特許 7342192 化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-01

(45)【発行日】2023-09-11

(54)【発明の名称】化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/742 20150101AFI20230904BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20230904BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230904BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230904BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20230904BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20230904BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230904BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230904BHJP

【ＦＩ】

A61K35/742

A61K31/198

A61P1/00

A61P1/04

A61P1/14

A61P1/12

A61P43/00 121

C12N1/20 A

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2022077813

(22)【出願日】2022-05-10

【審査請求日】2022-05-10

(31)【優先権主張番号】111110119

(32)【優先日】2022-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 33206

【微生物の受託番号】BCRC  BCRC 910916

(73)【特許権者】

【識別番号】509013611

【氏名又は名称】生展生物科技股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】陳威仁

(72)【発明者】

【氏名】唐宗寅

(72)【発明者】

【氏名】呉▲シェン▼慧

(72)【発明者】

【氏名】曾愛倫

(72)【発明者】

【氏名】沈秀如

【審査官】長部 喜幸

(56)【参考文献】

【文献】豪国特許出願公開第２０２１１０６４５９（ＡＵ，Ａ１）

【文献】特開２００４－１２３７６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】HSIEH C. et al.，CyTA - Journal of Food，2020年，18:1，pp.764-775

【文献】CAO J. et al.，Journal of Functional Foods，2020年，64，103643

【文献】EL-ATTI S. et al.，Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，2009年，Volume 33 Number 5，pp.569-570

【文献】KLIMBERG V. et al.，Arch Surg，1990年，Vol.125，pp.1040-1045

【文献】LIN X. et al.，PLOS ONE，2012年，Volume 7 Issue 7，e39764

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／７４２

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ １／１４

Ａ６１Ｐ １／１２

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バチルスコアグランスＢＣ１９８を含む化学療法による腸管損傷の関連病症を予防又は治療するための組成物であって、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８は、２０１９年７月１０日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ３３２０６として寄託されており、
前記化学療法による腸管損傷の関連病症は、体重減少、食欲不振、下痢、大腸長さの短縮、又は腸管組織損傷である組成物。

【請求項2】

グルタミンをさらに含む請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記バチルスコアグランスＢＣ１９８の有効用量は、各個体に毎日少なくとも５×１０^８ＣＦＵ／ｄａｙを投与する請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

バチルスコアグランスＢＣ１９８を含む腸内ミクロビオータのバランスを調整するための組成物であって、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８は、２０１９年７月１０日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ３３２０６として寄託されており、
腸内ミクロビオータのバランスを調整するための組成物は、下痢の発生に関連する腸内の少なくとも１つの菌株の成長を抑制するために用いられる組成物。

【請求項5】

下痢の発生に関連する菌株の門階層がＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、ＵＢＡ１８１９又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

グルタミンをさらに含む請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記バチルスコアグランスＢＣ１９８の有効用量は、各個体に毎日少なくとも５×１０^８ＣＦＵ／ｄａｙを投与する請求項４から６のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロバイオティックの用途に関し、特に、化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは、世界で２番目に多い死因となっていて、毎年新規症例数１，４００万人及び死亡数８００万人と推定され、２０３０年までに最大２，１００万人のがん診断症例が増加すると予測されている（非特許文献１）。がん治療について、現在化学療法が臨床上で主流の治療法であるが、化学療法を受けている患者の約５０～８０％が腸管粘膜炎を発症し、主な臨床症状として体重減少、食欲減退、潰瘍、下痢及び腹痛がり、癌患者の生活の質に著しく影響を与えていた（非特許文献２）。

【0003】

研究によると、Ｌ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｌ－ｇｌｎ）は、胃腸管の重要な非必須アミノ酸であり、上皮細胞の核酸合成に必要な基質として使用できるため、Ｌ－グルタミンが化学療法患者の補助薬としてよく使用される。しかし他の研究では、Ｌ－グルタミンが化学療法薬ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ誘発性下痢を抑制できず、又は化学療法薬５－ＦＵ／ｃａｌｃｉｕｍｆｏｌｉｎａｔｅ誘発性口内炎、悪心および下痢の重症度を軽減させることができないと示されている（非特許文献３）。要約すれば、Ｌ－グルタミンは、化学療法誘発性下痢の持続期間を短縮することができるが、重症度を軽減させることができない（非特許文献４）。

