特許 7341451 タンパク質性化合物とその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-01

(45)【発行日】2023-09-11

(54)【発明の名称】タンパク質性化合物とその利用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20230904BHJP

   A61K 38/10 20060101ALN20230904BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20230904BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20230904BHJP

   C12N 5/095 20100101ALN20230904BHJP

【ＦＩ】

C07K7/08 ZNA

A61K38/10

A61P35/00

A61P43/00 105

C12N5/095

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2018539984

(86)(22)【出願日】2017-02-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-03-07

(86)【国際出願番号】 AU2017050083

(87)【国際公開番号】W WO2017132728

(87)【国際公開日】2017-08-10

【審査請求日】2020-02-03

【審判番号】

【審判請求日】2021-10-29

(31)【優先権主張番号】2016900314

(32)【優先日】2016-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】520040751

【氏名又は名称】エピアクシス セラピューティクス プロプライアタリー リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(74)【代理人】

【氏名又は名称】胡田 尚則

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(72)【発明者】

【氏名】スダー ラオ

(72)【発明者】

【氏名】ピーター ミルバーン

【合議体】

【審判長】冨永 みどり

【審判官】森井 隆信

【審判官】原口 美和

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０３９１８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００２／０１０１９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２年，Ｖｏｌ．３，Ａｒｔｉｃｌｅ．２６０，ｐｐ．１－１３

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ，Ｃ０７Ｋ，Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（I）：
Z₁X₁X₂X₃X₄IDX₅PPX₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁Z₂ （I）
によって表わされる、単離または精製したタンパク質性分子であって、
前記式中、
「Z₁」と「Z₂」は、独立に、存在しないか、1～10個のアミノ酸残基からなるタンパク質性部分であり；
「X₁」は、存在しないか、RおよびKを含む塩基性アミノ酸残基から選択され；
「X₂」と「X₃」は、独立に、RおよびKを含む塩基性アミノ酸残基から選択され；
「X₄」は、R、K、DおよびEを含む帯電したアミノ酸残基から選択され；
「X₅」は、存在しないか、Wであり；
「X₆」は、F、Y、W、RおよびKを含む芳香族または塩基性アミノ酸残基から選択され；
「X₇」は、RおよびKを含む塩基性アミノ酸残基から選択され；
「X₈」は、存在しないか、Pであり；
「X₉」は、RおよびKを含む塩基性アミノ酸残基から選択され；
「X₁₀」は、V、L、IおよびMを含む疎水性アミノ酸残基と、Pから選択され；
「X₁₁」は、RおよびKを含む塩基性アミノ酸残基から選択され、
ここで、前記タンパク質性分子は、配列番号1のアミノ酸配列：
RKEIDPPFRPKVK ［配列番号1］
からなるタンパク質性分子ではない、タンパク質性分子。

【請求項2】

「X₁」が、存在しないか、Rである、請求項1に記載のタンパク質性分子。

【請求項3】

「X₂」がRである、請求項1または2に記載のタンパク質性分子。

【請求項4】

「X₃」がKである、請求項1～3のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項5】

「X₄」がEまたはRである、請求項1～4のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項6】

「X₅」が、存在しないか、Wである、請求項1～5のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項7】

「X₆」がFまたはRである、請求項1～6のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項8】

「X₇」がRである、請求項1～7のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項9】

「X₉」がKである、請求項1～8のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項10】

「X₁₀」がVまたはPである、請求項1～9いずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項11】

「X₁₁」がKである、請求項1～10のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【請求項12】

配列番号2のアミノ酸配列：
RRKRIDWPPRRKPK ［配列番号2］
を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、請求項1～11のいずれか1項に記載のタンパク質性分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、2016年2月1日に出願された「タンパク質性化合物とその利用」という名称のオーストラリア国仮出願第2016900314号の優先権を主張するものであり、その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0002】

本発明は、タンパク質性分子と、PKC-θ過剰発現が関係する疾患（例えばがん）におけるそのタンパク質性分子の利用に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質性分子と、それを利用して、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）上皮間葉移行；（v）間葉上皮移行のうちの少なくとも1つを変化させることに関する。

【背景技術】

【0003】

本明細書で以前の何らかの刊行物（またはそれに由来する情報）、または既知の何らかの事項を参照するとき、それは、以前のその刊行物（またはそれに由来する情報）、または既知の事項が、本明細書が関係する研究分野における共通の一般的な知識の一部を形成すると認識されている、または認められている、または何らかの示唆を与えることを意味しているわけでも、そのことを意味すると考えてもならない。

【0004】

プロテインキナーゼC（PKC）は、多数のタンパク質のセリン残基とトレオニン残基をリン酸化するキナーゼの1つのファミリーであり、そうすることで多数の細胞反応を調節している。11種類のアイソフォームが存在しており、それらが、古典的なアイソフォーム（その中には、ジアシルグリセロールとカルシウムに依存するPKC-α、PKC-βI、PKC-βII、PKC-γが含まれる）；新規なアイソフォーム（その中には、ジアシルグリセロールに依存するPKC-δ、PKC-ε、PKC-η、PKC-θが含まれる）；非典型的なアイソフォーム（その中には、ジアシルグリセロールとカルシウムとは独立なPKC-λ、PKC-ι、PKC-ζが含まれる）に分類される。

【0005】

近年、PKC-θアイソフォームがさまざまな疾患の有望な治療標的としてますます注目されるようになってきている。PKC-θは、免疫系が機能するとき、T細胞の機能を制御することを通じて主要な役割を演じている。PKC-θは細胞質から核に移行し、そこで、T細胞における効果的な免疫応答に不可欠な誘導性免疫応答遺伝子の転写とマイクロRNAに影響を与える。PKC-θの調節異常が、炎症性疾患や、腫瘍の進行と転移に関与していることが以前から知られている。PKC-θの活性がさまざまな神経疾患、血管疾患、気道疾患に関与していることも以前から知られている。より最近になって、PKC-θの調節異常が悪性の乳がんと結び付いていて、PKC-θが、上皮間葉移行（EMT）の誘導と、乳がん幹細胞（CSC）の形成においてある役割を果たしていることが示された（Zafar他（2014年）Mol Cell Biol, 第34巻(36)：2961～2980ページ；Lim他（2015年）Immunology、第146巻：508～522ページ）。

【0006】

炎症性疾患と、腫瘍の形成と進行にはPKC-θが関与するため、PKC-θは有望な治療標的である。いくつかのPKC-θ阻害剤が開発されていて、特にソトラスタウリンが現在乾癬と臓器移植に関して臨床試験中だが、これら阻害剤は、典型的には、PKC-θを他のPKC酵素から選択できないという問題を有する。PKC酵素が関与する細胞応答は多数あるため、選択的にPKC-θを抑制することが強く望まれている（Lim他（2015年）Immunology、第146巻：508522ページ；Manicassamy（2009年）Curr Opin Investig Drugs、第10巻(11)：1225～1235ページ）。

【0007】

したがってPKC-θを抑制する新たな治療剤が必要とされており、その治療剤は、PKC-θ過剰発現が関係する疾患（例えばがん）において有用である可能性がある。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、一部は、PKC-θポリペプチドの部分配列に基づくタンパク質性分子と、それと構造的に関連する分子が、PKC-θ活性（その中には、細胞の核へのPKC-θの移行が含まれる）を抑制するという発見に基づいている。これら分子は、EMTの抑制と、CSC腫瘍細胞と非CSC腫瘍細胞の形成および維持の抑制と、間葉上皮移行（MET）の誘導に関する大きな活性を有することもわかった。そのためこれら分子は、PKC-θ過剰発現が関係する多彩な疾患（例えばがん）の治療に有用である。

【0009】

本発明の1つの側面では、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）上皮間葉移行；（v）間葉上皮移行のうちの少なくとも1つを変化させる方法として、前記PKC-θ過剰発現細胞を、式（I）：
Z₁X₁X₂X₃X₄IDX₅PPX₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁Z₂ （I）
によって表わされる単離または精製したタンパク質性分子と接触させることを含む方法が提供される。前記式中、
「Z₁」と「Z₂」は、独立に、存在しないか、約1～約50個のアミノ酸残基を含むタンパク質性部分と、保護部分のうちの少なくとも1つから選択され；
「X₁」は、存在しないか、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₂」と「X₃」は、独立に、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₄」は、R、K、D、Eを含む帯電したアミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₅」は、存在しないか、Wまたはその修飾された形態であり；
「X₆」は、F、Y、W、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₇」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₈」は、存在しないか、Pまたはその修飾された形態であり；
「X₉」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₁₀」は、V、L、I、Mを含む疎水性アミノ酸残基とその修飾された形態と、Pとその修飾された形態から選択され；
「X₁₁」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択される。

【0010】

本発明の別の側面では、対象の体内にある少なくとも1つのPKC-θ過剰発現細胞を含むがんを治療または予防する方法として、前記対象に、上に定義した式（I）によって表わされる単離または精製したタンパク質性分子を投与することを含む方法が提供される。

【0011】

本発明のさらに別の側面では、式（I）：
Z₁X₁X₂X₃X₄IDX₅PPX₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁Z₂ （I）
によって表わされるが、配列番号1のアミノ酸配列：
RKEIDPPFRPKVK ［配列番号1］
からなるタンパク質性分子ではない、単離または精製したタンパク質性分子が提供される。ただし式（I）において、
「Z₁」と「Z₂」は、独立に、存在しないか、約1～約50個のアミノ酸残基を含むタンパク質性部分と、保護部分のうちの少なくとも1つから選択され；
「X₁」は、存在しないか、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₂」と「X₃」は、独立に、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₄」は、R、K、D、Eを含む帯電したアミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₅」は、存在しないか、Wまたはその修飾された形態であり；
「X₆」は、F、Y、W、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₇」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₈」は、存在しないか、Pまたはその修飾された形態であり；
「X₉」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₁₀」は、V、L、I、Mを含む疎水性アミノ酸残基とその修飾された形態と、Pとその修飾された形態から選択され；
「X₁₁」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1-1】PKC-θの核移行に対するインポーチニブの効果。（A）インポーチニブペプチドで処理したMCF7細胞の免疫蛍光顕微鏡写真；（B）ヒト乳房MDF7-IMモデルにおいてインポーチニブペプチドによるPKC-θの抑制を対照ST（刺激された）サンプルと比較したときの割合であり、平均密度が50個超の細胞に基づきImageJソフトウエアを用いて計算した（インポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1は、STと比較してp値≦0.0001）；（C）と（D）PKC-θ、PKC-β2、PKC-α、Imp 8、Impα2の局在に対するインポーチニブ4759_O1処理の効果を示す免疫蛍光顕微鏡写真（左）と、Fn/cのプロット（細胞質の蛍光強度に対する核の蛍光強度の比；右）。-は、刺激された対照を表わし；＋は、インポーチニブ4759_O1で前処理した刺激されたサンプルを表わす。****＝p値≦0.0001；ns＝p値≧0.05。

【図1-2】図１－１の説明に同じ。

【図1-3】図１－１の説明に同じ。

【0013】

【図2】MCF-IMモデルにおけるCD44^hiCD24^loがん幹細胞の形成に対するインポーチニブペプチドの効果。（A）インポーチニブペプチドで処理した後のMCF-IM細胞のFACSプロット。細胞は、前方散乱と側方散乱からのゲートをかけた後、Hoechst陰性集団（生きている細胞）によるゲートをかける；（B）インポーチニブペプチドによるCD44^hiCD24^lo（CSC）の抑制を対照ST（刺激された）サンプルと比較したときの割合（インポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1はSTと比較してp値が0.0079である）。

【0014】

【図3-1】MDA-MB-231モデルにおけるCD44^hiCD24^loがん幹細胞の形成に対するインポーチニブペプチドの効果。（A）インポーチニブ4759で処理した後のMDA-MB-231細胞のFACSプロット。細胞は、前方散乱と側方散乱からのゲートをかけた後、Hoechst陰性集団（生きている細胞）によるゲートをかける；（B）インポーチニブペプチドによるCD44^hiCD24^lo（CSC）の抑制を対照ST（刺激された）サンプルと比較したときの割合（インポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1はSTと比較してp値＜0.0001である）；（C）MCF7細胞またはMDA-MB-231細胞においてインポーチニブ4759_O1で処理した後の生きている細胞集団の図。

【図3-2】図３－１の説明に同じ。

【0015】

【図4】転写因子NF-κB、p65、p53と、腫瘍抑制タンパク質（例えばRb）の核移行に対するインポーチニブ4759_O1の効果。（A）インポーチニブ4759_O1で処理したMCF7細胞に関する免疫蛍光顕微鏡写真とFn/cのプロット。-は、刺激された対照を表わし；＋は、インポーチニブ4759_O1で前処理した刺激されたサンプルを表わす。インポーチニブ4759_O1は、対照と比較して、p65に関するp値が0.0033であり、Rbに関するp値が0.0007であり、p53に関するp値が0.0009である。****＝p値≦0.0001；***＝p値≦0.001；**＝p値≦0.01；*＝p値≦0.05；ns＝p値≧0.05。

【0016】

【図5】PKC-θの核移行に対し、他のPKCアイソフォームを標的とするペプチド阻害剤が及ぼす効果。（A）PKC-β1、PKC-δ、PKC-εを標的とするペプチド阻害剤で処理した細胞に関する免疫蛍光顕微鏡写真とFn/cのプロット。STは刺激されたサンプルを表わす。

【0017】

【図6】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルにおいてインポーチニブ4759とドセタキセルが腫瘍の体積に及ぼす効果の経時変化を示す線グラフ（データは平均値±SEで示す）。インポーチニブ4759は全p値が0.003である。

【0018】

【図7】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルにおいてインポーチニブ4759とドセタキセルががん幹細胞（CD44^highCD24^low）の割合に及ぼす効果を示す棒グラフ（データは平均値±SEで示す）。インポーチニブ4759は全p値が0.0317である。

【0019】

【図8】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルにおいてインポーチニブ4759_O1とドセタキセルが腫瘍の体積に及ぼす効果の経時変化を示す線グラフ（データは平均値±SEで示す）。インポーチニブ4759_O1は全p値が0.0079である。

【0020】

【図9】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルにおいてインポーチニブ4759_O1とドセタキセルががん幹細胞（CD44^highCD24^low）の割合に及ぼす効果を示す棒グラフ（データは平均値±SEで示す）。インポーチニブ4759_O1は全p値が0.0286である。

【0021】

【図10】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞におけるがん幹細胞マーカー（CSV、LSD1p、PDL1）の発現にインポーチニブ4759とドセタキセルが及ぼす効果を示す共焦点顕微鏡写真。

【0022】

【図11】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞においてインポーチニブ4759とドセタキセルががん幹細胞マーカー（CSV、LSD1p、PDL1）の核（TNFI）発現と細胞質（TCFI）発現に及ぼす効果を示すグラフ（n≧20個の個別の細胞；データは平均値±SEとして表示）。****＝p値≦0.0001；***＝p値≦0.001；**＝p値≦0.01；*＝p値≦0.05；ns＝p値≧0.05。

【0023】

【図12】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞においてインポーチニブ4759とドセタキセルががん幹細胞マーカー（CSV、PKC-θ、PDL-1）の発現に及ぼす効果を示す共焦点顕微鏡写真。

【0024】

【図13】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞においてインポーチニブ4759とドセタキセルががん幹細胞マーカー（CSV、PKC-θ、PDL1）の核（TNFI）発現と細胞質（TCFI）発現に及ぼす効果を示すグラフ（n≧20個の個別の細胞；データは平均値±SEとして表示）。****＝p値≦0.0001；***＝p値≦0.001；**＝p値≦0.01；*＝p値≦0.05；ns＝p値≧0.05。

【0025】

【図14】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞においてインポーチニブ4759とドセタキセルがCAFマーカー（FAP、LSD1、CCL2）の発現に及ぼす効果を示す共焦点顕微鏡写真。

【0026】

【図15】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞においてインポーチニブ4759とドセタキセルがCAFマーカー（FAP、LSD1、CCL2）の核（TNFI）発現と細胞質（TCFI）発現に及ぼす効果を示すグラフ（n≧20個の個別の細胞；データは平均値±SEとして表示）。****＝p値≦0.0001；***＝p値≦0.001；**＝p値≦0.01；*＝p値≦0.05；ns＝p値≧0.05。

【0027】

【図16】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞におけるM1マクロファージマーカー（LSD1p、CCR7、CD38）の発現にインポーチニブ4759とドセタキセルが及ぼす効果を示す共焦点顕微鏡写真。

