特許 7344206 二重特異性抗体製品のための連続製造プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-05

(45)【発行日】2023-09-13

(54)【発明の名称】二重特異性抗体製品のための連続製造プロセス

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/08 20060101AFI20230906BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230906BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20230906BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20230906BHJP

【ＦＩ】

C12P21/08

C12M1/00 A

C07K16/46

C07K16/28

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2020531608

(86)(22)【出願日】2018-12-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-18

(86)【国際出願番号】 US2018064901

(87)【国際公開番号】W WO2019118426

(87)【国際公開日】2019-06-20

【審査請求日】2021-12-13

(31)【優先権主張番号】62/597,250

(32)【優先日】2017-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500203709

【氏名又は名称】アムジェン インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ゴーダー，チェタン

(72)【発明者】

【氏名】デシュパンデ，ロヒニ

(72)【発明者】

【氏名】ゴメス，ナタリア

(72)【発明者】

【氏名】バークホーダリアン，ヘディー

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ヤン

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５２５９８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２５６３３６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１２－５０８１６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２４８５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２６３５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２０４４４６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１２－５０７２７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０７２２０１（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ０７Ｋ １６／２８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、
前記第１の結合ドメインが前記第２の結合ドメインとは異なる標的に結合する二重特異性抗体製品の生産のための連続的な上流製造プロセスであって、前記二重特異性抗体製品が、非全長二重特異性抗体コンストラクトであり、そして、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体コンストラクトであり、前記プロセスが：
（ｉ）灌流バイオリアクター中に少なくとも１つの哺乳動物細胞培養物を含む液体細胞培養培地を供給する工程であって、前記哺乳動物細胞培養物が、前記二重特異性抗体製品を発現することができ、且つ前記細胞が、前記灌流バイオリアクター中における播種時に少なくとも０．４×１０ ^６ 細胞／ｍＬの濃度を有する工程、
（ｉｉ）バイオリアクターから前記細胞を除去することなく、灌流量（Ｄ）を適用して連続的な様式で前記液体細胞培養培地を交換することによって、前記哺乳動物細胞培養物を増殖させる工程であって、前記灌流量が最初のうちは、少なくとも０．４の１日当たりの容器容量（ｖｖｄ）に相当し、続いて連続的に、徐々に又は漸増的に、少なくとも２ｖｖｄに増加され、その時、生物量設定値に達し、前記生物量設定値が、少なくとも６５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度（ＶＣＤ）に等しい工程、
（ｉｉｉ）前記灌流量（Ｄ）を適用して連続的又は漸増的に前記液体細胞培養培地を交換することによって灌流培養を維持し、その時、前記生物量設定値に達する工程であって、工程（ｉｉｉ）における前記灌流量が、２～６．４ｖｖｄの範囲であり、そして、前記灌流量（Ｄ）が、０．０１～０．１５ｎＬ／細胞－日（１日当たりの細胞当たりのｎＬ）の範囲の細胞比灌流量（ＣＳＰＲ）である、工程、
及び
（ｉｖ）前記バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、前記生物量設定値を維持する工程であって、
前記バイオリアクター中の前記二重特異性抗体製品濃度が、工程（ｉｉ）～（ｉｖ）の全体にわたって前記液体細胞培養培地から前記二重特異性抗体製品を連続的に収集することによって０．３ｇ／Ｌ未満に保たれる工程
を含む、連続的な上流製造プロセス。

【請求項2】

工程（ｉ）において、前記細胞が少なくとも１×１０ ^６ 細胞／ｍＬの濃度を有する、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

工程（ｉｉ）において、前記生物量設定値が、少なくとも７１×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＤに等しい、請求項１に記載のプロセス。

【請求項4】

工程（ｉｉ）において、前記細胞培養の前記増殖が、少なくとも４日間起こる、請求項１に記載のプロセス。

【請求項5】

工程（ｉｉ）において、前記細胞培養の前記増殖が１２日間起こる、請求項１に記載のプロセス。

【請求項6】

工程（ｉｉ）において、前記灌流量（Ｄ）が、０．４～７ｖｖｄの範囲である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項7】

工程（ｉｉｉ）において、前記灌流量（Ｄ）が、２ｖｖｄまたは２．０１ｖｖｄに等しい、請求項１に記載のプロセス。

【請求項8】

工程（ｉｉｉ）において、ＣＳＰＲが、０．０１５～０．０３５ｎＬ／細胞－日の範囲又は０．０５１～０．１ｎＬ／細胞－日の範囲である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項9】

工程（ｉｖ）における収集前の前記バイオリアクターにおける前記二重特異性抗体製品の滞留時間が、最大２日である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項10】

単離された前記二重特異性抗体のパーセンタイル単量体含量が、少なくとも８０％、９０％、９３％又は９５％である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項11】

前記二重特異性抗体コンストラクトが、ＩｇＧ抗体に由来するＦｃに基づく半減期延長部分を含む、
請求項１に記載のプロセス。

【請求項12】

前記二重特異性抗体製品の前記第１の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的細胞の表面抗原に結合する、
並びに／あるいは、
前記二重特異性抗体製品の前記第２の結合ドメインが、ＣＤ３に結合する、
請求項１に記載のプロセス。

【請求項13】

前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｂ）配列番号２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｃ）配列番号４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｄ）配列番号５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｅ）配列番号６５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｆ）配列番号８３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号８６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｇ）配列番号９４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号９６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号９９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｈ）配列番号１０５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１０７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１０９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｉ）配列番号１１５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１１８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｊ）配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１２８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｋ）配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１３９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１４０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｌ）配列番号１５２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、並びに
（ｍ）配列番号１６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１７０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１７２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３
からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、請求項１に記載のプロセス。

【請求項14】

収集された前記二重特異性抗体製品が、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）に含まれる、請求項１に記載のプロセス。

【請求項15】

前記ＨＣＣＦが、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は工程（ｉｉｉ）のみから得られる、請求項１４に記載のプロセス。

【請求項16】

前記ＨＣＣＦが、室温で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０及び／又は１４４時間刻みで、又は連続的に回収され、前記二重特異性抗体製品を捕捉するために下流工程に渡される、請求項１５に記載のプロセス。

【請求項17】

前記下流工程が、捕捉クロマトグラフィー、ウイルス不活性化及び／又はポリッシング工程を含む、請求項１６に記載のプロセス。

【請求項18】

前記灌流培養が、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８日間、あるいは、少なくとも３５日間、規定の細胞比灌流量で供給し、前記バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、前記生物量設定値を維持することによって連続的に行われている、請求項１に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジーの方法、特に、二重特異性抗体の製造のための連続製造プロセスに関する。

【背景技術】

【0002】

最も迅速且つ有望に開発されている治療薬の中には、すでにほぼ全ての医療分野で重要な役割を果たしているタンパク質に基づく医薬品があり、（前）臨床開発及び市販品として最も急速に成長している治療薬に含まれる（Ｌｅａｄｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２００８ Ｊａｎ ７，２１－３９）。低分子化学薬剤と比較して、タンパク質医薬品は、比較的低い濃度で高い特異性及び活性を有し、通常、種々の癌、自己免疫疾患及び代謝障害などの大きい影響のある疾患の療法を提供する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０、Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．１９９９ Ａｕｇ ２０；１８５（２）：１２９－８８）。

【0003】

商業規模での精製プロセスの進歩により、現在、組換え体タンパク質などのタンパク質系医薬品は、最初の製造時に高い純度で得ることができる。しかしながら、タンパク質は、わずかに安定であるにすぎず、上流の製造の間でさえ、化学的にも物理的にも非常に劣化しやすい。化学的劣化は、脱アミド、酸化、新たなジスルフィド架橋の切断若しくは形成、加水分解、異性化又は脱グリコシルなどの共有結合を伴う修飾を指す。物理的劣化には、タンパク質のアンフォールディング、表面への望ましくない吸着及び凝集が含まれる。これらの物理的及び化学的な不安定性への対処は、タンパク質医薬品の開発において最も難しい課題の１つである（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５１３３６、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０）。

【0004】

したがって、製造における進歩にもかかわらず、新規のタンパク質に基づく医薬品は、タンパク質の凝集などの製品品質への影響を回避するために、新たな最適化された製造プロセスを必要とする。これは、上流の製造、下流の製造、保管及び適用に影響を及ぼす。

【0005】

このような新規のタンパク質に基づく医薬品は、例えば、二重特異性（モノクローナル）抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの異なる型の抗原に同時に結合できる人工タンパク質である。それらは、いくつかの構造形式において知られており、現在では癌免疫療法及び薬物送達への応用が模索されている（Ｆａｎ，Ｇａｏｗｅｉ；Ｗａｎｇ，Ｚｕｊｉａｎ；Ｈａｏ，Ｍｉｎｇｊｕ；Ｌｉ，Ｊｉｎｍｉｎｇ（２０１５）．「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．８：１３０）。

【0006】

一般に、二重特異性抗体は、ＩｇＧ様、すなわち、全長二重特異性抗体であってもよいし、又は全長抗体コンストラクトではない非ＩｇＧ様二重特異性抗体であってもよい。全長二重特異性抗体は通常、２つのＦａｂ部位が異なる抗原に結合することを除いて、２つのＦａｂアーム及び１つのＦｃ領域の通常のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）構造を保持する。非全長二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を完全に欠く。これらとしては、Ｆａｂ領域のみからなる化学的に連結されたＦａｂ、並びに様々な型の二価及び三価の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が挙げられる。２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質もある。これらの新しい形式の中で最も開発が進んでいると思われるのは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））である（Ｙａｎｇ，Ｆａ；Ｗｅｎ，Ｗｅｉｈｏｎｇ；Ｑｉｎ，Ｗｅｉｊｕｎ（２０１６）．「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１８（１）：４８）。

【0007】

ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトなどの二重特異性分子は、２つの柔軟に連結された抗体に由来する結合ドメインから構成される組換え体タンパク質コンストラクトである。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの１つの結合ドメインは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。それらの特別な設計により、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、Ｔ細胞を標的細胞と一過的に結び付け、同時に標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能を強力に活性化するのに独特に適している。ＡＭＧ１０３及びＡＭＧ１１０としてクリニックに展開された第一世代のＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの重要なさらなる開発（国際公開第９９／５４４４０号パンフレット及び国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレットを参照されたい）は、ＣＤ３ε鎖のＮ末端のコンテクスト非依存的なエピトープに結合する二重特異性抗体コンストラクトを提供した（国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット）。この選出されたエピトープに結合するＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、ヒト及びマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３ε鎖に対する種間特異性を示さないだけでなく、二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子において以前に記載されたＣＤ３結合体のエピトープの代わりにこの特異的エピトープを認識するため、前世代のＴ細胞エンゲージ抗体で観察されたのと同程度にＴ細胞を非特異的に活性化しない。このＴ細胞活性化の低下は、患者におけるより少ない又は減少したＴ細胞再分布と関係し、これは、副作用のリスクがあると判断された。

【0008】

現在、二重特異性抗体は、フェドバッチ培養の製造プロセスによって生産される。フェッドバッチ培養は、１つ以上の栄養素（培養基）が培養中にバイオリアクターに与えられ（供給され）、その中で生成物は、稼働の終了時までバイオリアクターに残っているバイオテクノロジーのプロセスにおける操作技術としてよく知られている（Ｔｓｕｎｅｏ Ｙａｍａｎｅ，Ｓｈｏｉｃｈｉ Ｓｈｉｍｉｚｕ：Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．（１９８４） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３０：１４７－１９４）。したがって、二重特異性抗体製品は、フェドバッチプロセス中に蓄積され、例えば、凝集、クリッピング又は特定の化学的劣化反応のために製品品質の損失が起こりやすい。また、稼働の終了時まで製品が得られない場合もある。加えて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などのプロセスに関連する不純物も同様に、フェドバッチプロセス中にバイオリアクター内に蓄積する。これらの不純物の下流工程での除去は困難な場合が多く、最終製品の品質を確保するために追加の対策及びリソースを必要とする。新規の稼働のたびに新たな細胞培養の増殖期を必要とするため、その必要とされる増殖期の繰り返しによって、フェドバッチの全体的な生産性が損なわれる。さらに、フェドバッチ設備によって生産される十分な生産量を得るためには、大量のスペースとエネルギーを使用する大型のバイオリアクターが必要となる。したがって、下流の処理で廃棄される必要のある製品が少なくなるような品質にて商業規模で十分な量の製品を提供するために、製品量と製品品質の両方を向上させる、二重特異性抗体の生産のために特別に改善された上流製造プロセスが必要とされる。大規模な細胞培養プロセスの費用及び重度のアンメット・メディカル・ニーズを持つ患者に供給されることになる生物学的製品の大量且つ低コスト化の要求が高まっていることを考慮すると、組換えタンパク質の生産及び回収を少しずつでも改善できる新たなプロセス方法が有用である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

驚くべきことに、二重特異性抗体の製品量及び製品品質の両方の改善を保証した、適合した連続製造プロセスが提供され得る。抗体などのタンパク質の生産のための連続製造プロセスがそのようなものとして知られていたとしても（例えば、Ｃａｔｔａｎｅｏ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２０１７／０２０４４４６Ａ１号明細書）、そのようなプロセスは、上流の製造プロセス工程の間にすでに凝集し、クリッピングし且つ化学的に劣化する傾向がある二重特異性抗体の特定の必要性に合わせたものではなく、したがって、製品量及び品質の低下をもたらした。

【0010】

したがって、一態様において、本発明の文脈では、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインが第２の結合ドメインとは異なる標的に結合する二重特異性抗体製品の生産のための連続的な上流製造プロセスを提供することが想定され、そのプロセスは、
（ｉ）灌流バイオリアクター中に少なくとも１つの哺乳動物細胞培養物を含む液体細胞培養培地を供給する工程であって、哺乳動物細胞培養物が、二重特異性抗体製品を発現することができ、且つ細胞が、灌流バイオリアクター中における播種時に少なくとも０．５×１０＾６細胞／ｍＬの濃度を有する工程、
（ｉｉ）バイオリアクターから細胞を除去することなく、灌流量（Ｄ）を適用して好ましくは連続的な様式で液体細胞培養培地を交換することによって、哺乳動物細胞培養物を増殖させる工程であって、灌流量が最初のうちは、少なくとも０．４の１日当たりの容器容量（ｖｖｄ）に相当し、続いて連続的に、徐々に又は漸増的に、本明細書で１日当たりの容器容量（ｖｖｄ）としても理解される少なくとも１バイオリアクター容量に増加され、その時、生物量設定値に達し、生物量設定値が、少なくとも３５×１０＾６細胞／ｍＬの生細胞密度（ＶＣＤ）に等しい工程、
（ｉｉｉ）好ましくはバイオリアクターから細胞を除去することなく、灌流量（Ｄ）を適用して連続的又は漸増的に液体細胞培養培地を交換することによって灌流培養を維持し、その時、生物量設定値に達する工程であって、工程（ｉｉｉ）における灌流量が、本明細書で１日当たりの容器容量（ｖｖｄ）としても理解される少なくとも１バイオリアクター容量に相当する工程、及び
（ｉｖ）任意選択的にバイオリアクターから余分な細胞を抜いて、生物量設定値を維持する工程であって、
バイオリアクター中の二重特異性抗体製品濃度は、工程（ｉｉ）～（ｉｖ）の全体にわたって液体細胞培養培地から二重特異性抗体製品を連続的に収集すること及び／又はＤをＶＣＤに調整することによって３．５ｇ／Ｌ未満に保たれる工程を含む。