【0004】

最近の多くの研究では、腸内細菌叢が腸の健康に重要であることが指摘されており、化学療法薬の投与が腸内細菌叢の不均衡に影響を及ぼし、化学療法薬の副作用の発生につながっていた。具体的には、化学療法薬５－ＦＵは、炎症反応の発生を伴う腸内細菌叢の不均衡を引き起こすことで、腸管粘膜炎をさらに悪化させる可能性があり、すなわち、化学療法薬５－ＦＵ誘発性腸管粘膜炎と腸内細菌叢の恒常性の乱れとの間に高い相関関係がある。（非特許文献５）。

【0005】

プロバイオティクスで腸内ミクロビオータを調節することで、化学療法薬による副作用を効果的に改善できるという考えもあるが、実際には、異なる菌株による腸内細菌叢の組成の変更が異なるため、菌株が体重減少、食事量低下、下痢、腸管組織損傷、炎症、及び腸内ミクロビオータなどの腸管粘膜炎の臨床症状に与える影響を予測できない。例えば研究では、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）の投与は、化学療法５－ＦＵによる体重減少と食事摂取量低下を回復する能力がなく、化学療法誘発性腸管粘膜の損傷及び腸管透過性の増加を遅らせる能力もないことが指摘されている。（非特許文献６）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】ＢｉｏＭｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１８，２０１８：３４２８４３７．

【文献】Ｇｕｔ，２０００，４７：６３２－６３７．

【文献】Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９９７，１３（７－８）：７４８－７５１；Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５（２）：２０２－２０７；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００６，１３０（２Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１０６－Ｓ１１６．

【文献】Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１２，２１（３）：３８０－３８５．

【文献】Ｂａｓｉｃ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１７，１２１（３）：１５９－１６８；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，７：４５５．

【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，１３：６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の主な目的は、化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途を提供することである。すなわち、バチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物は、腸管の細胞を保護し、化学療法薬によって誘発される損傷の発生を減らし、腸内細菌叢のバランスを保ち、腸管組織構造の完全性を維持し、炎症関連因子の産生を減らすことができるため、有効量の本発明で開示されるバチルスコアグランスＢＣ１９８又は代謝産物を化学療法又は化学療法薬を受ける個体に投与することにより、化学療法薬による当前記個体の腸管の副作用及び例えば腸炎、下痢、体重減少、食欲不振等の関連する症候を効果的に改善することができる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

これ故に、上記目的を達成するため、本発明は、化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途を開示し、すなわち、有効量の本発明で開示されるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物を、化学療法を受ける予定又は化学療法薬を受けた個体に投与することにより、化学療法による腸病変又は関連の副作用を効果的に改善又は軽減することができる。

【0009】

本発明の実施例において、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８は、２０１９年７月１１日付で、台湾財団法人食品工業発展研究所に、受託番号ＢＣＲＣ９１０９１６として寄託され、並びに２０１９年７月１０日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ３３２０６として寄託されている。

【0010】

本発明の実施例において、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８の有効用量は、各個体に毎日少なくとも５×１０^８ＣＦＵ／ｄａｙ程度を投与し、正常誤差値の範囲内では本発明のいわゆる有効用量である。

【0011】

本発明の実施例において、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８は、例えば医薬組成物、栄養補助食品、健康補助食品等の組成物として調製される。

【0012】

ここで、前記組成物内は、グルタミンをさらに含む。

【0013】

本発明の一実施例において、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物は、化学療法による腸管損傷の関連病症を予防又は補助するための組成物であり、前記腸疾患に関連する病症は体重減少、食欲不振、下痢、腸炎、大腸の長さの短縮、腸内細菌叢の不均衡又は腸管組織損傷の症候、例えば腸管粘膜炎を有する。

【0014】

本発明の別の実施例において、腸内ミクロビオータのバランスを調整する組成物の調製における前記バチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途を開示し、すなわち、有効量の本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物を、化学療法を受ける予定又は化学療法薬を受けた個体に投与することにより、腸の健康に有害な腸内菌株の数を減らし、かつ腸の健康に有益な腸内菌株の数を増加させることができる。

【0015】

ここで、前記腸の健康に有害な菌株は、腸炎、下痢、腸管組織の病変を引き起こす可能性があり、前記腸の健康に有害な菌株の門階層はＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、ＵＢＡ１８１９又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである。