【0028】

【図17】Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植乳がんモデルに由来する細胞においてインポーチニブ4759とドセタキセルがM1マクロファージマーカー（LSD1p、CCR7、CD38）の核（TNFI）発現と細胞質（TCFI）発現に及ぼす効果を示すグラフ。****＝p値≦0.0001；***＝p値≦0.001；**＝p値≦0.01；*＝p値≦0.05；ns＝p値≧0.05。

【0029】

発明の詳細な説明
1．定義

【0030】

特に断わらない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味を持つ。本発明を実施するのに本明細書に記載したのと同様または同等な任意の方法と材料を使用できるが、好ましい方法と材料を記載する。本発明の目的で、以下の用語を下記のように定義する。

【0031】

冠詞「1つの」は、本明細書では、物品の文法的対象が1つ、または2つ以上（すなわち少なくとも1つ）であることを指すのに用いる。例えば「1つの要素」は、1つの要素、または2つ以上の要素を意味する。

【0032】

「約」は、量、レベル、値、数、頻度、割合、大きさ、サイズ、分量、重量、長さのいずれかを意味し、参照する量、レベル、値、数、頻度、割合、大きさ、サイズ、分量、重量、長さのいずれかから最大で15％、または14％、または13％、または12％、または11％、または10％、または9％、または8％、または7％、または6％、または5％、または4％、または3％、または2％、または1％の変動があることを意味する。

【0033】

「同時の投与」、「同時に投与する」、「同時に投与した」などの表現は、2種類以上の活性成分を含有する単一の組成物を投与することを意味するか、各活性成分を別々の組成物として、および／または別々の経路で、そのような活性成分をすべて単一の組成物として投与するときに得られるのと同等な有効な結果となるよう十分に短い時間内で、同じ時期、または同時に、または順番に送達することを意味する。「同時に」は、活性成分を望ましくは同じ製剤の中で実質的に同じ時期に投与することを意味する。「同じ時期に」は、活性成分を時間的に近接して投与することを意味し、例えば1つの薬剤を投与してから約1分以内～約1日以内に別の薬剤を投与する。どの同じ時期も有用である。しかし薬剤は、同時に投与しない場合には、約1分以内～約8時間以内に、好ましくは約1時間以内～約4時間以内に投与されることがしばしばある。薬剤は、同じ時期に投与する場合には、対象の同じ部位に投与するのが好適である。「同じ部位」という用語には、その正確な場所が含まれるが、約0.5～約15センチメートル以内、好ましくは約0.5～約5センチメートル以内が可能である。

【0034】

本明細書では、「および／または」は、列挙されている関連項目の1つ以上の可能な任意の組み合わせを包含するほか、代わりを選択できる（または）と解釈するときには、組み合わせでない場合を包含する。

【0035】

「がん幹細胞」（CSC）という用語は、腫瘍を発生させて腫瘍を維持する能力（その中には、活発に増殖する能力、新たな腫瘍を形成する能力、がんの発達を維持する能力が含まれる）を持つ細胞、すなわち腫瘍の形成と増殖を推進させる無限増殖能力を持つ細胞を意味する。CSCは、バルクの腫瘍細胞とは生物学的に異なっており、幹細胞に付随する性質、特に自ら再生し、増殖し、特定のがんサンプルで見られるあらゆるタイプの細胞を生み出す能力を有する。「がん幹細胞」（CSC）という用語には、幹細胞（SC）における遺伝子の変化と、CSCになる細胞における遺伝子の変化の両方が含まれる。特別な実施態様では、CSCは乳房CSCであり、それはCD24⁺CD44⁺であることが好ましく、その代表例にCD44^highCD24^lowが含まれる。

【0036】

本明細書と下記の請求項の全体を通じ、「含む」という用語や、「含んでいる」などのバリエーションは、文脈が別の意味を要求する場合を除き、記載されている整数や工程、または整数群や工程群を含むと理解されるが、他の整数や工程、または整数群や工程群が排除されるわけではない。したがって「含んでいる」などの用語の使用は、列挙されている整数が必要または義務であることを意味するが、他の整数はオプションであり、存在していても存在していなくてもよい。「からなる」は、その「からなる」という表現の後に続くすべてのものを含むことを意味するが、それらに限定されることはない。したがって「からなる」という表現は、列挙されている要素が必要または義務であることと、他の要素は存在しない可能性があることを示す。「主に～からなる」は、この表現の後に列挙されているあらゆる要素を含むが、他の要素は、列挙されている要素に関する開示の中で特定されている活性または活動を妨げないか、その活性または活動に寄与するものに限定される。したがって「主に～からなる」という表現は、列挙されている要素が必要または義務であるが、他の要素はオプションであり、列挙されている要素の活性または作用に影響を与えるかどうかに応じて存在していても存在していなくてもよい。特別な実施態様では、本明細書に開示した特定のアミノ酸配列の文脈における「主に～からなる」という表現は、その範囲に、その特定のアミノ酸配列の上流の約1～約50個のオプションのアミノ酸（とその間に挟まれたあらゆる整数個のオプションのアミノ酸）、および／またはその特定のアミノ酸配列の下流の約1～約50個のオプションのアミノ酸（とその間に挟まれたあらゆる整数個のオプションのアミノ酸）を含んでいる。

【0037】

本明細書では、「単位剤形」という用語は、治療する対象にとって1回の用量として適した物理的に離散したユニットを意味し、それぞれのユニットは、望む治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性材料と、必要な医薬として許容可能なビヒクルを含有している。

【0038】

本明細書でPKC-θに関連して用いられる「酵素活性」という用語は、タンパク質上のセリン残基および／またはトレオニン残基のリン酸化を意味する。

【0039】

本明細書では、「上皮間葉移行」（EMT）という用語は、胚発生の正常なプロセスである、上皮細胞から間葉表現型への変換を意味する。EMTは、イオンや体液の輸送体として機能する損傷した上皮細胞が、マトリックスをリモデリングする間葉細胞になるプロセスでもあり、癌では、この変換により、典型的には、細胞の形の変化、間葉タンパク質の発現、侵襲性の増加が起こる。インビトロでEMTを定義する基準には、上皮細胞の極性喪失と、個々の細胞への分離と、その後に起こる、細胞が運動性を獲得した後の分散が含まれる（Vincent-SalomonとThiery、Breast Cancer Res、2003年；第5巻(2)：101～106ページを参照されたい）。EMTの間に発現および／または分布および／または機能が変化する分子のクラスと、その原因として関与する分子のクラスに含まれるのは、増殖因子（例えばトランスフォーミング増殖因子（TGF）-β、wnt）、転写因子（例えばSNAI、SMAD、LEF、核β-カテニン）、細胞-細胞接着軸の分子（カドヘリン、カテニン）、細胞骨格調節因子（Rhoファミリー）、細胞外プロテアーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ、プラスミノーゲンアクチベータ）である（ThompsonとNewgreen、Cancer Res、2005年；65巻(14)：5991～5995ページを参照されたい）。

【0040】

本明細書では、「上皮」という用語は、身体の内面と外面の覆いを意味し、その中には血管やそれ以外の小さな洞孔のライニングが含まれる。上皮は、構成細胞が細胞間結合によって互いに広範囲に横方向に接着することが理由で比較的薄いシートまたは層を形成する上皮細胞の集合からなる。層は極性を持ち、頂端側と基底側がある。上皮細胞は強く組織化されているにもかかわらず可塑性が幾分かあるため、1つの上皮層内の細胞は形を変えることができる（例えば平坦な形から円柱形への変化、または一端が細く、他端が広がった形）。しかしそれは個別の細胞というよりは細胞群の中で起こる傾向がある（ThompsonとNewgreen、Cancer Res、2005年；65巻(14)：5991～5995ページを参照されたい）。

【0041】

「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を意味する。例えばコード配列の場合には、発現は、そのコード配列がmRNAに転写され、mRNAが翻訳されて1つ以上のポリペプチドになることを含んでいる。逆に、非コード配列の発現は、その非コード配列が転写産物に転写されることだけを含んでいる。「発現」という用語は、本明細書では、特定の位置にタンパク質または分子が存在することを意味するのにも使用するため、「局在」と同じ意味で用いることができる。

【0042】

「宿主細胞」という用語には、本発明の任意の組み換えベクターまたは単離ポリヌクレオチドのレシピエントになることができるか、そのようなレシピエントであった個別の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、その子孫は、自然の、または偶発的な、または意図的な変異および／または変化が理由で、元の親細胞と（形、または全体的なDNA相補性が）完全に同じである必要はない。宿主細胞には、生体内またはインビトロで本発明の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドをトランスフェクトするか感染させた細胞が含まれる。本発明の組み換えベクターを含む宿主細胞は、組み換え宿主細胞である。

【0043】

本明細書では、「単離した」という用語は、本来の状態で通常は付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。例えば「単離したタンパク質性分子」は、天然の細胞環境から、そして細胞の他の成分が付随している状態から、インビトロで単離および／または精製することを意味する。「実質的に含まない」は、タンパク質性分子の調製物の純度が、少なくとも10％、または15％、または20％、または25％、または30％、または35％、または40％、または45％、または50％、または55％、または60％、または65％、または70％、または75％、または80％、または85％、または90％、または91％、または92％、または93％、または94％、または95％、または96％、または97％、または98％、または99％であることを意味する。好ましい一実施態様では、タンパク質性分子の調製物は、本発明の対象ではない分子（本明細書では「汚染分子」とも呼ぶ）の含有率が、約30％未満、または25％未満、または20％未満、または15％未満、または10％未満、または9％未満、または8％未満、または7％未満、または6％未満、または5％未満、または4％未満、または3％未満、または2％未満、または1％未満（乾燥重量）である。タンパク質性分子が組み換えによって作製されるとき、培地を実質的に含まないこと、すなわち培地が調製物の体積の約20％未満、または15％未満、または10％未満、または5％未満、または4％未満、または3％未満、または2％未満、または1％未満であることも望ましい。本発明には、乾燥重量で少なくとも0.01ミリグラム、0.1ミリグラム、1.0ミリグラム、10ミリグラムの単離または精製した調製物が含まれる。

【0044】

本明細書では、「間葉上皮移行」（MET）という用語は、運動性、または多極性、または紡錘形である間葉細胞から、上皮と呼ばれる極性のある細胞の平坦なアレイへの移行を含む可逆的な生物学的プロセスである。METは、EMTの逆プロセスである。METは、正常な発生、がんの転移、人工多能性幹細胞の再プログラミングにおいて起こる。

【0045】

本明細書では、「間葉」は、胚性中胚葉のうちで、ゼラチン性基底物質の中にあってゆるく充填された未分化の細胞からなる部分を意味し、この部分から、結合組織、骨、軟骨、循環系、リンパ系が発生する。間葉は、比較的広がった組織ネットワークを形成する細胞集団である。間葉は、1つの完全な細胞層ではなく、細胞は、典型的には、その表面に、近傍への接着に関与する点だけを有する。その接着が、カドヘリン結合にも関与している可能性がある（ThompsonとNewgreen、Cancer Res、2005年；65巻(14)：5991～5995ページを参照されたい）。

【0046】

本明細書では、「過剰発現する」、「過剰発現」、「過剰発現している」、「過剰発現した」という用語は互いに交換可能であり、通常はがん細胞の中で、正常な細胞と比べて検出可能なより大きなレベルで転写または翻訳されている遺伝子（例えばPKC-θ遺伝子）を意味する。したがって過剰発現は、（増加した転写、増加した転写後プロセシング、増加した翻訳、増加した翻訳後プロセシング、変化した安定性、変化したタンパク質分解に起因する）タンパク質とRNAの過剰発現と、変化したタンパク質輸送パターン（核局在の増加）と（例えば基質の酵素加水分解の増加におけるような）機能的活性の増大に起因する局所的過剰発現の両方を意味する。過剰発現は、正常な細胞または比較する細胞（例えば乳房細胞）と比べて10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上も可能である。

【0047】

本明細書では、「機能可能に連結された」という表現は、構造遺伝子を調節エレメント（その非限定的な例にはプロモータが含まれ、そのプロモータがその後転写を制御し、場合によっては遺伝子の翻訳も制御する）の調節制御下に置くことを意味する。異種プロモータ／構造遺伝子の組み合わせを構成するとき、遺伝子配列またはプロモータを、遺伝子転写開始部位からの距離が、天然の状態でその遺伝子配列またはプロモータと、それが制御する遺伝子（すなわちその遺伝子配列またはプロモータの出所である遺伝子）を隔てる距離とほぼ同じになるように配置することが一般に好ましい。本分野で知られているように、機能を喪失することなく、この距離をいくらか変化させることができる。同様に、調節配列エレメントの制御下に置かれる異種遺伝子に対するその調節配列エレメントの好ましい位置は、天然状態におけるそのエレメント（すなわちそのエレメントの出所である遺伝子）の位置によって決まる。

【0048】

本明細書では、「PKC-θ阻害剤」とその文法的変形は、PKC-θの少なくとも1つの機能または生物活性を低下させるか抑制する分子を意味する。例えばPKC-θ阻害剤は、PKC-θの核移行を抑制するか低下させることができる、および／またはPKC-θの酵素活性を抑制するか低下させることができる、および／またはPKC-θの発現を抑制するか低下させることができる。いくつかの実施態様では、「PKC-θ阻害剤」という用語は、PKC-θの核移行を抑制する分子を意味する。

【0049】

本明細書では、「PKC-θ過剰発現細胞」という用語は、PKC-θを正常な細胞と比べて検出可能なより大きなレベルで発現する脊椎動物の細胞、特に哺乳動物または鳥類の細胞、その中でも哺乳動物の細胞を意味する。細胞として、脊椎動物の細胞（例えば霊長類の細胞）；鳥類の細胞；家畜動物の細胞（例えばヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ロバ、ブタの細胞）；実験室での試験に用いる動物の細胞（例えばウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターの細胞）；ペット動物の細胞（例えばネコ、イヌの細胞）；捕獲野生動物の細胞（例えばキツネ、シカ、ディンゴの細胞）が可能である。特別な実施態様では、PKC-θ過剰発現細胞は、ヒト細胞である。特別な実施態様では、PKC-θ過剰発現細胞は、がん幹細胞腫瘍細胞または非がん幹細胞腫瘍細胞であり、その中でもがん幹細胞腫瘍細胞が好ましい。過剰発現は、正常な細胞または比較する細胞（例えば乳房細胞）と比べて10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上も可能である。

【0050】

本明細書では、「ポリペプチド」、「タンパク質性分子」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、入れ換えて用いることができ、アミノ酸残基のポリマーと、そのバリアントおよび合成類似体を意味する。したがってこれらの用語は、含まれる1個以上のアミノ酸残基が合成された非天然アミノ酸（例えば対応する天然のアミノ酸の化学的類似体）であるアミノ酸ポリマーと、天然のアミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、修飾（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を排除しない。本発明のタンパク質性分子の可溶形態が特に有用である。その定義に含まれるのは、例えば1個のアミノ酸の1つ以上の類似体（例えば非天然アミノ酸）を含有するポリペプチドであり、その中には、置換された結合を有する非天然アミノ酸またはポリペプチドが含まれる。

【0051】

本明細書では、「選択的」とその文法的変形は、PKC-θを抑制するが、1つ以上の他のPKC酵素またはアイソフォーム（例えばPKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ、PKC-ν）の機能は実質的に抑制することのない分子を意味する。一般に、PKC-θに対して選択的な分子は、PKC-θに対する選択性が、1つ以上の他のPKC酵素（すなわちPKC-θ以外のPKC、例えばPKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ、PKC-ν）の抑制と比べて約2倍、または5倍、または10倍、または20倍、または50倍、またはそれ以上大きい。別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも50倍大きな抑制を示す。さらに別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも100倍大きな抑制を示す。さらに別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも500倍大きな抑制を示す。さらに別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも100倍大きな抑制を示す。

【0052】

本明細書では、「塩」と「プロドラッグ」という用語に、医薬として許容可能な塩、エステル、水和物や、他の任意の化合物で、レシピエントに投与したとき本発明のタンパク質性分子、またはその活性な代謝産物または残部を（直接または間接に）提供することのできるものが含まれる。医薬として許容可能な適切な塩に含まれるのは、医薬として許容可能な無機酸（例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、臭化水素酸）の塩、または医薬として許容可能な有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、吉草酸）の塩である。塩基性塩の非限定的な例に含まれるのは、医薬として許容可能なカチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、アルキルアンモニウム）とで形成される塩である。また、低級アルキルハロゲン化物（例えば塩化メチル、塩化エチル、塩化プロピル、塩化ブチル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、臭化ブチル、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、ヨウ化ブチル）、硫酸ジアルキル（例えば硫酸ジメチル、硫酸ジエチル）などの薬剤を用いて塩基性窒素含有基を四級化することができる。しかし医薬として許容可能でない塩も、医薬として許容可能な塩の調製に有用であるという理由で本発明の範囲に入ることが理解されよう。塩とプロドラッグの調製は、本分野で知られている方法によって実現することができる。例えば金属塩は、本発明の化合物を金属水酸化物と反応させることによって調製できる。酸性塩は、適切な酸を本発明のタンパク質性分子と反応させることによって調製できる。