【0011】

前記態様によれば、細胞は、バイオリアクター中における播種時に少なくとも１×１０＾６細胞／ｍＬの濃度を有することも工程（ｉ）において想定される。
前記態様によれば、生物量設定値は、少なくとも６５×１０＾６細胞／ｍＬのＶＣＤに等しいことが工程（ｉｉ）においてさらに想定される。

【0012】

前記態様によれば、生物量設定値は、少なくとも７１×１０＾６細胞／ｍＬのＶＣＤに等しいことが工程（ｉｉ）においてさらに想定される。
前記態様によれば、細胞培養の増殖は、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１２日間起こることも工程（ｉｉ）において想定される。

【0013】

前記態様によれば、灌流量（Ｄ）は、０．４～７ｖｖｄの範囲であることが工程（ｉｉ）においてさらに想定される。
前記態様によれば、灌流量（Ｄ）は、連続的に、すなわち、不連続的ではなく増加されることが工程（ｉｉ）においてさらに想定される。

【0014】

前記態様によれば、灌流量（Ｄ）は、１～７ｖｖｄの範囲であることが工程（ｉｉｉ）においてさらに想定される。
前記態様によれば、灌流量（Ｄ）は、２～６．４ｖｖｄの範囲、好ましくは２ｖｖｄ、最も好ましくは２．０１ｖｖｄであることも工程（ｉｉｉ）において想定される。

【0015】

前記態様によれば、灌流量（Ｄ）は、０．０１～０．１５ｎＬ／細胞－日（１日当たりの細胞当たりのｎＬ）の範囲、好ましくは０．０１５～０．０３１５ｎＬ／細胞－日の範囲又は０．０５～０．１ｎＬ／細胞－日の範囲の細胞比灌流量（ＣＳＰＲ）であることが工程（ｉｉｉ）においてさらに想定される。

【0016】

前記態様によれば、二重特異性抗体製品濃度は、１．２ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｇ／Ｌ未満、最も好ましくは０．１２ｇ／Ｌ未満に保たれることも工程（ｉｉ）～（ｉｖ）において想定される。

【0017】

前記態様によれば、工程（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）後の収集前のバイオリアクターにおける二重特異性抗体製品の平均滞留時間はそれぞれ、最大２日、好ましくは最大１日、最も好ましくは最大０．５日であることも想定される。

【0018】

前記態様によれば、最終ＩＶＣＤは、少なくとも１０×１０＾６細胞－日／ｍＬ、好ましくは少なくとも１２、２０又は５０×１０＾６細胞－日／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１００、５００又はさらに１０００×１０＾６細胞－日／ｍＬであることも想定される。

【0019】

前記態様によれば、平均ＨＣＣＦ生産性は、少なくとも２ｇ／Ｌのバイオリアクター容量、好ましくは少なくとも５、１０又は１５ｇ／Ｌのバイオリアクター容量であることも想定される。

【0020】

前記態様によれば、平均ＨＣＣＦ一日生産性は、少なくとも１０ｇ／Ｌの１日当たりのバイオリアクター容量、好ましくは少なくとも５０ｇ／Ｌの１日当たりのバイオリアクター容量、より好ましくは少なくとも１００又はさらに少なくとも２５０ｇ／Ｌの１日当たりのバイオリアクター容量であることも想定される。

【0021】

前記態様によれば、単離された二重特異性抗体製品のパーセンタイル単量体含量は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９３％又はさらに９５％であることがさらに想定される。

【0022】

前記態様によれば、単離された二重特異性抗体製品のパーセンタイル高分子量（ＨＭＷ）種含量は、最大５０％、好ましくは最大４０％、より好ましくは最大３０％、２０％、１０％、７％又はさらに５％であることがさらに想定される。

【0023】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体製品は、第１又は第２の精製プールにおいて、フェドバッチプロセスに由来する同じプールと比較して、宿主細胞タンパク質含量における少なくとも６０％の減少、好ましくは少なくとも６５％、典型的には少なくとも６８％又はさらに７５％～８６％の減少によって特徴付けられる。

【0024】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体製品は、第１又は第２の精製プールにおいて、フェドバッチプロセスに由来する同じプールと比較して、クリッピングされたタンパク質レベルにおける少なくとも４０％の減少、好ましくは少なくとも４４％、典型的には少なくとも７５％又はさらに９７％の減少によって特徴付けられる。

【0025】

前記態様によれば、クリッピングによって影響される本発明により生産される製品のパーセンタイル量は、最大１５％又は１０％、好ましくは最大７％、より好ましくは最大６、５、４、３、２、又は１％、及び最も好ましくは最大０．３％である。後者は、全長抗体ではなく、且つ好ましくは配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第２のドメインを含む本発明による二重特異性抗体に適用されることが好ましい。

【0026】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体製品は、例えば、第１又は第２の精製プールにおいて、フェドバッチプロセスに由来する同じプールと比較して、脱アミド又は異性化された製品種などの製品中の化学的に修飾されたアミノ酸レベルにおける少なくとも５０％の減少、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは６８％又はさらに少なくとも８０％の減少によって特徴付けられる。

【0027】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体は、全ての製品種と比較して、最大２％、好ましくは最大１％、より好ましくは最大０．５％又はさらに０．１％の脱アミド又は異性化された製品種のパーセンタイル含量によって特徴付けられる。

【0028】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体は、第１又は第２の精製プールにおいて、フェドバッチプロセスに由来する同じ精製プールと比較して、高分子量種、すなわち、純粋な製品単量体より高い分子量を有するコンストラクトにおける少なくとも２５％の減少、高分子量種における好ましくは少なくとも５０％又はさらに約７０％の減少によって特徴付けられる。

【0029】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体は、典型的には第１又は第２の精製プールにおいて、フェドバッチプロセスに由来する同じプールと比較して、酸性種レベルにおける減少、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、典型的には約３８～４９％の減少によって特徴付けられる。

【0030】

前記態様によれば、本発明により生産される二重特異性抗体は、全ての製品種と比較して、最大１５％、好ましくは最大１２％、より好ましくは最大１０％の酸性製品種のパーセンタイル含量によって特徴付けられる。

【0031】

前記態様によれば、二重特異性抗体製品は、二重特異性全長抗体、すなわち、典型的には２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体、又は一本鎖二重特異性抗体コンストラクトを含む非全長二重特異性抗体コンストラクトであることも想定される。

【0032】

前記態様によれば、二重特異性全長抗体であって、二重特異性抗体コンストラクトの第１及び／又は第２の結合ドメインが標的及び／又はエフェクター細胞に結合する二重特異性全長抗体が想定される。

【0033】

前記態様によれば、二重特異性全長抗体であって、二重特異性抗体コンストラクトの第１及び／又は第２の結合ドメインがＴ１１Ａ及び／又はＴＮＦ－アルファに結合する二重特異性全長抗体が想定される。

【0034】

前記態様によれば、二重特異性抗体コンストラクトは、半減期延長部分、好ましくはＩｇＧ抗体に由来するＦｃに基づく半減期延長部分、最も好ましくはｓｃＦｃ半減期延長部分を含むことも想定される。

【0035】

前記態様によれば、二重特異性抗体コンストラクトは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））であることがさらに想定される。
前記態様によれば、二重特異性抗体製品の第１の結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的細胞の表面抗原に結合することが想定される。

【0036】

前記態様によれば、二重特異性抗体コンストラクトの第２の結合ドメインは、ＣＤ３結合ドメインに結合することがさらに想定される。
前記態様によれば、第２の結合ドメインは、
（ａ）配列番号１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｂ）配列番号２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｃ）配列番号４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｄ）配列番号５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｅ）配列番号６２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｆ）配列番号８３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号８６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｇ）配列番号９４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号９６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号９９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｈ）配列番号１０５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１０７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１０９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｉ）配列番号１１５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１１８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｊ）配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１２８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｋ）配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１３９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１４０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｌ）配列番号１５２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、及び
（ｍ）配列番号１６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１７０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１７２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３
からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことも想定される。

【0037】

前記態様によれば、収集された二重特異性抗体製品は、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）に含まれることが想定される。
前記態様によれば、ＨＣＣＦは、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は工程（ｉｉｉ）のみから得られることが想定される。

【0038】

前記態様によれば、ＨＣＣＦは、室温で、例えば１、２、３、４、５、６、１２ ２４、３６、４８、７２、９６、１２０及び／又は１４４時間刻みで、又は連続的に回収され、さらなる処理、例えば、二重特異性抗体製品を捕捉するために下流工程に渡されることが想定される。

【0039】

前記態様によれば、下流工程は、捕捉クロマトグラフィー、ウイルス不活性化及び／又はポリッシング工程を含むことが想定される。
前記態様によれば、灌流培養は、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８日間、最も好ましくは少なくとも３５日間、規定の細胞比灌流量で供給し、バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、生物量設定値を維持することによって連続的に行われていることが想定される。

【0040】

本発明の別の態様では、少なくとも生物量制御デバイス、ＤＯ制御デバイス及びレベル制御デバイス、並びに灌流流量調節デバイスを有する注入口、並びに細胞保持デバイス及びＨＣＣＦ流量調節デバイスを有する放出口を備える灌流バイオリアクターを含む、図１に示されるとおりの本発明の連続製造方法を実施するための構成又は装置を提供することが想定される。この構成は、制御された灌流流量（灌流量）でバイオリアクターに汲み出される灌流培地を含み得る。その中で、酸素レベル（ＤＯ）、温度、ｐＨ、生物量（容量）及び液体レベル（レベル）が制御される。過剰な細胞は、セルブリードとして分離され得る。収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）は、液体を、０．２μｍフィルターを含み得る細胞保持デバイスに通すことによってバイオリアクターから分離することによって得られる。好ましくは、無細胞ＨＣＣＦは、さらに下流の処理に渡される前に保管容器に回収され得る。

【0041】

本発明の別の態様では、本発明の連続的な上流製造プロセスによって生産される二重特異性抗体製品が想定される。
本発明の別の態様では、ＣＭよりも短い期間でありながら、本明細書で提示されるとおりのものと同等の品質の製品特性を有利にもたらすフェドバッチ及び灌流の複合型の方法が想定される。今度は、製品の量はより少なく、ＦＢとほぼ同等である。好ましくは、バイオリアクター中の製品濃度が低いほど、本発明によるＣＭプロセスと同様により良好な製品品質をもたらす。しかしながら、細胞培養期間は最小化される。このような本発明による複合型のプロセスは、（ｉ）播種から約７日目までのフェドバッチ、（ｉｉ）その後の、好ましくは収集のために交互のタンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システムを使用する短い灌流培養の期間（ＣＭと同等）のプロセス工程を含む。製品の除去は、製品濃度の低下及び製品品質の向上のために、本発明によるＣＭプロセスと同様の方法で実施されることが好ましい。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】本発明による連続製造プロセスの１つの構成を示す。この構成は、制御された灌流流量（灌流量）でバイオリアクターに汲み出される灌流培地を含む。その中で、酸素レベル（ＤＯ）、温度、ｐＨ、生物量（静電容量）及び液体レベル（レベル）が制御される。過剰な細胞は、セルブリードとして分離され得る。収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）は、液体を、０．２μｍフィルターを含み得る細胞保持デバイスに通すことによってバイオリアクターから分離することによって得られる。好ましくは、無細胞ＨＣＣＦは、さらに下流の処理に渡される前に保管容器に回収され得る。

【図2】それぞれＣＤ１９ＸＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのフェドバッチ（「＋」）及び連続製造（白丸）に関する（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度（ＶＣＤ）（１０＾５細胞／ｍＬ）、（Ｂ）培養時間に応じた培養細胞株の細胞のパーセンタイル生存率、並びに（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。それぞれ、実線はＣＭ値の平均を表し、点線はフェドバッチ値の平均を表す。ＧＳ－ＫＯ宿主に由来する同じＣＨＯ細胞株が、両方のプロセス形式のために使用された。

【図3】それぞれＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのフェドバッチ（「＋」）及び連続製造（白丸）に関する（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度（ＶＣＤ）（１０＾５細胞／ｍＬ）、（Ｂ）培養時間に応じた培養細胞株の細胞のパーセンタイル生存率、並びに（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。それぞれ、実線はＣＭ値の平均を表し、点線はフェドバッチ値の平均を表す。ＤＨＦＲ欠損宿主に由来する同じＣＨＯ細胞株が、両方のプロセス形式のために使用された。

【図4】ＣＭ浸透液（白丸）及びＦＢ上清（「＋」）試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト製品単量体（％）を示す。それぞれ、実線はＣＭ値の平均を表し、点線はフェドバッチ値の平均を表す。

【図5】それぞれＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体のフェドバッチ（「＋」）及び連続製造（白丸）に関する（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度（ＶＣＤ）（１０＾５細胞／ｍＬ）、（Ｂ）培養時間に応じた培養細胞株の細胞のパーセンタイル生存率、並びに（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。それぞれ、実線はＣＭ値の平均を表し、点線はフェドバッチ値の平均を表す。ＤＨＦＲ欠損宿主に由来する同じＣＨＯ細胞株が、両方のプロセス形式のために使用された。

【図6】それぞれＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのフェドバッチ（白三角）及び連続製造（ＣＭ－Ａ：〇；ＣＭ－Ｂ：＋；ＣＭ－Ｃ：◇；ＣＭ－Ｄ：×）に関する（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度（ＶＣＤ）（１０＾５細胞／ｍＬ）、（Ｂ）培養時間に応じた培養細胞株の細胞のパーセンタイル生存率、並びに（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。連続製造下でのＶＣＤ設定値は、それぞれ１２．８＊１０＾５（ＣＭ－Ａ）、３２．０＊１０＾５（ＣＭ－Ｂ）、４９．２＊１０＾５（ＣＭ－Ｃ）及び６４．８＊１０＾５（ＣＭ－Ｄ）細胞値であり、４つの異なる製品濃度を得た。各プロセスの平均は、それぞれ実線、破線又は点線で示される。ＧＳ－ＫＯ宿主に由来する同じＣＨＯ細胞株（クローンＡ）が、両方のプロセス形式のために使用された。

【図7】ＣＭ浸透液及びＦＢ上清試料における製品濃度に応じたＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの製品単量体（％）を示す。処理されたＣＭは、４つの異なる生物量設定値を含み（ＣＭ－Ａ：〇；ＣＭ－Ｂ：＋；ＣＭ－Ｃ：◇；ＣＭ－Ｄ：×）、４つの異なる製品濃度を得た。

【図8】フェドバッチ（ＦＢ）又はそれぞれ１２．８＊１０＾５（ＣＭ－Ａ）、３２．０＊１０＾５（ＣＭ－Ｂ）、４９．２＊１０＾５（ＣＭ－Ｃ）及び６４．８＊１０＾５（ＣＭ－Ｄ）細胞のＶＣＤ設定値を有する４つの異なる濃度を得る連続製造（ＣＭ－ｘ）のいずれかによって生産されたＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（クローンＡ）に関する（Ａ）パーセンタイル高分子量画分、（Ｂ）パーセンタイル低分子量画分及び（Ｃ）パーセンタイルメインピーク画分を示す。ＧＳ－ＫＯ宿主に由来する同じＣＨＯ細胞株（クローンＡ）が、両方のプロセス形式のために使用された。

【図9】５種類の二重特異性抗体製品ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＨＬＥ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト及びＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトに関する、高分子量（ＨＭＷ、％）の増加と製品濃度の増加との相関を示す。

【図10】ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（ＣＨＯ細胞株クローンＢ）のＦＢ及びＣＭプロセスの比較を示す。（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度；（Ｂ）培養時間に応じた生存率；（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度。

【図11】ＦＢ及びＣＭプロセスにおけるＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（クローンＢ）ＳＥＣ高分子量（ＨＭＷ）及び低分子量（ＬＭＷ）の比較を示す。

