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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-08-31
(45)【発行日】2023-09-08
(54)【発明の名称】微小流体装置
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230901BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230901BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20230901BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20230901BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12M1/34 D
G01N37/00 101
C12N1/00 B
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020541502
(86)(22)【出願日】2019-02-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-06-03
(86)【国際出願番号】 SE2019050134
(87)【国際公開番号】W WO2019160491
(87)【国際公開日】2019-08-22
【審査請求日】2022-02-14
(31)【優先権主張番号】1850168-4
(32)【優先日】2018-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(73)【特許権者】
【識別番号】517180431
【氏名又は名称】アストレゴ ダイアグノスティクス エービー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】バルテキン，オズデン
(72)【発明者】
【氏名】オーマン，オーヴ
(72)【発明者】
【氏名】ロブマール，マーティン
(72)【発明者】
【氏名】エルフ，ジョアン
(72)【発明者】
【氏名】オルソン，ミカエル
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３３７５００（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１８８９６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2017年，Vol.114, No.34，pp.9170-9175, Supporting information
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的細胞を収容するように適合されたセルチャネル（２０）を有する基板（１０）と、第１の流体ポート（３１）と流体接続する第１の端部（３２）を有する流入チャネル（３０）であって、前記セルチャネル（２０）のそれぞれの第１の端部（２２）が、前記流入チャネル（３０）と流体接続している、流入チャネル（３０）と、
第３の流体ポート（４１）と流体接続する流出チャネル（４０）であって、前記セルチャネル（２０）のそれぞれの第２の端部（２４）が、前記流出チャネル（４０）と流体接続しており、前記セルチャネル（２０）が、前記標的細胞がそれぞれの障害物（２５）を通過して前記流出チャネル（４０）に入ることを防ぐように設計されたそれぞれの障害物（２５）を備える、流出チャネル（４０）と、
フィルタチャネル（６０）およびプレフィルタチャネル（７０）を備えるプレフィルタ（５０）であって、
前記フィルタチャネル（６０）は、第１のフィルタポート（６１）と流体接続する第１の端部（６２）および第２のフィルタポート（６５）と流体接続する第２の端部（６４）を有し、
前記プレフィルタチャネル（７０）は、前記標的細胞を収容するように適合され、前記プレフィルタチャネル（７０）のそれぞれの第１の端部（７２）は、前記フィルタチャネル（６０）と流体接続しており、かつ前記プレフィルタチャネル（7０）のそれぞれの第２の端部（７４）は、前記流入チャネル（３０）と流体接続しており、
流量制御装置（１００）は、前記標的細胞および前記フィルタチャネル（６０）の前記第１の端部（６２）および前記第２の端部（６４）の間を前後する混合粒子を含む生体試料の流れを誘導するように構成され、あるいは、前記第１のフィルタポート（６１）および前記第２のフィルタポート（６５）の間の前記生体試料の循環流であって、前記第１のフィルタポート（６１）および前記第２のフィルタポート（６５）の間の流体接続を介して循環流を誘導するように構成されることを特徴とする、プレフィルタ（５０）、
を備える微少流体装置（１）。
【請求項2】
前記流量制御装置（１００）が、前記流入チャネル（３０）から前記プレフィルタチャネル（７０）を通り前記フィルタチャネル（６０）に流体流を誘導するように構成される、請求項１に記載の微小流体装置（１）。
【請求項3】
前記流量制御装置（１００）が、前記流入チャネル（３０）から前記プレフィルタチャネル（７０）を通り前記フィルタチャネル（６０）に、かつ前記流入チャネル（３０）から前記セルチャネル（２０）を通り前記流出チャネル（４０）に前記流体流を誘導するように構成される、請求項２に記載の微小流体装置（１）。
【請求項4】
前記フィルタチャネル（６０）が第１のフィルタチャネル（６０）であり；前記プレフィルタチャネル（７０）が第１のプレフィルタチャネル（７０）であり；
前記プレフィルタ（５０）が、
第３のフィルタポート（８１）と流体接続する第１の端部（８２）を有する第２のフィルタチャネル（８０）と、
前記標的細胞を収容するように適合された第２のプレフィルタチャネル（９０）を備え、前記第２のプレフィルタチャネル（９０）のそれぞれの第１の端部（９２）が、前記第２のフィルタチャネル（８０）と流体接続しかつ前記第２のプレフィルタチャネル（９０）のそれぞれの第２の端部（９４）が、前記流入チャネル（３０）と流体接続し、
前記第１のプレフィルタチャネル（７０）の前記それぞれの第２の端部（７４）が前記第２のフィルタチャネル（８０）と流体接続している、
ことを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の微小流体装置（１）。
【請求項5】
前記第１のプレフィルタチャネル（７０）が、前記第２のプレフィルタチャネル（９０）と比較してより大きい直径又はより大きい高さ及び／又は幅を有することを特徴とする、請求項４に記載の微小流体装置（１）。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の微小流体装置（１）を操作する方法であって、前記方法が以下の工程：前記標的細胞および前記フィルタチャネル（６０）の前記第１の端部（６２）および前記第２の端部（６４）の間を前後する混合粒子を含む生体試料の流れを誘導する工程（Ｓ１）；または
前記第１のフィルタポート（６１）および前記第２のフィルタポート（６５）の間の前記生体試料の循環流であって、前記第１のフィルタポート（６１）および前記第２のフィルタポート（６５）の間の流体接続を介して前記循環流を誘導する工程（Ｓ１）；
を含み、かつ
前記プレフィルタチャネル（７０）を介して前記流入チャネル（３０）から流体流を前記フィルタチャネル（６０）に誘導する工程（Ｓ２）であって、工程Ｓ２により、前記プレフィルタ（５０）を洗浄して前記プレフィルタチャネル（７０）を目詰まりさせる混合粒子を除去し、かつ／または前記プレフィルタチャネル（７０）の入口を遮断する前記混合粒子を除去する、工程（Ｓ２）、
