がほぼ一定に現れることが分かった（図１）。

【0043】

２．ＭＧ１とＭＧ２のメチル化プロファイル比較
１４０個のＨＣＣサンプルをＤＮＡメチル化パターンによって分類した結果、メチル化グループ１（ｎ＝８１）及びグループ２（ｎ＝５９）（以下、それぞれＭＧ１及びＭＧ２と記載する）に分けられることを確認した（図２のＡ）。また、ＭＧ２のメチル化プロファイルは、非腫瘍性肝組織のメチル化プロファイルと最も異なっており、ＭＧ１のメチル化プロファイルは、非腫瘍性肝組織のメチル化プロファイルと類似していた（図２のＢ）。ＭＧ１は、無－再発生存（ＲＦＳ）の期間が長い反面、ＭＧ２は、無－再発生存が短く、予後が悪いことが分かった（図３）

【0044】

このような後性的変化は、信号伝達、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）及びＧタンパク質－共役受容体（ＧＰＣＲ）信号伝達経路と関連があった（表１）。本発明者らが前記グループのＧＯ（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ）システムに基づいて一連の遺伝子を解析する際に、上位５０個のプローブは、理化過程、神経伝達物質の分泌、分子機能の調節、Ｗｎｔ信号伝達経路、細胞移動調節、ｍＲＮＡ代謝過程、小さな（ｓｍａｌｌ）ＧＴＰａｓｅ媒介信号伝達、遺伝子発現調節、細胞死滅過程の調節と関連があった。

【0045】

【表1】

【0046】

３．ＨＣＣ再発予測マーカー選別
変数重要度のプロット（ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｐｌｏｔ、ｖａｒＩｍｐＰｌｏｔ）を用いて、ＨＣＣサンプルをＭＧ１及びＭＧ２に分類できる上位５０個のプローブを発掘した（図４）。以後、プローブ数による性能効率を比較するとともに、ＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）値を考慮し、最大の効率を持つプローブの最小個数を選んだ。その結果、プローブの個数が３つ以上の場合、肝がん再発予測の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）が１に収束することが分かった（図５及び表２）。下記表２に記載された文字は、それぞれの正確度（Ａｃｃｕ．）、敏感度（Ｓｅｎ．）及び特異度（Ｓｐｅｃ．）を意味する。

【0047】

【表2】

【0048】

前記表２の結果に基づいて、最終的に下記表３に記載されたプローブを選別し、プローブは、重要度値が高い順に記載した。

【0049】

【表3】

【0050】

下記表４に表３に記載されたプローブの配列を記載した。

【0051】

【表4】

【0052】

＊ゲノム配列において、[ＣＧ]は、該ＣＧマーカーが標的するメチル化部位を意味する。

【0053】

３．ＨＣＣ再発予測マーカー検証
ランダムフォレスト法を使用して、表３に記載されたプローブに対してメチル化レベルを確認した結果、正常肝組織（緑色）は、メチル化レベルがほぼ１００％に近づいて一定のレベルであり、ＭＧ１（赤色）は、正常肝組織と類似したメチル化レベルを示す反面、ＭＧ２（灰色）は、メチル化レベルが正常肝組織に比べて約５０％以下であることが確認できた（図６；Ｘ軸は、選別されたマーカー、Ｙ軸は、メチル化レベルを意味するｂ－値）。

【0054】

また、１４０個のＨＣＣサンプルをランダムに訓練データと検証データに分け、表３のプローブで再テストした結果、既存のＭＧ１は、再びＭＧ１に分類され、既存のＭＧ２も再びＭＧ２に分類されることが確認できた（表５）。

【0055】

【表5】

【0056】

本発明者が自体的に生産した肝がんコホートデータを前記表３のプローブで検証した。その結果、メチル化レベルによって肝がんコホートデータが２つのグループ（Ｐｒｅ＿ＭＧ１及びＰｒｅ＿ＭＧ２）に分類され、Ｐｒｅ＿ＭＧ２において再発率が高いことが確認できた（図７のＡ）。また、ＲＦＳを確認した結果、Ｐｒｅ＿ＭＧ２に比べてＰｒｅ＿ＭＧ１のＲＦＳが有意に長いことが確認できた（ｐ＝０．０１３６；図７のＢ）。この結果は、本発明のプローブで肝がんの再発の有無を成功的に予測できることを意味する。

【0057】

また、表３のプローブで公開データベースであるＴＣＧＡ（ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｔｌａｓ）肝がんデータに対して同様に検証した結果、肝がん患者がグループ（Ｐｒｅ＿ＭＧ１及びＰｒｅ＿ＭＧ２）に分類され（図８のＡ）、これらのグループは、予後が異なることが分かった（図８のＢ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

0007340879000001.app