特許 7340895 ＹＫＬ－４０標的ヒト単一クローン抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-08-31

(45)【発行日】2023-09-08

(54)【発明の名称】ＹＫＬ－４０標的ヒト単一クローン抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20230901BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230901BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230901BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230901BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230901BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K39/395 N

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022516421

(86)(22)【出願日】2020-09-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-24

(86)【国際出願番号】 KR2020012036

(87)【国際公開番号】W WO2021049830

(87)【国際公開日】2021-03-18

【審査請求日】2022-03-11

(31)【優先権主張番号】10-2019-0112572

(32)【優先日】2019-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】522099434

【氏名又は名称】セネリックス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】キム，デ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】カン，キョン ジェ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユン ジ

(72)【発明者】

【氏名】イ，セ ラ

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ジン テ

【審査官】中根 知大

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５３１６０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０９－５０２０９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平１０－５１３３４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０００２５８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Mol. Cancer Ther.，2011年，10(5)，pp.742-751

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＹＫＬ－４０に特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片であって、前記単一クローン抗体又はその断片は、下記の領域を含むことを特徴とする、単一クローン抗体又はその断片：
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【請求項2】

前記単一クローン抗体又はその断片は、下記の領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその断片：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【請求項3】

前記単一クローン抗体は、ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその断片。

【請求項4】

請求項１の単一クローン抗体又はその断片をコーディングする核酸分子。

【請求項5】

前記核酸分子は、下記の領域を含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸分子。
（ａ）配列番号２１の塩基配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２の塩基配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２３の塩基配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号２７の塩基配列からなるＣＤＲ１、配列番号２８の塩基配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２９の塩基配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【請求項6】

前記核酸分子は、下記の領域を含むことを特徴とする、請求項４に記載の核酸分子。
（ａ）配列番号１７の塩基配列からなる重鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号１９の塩基配列からなる軽鎖可変領域。

【請求項7】

請求項４の核酸分子を含む組換え発現ベクター。

【請求項8】

請求項７の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体。

【請求項9】

請求項１の単一クローン抗体又はその断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬学的組成物。

【請求項10】

前記癌は、乳房癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、頭頸部癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌及び骨髓癌からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

請求項１の単一クローン抗体又はその断片を有効成分として含む癌の診断用組成物。

【請求項12】

前記癌は、乳房癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、頭頸部癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌及び骨髓癌からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は、ＹＫＬ－４０に特異的に結合する単一クローン抗体、これをコーディングする核酸分子、前記単一クローン抗体を含む癌の予防又は治療用薬学的組成物、及び前記単一クローン抗体を含む癌の診断用組成物に関する。

【0002】

〔背景技術〕
抗体は、特定の抗原と結合する免疫タンパク質である。ヒト及びマウスを始めとしたほとんどの哺乳動物において、抗体は、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドが対をなして形成される。それぞれの鎖は、可変領域（Ｆｖ）及び不変領域（Ｆｃ）と呼ばれる２個の領域からなっている。軽鎖及び重鎖可変領域は、分子の抗原結合決定基を含み、標的抗原との結合に関与する。不変領域は、抗体の群（又は同基準標本型）を限定し（例えば、ＩｇＧ）、効果器作用と呼ばれる一連の重要な機能上の各特性を付与する、多数のＦｃ受容体及びＦｃリガンドとの結合に関与する。例えば、標的に対する特異性、免疫作用機序を媒介する能力及び長い血清半減期などのいくつかの重要な抗体の特性により、抗体は強力な治療剤として使用されている。

【0003】

ファージディスプレイ技術は、英国の医学研究会議（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）で１９９０年に初めて開発されたものであって、ヒト抗体ライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）を製造し、抗体切片（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ）の形態でバクテリオファージの表面に発現させ、特定の抗原に対する各抗体クローンを選別する技術である。抗原と特異的に反応するほぼ全ての種類のヒト組換え単一クローン抗体を単一ポット（ｐｏｔ）抗体ライブラリシステムから選別できる可能性が提案されており、これにより、ファージディスプレイ抗体技術を活用する場合、体内診断や治療に応用できる多様な抗体断片（Ｆａｂ又はＳｃＦｖ形態）を獲得することができる。

【0004】

関連先行技術文献としては、米国登録特許第７，６７０，５９９号がある。

【0005】

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、ＹＫＬ－４０に特異的に結合する単一クローン抗体を提供することにある。