を含む、方法。
【請求項7】
前記工程S２が、前記流入チャネル（３０）から前記プレフィルタチャネル（７０）を通り前記フィルタチャネル（６０）に、かつ前記流入チャネル（３０）から前記セルチャネル（２０）を通り前記流出チャネル（４０）に流体流を誘導する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記工程S２が、流体流を、前記流出チャネル（４０）から前記セルチャネル（２０）の少なくとも一部を通って前記流入チャネル（３０）に、かつ前記プレフィルタチャネル（７０）を通って前記フィルタチャネル（６０）に誘導することを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、一般に、微小流体装置を対象とし、特に、混入粒子及び標的細胞を含む生体試料の分析に使用できるそのような微小流体装置を対象とする。
本発明は、一般に、微小流体装置を対象とし、特に、混入粒子及び標的細胞を含む生体試料の分析に使用できるそのような微小流体装置を対象とする。
【背景技術】
【0002】
背景
単細胞生物学での最近の進展により、同質遺伝子細胞は、同一の条件下で成長した場合にも、遺伝子発現及び挙動に大きな差異を示し得ることが明らかになった。それにより、経時的な表現型における細胞間の差異を特徴付けるために、新しい装置が必要とされる。そのような装置は、単一の細胞を培養及び監視する際に有効なツールであるために、特定の基準を満たす必要がある。例えば、これらの装置は、投入直後に表現型特性を監視できるように、細胞の投入が容易であるべきである。さらに、多くの異なる個々の細胞を並行して成長させて、細胞間の差異を特徴付け、かつ平均化による個々の細胞の特性評価における測定誤差を克服する必要がある。これらの装置は、例えば、系統依存的動態を監視するために、一定のかつ十分に制御された成長条件下で長期間細胞の培養を可能にするように設計されなければならない。装置が、新しい培養培地又は試験剤に応答して動態変化を監視するために培養条件を変更できるならば、さらに好ましい。例えば、並行して同質遺伝子細胞に対して異なる培養培地を試験するか、又は並行して異なる細胞株での培地変化に対する応答を監視することが有利であり得る。
単細胞生物学での最近の進展により、同質遺伝子細胞は、同一の条件下で成長した場合にも、遺伝子発現及び挙動に大きな差異を示し得ることが明らかになった。それにより、経時的な表現型における細胞間の差異を特徴付けるために、新しい装置が必要とされる。そのような装置は、単一の細胞を培養及び監視する際に有効なツールであるために、特定の基準を満たす必要がある。例えば、これらの装置は、投入直後に表現型特性を監視できるように、細胞の投入が容易であるべきである。さらに、多くの異なる個々の細胞を並行して成長させて、細胞間の差異を特徴付け、かつ平均化による個々の細胞の特性評価における測定誤差を克服する必要がある。これらの装置は、例えば、系統依存的動態を監視するために、一定のかつ十分に制御された成長条件下で長期間細胞の培養を可能にするように設計されなければならない。装置が、新しい培養培地又は試験剤に応答して動態変化を監視するために培養条件を変更できるならば、さらに好ましい。例えば、並行して同質遺伝子細胞に対して異なる培養培地を試験するか、又は並行して異なる細胞株での培地変化に対する応答を監視することが有利であり得る。
【0003】
微小流体装置の所望の用途は、標的細胞が微小流体装置に投入された直後に、抗生物質又は他の試験薬剤のセットに対する生体試料中の細菌などの標的細胞の表現型応答を迅速にかつ並行して監視することである。そのような用途では、分析の速度を上げるために、生体試料を微小流体装置に直接投入できることが有利である。
【0004】
「マザーマシン（Ｍｏｔｈｅｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）」と名付けられた従来技術の微小流体装置が、Ｗａｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、２０：１０９９－１１０３に開示されている。マザーマシンは、並行して多数の異なるセルチャネルで細胞を監視することを可能にする。しかしながら、この従来技術の微小流体装置は、いくつかの欠点を有する。例えば、細胞投入が複雑であり、微小流体装置中の培養条件を急速に変更することが困難である。
【0005】
生体試料の分析に有用なさらなる微小流体装置は、ＷＯ ２０１６／００７０６３及びＷＯ ２０１６／００７０６８に示されている。
【0006】
Ｂａｌｔｅｋｉｎら、ＰＮＡＳ ２０１７、１１４（３４）：９１７０－９１７５は、微小流体装置を使用する、高速抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）試験であるＦＡＳＴｅｓｔについて開示している。濾過サイズを徐々に減少させる異なるゾーンを有するフィルタ領域が微小流体装置のポートに設けられて、粉塵、成長培地中の大きな沈殿物及び気泡を捕捉する。
【0007】
そうでなければ微小流体装置中で標的細胞の捕捉を妨げ得る混入粒子を含む生体試料に使用できる、微小流体装置の必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
一般的な目的は、混入粒子を含む生体試料を投入できる微小流体装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
この及び他の目的は、本明細書に開示される実施形態によって達成される。
【発明の効果】
【0010】
実施形態の態様は、標的細胞を収容するように適合されたセルチャネルを有する基板を含む微小流体装置に関する。微小流体装置はまた、第１の流体ポートと流体接続する第１の端部と、第３の流体ポートと流体接続する流出チャネルとを有する流入チャネルを備える。セルチャネルのそれぞれの第１の端部は流入チャネルと流体接続し、セルチャネルのそれぞれの第２の端部は流出チャネルと流体接続する。セルチャネルは、標的細胞がそれぞれの障害物を通過して流出チャネルに入るのを阻止するように設計されたそれぞれの障害物を備える。微小流体装置は、第１のフィルタポートと流体接続する第１の端部を有するフィルタチャネルと、標的細胞を収容するように適合されたプレフィルタチャネルとをさらに備える。プレフィルタチャネルのそれぞれの第１の端部はフィルタチャネルと流体接続し、プレフィルタチャネルのそれぞれの第２の端部は流入チャネルと流体接続する。
【0011】
実施形態の別の態様は、実施形態に従い微小流体装置を操作する方法に関する。本方法は、流入チャネルからプレフィルタチャネルを通ってフィルタチャネルに流体流を誘導することを含む。
【0012】
微小流体装置は、標的細胞に加えて、生体試料中に存在する混入粒子を捕捉及び／又は排除するか、又はそのような混入粒子がセルチャネルに入る危険性を少なくとも著しく低減するように設計されたプレフィルタを備える。プレフィルタは、そうでなければプレフィルタ及びセルチャネルを通る生体試料の流れを妨害する混入粒子を目詰まりさせることなく洗浄することができる。それにより、微小流体装置は、高濃度の混入粒子及び／又は混入粒子に対して低い比率の標的細胞を含む生体試料に使用することができる。
【0013】
本実施形態は、そのさらなる目的及び利点と共に、添付の図面と共に以下の説明を参照することにより最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
図面全体を通して、同様の又は対応する要素には同じ参照番号が使用される。
【0016】
本発明は一般に、微小流体装置を対象とし、特に、混入粒子及び標的細胞を含む生体試料の分析に使用できるそのような微小流体装置を対象とする。