【0016】

ここで、前記腸の健康に有益な菌株は、酪酸の産生に関連しており、例えば門階層がＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍ又はＬａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍに属する菌株である。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】異なる熱不活性化バチルス菌で処理されたＩＥＣ－６細胞が、５－ＦＵ薬によって誘発される細胞損傷の後の細胞生存率の結果を示す図である。

【図2】実施例４における各群のマウスの試験期間中の体重変化を示す図である（赤い矢印は、５－ＦＵ薬の投与時点を表す）。

【図3】実施例４における各群のマウスの試験期間中の摂食量変化示す図である（赤い矢印は、５－ＦＵ薬の投与時点を表す）。

【図4】実施例４における各群のマウスの下痢指数を分析した結果を示す図である（赤い矢印は５－ＦＵ薬の投与時点を表す）。

【図5】実施例４における各群のマウスの血清中のＩＬ－６濃度を検出した結果を示す図である。

【図6】実施例４における各群のマウスの大腸の長さを検出した結果を示す図である。

【図7A】実施例４における各群のマウスの小腸組織の切片をヘマトキシリン・エオジン染色した後の結果を示す図である。

【図7B】実施例４における各群のマウスの大腸組織の切片をヘマトキシリン・エオジン染色した後の結果を示す図である。

【図8】実施例４における各群のマウス糞便サンプルを分析する上位１０位の物種の相対存在量のヒストグラムである。

【図9】実施例４における各群のマウス糞便サンプル内の物種の存在量を分析して得られた物種の存在量のクラスタリングヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）である。

【図10】実施例４における各群のマウス糞便サンプルの部分的最小二乗判別分析の結果を示す図である（図内のパーセンテージは、サンプルの差に対するＰＬＳ主成分の寄与率を表し、各群の糞便サンプル平均値は正規信頼楕円の中心で示され、図内の各点が１つの糞便サンプルを示し、同じ群の糞便サンプルが同じ色で表される）。

【図11A】ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑで各群のマウスの細菌相におけるＵＢＡ１８１９の相対存在量を分析した結果を示す図（水平線は有意差のある２群を示し、水平線のないはこの物種が群間に有意差がないことを示す。＊は２群間のｐ値＜０．０５で、＊＊が２群間のｐ値＜０．０１であることを示す）。

【図11B】ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑで各群のマウスの細菌相におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの相対存在量を分析した結果を示す図（水平線は有意差のある２群を示し、水平線のないはこの物種が群間に有意差がないことを示す。＊は２群間のｐ値＜０．０５で、＊＊が２群間のｐ値＜０．０１であることを示す）。

【図11C】ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑで各群のマウスの細菌相におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌａの相対存在量を分析した結果を示す図（水平線は有意差のある２群を示し、水平線のないはこの物種が群間に有意差がないことを示す。＊は２群間のｐ値＜０．０５で、＊＊が２群間のｐ値＜０．０１であることを示す）。

【図11D】ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑで各群のマウスの細菌相におけるＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍの相対存在量を分析した結果を示す図（水平線は有意差のある２群を示し、水平線のないはこの物種が群間に有意差がないことを示す。＊は２群間のｐ値＜０．０５で、＊＊が２群間のｐ値＜０．０１であることを示す）。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＢＣ１９８）又はその代謝産物の用途を開示し、具体的には化学療法を受ける個体に有効量のバチルスコアグランスＢＣ１９８を投与することにより、化学療法薬による体重減少、食欲不振、下痢、大腸の長さの短縮、炎症、腸管組織損傷及び腸内細菌叢の不均衡等の病症を効果的に改善することができる。したがって、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物は、食品、医薬組成物又は栄養補助食品として調製し、化学療法誘発性腸管粘膜炎或いはその関連病症の予防又は／及び治療に使用されることから、がん患者のアジュバント又は食事療法のための食品とすることができる。

【0019】

さらに、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物は、グルタミンとの相乗効果が生じ、化学療法薬による腸炎、下痢、体重減少、食欲不振又は腸管損傷に関する他の副作用を改善する効果を大幅に向上させることができる。本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物がグルタミンと併用できる場合、二者の有効用量は個体の物種の違いによって調整できることは、当業者には熟知されている。

【0020】

本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物を投与できる個体は、ヒトに限定されない任意の物種の動物である。