【0053】

本明細書では、「厳密さ」という用語は、ハイブリダイゼーション手続きと洗浄手続きの間の温度とイオン強度の条件と、ある種の有機溶媒の存在または不在を意味する。厳密さが大きくなるほど、固定化された標的ヌクレオチド配列と、洗浄後に標的にハイブリダイズしたまま残る標識されたプローブポリヌクレオチド配列の間の相補性の程度が大きくなる。「高度の厳密さ」という用語は、相補的塩基の数が多いヌクレオチド配列だけがハイブリダイズする温度とイオンの条件を意味する。必要とされる厳密さは、ヌクレオチド配列と、ハイブリダイゼーション中に存在するさまざまな要素に依存する。一般に、厳密さの条件は、規定されたイオン強度とpHのもとで特定の配列の融点（T_m）よりも約10～20℃低く選択される。T_mは、標的配列の50％が相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。

【0054】

本明細書では、「対象」という用語は、治療または予防を望む脊椎動物の対象、特に哺乳動物または鳥類の対象を意味する。適切な対象の非限定的な例に含まれるのは、霊長類；鳥類；家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ロバ、ブタ）；実験室での試験に用いる動物（例えばウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）；ペット動物（例えばネコ、イヌ）；捕獲野生動物（例えばキツネ、シカ、ディンゴ）である。特に、対象はヒトである。しかし上記の用語は、症状が存在することを意味しないことが理解されよう。

【0055】

本明細書では、「腫瘍」という用語は、悪性であるか良性であるかに関係なく、あらゆる新生細胞の成長および増殖と、あらゆる前がん性の細胞および組織と、あらゆるがん性の細胞および組織を意味する。「がん」と「がん性」という用語は、哺乳動物における細胞の制御されない増殖を典型的な特徴の一部とする生理学的状態を意味する。本明細書では、「がん」という用語は、非転移性がんと転移性がんを意味し、その中には、初期ステージのがんと後期ステージのがんが含まれる。「前がん性」という用語は、典型的には進行または発達してがんになる状態または増殖を意味する。「非転移性」という用語は、良性のがんを意味するか、原発部位に留まっていて、リンパ系または血管系や原発部位以外の組織に侵入していないがんを意味する。一般に、非転移性がんは、ステージ0、I、IIのあらゆるがんである。「初期ステージのがん」は、侵襲性または転移性ではないがん、またはステージ0、I、IIに分類されるがんを意味する。「後期ステージのがん」という用語は、一般に、ステージIIIまたはIVのがんを意味するが、ステージIIのがん、またはステージIIのがんのサブステージも意味することができる。当業者であれば、ステージIIのがんを初期ステージのがんに分類するか後期ステージのがんに分類するかは、がんの具体的なタイプに依存することがわかるであろう。代表的ながんの非限定的な例に含まれるのは、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、大腸がん、肺がん、肝細胞がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、尿管のがん、甲状腺がん、腎臓がん、癌腫、メラノーマ、脳腫瘍、非小細胞肺がん、頭と首の扁平細胞がん、子宮内膜がん、多発性骨髄腫、中皮腫、直腸がん、食道がんである。一実施態様では、がんは乳がんである。

【0056】

本明細書では、「ベクター」という用語は、中にポリヌクレオチドを挿入するか、中でポリヌクレオチドをクローニングすることのできるポリヌクレオチド分子を意味し、適しているのは、例えばプラスミド、バクテリオファージ、酵母、ウイルスに由来するDNA分子である。ベクターは、1つ以上の独自の制限部位を含有することができ、所定の宿主細胞（標的細胞、標的組織、その前駆細胞、その前駆組織が含まれる）の中で自律的に複製すること、または所定の宿主のゲノムと一体化してクローニングされた配列を再現することが可能である。したがってベクターとして、自律的に複製するベクター（すなわち染色体外部分として存在し、染色体の複製とは独立に複製されるベクター）が可能であり、例えば、直線状または閉環状のプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、人工染色体がある。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含有することができる。あるいはベクターとして、宿主細胞の中に導入されたときゲノムと一体化して、一体化した染色体とともに複製されるベクターが可能である。ベクター系は、単一のベクターまたはプラスミド、または2つ以上のベクターまたはプラスミド（それらが合わさって、宿主細胞のゲノムの中に導入される全DNAを含有する）、またはトランスポゾンを含むことができる。ベクターの選択は、典型的には、そのベクターが導入される宿主細胞とそのベクターの適合性に依存する。本件では、ベクターは、真菌細胞、細菌細胞、動物細胞いずれか（哺乳動物の細胞が好ましい）の中で機能することが可能なウイルスベクターまたはウイルス由来ベクターが好ましい。そのようなベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、酵母のいずれかに由来するものが可能である。ベクターは、選択マーカー（例えば適切な形質転換体の選択に使用できる抗生剤耐性遺伝子）も含むことができる。そのような抵抗遺伝子の例は当業者に知られており、抗生剤であるカナマイシンやG418（Geneticin（登録商標））に対する耐性を与えるnptII遺伝子や、抗生剤であるハイグロマイシンBに対する耐性を与えるhph遺伝子が含まれる。

【0057】

本明細書に記載した各実施態様は、特に断わらない限り、必要な変更を加えてすべての実施態様に適用される。

【0058】

2．タンパク質性PKC-θ阻害剤

【0059】

本発明は、一部が、PKC-θの核移行を抑制するタンパク質性分子の同定に基づいている。そのようなタンパク質性分子は、CSC腫瘍細胞と非CSC腫瘍細胞の形成と維持を抑制し、CSC腫瘍細胞のEMTを抑制し、CSC腫瘍細胞のMETを誘導する。そこで発明者は、本発明のタンパク質性分子をがんの治療または予防に使用できると考えた。

【0060】

したがって本発明の1つの側面では、式（I）：
Z₁X₁X₂X₃X₄IDX₅PPX₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁Z₂ （I）
によって表わされる単離または精製したタンパク質性分子が提供される。前記式中、
「Z₁」と「Z₂」は、独立に、存在しないか、約1～約50個のアミノ酸残基（と、その間のあらゆる整数個のアミノ酸残基）を含むタンパク質性部分と、保護部分のうちの少なくとも1つから選択され；
「X₁」は、存在しないか、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₂」と「X₃」は、独立に、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₄」は、R、K、D、Eを含む帯電したアミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₅」は、存在しないか、Wまたはその修飾された形態であり；
「X₆」は、F、Y、W、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₇」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₈」は、存在しないか、Pまたはその修飾された形態であり；
「X₉」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₁₀」は、V、L、I、Mを含む疎水性アミノ酸残基とその修飾された形態と、Pとその修飾された形態から選択され；
「X₁₁」は、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択される。

【0061】

いくつかの実施態様では、「X₁」～「X₁₁」は、
「X₁」が、存在しないか、Rである；
「X₂」がRである；
「X₃」がKである；
「X₄」がEまたはRである；
「X₅」が、存在しないか、Wである；
「X₆」がFまたはRである；
「X₇」がRである；
「X₈」が、存在しないか、Pである；
「X₉」がKである；
「X₁₀」がVまたはPである；
「X₁₁」がKである
の1つ以上の組み合わせから選択される。

【0062】

いくつかの実施態様では、「Z₁」は、10個、または9個、または8個、または7個、または6個、または5個、または4個、または3個、または2個、または1個のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施態様では、「Z₂」は、10個、または9個、または8個、または7個、または6個、または5個、または4個、または3個、または2個、または1個のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施態様では、「Z₁」と「Z₂」の中のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基から選択される。

【0063】

いくつかの実施態様では、「Z₁」は、式（II）：
X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆ （II）
によって表わされるタンパク質性分子である。前記式中、
「X₁₂」は、存在しないか、保護部分であり；
「X₁₃」は、存在しないか、Pと、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₁₄」は、存在しないか、Pと、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₁₅」は、存在しないか、Pと、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択され；
「X₁₆」は、存在しないか、Pと、R、Kを含む塩基性アミノ酸残基とその修飾された形態から選択される。

【0064】

いくつかの実施態様では、「Z₂」は、式（III）：
X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀ （III）
によって表わされるタンパク質性分子である。前記式中、
「X₁₇」は、存在しないか、任意のアミノ酸残基から選択され；
「X₁₈」は、存在しないか、任意のアミノ酸残基から選択され；
「X₁₉」は、存在しないか、任意のアミノ酸残基から選択され；
「X₂₀」は、存在しないか、保護部分である。

【0065】

いくつかの実施態様では、「Z₁」と「Z₂」が存在しない。

【0066】

特別な実施態様では、式（I）のタンパク質性分子は、配列番号1または2：
RKEIDPPFRPKVK ［配列番号1］
または
RRKRIDWPPRRKPK ［配列番号2］
によって表わされるアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、または主にそのアミノ酸配列からなる。

【0067】

本明細書では、配列番号1のタンパク質性分子を「インポーチニブ4759」とも呼び、配列番号2のタンパク質性分子を「インポーチニブ4759_O1」とも呼ぶ。

【0068】

いくつかの実施態様では、式（I）のタンパク質性分子は、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質性分子ではない。

【0069】

そこで特別な実施態様では、式（I）のタンパク質性分子は、配列番号2のアミノ酸配列を含む、またはそのアミノ酸配列からなる、または主にそのアミノ酸配列からなる。

【0070】

本発明では、配列番号1および／または2のバリアントであるタンパク質性分子も考慮する。そのような「バリアント」タンパク質性分子には、自然状態のタンパク質のN末端および／またはC末端に1個以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮）または付加があるもの、または自然状態のタンパク質の1つ以上の部位に1個以上のアミノ酸の欠失または付加があるもの、または自然状態のタンパク質の1つ以上の部位に1個以上のアミノ酸の置換があるものが含まれる。

【0071】

本発明に包含されるバリアントタンパク質は、生物活性である。すなわち自然状態のタンパク質の望む生物活性を保持し続けている。そのようなバリアントは、例えば遺伝的多型や人為的操作によって生じる可能性がある。

【0072】

配列番号1および／または2のタンパク質性分子は、さまざまな方法で変化させることができ、方法には、アミノ酸の置換、欠失、短縮化（truncation）、挿入が含まれる。そのような操作方法は一般に本分野で知られている。例えば配列番号1および／または2のアミノ酸配列バリアントは、配列番号1および／または2のアミノ酸配列をコードする核酸の突然変異誘発によって調製することができる。突然変異誘発とヌクレオチド配列改変の方法は、本分野で周知である。例えばKunkel（1985年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 第82巻：488～492ページ）、Kunkel他（1987年、Methods in Enzymol、第154巻：367～382ページ）、アメリカ合衆国特許第4,873,192号、Watson, J. D. 他（『Molecular Biology of the Gene』、第4版、Benjamin/Cummings社、メンロ・パーク、カリフォルニア州、1987年）と、その中の参考文献を参照されたい。興味あるタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Dayhoffらのモデル（1978年）『Atlas of Protein Sequence and Structure』（Natl. Biomed. Res. Found. ワシントンD.C.）に見いだすことができる。点突然変異または短縮化によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングする方法と、選択された特性を有する遺伝子産物のcDNAライブラリをスクリーニングする方法が、本分野で知られている。そのような方法を、配列番号1および／または2のタンパク質性分子のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適合させることができる。ライブラリ内の機能する変異体の頻度を大きくする技術である回帰的アンサンブル突然変異誘発（REM）をスクリーニングアッセイと組み合わせて利用し、活性なバリアントを同定することができる（ArkinとYourvan（1992年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA第89巻：7811～7815ページ；Delgrave他、（1993年）Protein Engineering、第6巻：327～331ページ）。保存的置換（例えば1個のアミノ酸を、似た特性を持つ別のアミノ酸と交換すること）が望ましい可能性がある。それについてはあとでより詳しく説明する。

【0073】

本発明のバリアントペプチドまたはバリアントポリペプチドは、その配列に沿ったさまざまな位置に、親アミノ酸配列（例えば天然のアミノ酸配列、または参照アミノ酸配列）と比べて保存的アミノ酸置換を含有することができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、似た側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられる置換である。似た側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、あとで詳細に説明するように、本分野ですでに定められている。

【0074】

本発明のタンパク質性分子のアミノ酸配列は、ある種の性質または下位クラスのアミノ酸で定義される。アミノ酸残基は、一般に、以下のような主要な下位クラスに下位分類される。

【0075】

酸性：生理学的pHでプロトンが失われることが原因で残基は負の電荷を持つため、その残基は水溶液によって引き付けられて、ペプチドの配置内で、そのペプチドが生理学的pHの水性媒体の中にあるときに含まれる表面位置を探す。酸性側鎖を有するアミノ酸に含まれるのは、グルタミン酸、アスパラギン酸である。

【0076】

塩基性：生理学的pHで、またはその値からpH単位で1または2以内（例えばヒスチジン）でプロトンが会合することが原因で残基は正の電荷を持つため、その残基は水溶液によって引き付けられて、ペプチドの配置内で、そのペプチドが生理学的pHの水性媒体の中にあるときに含まれる表面位置を探す。塩基性側鎖を有するアミノ酸に含まれるのは、アルギニン、リシン、ヒスチジンである。

【0077】

帯電：残基は生理学的pHで帯電しているため、その残基には、酸性側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸である、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンが含まれる。

【0078】

疎水性：残基は生理学的pHで帯電していないため、水溶液による反発を受けて、ペプチドの配置内で、そのペプチドが生理学的pHの水性媒体の中にあるときに含まれる内部位置を探す。疎水性側鎖を有するアミノ酸に含まれるのは、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンである。

【0079】

中性／極性：残基は生理学的pHで帯電していないが、水溶液による十分な反発を受けることはなく、ペプチドの配置内で、そのペプチドが生理学的pHの水性媒体の中にあるときに含まれる内部位置を探す。中性／極性の側鎖を有するアミノ酸に含まれるのは、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、トレオニンである。

【0080】

この記述は、極性基がない場合でさえ疎水性を与えるほど十分に側鎖が大きくないという理由で「小さな」いくつかのアミノ酸も特徴づけている。「小さな」アミノ酸は、プロリンを例外として、少なくとも1個の極性基が側鎖にあるときには4個以下の炭素原子を持ち、そうでないときには3個以下の炭素を持つアミノ酸である。小さな側鎖を有するアミノ酸に含まれるのは、グリシン、セリン、アラニン、トレオニンである。遺伝子によってコードされる二次的アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次構造に対する既知の効果が理由で特別なケースである。プロリンの構造は、その側鎖がα-アミノ基の窒素とα-炭素に結合しているという点で他のすべての天然アミノ酸と異なっている。しかしいくつかのアミノ酸類似性マトリックス（例えばM. O. Dayhoff（編）、『Atlas of protein sequence and structure』、第5巻の中のDayhoff他、（1978年）、「タンパク質における進化的変化のモデル。距離関係を求めるためのマトリックス」、345～358ページ、National Biomedical Research Foundation、ワシントンDC；と、Gonnet他、（1992年）、Science、第256巻(5062)：1443～1445ページに開示されている例えばPAM120マトリックスとPAM250マトリックス）は、プロリンを、グリシン、セリン、アラニン、トレオニンと同じグループに含んでいる。したがって本発明の目的では、プロリンは「小さな」アミノ酸に分類される。

【0081】

極性または非極性として分類するのに必要な引力または反発の程度は任意であるため、本発明で特に考慮するアミノ酸は、一方または他方に分類されている。特に名称を挙げないたいていのアミノ酸は、知られている挙動に基づいて分類することができる。

【0082】

アミノ酸残基はさらに、環式または非環式、芳香族または非芳香族として下位分類すること（残基の側鎖置換基に関する自明な分類）、小または大として下位分類することができる。残基が小さいと見なされるのは、追加の極性置換基が存在する場合には合計で炭素原子（カルボキシル炭素を含む）を4個以下含有しているときであり、そうでない場合には3個以下含有しているときである。小さなアミノ酸残基は、もちろん、常に非芳香族である。アミノ酸残基は、その構造特性に応じ、2つ以上のクラスに入る可能性がある。天然のタンパク質のアミノ酸について、このスキームに従う下位分類を表1に示す。