【0017】
微小流体装置は、生体試料中に存在する標的細胞を分析及び監視して、表現型及び／又は遺伝子型の特徴並びに形質などの標的細胞の様々な特徴を決定することを提案されてきた。この手法は一般に、液体培地中に標的細胞を主に含む実質的に純粋な生体試料の場合に、又は生体試料が比較的高い濃度で標的細胞を含む場合に良好に機能する。
【0018】
しかしながら、いくつかの用途では、生体試料は、複雑であり、いわゆる混入粒子をさらに含み、かつ／又は比較的低い濃度で標的細胞を含み得る。混入粒子は、標的細胞以外の細胞、細胞破片並びに粉塵及び／又は塵粒子などの非細胞材料を含み得る。これらの用途において、混入粒子は、微小流体装置を詰まらせることによって、微小流体装置での生体試料中に存在する標的細胞の効率的な捕捉を阻止する場合がある。さらに、生体試料が、標的細胞と比較して、比較的高い濃度の混入粒子を含む場合に、混入粒子は、微小流体装置での捕捉中に標的細胞と競合し、その結果、微小流体装置中で標的細胞を全く又はほとんど捕捉しない場合がある。いずれの場合も、微小流体装置で捕捉される標的細胞の数は、標的細胞の効率的な分析を行い、かつその特徴を決定するのに十分ではない。
【0019】
典型的な状況は、（仮の）敗血症患者から採取された血液試料を有することである。そのような場合、血液試料は、多くの場合、標的細胞として比較的低い濃度の感染原因菌と、混入粒子としての比較的はるかに高濃度の白血球（ＷＢＣ）及び赤血球（ＲＢＣ）とを含む。
【0020】
これは、そのような血液試料が微小流体装置に投入されると、ＷＢＣ及びＲＢＣが、細菌が捕捉されるべき微小流体装置中のセルチャネルを妨害及び閉塞させ、かつ／又は実質的に全てのセルチャネルを占有する場合があることを意味する。その結果、そのような血液試料を有する微小流体装置では、細菌が全く又はほとんど捕捉されない。
【0021】
フィルタを備える微小流体装置が、Ｂａｌｔｅｋｉｎら、ＰＮＡＳ２０１７、１１４（３４）：９１７０－９１７５で提案されている。次いで、微小流体装置は、投入ポート中にフィルタ領域を含む。このフィルタ領域は、投入培地中の粉塵及び大きな沈殿物を捕捉し、培地から気泡を除去するのに有効であり得る。しかしながら、血液試料などの、標的細胞と類似の大きさの混入粒子が多く存在する生体試料は、最終的にフィルタ領域を目詰まりさせ、それによって、ポートを通る、さらに微小流体装置中への血液の流れを防ぐ。
【0022】
そのため、ＷＢＣ及びＲＢＣを有する血液試料などの混入粒子を含む生体試料の分析に使用できる微小流体装置の必要性が存在する。
【0023】
本実施形態の微小流体装置は、混入粒子の少なくとも一部を除去するように設計されたプレフィルタを備え、それによって、微小流体装置内の標的細胞を捕捉するために使用されるセルチャネルに到達し得るそのような混入粒子の数を抑えるか又は少なくとも著しく減少させる。実施形態の微小流体装置及びプレフィルタの重要な利点は、プレフィルタが混入粒子によって目詰まりしたり妨害されたりする場合にそれを洗浄できることである。プレフィルタのこのような洗浄は、微小流体装置の動作中に、標的細胞が既にセルチャネルに捕捉されている場合であっても行うことができる。
【0024】
そのため、生体試料が、プレフィルタ及び微小流体装置を詰まらせる場合があるそのような混入粒子を比較的多く含む場合であっても、プレフィルタを洗浄して、そのような目詰まり混入粒子を除去し、それによって、微小流体装置内の生体試料から標的細胞を捕捉し続けることができる。
【0025】
図１は、一実施形態による微小流体装置１の図である。微小流体装置１は、標的細胞を収容するように適合され、細胞捕捉とも呼ばれるセルチャネル２０を有する基板１０を備える。微小流体装置１はまた、第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０を備える。セルチャネル２０のそれぞれの第１の端部２２は流入チャネル３０と流体接続する。微小流体装置１はさらに、第３の流体ポート４１と流体接続する流出チャネル４０を備える。セルチャネル２０のそれぞれの第２の端部２４は流出チャネル４０と流体接続する。セルチャネル２０は、標的細胞がそれぞれの障害物２５を通過し流出チャネル４０に入るのを阻止するか、又は少なくとも抑制するように設計されたそれぞれの障害物２５を備える。微小流体装置１は、さらにプレフィルタ５０を備える。プレフィルタ５０は、第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０を備える。プレフィルタ５０はまた、標的細胞を収容するように適合されたプレフィルタチャネル７０を備える。プレフィルタチャネル７０のそれぞれの第１の端部７２は、フィルタチャネル６０と流体接続し、プレフィルタチャネル７０のそれぞれの第２の端部７４は、流入チャネル３０と流体接続する。
【0026】
微小流体装置１の基板１０は、複数の、すなわち、少なくとも２つ、最も一般的には数十、数百、又は数千又は数百万のセルチャネル２０を有し、セルチャネル２０は、流入チャネル３０と流出チャネル４０の間に延在している。セルチャネル２０は好ましくは、図１に示されるように互いに平行であり、第１の端部２２は流入チャネル３０と流体接続し、反対の第２の端部２４は流出チャネル４０と流体接続している。したがって、流入チャネル３０に存在する生体試料は、セルチャネル２０を通って流れ、さらに流出チャネル４０に流入し、第３のポート４１を通って流出し得る。
【0027】
セルチャネル２０は、流入チャネル３０で生体試料中に存在する標的細胞がセルチャネル２０に入るのを可能にするのに十分に大きい幅及び高さ又は直径などのサイズ、並びに形状を有する寸法である。プレフィルタ５０を通過し、大きすぎるか、又はセルチャネル２０の断面サイズ及び形状に適合しないサイズ及び／又は形状を有する混入粒子はいずれも、第１の端部２２を通ってセルチャネル２０に入らない。
【0028】
特定の実施形態では、セルチャネル２０の寸法は、１００ｎｍ～１００μｍの範囲である。
【0029】
セルチャネル２０の障害物２５は、標的細胞が障害物２５を通過して流出チャネル４０に入るのを阻止する、直径、幅及び／又は高さなどの形状及び寸法を有するように設計される。したがって、標的細胞は、細胞チャネル２０に閉じ込められ、捕捉されるようになる。
【0030】
セルチャネル２０の障害物２５は好ましくは、図１に示すように、セルチャネル２０の第２の端部２４に配置されるか又はこれと接続している。これは、セルチャネル２０あたり２個以上の標的細胞の捕捉及び／又はセルチャネル２０内での標的細胞の成長、すなわち分裂を可能にする。
【0031】
混入粒子が入口、すなわち、セルチャネル２０の第１の端部２２を塞ぐ危険性を防止するか又は少なくとも著しく低減するために、生体試料中の標的細胞がセルチャネル２０に入って、その中に捕捉されることを阻止するために、プレフィルタ５０は、セルチャネル２０の上流に配置される。これは、プレフィルタ５０が、生体試料中に存在する混入粒子の少なくとも重要な部分を効果的に除去することにより、そのような混入粒子が流入チャネル３０及びセルチャネル２０に到達するのを阻止するか、又はそのような混入粒子の数を低下させることを意味する。
【0032】
図１に示すプレフィルタ５０の実施形態では、プレフィルタ５０は、好ましくは互いに平行である複数のプレフィルタチャネル７０を備える。これらのプレフィルタチャネル７０は、一実施形態では、セルチャネル２０が有するような障害物２５を有しないことを除いて、セルチャネル２０と実質的に類似していてよい。
【0033】
次いで、プレフィルタチャネル７０は、セルチャネル２０と同じ断面サイズ及び形状を有するか、又は標的細胞がプレフィルタチャネル７０に入りそこを通って流れることができる限り、異なるそのような断面サイズ及び／又は形状を有してよい。