【0006】

本発明の他の目的は、前記単一クローン抗体をコーディングする核酸分子を提供することにある。

【0007】

本発明の更に他の目的は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供することにある。

【0008】

本発明の更に他の目的は、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。

【0009】

本発明の更に他の目的は、前記単一クローン抗体を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

【0010】

本発明の更に他の目的は、前記単一クローン抗体を有効成分として含む癌の診断用組成物を提供することにある。

【0011】

〔課題を解決するための手段〕
前記目的を達成するために、本発明は、ＹＫＬ－４０に特異的に結合する単一クローン抗体を提供する。

【0012】

本発明の一実施例において、前記単一クローン抗体は、（ａ）序列番号５のアミノ酸序列からなるＣＤＲ１、序列番号６のアミノ酸序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号７のアミノ酸序列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号１１のアミノ酸序列からなるＣＤＲ１、序列番号１２のアミノ酸序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号１３のアミノ酸序列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むものであったり、（ａ）序列番号８のアミノ酸序列からなるＣＤＲ１、序列番号９のアミノ酸序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号１０のアミノ酸序列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号１４のアミノ酸序列からなるＣＤＲ１、序列番号１５のアミノ酸序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号１６のアミノ酸序列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むものであり得る。

【0013】

本発明の一実施例において、前記単一クローン抗体は、（ａ）序列番号１のアミノ酸序列からなる重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号３のアミノ酸序列からなる軽鎖可変領域；を含むものであったり、（ａ）序列番号２のアミノ酸序列からなる重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号４のアミノ酸序列からなる軽鎖可変領域；を含むものであり得る。

【0014】

本発明の一実施例において、前記単一クローン抗体はヒト化抗体であり得る。

【0015】

また、本発明は、前記単一クローン抗体をコーディングする核酸分子を提供する。

【0016】

本発明の一実施例において、前記核酸分子は、（ａ）序列番号２１の塩基序列からなるＣＤＲ１、序列番号２２の塩基序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号２３の塩基序列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号２７の塩基序列からなるＣＤＲ１、序列番号２８の塩基序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号２９の塩基序列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むものであったり、（ａ）序列番号２４の塩基序列からなるＣＤＲ１、序列番号２５の塩基序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号２６の塩基序列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号３０の塩基序列からなるＣＤＲ１、序列番号３１の塩基序列からなるＣＤＲ２、及び序列番号３２の塩基序列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むものであり得る。

【0017】

本発明の一実施例において、前記核酸分子は、（ａ）序列番号１７の塩基序列からなる重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号１９の塩基序列からなる軽鎖可変領域；を含むものであったり、（ａ）序列番号１８の塩基序列からなる重鎖可変領域；及び（ｂ）序列番号２０の塩基序列からなる軽鎖可変領域；を含むものであり得る。

【0018】

また、本発明は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0019】

また、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。

【0020】

また、本発明は、前記単一クローン抗体を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

【0021】

本発明の一実施例において、前記癌は、乳房癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、頭頸部癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌及び骨髓癌からなる群から選ばれるいずれか一つであり得る。

【0022】

また、本発明は、前記単一クローン抗体を有効成分として含む癌の診断用組成物を提供する。

【0023】

本発明の一実施例において、前記癌は、乳房癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、頭頸部癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌及び骨髓癌からなる群から選ばれるいずれか一つであり得る。

【0024】

〔発明の効果〕
本発明のＹＫＬ－４０は、癌の増殖及び転移と関連しており、ＹＫＬ－４０に特異的に結合する単一クローン抗体は、癌の増殖及び転移を抑制するという効果を有し、本発明の単一クローン抗体は、癌の診断、予防又は治療に有用に使用可能である。

【0025】

〔図面の簡単な説明〕
図１ａは、ファージディスプレイを通じてヒトＹＫＬ－４０との有意的な結合能を示す抗体を選別する過程を示す模式図で、図１ｂ乃至図１ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定（ｐａｎｎｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）結果を示した図である。

【0026】

図２ａ及び図２ｂは、ファージディスプレイから選別された７個のヒトＹＫＬ－４０に対する抗体を示した図である。

【0027】

図３ａは、ファージディスプレイを通じてマウスＹＫＬ－４０との有意的な結合能を示す抗体を選別する過程を示す模式図で、図３ｂ乃至図３ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定結果を示した図である。

【0028】

図４は、ファージディスプレイから選別された６個のマウスＹＫＬ－４０に対する抗体を示した図である。

【0029】

図５ａ乃至図５ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体を有する６個のクローン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【0030】

図６ａ及び図６ｂは、６個のヒトＹＫＬ－４０抗体に対するＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果を示した図である。

【0031】

図７は、６個のヒトＹＫＬ－４０抗体に対してＥＬＩＳＡを通じてＥＣ５０値を測定した結果を示した図である。

【0032】

図８ａ及び図８ｂは、マウスＹＫＬ－４０抗体を有する４個のクローン（Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【0033】