【0083】

【表1】

【0084】

保存的アミノ酸置換も側鎖に基づくグループ分けを含んでいる。例えば脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンであり；脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンとトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンとグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインとメチオニンである。例えばロイシンをイソロイシンまたはバリンで置き換えること、またはアスパラギン酸をグルタミン酸で置き換えること、またはトレオニンをセリンで置き換えること、またはあるアミノ酸を構造的に関連したアミノ酸で同様に置き換えることが、その結果として得られる本発明で有用なバリアントペプチドの特性に大きな影響を与えることはないと予想するのは合理的である。あるアミノ酸が変化することによってPKC-θを抑制するタンパク質性分子になるかどうかは、その活性を調べることによって容易に判断できる。保存的置換を、「アミノ酸置換の例と好ましいアミノ酸置換」というタイトルで表2に示す。本発明の範囲に入るアミノ酸置換は、一般に、（a）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、（c）側鎖の大きさのいずれかを維持することに対する効果が顕著に異ならない置換を選択することによって実現される。置換を導入した後、バリアントの生物活性をスクリーニングする。

【0085】

【表2】

【0086】

あるいは保存的置換にするための類似したアミノ酸は、側鎖が何であるかに基づいて3つのカテゴリーに分類することができる。第1のグループに含まれるのは、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジンであり、これらはすべて帯電した側鎖を持っており、第2のグループに含まれるのは、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンであり、第3のグループに含まれるのは、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンであることが、Zubay、『Biochemistry』第3版、Wm.C. Brown Publishers社（1993年）に記載されている。

【0087】

そこで本発明のペプチド内で予想される非必須アミノ酸残基は、典型的には、側鎖が同じであるファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは変異を例えば飽和突然変異誘発によって本発明のペプチドのコード配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を例えば本明細書に記載されているようにして親ポリペプチドの活性に関してスクリーニングすることで、その活性を保持している変異体を同定することができる。コード配列の突然変異誘発の後、コードされたペプチドを組み換え発現させ、その活性を求めることができる。「非必須」アミノ酸残基は、本発明の一実施態様のペプチドの野生型配列から変化している可能性があるが、その活性の1つ以上が失われたり実質的に変化したりしていない残基である。変化によってこれら活性の1つが実質的に変化しないことが好ましく、例えば活性は、野生型の活性の少なくとも20％、または40％、または60％、または70％、または80％である。逆に、「必須」アミノ酸残基は、本発明の一実施態様のペプチドの野生型配列から変化するとき、親分子の活性を失い、活性が野生型の20％未満になる残基である。例えばそのような必須アミノ酸残基に含まれるのは、式（I）のX₁から始まる番号付けで位置5のIle（またはその修飾された形態）、位置6のAso（またはその修飾された形態）、位置8のPro（またはその修飾された形態）、位置9のPro（またはその修飾された形態）である。

【0088】

したがって本発明では、本発明の配列番号1および／または2のタンパク質性分子のバリアントも考慮する。そのバリアントは、1個以上のアミノ酸残基の付加、または欠失、または置換によって親配列から識別される。一般に、バリアントは、例えば配列番号1または2に示した親タンパク質性分子配列または参照タンパク質性分子配列と、少なくとも約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列類似性を示すことが、本明細書の別の箇所に記載した配列アラインメントプログラムにより、デフォルトパラメータを用いて求められる。バリアントは、例えば配列番号1または2に示した親タンパク質性分子配列または参照タンパク質性分子配列と、少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列一致であることが、本明細書の別の箇所に記載した配列アラインメントプログラムにより、デフォルトパラメータを用いて求まることが望ましい。本発明のバリアントペプチドの範囲に入るインポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1のバリアントは、親分子から一般に少なくとも1個かつ5個未満、または4個未満、または3個未満、または2個未満、または1個未満のアミノ酸残基が異なっている可能性がある。いくつかの実施態様では、本発明のバリアントペプチドは、配列番号1または2内の対応する配列から一般に少なくとも1個かつ5個未満、または4個未満、または3個未満、または2個未満、または1個未満のアミノ酸残基が異なっている可能性がある。いくつかの実施態様では、本発明のバリアントペプチドのアミノ酸配列は、式（I）のX₁から始まる番号付けで位置5のIle（またはその修飾された形態）、位置6のAso（またはその修飾された形態）、位置8のPro（またはその修飾された形態）、位置9のPro（またはその修飾された形態）を含んでいる。いくつかの実施態様では、本発明のバリアントペプチドのアミノ酸配列は、式（I）のタンパク質性分子を含んでいる。特別な実施態様では、本発明のバリアントペプチドは、PKC-θ核移行を抑制する。

【0089】

配列を比較するのにアラインメントが必要な場合には、配列を典型的には類似度または一致度が最大となるようにアラインメントする。欠失、または挿入、またはミスマッチによって「外れた」配列が、一般に違いであると見なされる。違いは、非必須残基の位置での違いまたは変化であるか、保存的置換であることが好ましい。

【0090】

いくつかの実施態様では、配列間の配列類似度または配列一致度の計算は、以下のようにして行なう。

【0091】

2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の％一致度を求めるため、最適な比較を目的として配列をアラインメントさせる（例えば最適なアラインメントのため、第1と第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較を目的として、非相同配列は無視することができる）。いくつかの実施態様では、比較を目的としてアラインメントさせる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも40％、より一般には少なくとも50％または60％、さらに一般には少なくとも70％、または80％、または90％、または100％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列内のある位置が、第2の配列内の対応する位置にあるのと同じアミノ酸またはヌクレオチドによって占められているとき、その分子はその位置が一致している。アミノ酸配列の比較に関しては、第1の配列内のある位置が、第2の配列内の対応する位置にあるのと同じアミノ酸または類似したアミノ酸（すなわち保存的置換）によって占められているとき、その分子はその位置が類似している。

【0092】

2つの配列の間の％一致度は、それら2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮した上で、それらの配列が同じ位置で共有している同じアミノ酸残基の数の関数である。逆に、2つの配列の間の％類似度は、それら2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮した上で、それらの配列が同じ位置で共有している同じアミノ酸残基と類似したアミノ酸残基の数の関数である。

【0093】

配列の比較と、配列間の％一致度または％類似度の決定は、数学的アルゴリズムを利用して実現することができる。いくつかの実施態様では、アミノ酸配列の間の％一致度または％類似度は、GCGソフトウエアパッケージ（Devereaux他（1984年）Nucleic Acids Research、第12巻：387～395ページ）の中のGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanとWunsch（1970年、J. Mol. Biol.、第48巻：444～453ページ）のアルゴリズムを利用し、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスと、ギャップの重み（16、14、12、10、8、6、4のいずれか）と、長さの重み（1、2、3、4、5、6のいずれか）を用いて求められる。いくつかの実施態様では、アミノ酸配列の間の％一致度または％類似度は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているMeyersとMiller（1989年、Cabios、第4巻：11～17ページ）のアルゴリズムを利用し、PAM120重み残基表を用い、ギャップ長のペナルティを12、ギャップのペナルティを4にして求めることができる。

【0094】

本発明では、本明細書で規定した厳密さ条件下で、特に中程度、高度、非常に高度の厳密さ条件下で、好ましくは高度または非常に高度の厳密さ条件下で、配列番号1および／または2のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその非コード鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる単離したペプチド、合成ペプチド、組み換えペプチドも考慮する。本発明では、本明細書で規定した厳密さ条件下で、特に中程度、高度、非常に高度の厳密さ条件下で、好ましくは高度または非常に高度の厳密さ条件下で、配列番号1および／または2のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその非コード鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子も考慮する。

【0095】

本明細書では、「厳密さ条件下でハイブリダイズする」という表現は、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件を記述しており、低度の厳密さ、中程度の厳密さ、高度の厳密さ、非常に高度の厳密さという条件を包含する。

【0096】

ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、Ausubel他（1998年）『Current Protocols in Molecular Biology』（John Wiley and Sons, Inc.社）の特に6.3.1節～6.3.6節に見いだすことができる。水性法と非水性法の両方を利用できる。本明細書で低度の厳密さ条件に言及するとき、そこには、42℃でハイブリダイズさせるための少なくとも約1％v/v～少なくとも約15％v/vのホルムアミド、少なくとも約1M～少なくとも約2Mの塩と、42℃で洗浄するための少なくとも約1M～少なくとも約2Mの塩が含まれ、かつ包含される。低度の厳密さ条件は、65℃でハイブリダイズさせるための1％ウシ血清アルブミン（BSA）、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO₄（pH 7.2）、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と、室温で洗浄するための（i）2×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、0.1％SDS；または（ii）0.5％BSA、1 mM EDTA、40 mM NaHPO₄（pH 7.2）、5％SDSも含むことができる。低度の厳密さ条件の一実施態様には、約45℃の6×SSCの中でハイブリダイズさせた後、少なくとも50℃の0.2×SSC、0.1％SDSの中で2回洗浄すること（低度の厳密さ条件では、洗浄の温度を55℃まで上昇させることができる）が含まれる。中程度の厳密さ条件には、42℃でハイブリダイズさせるための少なくとも約16％v/v～少なくとも約30％v/vのホルムアミド、少なくとも約0.5M～少なくとも約0.9Mの塩と、55℃で洗浄するための少なくとも約0.1M～少なくとも約0.2Mの塩が含まれ、かつ包含される。中程度の厳密さ条件は、65℃でハイブリダイズさせるための1％ウシ血清アルブミン（BSA）、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO₄（pH 7.2）、7％SDSと、60～65℃で洗浄するための（i）2×SSC、0.1％SDS；または（ii）0.5％BSA、1 mM EDTA、40 mM NaHPO₄（pH 7.2）、5％SDSも含むことができる。中程度の厳密さ条件の一実施態様には、約45℃の6×SSCの中でハイブリダイズさせた後、60℃の0.2×SSC、0.1％SDSの中で1回または2回洗浄することが含まれる。高度の厳密さ条件には、42℃でハイブリダイズさせるための少なくとも約31％v/v～少なくとも約50％v/vのホルムアミド、約0.01M～約0.15Mの塩と、55℃で洗浄するための約0.01M～約0.02Mの塩が含まれ、かつ包含される。高度の厳密さ条件は、65℃でハイブリダイズさせるための1％BSA、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO₄（pH 7.2）、7％SDSと、65℃超の温度で洗浄するための（i）0.2×SSC、0.1％SDS；または（ii）0.5％BSA、1 mM EDTA、40 mM NaHPO₄（pH 7.2）、1％SDSも含むことができる。高度の厳密さ条件の一実施態様には、約45℃の6×SSCの中でハイブリダイズさせた後、65℃の0.2×SSC、0.1％SDSの中で1回以上洗浄することが含まれる。

【0097】

本発明のいくつかの側面では、配列番号1および／または2のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその非コード鎖に高度の厳密さ条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる本発明の単離したペプチド、合成ペプチド、組み換えペプチドが提供される。いくつかの実施態様では、本発明の単離したペプチド、合成ペプチド、組み換えペプチドは、配列番号1および／または2のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその非コード鎖に非常に高度の厳密さ条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる。非常に高度の厳密さ条件の一実施態様には、65℃の0.5Mリン酸ナトリウム、7％SDSの中でハイブリダイズさせた後、65℃の0.2×SSC、1％SDSの中で1回以上洗浄することが含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のバリアントペプチドのアミノ酸配列は、式（I）のX₁から始まる番号付けで位置5のIle（またはその修飾された形態）、および／または位置6のAso（またはその修飾された形態）、および／または位置8のPro（またはその修飾された形態）、および／または位置9のPro（またはその修飾された形態）を含んでいる。いくつかの実施態様では、本発明のバリアントペプチドのアミノ酸配列は、式（I）のタンパク質性分子を含んでいる。いくつかの実施態様では、本発明のバリアントペプチドのアミノ酸配列は、式（I）のタンパク質性分子を含んでいる。特別な実施態様では、本発明のバリアントペプチドは、PKC-θ核移行を抑制する。

【0098】

他の厳密さ条件は本分野で周知であり、当業者であれば、さまざまな因子を操作してハイブリダイゼーションの特異性を最適化できることがわかるであろう。最終洗浄の厳密さの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを保証するのに役立つ。詳細な例に関しては、Ausubel他（1998年）『Current Protocols in Molecular Biology』（John Wiley and Sons, Inc.社）、特に2.10.1～2.10.16ページと、Sambrook他（1989年）『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』（Cold Spring Harbour Press）、特に1.101節～ 1.104節を参照されたい。

【0099】

厳密な洗浄は、典型的には約42℃～68℃の温度で実施されるが、当業者は、他の温度も厳密さ条件に適している可能性があることを理解するであろう。最大ハイブリダイゼーション率は、典型的には、DNA-DNAハイブリッドを形成するためのT_mよりも約20℃～25℃下で起こる。T_mが融点であること、すなわち2つの相補的なポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、本分野において周知である（Ausubel他（1998年）『Current Protocols in Molecular Biology』（John Wiley and Sons, Inc.社）の2.10.8ページを参照されたい）。一般に、DNAの完全に一致した二本鎖のT_mは、式：
T_m＝81.5 + 16.6 (log₁₀ M) + 0.41 (％G＋C) - 0.63 (％ホルムアミド) - (600/長さ)
によって大まかな値を予測することができる。ただしMはNa⁺の濃度であり、0.01 M～0.4 Mの範囲が好ましく；％G＋Cは、全塩基数に対する割合としてのグアノシン塩基とシトシン塩基の和であり、30％～75％G＋Cの範囲が好ましく；％ホルムアミドは、体積％で表わしたホルムアミドの濃度であり；長さは、DNA二本鎖の中の塩基対の数である。DNA二本鎖のT_mは、ランダムなミスマッチ塩基対の数が1％増加するごとに約1℃低下する。洗浄は、一般に、高度の厳密さではT_m-15℃で実施され、中程度の厳密さではT_m-30℃で実施される。

【0100】

ハイブリダイゼーション法の一例では、固定化されたDNAを含む膜（例えばニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、標識したプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（50％脱イオン化ホルムアミド、5×SSC、5×デンハルト溶液（0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％BSA）、0.1％SDS、200 mg/mlの変性したサケ精子DNA）の中で42℃にて一晩ハイブリダイズさせる。次に膜に対して2回続けて厳密な洗浄（すなわち2×SSC、0.1％SDSで45℃にて15分間、その後2×SSC、0.1％SDSで50℃にて15分間）を実施した後、2回続けてより高度の厳密な洗浄（すなわち0.2×SSC、0.1％SDSで55℃にて12分間、その後0.2×SSC、0.1％SDSで65～68℃にて12分間）を実施する。

【0101】

本発明のタンパク質性分子には、修飾された側鎖を有するアミノ酸を含むペプチド、ペプチド合成中に非天然アミノ酸残基および／またはその誘導体を組み込むこと、本発明のペプチドに配置の制約を課す架橋剤や他の方法を使用することも包含される。側鎖修飾の例に含まれるのはアミノ基の修飾であり、それは、例えば、無水酢酸を用いてアシル化することによって；無水コハク酸と無水テトラヒドロフタル酸を用いてアシル化することによって；メチルアセトイミデートを用いてアミジン化することによって；シアン酸塩を用いてアミノ基をカルバモイル化することによって；ピリドキサール-5-リン酸塩を用いてリシンをピリドキシル化した後にホウ水素化ナトリウムを用いて還元することによって；アルデヒドとの反応による還元的アルキル化の後にホウ水素化ナトリウムを用いて還元することによって；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）を用いてアミノ基をトリニトロベンジル化することによってなされる。

【0102】

カルボキシル基は、O-アシルイソ尿素の形成を通じたカルボジイミド活性化によって修飾した後、例えば誘導体化して対応するアミドにすることができる。

【0103】

アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、グリオキサールなどの試薬を用いて複素環縮合生成物を形成することによって修飾できる。

【0104】

トリプトファン残基は、例えば臭化2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルまたはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化によって、またはN-ブロモスクシンイミドを用いた酸化によって修飾することができる。

【0105】

チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いてニトロ化して3-ニトロチロシン誘導体を形成することによって修飾できる。

【0106】

ペプチドの合成中に組み込む非天然アミノ酸と誘導体の非限定的な例に含まれるのは、4-アミノ酪酸、および／または6-アミノヘキサン酸、および／または4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、および／または4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、および／またはt-ブチルグリシン、および／またはノルロイシン、および／またはノルバリン、および／またはフェニルグリシン、および／またはオルニチン、および／またはサルコシン、および／または2-チエニルアラニン、および／またはセレノシステイン、および／またはアミノ酸のD-異性体である。本発明で考慮する非天然アミノ酸のリストを表3に示す。