【0021】

本発明において「投与」とは、経口投与に限定されず、投与時に一般的な食品又は食品組成物と一緒に食べることができることを意味する。

【0022】

本発明において「組成物」とは、少なくとも有効量の本発明に開示され、熱不活性化菌及び生菌を含むバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物を含有するものを意味する。前記組成物には、前記バチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物に加えて、本発明の属する技術分野でよく知られている賦形剤、担体、アジュバント及び／又は食品添加物、任意の食品又はタンパク質、糖質、脂質、炭水化物、アミノ酸、ビタミン等の薬学的に許容される成分、及び／又は乳酸菌、酵母菌等の個体の安全性を有する細菌を含み得る。前記組成物は、医薬組成物、食品組成物、栄養補助食品、健康補助食品或いは任意の形態の食べられる物であり得る。前記組成物の剤形には、噴霧ガス、溶液、半固体、固体、ゼラチンカプセル、ソフトカプセル、錠剤、トローチ、チューインガム及び／又は凍結乾燥粉末製剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0023】

本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８の１６Ｓ Ｓ ｒＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、バチルスコアグランスＢＣ１９８の配列を複合配列比較データベース（ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ）と対照して配列比較を行い、結果は本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８がＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ菌株４０８６に最も近く、類似度が１００．００％に達することを示している。本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８は、ドイツ及び台湾に寄託され、寄託情報は次の通りである。
２０１９年７月１０日付で、ドイツ微生物細胞培養コレクションに、受託番号ＤＳＭ３３２０６として寄託され、
２０１９年７月１１日付で、台湾財団法人食品工業発展研究所に、受託番号ＢＣＲＣ９１０９１６として寄託されている。

【0024】

前記バチルスコアグランスＢＣ１９８の培養環境及び条件：ＭＲＳブロス培地、ｐＨ６．２５、４５℃の嫌気性又は好気性環境。

【0025】

前記バチルスコアグランスＢＣ１９８の細菌学的特徴は、以下の構成を有する。すなわち、
１．細胞形態とグラム染色：細菌をＭＲＳブロス培地において４５℃嫌気性環境下で２４時間培養した後、顕微鏡下で外観を観察すると、図１に示すような棒状の桿菌であり、
２．活動量：運動性あり、
３．胞子形成：胞子形成あり、
４．グラム染色：陽性、
５．カタラーゼ：陰性。

【0026】

本発明に開示されている「有効量」は、「有効用量」とも呼ばれ、投与する個体が所属する生物の種類又は個体差によって異なる。一般的に前記有効量は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が用量漸増試験（ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）などの試験結果によって決定することができる。例えば本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８を哺乳動物又はヒトへ１日あたりの有効量は、少なくとも５×１０^８ＣＦＵ／ｄａｙ程度で、投与期間が１７日以上であってもよい。上述の投与有効量又は投与期間の正常誤差範囲内において、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８が投与された個体の体内で化学療法による腸管粘膜炎の臨床症状（体重減少、食欲不振、下痢等）を改善し、並びに化学療法による大腸の長さの短縮、炎症反応、腸管組織損傷及び腸内細菌叢の不均衡等の症候を軽減させる効果を発揮することに影響を与えない。

【0027】

本発明に開示されている「化学療法」は、化学療法薬をがん又は腫瘍に罹患している個体に投与される治療法を意味し、ここで、前記化学療法薬は化学的に合成された薬品で、血液循環を介して個体の体内に入り、がん細胞又は腫瘍細胞の成長を抑制することで消える効果を奏することができるものを意味する。

【0028】

以下に、本発明の技術的特徴及び奏することができる効果を説明するため、いくつかの実施例を挙げて、図面を参照しつつ詳細に描写する。

【0029】

以下の実施例で使用されるラットの正常小腸上皮細胞ＩＥＣ－６細胞株（以下、「ＩＥＣ－６細胞」という）（受託番号ＢＣＲＣ６０３０１、食品工業発展研究所の生物資源保存及び研究センターから購入された）を、１０％の血清とインスリンを含む基本培地ＤＭＥＭで温度３７℃、二酸化炭素濃度５％で培養する。

【0030】

以下の実施例で使用される５－ＦＵ薬（５－Ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｅ）は、化学療法薬である。