【図12】ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（クローンＢ）複合型－３Ｄ－１ＶＶＤ １０－日及び従来のＦＢプロセスの比較を示す。（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度；（Ｂ）培養時間に応じた生存率。

【図13】ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥ抗体コンストラクトのＦＢ及びＣＭプロセスの比較を示す。（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度；（Ｂ）培養時間に応じた生存率；（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度。

【図14】ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのＦＢ及びＣＭプロセスの比較を示す。（Ａ）培養時間に応じた生細胞密度；（Ｂ）培養時間に応じた生存率；（Ｃ）培養時間に応じた製品濃度。

【図15】細胞培養期間（日）にわたる３つのＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトについてのＣＭプロセスからの浸透液ＨＣＣＦ及びバイオリアクター上清試料（細胞培養液由来）に関する製品濃度及びＳＥＣ ＨＭＷレベルの比較を示す。試料は、バイオリアクター上清（白丸）又はフィルター浸透液ＨＣＣＦ（黒丸）から得られる。

【発明を実施するための形態】

【0043】

治療用タンパク質、特に、二重特異性抗体を製造するための連続的なプロセスが本明細書で提供される。本発明は、上流プロセスを、二重特異性抗体の製造の特定の要求に合わせることが想定される。前記上流プロセスは、当技術分野で知られる標準的なフェドバッチ製造による解決策と比較して、生産性の向上及びスペースに関する要件の縮小に寄与するだけではない。さらに、本連続製造プロセス（好ましくは、連続的な上流製造プロセス）は、二重特異性抗体のために特別に適合されており、より高い製品品質、すなわち、フェドバッチ製造に対してより高い単量体含量の点から、凝集した二重特異性抗体の減少をもたらすことが想定される。また、本連続製造プロセスは、当業者に知られるフェドバッチ製造プロセスよりも少ない化学修飾、少ないクリッピング、少ないプロセスに関連する不純物を有利にもたらす。特定の製造上の利点として、本明細書では平均ＨＣＣＦ一日生産性とも称される同じ細胞型に基づく経時的生産量は、当業者に知られるフェドバッチプロセスと比較して、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、さらにより好ましくは少なくとも６倍に増加する。

【0044】

バイオリアクター内の特定の低い製品濃度が決定的に凝集体の回避、すなわち、製品のより高い相対的及び／又は絶対的な単量体濃度に寄与することが判明した。これは、製品の品質を確保し、プロセスの全体的な経済性を高めるために必須である。上流で生成される凝集体が少ないほど、下流で除去される必要のある不良品が少ない。３．５ｇ／ｌ未満の製品濃度は、凝集の可能性が低いことと関連する。上流プロセス全体で最大製品濃度が１．２ｇ／ｌ未満に保たれる場合、製品品質はさらに向上する。０．５又はさらに０．３ｇ／Ｌ未満の製品濃度がさらに好ましい。１ｖｖｄ又は好ましくは少なくとも２ｖｖｄ以上の十分に高い灌流量を確保することにより、好ましくは凝集体を含まない製品の経済的に有利な生産率が達成され得る。これは、全長抗体であるか（一本鎖）二重特異性抗体コンストラクトなどの非全長抗体であるかにかかわらず、全ての二重特異性抗体製品に適用される。

【0045】

本発明の文脈における別の驚くべき態様は、好ましい製品の品質及び量を得るために、ＶＣＤに対して灌流量を適合させることが二重特異性抗体製品のために好ましいという事実である。これに関して、灌流量は、好ましい設定値に達するまで、播種後に連続的に、徐々に又は漸増的に増加される。通常、前記設定値は、生物量設定値が、少なくとも３５×１０＾６細胞／ｍＬ、好ましくは少なくとも６５×１０＾６細胞／ｍＬ、より好ましくは少なくとも７１×１０＾６細胞／ｍＬ、及び最も好ましくは少なくとも８５×１０＾６細胞／ｍＬの平均生細胞密度（ＶＣＤ）に等しいときに到達される。通常、同じプロセスにおいて到達した最大ＶＣＤに対してＶＣＤが低い限り、灌流量は低い値に設定される。例えば、ＶＣＤが約０．５×１０＾６細胞に等しい場合、灌流量は約０．４ｖｖｄという低さでもよい。しかしながら、バイオリアクター中での細胞増殖によりＶＣＤが増加するにつれて、灌流量は、０．４ｖｖｄから２ｖｖｄへと例えば連続的に、徐々に又は漸増的に増加され得るが、その時、例えば、３５×１０＾６細胞／ｍＬの生物量設定値に達する。好ましくは、灌流量が増加されるほど、生物量設定値が高くなる。例えば、生物量設定値が、例えば、少なくとも６５×１０＾６細胞／ｍＬ、より好ましくは少なくとも７１×１０＾６細胞／ｍＬ、及び最も好ましくは少なくとも８５×１０＾６細胞／ｍＬであるとき、ｖｖｄは、少なくとも２、好ましくは少なくとも２．０１、３、４、５、６、又はさらに６．４に設定され得る。

【0046】

また、好ましくは、本発明の工程（ｉｉｉ）で生物量設定値に到達した後、ＶＣＤは一定に保たれ、それに応じて、灌流量も同様に一定に保たれることが好ましい。また、本発明の文脈において、連続的に測定されるＶＣＤに応じて、連続製造プロセスを通して灌流量が調整されることも想定される。ＶＣＤは、容易に利用でき、且つ信頼性の高いパラメータであると理解される。積分された生細胞密度（ＩＶＣＤ）は、時間に応じたＶＣＤに関する曲線下面積として本明細書では理解される。それによって、例えば、一定の細胞比灌流量（ＣＳＰＲ、１日当たりの細胞当たりのｎＬ）が維持されることが好ましい場合があり、これは、製品の品質への負の影響を回避するために、バイオリアクター中の制御された製品濃度に寄与し得る。

【0047】

結果として、制御され且つ好ましくは低い製品濃度（例えば、好ましくは、全長二重特異性抗体では１．２ｇ／ｌ未満、好ましくは、ＨＬＥ二重特異性抗体コンストラクトでは０．４ｇ／ｌ未満、及び好ましくは、本発明による非ＨＬＥ二重特異性抗体コンストラクトでは０．１２ｇ／ｌ未満）が、連続的な上流製造プロセスを通して確保されることにより、凝集、クリッピング又は他の化学的劣化によって影響される製品が少なくなる。

【0048】

本発明の文脈において、ＣＳＰＲは、平均ＶＣＤ（ＣＶ、すなわち、１ｍＬ当たりの平均生細胞数）に対する灌流量Ｄ（１日当たりのバイオリアクター用量）の比率として理解される。

【0049】

【数1】

【0050】

また、本発明の文脈において、細胞密度にかかわらず、一貫した微小環境が細胞培養中の細胞に提供されることが好ましいことが理解される。したがって、培地は、細胞密度に比例した速度で交換されることが好ましい。好ましいＣＳＰＲに基づいて灌流量を適用することによって、細胞密度に好ましい灌流量になる。

【0051】

本発明の文脈において、ＣＳＰＲは、オンラインの生物量測定を伴う制御ステーションによって自動的に適用されてもよい。これにより、好ましくは、ＣＶの変動に応答したＤの微量且つ／又は安定した調節が可能になる。このような安定した、すなわち、連続的な応答が、段階的な、すなわち、漸増的又は不連続的なＤの変化の代わりに好ましい場合がある。最小ＣＳＰＲは、細胞の要求を満たす最小量の栄養素を送達し、且つ高い生産性を助ける量である。最小ＣＳＰＲ又は最小ＣＳＰＲに近いＣＳＰＲの適用は、高細胞密度、例えば、高細胞密度培養（ＨＣＤＣ）において特に実用的に重要である。本発明の文脈において、ＨＣＤＣは、例えば、少なくとも６５×１０＾６細胞／ｍＬ、好ましくは少なくとも７１×１０＾６細胞／ｍＬ又はさらに少なくとも８５×１０＾６細胞／ｍＬのＶＣＤを有する細胞培養を対象とする。ＨＣＤＣは、少なくとも１００×１０＾６細胞／ｍＬのＶＣＤを有し得ることも想定される。

【0052】

本発明の文脈における典型的な最小ＣＳＰＲは、０．０１ｎｌ／細胞－日である。全ての二重特異性抗体に共通する好ましい範囲内で、一部は、最高の製品品質のためにさらに好ましい値を有する。例えば、本発明の文脈において、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＣＳＰＲは、好ましくは０．０４ｎｌ／細胞－日未満、より好ましくは０．０２８ｎｌ／細胞－日以下である。ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトなどのＣＤ３を標的とするＩ２Ｃドメイン（配列番号２６）を含む二重特異性抗体コンストラクトに関して、ＣＳＰＲは、好ましくは０．０２８ｎｌ／細胞－日以下又は少なくとも０．０５１ｎｌ／細胞－日、より好ましくは０．０６～０．１ｎｌ／細胞－日である。ＴＮＦ－α×ＴＬ１Ａ二重特異性抗体などの全長二重特異性抗体に関して、ＣＳＰＲは、好ましくは０．０２８ｎｌ／細胞－日以下又は少なくとも０．０５１ｎｌ／細胞－日、より好ましくは０．０６～０．１ｎｌ／細胞－日である。

【0053】

本発明の文脈において、「細胞培養」又は「培養」は、多細胞生物又は組織の外部での細胞の増殖及び繁殖を意味する。哺乳動物細胞に好適な培養条件は、当技術分野において知られている。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁液中で又は固形の培養基に付着されながら培養され得る。

【0054】

用語「哺乳動物細胞」は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、雌ウシ、又はウサギ）からの又はそれに由来する任意の細胞を意味する。例えば、哺乳動物細胞は、不死化細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、分化細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、未分化細胞である。哺乳動物細胞の非限定的な例は、本明細書に記載される。本発明の文脈における哺乳動物細胞の好ましい型は、ＧＳ－ＫＯ細胞である。哺乳動物細胞のさらなる例は，当技術分野において知られる。

【0055】

本明細書で使用する場合、用語「細胞培養培地」（「培養培地」、「細胞培養培地」、「組織培養培地」とも呼ばれる）は、細胞、例えば、動物又は哺乳動物の細胞を増殖させるために使用される任意の栄養液を指し、これは一般に、次の：エネルギー源（通常はグルコースなどの炭水化物の形態）；全ての必須アミノ酸、及び一般に２０種類の塩基性アミノ酸にシステインを加えたもののうちの１種以上；ビタミン及び／又は典型的には低濃度で必要とされる他の有機化合物；脂質又は遊離脂肪酸；並びに例えば、一般的にはマイクロモル濃度の範囲内の非常に低い濃度で通常必要とされる微量元素、例えば、無機化合物又は天然に存在する元素から少なくとも１つ以上の成分を提供する。

【0056】

細胞培養培地としては、限定されないが、細胞のバッチ、拡張バッチ、フェドバッチ及び／又は灌流若しくは連続培養などの任意の細胞培養プロセスにおいて通常利用され、且つ／又はそれとの使用に関して知られるものが挙げられる。

【0057】

「増殖」細胞培養培地又はフィード培地は、通常、指数増殖の期間、「増殖期」の間の細胞培養において使用され、この期の間の細胞培養を助けるのに十分に完全である細胞培養培地を指す。増殖細胞培養培地はまた、宿主細胞株に組み込まれた選択可能マーカーに耐性又は生存を付与する選択薬剤を含有してもよい。このような選択薬剤としては、ジェネテシン（Ｇ４１１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシミン、メトトレキセート、グルタミンを含まない細胞培養培地、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠くか、又はチミジンのみを欠く細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

「生産」細胞培養培地又はフィード培地は、指数増殖が終了する移行期の間、並びにタンパク質産生が優勢になるその後の移行期及び／又は生産期の間に細胞培養に通常使用される細胞培養培地を指す。そのような細胞培養培地は、この期の間の所望の細胞密度、生存率及び／又は製品力価を維持するのに十分に完全である。

【0059】

「灌流」細胞培養培地又はフィード培地は、灌流又は連続培養法によって維持され、且つこのプロセスの間に細胞培養を助けるのに十分に完全である細胞培養において通常使用される細胞培養培地を指す。灌流細胞培養培地配合物は、使用済み培地を除去するために使用される方法に対応するために、基本の細胞培養培地配合物よりも富んでいてもよいし、より濃縮されていてもよい。灌流細胞培養培地は、増殖期及び生産期の両方で使用され得る。

【0060】

用語「０．５×量」は、約５０％の量を意味する。用語「０．６×量」は、約６０％の量を意味する。同様に、０．７×、０．８×、０．９×、及び１．０×は、それぞれ約７０％、８０％、９０％、又は１００％の量を意味する。

【0061】

用語「培養」又は「細胞培養」は、制御された一連の物理的条件下での哺乳類細胞の維持又は増殖を意味する。
用語「哺乳動物細胞の培養物」は、制御された一連の物理的条件下で維持又は増殖される複数の哺乳動物細胞を含有する液体培養培地を意味する。

【0062】

用語「液体培養培地」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）をインビトロで成長又は増殖させるのに十分な栄養素を含有する液体を意味する。例えば、液体培養培地は、アミノ酸（例えば、２０種類のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルビン酸、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、及び炭酸水素ナトリウムのうちの１つ以上を含有し得る。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清を含有し得る。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清又は別の抽出物を含有しない（規定の液体培養培地）。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモン、及び／又は哺乳動物増殖因子を含有し得る。液体培養培地の別の例は、最小培地（例えば、無機塩、炭素源、及び水のみを含有する培地）である。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書に記載される。液体培養培地のさらなる例は、当技術分野において知られており、市販されている。液体培養培地は、任意の密度の哺乳動物細胞を含有し得る。例えば、本明細書で使用する場合、バイオリアクターから除去される液体培養培地の体積は、哺乳動物細胞を実質的に含まないものであり得る。

【0063】

本発明の文脈における「バイオリアクター」は、少なくとも本発明の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）が行われる灌流細胞培養を実施するのに好適な容器を指す。バイオリアクターは、例えば、プラスチック材料からなる使い捨ての容器であってもよいし、例えば、ステンレス鋼からなる再利用可能な容器であってもよい。

【0064】

用語「撹拌」とは、バイオリアクター内の液体培養培地の一部をかき混ぜるか又はその他の方法で動かすことを意味する。これは、例えば、バイオリアクター内の液体培養培地中の溶存Ｏ２濃度を増大させるために実施される。撹拌は、当技術分野で知られる任意の方法、例えば、機器又はプロペラを用いて実施され得る。バイオリアクター内の液体培養培地中の一部の撹拌を実施するために使用され得る例示的なデバイス及び方法は、当技術分野において知られている。

【0065】

用語「連続的なプロセス」は、系の少なくとも一部を介して液体を連続的に供給するプロセスを意味する。例えば、本明細書に記載される例示的な連続的な生物学的製造系のいずれかにおいて、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地は、系の稼働中に系に連続的に供給され、治療用タンパク質原体が系から供給される。

【0066】

用語「フェドバッチバイオリアクター」は、技術用語であり、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含有するバイオリアクターを意味し、バイオリアクター中に存在する細胞の培養は、細胞培養物からの第１の液体培養培地又は第２の液体培養培地の実質的又は大幅な除去を伴わない、第１の液体培養培地に対する第２の液体培地の周期的又は連続的な添加を含む。第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じであってもよい。フェドバッチ培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態である。フェドバッチ培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、乾燥粉末として添加される。

【0067】

用語「クリッピング」は、通常はタンパク質分解による、発現されたタンパク質の部分的な切断を意味する。
用語「分解」は一般に、ペプチド又はタンパク質などの、より大きい実体の少なくとも２つのより小さい実体への崩壊を意味し、そのうちの１つの実体は、他の実体又は実体（複数）よりも著しく大きい場合がある。