図９ａ及び図９ｂは、４個のマウスＹＫＬ－４０抗体に対するＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果を示した図である。

【0034】

図１０は、４個のマウスＹＫＬ－４０抗体に対してＥＬＩＳＡを通じてＥＣ５０値を測定した結果を示した図である。

【0035】

図１１ａ及び図１１ｂは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）クローンがヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に交差結合するかどうかをＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【0036】

図１２ａ乃至図１２ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）のヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に対する抗原親和性を測定した結果を示した図である。

【0037】

図１３ａ乃至図１３ｄは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数（ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を測定した結果を示した図である。

【0038】

図１４ａ乃至図１４ｄは、候補抗体としてマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数を測定した結果を示した図である。

【0039】

図１５ａ及び図１５ｂは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２及びＨ４；及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２及びＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺表面の腫瘍面積（ｔｕｍｏｒ ａｒｅａ）を測定した結果を示した図である（ｎ＝３）。

【0040】

図１６ａ乃至図１６ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺組織で腫瘍結節（ｔｕｍｏｒ ｎｏｄｕｌｅ）の数を測定した結果を示した図である（ｎ＝８）。

【0041】

〔発明を実施するための形態〕
本発明における「抗体」という用語は、免疫学的に特定の抗原との反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、多クローン抗体及び単一クローン抗体を全て含む概念である。また、前記用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）及び異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝工学によって生産された形態を含む。

【0042】

本発明における「単一クローン抗体」という用語は、当該分野に公知となった用語であって、単一抗原性部位に対して指示される高度の特異的な抗体を意味する。通常、相違する各エピトープ（抗原決定基）に対して指示される相違する各抗体を含む多クローン抗体とは異なり、単一クローン抗体は、抗原上の単一決定基に対して指示される。単一クローン抗体は、抗原－抗体結合を用いる診断及び分析学的分析法の選択性と特異性を改善させるという長所を有し、また、ハイブリドーマ培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンによって汚染しないという長所も有する。

【0043】

典型的に、免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域（前記部位は、「ドメイン」としても知られている）を含む。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の可変領域及び４個の「構造領域」（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ－末端から始めて順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。

【0044】

前記「重鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域序列を有するアミノ酸序列を含む可変領域ドメインＶ_Ｈ及び３個の不変領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。前記「軽鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域序列を有するアミノ酸序列を含む可変領域ドメインＶ_Ｌ及び不変領域ドメインＣ_Ｌを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。

【0045】

本発明における「可変」という用語は、各抗体間で特定の領域の序列が大きく異なり、特定の抗原に対してそれぞれの特定の抗体の結合特異性を示すのに使用されることを意味する。抗体の可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するのではなく、ＣＤＲに集中する。単一クローン抗体の重鎖及び軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを有し、これらの領域がニキビ菌の表面抗原を認識することによって抗原－抗体複合体を形成する。このようなＣＤＲは、それぞれの単一クローン抗体ごとに特徴的な序列を有し、一つの単一クローン抗体が特定のエピトープを認識するために、これらの６個のＣＤＲの一部又は全てが相互作用し得る。

【0046】

本発明における「ファージディスプレイ技術」という用語は、ファージライブラリから標的抗原との有意的な結合能を示すファージのみを選別することを通じて、抗原との結合能を示す抗体を選別する技術を示す。前記技術において、「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」は、ファージの外壁（ｃｏａｔ）にペプチドを発現（ｄｉｓｐｌａｙ）するファージライブラリから、標的分子（抗体、酵素、細胞表面受容体など）と結合する性質を有するペプチドを表面に発現しているファージのみを選択する過程を示す。このような過程を３回乃至１０回繰り返し、標的抗原に対して有意的な結合能を示す抗体を選別することができ、選別された抗体をヒト化単一クローン抗体として製造することができる。

【0047】

本発明の単一クローン抗体は、ＹＫＬ－４０に特異的に結合できる範囲内で添付の序列リストに記載されたアミノ酸序列の変異体を含むことができる。例えば、単一クローン抗体の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性を改善させるために、単一クローン抗体のアミノ酸序列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば、単一クローン抗体のアミノ酸序列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸の変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて構成される。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基で；アラニン、グリシン及びセリンは類似する大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似する形状を有することが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物であると言える。変異を導入するにおいて、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。それぞれのアミノ酸には、疎水性及び電荷によって疎水性インデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）。タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するにおいて、疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似する疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換したとき、類似する生物学的活性を保有できることは公知の事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の疎水性インデックスの差を示すアミノ酸間の置換を行う。