【0034】
プレフィルタチャネル７０は、フィルタチャネル６０の第１の端部７２から流入チャネル３０の第２の端部７４に向かって移動するときに、実質的に均一な断面サイズ及び形状を有してよい。別の実施形態では、断面サイズ及び／又は形状は、第１の端部７２から第２の端部７４へと連続的に又は１以上の工程でのいずれかで変化してよい。例えば、プレフィルタチャネル７０の直径、幅又は高さは、第２の端部７４と比較して、第１の端部７２でより大きくてよい。プレフィルタチャネル７０のこの狭小化は連続的であってよく、すなわち第１の端部７２から第２の端部７４に向かうときに、直径、幅又は高さを滑らかに減少させる。あるいは、プレフィルタチャネル７０の狭小化は、１以上の工程で段階的であり得る。
【0035】
基板材料間に配置された平行なプレフィルタチャネル７０を有する実施形態は単に、プレフィルタ５０の例示的な例として見られるべきである。図７及び８は、プレフィルタチャネル７０を有するプレフィルタ５０の他の実施形態を示す。図７では、フィルタチャネル６０と流入チャネル３０の間でプレフィルタ５０に複数のピラー７１が配置されている。これらの複数のピラー７１は、ピラー７１間及びフィルタチャネル６０から流入チャネル３０へと延びるプレフィルタチャネル７０を形成する。一実施形態では、ピラー７１は、フィルタチャネル６０と流入チャネル３０の間のいわゆるプレフィルタ領域又はゾーン７５で均一に分布される。そのような実施形態では、隣接するピラー７１間のピラー間距離は、プレフィルタ領域又はゾーン７５全体にわたって実質的に同じである。代替的な実施形態では、ピラー７１は、フィルタチャネル６０と投入チャネル３０の間に延在し標的細胞がフィルタチャネル６０からプレフィルタ領域又はゾーン７５を通って流入チャネル３０に流入することを可能にするのに十分な寸法を有するプレフィルタチャネル７０がある限り、プレフィルタ領域又はゾーン７５上で多かれ少なかれランダムに分布してよい。
【0036】
さらなる実施形態では、ピラー間の距離は、フィルタチャネル６０から流入チャネル３０に向かうときに、連続的に又は段階的に、プレフィルタ領域又はゾーン７５上で変化してよい。例えば、ピラー間の距離は、フィルタチャネル６０近くの隣接ピラー７１間に比べて、流入チャネル３０近くの隣接ピラー７１間でより小さくてよい。
【0037】
図８は、プレフィルタ５０の別の実施形態を示す。この実施形態では、プレフィルタ領域又はゾーン７５は、その間に開口部を有するフィルタ構造７３の列又はアレイを備える。これらの開口部は、それによって、標的細胞がフィルタ構造７３の列又はアレイを通過するのを可能にする。そのため、プレフィルタ領域又はゾーン７５は、図に示すようにプレフィルタチャネル７０を備える。
【0038】
図８では、フィルタ構造７３の単一の列又はアレイは、プレフィルタ領域又はゾーン７５に配置されている。これは単に、例示的な例として見られるべきである。実際には、基本的にフィルタ構造７３のマトリクスを形成するために、次々に配置される複数のそのような列又はアレイを有することが可能である。そのような場合、異なる列のフィルタ構造７３は互いに整列されてよく、又は互いに少なくとも部分的にずれていてもよい。前者の場合は、プレフィルタチャネル７０はフィルタ構造７３の開口部間で直線のチャネルであるが、後者の場合は、プレフィルタチャネル７０は、フィルタ構造７３の異なる列の中のずれた開口部間でジグザグである。
【0039】
複数の列又はアレイのフィルタ構造７３の場合、隣接するフィルタ構造７３間の距離は、全ての列又はアレイで同じである、すなわち、均一な開口部を有してよい。あるいは、隣接するフィルタ構造７３間の距離は、異なる列間で異なってよく、例えば、そのような距離はより大きく、それによって、距離と比較してフィルタチャネル６０に近接するフィルタ構造７３の列の開口部を有し、それによって、流入チャネル３０に近いフィルタ構造７３の列の開口部を有する。
【0040】
図１でのような平行なプレフィルタチャネル７０、図７のようなピラー画定プレフィルタチャネル７０及び図８のようなフィルタ構造７３の間のプレフィルタチャネル７０を有するよりも、プレフィルタ領域又はゾーン７５にプレフィルタチャネル７０を形成するさらなる代替方法がある。本実施形態はそれにより、これらの例示的な実施例に限定されるものではない。例えば、フィルタチャネル６０と流入チャネル３０の間でプレフィルタ領域若しくはゾーン７５に配置される基板又は半透過性膜構造を通って延在する連続的な孔を、プレフィルタチャネル７０として代替的に使用することができる。
【0041】
以下では、微小流体装置１の様々な実施形態をより詳細に、かつ図１によるプレフィルタ領域又はゾーン７５を有するプレフィルタ５０と共に説明する。しかしながら、微小流体装置１のこれらの様々な実施形態は、図７又は図８の中のものなどの他のプレフィルタの実施形態を代替的に有してもよい。
【0042】
図１に示すような微小流体装置１の動作中に、生体試料は、好ましくは、第１のフィルタポート６１を介して微小流体装置１内に投入される。生体試料は、フィルタチャネル６０を通って、プレフィルタチャネル７０に流入する。生体試料中に存在し、十分に大きなサイズ、形状及び／又は剛性を有する混入粒子は、プレフィルタチャネル７０の第１の端部７２に入ることを阻止され、それによってフィルタチャネル６０に残る。しかしながら、生体試料中に存在するいかなる標的細胞も、第１の端部７２に入り、プレフィルタチャネル７０を通って流入チャネル３０に流入する。プレフィルタチャネル７０のサイズ及び／又は寸法が変わる場合、混入粒子は実際には、第１の端部７２を通ってプレフィルタチャネル７０に入ってもよいが、その後、大きすぎるか、又はさらにプレフィルタ領域若しくはゾーン７５を通ってプレフィルタチャネル７０の第２の端部７４に向かって流れるのを阻止する形状を有することに起因して、プレフィルタチャネル７０の長さに沿ってどこかに留まってもよい。
【0043】
生体試料の流れは、流入チャネル３０からセルチャネル２０を通り、その後、流出チャネル４０及び第３の流体ポート４１に流出し続ける。生体試料の流れに存在するいかなる標的細胞も、障害物２５の存在によりセルチャネル２０で捕えられる。
【0044】
プレフィルタチャネル７０を目詰まりさせるか、かつ／又はプレフィルタチャネル７０の入口を遮断する混入粒子のため、プレフィルタ５０を洗浄する必要がある場合に、第１の流体ポート３１から第１のフィルタポート６１を通って出る逆方向の流体流を確立することができる。その後、流体は流入チャネル３０からプレフィルタチャネル７０を通るが逆方向に、すなわち、第２の端部７４から第１の端部７２に向かい、その後にフィルタチャネル６０に流れる。その後、詰まっている混入粒子は、流体流によって洗い流され、第１のフィルタポート６１を通って流出する。この逆方向の流れは、好ましくは、培養培地、洗浄培地又は他の液体などの、混入粒子を含まない流体流である。
【0045】
プレフィルタ５０の洗浄中に、第１の流体ポート３１からの流れを有することにより、流体はまた好ましくは、セルチャネル２０に入り、流出チャネル４０を通り、第３の流体ポート４１から流出する。プレフィルタ５０の洗浄中にセルチャネル２０を通るこの流れは、セルチャネル２０で捕捉された標的細胞を洗い流す危険性を低下させる。したがって、セルチャネル２０で既に捕捉された標的細胞はいずれも、洗浄プロセス中にセルチャネル２０に保持される。
【0046】
一実施形態では、微小流体装置１は、図６を参照すると、流入チャネル３０から複数のプレフィルタチャネル７０を通ってフィルタチャネル６０に流体流を誘導するように構成される、流量制御装置１００を備える。
【0047】