【0031】

以下の実施例の実験データは、平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）方式で示される。ＳＰＳＳソフトウェアを利用して統計分析を行い、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで検定し、さらにＤｕｎｃａｎ'ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔで各群のサンプル間の群間の差を検定する。ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５の場合、有意差があることを示し、図面又は表においてａ、ｂ又はｃなどの異なる英字でマークされる。

【0032】

（実施例１：バチルスコアグランスＢＣ１９８の分離）
グリーンモルトに１０倍重量の滅菌水を加え、ホモジナイザーで粉砕し、１０分間重力沈降させ、上澄みをＭＲＳブロス培地に入れ、５０℃で４８時間培養し、１０分間重力沈降させ、培養物をＭＲＳ寒天プレートに広げ、次に５０℃で７２時間嫌気培養した後、寒天培地に出現した単一コロニーを回収し、分離株をさらに精製し、検査後、カタラーゼ陰性となり、顕微鏡下では棒状を呈する。

【0033】

前記分離株のＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ）フラグメントを増幅し、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、産物が期待されるサイズを満たしていることを確認し、配列を決定して、得られたヌクレオチド配列番号がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１で、前記分離株が本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８であることを確認し、配列比較によりＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ菌株４０８６に最も近いことが分かる。

【0034】

（実施例２：バチルスコアグランスＢＣ１９８生菌の調製）
培養・分離したバチルスコアグランスＢＣ１９８をＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）培地に入れ、３７℃の環境下で２０～２４時間培養し、遠心分離をして上清を除去し、細胞を採取して凍結乾燥してバチルスコアグランスＢＣ１９８生菌を得た。

【0035】

（実施例３：細胞試験）
ＩＥＣ－６細胞を１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ培養液の濃度で釈９６ウェルプレートに接種し、細胞がプレートに付着された後、異なる熱不活性化バチルス菌（菌数は１０^８ ＣＦＵ／ｍＬ）である本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８、ＢＣ１菌株、ＢＣ２菌株、ＢＣ３菌株を加えた後、それぞれ５－ＦＵ薬（濃度が３μＭ）と共に９６時間培養した後、ＭＴＴ溶液を添加して、各ウェルの終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにし、温度３７℃、二酸化炭素５％濃度の培養環境下で４時間培養した後、培養液を吸引し、１００μＬ ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を加え、暗室で４５分間振とうした後、マイクロプレート分光光度計で５７０ｎｍ吸光度値を測定し、各群の細胞生存率を計算し、結果を図１に示す。ここで、ＢＣ１菌株及びＢＣ３菌株は、それぞれ市販の商品から分離されたバチルスコアグランス菌株で、ＢＣ２が受託番号ＢＣＲＣ１０６０６として新竹食品工業研究所に寄託されている菌株である。

【0036】

図１の結果から分かるように、熱不活性化バチルス菌を添加していない群と比較すると、異なる熱不活性化バチルス菌で処理した後のＩＥＣ－６細胞を５－ＦＵ薬と共培養した後、各群の細胞生存率は向上されおり、各株の熱不活性化バチルス菌は、５－ＦＵ薬によって誘発される細胞損傷に対して保護効果を有するが、各群の細胞生存率を比較すると、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８は５－ＦＵ薬によって誘発された後の細胞生存率を明らかに向上できることを示している。換言すれば、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８は、腸管細胞を保護する能力を有し、化学療法薬による腸管細胞損傷を効果的に低減して、化学療法薬による副作用又は不快感、例えば体重減少、食欲不振、下痢、大腸長さの短縮、炎症、腸管組織損傷及び腸内細菌叢の不均衡等の病症の改善を実現する。

【0037】

（実施例４：動物試験）
複数の５週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに群分けし、試験期間は１８日で、各群のマウスの飼育温度を２２±２℃に維持し、昼夜サイクルが各１２時間で、自由摂食方法を用い、下記条件で投与し、ここで試験の１１日目から１３日目に投与された５－ＦＵ薬を除いて、他の薬剤は試験期間中（すなわち、試験の初日から試験期間の終わりまで）毎日投与された。５－ＦＵ薬は腹腔内注射により投与され、他の薬剤は経口投与された。