【0107】

【表3-1】

【表3-2】

【0108】

本発明のタンパク質性分子は本来的に透過性の膜である可能性があるが、膜透過部分をそのタンパク質性分子と共役させることによって膜の透過性をさらに増大させることができる。したがっていくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、少なくとも1つの膜透過部分を含む。膜透過部分は、タンパク質性分子の任意の点で共役させることができる。適切な膜透過部分に含まれるのは、脂質部分、コレステロール、タンパク質（例えば細胞膜透過ペプチド、ポリカチオン性ペプチド）であり、その中でも特に脂質部分である。

【0109】

適切な細胞膜透過ペプチドには、例えばアメリカ合衆国特許出願公開第 20090047272号、第 20150266935号、第20130136742号に記載されているペプチドを含めることができる。したがって適切な細胞膜透過ペプチドの非限定的な例に含まれるものとして、塩基性ポリ(Arg)ペプチドと塩基性ポリ(Lys)ペプチド、Arg残基とLys残基の非天然類似体を含有する塩基性ポリ(Arg)ペプチドと塩基性ポリ(Lys)ペプチド（例えばYGRKKRPQRRR（HIV TAT_47-57）、RRWRRWWRRWWRRWRR（W/R）、CWK₁₈（AlkCWK₁₈）、K₁₈WCCWK₁₈（Di-CWK₁₈）、KWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（Transportan）、GLFEALEELWEAK（DipaLytic）、K₁₆GGCRGDMFGCAK₁₆RGD（K₁₆RGD）、KK₁₆GGCMFGCGG（P1）、K₁₆ICRRARGDNPDDRCT（P2）、KKWKMRRNQFWVKVQRbAK（B）bA（P3）、VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKY
NKRA（P3a）、IGRIDPANGKTKYAPKFQDKATRSNYYGNSPS（P9.3）、KETWWETWWTEWS
QPKKKRKV（Pep-1）、PLAEIDGIELTY（Plae）、K₁₆GGPLAEIDGIELGA（Kplae)、K₁₆GGPLAEID
GIELCA（cKplae）、GALFLGFLGGAAGSTMGAWSQPKSKRKV（MGP）、WEAK(LAKA)₂-LAK
H(LAKA)₂LKAC（HA2）、(LARL)₆NHCH₃（LARL4₆）、KLLKLLLKLWLLKLLL（Hel-11-7）、(KKKK)₂GGC（KK）、(KWKK)₂GCC（KWK）、(RWRR)₂GGC（RWR）、PKKKRKV（SV40 NLS7）、PEVKKKRKPEYP（NLS12）、TPPKKKRKVEDP（NLS12a）、GGGGPKKKRKVGG（SV40 NLS13）、GGGFSTSLRARKA（AV NLS13）、CKKKKKKSEDEYPYVPN（AV RME NLS17）、CKKKKKK
KSEDEYPYVPNFSTSLRARKA（AV FP NLS28）、LVRKKRKTEEESPLKDKDAKKSKQE（SV40 N1 NLS24）、K₉K₂K₄K₈GGK₅（Loligomer））；HSV-1外被タンパク質VP22；核外搬出シグナル（NES）と融合したHSV-1外被タンパク質VP22r；大腸菌エンテロトキシンEtxB（H57S）の変異体B-サブユニット；解毒された外毒素A (ETA)；HIV-1 Tatタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン、GRKKRRQRRRPPQ；Drosophila melanogasterのアンテナペディアドメインAntp（アミノ酸43～58）、RQIKIWFQNRRMKWKK；ブホリンII、TRSSRAGLQFPV
GRVHRLLRK；hClock-（アミノ酸35～47）（ヒトClockタンパク質DNA結合ペプチド）、KRVSRNKSEKKRR；MAP（モデル両親媒性ペプチド）、KLALKLALKALKAALKLA；K-FGF、AAVALLPAVLLALLAP；Ku70由来ペプチド（VPMLKE、VPMLK、PMLKE、PMLKを含むグループから選択されたペプチドが含まれる）；プリオン、マウスPrpe（アミノ酸1～28）、MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP；pVEC、LLIILRRRIRKQAHAHSK；Pep-I、KET
WWETWWTEWSQPKKKRKV；SynBl、RGGRLSYSRRRFSTSTGR；トランスポータン、GWTL
NSAGYLLGKINLKALAALAKKIL；トランスポータン-10、AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY、Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-システアミド；Pep-7、SDLWEMMMVSLACQY; HN-1、TSPLNIHNGQKL；VT5、DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD；pISL、RVIRVWFQ
NKRCKDKKが可能である。

【0110】

好ましい実施態様では、膜透過部分は、脂質部分（例えばC₁₀-C₂₀脂肪アシル基、特にオクタデカノイル（ステアロイル；C₁₈）、ヘキサデカノイル（パルミトイル；C₁₆）、テトラデカノイル（ミリストイル；C₁₄））であり、最も好ましいのはテトラデカノイルである。好ましい実施態様では、膜透過部分は、タンパク質性分子のN末端またはC末端のアミノ酸残基に共役させるか、リシン側鎖のアミンを通じて共役させる（特にタンパク質性分子のN末端アミノ酸残基に共役させる）。特別な実施態様では、膜透過部分は、タンパク質性分子のN末端アミノ酸残基のアミンを通じて共役させる。

【0111】

本発明の特別な利用と方法では、例えば対象の体内でのタンパク質性分子の半減期を長くするため、高レベルの安定性を持つタンパク質性分子が望ましい可能性がある。そこでいくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は安定化部分を含んでいる。安定化部分は、タンパク質性分子上の任意の点に共役させることができる。適切な安定化部分に含まれるのは、ポリエチレングリコール（PEG）またはキャッピング部分（アセチル基、ピログルタミン酸塩、アミノ基が含まれる）である。好ましい実施態様では、アセチル基および／またはピログルタミン酸塩をタンパク質性分子のN末端アミノ酸残基に共役させる。特別な実施態様では、タンパク質性分子のN末端は、ピログルタミドまたはアセトアミドである。好ましい実施態様では、アミノ基をタンパク質性分子のC末端アミノ酸残基に共役させる。特別な実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、C末端に第一級アミドを有する。好ましい実施態様では、PEGを、タンパク質性分子のN末端またはC末端のアミノ酸残基に共役させるか、リシン側鎖のアミンを通じて（特にN末端アミノ酸残基を通じて、またはリシン側鎖のアミンを通じて）共役させる。

【0112】

好ましい実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、C末端に第一級アミドまたは自由なカルボキシル基を、N末端に第一級アミンを有する。

【0113】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、環状ペプチドである。理論に縛られることは望んでいないが、ペプチドの環化は、分解に対するペプチドの感受性を低下させると考えられている。特別な実施態様では、タンパク質性分子は、NからCに向かう環化（先頭から末尾に向かう環化）を利用し、好ましくはアミド結合を通じて環化される。そのようなペプチドは、N末端またはC末端のアミノ酸残基を持っていない。特別な実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、アミド環化ペプチド骨格を有する。別の実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、側鎖から側鎖に向かう環化を利用し、好ましくはジスルフィド結合またはラクタム架橋を通じて環化される。

【0114】

いくつかの実施態様では、N末端とC末端が連結部分を利用して連結される。連結部分としてペプチドリンカーが可能であり、環化によってアミド環化ペプチド骨格が生じる。連結部分のペプチド配列内のバリエーションが可能であるため、連結部分を改変してタンパク質性分子の生理学的特性を変化させることで、例えば安定性が向上することにより、本発明のタンパク質性分子の副作用が潜在的に少なくなったり、治療でのタンパク質性分子の利用が改善されたりする可能性がある。連結部分は、ペプチドのN末端とC末端にまたがる距離を持ち、タンパク質性分子の構造配置を実質的に変化させることがない適切な長さになろう。例えばペプチド連結部分として、長さが2～10個のアミノ酸残基が可能である。いくつかの実施態様では、より長いペプチド連結部分、またはより短いペプチド連結部分が必要とされる可能性がある。

【0115】

本発明のタンパク質性分子は、塩またはプロドラッグの形態が可能である。本発明のタンパク質性分子の塩は、医薬として許容可能であることが好ましいが、医薬として許容可能でない塩も本発明の範囲に入ることが理解されよう。

【0116】

本発明のタンパク質性分子は、結晶形態、および／または溶媒和物の形態（例えば水和物）が可能である。溶媒和化は、本分野で知られている方法を利用して実施することができる。

【0117】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、PKC-θを、少なくとも1つの他のPKC酵素またはアイソフォーム（例えばPKC-α、PKC-β、PKC-γ、PKC-δ、PKC-ε、PKC-ζ、PKC-η、PKC-λ、PKC-μ、PKC-ν）よりも選択的に抑制する。いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、PKC-θを、他の10種類のPKC酵素よりも選択的に抑制する。いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、PKC-θに対する選択性が、1つ以上の他のPKC酵素（すなわちPKC-θ以外の1つ以上のPKC酵素、例えばPKC-α、および／またはPKC-β、および／またはPKC-γ、および／またはPKC-δ、および／またはPKC-ε、および／またはPKC-ζ、および／またはPKC-η、および／またはPKC-λ、および／またはPKC-μ、および／またはPKC-ν）の抑制よりも約2倍、または5倍、または10倍、または20倍、または50倍、または約100倍大きい。別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも50倍大きい抑制を示す。さらに別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも100倍大きい抑制を示す。さらに別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも500倍大きい抑制を示す。さらに別の実施態様では、選択的分子は、PKC-θに対して1つ以上の他のPKC酵素に対するよりも少なくとも100倍大きい抑制を示す。いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、非選択的PKC-θ阻害剤である。

【0118】

本発明では、本発明のタンパク質性分子をコードする核酸分子も考慮する。したがって本発明のさらに別の側面では、本発明のタンパク質性分子（例えば式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントタンパク質性分子）をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子が提供される。

【0119】

いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性分子は、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質性分子ではない。

【0120】

本発明の単離された核酸分子としてDNAまたはRNAが可能である。核酸がDNAの形態であるとき、それはゲノムDNAまたはcDNAが可能である。RNAの形態になった本発明の核酸分子は、一般にmRNAである。

【0121】

核酸分子は典型的には単離されているとはいえ、いくつかの実施態様では、核酸分子は、他の遺伝的分子（例えば発現ベクター）の中に統合すること、他の遺伝的分子に連結すること、他の遺伝的分子と融合または結合させることができる。一般に、発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能可能に連結された転写と翻訳を調節する核酸を含んでいる。したがって本発明の別の側面では、本発明のタンパク質性分子（例えば式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントタンパク質性分子）をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。

【0122】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子を細胞の内部で産生させることが、1つ以上の発現コンストラクト（例えば本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター）を導入することによって可能になる。

【0123】

本発明では、本発明のタンパク質性分子を宿主細胞の内部で組み換えによって産生させることも考慮する。宿主細胞は、哺乳動物の細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、マウス骨髄腫（NS0）細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK) 細胞、ヒト胚性腎臓（HEK293）細胞）、酵母の細胞（例えばPichia pastoris細胞、Saccharomyces cerevisiae細胞、Schizosaccharomyces pombe細胞、Hansenula polymorpha細胞、Kluyveromyces lactis細胞、Yarrowia lipolytica細胞、Arxula adeninivorans細胞）、細菌の細胞（例えばEscherichia coli細胞、Corynebacterium glutamicum細胞、Pseudomonas fluorescens細胞））などである。

【0124】

治療の用途に関し、本発明では、本発明のタンパク質性分子をPKC-θ過剰発現細胞（例えば脊椎動物の細胞、特に哺乳動物細胞または鳥類細胞、その中でも特に哺乳動物細胞）の内部で生体内産生させることも考慮する。

【0125】

例えばアメリカ合衆国特許第5,976,567号に記載されているように、天然核酸または合成核酸の発現は、典型的には、本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチド配列を調節エレメント（例えばプロモータであり、構成的プロモータと誘導的プロモータのいずれかが可能である）に機能可能に連結し、好ましくはそのコンストラクトを発現ベクターの中に組み込み、そのベクターを適切な宿主細胞の中に導入することによって実現される。典型的なベクターは、転写ターミネータ、翻訳ターミネータ、転写開始配列、翻訳開始配列、核酸の発現調節に有用なプロモータを含有している。ベクターは、場合によっては、少なくとも1つの独立なターミネータ配列を含有する遺伝子発現カセットと、そのカセットを真核生物と原核生物の一方または両方の中で複製することを可能にする配列（例えばシャトルベクター）と、真核生物系と原核生物系両方のための選択マーカーを含んでいる。ベクターは、真核生物と原核生物の一方または両方の中での複製と統合に適したものが可能である。GilimanとSmith（1979年）、Gene、第8巻：81～97ページ；Roberts他（1987年）Nature、第328巻：731～734ページ；BergerとKimmel『Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology』第152巻、Academic Press, Inc.社、サン・ディエゴ、カルフォルニア州（Berger）；Sambrook他（1989年）、『Molecular Cloning - a Laboratory Manual』（第2版）第1巻～第3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州；Ausubel他（1994年）『Current Protocols in Molecular Biology』、Current Protocols（Greene Publishing Associates, Inc.社とJohn Wiley & Sons, Inc. 社のジョイントベンチャー）編（追補）を参照されたい。

【0126】

真核生物ウイルス（例えばレトロウイルス）からの調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核細胞の中で核酸配列を発現させるのに用いられる。SV40ベクターにはpSVT7とpMT2が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターにはpBV-1MTHAが含まれ、エプスタイン・バーウイルスに由来するベクターには、pHEBOとp2O5が含まれる。他のベクターの例に含まれるのは、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVEのほか、SV-40初期プロモータ、SV-40後期プロモータ、メタロチオネインプロモータ、マウス乳がんウイルスプロモータ、ラウス骨肉腫ウイルスプロモータ、ポリへドリンプロモータ、真核細胞の中での発現に有効であることがわかっている他のプロモータの指示下でタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターである。

【0127】

多彩なベクターを使用できるが、ウイルス発現ベクターが、真核細胞の改変に有用であることに注意すべきである。なぜならウイルス発現ベクターを用いると、標的細胞へのトランスフェクションと、その標的細胞のゲノムとの一体化の効率が大きいからである。このタイプの代表的な発現ベクターとして、ウイルスDNA配列に由来するものが可能であり、その非限定的な例に含まれるのは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス（例えばBレトロウイルス、Cレトロウイルス、Dレトロウイルス）、スプマウイルス、改変されたレンチウイルスである。動物細胞のトランスフェクションに適した発現ベクターが記載されているのは、例えば、WuとAtaai（2000年）Curr. Opin. Biotechnol.、第11巻(2)：205～208ページ；VignaとNaldini（2000年）J. Gene Med.、第2巻(5)：308～316ページ；Kay他（2001年）Nat. Med.、第7巻(1)：33～40ページ；Athanasopoulos他（2000年）Int. J. Mol. Med.、第6巻(4)：363～375ページ；WaltherとStein（2000年）Drugs、第60巻(2)：249～271ページである。

【0128】

発現ベクターのポリペプチドコード部分またはペプチドコード部分は、天然の配列、または組み換え技術を利用して操作されたそのバリアントを含むことができる。バリアントの一例では、例えば国際出願WO 99/02694とWO 00/42215に記載されているように、特定のタイプの哺乳動物の細胞または組織におけるコドン利用の偏りまたはコドンの翻訳効率を活用する方法を利用して本発明のタンパク質性分子をコードするポリヌクレオチドのコドン組成を改変し、哺乳動物宿主の中で本発明のタンパク質性分子の発現増大が可能になるようにする。簡単に述べると、後者の方法は、異なる細胞または組織では異なるコドンの翻訳効率が異なるため、その違いと遺伝子のコドン組成を利用して、特定のタイプの細胞または組織におけるタンパク質の発現を調節できるという観察に基づいている。そこでコドンが最適化されたポリヌクレオチドを構成するため、親ポリヌクレオチドの少なくとも1つの既存のコドンを、標的細胞または標的組織の中で既存のそのコドンよりも翻訳効率が大きい同義コドンで置き換える。親核酸分子の既存のすべてのコドンを、翻訳効率がより大きい同義コドンで置き換えることが好ましいとはいえ、部分的な置換でさえ発現を増大させることができるため、そうする必要はない。置換工程は、親ポリヌクレオチドの既存のコドンの5％、10％、15％、 20％、25％、30％に影響を与えることが好ましく、35％、40％、50％、60％、70％に影響を与えることがより好ましい。