【0068】

用語「脱アミド」は、典型的にはアスパラギン又はグルタミンなどのアミノ酸の側鎖のアミド官能基が、除去されるか又は別の官能基に変換される任意の化学反応を意味する。通常、アスパラギンは、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸に変換される。

【0069】

用語「凝集」は一般に、例えば、ファンデルワールス力又は化学結合を介する分子間の直接的な相互引力を指す。特に、凝集は、蓄積し、塊になっているタンパク質として理解される。凝集体は、非晶質凝集体、オリゴマー、及びアミロイド線維を含んでもよく、典型的には、高分子量（ＨＭＷ）種、すなわち、典型的には、本明細書では低分子量（ＬＭＷ）種又は単量体とも呼ばれる非凝集分子である純粋な製品分子よりも高い分子量を有する分子として参照される。

【0070】

酸性種は通常、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）ゲル電気泳動、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）及びアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）などの電荷に基づく分離技術によって抗体を分析する際に一般に観察されるバリアントに含まれると本明細書で理解される。これらのバリアントは、主要な種と比較して酸性種又は塩基性種と呼ばれる。抗体がＩＥＦに基づく方法を用いて分析されるとき、酸性種は通常、低い見かけのｐＩを有するバリアントであり、塩基性種は、高い見かけのｐＩを有するバリアントである。

【0071】

用語「滞留時間」は通常、特定の製品分子がバイオリアクター中に存在する時間、すなわち、そのバイオテクノロジーによる生成からそのバイオリアクターの内腔からの分離までに及ぶ時間を指す。

【0072】

「製品品質」は通常、クリッピング、分解、脱アミド及び／又は凝集の有無によって評価される。例えば、４０％未満、好ましくは３５％未満、又はさらに３０％未満、２５％未満又は２０％未満のＨＭＷ種のパーセンタイル含量を含む製品（分子）が、好ましい製品品質と考えられ得る。また、好ましい製品品質は、フェドバッチプロセスなどの本発明のプロセスとは異なるプロセスによって製造された製品と比較して、残留性の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の本質的な欠如並びにクリッピング、分解及び脱アミドの本質的な欠如、又はＨＣＰ濃度、クリッピング、分解及び／又は脱アミドの著しい減少を伴う。本発明の文脈において製品品質を評価するための当技術分野において知られる方法は、電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、化学修飾に関するトリプシンペプチドマッピング、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＲＣＥ－ＳＤＳ）、及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を含む。

【0073】

用語「抗体製品」は、「分泌されたタンパク質」又は「分泌された組換えタンパク質」を指し、哺乳動物細胞内で翻訳される際に少なくとも１つの分泌シグナル配列を元々含有し、且つ少なくとも部分的に哺乳動物細胞内での分泌シグナル配列の酵素的切断を介して、少なくとも部分的に細胞外空間（例えば、液体培養培地）に分泌されるタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を意味する。当業者は、「分泌された」タンパク質が、分泌されたタンパク質とみなされるために、細胞から完全に解離する必要はないことを理解するであろう。

【0074】

二重特異性抗体製品という用語は、全長、例えば、ＩｇＧに基づく抗体及びそのフラグメントなどの二重特異性抗体を包含し、これらは通常本明細書で二重特異性抗体コンストラクトと呼ばれる。

【0075】

用語「抗体コンストラクト」は、その構造及び／又は機能が、抗体、例えば全長又は完全免疫グロブリン分子（通常、２つのトランケートされていない重鎖及び２つの軽鎖で構成される）の構造及び／若しくは機能に基づき、且つ／又は抗体若しくはそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから抽出される分子を指す。したがって、抗体コンストラクトは、その特異的な標的又は抗原に結合することができる。さらに、本発明による結合パートナーに結合するドメインは、本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインとして本明細書で理解される。通常、本発明による結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義され得る。抗体の最小構造要件を定義する代替の手法は、特異的な標的の構造、それぞれエピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメイン（エピトープクラスター）内での抗体のエピトープの定義であるか、又は定義された抗体のエピトープと競合する特異的な抗体を参照することによる。本発明によるコンストラクトが基づく抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。

【0076】

本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインは、例えば、上で参照されたグループのＣＤＲを含み得る。好ましくは、それらのＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク内に含まれるが、それが両方を含む必要はない。Ｆｄフラグメントは、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体フラグメント、抗体バリアント又は結合ドメインの形式についてのさらなる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリ由来のもの）。本発明による抗体コンストラクトの実施形態の例は、例えば、国際公開第００／００６６０５号パンフレット、国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレット、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３７８３８号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３７号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、国際公開第２０１４／１５１９１０号パンフレット、及び国際公開第２０１５／０４８２７２号パンフレットにおいて記載される。

【0077】

「結合ドメイン」又は「～に結合するドメイン」の定義には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は「ｒＩｇＧ」（「半抗体」）などの全長抗体のフラグメントも含まれる。本発明による抗体コンストラクトは、抗体バリアントとも呼ばれる、抗体の改変されたフラグメント、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ又はｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ_３、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ、「マルチボディ」、例えばトリアボディ又はテトラボディ及び単一ドメイン抗体、例えばナノボディ又は他のＶ領域若しくはドメインに非依存的に抗原若しくはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ若しくはＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体も含み得る。

【0078】

本明細書で使用する場合、用語「一本鎖Ｆｖ」、「一本鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖及び軽鎖の両方の由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く単一ポリペプチド鎖抗体フラグメントを指す。通常、一本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメイン間において、抗原への結合を可能にする所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体は、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎによって詳細に議論されている。一本鎖抗体を作製する様々な方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書；国際特許出願公開国際公開第８８／０１６４９号パンフレット；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１に記載されるものを含む。特定の実施形態において、一本鎖抗体は、二重特異性、多重特異性、ヒト及び／若しくはヒト化並びに／又は合成性でもあり得る。

【0079】

さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、一価、二価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）コンストラクト、したがって２つのみの抗原性構造に特異的に結合する二重特異性コンストラクト並びに異なる結合ドメインを通じて３つ以上の抗原性構造、例えば３つ、４つ以上に特異的に結合する多重特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）コンストラクトを含む。さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、１つのみのポリペプチド鎖からなる分子及び鎖が同一（ホモ二量体、ホモ三量体若しくはホモオリゴマー）であるか、又は異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体若しくはヘテロオリゴマー）かのいずれかであり得る２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上記で特定された抗体及びそのバリアント又は誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ２００９に記載されている。

【0080】

本明細書で使用する場合、用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを指し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインは、１つの抗原又は標的（ここで、標的細胞の表面抗原）に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的（例えば、ＣＤ３）に結合する。したがって、本発明による抗体コンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を備える。例えば、第１のドメインは、好ましくは、本明細書に記載される種の１つ以上のＣＤ３εの細胞外エピトープに結合しない。用語「標的細胞の表面抗原」は、細胞によって発現され、且つ本明細書に記載される抗体コンストラクトがアクセスできるようにその細胞表面に存在する抗原性構造を指す。それは、タンパク質、好ましくはタンパク質の細胞外部分又は糖質構造、好ましくは糖タンパク質などのタンパク質の糖質構造であり得る。それは、腫瘍抗原であることが好ましい。本発明の用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。

【0081】

本発明による抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、それらは、天然に存在せず、且つそれらは、天然に存在する産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体コンストラクト又は免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。二重特異性抗体コンストラクトは、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）を参照されたい。

【0082】

本発明の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及びもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーは、第３のドメインを本発明の抗体コンストラクトの他のドメインに融合するためにも使用され得る。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、それがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。ペプチドリンカーは、他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体コンストラクトに結合するためにも使用され得る。

【0083】

本発明の抗体コンストラクトは、「インビトロで作製された抗体コンストラクト」であることが好ましい。本用語は、可変領域の全て又は一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ又は抗原結合能に関して候補配列を試験することができる任意の他の方法において作製される、上記定義による抗体コンストラクトを指す。したがって、本用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ作製される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学の使用により作製された抗体である。

【0084】

本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又はモノクローナル抗体コンストラクトは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。

【0085】

モノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養により産生される抗体をもたらす任意の技術を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が挙げられる。

【0086】

次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、その任意のバリアント又はフラグメント並びにその抗原性ペプチドなど、任意の形態の関連抗原が免疫原として使用され得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的細胞の表面抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７－１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。

【0087】

モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）において記載される。

【0088】

ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きいフラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、米国特許出願公開第２００３－００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。

【0089】

モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得た後、当技術分野で知られる組換えＤＮＡ技術を用いて、例えばヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うこともできる。改変抗体コンストラクトの例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１）を参照されたい）及びエフェクター機能が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照されたい）が挙げられる。

【0090】

免疫学において、親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性の増大した抗体をＢ細胞が産生するプロセスである。同一抗原への反復暴露により、宿主は、親和性が連続的に増大する抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、変異と選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を問題なく使用して、抗体、抗体コンストラクト及び抗体フラグメントを最適化している。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原又はエラープローンＰＣＲを用いて導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェイン・シャッフリング法によって増大させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが得られる。

【0091】

抗体コンストラクトの好ましいタイプのアミノ酸置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴うものである。一般に、さらなる開発のために選択されて得られるバリアントは、それらが生成された親抗体と比べて向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換バリアントを生成するための簡便な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性成熟が含まれる。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）は、それぞれの部位で可能な全てのアミノ酸置換が生じるように変異される。そのようにして生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次に、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるとおりにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング変異導入法を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。代わりに又は加えて、結合ドメインと例えばヒト標的細胞の表面抗原との接触点を同定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換の候補である。そのようなバリアントを生成してから、バリアントのパネルに対して、本明細書に記載されるとおりのスクリーニングを施し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択し得る。

【0092】

本発明のモノクローナル抗体及び抗体コンストラクトは、特に重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な方法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。

【0093】

抗体、抗体コンストラクト、抗体フラグメント又は抗体バリアントは、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット又は国際公開第００／３４３１７号パンフレットの実施例に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても改変され得る。簡潔に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに定義される）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに記載されるとおり、「ペプチドスレッディング法」と呼ばれるコンピュータモデリング手法を適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースにおいて、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合するため、潜在的なＴ細胞エピトープとなる。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は好ましくは単一のアミノ酸置換により除去することができる。通常、保存的置換がなされる。全てではないが多くの場合、ヒト生殖細胞系列の抗体配列内の位置に共通するアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖細胞系列配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７－２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８－４６３８において開示される。Ｖ ＢＡＳＥ総覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる編集）。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されるコンセンサスヒトフレームワーク領域を使用することもできる。

【0094】

「ヒト化」抗体、抗体コンストラクト、バリアント又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、大部分がヒト配列である抗体又は免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲともいう）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ハムスター又はウサギなどの非ヒト（例えば齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させ、最適化するためになされる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む場合がある。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。

【0095】

ヒト化抗体又はそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価な配列で置換することによって生成することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４並びに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，８５９，２０５号明細書及び米国特許第６，４０７，２１３号明細書により提供される。それらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部分をコードする核酸配列を単離、操作及び発現することを含む。そのような核酸を、上記のとおりの所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ及び他の供給源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡが適切な発現ベクターにクローニングされ得る。

【0096】

ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を用いて作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換されるか又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置換することのみが必要である。

【0097】

ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化することができる。このような改変免疫グロブリン分子は、当技術分野で知られる複数の技術のいずれによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２、及び欧州特許第２３９４００号明細書）。

【0098】

用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体コンストラクト」及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されたものを含む、当技術分野で知られるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域又はドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える位置を有し得る。しかしながら、本明細書で使用する場合、ヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む「完全ヒト抗体」も意図している。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含まない。

【0099】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、「単離された」又は「実質的に純粋な」抗体コンストラクトである。本明細書に開示される抗体コンストラクトを記載するために使用する場合、「単離された」又は「実質的に純粋な」は、その産生環境の成分から同定、分離及び／又は回収された抗体コンストラクトを意味する。好ましくは、抗体コンストラクトは、その産生環境由来の他の全ての成分との会合を有しないか又は実質的に有しない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などのその産生環境の混入成分は、通常、ポリペプチドについての診断又は治療用途を妨げる材料であり、これは、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。抗体コンストラクトは、例えば、所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約５重量％又は少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、環境に応じて総タンパク質含量の５重量％～９９．９重量％を構成し得ると理解される。ポリペプチドが高い濃度レベルで作製されるように、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターの使用によって著しく高濃度でポリペプチドが作製され得る。この定義は、当技術分野で知られる多様な生物体及び／又は宿主細胞での抗体コンストラクトの産生を含む。好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いた非還元若しくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均一性まで精製されることになる。ただし、通常、単離された抗体コンストラクトは、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。

【0100】

用語「結合ドメイン」は、本発明との関係では、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位、例えばそれぞれＣＤ３３及びＣＤ３と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインと見なす。第１の結合ドメイン（例えばＣＤ３３を認識する）の構造及び機能、好ましくは第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／又は機能も、抗体の例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づき、且つ／又は抗体又はそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから抽出される。好ましくは、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる。第２の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列をスキャフォールドに移植する以外のファージディスプレイ又はライブラリスクリーニング法によって作製されるか又は得られることが想定される。

【0101】

本発明によれば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。このようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカー又はグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含み得る。タンパク質（そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント及び通常３０個未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、（アミノ酸の鎖をもたらす）共有ペプチド結合を通じて相互に結合された２つ以上のアミノ酸を含む。

【0102】

本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、通常、３０個を超えるアミノ酸からなる分子群を表す。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高次のオリゴマーなどのマルチマーをさらに形成し、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる場合もある。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても同一でなくてもよい。このようなマルチマーの対応する高次構造は、したがって、ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。本明細書で参照される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペグ化などの化学修飾されたものでもあり得る。このような修飾は、当技術分野でよく知られており、本明細書で以下に記載される。

【0103】

好ましくは、標的細胞の表面抗原に結合する結合ドメイン及び／又はＣＤ３εに結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体コンストラクトは、齧歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター又はウサギ）などの非ヒト可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗体コンストラクトに伴う問題の一部を回避する。このような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体又は抗体コンストラクトの迅速なクリアランスをもたらす可能性があるか、又は患者による抗体又は抗体コンストラクトに対する免疫反応を発生させる可能性がある。齧歯類由来抗体又は抗体コンストラクトの使用を避けるために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒト又は完全ヒト抗体／抗体コンストラクトを生成することができる。

【0104】

ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構築する能力及びそれらをマウス生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きいか又は粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明並びにヒト疾患の有用なモデルの生成にとって強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するそのような技術を使用すれば、発生期のヒト遺伝子産物の発現及び調節、それらと他の系との伝達並びに疾患の誘発及び進行へのそれらの関与について独特の見解を得ることができるであろう。

【0105】

このような戦略の重要な実用化は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が不活性化されたマウスへのヒトＩｇ遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現及び構築並びにＢ細胞の発生におけるそれらの役割の基礎となる機構を研究する機会が得られる。さらに、このような戦略であれば、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンとなる完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製にとって理想的な供給源を得ることができるであろう。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトは、マウスｍＡｂ又はマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化し、それによって投与される抗体／抗体コンストラクトの有効性及び安全性を増大させることが期待される。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトの使用により、化合物の反復投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫及び癌の治療に大幅な利点が得られるものと期待され得る。