【0038】

第１群：対照群で、５－ＦＵ薬の代わりにリン酸緩衝生理食塩水を使用し、
第２群：５－ＦＵ薬のみ（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与し、
第３群：グルタミン（１ｇ／ｋｇ／ｄａｙ）及び５－ＦＵ薬（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与し、
第４群：本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８（５×１０^８／ｄａｙ）、及び５－ＦＵ薬（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与し、
第５群：本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８（５×１０^８／ｄａｙ）、グルタミン（１ｇ／ｋｇ／ｄａｙ）及び５－ＦＵ薬（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を投与した。

【0039】

試験期間に各群のマウスの体重と飼料摂取量を毎日測定し、記録し、結果を図２及び図３に示す。５－ＦＵ薬の投与後、各群のマウスの糞便を収集して各群のマウスの下痢指数を評価し、結果を図４に示す。

【0040】

図２及び図３の結果から、試験の１１～１３日目に５－ＦＵ薬を投与した後、第２群のマウスの体重と摂食量は、第１群のマウスよりも有意に低かったことが分かり、５－ＦＵ薬が確実に個体に食欲減退や体重減少などの副作用をもたらしたことを示している。第３群及び第４群のマウスは、それぞれ体重と摂食量を維持でき、第５群のマウスは試験期間に体重を維持し続けるだけではなく、試験の１４～１５日目での摂食量が第３群及び第４群のマウスより有意に多かった。

【0041】

図４の結果から分かるように、試験の１１～１３日目に５－ＦＵ薬を投与した後、試験の１４～１５日目に第２群のマウスの下痢指数が有意に向上し、５－ＦＵ薬が腸管細胞を損傷させて、個体に下痢又は胃腸の不具合等の病症を引き起こす可能性があることを示している。第２群のマウスと比較して、第３群及び第４群のマウスは、５－ＦＵ薬による下痢を軽減させることができ、第５群のマウスが試験の１４日目から下痢指数を効果的に低下させることができる。

【0042】

図２～図４の結果は、個体が化学療法前に先に本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８を投与すると、化学療法薬又は化学療法による体重減少、食欲不振、下痢、胃腸の不具合等の病症を効果的に改善できることを示している。本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８をグルタミンと併用した場合、化学療法薬による胃腸の不具合及び腸管細胞損傷によって引き起こされる副作用を大幅に改善又は軽減できる。

【0043】

（実施例５：炎症関連サイトカインに対するバチルスコアグランスＢＣ１９８の影響の分析）
実施例４の試験期間の終わりに、各群のマウスの血清をそれぞれ収集し、各群のマウスの血清中のＩＬ－６濃度を市販のキットで分析し、結果を図５に示す。

【0044】

図５の結果から分かるように、第２群のマウスの血清中のＩＬ－６濃度は、第１群のマウスよりも有意に高く、５－ＦＵ薬が確実に炎症反応を引き起こす可能性があることを示している。第３群～第５群のマウスの血清中のＩＬ－６濃度は、それぞれ第２群のマウスよりも有意に低く、第５群のマウスの血清中のＩＬ－６濃度が第３群のマウスよりも低かった。

【0045】

図５の結果は、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８が確実に化学療法又は化学療法薬による炎症反応の発生を低減でき、かつ本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８がグルタミンとの相乗効果を生じることができ、炎症関連サイトカインの産生の抑制を強化することで、化学療法薬による炎症又はその関連する副作用を効果的に軽減又は改善する効果を奏することができることを示している。

【0046】

（実施例６：腸管組織に対するバチルスコアグランスＢＣ１９８の影響の分析）
実施例４の試験期間の終わりに、各群のマウスの大腸及び小腸組織を収集し、各群のマウスの大腸の長さをそれぞれ測定し、結果を図６に示す。かつ各群のマウスの大腸及び小腸の組織をスライスした後、ヘマトキシリン－エオシン染色し、結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。

【0047】

図６の結果から分かるように、第１群のマウスと比較して、第２群のマウスの大腸の長さは短くなる傾向があり、第３群及び第４群のマウスが大腸の長さを維持し、第５群のマウスが大腸の長さを維持するだけでなく、大腸の長さを伸ばすことができる。さらに、図５及び図６の結果をまとめると、化学療法薬を受ける個体に本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８を事前かつ持続投与することにより、大腸の長さを維持して、化学療法薬による下痢又は腸の不具合の副作用を早期に軽減或いは効果的に改善することができることが分かる。