【0048】

一方、類似する親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が、均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすこともよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されたように、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の親水性値の差を示すアミノ酸間の置換を行う。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸の交換は、当該分野に公知となっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の単一クローン抗体又はこれをコーディングする核酸分子は、序列リストに記載された序列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す序列も含むものと解釈される。前記実質的な同一性は、上述した本発明の序列と任意の他の序列とを最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた序列を分析した場合、少なくとも６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す序列を意味する。

【0049】

本発明における「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。本発明の単一クローン抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸分子の塩基序列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

【0050】

本発明で製作されるベクターは、宿主細胞で所望の遺伝子を発現できるように構築される。一般に、前記ベクターのアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）及びダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にそれぞれ作動的に結合されたプローモーター及びターミネーターが位置する。

【0051】

本発明における「プローモーター」という用語は、コーディング序列又は機能的ＲＮＡの発現を調節するＤＮＡ序列を意味する。本発明の組換えベクターにおいて、目的塩基序列は前記プローモーターに作動的に連結される。

【0052】

本発明における「作動的に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、核酸発現調節序列（例：プローモーター序列、シグナル序列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸序列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節序列は、前記他の核酸序列の転写及び／又は翻訳を調節するようになる。

【0053】

本発明のベクターシステムは、当業界に公知となった多様な方法を通じて構築され得る。また、これに対する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されている。本発明のベクターは、典型的に発現のためのベクターとして構築され得る。

【0054】

本発明のベクターを形質転換体である宿主細胞内に運搬する方法は、熱ショック方法、ＣａＣｌ_２方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０－２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０－２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７－５８０（１９８３））及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：６１２７－６１４５（１９８８））などによって実施され得る。

【0055】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。本発明における「薬学的に許容可能な」という用語は、前記組成物に露出する細胞やヒトに毒性のない特性を示すことを意味する。前記担体は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤、基剤、賦形剤、潤滑剤などの当業界に公知となったものであれば制限なく使用することができる。

【0056】

また、本発明の薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができ、さらに、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤又はゲルの形態の皮膚外用剤の形態で使用することができる。本発明の組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合は、通常的に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。

【0057】

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記ボチョウジ抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの各潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあるが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。

【0058】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明における「投与」という用語は、適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、目的組織に到逹し得る限り、如何なる一般的な経路であってもよい。前記組成物の投与経路としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与があり得るが、これに制限されない。

【0059】

前記「個体」という用語は、ヒトを含むラット、マウス、家畜などの全ての動物を意味し、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物であり得る。

【0060】

前記「薬学的に有効な量」という用語は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険割合で疾患を治療するのに十分で、且つ副作用を起こさない程度の量を意味し、有効容量水準は、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、配合又は同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素によって当業者が容易に決定することができる。投与は、前記推奨投与量を１日に一度行うこともでき、数回に分けて行うこともできる。

【0061】

以下では、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることはない。

【0062】

〔実施例〕
実施例１．ファージディスプレイライブラリパンニング（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｐａｎｎｉｎｇ）
ＹＫＬ－４０（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－３－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子によってコーディングされる約４０ｋＤａの分泌糖タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であって、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などの多様な細胞で発現されて分泌されるものと知られている。また、最近の研究によると、ＹＫＬ－４０は、癌細胞の増殖、生存及び転移で重要な役割をするものと推定されている。さらに、先行研究において、ＹＫＬ－４０は、４９個の疾病のうち３８個が癌と関連することから発現が抑制され、このうち８個が肺癌と関連していることを確認した。そこで、本発明者等は、ＹＫＬ－４０の発現を抑制できる抗体を発掘するための実験を行った。

【0063】

ＹＫＬ－４０に対する抗体としては、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術を通じてヒトＹＫＬ－４０（ｈＹＫＬ－４０）との有意的な結合能を示す抗体を選別した（図１ａ乃至図１ｄ）。ｈＹＫＬ－４０との結合能は、ｈＹＫＬ－４０ファージに対するＥＬＩＳＡを通じて確認した。簡単に、ｈＹＫＬ－４０抗原は、１ウェル当たり３０ｎｇずつ固定され、抗原が固定されたウェルは、ＭＰＢＳ（ＰＢＳ内の５％のスキムミルク）でブロッキング処理した後、ｈＹＫＬ－４０ファージ及びｍＹＫＬ－４０ファージを添加して反応させた。結合されたファージを検出するために、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ内の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、Ａｎｔｉ－Ｍ１３－ＨＲＰ（１：５，０００）を添加して反応させた。最後に、ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＴＭＢ（３，３'，５，５'－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質を添加することによって発色反応を誘導し、２ＮＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を終決させた後、波長４５０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。