【0106】

この目標に向けた手法の１つが、マウス抗体の産生に欠損があるマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いて操作することであり、これは、このようなマウスが、マウス抗体を生じずに広範なレパートリーのヒト抗体を産生するであろうとの予測に立つものであった。大きいヒトＩｇフラグメントは、可変遺伝子の広範な多様性並びに抗体の産生及び発現の適切な調節を保持すると考えられる。抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することにより、これらのマウス系統において再現されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高親和性の抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を使用すれば、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製及び選択することができるであろう。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）を参照されたい）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、可変領域及び定常領域のコア配列を含有したヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列配置フラグメントを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて操作された。このヒトＩｇを含有するＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方に関してマウス系への適合性があることが証明されており、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することが可能であった。これは、それらがＢ細胞の発生を誘導して、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを産生する能力によって実証された。これらの結果は、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫化に対するヒト液性応答を特徴とする実質的に完全なレパートリーを再現し得ることも示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎらの研究を発展させ、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガベースサイズの生殖細胞系列配置ＹＡＣフラグメントの導入により、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超が導入された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６ （１９９７）及び米国特許出願公開第０８／７５９，６２０号明細書を参照されたい。

【0107】

ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの作製は、米国特許出願公開第０７／４６６，００８号明細書、同第０７／６１０，５１５号明細書、同第０７／９１９，２９７号明細書、同第０７／９２２，６４９号明細書、同第０８／０３１，８０１号明細書、同第０８／１１２，８４８号明細書、同第０８／２３４，１４５号明細書、同第０８／３７６，２７９号明細書、同第０８／４３０，９３８号明細書、同第０８／４６４，５８４号明細書、同第０８／４６４，５８２号明細書、同第０８／４６３，１９１号明細書、同第０８／４６２，８３７号明細書、同第０８／４８６，８５３号明細書、同第０８／４８６，８５７号明細書、同第０８／４８６，８５９号明細書、同第０８／４６２，５１３号明細書、同第０８／７２４，７５２号明細書、及び同第０８／７５９，６２０号明細書；並びに米国特許第６，１６２，９６３号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書、及び同第５，９３９，５９８号明細書並びに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号公報、同第３０６８５０６Ｂ２号公報、及び同第３０６８５０７Ｂ２号公報でさらに議論され詳述されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－４９５（１９９８）、欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第００／７６３１０号パンフレット、及び国際公開第０３／４７３３６号パンフレットも参照されたい。

【0108】

別の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，を含む他社が「ミニ遺伝子座」の手法を利用している。このミニ遺伝子座の手法において、外来性Ｉｇ遺伝子座は、このＩｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）を含めることにより模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域及び第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）は、動物に挿入されるコンストラクトを形成する。この手法は、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙのそれぞれに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，６２５，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，７７０，４２９号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書；同第５，７２１，３６７号明細書；及び同第５，７８９，２１５号明細書並びにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書並びにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願公開第０７／５７４，７４８号明細書、同第０７／５７５，９６２号明細書、同第０７／８１０，２７９号明細書、同第０７／８５３，４０８号明細書、同第０７／９０４，０６８号明細書、同第０７／９９０，８６０号明細書、同第０８／０５３，１３１号明細書、同第０８／０９６，７６２号明細書、同第０８／１５５，３０１号明細書、同第０８／１６１，７３９号明細書、同第０８／１６５，６９９号明細書、同第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット及び国際公開第９８／２４８８４号パンフレット並びに米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照されたい。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。

【0109】

Ｋｉｒｉｎも、マイクロセル融合によって大きい染色体片又は染色体全体が導入された、マウスからのヒト抗体の産生を実証した。欧州特許出願公開第７７３２８８号明細書及び同第８４３９６１号明細書を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、有望なヒト抗体産生技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスをヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞で再構成する。その後、マウスは、抗原で免疫化され、その抗原に対する免疫反応を発生させることができる。米国特許５，４７６，９９６号明細書；同第５，６９８，７６７号明細書；及び同第５，９５８，７６５号明細書を参照されたい。

【0110】

ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、産業界がキメラ又は別の方法でヒト化された抗体を作製する要因となった。しかしながら、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応は、特に慢性又は複数回用量での抗体の利用において観察されることになると予想される。したがって、ＨＡＭＡ若しくはＨＡＣＡ反応の懸念及び／又は影響をなくすために、標的細胞の表面抗原に対するヒト結合ドメイン及びＣＤ３εに対するヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトを提供することが望ましいと考えられる。

【0111】

用語「（特異的に）結合する」、（特異的に）認識する」、「（特異的に）誘導される」及び「（特異的に）反応する」は、本発明によれば、結合ドメインが標的分子（抗原）上の所与のエピトープ又は所与の標的部位、すなわち本明細書ではそれぞれ標的細胞の表面抗原及びＣＤ３εと相互作用するか又は特異的に相互作用することを意味する。 用語「エピトープ」は、抗体若しくは免疫グロブリン又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体、フラグメント若しくはバリアントなどの結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、抗原性であり、したがって、エピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称する場合もある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用は、「特異的認識」も定義すると理解される。

【0112】

「エピトープ」は、連続したアミノ酸又はタンパク質の三次元フォールディングによって並列される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、通常、特有の配列内に少なくとも３つ又は少なくとも４つ及びより一般的に少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、例えば約８～約１０のアミノ酸を含む。

【0113】

「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。一般に、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチド若しくはタンパク質又はそれらのフラグメントの三次元構造を認識する（本発明に関連して、結合ドメインの１つに対する抗原性構造が標的細胞の表面抗原タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成する場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／又はポリペプチド骨格が並列した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ－ＮＭＲ）分光分析、及び部位特異的スピンラベル法及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0114】

エピトープマッピングの方法を以下に記載する。ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質の領域（隣接するひと続きのアミノ酸）が、非ヒト及び非霊長類の標的細胞の表面抗原（例えば、マウス標的細胞の表面抗原であるが、他にニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどのものも考えられる）の対応する領域で交換／置換される場合、使用されている非ヒト、非霊長類の標的細胞の表面抗原に対して結合ドメインが交差反応性でない限り、結合ドメインの結合性の低減が起こると予想される。前述の低減は、ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質の対応する領域への結合を１００％とした場合、ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質内の対応する領域への結合と比較して好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％又は８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又はさらに１００％である。上記のヒト標的細胞の表面抗原／非ヒト標的細胞の表面抗原のキメラは、ＣＨＯ細胞において発現されることが想定される。また、ヒト標的細胞の表面抗原／非ヒト標的細胞の表面抗原のキメラは、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合されることも想定される。

【0115】

エピトープマッピングの代替的又は追加の方法では、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、ヒト標的細胞の表面抗原細胞外ドメインのいくつかの短縮型が作製され得る。これらの短縮型では、細胞外の異なる標的細胞の表面抗原ドメイン／サブドメイン又は領域は、Ｎ末端から開始して段階的に欠失される。短縮型の標的細胞の表面抗原は、ＣＨＯ細胞で発現され得ることが想定される。また、短縮型の標的細胞の表面抗原は、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合される場合があることも想定される。また、短縮型の標的細胞の表面抗原は、それらのＮ末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチドを包含する場合があることも想定される。さらに、短縮型の標的細胞の表面抗原は、細胞表面上でのそれらの正確な発現を確認できる（シグナルペプチドに続く）Ｎ末端におけるｖ５ドメインを包含する場合があることも想定される。結合ドメインによって認識される標的細胞の表面抗原領域をもはや包含しない短縮型の標的細胞の表面抗原では、結合の低減又は喪失が起こると予想される。結合の低減は、ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質全体（又はその細胞外領域若しくはドメイン）への結合を１００とした場合、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又はさらに１００％である。

【0116】

抗体コンストラクト又は結合ドメインによる認識に対する標的細胞の表面抗原の特定の残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、分析される各残基を例えば部位特異的変異誘発によってアラニンで置換するアラニンスキャニング（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２－７を参照されたい）である。アラニンが使用される理由は、嵩高くなく、化学的に不活性であり、それでも多くの他のアミノ酸が有している二次構造基準を模倣するメチル官能基を有しているためである。変異される残基のサイズを保存することが望ましい場合、ときにバリン又はロイシンなどの嵩高いアミノ酸が使用され得る。アラニンスキャニングは、長期にわたり使用されてきた成熟した技術である。

【0117】

結合ドメインと、エピトープ又はエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質又は抗原（本明細書では、それぞれ標的細胞の表面抗原及びＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して測定可能な親和性を示し、且つ一般に標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して著しい反応性を示さないことを意味する。「測定可能な親和性」は、約１０^－６Ｍ（ＫＤ）又はそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０^－１２～１０^－８Ｍ、１０^－１２～１０^－９Ｍ、１０^－１２～１０^－１０Ｍ、１０^－１１～１０^－８Ｍ、好ましくは約１０^－１１～１０^－９Ｍである場合、結合を特異的と見なす。結合ドメインが標的と特異的に反応するか又は標的に結合するかどうかは、とりわけ、標的タンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応を標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応と比較することにより、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に本質的に又は実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。他のＨＬＥ形式と比較して優れた親和性特性を有することは、本発明による抗体コンストラクトの想定される特徴である。このような優れた親和性は、結果として、インビボでの半減期の延長を示唆する。本発明による抗体コンストラクトのより長い半減期は、投与期間及び頻度を減少させる場合があり、これは、通常、患者のコンプライアンスの改善に寄与する。これは、特に重要なことであり、なぜなら、本発明の抗体コンストラクトは、非常に衰弱した又はさらに多疾患である癌患者に特に有益であるためである。

【0118】

用語「本質的／実質的に結合しない」又は「結合することができない」は、本発明の結合ドメインが標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に結合せず、すなわち標的細胞の表面抗原又はＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％とした場合、標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の反応性を示さないことを意味する。

【0119】

特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの一次、二次及び／又は三次構造の結果として並びに前記構造の二次的修飾の結果として生じる。抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、抗原に対する前記側の単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、例えば抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化などにより、代替的に又は追加的にシグナルの開始がもたらされ得る。

【0120】

用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対がともに単一の抗原結合部位を形成する。

【0121】

可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して共同で保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい）。

【0122】

用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。すなわち、それらは、抗原特異性の主要な決定基である。

【0123】

ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍを参照されたい（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技術が同一の領域ではなく重複する領域を定義する程度まで、それらを組み合わせて、ハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従う付番が好ましい。

【0124】

通常、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造をポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：８００）。さらに、採用されたループ構造とその周辺のアミノ酸配列との間に関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さにより、及びそのループ内並びに保存的フレームワーク内（すなわちループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。

【0125】

用語「カノニカル構造」は、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲）により分類されるとおり、抗体の線状配列に関する考慮も含み得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるとおり本発明での適用に好ましいスキームである。さらなる構造的な考慮が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合がある。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違をＣｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、且つ／又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、（例えば、種々のカノニカル構造をライブラリに含めるという要求に基づいて）適切なシャーシ配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（前掲）に記載される構造的な考慮並びに抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するそれらの意義については、文献に記載されている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当技術分野でよく知られている。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。

【0126】

軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子となる場合がある。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域になると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させることができるか、又はいずれの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は、通常、抗体結合部位内での分子的多様性の最大の源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基程度の短いもの又は２６個超のアミノ酸であり得る。

【0127】

古典的な全長抗体又は免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接的に関与しないが、抗体依存性細胞性細胞傷害及び補体活性化などの様々なエフェクター機能を呈する。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。

【0128】

構築及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０^１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２^ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体又は一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この配列は、重鎖のＶ、ＤＪセグメント並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再編成によって生成され得る。代わりに、この配列は、再編成を生じさせる、例えばインビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。代わりに、この配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発及び他の方法によって得られる場合がある（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含むか、又は遺伝的に多様なコレクション内のものを含む複数の配列を含み得る。

【0129】

用語「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」は、本発明との関係では、免疫グロブリン分子のＣＨ２ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメイン及びＣＨ３ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを意味する。「Ｆｃ単量体」という用語から明らかなとおり、それらのＣＨドメインを含むポリペプチドは、「ポリペプチド単量体」である。Ｆｃ単量体は、少なくとも重鎖の第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）を除く免疫グロブリンの定常領域のフラグメントを含むが、少なくとも１つのＣＨ２ドメインの機能的部分及び１つのＣＨ３ドメインの機能的部分を維持しており、ＣＨ２ドメインがＣＨ３ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチドであり得る。本定義の好ましい態様において、Ｆｃ単量体は、Ｉｇ－Ｆｃヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、ヒンジ領域がＣＨ２ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチド定常領域であり得る。本発明のヒンジ領域は、二量体化を促進することが想定される。このようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン領域のパパイン消化（当然のことながら、２つのＦｃポリペプチドの二量体を生じる）によって入手され得るが、これに限定されない。本定義の別の態様において、Ｆｃ単量体は、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の一部を含むポリペプチド領域であり得る。このようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって入手され得るが、これに限定されない。一実施形態において、Ｆｃ単量体のポリペプチド配列は、ＩｇＧ_１Ｆｃ領域、ＩｇＧ_２Ｆｃ領域、ＩｇＧ_３Ｆｃ領域、ＩｇＧ_４Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域及びＩｇＥ Ｆｃ領域のＦｃポリペプチド配列と実質的に同様である。（例えば、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９－２１７（１９９３）を参照されたい）。免疫グロブリン間に一定の変種が存在するため、及び単に明確性のために、Ｆｃ単量体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの末尾の２つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメイン並びにＩｇＥ及びＩｇＭの末尾の３つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインを指す。言及されるとおり、Ｆｃ単量体は、これらのドメインのＮ末端側に可動性のヒンジも含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３並びに最初の２つのドメインとＣＨ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ部分の境界は、異なる場合があるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、Ｋａｂａｔに従う付番でＣＨ３ドメインのカルボキシル末端の残基Ｄ２３１（ヒンジドメインの－以下の表１のＤ２３４に相当）～Ｐ４７６、Ｌ４７６（ＩｇＧ_４の場合）をそれぞれ含むように定義され得る。ペプチドリンカーを介して互いに融合される２つのＦｃ部分又はＦｃ単量体は、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインを定義し、これは、ｓｃＦｃドメインとも定義され得る。

【0130】

本発明の一実施形態において、本明細書に開示されるｓｃＦｃドメイン、それぞれ互いに融合されるＦｃ単量体は、抗体コンストラクトの第３のドメインにのみ含まれることが想定される。

【0131】

本発明に一致して、ＩｇＧヒンジ領域は、表１に記述されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。上記に一致して、本発明のヒンジドメイン／領域は、Ｋａｂａｔ付番によるＤ２３４～Ｐ２４３の一続きのＩｇＧ_１配列に相当するアミノ酸残基を含むことが想定される。本発明のヒンジドメイン／領域がＩｇＧ１ヒンジ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１８２）（以下の表１に示される一続きのＤ２３４～Ｐ２４３に相当する － ヒンジ領域がなお二量体化を促進する限り、前記配列の変種も想定される）を含むか又はそれからなることも同様に想定される。本発明の好ましい実施形態において、抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位は、Ｎ３１４Ｘ置換によって除去され、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇ置換である。より好ましい実施形態において、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換をさらに含む（位置は、Ｋａｂａｔに従う）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。

【0132】

本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１８２）（すなわちヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１８２）（すなわちヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３を含むか又はそれからなることも想定される。上記抗体コンストラクトのペプチドリンカーは、好ましい実施形態において、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１８７）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、５又はそれを超える整数（例えば、５、６、７、８など又はそれを超える）であり、６が好ましい（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６）。前記コンストラクトは、上記の置換Ｎ３１４Ｘ、好ましくはＮ３１４Ｇ並びに／又はさらなる置換Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃをさらに含み得る。本明細書に上記で定義される本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、第２のドメインは、ヒト及び／又はマカク（Ｍａｃａｃａ）ＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合することが想定される。