【0129】

発現ベクターは、その発現ベクターが導入される細胞に適合性があるため、その細胞は本発明のタンパク質性分子を発現することができる。発現ベクターは、具体的に選択する発現ベクターと用いる細胞に依存することになる適切な任意の手段によって細胞の中に導入される。導入のためのそのような手段は当業者に周知である。導入に利用できるのは、例えば接触（例えばウイルスベクターの場合）、電気穿孔、形質転換、形質導入、共役、三親接合、トランスフェクション、カチオン性脂質との感染膜融合、DNAで被覆したミクロ射出粒子の高速打ち込み、リン酸カルシウム-DNA沈降物とのインキュベーション、個々の細胞への直接的微量注入などである。他の方法も利用することができ、そうした方法も当業者に知られている。あるいはベクターは、カチオン性脂質（例えばリポソーム）によって導入される。そのようなリポソームは市販されている（例えばLife Technologies社、Gibco BRL社、ゲイザースバーグ、メリーランド州が供給しているLipofectin（登録商標）、Lipofectamine（商標）など）。

【0130】

本発明のタンパク質性分子は、組み換えDNA技術を利用して、または化学合成によって調製することができる。

【0131】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、標準的なペプチド合成法（例えば溶液合成や固相合成）を利用して調製される。本発明のタンパク質性分子の化学合成は、手作業で、または自動化合成装置を用いて実施することができる。例えば直線状ペプチドは、Boc化学またはFmoc化学を用いた固相ペプチド合成を利用して合成することができる（例えば、Merrifield（1963年）J Am Chem Soc、第85巻(14)：2149～2154ページ；Schnolzer他（1992年）Int J Pept Protein Res、第40巻：180～193ページ；Ensenat-Waser他（2002年）IUBMB Life、54巻：33～36ページ；WO 2002/010193；Cardosa他（2015年）Mol Pharmacol、第88巻(2)：291～303ページに記載されている）。保護を外し、固体支持体から開裂させた後、適切な方法（例えば分取クロマトグラフィ）を利用して直線状ペプチドを精製する。

【0132】

別の実施態様では、本発明のタンパク質性分子は環化することができる。環化は、いくつかの技術（例えばDavies（2003年）J Pept Sci、第9巻：471～501ページに記載されている技術）を利用して実施することができる。

【0133】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、組み換えDNA技術を利用して調製される。例えば本発明のタンパク質性分子は、（a）本発明のタンパク質性分子をコードしていて調節エレメントに機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含むコンストラクトを調製する工程と；（b）そのコンストラクトを宿主細胞の中に導入する工程と；（c）その宿主細胞を培養してポリヌクレオチド配列を発現させることで、本発明のコードされたタンパク質性分子を産生させる工程と；（d）宿主細胞から本発明のタンパク質性分子を単離する工程を含む方法で調製することができる。本発明のタンパク質性分子は、標準的なプロトコルを利用して組み換えで調製することができる。標準的なプロトコルが記載されているのは、例えば、Klint他（2013年）PLOS One、第8巻(5)：e63865ページ；Sambrook他（1989年）『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』（Cold Spring Harbour Press）、特に16節と17節；Ausubel他（1998年）『Current Protocols in Molecular Biology』（John Wiley and Sons, Inc.社）、特に第 10章と第16章；Coligan他（1997年）『Current Protocols in Protein Science』（John Wiley and Sons, Inc.社）、特に第1章、第5章、第6章である。

【0134】

3．医薬組成物

【0135】

本発明によれば、タンパク質性分子は、PKC-θ過剰発現が関与する疾患（例えばがん）の治療または予防のための組成物と方法において有用である。

【0136】

したがっていくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子を医薬組成物の形態にすることができ、その医薬組成物は、本発明のタンパク質性分子と、医薬として許容可能な基剤または希釈剤を含んでいる。

【0137】

本発明のタンパク質性分子は、中性形態または塩形態としての医薬組成物に製剤化することができる。

【0138】

当業者であればわかるように、医薬として許容可能な基剤または希釈剤の選択は、投与経路と、治療する疾患と対象の性質に依存する。具体的な担体または送達系と投与経路は、当業者が容易に決定することができる。担体または送達系と投与経路は、製剤の調製中にタンパク質性分子の活性が失われないよう、そしてそのタンパク質性分子が活性部位に完全な状態で到達できるよう、注意深く選択されねばならない。本発明の医薬組成物は、多彩な経路を通じて投与することができ、投与経路の非限定的な例に含まれるのは、経口投与、直腸投与、局所投与、鼻腔内投与、眼内投与、経粘膜投与、腸投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、脳内投与、膣内投与、膀胱内投与、静脈内投与、腹腔内投与である。

【0139】

注射での利用に適した医薬形態は、注射可能な無菌の溶液または分散液と、注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末を含んでいる。そのような形態は、製造と保管の条件下で安定でなければならず、還元、酸化、微生物汚染から保護することができる。

【0140】

当業者であれば、従来からある方法を利用して本発明のタンパク質性分子のための適切な製剤化法を容易に決定することができよう。製剤化と投与の技術は、例えばRemington（1980年）『Remington’s Pharmaceutical Sciences』、Mack Publishing Co.社、イーストン、ペンシルヴェニア州、最新版に見いだすことができる。

【0141】

好ましいpHの範囲と適切な賦形剤（例えば抗酸化剤）の確認は、本分野では定型作業であり、例えばKatdareとChaubel（2006年）『Excipient Development for Pharmaceutical, Biotechnology and Drug Delivery Systems』（CRC Press社）に記載されている。望む範囲のpH値にするのに緩衝系が日常的に用いられている。緩衝系の非限定的な例に含めることができるのは、カルボン酸緩衝液（例えば酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩）；グリシン緩衝液；ヒスチジン緩衝液；リン酸塩緩衝液；トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液（トリス）；アルギニン緩衝液；水酸化ナトリウム緩衝液；グルタミン酸塩緩衝液；炭酸塩緩衝液である。適切な抗酸化剤の非限定的な例に含めることができるのは、フェノール化合物（例えばブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、ブチル化ヒドロキシアニソール）；ビタミンE；アスコルビン酸；還元剤（例えばメチオニン、亜硫酸塩）；金属キレータ（例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA））；システイン塩酸塩；亜硫酸水素ナトリウム；亜硫酸ナトリウム；パルミチン酸アスコルビル；レシチン；没食子酸プロピル；α-トコフェロールである。

【0142】

注射するため、本発明のタンパク質性分子を水溶液の製剤、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液（例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、生理食塩水緩衝液）の製剤にする。経粘膜投与のためには、障壁を透過させるのに適した浸透剤を製剤で用いる。そのような浸透剤は一般に本分野で知られている。

【0143】

本発明の組成物は、許容可能な希釈剤（例えば生理食塩水、無菌水）を含有する液体の形態で投与するための製剤にすること、または望む質感、コンシステンシー、粘度、外観を与える許容可能な希釈剤または基剤を含有するローション、クリーム、ゲルの形態にすることができる。許容可能な希釈剤と基剤は当業者には馴染みがあり、その非限定的な例に含まれるのは、エトキシル化された、またはエトキシル化されていない界面活性剤、脂肪アルコール、脂肪酸、炭化水素油（例えばヤシ油、ココナツ油、鉱物油）、カカオバター、ワックス、シリコーン油、pH調節剤、セルロース誘導体、乳化剤（例えば非イオン性有機塩基、非イオン性無機塩基）、保存剤、ワックスエステル、ステロイドアルコール、トリグリセリドエステル、リン脂質（例えばレシチン、セファリン）、多価アルコールエステル、脂肪アルコールエステル、親水性ラノリン誘導体、親水性蜜蝋誘導体である。

【0144】

あるいは本発明のタンパク質性分子は、本分野で周知の医薬として許容可能な基剤を用いて経口投与に適した製剤にすることが容易にでき、これも本発明を実施する際に考慮する。そのような基剤により、治療を受ける患者が本発明の生物活性剤を経口で摂取するための剤形（例えば錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液など）にすることが可能になる。これら基剤の選択は、糖、デンプン、セルロースとその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝化溶液、乳化剤、等張生理食塩水、発熱物質を含まない水からなすことができる。

【0145】

非経口投与のための医薬製剤は、水溶形態にした本発明のタンパク質性分子の水溶液を含んでいる。それに加え、本発明のタンパク質性分子の懸濁液を適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルに含まれるのは、脂肪油（例えばゴマ油）、合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルやトリグリセリド）である。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を大きくする物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン）を含有することができる。場合によっては、懸濁液は、高濃度溶液を調製できるようにするため、適切な安定剤、または化合物の溶解度を大きくする薬剤も含むことができる。

【0146】

無菌溶液は、必要量の活性化合物を含む適切な溶媒を、必要に応じて上記の他の賦形剤と組み合わせた後、殺菌（例えば濾過）することによって調製できる。一般に、分散液は、殺菌したさまざまな活性化合物を、塩基性分散媒体と上記の必要な賦形剤を含有する無菌ビヒクルの中に組み込むことによって調製される。無菌乾燥粉末は、活性化合物と上記の必要な他の賦形剤を含む無菌溶液を真空乾燥または凍結乾燥させることによって調製できる。

【0147】

経口で用いる医薬組成物は、本発明のタンパク質性分子を固体賦形剤と組み合わせ、その顆粒混合物を、望むのであれば適切な助剤を添加した後に処理して得ることができ、錠剤またはドラジェコアになる。適切な賦形剤は、特に、充填剤（例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖）；セルロース調製物（例えばトウモロコシのデンプン、コムギのデンプン、コメのデンプン、ジャガイモのデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリド（PVP））である。望むのであれば、崩壊剤（例えば架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど））を添加することができる。このような組成物は、薬剤学の任意の方法で調製することができるが、どの方法も、上記の1つ以上の治療剤を、1つ以上の必要な成分を構成する基剤と組み合わせる工程を含んでいる。一般に、本発明の医薬組成物は、公知のやり方（例えば従来からある混合法、溶解法、顆粒化法、ドラジェ作製法、研和法、乳化法、カプセル化法、封入法、凍結乾燥法）で製造することができる。

【0148】

ドラジェコアは適切なコーティングをして提供される。その目的で、濃縮糖溶液を用いることができる。その濃縮糖溶液は、場合によっては、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、樹脂溶液、適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。異なる組み合わせの粒子含量を特定すること、または特徴づけることを目的として、錠剤またはドラジェコーティングに染料または顔料を添加することができる。

【0149】

経口で使用できる医薬組成物に含まれるのは、ゼラチン製の噛み合わせ式（fit-in）カプセルと、ゼラチンと可塑剤（例えばグリセロールやソルビトール）でできた密封式軟カプセルである。噛み合わせ式カプセルは、活性成分を、充填剤（例えばラクトース）、および／または結合剤（例えばデンプン）、および／または潤滑剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム）と混合し、場合によっては安定剤も混合した状態で含有することができる。軟カプセルの場合には、活性化合物を適切な液体（例えば脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコール）の中に溶かすか懸濁させることができる。それに加え、安定剤と添加することができる。

【0150】

本発明のタンパク質性分子は、放出調節調製物と放出調節製剤（例えば高分子微小球製剤、油をベースとした製剤、ゲルをベースとした製剤）に組み込むことができる。

【0151】

特別な実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、しばしばデポ剤または持続放出製剤の形で組織（皮下組織または網組織）に直接注入することにより、全身ではなくて局所的に投与することができる。

【0152】

さらに、本発明のタンパク質性分子は、標的薬物送達システム（例えば細胞または組織を標的とするのに適していてその細胞または組織によって選択的に取り込まれる粒子）の中に入れて投与することができる。いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子は、リポソーム、ミセル、デンドリマー、生物分解性粒子、人工DNAナノ構造体、脂質をベースとしたナノ粒子、炭素ナノ粒子、金ナノ粒子から選択されるビヒクルの中に含めるか、そのビヒクルと結合させる。このタイプの代表的な例では、ビヒクルの選択は、ポリ(乳酸)（PLA）、ポリ(グリコール酸)（PGA）、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリ(エチレングリコール)（PEG）、PLA-PEGコポリマーと、これらの組み合わせからなされる。

【0153】

局所的投与または選択的取り込みの場合には、薬剤の有効局所濃度は血漿濃度と関係していなくてもよい。

【0154】

投与を容易にするとともに用量を一定にするため、組成物を単位剤形にすると有利である。本発明の新規な単位剤形は、本明細書に詳細に開示したように、身体の健康が損なわれた疾患状態である生きている対象の疾患を治療するための活性材料の独自の性質と、実現する具体的な治療効果と、活性材料を調合する技術に固有の制約によって決まるため、これらの因子に直接依存する。

【0155】

本発明のタンパク質性分子は対象に投与される唯一の活性成分である可能性があるが、そのタンパク質性分子と他のがん治療法の同時適用が本発明の範囲に入る。例えば式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントを、１つ以上のがん治療法と同時に適用することができる。がん治療法の非限定的な例に含まれるのは、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、免疫療法であり、その中でも特に化学療法である。本発明のタンパク質性分子は、そのがん治療法で治療する前に治療のため利用すること、またはそのがん治療法で治療した後に治療のため利用すること、またはそのがん治療法とともに治療のため利用することができる。

【0156】

適切な放射線療法には、DNAの損傷を誘導する放射線と波動（例えばガンマ線、X線、UV光、マイクロ波、電子線、放射性同位体）が含まれる。典型的には、治療は、局在した腫瘍部位に上記の形態の照射線を照射することによって実現できる。これらの因子はすべて、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製と修復、染色体の構造と維持に対してさまざまな損傷を引き起こす可能性が非常に大きい。

【0157】

X線の線量の範囲は、3～4週間の長期にわたって毎日50～200レントゲンから、1回だけ2000～6000レントゲンまでの範囲である。放射性同位体のための線量の範囲は非常に広く、同位体の半減期と、放出される照射線の強度およびタイプと、がん細胞によって取り込まれる量に依存する。適切な放射線療法の非限定的な例に含まれるのは、共焦点外部ビーム放射線療法（50～100グレイを分割し、4～8週間の期間をかける）、単一回または多数回の高用量小線源療法、永久組織内小線源療法、全身放射性同位体療法（例えばストロンチウム89）である。いくつかの実施態様では、放射線療法は、放射線増感剤とともに適用することができる。適切な放射線増感剤の非限定的な例に含まれるのは、エファプロキシラル、エタニダゾール、フルオゾール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、チラパザミンである。

【0158】

適切な化学療法剤の非限定的な例に含まれるのは、抗増殖／抗腫瘍薬とその組み合わせ（その中に含まれるのは、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素）、代謝拮抗剤（例えばフルオロピリミジン系（例えば 5-フルオロウラシル、 テガフール）、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素などの抗葉酸剤）、抗腫瘍抗生剤（例えばアドリアマイシン、ブレマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトマイシン-C、ダクチノマイシン、ミトラマイシンなどのアントラサイクリン系）、抗有糸分裂剤（例えばビンカアルカロイド系（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンなど）、タキソイド系（パクリタキセル、ドセタキセルなど））、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエピポドフィロトキシン系（エトポシド、テニポシドなど）、アムサクリン、チポテカン、カンプトテシン）である）；細胞増殖抑制剤（抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン）、エストロゲン受容体下方調節剤（例えばフルベストラント）、抗アンドロゲン剤（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、シプロテロン酢酸)、UHアンタゴニストまたはLHRH アゴニスト（例えばゴセレリン、リュープロレリン、ブセレリン）、黄体ホルモン剤（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、エキセメスタン）、5α-レダクターゼの阻害剤（例えばフィナステリド）など）；がん細胞の浸潤を抑制する薬剤（例えばメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えばマリマスタット）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体機能の阻害剤）；増殖因子機能の阻害剤（例えばそのような阻害剤に含まれるのは、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体（例えば抗erbb2抗体トラスツズマブ［ハーセプチン（商標）］、抗erbb1抗体セツキシマブ［C225]）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MEK阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤であり、例えば上皮増殖因子ファミリーの他の阻害剤（例えば他のEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(ゲフィチニブ、AZD1839）、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン（エルロチニブ、OSI-774、6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン（CI 1033）など）、例えば血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、例えば肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤がある）；抗血管新生剤（例えば血管内皮増殖因子の効果を抑制する薬剤（例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［アバスチン（商標）］、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856、WO 98/13354に開示されている化合物）、他の機構によって機能する化合物（例えばリノミド、インテグリンαvβ3 機能とアンギオスタチンの阻害剤））；血管損傷剤（例えばコンブレタスタチンA4と、国際特許出願WO 99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO02/04434、WO02/08213に開示されている化合物）；アンチセンス治療剤（例えば上に列挙した標的に向かう薬剤（ISIS 2503、抗rasアンチセンスなど））；遺伝子療法のアプローチ（例えば、異常な遺伝子（例えば異常なp53）を置き換えるアプローチ、異常なGDEPT (遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ（例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、細菌ニトロ還元酵素のいずれかを用いたアプローチ）、化学療法または放射線療法に対する患者の忍容性を増大させるアプローチ（例えば多剤耐性遺伝子療法）が含まれる）である。