【0048】

図７Ａ及び図７Ｂの結果から分かるように、第１群のマウスと比較して、第２群のマウスの小腸の組織構造、例えば絨毛短縮などの損傷を受け、大腸組織に絨毛の短縮や腺窩（赤い矢印で示されている箇所）の消失などの明らかな病変が生じ、第３群及び第４群のマウスはそれぞれ５－ＦＵ薬によって誘発される小腸及び大腸の構造損傷を軽減させることができ、すなわち、第３群及び第４群のマウスの小腸及び大腸の構造はそれぞれ第２群のマウスよりも完全しており、第５群のマウスは小腸組織及び大腸組織を５－ＦＵ薬による損傷から保護し、小腸又は大腸の病変の発生を避けるだけではなく、小腸組織及び大腸組織の構造を維持でき、例えば小腸の絨毛組織の完全性、腺窩の完全性及び数量を維持する。

【0049】

図６～図７の結果は、化学療法又は化学療法薬を受ける個体に本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８を単独事前かつ持続投与すると、前記個体が化学療法過程中で化学療法薬による腸管組織損傷を低減して、腸管構造の完全性を維持するか、化学療法薬による胃腸病症を低下する効果を奏することができ、かつ本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８はグルタミンとの相乗効果を生じ、すなわち化學療法又は化学療法薬を受ける個体に本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８及びグルタミンを同時に投与した場合、小腸及び大腸の保護効果を強化することで、腸管組織を保護し、腸管構造完全性を維持し、腸管組織の病変の発生を防ぐ効果を奏することができることを示している。

【0050】

（実施例７：細菌相解析）
実施例４の試験の終わりに、各群のマウスの糞便を収集して、各群のマウスの糞便の配列決定解析を外部委託し、次に類似度（９７％超）ＯＴＵｓ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔｓ）のクラスタリング及び物種分類解析を行い、物種注釈結果に基づいて、各群のマウスの門階層（ｐｈｙｌｕｍ）における相対存在量の上位１０位の物種を選択し、結果を図８に示す。ここで、糞便配列決定解析及び細菌相解析は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によく知られている技術である。一般的にまず糞便サンプルのＤＮＡを抽出及び精製した後、ＰＣＲで増幅、精製し、配列決定が行われる。配列決定の結果は、ペアシーケンススプライシング（Ｒａｗ Ｔａｇｓ）、フィルタリングなどのステップを経て、識別可能な有効なデータを得てからＯＴＵｓのクラスタリング及び物種分類解析を実施する。

【0051】

各群の各階層における全ての物種注釈情報及び存在量情報に基づいて、存在量の上位３５位の属を選択し、群別の存在量は群内の全てのサンプルの平均存在量で、物種階層からクラスタリングを行って各群の糞便サンプル内の物種ヒットマップを作成し、結果を図９に示す。

【0052】

部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ、Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して各群のマウスの糞便中の微生物群集のβ多様性を分析し、各群のマウスの細菌相間に菌群差があるかどうかを判断し、結果を図１０に示す。ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑで各群のマウスの細菌相データを分析して、各群のマウスの細菌相間の有意差を評価し、結果を図１１Ａ～図１１Ｄに示す。

【0053】

図８に示すように、腸管粘膜の特徴がない第１群の腸内ミクロビオータを正常な細菌相と見なした場合、第２群のマウスの糞便では、粘膜関連炎症を起こす細菌相である変形菌門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の相対存在量は比較的高く、以前の研究では変形菌門の存在量の増加が腸内ミクロビオータの不均衡につながることが指摘され、すなわち、変形菌門の存在量の増加が腸管及び上皮細胞の機能障害を判断する微生物特徴とすることができ、したがって、第２群のマウスの腸内ミクロビオータは不均衡な状態にあり、かつ第２群のマウスに腸管及び上皮細胞の機能障害現象があると推測される。第２群のマウスと比較して、第３群～第５群のマウスはそれぞれ変形菌門の相対存在量を減らすことができ、また第５群のマウスの変形菌門の相対存在量を減らす方が良い。

【0054】

図９の結果から分かるように、第２群のマウスの細菌相分布は、第１群のマウスの細菌相とは明らかに異なり、第２群のマウスの腸内ミクロビオータが不均衡な状態になり、かつ第２群のマウスの細菌相中の下痢及び腸炎に関連する細菌相の存在量が有意に増加し、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒであり、第３群～第５群のマウスの細菌相中の下痢及び腸炎に関連する細菌相の存在量はそれぞれ第２群のマウスよりも低く、第５群のマウスの細菌相では酪酸産生に関する菌株であるＬａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの相対存在量をより増えた。