【0133】

【表1】

【0134】

本発明のさらなる実施形態において、ヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ２サブタイプのヒンジ配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１８３）、ＩｇＧ３サブタイプヒンジ配列ＥＬＫＴＰＬＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１８４）若しくはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１８５）及び／又はＩｇＧ４サブタイプヒンジ配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号１８６）を含むか又はそれらからなる。ＩｇＧ１サブタイプヒンジ配列は、次の配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰであってもよい（表１及び配列番号１８３において示される）。したがって、これらのコアヒンジ領域も本発明に関連して想定される。

【0135】

ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＤ３ドメインの位置並びに配列は、表２に記述されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。

【0136】

【表2】

【0137】

本発明の一実施形態では、第１又は両方のＦｃ単量体のＣＨ３ドメイン内の太字で強調表示されたアミノ酸残基は欠失される。
第３のドメインのポリペプチド単量体（「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」）を互いに融合するペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも２５アミノ酸残基（２５、２６、２７、２８、２９、３０など）を含む。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸残基（３０、３１、３２、３３、３４、３５など）を含む。リンカーが最大４０アミノ酸残基を含むことも好ましく、より好ましくは最大３５アミノ酸残基、最も好ましくはちょうど３０アミノ酸残基である。このようなペプチドリンカーの好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１８７）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、５又はそれを超える整数（例えば、６、７又は８）である。好ましくは、整数は、６又は７であり、より好ましくは、整数は、６である。

【0138】

第１のドメインを第２のドメインと融合するために、又は第１若しくは第２のドメインを第３のドメインと融合するためにリンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第１及び第２のドメインの各々が互いに独立してそれらの異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、Ｇｌｙに富んだリンカーが好ましい。第１及び第２のドメインの融合のためのペプチドリンカーの好ましい実施形態は、配列番号１に示される。第２及び第３のドメインを融合するためのペプチドリンカーの好ましいリンカー実施形態は、（Ｇｌｙ）_４－リンカーであり、それぞれＧ_４－リンカーである。

【0139】

上記の「ペプチドリンカー」の１つに関連して特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、上記のペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。本発明の好ましい実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１８７）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、１又はそれより大きい整数（例えば、２又は３）である。好ましいリンカーは、配列番号１～１２に示される。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で知られており、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）に記載されている。いずれの二次構造もさらに促進しないペプチドリンカーが好ましい。上記のドメインの相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子操作によって提供することができる。融合され作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。

【0140】

抗体コンストラクト又は本発明の好ましい実施形態において、第１及び第２のドメインは、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及びそれらの形式のいずれかのオリゴマーからなる群から選択される形式の抗体コンストラクトを形成する。

【0141】

特に好ましい実施形態に従い、且つ付属の実施例において記述されるとおり、本発明の抗体コンストラクトの第１及び第２のドメインは、「二重特異性一本鎖抗体コンストラクト」、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が一価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする、本明細書の上記のとおりの合成リンカーによって結合することができる；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来技術を用いて得られ、且つそのフラグメントは、完全又は全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常、約１０～約２５アミノ酸、好ましくは約１５～２０アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシン及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。

【0142】

二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６に記載されている。一本鎖抗体の作製のために記載された技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）、前掲及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、前掲を参照のこと）は、選出された標的を特異的に認識する一本鎖抗体コンストラクトを作製するために適合され得る。

【0143】

二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性一本鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）_２を有するｂｉ－ｓｃＦｖ又はｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書の上記に記載されるリンカーを用いて）連結することにより作り出すことができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８）。

【0144】

本発明に一致して、第１のドメイン、第２のドメイン又は第１及び第２のドメインは、それぞれ単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体の可変ドメイン又は単一ドメイン抗体の少なくともＣＤＲを含み得る。単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はドメインに非依存的に特異抗原に選択的に結合することができる１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から作り出され、これらは、Ｖ_ＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶ_ＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的な手法は、例えばヒト又は齧歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。

【0145】

したがって、（単一ドメインｍＡｂ）_２は、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｖ_ＨＨ及びＶ_ＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ」は、少なくとも１つの上記の単一ドメイン抗体及び１つの上記のｓｃＦｖ分子から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合も、リンカーは、ペプチドリンカーの形態であることが好ましい。

【0146】

抗体コンストラクトが別の所与の抗体コンストラクトと競合して結合するかどうかは、競合ＥＬＩＳＡ又は細胞を用いた競合アッセイなどの競合アッセイで測定することができる。アビジンを結合したマイクロ粒子（ビーズ）を使用することもできる。アビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させる際、これらのビーズのそれぞれを基材として使用することができ、その上でアッセイを実施することができる。抗原をビーズ上にコーティングし、次に一次抗体でプレコーティングする。二次抗体を添加して、任意のさらなる結合を確認する。読み取りのために可能な手段としては、フローサイトメトリーが挙げられる。

【0147】

Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体白血球の一種）の一種である。Ｔ細胞には、それぞれ異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在する。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在する点で他のリンパ球、例えばＢ細胞及びＮＫ細胞と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と結合するとき、Ｔリンパ球が、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子及び活性化又は放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じて活性化される。

【0148】

ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、関連性の高い免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち略称ＩＴＡＭとして知られる単一の保存的モチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトの第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。最も好ましいＣＤ３イプシロンのエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１～２７の範囲に含まれる。本発明による抗体コンストラクトは、典型的且つ有利には、特異的免疫療法において望ましくない非特異的Ｔ細胞活性化をわずかにのみ示すと想定される。これは、副作用のリスクが低いことになる。

【0149】

多重特異性、少なくとも二重特異性抗体コンストラクトによるＴ細胞の動員を介するリダイレクトされた標的細胞の溶解は、細胞溶解性シナプスの形成並びにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。結合したＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示又はクローナルなＴ細胞分化を妨げる免疫回避機構による影響を受けない（例えば、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレットを参照されたい）。

【0150】

本発明の抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は未刺激の（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源である場合又は第１のドメインによって結合されるマカク標的細胞の表面抗原を発現するか若しくはそれでトランスフェクトされる場合、エフェクター細胞もマカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなどのマカク起源のものであるべきである。標的細胞は、標的細胞の表面抗原、例えばヒト又はマカク標的細胞の表面抗原（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、標的細胞の表面抗原、例えばヒト又はマカク標的細胞の表面抗原で安定的に又は一過的にトランスフェクトされている細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。代わりに、標的細胞は、天然の標的細胞の表面抗原陽性発現細胞株であり得る。通常、ＥＣ_５０値は、細胞表面に高レベルの標的細胞の表面抗原を発現する標的細胞株で低くなると予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であるが、これは、変動し得る。標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、^５１Ｃｒ放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）又はＦＡＣＳを用いた細胞傷害性アッセイ（約４８時間インキュベーション時間）において測定することができる。アッセイのインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者によく知られており、ＭＴＴ又はＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰ系アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含む。

【0151】

本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞を用いた細胞傷害性アッセイで測定される。これは、^５１Ｃｒ放出アッセイでも測定され得る。細胞傷害活性は、ＥＣ_５０値によって表され、これは、半数効果濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体コンストラクトの濃度）に相当する。好ましくは、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ_５０値は、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ、より好ましくは≦３０００ｐＭ又は≦２０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦４００ｐＭ又は≦３００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０ｐＭ又は≦１０ｐＭ及び最も好ましくは≦５ｐＭである。

【0152】

様々なアッセイにおいて、上記の所与のＥＣ_５０値を測定することができる。刺激された／濃縮ＣＤ８^＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合、未刺激のＰＢＭＣと比較してＥＣ_５０値が低くなると予想できることを当業者は認識している。さらに、ＥＣ_５０値は、標的細胞が多数の標的細胞の表面抗原を発現する場合、標的発現の少ないラットと比較して低くなると予想することができる。例えば、刺激された／濃縮ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合（及びＣＨＯ細胞などの標的細胞の表面抗原をトランスフェクトされた細胞又は標的細胞の表面抗原陽性ヒト細胞株のいずれかを標的細胞として使用する場合）、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ_５０値は、好ましくは≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０ｐＭ及び最も好ましくは≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する場合、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ_５０値は、好ましくは、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ（特に標的細胞が標的細胞の表面抗原陽性ヒト細胞株である場合）、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に標的細胞がＣＨＯ細胞などの標的細胞の表面抗原でトランスフェクトされた細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ及び最も好ましくは≦５０ｐＭ又はそれ未満である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株をエフェクター細胞として使用し、ＣＨＯ細胞などのマカク標的細胞の表面抗原でトランスフェクトされた細胞株を標的細胞株として使用する場合、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ_５０値は、好ましくは、≦２０００ｐＭ又は≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭ又は≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ及び最も好ましくは≦５０ｐＭである。

【0153】

好ましくは、本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトは、ＣＨＯ細胞などの標的細胞の表面抗原陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、又は溶解を本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」又は「溶解を本質的に媒介しない」は、標的細胞の表面抗原陽性ヒト細胞株の溶解を１００％とした場合、本発明の抗体コンストラクトが標的細胞の表面抗原陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の溶解を誘導又は媒介しないことを意味する。これは、通常、５００ｎＭまでの抗体コンストラクトの濃度で当てはまる。当業者は、さらなる労力を伴わずに細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書では細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。

【0154】

個々の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの間の細胞傷害活性の差を「効力ギャップ」と称する。この効力ギャップは、例えば、その分子の単量体形態のＥＣ_５０値と二量体形態のＥＣ_５０値との間の比率として算出することができる。本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの効力ギャップは、好ましくは、≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２及び最も好ましくは≦１である。

【0155】

本発明の抗体コンストラクトの第１及び／又は第２の（又は任意のさらなる）結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーにおいて異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載されている。一実施形態によれば、第１及び／又は第２の結合ドメインは、ヒト標的細胞の表面抗原及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル及び非ヒトのヒト亜科動物を含む（ただし、これらに限定されない）霊長類の標的細胞の表面抗原／ＣＤ３にもそれぞれ結合することになる。

【0156】

本発明の抗体コンストラクトの一実施形態において、第１のドメインは、ヒト標的細胞の表面抗原に結合し、且つカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の標的細胞の表面抗原などのマカク標的細胞の表面抗原、より好ましくはマカク細胞の表面で発現されるマカク標的細胞の表面抗原にさらに結合する。マカク標的細胞の表面抗原に対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは、≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ及び最も好ましくは≦０．０５ｎＭ又はさらに≦０．０１ｎＭである。

【0157】

好ましくは、本発明による抗体コンストラクトの、（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ又はスキャッチャード分析により決定される）マカク標的細胞の表面抗原対ヒト標的細胞の表面抗原［ｍａ 標的細胞の表面抗原：ｈｕ 標的細胞の表面抗原］の結合親和性ギャップは、＜１００、好ましくは＜２０、より好ましくは＜１５、さらに好ましくは＜１０、さらにより好ましくは＜８、より好ましくは＜６及び最も好ましくは＜２である。本発明による抗体コンストラクトの、マカク標的細胞の表面抗原対ヒト標的細胞の表面抗原の結合親和性ギャップの好ましい範囲は、０．１～２０、より好ましくは０．２～１０、さらにより好ましくは０．３～６、さらにより好ましくは０．５～３又は０．５～２．５及び最も好ましくは０．５～２又は０．６～２である。

【0158】

本発明の抗体コンストラクトの第２の（結合）ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン及び／又はマカクＣＤ３イプシロンに結合する。好ましい実施形態において、第２のドメインは、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３イプシロンにさらに結合する。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）及びワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）は、両方ともマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類であるが、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル（Ｃｅｂｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類である。

【0159】

本発明の抗体コンストラクトに関して、ヒト及び／又はマカクＣＤ３の細胞外エピトープに結合する第２のドメインは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２９に示されるＣＤＲ－Ｌ３；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１９に示されるＣＤＲ－Ｌ３；並びに
Ｉ 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｌ３
から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが好ましい。

【0160】

本発明の抗体コンストラクトのさらに好ましい実施形態において、ヒト及び／又はマカクＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメインは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３２に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
Ｉ 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号４８に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６６に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６７に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６８に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
Ｉ 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３８に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３９に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５６に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５７に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｌ３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。

【0161】

本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、第２の結合ドメイン内でＶＬ ＣＤＲの上記３群をＶＨ ＣＤＲの上記１０群と組み合わせて、それぞれＣＤＲ－Ｌ１～３及びＣＤＲ－Ｈ１～３を含む（３０）群を形成する。

【0162】

本発明の抗体コンストラクトに関して、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７、２１、３５、３９、５３、５７、７１、７５、８９、９３、１０７、１１１、１２５、１２９、１４３、１４７、１６１、１６５、１７９若しくは１８３で示されるか又は配列番号２００で示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことが好ましい。

【0163】

ＣＤ３に結合する第２のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７若しくは１８１で示されるか又は配列番号２０１で示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことが好ましい。

【0164】

より好ましくは、本発明の抗体コンストラクトは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７又は２１に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５又は１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３５又は３９に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３３又は３７に示されるＶＨ領域；
Ｉ 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５３又は５７に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５１又は５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号７１又は７５に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６９又は７３に示されるＶＨ領域；
Ｉ 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８９又は９３に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８７又は９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０７又は１１１に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０５又は１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２５又は１２９に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２３又は１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４３又は１４７に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４１又は１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１６１又は１６５に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５９又は１６３に示されるＶＨ領域；並びに
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７９又は１８３に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７７又は１８１に示されるＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＤＣ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。

【0165】

また、本発明の抗体コンストラクトとの関係で好ましいのは、配列番号２００に示されるＶＬ領域及び配列番号２０１に示されるＶＨ領域を含むＣＤ３に結合する第２のドメインである。

【0166】

本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態によれば、第１の及び／又は第２のドメインは、以下の形式を有する：ＶＨ領域とＶＬ領域との対は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域がリンカー配列のＮ末端に配置され、且つＶＬ領域がリンカー配列のＣ末端に配置されることが好ましい。

【0167】

本発明の上記の抗体コンストラクトの好ましい実施形態は、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７又は配列番号２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。

【0168】

抗体コンストラクトの共有結合的修飾も本発明の範囲内に含まれ、これは、常にではないものの通常、翻訳後に行われる。例えば、抗体コンストラクトのいくつかの種類の共有結合的修飾は、抗体コンストラクトの特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。

【0169】

システイニル残基は、最も一般的には、α－ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリ安息香酸メチル、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、又はクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

【0170】

ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５～７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ－アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソ尿素；２，４－ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。

【0171】

アルギニル残基は、１つ又は複数の従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン－アミノ基と反応し得る。

【0172】

チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミジゾール（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。^１２５Ｉ又は^１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製する上記のクロラミンＴ法が好適である。

【0173】

カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択的に異なるアルキル基、例えば１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド又は１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。

【0174】

二官能性物質による誘導体化は、本発明の抗体コンストラクトを、様々な方法に使用するための非水溶性の支持マトリックス又は支持表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４－アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３，３－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化され得る中間体が得られる。代わりに、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリックス並びに米国特許第３，９６９，２８７号明細書；同第３，６９１，０１６号明細書；同第４，１９５，１２８号明細書；同第４，２４７，６４２号明細書；同第４，２２９，５３７号明細書；及び同第４，３３０，４４０号明細書に記載されている反応性基材がタンパク質の固定化に使用される。

【0175】

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。或いは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。

【0176】

他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９－８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

【0177】

本発明の範囲内に含まれる抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で知られるとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在）又はそのタンパク質を産生する宿主細胞若しくは生物体の両方に依存し得る。個々の発現系について以下で論じる。

【0178】

ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合又はＯ結合である。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ－結合グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンもまた使用され得る。