【0064】

その結果、Ｆａｂ－Ｉライブラリ及びＦａｂ－ＩＩライブラリでは７個のｈＹＫＬ－４０に対する抗体を有するクローンが選別され、ｓｃＦｖライブラリではクローンが形成されなかった（図２ａ及び図２ｂ）。Ｆａｂ－Ｉライブラリにおける２個のクローンは３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及び３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）と記載し、ＫＦａｂ－ＩＩライブラリにおける５個のクローンは、それぞれ３Ａ１１－Ｆ２（Ｈ３）、３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）、３Ｄ１２－Ｆ２（Ｈ５）、３Ｅ１２－Ｆ２（Ｈ６）及び３Ｇ７－Ｆ２（Ｈ７）と記載した。

【0065】

また、マウスＹＫＬ－４０（ｍＹＫＬ－４０）との有意的な結合能を示す抗体を選別し（図３ａ乃至図３ｄ）、ｍＹＫＬ－４０との結合能は、ｍＹＫＬ－４０ファージに対するＥＬＩＳＡを通じて確認したが、簡単に、ｍＹＫＬ－４０抗原は、１ウェル当たり３０ｎｇずつ固定され、抗原が固定されたウェルは、ＭＰＢＳ（ＰＢＳ内の５％のスキムミルク）でブロッキング処理した後、ｈＹＫＬ－４０ファージ及びｍＹＫＬ－４０ファージを添加して反応させた。結合されたファージを検出するために、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ内の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、Ａｎｔｉ－Ｍ１３－ＨＲＰ（１：５，０００）を添加して反応させた。最後に、ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＴＭＢ（３，３'，５，５'－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質を添加することによって発色反応を誘導し、２ＮＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を終決させた後、波長４５０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。その結果、Ｆａｂ－ＩＩライブラリでは６個の抗体が選別され、Ｆａｂ－Ｉ又はｓｃＦｖライブラリではクローンが形成されなかった（図４）。Ｆａｂ－ＩＩライブラリにおける６個のクローンは、それぞれ４Ａ１２－Ｆ２（Ｍ１）、４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）、４Ｄ１０－Ｆ２（Ｍ４）、４Ａ７－Ｆ２（Ｍ５）及び４Ａ１－Ｆ２（Ｍ６）と記載した。

【0066】

実施例２．ＩｇＧ生産及び特性分析
本発明者等は、選別されたＹＫＬ－４０ファージをヒト抗体のＩｇＧ形態に転換させ、これを検証する実験を行った。簡単に、選別されたＹＫＬ－４０ファージは、Ｅｘｐｉ２９３細胞株に形質感染させた後で培養し、培養されたＥｘｐｉ２９３細胞株の細胞培養液３００ｍｌからＩｇＧを精製した。精製されたＩｇＧに対しては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて分子量及び純粋分離度を確認した。

【0067】

その結果、ｈＹＫＬ－４０抗体を有する６個のクローンでＩｇＧを生産したが、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）では最終的に０．２３７ｍｇのＩｇＧが生産され、３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）では最終的に１．８４ｍｇのＩｇＧが生産され、３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）では最終的に６．５ｍｇのＩｇＧが生産され、３Ｄ１２－Ｆ２（Ｈ５）では最終的に０．３ｍｇのＩｇＧが生産され、３Ｅ１２－Ｆ２（Ｈ６）では最終的に０．８ｍｇのＩｇＧが生産され、３Ｇ７－Ｆ２（Ｈ７）では最終的に５．３ｍｇのＩｇＧが生産された（図５ａ乃至図５ｃ）。

【0068】

また、本発明者等は、ＳＥＣ（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を通じて単一抗体の有無を確認し、ＥＬＩＳＡを通じて各抗体に対するＥＣ５０値によって抗原親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を測定する実験を行った。その結果、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）、３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）、３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）、３Ｄ１２－Ｆ２（Ｈ５）、３Ｅ１２－Ｆ２（Ｈ６）及び３Ｇ７－Ｆ２（Ｈ７）は、いずれもＳＥＣで単一ピーク（ｐｅａｋ）を示すことから単一抗体であることが確認された（図６ａ及び図６ｂ）。ＥＬＩＳＡ結果により、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）におけるＥＣ５０値が５８２ｐＭ（０．５８２ｎＭ）として最も低いＥＣ５０値であることが確認された（図７）。

【0069】

本発明者等は、選別されたマウスＹＫＬ－４０ファージに対しても同一の実験を行った。その結果、４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）では最終的に１．６ｍｇのＩｇＧが生産され、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）では最終的に３．６ｍｇのＩｇＧが生産され、４Ｄ１０－Ｆ２（Ｍ４）では最終的に６．３ｍｇのＩｇＧが生産され、４Ａ７－Ｆ２（Ｍ５）では最終的に０．７ｍｇのＩｇＧが生産された（図８ａ及び図８ｂ）。