また、第３の流体ポート４１から流出チャネル４０及びセルチャネル２０を通って流入チャネル３０に流体流を導くことにより、プレフィルタ５０の洗浄を行うことも可能である。その後、流体流は、プレフィルタチャネル７０を通ってフィルタチャネル６０に入り、第１のフィルタポート６１を通って流出し続ける。
【0048】
この後者の実施形態は、特に、セルチャネル２０のいずれかの中で標的細胞が全く捕捉されないか、又はほとんど捕捉されない場合に用いられ得る。そのような標的細胞がセルチャネル２０に存在する場合、標的細胞は、逆方向の流体流のために、セルチャネル２０から押し出される。したがって、プレフィルタ洗浄が第３の流体ポート４１から第１のフィルタポート６１への逆方向の流体流を用いて微小流体装置１において行われる場合には、捕捉された標的細胞がどのセルチャネル２０にも存在しないという初期検証又は検査を最初に行うことが好ましい。セルチャネル２０に存在する標的細胞２０がある場合には、プレフィルタ洗浄を、第１の流体ポート３１から第１のフィルタポート６１への逆方向の流れを指示することにより、代わりに行うことが好ましい。代替として、標的細胞を含む選択されたセルチャネル２０を通る逆方向の流れを阻止しながら、セルチャネル２０の一部だけを通る逆方向の流れを導くことが可能である。この手法では、標的細胞を含む選択されたセルチャネル２０の第２の端部２４で一時的な流体ブロック又は制限が設けられ、それにより流体がこれらのセルチャネル２０を通って流れるのを阻止する。そのような一時的なブロック又は制限は、例えば、微小流体装置１の蓋として作用する膜に圧力を提供し、選択されたセルチャネル２０の第２の端部２４と整列された膜の一部を、選択されたセルチャネル２０の第２の端部２４の中に押し下げ、それをブロックさせることによって達成できる。このさらなる実施例では、押圧可能な膜が基板１０上に設けられる。
【0049】
セルチャネル２０に標的細胞が存在するか否かの検証又は検査を行い、それによって、一時的に閉塞又は制限されるべきそれらのセルチャネル２０を識別することは、本明細書にさらに記載される技術に従って実施できる。
【0050】
図２は、別の実施形態による微小流体装置１の図である。この実施形態では、微小流体装置１は、第２のフィルタポート６５と流体接続する第２の端部６４を有するフィルタチャネル６０を備える。したがって、フィルタチャネル６０は、その端部６２、６４の各々にそれぞれのフィルタポート６１、６５を有する。
【0051】
フィルタチャネル６０の両端６２、６４にフィルタポート６１、６５を有することは、生体試料中に存在する標的細胞の連続培養を含む、微小流体装置１の長期の投入及び捕捉段階を可能にする。
【0052】
例えば、図６を参照すると、流量制御装置１００は、フィルタチャネル６０の第１の端部６２と第２の端部６４の間で標的細胞、すなわち、生体試料を含む流体の流れを前後に誘導するように提供され、構成され得る。これは、生体試料が、端部６２、６４の間で前後に流れ、すなわち、第１の端部６２から第２の端部６４に向かって流れ、その後第２の端部６４から第１の端部６２に戻るように流れることができることを意味する。
【0053】
本実施形態の特定の実施では、第１の流体リザーバ２が第１のフィルタポート６１に接続され、第２の流体リザーバ４が第２のフィルタポート６５に接続される。このような場合、流量制御装置１００は、第１の流体リザーバ２から第１のフィルタポート６１を通り、フィルタチャネル６０を通って第２のフィルタポート６５を通って出て、第２の流体リザーバ４に生体試料の流れを誘導するように構成できる。次いで、流量制御装置１００は、逆方向に、すなわち、第２の流体リザーバ４から第２のフィルタポート６５を通り、フィルタチャネル６０を通って第１のフィルタポート６１を通って出て、第１の流体リザーバ２中へと、生体試料の流れを誘導するように構成される。
【0054】
別の実施形態では、流量制御装置１００は、第１のフィルタポート６１と第２のフィルタポート６５の間で、標的細胞を含む流体、すなわち、生体試料の循環流を誘導するように構成される。この実施形態では、生体試料は、前後に振動するよりむしろ、一つの及び同じ方向に流れる。そのような場合、第１のフィルタポート６１と第２のフィルタポート６５の間に流体接続が存在する。この流体接続は好ましくは、生体試料を含有するように適合された少なくとも１つの流体リザーバを備える。この流体接続は、例えば、基板１０に設けられた管又はチャネルであり得る。
【0055】
いずれの場合においても、生体試料をフィルタチャネル６０に流して、それによりセルチャネル２０に存在する標的細胞を捕捉する機会を増加させることができる。加えて、流量制御装置１００の制御によるフィルタチャネル６０中の生体試料の流れは、生体試料中の標的細胞の培養を可能にする。これは、生体試料が最初に非常に少ない標的細胞を含む場合であっても、培養が、これらの標的細胞が生体試料の振動流又は円形流中に成長及び増殖することを可能にすることを意味する。したがって、セルチャネル２０中で標的細胞を捕捉する機会は、それにより経時的に増大する。
【0056】
図３は、微小流体装置１のさらなる実施形態の図である。この実施形態では、微小流体装置１のフィルタチャネル６０は、複数の、すなわち、少なくとも２つの第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と、複数の第２のフィルタポート６５、６７と流体接続する第２の端部６４とを有する。
【0057】
微小流体装置１のこの実施形態は、生体試料を培養培地又は他の流体若しくは液体と混合することを可能にする。例えば、第１及び第２のフィルタポート６１、６５は、前述のように、生体試料を含有するように適合された１以上の流体リザーバ２、４に接続されてよい。そのような場合、第１のフィルタポート６３及び／又は第２のフィルタポート６７は、培養培地又は他の流体若しくは液体を含有するように適合された１以上の流体リザーバに接続されてよい。第１のフィルタポート６３及び第２のフィルタポート６７の他方を廃棄ポートとして使用しながら、第１のフィルタポート６３及び第２のフィルタポート６７の一方をこのような流体リザーバと接続することも可能である。
【0058】
図４は、さらに別の実施形態による微小流体装置１の図である。この実施形態では、微小流体チャネル１の流入チャネル３０は、第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４を有する。
【0059】
そのため、流入チャネル３０は、それぞれの端部３２、３４の各々に接続されたそれぞれの流体ポート３１、３３を有する。さらなる実施形態では、流入チャネル３０の第１の端部３２及び第２の端部３４の少なくとも一方は、フィルタチャネル６０に対して図３に示すように、複数の流体ポートと流体接続されてよい。
【0060】