【0055】

図１０の結果から分かるように、第２群のマウスの細菌相分布は、第１群のマウスの細菌相から遠く離れており、第２群のマウスの細菌相が不均衡な状態になることを示している。第３群及び第４群のマウスの細菌相分布状態は、第２群のマウスに近く、ここで、第３群のマウスの細菌相分布のごく一部が第２群と重なり、第３群と第２群のマウスの腸管内に類似の細菌相が存在していることを示す。ただし、第５群のマウスの細菌相分布は、第２群のマウスとは明らかに異なり、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８及びグルタミンを同時に投与すると、化学療法薬による腸内細菌叢の不均衡を効果的に改善できることを示している。

【0056】

図１１Ａ～図１１Ｂに示すように、第１群と比較して、第２群の細菌相中にはＵＢＡ１８１９及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの相対存在量が有意に増加し、第２群と比較して、第３群及び第４群がＵＢＡ１８１９及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの相対存在量を有意に減少できないが、第５群は、ＵＢＡ１８１９及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの相対存在量を有意に減少できる。図１１Ｃに示すように、第１群と比較して、第２群の細菌相にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌａの相対存在量を有益に増加し、第２群と比較して、第３群～第５群はそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌａの相対存在量を減少でき、第５群の減少程度が最高であった。また図１１Ｄに示すように、第１群と比較して、第２群の細菌相中にはＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍの相対存在量を有益に減少し、第２群と比較して、第３群のＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍの相対存在量が有益に減少され、第３群と比較して、第４群及び第５群のＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍの相対存在量はそれぞれ有意に増加され、ここで第５群の増加が有意に良好である。

【0057】

当業者によく知られているように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌは下痢関連菌株で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは腸管粘膜炎を誘発する可能性のあるβ－グルクロニダーゼ（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）産生菌株で、ＵＢＡ１８１９は腸炎を助長する関連菌株である。

【0058】

図８～図１１に示す結果は、化学療法を受ける個体に本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８を事前かつ持続投与することにより、当該個体の腸内ミクロビオータのバランスを維持でき、かつ腸炎又は下痢を助長する関連菌株、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ＿Ｓｈｉｇｅｌｌ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＵＢＡ１８１９の存在量を効果的に減少でき、また酪酸産生菌株であるＭｕｒｉｂａｃｕｌｕｍの相対存在量を増加でき、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８とグルタミンを併用する時、腸の健康に有害な上記菌株の相対存在量の減少効果及び腸の健康に有益な菌株の相対存在量の増加効果はより良い。

【0059】

これから分かるように、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８は、確実に腸内細菌相のバランスを維持でき、また腸管内の腸炎又は下痢に関連する菌株の成長を低下又は抑制でき、同時に消化器系環境に有益な菌株の成長を促進できるから個体が化学療法を受けて引き起こす腸炎、体重減少、下痢、食欲不振等の副作用を効果的に改善する。なお、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８は、グルタミンとの相乗効果を生じることができ、すなわち本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８及びグルタミンを同時に投与すると、化学療法薬５－ＦＵによる腸内細菌叢の不均衡を低減する効果はより良い。

【受託番号】

【0060】

ＤＳＭ３３２０６

【要約】

【課題】 化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途を提供することを課題とする。
【解決手段】 本発明は、化学療法による腸管損傷の関連病変又は細菌叢の不均衡の予防或いは補助療法におけるバチルスコアグランスＢＣ１９８又はその代謝産物の用途を開示し、すなわち、化学療法を受ける個体に有効量を含有するバチルスコアグランスＢＣ１９８を投与することにより、化学療法薬による体重減少、食欲不振、下痢、大腸の長さの短縮、炎症、腸管組織損傷及び腸内細菌叢の不均衡等の病症を効果的に改善することができ、換言すれば、本発明に開示されているバチルスコアグランスＢＣ１９８は化学療法のアジュバント又は食事療法のための食品、或いは副作用改善又は治療効果向上のための他の組成物とすることができる。
【選択図】 図1

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【配列表】

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