【0179】

抗体コンストラクトへのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより行うと好都合である。改変はまた、１つ以上のセリン又はトレオニン残基の開始配列への付加、又はそれによる置換によってなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位に場合）。簡潔には、抗体コンストラクトのアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変更、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生じるようにポリペプチドをコードするＤＮＡを、事前に選択した塩基で変異させることによって改変することが好ましい。

【0180】

抗体コンストラクト上の糖鎖の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖が（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、Ｉ フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６に記載されている。

【0181】

出発抗体コンストラクト上に存在する糖鎖の除去は、化学的又は酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載される。ポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載される様々なエンド－及びエキソ－グリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載される化合物ツニカマイシンの使用によって妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質－Ｎ－グリコシド結合の形成を阻止する。

【0182】

本明細書では、抗体コンストラクトの他の修飾も企図される。例えば、抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、様々な非タンパク質性ポリマーへの抗体コンストラクトの連結を含み、ポリマーとしては、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に示される様式の様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない。加えて、当技術分野で知られるとおり、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗体コンストラクト内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。

【0183】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの共有結合的修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して標識基が抗体コンストラクトに結合され得る。タンパク質を標識するための様々な方法が当技術分野で知られており、本発明を実施する際に使用することができる。用語「標識」又は「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、標識を検出しようとするアッセイに応じて様々なクラスに分類され、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）放射性同位体又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）などの放射性同位体又は重同位体であり得る同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基及び「低分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない）
ｅ）酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。

【0184】

「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、５１ｙｏｐｈｉｌｉｓａｔ、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアを含む好適な光学色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。

【0185】

好適なタンパク質性蛍光標識としてはまた、以下に限定はされないが、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）種、プチロサルカス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）種又はエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号 Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２－４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８－１８２）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８－５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３－２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書；同第５，４１８，１５５号明細書；同第５，６８３，８８８号明細書；同第５，７４１，６６８号明細書；同第５，７７７，０７９号明細書；同第５，８０４，３８７号明細書；同第５，８７４，３０４号明細書；同第５，８７６，９９５号明細書；同第５，９２５，５５８号明細書）も挙げられるが、これらに限定されない。

【0186】

本発明の抗体コンストラクトは、例えば、その分子の単離に役立つか又はその分子の薬物動態プロファイルの適合に関連する追加ドメインも含み得る。抗体コンストラクトの単離に役立つドメインは、単離方法、例えば単離用カラムで捕捉できるペプチドモチーフ又は二次的に導入される部分から選択され得る。このような追加ドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）並びにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲによって特徴付けられる本明細書で開示される抗体コンストラクトの全ては、分子のアミノ酸配列中の連続するＨｉｓ残基、好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン）のリピートとして一般に知られるＨｉｓタグドメインを含み得る。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体コンストラクトのＮ末端にもＣ末端にも配置され得るが、Ｃ末端に配置されることが好ましい。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１９９）を、ペプチド結合を介して本発明による抗体コンストラクトのＣ末端に結合する。加えて、持続放出用途及び薬物動態プロファイルの向上のために、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡのコンジュゲート系をポリヒスチジンタグと組み合わせ得る。

【0187】

本明細書に記載される抗体コンストラクトのアミノ酸配列改変も企図される。例えば、抗体コンストラクトの結合親和性及び／又は他の生物学的特性の向上が望ましい場合がある。抗体コンストラクトのアミノ酸配列バリアントは、抗体コンストラクトの核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって又はペプチド合成によって作製される。以下に記載されるアミノ酸配列改変の全ては、未改変の親分子の所望の生物活性（標的細胞の表面抗原及びＣＤ３への結合）を引き続き保持する抗体コンストラクトをもたらすはずである。

【0188】

用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、通常、その技術分野で認められている定義を有するアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｈｅ又はＩ）；ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リジン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、必要に応じて修飾アミノ酸、合成アミノ酸又は希少アミノ酸が使用され得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）の存在によって分類することができる。

【0189】

アミノ酸改変は、例えば、抗体コンストラクトのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せは、最終構築体が所望の特徴を有するなら、その最終構築体に到達するようになされる。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの抗体コンストラクトの翻訳後プロセスも変え得る。

【0190】

例えば、１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸がＣＤＲの各々において（当然のことながら、それらの長さに依存する）挿入、置換又は欠失され得る一方、ＦＲの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５個のアミノ酸が挿入、置換又は欠失され得る。好ましくは、抗体コンストラクトへのアミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。対応する改変を本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内で実施し得る。本発明の抗体コンストラクトの挿入バリアントは、抗体コンストラクトのＮ末端若しくはＣ末端への酵素の融合又はポリペプチドへの融合を含む。

【0191】

置換変異誘発にとって最も重要な部位としては、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが（これらに限定されるものではない）、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。置換は、本明細書に記載される保存的置換であることが好ましい。好ましくは、ＣＤＲ又はＦＲの長さに応じて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を置換し得る一方、フレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５個のアミノ酸を置換し得る。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２又は３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５又は６個が置換されることが想定される。

【0192】

変異誘発について好ましい位置である抗体コンストラクトの特定の残基又は領域を同定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）に記載されるとおり「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれる。この方法では、抗体コンストラクト内の残基又は標的残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える中性又は負電荷アミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）で置き換えられる。

【0193】

次に、さらなるバリアント又は他のバリアントを置換部位に、すなわち置換部位の代わりに導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置を厳選する。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位又は領域は、予め決定されるが、変異の性質自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析又は最適化するために、アラニンスキャニング又はランダム変異誘発が標的コドン又は標的領域で実施される場合があり、発現される抗体コンストラクトのバリアントは、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位に置換変異を行う技術は、よく知られており、例えばＭ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、標的細胞の表面抗原又はＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。

【0194】

一般に、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上又は全てにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列は、「当初の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一であることが好ましい。これは、それが「置換された」配列とどの程度同一であるかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するために、その置換された配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、抗体コンストラクトのＣＤＲは、それらの置換配列に対して異なる程度の同一性を有する場合があり、例えば、ＣＤＲＬ１が８０％を有する場合がある一方、ＣＤＲＬ３は９０％を有する場合がある。

【0195】

好ましい置換（又は置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、抗体コンストラクトが、それぞれ第１のドメインを介して標的細胞の表面抗原に結合し、第２のドメインを介してＣＤ３、ＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、且つ／又はそのＣＤＲが置換後の配列に対して同一性を有している（「当初の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一である）限り、（非保存的置換又は以下の表３に列挙される「例示的な置換」の１つ以上を含む）任意の置換が想定される。

【0196】

保存的置換を表３の「好ましい置換」の見出し下に示す。このような置換が生物活性を変化させる場合、表３において「例示的な置換」と称されるか、又はアミノ酸クラスに関連して以下でさらに記載されるとおりのより実質的な変更が導入され、所望の特徴について産物がスクリーニングされ得る。

【0197】

【表3】

【0198】

本発明の抗体コンストラクトの生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えばシート状若しくはらせん状の立体構造としての置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対する影響が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性；ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

【0199】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。抗体コンストラクトの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を一般的にはセリンで置換することで、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を回避し得る。逆に、抗体にシステイン結合を付加することで、（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を向上させ得る。

【0200】

アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当技術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより又は目視により決定される。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。

【0201】

有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から多重配列アラインメントを生成する。これにより、アラインメントの生成に使用されたクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３により記載されたものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルトのギャップ加重、０．１０のデフォルトのギャップ長加重及び加重エンドギャップを含む。

【0202】

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７において記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定する：重複範囲＝１、重複割合＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、個々の配列の構成及び目的配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じてプログラム自体によって設定されるが、感度を上げるために値を調整し得る。

【0203】

他の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されたギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメータは、９に設定され、ギャップなし伸長をもたらすｔｗｏ－ｈｉｔ法は、ギャップ長ｋのコストを１０＋ｋとし、Ｘｕは、１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアによってもたらされる。

【0204】

一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸相同性、類似性又は同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％又は８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体コンストラクトのコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の割合と定義される。具体的な方法では、重複範囲及び重複割合がそれぞれ１及び０．１２５を有するデフォルトパラメータに設定されたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。

【0205】

一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列間の核酸配列相同性、類似性又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。したがって、「バリアントＣＤＲ」又は「バリアントＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対して特定の相同性、類似性又は同一性を有するものであり、且つ親ＣＤＲ若しくはＶＨ／ＶＬの特異性及び／又は活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含むが、これらに限定されない生物学的機能を共有している。

【0206】

一実施形態では、本発明による抗体コンストラクトのヒト生殖細胞系列に対する同一性の割合は、≧７０％又は≧７５％、より好ましくは≧８０％又は≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％又はさらに≧９６％である。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物に対する同一性は、治療用タンパク質が治療中の患者の薬物に対する免疫反応を誘発するリスクを低減するための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３－１０）は、薬物抗体コンストラクトの非ヒト部分の減少が治療中の患者における抗薬物抗体の誘発リスクの低減をもたらすことを実証している。膨大な数の臨床評価済み抗体薬物及び対応する免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変の非ヒトＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性が少ない（患者の平均５．１％）という傾向を示している。したがって、Ｖ領域をベースにした抗体コンストラクトの形態でのタンパク質治療薬に関して、ヒト配列に対する同一性が高いことが望ましい。この生殖細胞系列同一性の決定のために、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いて、ＶＬのＶ領域をヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインメントし、同一のアミノ酸残基数をＶＬの総アミノ酸残基数で割ることによりアミノ酸配列をパーセントで算出することができる。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても同様の方法が可能であるが、例外として、ＶＨ ＣＤＲ３は、多様性が高く、既存のヒト生殖細胞系列ＶＨ ＣＤＲ３のアラインメントパートナーを欠くために除外され得る。続いて、組換え技術を使用して、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する配列同一性を増大させることができる。

【0207】

さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、標準的な研究規模の条件下において、例えば標準的な二段階精製プロセスで高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明による抗体コンストラクトの単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ、及び最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。

【0208】

同様に、抗体コンストラクトの二量体抗体コンストラクトアイソフォームの収量及びそのため単量体の割合（すなわち単量体：（単量体＋二量体））が決定され得る。単量体及び二量体抗体コンストラクトの生産性並びに算出される単量体の割合は、例えば、ローラーボトル中における標準化された研究規模の製造に由来する培養上清のＳＥＣ精製工程で取得することができる。一実施形態では、抗体コンストラクトの単量体の割合は、≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９５％である。

【0209】

一実施形態では、抗体コンストラクトは、好ましくは、≦５又は≦４、より好ましくは≦３．５又は≦３、さらにより好ましくは≦２．５又は≦２及び最も好ましくは≦１．５又は≦１の血漿安定性（血漿非存在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比率）を有する。抗体コンストラクトの血漿安定性は、コンストラクトをヒト血漿中、３７℃で２４時間インキュベートし、続いて^５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することにより試験することができる。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激された濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であり得る。標的細胞は、例えば、ヒト標的細胞の表面抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１を選択することができる。この目的で使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液に由来する。細胞成分を遠心分離により除去して、上部血漿相を回収し、その後、プールする。対照として、抗体コンストラクトを細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈する。血漿安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比率として算出される。

【0210】

本発明の抗体コンストラクトの単量体から二量体への変換率は、低いことがさらに好ましい。変換率は、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。例えば、抗体コンストラクトの単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内で例えば１００μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度において３７℃で７日間行われ得る。これらの条件下において、本発明の抗体コンストラクトは、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又は≦０．５％又はさらに０％の二量体の割合を示すことが好ましい。

【0211】

本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、数回の凍結／解凍サイクル後、非常に低い二量体変換率を示すことも好ましい。例えば、抗体コンストラクトの単量体を例えば汎用の製剤緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、３回の凍結／解凍サイクル（－８０℃で３０分間の凍結後、室温で３０分間の解凍）にかけた後、高速ＳＥＣを行い、二量体抗体コンストラクトに変換された初期単量体抗体コンストラクトの割合を決定する。好ましくは、二重特異性抗体コンストラクトの二量体の割合は、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又はさらに≦０．５％である。

【0212】

本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、≧４５℃又は≧５０℃、より好ましくは≧５２℃又は≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃又は≧５７℃及び最も好ましくは≧５８℃又は≧５９℃の凝集温度で良好な熱安定性を示す。抗体の凝集温度の観点から熱安定性パラメータを以下のように決定することができる：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を単回使用のキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置内に置く。測定半径を常時取得しながら、０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃まで試料を加熱する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増大を使用して、抗体の凝集温度を算出する。

【0213】

代わりに、融解温度曲線を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定して、抗体コンストラクトの固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定することができる。これらの実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して実施する。抗体コンストラクトを含有する試料のエネルギー取り込みを２０℃から９０℃まで記録して、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較する。抗体コンストラクトを例えばＳＥＣランニング緩衝液中において最終濃度２５０μｇ／ｍｌに調整する。それぞれの融解曲線を記録するために試料の全体温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔでの試料及び製剤緩衝液標準物質のエネルギー取り込みを記録する。試料から標準物質を差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差をそれぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。

【0214】

本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトは、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１及び最も好ましくは≦０．０８の混濁度（精製された単量体抗体コンストラクトを２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、一晩インキュベートした後、ＯＤ３４０により測定される）を有するとも想定される。

【0215】

さらなる実施形態では、本発明による抗体コンストラクトは、生理的なｐＨ又はそれよりわずかに低いｐＨ、すなわち、約ｐＨ７．４～６．０で安定である。非生理的ｐＨ、例えば約ｐＨ６．０で抗体コンストラクトが示す耐性が高いほど、充填されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出される抗体コンストラクトの回収率が高くなる。ｐＨ６．０でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの抗体コンストラクトの回収率は、好ましくは、≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、さらにより好ましくは≧６０％、さらにより好ましくは≧７０％、さらにより好ましくは≧８０％、さらにより好ましくは≧９０％、さらにより好ましくは≧９５％及び最も好ましくは≧９９％である。

【0216】

本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、治療有効性又は抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。これは、例えば、以下の進行期のヒト腫瘍異種移植モデルの実施例に開示される試験において評価することができる。

【0217】

当業者は、この試験の特定のパラメータ、例えば注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与する二重特異性抗体コンストラクトの量及び予定表を変更又は適合させながらも、有意義で再現性のある結果を得る方法を知っている。好ましくは、腫瘍増殖抑制Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０若しくは≦６０、より好ましくは≦５０若しくは≦４０、さらにより好ましくは≦３０若しくは≦２０及び最も好ましくは≦１０若しくは≦５又はさらに≦２．５である。

【0218】

本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、一本鎖抗体コンストラクトである。
また、本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
を含む。

【0219】

また、本発明の一実施形態では、第３のドメインの１つ又は好ましくは各々（両方）のポリペプチド単量体のＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む。当技術分野で知られるとおり、用語「システインジスルフィド架橋」は、一般構造Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒを有する官能基を指す。この連結は、ＳＳ結合又はジスルフィド架橋とも呼ばれ、システイン残基の２つのチオール基のカップリングによって得られる。本発明の抗体コンストラクトに関して、成熟抗体コンストラクト内でシステインジスルフィド架橋を形成するシステインは、３０９及び３２１（Ｋａｂａｔ付番）に相当するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列に導入されることが特に好ましい。

【0220】

本発明の一実施形態では、ＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が除去される。このグリコシル化部位の除去は、Ｎ３１４Ｘ置換によって達成されることが好ましく、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇ置換である。より好ましい実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換をさらに含む（位置は、Ｋａｂａｔに従う）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。

【0221】

例えば、当技術分野で知られる二重特異性ヘテロＦｃ抗体コンストラクトと比較した本発明の抗体コンストラクトの好ましい特徴は、とりわけ、ＣＨ２ドメインにおける上記の改変の導入に関連し得ると考えられる。したがって、本発明のコンストラクトに関して、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインがＫａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つ／又はＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が上記のとおりＮ３１４Ｘ置換により、好ましくはＮ３１４Ｇ置換により除去されることが好ましい。