【0070】

また、ＳＥＣ結果により、４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）、４Ｄ１０－Ｆ２（Ｍ４）及び４Ａ７－Ｆ２（Ｍ５）は、いずれも単一ピークを示すことから単一抗体であることが確認された（図９ａ及び図９ｂ）。ＥＬＩＳＡ結果により、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）におけるＥＣ５０値が６７ｐＭ（０．０６７ｎＭ）として最も低いＥＣ５０値であることが確認された（図１０）。

【0071】

また、本発明者等は、ｈＹＫＬ－４０及びｍＹＫＬ－４０に対してそれぞれ最も低いＥＣ５０値を示した３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）と４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）クローンがｈＹＫＬ－４０とｍＹＫＬ－４０に交差結合するかどうかを調査するために、各抗体のＦａｂタンパク質を用いたＥＬＩＳＡを行った。その結果、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）はｈＹＫＬ－４０にのみ結合することが確認され、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）はｈＹＫＬ－４０とｍＹＫＬ－４０に交差結合することが確認された（図１１ａ及び図１１ｂ）。

【0072】

ＥＬＩＳＡで得られたＥＣ５０値を再確認するために、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）装備を用いて４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）と３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）に対する抗原親和性を測定した。二つの抗体に対して、ｈＹＫＬ－４０とｍＹＫＬ－４０を用いて交差結合実験を進めた。ＡＲ２Ｇ（Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ２^ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）センサーを用いて各抗原タンパク質を固定し、各抗体を濃度別（０μＭ～１μＭ）に結合させる直接固定化方法（ｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用した。その結果、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）の場合は、ｍＹＫＬ－４０及びｈＹＫＬ－４０に対してそれぞれ６．７×１０^－８Ｍ及び５．７×１０^－８ＭのＫ_Ｄ値であることを確認し、マウスとヒト抗原タンパク質がいずれも類似する水準で結合することを確認した。３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）の場合は、ｍＹＫＬ－４０とは結合しないことを確認し、ｈＹＫＬ－４０では５．０×１０^－１１ＭのＫ_Ｄ値であることを確認した（図１２ａ乃至図１２ｃ）。

【0073】

実施例３．試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での候補抗体の抗癌効能分析
本発明者等は、ＹＫＬ－４０に対する各候補抗体を肺癌細胞株に処理した場合、癌転移を抑制する効果があるかどうかを確認する実験を行った。簡単に、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株の移動を透過性挿入物（８μｍ ｐｏｒｅ ｔｒａｎｓ－ｗｅｌｌ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）で定量的に行った。候補抗体として、ｈＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）、３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）、３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）、３Ｄ１２－Ｆ２（Ｈ５）、３Ｅ１２－Ｆ２（Ｈ６）及び３Ｇ７－Ｆ２（Ｈ７）；及びｍＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）、４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）、４Ｄ１０－Ｆ２（Ｍ４）及び４Ａ７－Ｆ２（Ｍ５）をそれぞれ肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に１μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、候補抗体が処理されたＡ５４９及びＨ４６０細胞をそれぞれ１ウェル当たり２．０×１０^４細胞になるように入れ、加湿インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で１７時間にわたって培養した。培養後、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで２分間固定させた後、１×ＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を１５分間１００％のメタノールで透過させ、２０分間トリパンブルーで染色した。ウェル内部の移動していない細胞を綿棒で除去し、×２００倍率で光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によってキャプチャーしたイメージをＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。

【0074】

その結果、ｈＹＫＬ－４０に対する６個の抗体を処理した場合、Ａ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株のいずれにおいても、対照群に比べて移動した細胞数が減少したことを確認し、特に、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）、３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）及び３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）抗体を処理した場合は、移動した細胞数が著しく減少したことを確認した（図１３ａ乃至図１３ｄ）。同様に、ｍＹＫＬ－４０に対する４個の抗体を処理した場合、Ａ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株のいずれにおいても、対照群に比べて移動した細胞数が減少したことを確認し、特に、４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）抗体を処理した場合は、移動した細胞数が著しく減少したことを確認した（図１４ａ乃至図１４ｄ）。

【0075】

前記結果により、選別された３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）、３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）、３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）、４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）抗体の場合、ＹＫＬ－４０タンパク質を抑制し、肺癌細胞の転移を抑制する効果があることを確認した。