したがって、微小流体装置１の実施形態は、第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と流体接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と流体接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２と複数の第２のフィルタポート６５、６７と流体接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と複数の第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と複数の第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と複数の第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と複数の第２のフィルタポート６５、６７と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と複数の第２のフィルタポート６５、６７と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と複数の第２のフィルタポート６５、６７と接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と複数の第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２を有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２と複数の第２の流体ポート３３と流体接続する第２の端部３４とを有する流入チャネル３０；第１のフィルタポート６１と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と流体接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と第２のフィルタポート６５と流体接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０；複数の第１のフィルタポート６１、６３と流体接続する第１の端部６２と複数の第２のフィルタポート６５、６７と流体接続する第２の端部６４とを有するフィルタチャネル６０、及び複数の第１の流体ポート３１と流体接続する第１の端部３２を有する流入チャネル３０、を含む。
【0061】
１つ又は複数の流体ポートを有する概念は流出チャネル４０にも適用することができ、それは単一の流体ポート４１と、流出チャネル４０のそれぞれの端部と流体接続するそれぞれの流体ポートと、流出チャネル４０の第１の端部と流体接続する複数の流体ポートと、流出チャネル４０の第２の端部と流体接続する流体ポート、又は第１の端部と流体接続する複数の流体ポートと、第２の端部と流体接続する複数の流体ポートを備えてよい。
【0062】
図５は、プレフィルタチャネル７０、９０の複数のセットを有する微小流体装置１のさらに別の実施形態の図である。この実施形態では、フィルタチャネル６０は第１のフィルタチャネル６０であり、プレフィルタチャネル７０は第１のフィルタチャネル７０である。プレフィルタ５０はまた、第３のフィルタポート８１と流体接続する第１の端部８２を有する第２のフィルタチャネル８０と、標的細胞を収容するように適合された第２のプレフィルタチャネル９０とを備える。第２のプレフィルタチャネル９０のそれぞれの第１の端部９２は、第２のフィルタチャネル８０と流体接続し、第２のプレフィルタチャネル９０のそれぞれの第２の端部９４は、流入チャネル３０と流体接続している。この実施形態では、第１のプレフィルタチャネル７０のそれぞれの第２の端部７４は、第２のフィルタチャネル８０と流体接続している。
【0063】
そのため、図５に示す実施形態は、複数の、すなわち、少なくとも２つの、フィルタチャネル６０、８０とプレフィルタチャネル７０、９０のセットを有するプレフィルタ５０を備える。次いで、これらのセットは、第１のフィルタチャネル６０と第１のプレフィルタチャネル７０の上流のセットと、第２のフィルタチャネル８０と第２のプレフィルタチャネル９０の下流のセットとを有し上流対下流が第１のフィルタチャネル６０から流出チャネル４０へ向かう流れ方向に関する基板１０で直列に配置される。
【0064】
一実施形態では、第２のプレフィルタチャネル９０及び第１のプレフィルタチャネル７０は、同じ直径、幅及び高さ、並びに同じ断面形状を有する。これは、フィルタチャネル６０、８０とプレフィルタチャネル７０、９０の２セットが実質的に同じであることを意味する。別の実施形態では、第２のプレフィルタチャネル９０は、第１のプレフィルタチャネル７０と比較して、異なる直径、幅及び高さ並びに／又は断面形状を有してよい。特に、第１のプレフィルタチャネル７０は、第２のプレフィルタチャネル９０と比較して、より大きい直径又はより大きい高さ及び／若しくは幅を有する。
【0065】
したがって、プレフィルタチャネル７０、９０の断面積は好ましくは、第２のプレフィルタチャネル９０と比較して第１のプレフィルタチャネル７０の方がより大きい。第１及び第２のプレフィルタチャネル７０、９０の少なくとも１つが狭くなる断面形状を有する場合には、第２の端部７４における第１のプレフィルタチャネル７０の直径、幅及び／又は高さは好ましくは、第２の端部９４における第２のプレフィルタチャネル９０の直径、幅及び／又は高さよりも大きい。
【0066】
第１と第２のプレフィルタチャネル７０、９０の両方は、第１の端部７２、９２から第２の端部７４、９４へ移動するときに、均一な断面形状及びサイズを有してよい。あるいは、第１及び第２のプレフィルタチャネル７０、９０の一方又は両方は、連続的に又は段階的に狭くなるプレフィルタチャネル７０、９０などの第２の端部７４、９４と比較して、第１の端部７２、９２において異なる断面形状及びサイズを有してよい。
【0067】
複数のフィルタチャネル６０、８０及び複数のプレフィルタチャネル７０、９０を有するこの概念は当然ながら、異なる寸法を有する可能性のあるそのようなフィルタチャネル６０、８０とプレフィルタチャネル７０、９０の３以上のセットに拡張できる。
【0068】
第１のフィルタチャネル６０及び第２のフィルタチャネル８０は、前述のように、及び図１～３に例示されるような、任意の数のフィルタポートを有してよい。
【0069】
図５に示すプレフィルタ５０は、様々な実施形態によれば、混入粒子を詰まらせることなく洗浄できる。例えば、プレフィルタチャネル７０、９０の各セットを個別に洗浄できる。第１のプレフィルタチャネル７０の別々の洗浄は、第３のフィルタポート８１から第２のフィルタチャネル８０及び第１のプレフィルタチャネル７０及び第１のフィルタチャネル６０を通って、その接続されているフィルタポート６１、６５のうちの１つから流出する逆方向の流れを指示することによって行うことができる。これに対応して、第２のプレフィルタチャネル９０の別々の洗浄は、第１の流体ポート３１から流入チャネル３０及び第２のプレフィルタチャネル９０及び第２のフィルタチャネル８０を通って、第３のフィルタポート８１から流出する逆方向の流れを指示することによって行ってよい。
【0070】
あるいは、２セットのプレフィルタチャネル７０、９０は、第１の流体ポート３１、流入チャネル３０から、第２のプレフィルタチャネル９０、第２のフィルタチャネル８０、第１のプレフィルタチャネル７０及び第１のフィルタチャネル６０を通って、その接続されたフィルタポート６１、６３のいずれか又は全てから流出する逆方向の流れを提供することによって、組み合わせた操作で洗浄できる。この組み合わせ洗浄は代替的にまた、第３の流体ポート４１からの流体流を提供することによって、本明細書で先に説明したように、セルチャネル２０の全て又は選択された部分を通る逆方向の流れを含んでよい。
【0071】
流量制御装置１００は、微小流体装置１を介して、生体試料などの流体流及び任意の培養培地又は他の流体若しくは液体を導きかつ制御するために様々な実施形態に従って実施できる。
【0072】
図６は、各フィルタ及び流体ポートがそれぞれの流体リザーバ２、３、４、５に接続され、それらが今度は流量制御装置１００に接続され及び流量制御装置１００により制御される、実施形態を示す。これは、生体試料の微小流体装置１への投入、セルチャネル２０での標的細胞の捕捉、プレフィルタ５０の洗浄、セルチャネル２０での標的細胞の培養、又は振動流若しくは循環流における標的細胞の培養などの、どの操作を行うかに応じて、それぞれの流体リザーバ２、３、４、５からの又はそこへ向かう流体流を制御することを意味する。
【0073】