【0159】

適切な免疫療法のアプローチの非限定的な例に含まれるのは、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増大させる生体外と生体内のアプローチ（例えばインターロイキン2、インターロイキン4、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子を含むサイトカインのトランスフェクション）；T細胞不応答性を低下させるアプローチ；トランスフェクトされた免疫細胞（例えばサイトカインをトランスフェクトされた樹状細胞）を用いるアプローチ；サイトカインをトランスフェクトされた腫瘍細胞系を用いるアプローチ；抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチである。これらのアプローチは、一般に、がん細胞を標的として破壊するのに免疫エフェクタ細胞と分子を利用することに頼っている。免疫エフェクタとして、例えば悪性細胞の表面上の何らかのマーカーに対して特異的な抗体が可能である。抗体は、単独で治療のエフェクタとして機能する可能性、または他の細胞をリクルートして実際に細胞の殺傷を容易にする可能性がある。抗体は、薬または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と共役して標的剤としてだけ機能させることもできる。あるいはエフェクタとして、悪性細胞標的と直接または間接に相互作用する表面分子を有するリンパ球が可能である。さまざまなエフェクタ細胞には、細胞傷害性T細胞とNK細胞が含まれる。

【0160】

他のガン治療法の例には、植物療法、凍結療法、毒素療法、アポトーシス促進療法が含まれる。当業者であれば、このリストが、がんとそれ以外の過形成性病変に関して利用できる治療法のタイプを網羅していないことがわかるであろう。

【0161】

化学療法と放射線療法は、急速に分裂している細胞を標的とすること、および／または細胞周期または細胞分裂を阻害することがよく知られている。これらの療法は、いくつかの形態のがんの治療法の一部として提供されており、治療的措置によってがんの進行を遅延させるか、疾患の症状を逆転させることを目指している。しかしこれらのがん治療法によって免疫低下状態に至り、その結果として病気を引き起こす感染が起こる可能性があるため、本発明は併用療法にも拡張され、その併用療法では、式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントと、がん治療法と、そのがん治療法によって生じる免疫低下状態から展開するか、展開するリスクが大きい感染症に対して効果的な抗感染剤を利用する。抗感染剤は抗菌剤から選択することが適切であり、抗菌剤の非限定的な例に含まれるのは、微生物（例えばウイルス、細菌、酵母、真菌、原生動物など）を殺したり微生物の増殖を抑制したりする化合物、つまり抗生剤、殺アメーバ剤、抗菌真剤、抗原虫剤、抗マラリア剤、抗結核剤、抗ウイルス剤である。抗感染剤の範囲には、駆虫剤と殺線虫剤も含まれる。代表的な抗生剤に含まれるのは、キノロン系（例えばアミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ロソキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、スパルフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン；ゲミフロキサシン；ガレノキサシン）、テトラサイクリン系、グリシルサイクリン系、オキサゾリジノン系（例えばクロロテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン；リネゾリド、エペレゾリド）、糖ペプチド系、アミノグリコシド系（例えばアミカシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、ホルチミシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メノマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、β-ラクタム系（例えばイミペネム、メロペネム、ビアペネム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロドン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファラジン、セフィネタゾール、セフォキシチン、セフォテタン、アズトレオナム、カルモナム、フロモキセフ、モキサラクタム、アムジノシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、ベンジルペニシリン、カルフェシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンG、ピペラシリン、スルベニシリン、テモシリン、チカルシン、セフジトレン、SC004, KY-020, セフジニル、セフチブテン、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、セフォゾプラン、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763）、リファマイシン系、マクロライド系（例えばアジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン）、ケトライド系（例えばテリスロマイシン、セスロマイシン）、クメルマイシン系、リンコサミド系（例えばクリンダマイシン、リンコマイシン）、クロラムフェニコールである。

【0162】

代表的な抗ウイルス剤に含まれるのは、アバカビル硫酸塩、アシクロビルナトリウム、アマンタジン塩酸塩、アンプレナビル、シドフォビル、デラビルジンメシル酸塩、ジダノシン、エファビレンツ、ファムシクロビル、ホミビルセンナトリウム、ホスカルネットナトリウム、ガンシクロビル、インジナビル硫酸塩、ラミブジン、ラミブジン／ジドブジン、ネルフィナビルメシル酸塩、ネビラピン、オセルタミビルリン酸塩、リバビリン、リマンタジン塩酸塩、リトナビル、サキナビル、サキナビルメシル酸塩、スタブジン、バラシクロビル塩酸塩、 ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジンである。

【0163】

適切な殺アメーバ剤または抗原虫剤の非限定的な例に含まれるのは、アトバコーン、クロロキン塩酸塩、クロロキンリン酸塩、メトロニダゾール、メトロニダゾール塩酸塩、ペンタミジンイセチオン酸塩である。駆虫剤として、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、アルベンダゾール、イベルメクチン、チアベンダゾールから選択された少なくとも1つの薬剤が可能である。代表的な抗真菌剤の選択は、アムホテリシンB、アムホテリシンBコレステリル硫酸塩複合体、アムホテリシンB脂質複合体、アムホテリシンBリポソーマル、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビンミクロサイズ、グリセオフルビン超ミクロサイズ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ニスタチン、テルビナフィン塩酸塩からなすことができる。適切な抗マラリア剤の非限定的な例に含まれるのは、クロロキン塩酸塩、リン酸クロロキン、ドキシサイクリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メフロキン塩酸塩、リン酸プリマキン、ピリメタミン、ピリメタミン・スルファドキシン合剤である。抗結核剤の非限定的な例に含まれるのは、クロファジミン、シクロセリン、ダプソン、エタンブトール塩酸塩、イソニアジド、ピラジナミド、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、硫酸ストレプトマイシンである。

【0164】

上記のように、タンパク質性分子は、有効な量を手軽かつ有効に投与するため、医薬として許容可能な適切な基剤とともに調剤して単位剤形にすることができる。いくつかの実施態様では、単位剤形は、本発明の活性なペプチドを約0.25μg～約2000 mgの範囲の量で含んでいる。本発明の活性なペプチドは、約0.25μg～約2000 mg/mlの量の基剤の中に存在することができる。医薬組成物が1つ以上の追加活性成分を含む実施態様では、用量は、それら成分の通常の用量と投与法を参考にして決められる。

【0165】

4．方法

【0166】

本発明によれば、本発明のタンパク質性分子は、PKC-θ過剰発現細胞の形成、増殖、維持、EMT、METのうちの少なくとも1つを変化させる方法において有用である。本発明のタンパク質性分子は、対象の体内にあるPKC-θ過剰発現が関与する疾患（例えばがん）の治療または予防に有用である。

【0167】

したがって本発明の別の側面では、治療のための、単離または精製した本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドの利用が提供される。

【0168】

本発明のさらに別の側面では、治療のための薬の製造における、単離または精製した本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドの利用が提供される。

【0169】

本発明のさらに別の側面では、治療で利用するための、単離または精製した本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドが提供される。

【0170】

本発明のさらに別の側面では、PKC-θ過剰発現細胞の中のPKC-θの核移行を抑制するか減らす方法として、PKC-θ過剰発現細胞を、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドと接触させることを含む方法が提供される。

【0171】

本発明により、PKC-θ過剰発現細胞の中のPKC-θの核移行を抑制するか減らすための、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドの利用も提供される。

【0172】

PKC-θ過剰発現が関与する疾患の中には、本発明のタンパク質性分子が有用である可能性のある疾患が多数存在している。したがって本発明のさらに別の側面では、PKC-θの抑制が効果的な治療と関係する患者で疾患を治療または予防する方法として、前記対象に、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドを投与することを含む方法が提供される。

【0173】

本発明では、PKC-θの抑制が効果的な治療と関係する患者で疾患を治療または予防するための薬の製造における、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドの利用も考慮する。

【0174】

本発明のさらに別の側面では、PKC-θの抑制が効果的な治療と関係する患者で疾患を治療または予防するための、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドの利用が提供される。

【0175】

本発明の別の側面では、PKC-θの抑制が効果的な治療と関係する患者で疾患を治療または予防するのに用いるための、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドが提供される。

【0176】

PKC-θ過剰発現が関与する疾患の非限定的な例に含まれるのは、がん；神経と血管の異常（例えばダウン症候群、記憶と認知の障害、認知症、アミロイドニューロパチー、脳炎、神経と脳の外傷、血管アミロイドーシス、鬱、アミロイドーシスを伴う脳出血）；急性と慢性の気道疾患（例えば気管支炎、閉塞性気管支炎、痙攣性気管支炎、アレルギー性気管支炎、アレルギー性喘息、気管支喘息、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（COPD））；皮膚疾患（例えば乾癬、毒性とアレルギー性の接触湿疹、アトピー性湿疹、脂漏性湿疹、単純性苔癬、日焼け、肛門性器部の掻痒症、円形脱毛症、肥厚性瘢痕、円板状エリテマトーデス、濾胞性膿皮症、広域膿皮症、内因性と外因性のざ瘡、ざ瘡または酒土性ざ瘡）；関節疾患（例えば関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、他の関節疾患）；後天性免疫不全症候群（AIDS）；多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症；敗血症性ショック；成人呼吸窮迫症候群；移植片対宿主反応；急性または慢性の臓器または組織の同種移植片または異種移植片の拒絶；クローン病；潰瘍性大腸炎；炎症性腸疾患；アレルギー性の鼻炎または副鼻腔炎；アレルギー性結膜炎；鼻ポリープ自己免疫疾患；尿崩症である。

【0177】

本発明のさらに別の側面では、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）上皮間葉移行；（v）間葉上皮移行のうちの少なくとも1つを変化させる方法として、前記PKC-θ過剰発現細胞を、本発明の単離または精製したタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドと接触させることを含む方法が提供される。

【0178】

本発明のさらに別の側面では、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）上皮間葉移行；（v）間葉上皮移行のうちの少なくとも1つを変化させるための薬の製造における、本発明の単離または精製したタンパク質性分子、特に式（I）によって表わされるタンパク質性分子、または配列番号1または2のアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるか、主にそのアミノ酸配列からなるタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントタンパク質性分子の利用が提供される。

【0179】

本発明のさらに別の側面では、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）上皮間葉移行；（v）間葉上皮移行のうちの少なくとも1つを変化させるのに利用するための、単離または精製した本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドが提供される。

【0180】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子により、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）EMTの減少、低下、無効化、および／またはPKC-θ過剰発現細胞の（v）MET の増大が得られる。

【0181】

本発明のさらに別の側面では、PKC-θ過剰発現細胞の（i）形成；（ii）増殖；（iii）維持；（iv）EMTを減少させる、低下させる、無効化するための、および／またはPKC-θ過剰発現細胞の（v）MET を増大させるための薬の製造における、本発明の単離または精製したタンパク質性分子、特に式（I）によって表わされるタンパク質性分子、または配列番号1または2のアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるか、主にそのアミノ酸配列からなるタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントタンパク質性分子の利用が提供される。

【0182】

適切なPKC-θ過剰発現細胞の非限定的な例に含めることができるのは、乳房細胞、前立腺細胞、肺細胞、膀胱細胞、膵臓細胞、大腸細胞、メラノーマ細胞、肝臓細胞、グリオーマ細胞であり、その中でも特に乳房細胞である。特別な実施態様では、PKC-θ過剰発現細胞は、乳房上皮細胞、その中でも特に乳管上皮細胞である。

【0183】

特別な実施態様では、PKC-θ過剰発現細胞は、CSC腫瘍細胞または非CSC腫瘍細胞であり、CSC腫瘍細胞が好ましい。いくつかの実施態様では、CSC腫瘍細胞は、CD24とCD44、特にCD44^high、CD24^lowを発現する。

【0184】

本発明のさらに別の側面では、対象の体内にある少なくとも1つのPKC-θ過剰発現細胞を含むがんを治療または予防する方法として、本発明の単離または精製したタンパク質性分子、特に式（I）によって表わされるタンパク質性分子、または配列番号1または2のアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるか、主にそのアミノ酸配列からなるタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントタンパク質性分子を前記対象に投与することを含む方法が提供される。

【0185】

いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質性分子を、悪性腫瘍、特に転移性がんの症状の治療および／または予防および／または緩和に用いる。好ましい実施態様では、本発明のタンパク質性分子を、転移性がんの症状の治療および／または予防および／または緩和に用いる。

【0186】

本発明のさらに別の側面では、対象の体内にある少なくとも1つのPKC-θ過剰発現細胞を含むがんを治療または予防するための薬の製造における、本発明の単離または精製したタンパク質性分子、特に式（I）によって表わされるタンパク質性分子、または配列番号1または2のアミノ酸配列を含むか、そのアミノ酸配列からなるか、主にそのアミノ酸配列からなるタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントタンパク質性分子の利用が提供される。

【0187】

本発明の別の側面では、対象の体内にある少なくとも1つのPKC-θ過剰発現細胞を含むがんを治療または予防するのに用いるための、単離または精製した本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドが提供される。

【0188】

本発明では、対象の体内にある少なくとも1つのPKC-θ過剰発現細胞を含むがんを治療または予防するための、本発明のタンパク質性分子、特に式（I）、配列番号1または2のタンパク質性分子、または本明細書に記載したバリアントペプチドの利用も考慮する。

【0189】

本発明のタンパク質性分子は、がんと診断された個人、またはがんが疑われる個人、またはがんになりやすいことがわかっている個人、またはがんが発達する可能性が大きいと考えられる個人、または以前に治療したがんが再発する可能性が大きいと考えられる個人の治療に適している。がんは、ホルモン受容体陽性であってもホルモン受容体陰性であってもよい。いくつかの実施態様では、がんはホルモン受容体陰性であり、したがってホルモン療法または内分泌療法に対して抵抗性である。がんが乳がんであるいくつかの実施態様では、その乳がんはホルモン受容体陰性である。いくつかの実施態様では、がんは、エストロゲン受容体陰性および／またはプロゲステロン受容体陰性である。

【0190】

特別な実施態様では、本発明の方法と利用は、上記の第3節に記載したさらに1つ以上の活性剤（例えば追加がん治療剤および／または抗感染剤）、特にがん治療剤、その中でも化学療法剤を投与することを含んでいる。そのさらに1つ以上の活性剤とタンパク質性分子は、別々に、または同時に、または順番に投与することができる。

【0191】

当業者であれば、PKC-θ抑制（例えば核移行の抑制）の評価と、PKC-θ阻害剤であるタンパク質性分子の同定に用いるのに適したアッセイを知っていると考えられる。そのようなアッセイが記載されているのは、例えばSutcliffe他（2012) Front Immunol、第3巻：260ページ；Ghildyal他（2009年）J Virol、第83巻(11)：5353～5362ページ；Sittampalam他、Assay Guidance Manual［インターネット］、ベセスダ（メリーランド州）の中のRiss TL他（2013年）Cell Viability Assays：Eli Lilly & Company社とthe National Center for Advancing Translational Sciences、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/から入手できる；アメリカ合衆国特許出願公開第2005222186号；Li他（2011年）J Biomol Screen、第16巻(2)：141～154ページ；Zhang他（2010年）FEBS Letters、第584巻(22)：4646～4654ページである。

【実施例】

【0192】

以下の実施例を参照して本発明のいくつかの実施態様をこれから説明する。実施例は例示のみを目的としており、これまでに記載したことの一般性の範囲を制限することは意図していない。

【0193】

特に断わらない限り、ペプチドの合成と試験で用いるあらゆる材料と試薬は、市場で、例えばSigma-Aldrich Co.社、Novabiochem, Abcam社、American Type Culture Collection （ATCC）から入手できる。

【0194】

実施例1 インポーチニブペプチドの合成

【0195】

最新の自動化固相ペプチド合成・精製技術を利用して、Fmoc化学法でインポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1（表4）を合成した。Fmoc化学法は、例えばEnsenat-Waser他（2002年）IUBMB Life、第54巻：33～36ページと、WO 2002/010193に記載されている。自動化分取逆相高性能液体クロマトグラフィ（RP-HPLC）を利用してペプチドを精製した。分析RP-HPLCと質量分析を利用して分画を分析した。純度98％超の分画をまとめ、最終生成物を得た。

【0196】

【表4】

【0197】

インビトロ試験で調べたすべてのペプチドを、N末端アミノ酸のN末端アミノ基を通じてミリストイル化した。ミリストイル化は、上に記載したように標準的なN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）カップリングを利用してミリスチン酸をN末端残基に共有結合させることによって実現し、その後ペプチドの脱保護と精製を行なった。