【0076】

実施例４．動物実験（ｉｎ ｖｉｖｏ）での候補抗体の抗癌効能分析
本発明者等は、細胞株実験で選別された５個の候補抗体を肺転移動物モデルに処理した場合、癌転移を抑制するという効果があるかどうかを確認する実験を行った。簡単には、マウス１匹当たりＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞（３．７５×１０４ｃｅｌｌｓ）を尾静脈注射（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）方式で入れることによって肺転移させた後、一週間に１回ずつ合計３週間にわたって、マウスにｈＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）、３Ｂ１２－Ｆ１（Ｈ２）及び３Ｂ７－Ｆ２（Ｈ４）；及びｍＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ１２－Ｆ２（Ｍ２）及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）を０．５ｍｇ／ｋｇずつ投与した。黒色腫細胞を投与してから３週後に肺を摘出し、肺表面に存在する腫瘍面積を測定した。

【0077】

その結果、ｈＹＫＬ－４０抗体のうち３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）、及びｍＹＫＬ－４０抗体のうち４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）を処理した場合、対照群に比べて肺表面の腫瘍面積が著しく減少したことを確認した（図１５ａ及び図１５ｂ）。これは、細胞株でのＥＣ５０値を測定した結果と一貫した結果であって、Ｈ１及びＭ３抗体が肺癌の転移を抑制する効果を有することを確認した。

【0078】

また、本発明者等は、前記結果から選別されたＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）に対する検証のために実験動物の数を増加させ、癌転移を抑制する効果があるかどうかを確認する実験を行った。その結果、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）のいずれも、対照群に比べて肺組織の表面で腫瘍結節の数が減少し、肺癌の転移を抑制する効果を有し、特に、３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）抗体は、最も著しく腫瘍結節の数を抑制する効果を有することを確認した（図１６ａ乃至図１６ｃ）。

【0079】

前記結果により、ＹＫＬ－４０に対する３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）抗体は、肺癌を抑制する著しい効果を有することを確認した。

【0080】

実施例５．抗体序列分析
本発明者等は、前記結果から癌を抑制する効果を有する３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）抗体及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）抗体の序列を分析した。３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）抗体及び４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）抗体に対する重鎖可変領域のアミノ酸序列は下記の表１の通りであって、軽鎖可変領域のアミノ酸序列は下記の表２の通りである。また、重鎖可変領域のうちＣＤＲ１乃至ＣＤＲ３のアミノ酸序列は下記の表３の通りであって、軽鎖可変領域のうちＣＤＲ１乃至ＣＤＲ３のアミノ酸序列は下記の表４の通りである。

【0081】

また、前記抗体をコーディングする核酸分子に対する重鎖可変領域の塩基序列は下記の表５の通りであって、軽鎖可変領域の塩基序列は下記の表６の通りである。また、重鎖可変領域のうちＣＤＲ１乃至ＣＤＲ３をコーディングする塩基序列は下記の表７の通りであって、軽鎖可変領域のうちＣＤＲ１乃至ＣＤＲ３をコーディングする塩基序列は下記の表８の通りである。

【0082】

【表1】

【0083】

【表2】

【0084】

【表3】

【0085】

【表4】

【0086】

【表5】

【0087】

【表6】

【0088】

【表7】

【0089】

【表8】

【図面の簡単な説明】

【0090】

【図1a】図１ａは、ファージディスプレイを通じてヒトＹＫＬ－４０との有意的な結合能を示す抗体を選別する過程を示す模式図である。

【図1b】図１ｂ乃至図１ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定（ｐａｎｎｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）結果を示した図である。

【図1c】図１ｂ乃至図１ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定（ｐａｎｎｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）結果を示した図である。

【図1d】図１ｂ乃至図１ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定（ｐａｎｎｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）結果を示した図である。

【図2a】図２ａ及び図２ｂは、ファージディスプレイから選別された７個のヒトＹＫＬ－４０に対する抗体を示した図である。

【図2b】図２ａ及び図２ｂは、ファージディスプレイから選別された７個のヒトＹＫＬ－４０に対する抗体を示した図である。

【図3a】図３ａは、ファージディスプレイを通じてマウスＹＫＬ－４０との有意的な結合能を示す抗体を選別する過程を示す模式図で、図３ｂ乃至図３ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定結果を示した図である。

【図3b】図３ｂ乃至図３ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定結果を示した図である。

【図3c】図３ｂ乃至図３ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定結果を示した図である。

【図3d】図３ｂ乃至図３ｄは、それぞれＦａｂ－Ｉ、Ｆａｂ－ＩＩ及びｓｃＦｖに対するパンニング滴定結果を示した図である。

【図4】図４は、ファージディスプレイから選別された６個のマウスＹＫＬ－４０に対する抗体を示した図である。

【図5a】図５ａ乃至図５ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体を有する６個のクローン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【図5b】図５ａ乃至図５ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体を有する６個のクローン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【図5c】図５ａ乃至図５ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体を有する６個のクローン（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【図6a】図６ａ及び図６ｂは、６個のヒトＹＫＬ－４０抗体に対するＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果を示した図である。