一実施形態では、流量制御装置１００は、圧力駆動された流れを提供する圧力制御装置である。そのような場合、圧力制御装置は、フィルタポート６１、６５、８１及び流体ポート３１、４１に印加される流体圧力を制御して、流体流の方向を制御するように構成される。例えば、第１のフィルタチャネル６０における生体試料の振動流を達成するために、圧力制御装置は好ましくは、第１のフィルタポート６１及び第２のフィルタポート６５に印加される流体圧力を制御して、第１のフィルタチャネル６０の第１の端部６２と第２の端部６４の間で、標的細胞を含む流体流を前後に誘導するように構成される。
【0074】
使用できる非限定的であるが、例示的なそのような圧力制御装置の例は、ＦｅｓｔｏＡＧによる比例圧力調整器VEABである。
【0075】
他の流量制御の解決法は、流体流の方向を制御するためにバルブと接続する１以上のポンプを使用することを含んでよい。
【0076】
図１～図６において、プレフィルタ５０は、セルチャネル２０、流入チャネル３０及び流出チャネル４０と同じ基板１０に配置されるか又は設けられるように図示されている。そのような実装が可能である。代替実施形態では、プレフィルタ５０は、第１の基板に配置されるか又は設けられ、一方でセルチャネル２０、流入チャネル３０及び流出チャネル４０は、微小流体装置１の第２の基板１０に配置されるか又は設けられる。両方の実施形態は、プレフィルタ５０が流入チャネル３０と流体接続している限り可能である。
【0077】
微小流体装置１の基板１０又は複数の基板は、プラスチック材料などの任意の材料でできており、セルチャネル２０、流入チャネル３０、流出チャネル４０及びプレフィルタ５０を構成する構造を画定できる。流体ポート３１、３３、４１及びフィルタポート６１、６３、６５、６７、８１は、基板１０に存在してよい。あるいは、それらは、基板１０の外側に設けられてもよく、次いで、好ましくは、流入チャネル３０、流出チャネル４０及びフィルタチャネル６０、８０のそれぞれの端部３２、３４、６２、６４、８２にそれぞれの管で接続される。
【0078】
基板１０に適する材料の非限定的な例は、ＺＥＯＮ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌ．Ｐ．によって販売される環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）であるＺＥＯＮＥＸ（登録商標）及びＺＥＯＮＯＲ（登録商標）並びにＴｏｐａｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓによって販売される環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）であるＴＯＰＡＳ（登録商標）を含む。これらの材料は、透過性及び背景の蛍光の点で優れた光学特徴を有する。それらはまた、加熱される場合に良好な流れの特徴を有し、したがって微小流体装置の基板の形成を可能にする小さな構造を複製し得る。
【0079】
基板１０に適する材料の他の例は、ガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）及びポリ（ｐ－フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）を含む。
【0080】
基板１０は、好ましくは透明であり、基板１０を通して撮像を可能にする。
【0081】
一実施形態では、蓋（図示せず）が、基板１０上に配置される。その後、この蓋は、基板１０で画定されるチャネル２０、３０、４０、６０、７０、８０、９０のためのカバー又は蓋として機能する。蓋は、プラスチック材料又はガラスで作られてよい。蓋は、好ましくは透明であり、蓋を通る撮像を可能にする。
【0082】
本実施形態の微小流体装置１は、生体試料中に存在する標的細胞の表現型特性を監視又は分析するのに有用である。
【0083】
一実施形態では、生体試料は、全血試料、希釈血液試料又は血液培養試料などの血液試料である。生体試料の他の例は、尿試料、唾液試料、糞便試料、脳脊髄液試料、羊水試料、乳試料、痰由来試料又はリンパ試料などの他の体液試料を含む。あるいは、生体試料は、生検などの身体組織から得ることができる。他の例は、細菌混入について試験される食品試料、乳棒炎試験のためのウシ、ヤギ又は他の乳生成動物由来の乳を含む。実際には、本発明の実施形態によれば、微小流体装置１に投入することができる細胞を含む任意の生体試料を使用できる。
【0084】
一実施形態では、セルチャネル２０における標的細胞の表現型特性は、試験剤に対する標的細胞の表現型応答を決定することによって行われる。それゆえ、そのような方法では、セルチャネル２０中の標的細胞は、試験剤に暴露される。この試験剤は、任意の分子、化合物、組成物、又は分子、化合物若しくは組成物の混合物であり得る。関連する実施形態では、標的細胞はより一般的に、細胞チャネル２０中の１以上の刺激にさらされる。そのような１以上の刺激は、必ずしも試験剤である必要はないが、代わりに、温度変化などの環境条件の変化であり得る。そのため、１以上の刺激に対する標的細胞の表現型応答がその後、決定される。
【0085】
そのため、一実施形態では、セルチャネル２０中の標的細胞は、試験剤に暴露される。この試験剤は、生体試料自体に含まれ得る。あるいは、試験剤は、微小流体装置１のポートの１つ、典型的には第１の流体ポート３１及び第２の流体ポート３３の１つを使用して、培養培地又は他の流体若しくは液体などに添加されてよい。
【0086】
試験剤に対する標的細胞の表現型応答を決定することは、標的細胞についての成長速度、形状、サイズ、経時的な成長速度を規定する成長速度曲線の形、経時的な細胞長を規定する長さ曲線の形、経時的な細胞面積を規定する面積曲線の形、色、光学密度、吸収スペクトル、導電性、熱生成又はそれらの混合物の少なくとも１つを決定することを含んでよい。
【0087】
標的細胞の表現型応答の決定は典型的には、細胞チャネル２０中の標的細胞を１回又は複数の時点で監視することを伴う。そのため、試験剤への標的細胞の特定の表現型応答に応じて、標的細胞を１回又は複数の時点で監視することは十分である。
【0088】
標的細胞の監視は、細胞チャネル２０中の標的細胞の少なくとも１つの画像を取得することを含んでよい。単一の時点で単一の画像を取得できるか、又は複数の時点で複数の画像が取得される。
【0089】
特定の実施形態では、少なくとも１つの画像は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ若しくは相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）カメラなどのカメラに接続された位相コントラスト顕微鏡などの顕微鏡、又は蛍光用共焦点走査システム、ラマン撮像、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、刺激ラマン散乱（ＳＲＳ）、並びに死細胞及び生細胞にスペクトル変化を与える類似の化学的感受性技術を用いて取得される。これは、化学的に特異的なプローブ及び色素などの、成長培地へのコントラスト増強添加物を伴う又は伴わない、１つ又はいくつかの波長での測定値を含む。
【0090】
画像は必ずしも領域の２Ｄ写真である必要はなく、例えば、微小流体装置１での選択された位置におけるライン走査に対応してもよい。
【0091】
細胞チャネル２０を通る導電率の測定又は電子測定装置を用いる細胞チャネル２０での熱生成などの、細胞チャネル２０における標的細胞の存在を検出する他の技術を、細胞チャネル２０の画像を取得する代わりに、又はその相補物として使用できる。
【0092】
第１の実施例では、試験剤は抗生物質である。この実施例では、微小流体装置１を使用して、細菌などの標的細胞の抗生物質に対する感受性を決定できる。
【0093】