【0198】

以下の実施例に記載するすべての試験はN-ミリストイル化ペプチドを用いて実施した。

【0199】

実施例2 インポーチニブペプチドは、PKC-θの核移行を、他のPKCアイソマーとインポーチンに影響を与えることなく特異的に阻止する

【0200】

補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を1 ml入れた12ウエルのプレートの中の無菌カバースリップの表面にMCF7細胞をあらかじめ播種して一晩経過させた後、50μMのインポーチニブ4759（実施例1に従って合成）およびインポーチニブ4759_O1（実施例1に従って合成）とともに24時間インキュベートした。MCF7細胞を0.65 ng/mlのホルボール12-ミリスタート13-アセタート（PMA）で60時間刺激したとき、試験ペプチドは除去しなかった。ピロカルボン酸ジエチル（DEPC）-水を対照として用いた（試験ペプチドを無菌DEPC-水に溶かした）。ダルベッコリン酸塩緩衝化生理食塩水（DPBS）で2回洗浄した後、カバースリップ上のサンプルを4％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PKC-θ（カタログ番号SC-212）一次抗体、PKC-θ-Phosphor-T538一次抗体、PKC-β2一次抗体、PKC-α一次抗体、インポーチンα一次抗体、インポーチン8一次抗体でそれぞれ染色し、Alexa-488二次抗体と共役させた。細胞核は褪色防止2-(4-アミジノフェニル)-6-インドールカルバミジンジヒドロクロリド（DAPI）で染色した。サンプルを一晩乾燥させた後、Nikon蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。ImageJソフトウエアを用いて密度測定分析をした。式Fn/c＝（核密度-バックグラウンド密度）／（細胞質密度-バックグラウンド密度）を用いてFn/cを計算した。

【0201】

インポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1は、PKC-θの核移行を阻止することができる（図1aと図1b；対照と比較してp＜0.0001）。しかしインポーチニブ4759_O1は、インポーチニブ4759と比べてPKC-θの核移行を阻止する能力が有意に大きい。インポーチニブ4759_O1は、他のPKCアイソフォーム（例えばPKC-α、PKC-β2）の分布に対する効果はなく（図1c）、インポーチンαやインポーチン8などの搬入タンパク質に対する効果もなかった（図1d）（p＝対照に対して有意ではない）。

【0202】

実施例3 インポーチニブペプチドは、MCF-IMモデルにおいてCD44^hiCD24^loがん幹細胞の形成を抑制する

【0203】

5×10⁴個のMCF7細胞を1 mlの完全DMEMとともに12ウエルのプレートに播種して一晩経過させた後、インポーチニブ4759（50μMと100μM；実施例1に従って合成）またはインポーチニブ4759_O1（25μMと50μM；実施例1に従って合成）を用いて細胞を24時間処理し、その後PMAで60時間刺激した。サンプルをトリプシン化によって回収した後、熱で不活性化したウシ胎仔血清（HI-FBS）を2％含有するDPBSで洗浄した。抗ヒトCD44-APC抗体と、抗ヒトCD 24-PE抗体と、Hoechst抗体と、抗ヒトCEpCAM抗体のカクテルを用いてFACS染色を実施した。データをBD FACSLSR-IIフローサイトメータから回収した。Treestar FlowJoを用いてデータを分析した。

【0204】

インポーチニブ4759とインポーチニブ4759_O1の両方によってがん幹細胞の形成が抑制された（図2aと図2b；対照と比較してp＝0.0079）。

【0205】

実施例4 インポーチニブペプチドは、MDA-MB-231モデルにおいてCD44^hiCD24^loがん幹細胞の形成を減少させる。

【0206】

5×10⁴個のMDA-MB-231細胞を1 mlの完全DMEMとともに12ウエルのプレートに播種して一晩経過させた後、インポーチニブ4759（50μMと100μM；実施例1に従って合成）またはインポーチニブ4759_O1（25μMと50μM；実施例1に従って合成）を用いて細胞を48時間処理し、その後サンプルをトリプシン化によって回収し、次いでHI-FBSを2％含有するDPBSで洗浄した。抗ヒトCD44-APC抗体と、抗ヒトCD 24-PE抗体と、Hoechst抗体と、抗ヒトCEpCAM抗体のカクテルを用いてFACS染色を実施した。データをBD FACSLSR-IIフローサイトメータから回収した。Treestar FlowJoを用いてデータを分析した。

【0207】

50μMまたは100μMのインポーチニブ4759で処理した後にがん幹細胞の有意な減少が検出された（図3aと図3b；対照と比較してp＜0.0001）。インポーチニブ4759_O1は、ほとんどすべてのMDA-MB-231細胞を消した一方で、同じ濃度の阻害剤は、MCF7上皮細胞に対しては最少の効果しかなかった（図3bと図3c；対照と比較してp＜0.0001）。

【0208】

実施例5 インポーチニブ4759_O1は、転写因子NF-κBに属するp65とp53の核移行を有意に阻止し、腫瘍抑制タンパク質（例えばRb）を有意に増加させる。

【0209】

補足したDMEMを1 ml入れた12ウエルのプレートの中の無菌カバースリップの表面にMCF7細胞をあらかじめ播種して一晩経過させた後、50μMのインポーチニブ4759_O1（実施例1に従って合成）を用いて24時間抑制した。MCF7細胞を0.65 ng/mlのPMAで60時間刺激したとき、インポーチニブ4759_O1は除去した。DEPC-水を対照として用いた（インポーチニブ4759_O1を無菌DEPC-水に溶かした）。DPBSで2回洗浄した後、カバースリップ上のサンプルを4％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、p65一次抗体、Rb一次抗体、p53一次抗体のいずれかで染色し、Alexa-488二次抗体と共役させた。細胞核は褪色防止DAPIで染色した。サンプルを一晩乾燥させた後、Nikon蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。ImageJソフトウエアを用いて密度測定分析をした。式Fn/c＝（核密度-バックグラウンド密度）／（細胞質密度-バックグラウンド密度）を用いてFn/cを計算した。

【0210】

インポーチニブ4759_O1は、転写因子NF-κBに属するp65とp53の核発現を有意に抑制した（図4；それぞれp＝0.0033、p＝0.0009）。インポーチニブ4759_O1は、腫瘍抑制タンパク質Rbの発現を増大させた（図4；p＝0.0007）。

【0211】

実施例6 他のPKCアイソフォームを標的とするペプチド阻害剤は、PKC-θの核移行に対して効果がなかった

【0212】

PKC-β1、PKC-ε、PKC-δの核局在シグナルに基づいてnPKC-β1ペプチド阻害剤、nPKC-εペプチド阻害剤、nPKC-δペプチド阻害剤をそれぞれ設計した。これらペプチドの配列を表5に示す。これらペプチドは、実施例1の方法を利用して合成し、N-ミリストイル化した。

【0213】

【表5】

【0214】

補足したDMEMを1 ml入れた12ウエルのプレートの中の無菌カバースリップの表面にMCF7細胞をあらかじめ播種して一晩経過させた後、50μM のnPKC-β1ペプチド阻害剤、nPKC-εペプチド阻害剤、nPKC-δペプチド阻害剤をそれぞれ用いて24時間抑制した。MCF7細胞を0.65 ng/mlのPMAで60時間刺激したとき、阻害剤は除去しなかった。DEPC-水を対照として用いた（試験ペプチドを無菌DEPC-水に溶かした）。DPBSで2回洗浄した後、カバースリップ上のサンプルを4％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PKC-θ-Phosphor-T538一次抗体で染色し、Alexa-488二次抗体と共役させた。細胞核は褪色防止DAPIで染色した。サンプルを一晩乾燥させた後、Nikon蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。ImageJソフトウエアを用いて密度測定分析をした。式Fn/c＝（核密度-バックグラウンド密度）／（細胞質密度-バックグラウンド密度）を用いてFn/cを計算した。

【0215】

nPKC-β1ペプチド阻害剤、nPKC-εペプチド阻害剤、nPKC-δペプチド阻害剤は、PKC-θの核局在に対する効果がなかった（図5）。

【0216】

実施例7 Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植片乳がんモデルに対するインポーチニブペプチドの効果

【0217】

Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植片乳がんモデルを用い、単独のインポーチニブペプチドの効果と、化学療法剤ドセタキセルと組み合わせた効果を、ランダム化したペプチド対照と比較した。

【0218】

5週齢のBalb/c-ヌードマウス（試験化合物1つにつきn＝5）の右乳腺に、MDA-MB-231ヒト乳がん細胞懸濁液（25μlのBDマトリゲルマトリックスを混合した25μlのPBSの中に2×10⁶個の細胞）を皮下注射した。試験化合物［4 mg/kgのドセタキセル；8 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kgのインポーチニブ4759またはインポーチニブ4759_O1（実施例1に従って合成）；4 mg/kgのドセタキセルと8 mg/kgのインポーチニブ4759またはインポーチニブ4759_O1；4 mg/kgのドセタキセルと40 mg/kgのインポーチニブ4759またはインポーチニブ4759_O1；4 mg/kgのドセタキセルと60 mg/kgのインポーチニブ4759またはインポーチニブ4759_O1；ランダム化したペプチド対照のいずれか］を含む生理食塩水ビヒクルを腹腔内注射した。処理後5週間の期間にわたって毎日カリパスを用いて腫瘍の体積を評価した。その5週間の期間が経過した後にマウスを安楽死させた。腫瘍移植片を取り出して処理し、単細胞浮遊液にする。FACS分析を利用してがん幹細胞の割合を求めた。抗ヒトCD44-APC抗体と、抗ヒトCD 24-PE抗体と、Hoechst抗体と、抗ヒトCEpCAM抗体のカクテルを用いてFACS染色を実施した。データをBD FACSLSR-IIフローサイトメータから回収した。Treestar FlowJoを用いてデータを分析した。一元配置分散分析またはマン-ホイットニーのT検定を用いて有意さを求めた。

【0219】

インポーチニブ4759の投与によって腫瘍の体積が時間経過とともに有意に減少した（図6；全p＝0.03）。しかしインポーチニブ4759とドセタキセルの併用は腫瘍の体積の顕著な減少を引き起こし、この併用療法とインポーチニブ4759療法の両方とも、対照またはドセタキセル単独療法と比較して腫瘍の体積を低下させた。インポーチニブ4759はがん幹細胞（CD44^highCD24^low）を好み、単独のインポーチニブ4759療法と、ドセタキセルとの併用療法の両方が、がん幹細胞の集団を有意に小さくした（図7；全p＝0.0317）。

【0220】

同様に、インポーチニブ4759_O1は、腫瘍の体積を時間経過とともに減少させ、インポーチニブ4759_O1とドセタキセルの併用は、腫瘍の体積を顕著に減少させた（図8；全p＝0.0079）。この併用療法とインポーチニブ4759_O1療法の両方とも、対照またはドセタキセル単独療法と比較して腫瘍の体積を減少させた。単独のインポーチニブ4759_O1療法と、ドセタキセルとの併用療法の両方が、がん幹細胞の集団を有意に小さくした（図9；全p＝0.0286）。

【0221】

実施例8 Balb/c-ヌードMDA-MB-231異種移植片乳がん細胞におけるがん幹細胞マーカーの発現に対するインポーチニブ4759阻害剤の効果

【0222】

共焦点レーザー走査顕微鏡法を利用して、Balb/c-ヌードマウスからのMDA-MB-231異種移植片乳がん細胞におけるがん幹細胞マーカーの発現に対するインポーチニブ4759の効果を評価した。

【0223】

実施例7の方法に従い、Balb/c-ヌードマウスからのMDA-MB-231異種移植片乳がん細胞の処理と調製を行なった。試験化合物には、対照（生理食塩水）、ドセタキセル（4 mg/kg）、インポーチニブ4759（40 mg/kg；実施例1に従って合成）、インポーチニブ4759（40 mg/kg）とドセタキセル（4 mg/kg）の組み合わせのいずれかが含まれていた。単細胞浮遊液を3.7％ホルムアルデヒドで固定し、2％Triton-X-100を用いて透過性にし、次いでCSVに対する一次マウス抗体、PDL1に対する一次ヤギ抗体、リン酸化LSD1（LSD1p；リシン特異的ヒストンデメチラーゼ1A）（PKC-θの標的）に対する一次ウサギ抗体のいずれかを用いて調べた後、対応する二次抗体である抗マウスAlexa-Fluor 568、抗ヤギAlexa-Fluor 633、抗ウサギAlexa-Fluor 488のいずれかと共役させた。細胞核は褪色防止 DAPIで染色した。サンプルごとに少なくとも20個の個別の細胞についてTNFI（全核蛍光強度）値またはTCFI（全細胞質蛍光強度）値を計算した。図示したデータは、回収の時点でグループ化した平均値±SEを表わす。

【0224】

ドセタキセルだけで処理すると、生き延びている抵抗性がん細胞におけるがん幹細胞マーカーの発現が増加した（図10～図13）。インポーチニブ4759を用いて細胞を処理すると、単独であれ、ドセタキセルとの併用であれ、がん幹細胞マーカー（浸潤性のある転移性がんのマーカー）の発現が有意に減少した。

【0225】

実施例9 MDA-MB-231におけるがん関連線維芽細胞（CAF）マーカーとマクロファージマーカーの発現に対するインポーチニブ4759の効果

【0226】

共焦点レーザー走査顕微鏡法を利用して、Balb/c-ヌードマウスからのMDA-MB-231異種移植片乳がん細胞におけるがん関連線維芽細胞（CAF）とマクロファージの発現に対するインポーチニブ4759の効果を評価した。

【0227】

実施例7の方法に従い、Balb/c-ヌードマウスからのMDA-MB-231異種移植片乳がん細胞の処理と調製を行なった。試験化合物には、対照（生理食塩水）、ドセタキセル（4 mg/kg）、インポーチニブ4759（40 mg/kg；実施例1に従って合成）、インポーチニブ4759（40 mg/kg）とドセタキセル（4 mg/kg）の組み合わせのいずれかが含まれていた。単細胞浮遊液を3.7％ホルムアルデヒドで固定し、2％Triton-X-100を用いて透過性にし、一群のCAFシグネチャ抗体［FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）に対する一次マウス抗体、リン酸化LSD1（LSD1p；リシン特異的ヒストンデメチラーゼ1A）に対する一次ウサギ抗体；PKC-θの1つの標的］またはM1マクロファージマーカー［CCR7（C-Cケモカイン受容体タイプ7）に対する一次マウス抗体、CD38（分化クラスター38）に対する一次ヤギ抗体、LSD1p（PKC-θの1つの標的）に対する一次ウサギ抗体］を用いて調べた後、対応する二次抗体である抗マウスAlexa-Fluor 568、抗ヤギAlexa-Fluor 633、抗ウサギAlexa-Fluor 488のいずれかと共役させた。細胞核は褪色防止DAPIで染色した。サンプルごとに少なくとも20個の個別の細胞についてTNFI値またはTCFI値を計算した。図示したデータは、回収の時点でグループ化した平均値±SEを表わす。

【0228】

CAFは、がん幹細胞シグネチャの誘導につながる腫瘍微小環境を作り出す上で重要であり、腫瘍の発生、転移、抵抗性を促進する。

【0229】

ドセタキセルだけを用いて処理すると、生き延びている抵抗性がん細胞におけるCAFマーカー［FAP、非リン酸化LSD1（LSD1np）、CCL2］の発現が有意に増加した（図14と図15；すべてのマーカーでp＜0.0001）。それに対してインポーチニブ4759だけを用いた処理（対照と比較してFAP p＝0.0018、LSD1np p＜0.0001、CCL2 p＜0.0001）、またはドセタキセルと併用する処理（対照と比較してすべてのマーカーでp＜0.0001）では、CAFマーカーの発現が低下した。

【0230】

M1マクロファージマーカーの発現は、腫瘍免疫を示している。M1マクロファージマーカーであるCCR7とCD38の発現は、ドセタキセルを用いた処理の後に変化しなかった（図16と図17；対照と比較して、LSD1p p＜0.0001、CCR7 p＜0.0001、CD38 p＝0.0003）。インポーチニブ4759を用いた処理（対照と比較してLSD1np p＜0.0001、CCL7 p＜0.0001、CD38 p＝0.0003）の後と、インポーチニブ4759とドセタキセルを併用する処理（LSD1np p＜0.0001、CCL7 p＜0.0001、CD38 p＜0.0001）の後には、M1マクロファージマーカーの発現が増加した。

【0231】

本明細書で引用したあらゆる特許、特許出願、刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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