【図6b】図６ａ及び図６ｂは、６個のヒトＹＫＬ－４０抗体に対するＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果を示した図である。

【図7】図７は、６個のヒトＹＫＬ－４０抗体に対してＥＬＩＳＡを通じてＥＣ５０値を測定した結果を示した図である。

【図8a】図８ａ及び図８ｂは、マウスＹＫＬ－４０抗体を有する４個のクローン（Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【図8b】図８ａ及び図８ｂは、マウスＹＫＬ－４０抗体を有する４個のクローン（Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５）からＩｇＧ生産を確認するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果及びＩｇＧ生産量の測定結果を示した図である。

【図9a】図９ａ及び図９ｂは、４個のマウスＹＫＬ－４０抗体に対するＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果を示した図である。

【図9b】図９ａ及び図９ｂは、４個のマウスＹＫＬ－４０抗体に対するＳＥＣ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）結果を示した図である。

【図10】図１０は、４個のマウスＹＫＬ－４０抗体に対してＥＬＩＳＡを通じてＥＣ５０値を測定した結果を示した図である。

【図11a】図１１ａ及び図１１ｂは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）クローンがヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に交差結合するかどうかをＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【図11b】図１１ａ及び図１１ｂは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）クローンがヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に交差結合するかどうかをＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【図12a】図１２ａ乃至図１２ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）のヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に対する抗原親和性を測定した結果を示した図である。

【図12b】図１２ａ乃至図１２ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）のヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に対する抗原親和性を測定した結果を示した図である。

【図12c】図１２ａ乃至図１２ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体である３Ａ１０－Ｆ１（Ｈ１）及びマウスＹＫＬ－４０抗体である４Ｅ３－Ｆ２（Ｍ３）のヒトＹＫＬ－４０抗原及びマウスＹＫＬ－４０抗原に対する抗原親和性を測定した結果を示した図である。

【図13a】図１３ａ乃至図１３ｄは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数（ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を測定した結果を示した図である。

【図13b】図１３ａ乃至図１３ｄは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数（ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を測定した結果を示した図である。

【図13c】図１３ａ乃至図１３ｄは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数（ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を測定した結果を示した図である。

【図13d】図１３ａ乃至図１３ｄは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６及びＨ７をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数（ｍｉｇｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）を測定した結果を示した図である。

【図14a】図１４ａ乃至図１４ｄは、候補抗体としてマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数を測定した結果を示した図である。

【図14b】図１４ａ乃至図１４ｄは、候補抗体としてマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数を測定した結果を示した図である。

【図14c】図１４ａ乃至図１４ｄは、候補抗体としてマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数を測定した結果を示した図である。

【図14d】図１４ａ乃至図１４ｄは、候補抗体としてマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５をＡ５４９細胞株及びＨ４６０細胞株に処理した後、移動した細胞数を測定した結果を示した図である。

【図15a】図１５ａ及び図１５ｂは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２及びＨ４；及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２及びＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺表面の腫瘍面積（ｔｕｍｏｒ ａｒｅａ）を測定した結果を示した図である（ｎ＝３）。

【図15b】図１５ａ及び図１５ｂは、候補抗体としてヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１、Ｈ２及びＨ４；及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ２及びＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺表面の腫瘍面積（ｔｕｍｏｒ ａｒｅａ）を測定した結果を示した図である（ｎ＝３）。

【図16a】図１６ａ乃至図１６ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺組織で腫瘍結節（ｔｕｍｏｒ ｎｏｄｕｌｅ）の数を測定した結果を示した図である（ｎ＝８）。

【図16b】図１６ａ乃至図１６ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺組織で腫瘍結節（ｔｕｍｏｒ ｎｏｄｕｌｅ）の数を測定した結果を示した図である（ｎ＝８）。

【図16c】図１６ａ乃至図１６ｃは、ヒトＹＫＬ－４０抗体であるＨ１及びマウスＹＫＬ－４０抗体であるＭ３を肺転移動物モデルに処理した後、肺組織で腫瘍結節（ｔｕｍｏｒ ｎｏｄｕｌｅ）の数を測定した結果を示した図である（ｎ＝８）。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6a】

【図6b】

【図7】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10】

【図11a】

【図11b】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【図13a】

【図13b】

【図13c】

【図13d】

【図14a】

【図14b】

【図14c】

【図14d】

【図15a】

【図15b】

【図16a】

【図16b】

【図16c】