第２の実施例では、試験剤は細胞増殖抑制剤である。そのような実施例では、微小流体装置１を用いて、セルチャネル２０での標的細胞の監視に基づき、癌細胞などの標的細胞の細胞増殖抑制剤への感受性を決定する。
【0094】
第３の実施例では、試験剤は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブなどのプローブである。そのような場合、ＦＩＳＨプローブは、細胞チャネル２０での標的細胞の監視に基づいて、細胞チャネル２０で捕捉された特定の標的細胞を識別するために使用できる。異なるそのようなＦＩＳＨプローブは異なる標的細胞を標的とし、それにより、ＦＩＳＨプローブが標的細胞に特異的に結合するか否かに応じて標的細胞の独自性を決定することを可能にする。ＦＩＳＨプローブは、２３Ｓ ｒＲＮＡなどの種特異的ＲＮＡ又はＤＮＡ配列を標的にできる。血液培養物中の微生物を識別するためのＦＩＳＨプローブを使用するより多くの情報については、ｋｅｍｐｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００、３８（２）：８３０－８３８で言及されている。異なる細菌に適合されたＦＩＳＨプローブは、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｂａｓｅ．ｃｓｂ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｎｏｄｅ／８で見出すことができる。
【0095】
種の識別は有利には、上記の実施例のいずれかに従って、試験剤に対する標的細胞の表現型応答の決定と組み合わせることができる。そのような場合、種の識別は好ましくは、抗生物質又は細胞増殖抑制剤に対する表現型応答の後に行われる。このようにして、種の識別は、細胞チャネル２０中の試験剤に対する表現型応答の解釈を容易にすることができ、それは生体試料が種又は株の標的細胞の混合物を含む場合に特に有利である。
【0096】
図９は、本実施形態に従い微小流体装置１を操作する方法を示すフローチャートである。本方法は、工程Ｓ２において、流入チャネル３０からプレフィルタチャネル７０を通ってフィルタチャネル６０に流体流を誘導することを含む。
【0097】
それゆえ、工程Ｓ２で定義された微小流体装置１を操作するこの方法は、微小流体装置１のプレフィルタ５０を、詰まっている混入粒子から洗浄することに関する。
【0098】
一実施形態では、流体流はまた、工程Ｓ２において、流入チャネル３０からセルチャネル２０を通って出力チャネル４０内に流れるように誘導される。このようにして、セルチャネル２０を通る流れの方向を維持しながら流れを逆方向にしてプレフィルタ５０を洗浄することが可能である。
【0099】
特定の実施形態では、工程Ｓ２は、流体圧力を第１の流体ポート３１に印加して、流入チャネル３０からプレフィルタチャネル７０を通ってフィルタチャネル６０内に流体流を誘導することを含む。
【0100】
一実施形態では、工程Ｓ２は、流出チャネル４０からセルチャネル２０の少なくとも一部を通って流入チャネル３０に入り、プレフィルタチャネル７０を通ってフィルタチャネル７０に流体流を誘導することを含む。
【0101】
この実施形態では、洗浄操作は、セルチャネル２０の少なくとも一つの選択された部分も通過する逆方向の流れを提供することを伴う。上で説明したように、セルチャネル２０の選択された部分は好ましくは、捕捉された標的細胞を欠く。それゆえ、逆方向の流れは好ましくは、標的細胞を含む任意のセルチャネル２０を通って流れることを阻止され又は少なくとも著しく低減されて、それにより以前に捕捉された標的細胞を洗い流す危険性を低減する。
【0102】
標的細胞を含むセルチャネル２０の識別は、前述のように、セルチャネル２０の１以上の画像を取得することに基づいて行うことができる。
【0103】
一実施形態では、あるマーカーに特異的に結合する蛍光プローブを用いて、標的細胞を標識し、タグ付けしてよい。そのような場合、セルチャネル２０中の蛍光を測定することにより、セルチャネル２０に存在する標的細胞を同定できる。蛍光プローブはあるマーカーに特異的に結合する。このマーカーは、標的細胞中又は受容体などの標的細胞の細胞膜中のタンパク質などの、分子であり得る。あるいは、マーカーは、特定のＤＮＡ又は遺伝子配列又は特定のｍＲＮＡ配列などの、核酸分子であり得る。
【0104】
蛍光プローブは、例えば、標的細胞を混入粒子と明確に区別するインタカレートＤＮＡ結合色素であり得る。蛍光プローブは、死細胞にのみ入る、生死スクリーニング色素であり得る。
【0105】
蛍光プローブは、標的細胞に特異的に結合する蛍光抗体であり得、例えば、異なる表面抗原を有する異なる細菌種、表面抗原に基づく他の細胞からの癌細胞、妊娠した女性自身の細胞からの循環胎児細胞の区別を可能にする。
【0106】
蛍光プローブは、１６Ｓ又は２３ＳリボソームＲＮＡなどの種特異的ＲＮＡを標的とする蛍光オリゴヌクレオチドであり得る。
【0107】
蛍光プローブの特異的結合は、親和性及び／又は結合活性に基づいて決定できる。蛍光プローブと標的マーカーの解離平衡定数（Ｋｄ）によって表される親和性は、標的マーカーと蛍光プローブの間の結合強度の尺度である。Ｋｄの値が小さいほど、結合強度は強くなる。あるいは、親和性は、１／Ｋｄである、親和性定数（Ｋａ）としても表すことができる。当業者には明らかなように、親和性は、目的の特定の標的マーカーに応じて、それ自体公知の方法で決定できる。
【0108】
結合活性は、蛍光プローブと標的マーカーの間の結合強度の尺度である。結合活性は、標的マーカーと蛍光プローブ上の結合部位の間の親和性と、蛍光プローブ上に存在する結合部位の数の両方に関連する。
【0109】
一般に、１０－４Ｍ超の任意のＫｄ値（又は１０４Ｍ－１未満の任意のｋａ値）は、非特異的結合を示すと一般的に考えられている。
【0110】
標的マーカーへの蛍光プローブの特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ、並びに当技術分野においてそれ自体公知の異なる変異体などを含む、それ自体公知の任意の適切な方法で決定できる。
【0111】
上記において、プローブは蛍光プローブで例示してきた。しかしながら、実施形態はこれに限定されるものではない。実際には、蛍光プローブ、染色プローブ、化学発光プローブ、放射標識プローブ、金ビーズなどの検出可能かつ測定可能な任意のプローブを実施形態に従って使用できる。
【0112】
この方法はまた、任意選択の工程Ｓ１を含んでよい。そのような場合、微小流体装置１のフィルタチャネル６０は、第２の流体ポート６５と流体接続する第２の端部６４を有する。一実施形態では、この工程Ｓ１は、フィルタチャネル６０の第１の端部６２と第２の端部６４の間で、標的細胞を含む流体の流れを前後に誘導することを含む。
【0113】
例えば、この工程Ｓ１は、第１のフィルタポート６１及び第２のフィルタポート６５に印加される流体圧力を制御して、フィルタチャネル６０の第１の端部６２と第２の端部６４の間で、標的細胞を含む流体の流れを前後に誘導することによって得ることができる。
【0114】
別の実施形態では、工程Ｓ１は、第１のフィルタポート６１と第２のフィルタポート６５の間で、標的細胞を含む流体の循環流を誘導することを含む。
【0115】
上記の実施形態は、本発明のいくつかの例示的な実施例として理解されるべきである。当業者なら、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変、組み合わせ及び変更が実施形態に対してなされ得ることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決法を、技術的に可能である他の構成で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】