【0222】

本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つＫａｂａｔ位３１４のグリコシル化部位がＮ３１４Ｇ置換によって除去される。

【0223】

一実施形態では、本発明は、抗体コンストラクトであって、
（ｉ）第１のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第１のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第１のドメインが、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
（ｉｖ）第１のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインが、１つの抗体可変ドメインを含む抗体コンストラクトを提供する。

【0224】

したがって、第１及び第２のドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインなどの各々２つの抗体可変ドメインを含む結合ドメインであり得る。本明細書で上記される２つの抗体可変ドメインを含むこのような結合ドメインの例は、例えば、本明細書で上記されるＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントを含む。代わりに、それらの結合ドメインのいずれか一方又は両方は、単一の可変ドメインのみを含み得る。本明細書で上記されるこのような単一ドメイン結合ドメインの例は、例えば、他のＶ領域又はドメインに非依存的に抗原又はエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含むナノボディ又は単一可変ドメイン抗体を含む。

【0225】

本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、第１及び第２のドメインは、ペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される。好ましいペプチドリンカーは、本明細書で上記されており、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ_４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、１又はそれより大きい整数（例えば、２又は３）である。第３のドメインに対する第１及び第２のドメインの融合において特に好ましいリンカーは、配列番号１に示される。

【0226】

好ましい実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１８７～１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
Ｉ 第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１８７、
１８８、１８９、１９５、１９６、１９７及び１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
Ｉ 第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号１９１、１９２、１９３及び１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含むように特徴付けられる。

【0227】

本発明の一態様では、第１のドメインによって結合される標的細胞の表面抗原は、腫瘍抗原、免疫障害に特異的な抗原又はウイルス抗原である。本明細書で使用する場合、用語「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞上に提示されるそれらの抗原として理解され得る。これらの抗原は、細胞外部分とともに細胞表面上に提示され得、多くの場合、分子の膜貫通部分及び細胞質部分を併せ持つ。これらの抗原は、場合により腫瘍細胞によってのみ提示され得、正常細胞によって決して提示され得ない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上に限って発現され得るか、又は正常細胞と比較して腫瘍特異的変異を示す可能性がある。この場合、それらは、腫瘍特異抗原と呼ばれる。より一般的な抗原は、腫瘍細胞及び正常細胞によって提示される抗原であり、それらは、腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞と比較して過剰発現され得るか、又は正常細胞と比較して腫瘍組織のコンパクトさに欠ける構造に起因して腫瘍細胞において抗体結合のために利用できる。本明細書で使用される腫瘍抗原の非限定的な例は、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡである。

【0228】

本発明の文脈における免疫学的障害に特異的なさらなる標的細胞の表面抗原は、例えば、ＴＬＡ１及びＴＮＦ－アルファを含む。前記標的は、好ましくは全長抗体である本発明の二重特異性抗体によって対処されることが好ましい。非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヘテロＩｇＧ抗体である。

【0229】

本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される。

【0230】

本発明の一態様では、抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）配列番号７、８、１７、２７、２８、３７、３８、３９、４０、４１、４８、４９、５０、５１，５２、５９、６０、６１、６２、６３、６４、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８９、９０、９１、９２、９３、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１１３、１１４、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１のドメイン
（ｂ）配列番号１８７～１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
Ｉ 国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７又は配列番号２０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１８７、１８８、１８９、１９５、１９６、１９７及び１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
Ｉ 国際公開第２０１７／１３４１４０号パンフレットの配列番号１７～２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号１９１、１９２、１９３及び１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）国際公開第２０１７／１３４１４０号パンフレットの配列番号１７～２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第２のポリペプチド単量体を含む。

【0231】

一態様では、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、それぞれの標的細胞の表面抗原：
（ａ）配列番号２７、２８、３７～４１； ＣＤ３３
（ｂ）配列番号４８～５２の各々； ＥＧＦＲｖＩＩＩ
（ｃ）配列番号５９～６４の各々； ＭＳＬＮ
（ｄ）配列番号７１～８２の各々； ＣＤＨ１９
（ｅ）配列番号１００～１０４の各々； ＤＬＬ３
（ｆ）配列番号７、８、１７、１１３及び１１４ ＣＤ１９
（ｇ）配列番号８９～９３の各々； ＦＬＴ３
（ｈ）配列番号１２１～１２５の各々； ＣＤＨ３
（ｉ）配列番号１３２～１３６の各々； ＢＣＭＡ及び
（ｊ）配列番号１４３～１５１、１５８～１６６及び１７３～１８１の各々 ＰＳＭＡ
からなる群から選択され、且つそれらを対象とするアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。

【0232】

本発明は、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子をさらに提供する。ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合された１３個以上のヌクレオチド単量体で構成される生体高分子である。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのような核酸分子の単量体又はサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子又はポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、線状及び環状であり得る。好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内にそれが含まれることが好ましい。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクター又はポリヌクレオチドを用いた形質転換又はトランスフェクション後、抗体コンストラクトを発現することができる。それを目的として、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。

【0233】

遺伝暗号は、遺伝子材料（核酸）内にコードされた情報をタンパク質に翻訳するルールのセットである。生細胞中での生物学的解読は、アミノ酸を運搬し、ｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドを一度に読み取るｔＲＮＡ分子を使用して、ｍＲＮＡによって指定された順にアミノ酸を結合するリボソームによって行われる。この暗号は、コドンと呼ばれる三つ組のヌクレオチド配列が、タンパク質の合成時に次に付加されることになるアミノ酸をどのように指定するかを定義する。いくつかの例外はあるが、核酸配列中の３ヌクレオチドのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子は、厳密に同じ暗号で暗号化されているため、この特定の暗号を基準遺伝暗号又は標準遺伝暗号と称する場合が多い。遺伝暗号は、所与のコード領域のタンパク質配列を決定するが、他のゲノム領域がこれらのタンパク質が産生される時期及び場所に影響を及ぼし得る。

【0234】

さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、（外来）遺伝子材料を細胞内に移すための媒体として使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般に、遺伝子操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位及び選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」の役割をするより大きい配列を含むヌクレオチド配列、一般にＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて、プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグといった追加の特徴を包含する場合がある。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは、特に標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に制御配列を有する。

【0235】

用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。

【0236】

核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列若しくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されているか；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること、及び分泌リーダーの場合には連続し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによってなされる。このような部位が存在しない場合、従来の慣例に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。

【0237】

用語「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入する方法である。本用語は、ほとんどの場合、真核細胞における非ウイルス的方法に使用される。形質導入は、核酸分子又はポリヌクレオチドのウイルス媒介性の移入を表すために使用される場合が多い。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔、すなわち「穴」を開けて、物質の取り込みを可能にすることを伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションにより、細胞の圧迫により、又は陽イオン性脂質とリポソームを生成する物質とを混合し、細胞膜と融合させ、内部のカーゴを蓄積することにより行うことができる。

【0238】

用語「形質転換」は、細菌への及び植物細胞を含む非動物真核細胞への核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を表すために使用される。したがって、形質転換は、細胞膜を通じたその周辺からの直接的取り込み及びそれに続く外来性遺伝子材料（核酸分子）の組み込みから生じる、細菌又は非動物真核細胞の遺伝的改変である。形質転換は、人為的手段によって生じさせることができる。形質転換を生じさせるには、細胞又は細菌は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限応答として形質転換が起こり得るコンピテントな状態でなければならない。

【0239】

さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」又は「レシピエント細胞」は、本発明の抗体コンストラクトをコードするベクター、外来性核酸分子及びポリヌクレオチドのレシピエント；並びに／又はその抗体コンストラクト自体のレシピエントであり得るか、又はそうであった任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことが意図される。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクションなどによって実施される。用語「宿主細胞」は、単一細胞の子孫又は潜在的子孫を含むことも意図する。後継世代において、自然発生的、偶発的若しくは意図的な変異のいずれかに起因して、又は環境的影響に起因して一定の改変が生じる場合があるため、そのような子孫は、実際には、（形態学的に又はゲノム若しくは全ＤＮＡの組に関して）親細胞と完全に同一でない場合もあるが、なおも本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカク又はヒトを含むが、これらに限定されない。

【0240】

本発明の抗体コンストラクトは、細菌内で産生することができる。発現後、本発明の抗体コンストラクトを可溶性画分中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離し、例えば親和性クロマトグラフィー及び／又はサイズ排除によって精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体の精製方法と同様に実施することができる。

【0241】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が本発明の抗体コンストラクトのための好適なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、いくつかの他の属、種及び系統が一般に利用可能であり、且つ本発明において有用であり、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２２２６号明細書）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３０７０号明細書）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４２３４号明細書）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。

【0242】

本発明のグリコシル化抗体コンストラクトの発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及びバリアント並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１バリアント及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスを、本発明による本明細書のウイルスとして、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用し得る。

【0243】

綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。植物細胞培養におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に知られている。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６－７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０－７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５－７５０及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９－９８６を参照されたい。

【0244】

しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の増殖は、通例の手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養物中で増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４－６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

【0245】

さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体コンストラクトの作製方法であって、本発明の抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、産生された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法を提供する。

【0246】

本明細書で使用する場合、用語「培養」は、培地中の好適な条件下におけるインビトロでの細胞の維持、分化、成長、増殖及び／又は伝播を指す。用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むが、これらに限定されない、本発明の抗体コンストラクトの作製に関与するいずれの工程も含む。

【0247】

組換え技術を使用する場合、抗体コンストラクトは、細胞膜周辺腔において細胞内で産生され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体コンストラクトが細胞内で産生される場合、第１段階として、例えば遠心分離又は限外濾過により、宿主細胞又は溶解したフラグメントの粒子状の細片を除去する。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞片は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、一般にそのような発現系からの上清を、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、前述の段階のいずれかにおいてＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれ得、また外来性の汚染菌の増殖を防止するために抗生物質が含まれ得る。

【0248】

宿主細胞から調製された本発明の抗体コンストラクトは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを用いて回収又は精製することができる。回収される抗体に応じて、他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、６８ｙｏｐｈｉｌｉ－フォーカシング（６８ｙｏｐｈｉｌｉ－ｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿法も利用可能である。本発明の抗体コンストラクトがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。

【0249】

親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドが結合するするマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えばコントロールドポアガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。

【0250】

さらに、本発明は、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製された抗体コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において、抗体コンストラクトの均質性は、≧８０％であることが好ましく、より好ましくは≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％又は≧８５％、さらに好ましくは≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％又は≧９０％、なおさらに好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％又は≧９５％及び最も好ましくは≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％である。

【0251】

本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与に好適な組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つ又は複数の本発明の抗体コンストラクトを好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物はさらに、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤、及び／又はアジュバントの好適な製剤を含む。許容される組成物の成分は、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。本発明の医薬組成物には液体、凍結及び凍結乾燥組成物が含まれるが、これらに限定されない。

【0252】

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。一般に、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合するあらゆる水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒体及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られており、そのような担体を含む組成物は、よく知られる従来法によって製剤化することができる。

【0253】

ある種の実施形態は、本発明の抗体コンストラクト及びさらに１つ以上の賦形剤、例えば本節及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されているものを含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整及び／又は有効性を向上させ、且つ／若しくはこのような製剤を安定化するための本発明の方法並びに例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与中及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法など、広範囲の目的を考慮して本発明で使用することができる。

【0254】

ある種の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透を変更、持続又は保護することを目的とする製剤材料を含有し得る（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８” Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。このような実施形態では、好適な製剤材料は、以下を含み得るが、これらに限定されない：
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／又はヒスチジンを含むアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２－フェニルアラニン
・抗菌剤及び抗真菌剤などの抗菌薬
・アスコルビン酸、メチオニン、ナトリウム６９ｙｏｐｈｉｌｉ（ｓｏｄｉｕｍ ６９ｙｏｐｈｉｌｉ）又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；
・生理的なｐＨ又はそれよりわずかに低いｐＨで組成物を維持するのに使用される緩衝液、緩衝液系及び緩衝化剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、及びヒスチジンである；例えば、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液；
・非水性溶媒、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル；
・生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む水性担体；
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー；
・マンニトール又はグリシンなどの充填剤；
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；
・等張剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）
・注入剤；
・単糖類；二糖類；及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；糖質は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトール又はキシリトールであり得る；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質性担体、例えばヒト若しくはウシ血清アルブミン、ゼラチン又は好ましくはヒト起源の免疫グロブリン；
・着色及び着香剤；
・硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤；
・乳化剤；
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー）
・ナトリウムなどの塩形成対イオン；
・抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素である）；
・Ｚｎ－タンパク質錯体などの金属錯体；
・溶媒及び共溶媒（７０ｙｏｐｈｉｌｉｓ、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；
・糖及び糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトール又はキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・懸濁化剤；
・界面活性剤又は湿潤剤、例えばプルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；界面活性剤は、好ましくは、＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤及び／又は好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得る；好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｗｅｅｎ ８５であり；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００及びＰＥＧ ５０００である；
・スクロース又はソルビトールなどの安定性増強剤；
・等張性増強剤、例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール；
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は固定油を含む非経口送達ビヒクル；
・体液及び栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースをベースにしたものなど）を含む静脈内送達ビヒクル。

【0255】

医薬組成物の異なる成分（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定化剤及び／又は抗酸化剤として作用することができ；マンニトールは、充填剤及び／又は等張性増強剤として作用することができ；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／又は等張性増強剤として作用することができるなどである。

【0256】

本発明の組成物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、組成物の使用目的に応じてさらなる生物学的に活性な薬剤を含む場合があることが想定される。このような薬剤は、当技術分野で知られる胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、７１ｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏを防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物及び／又はサイトカインなどの薬剤であり得る。また、本発明の抗体コンストラクトは、併用療法で、すなわち別の抗癌薬と併用して適用されることも想定される。

【0257】

ある種の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて、当業者により決定されることになる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前掲）を参照されたい。ある種の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体コンストラクトの物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビトロクリアランス速度に影響し得る。ある種の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、水性又は非水性のいずれかの性質を有し得る。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水もさらなる例示的なビヒクルである。ある種の実施形態では、本発明の組成物の抗体コンストラクトは、凍結乾燥ケーク又は水性溶液の形態において、所望の度合いの純度を有する選択された組成物を任意選択的に配合剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保管のために調製され得る。さらに、ある種の実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。

【0258】

非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の所望の抗体コンストラクトを含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、本発明の抗体コンストラクトは、その中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。ある種の実施形態では、製剤は、デポ注射を介して送達できる産物の制御性又は持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームと、所望の分子との製剤を含み得る。ある種の実施形態では、循環中の持続期間を増進する効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。ある種の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体コンストラクトを導入し得る。

【0259】

さらなる医薬組成物が当業者に明らかであり、これには、持続性又は制御性の送達／放出製剤中に本発明の抗体コンストラクトを含む製剤が含まれる。様々な他の持続性又は制御性の送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子又は多孔ビーズ及びデポ注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第９３／００８２９号明細書を参照されたい。持続放出製剤は、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出組成物は、当技術分野において知られるいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。

【0260】

抗体コンストラクトは、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0261】

インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌製剤として提供される。無菌化は、無菌濾過膜を介す濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）及び再構成の前後のいずれかに実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態又は溶液で保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器に充填され、こうした容器は、例えば、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルである。

【0262】

本発明の別の態様は、国際特許出願国際公開第０６１３８１８１Ａ２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０２２５９９号明細書）に記載される、医薬組成物として使用することができる本発明の製剤の自己緩衝性抗体コンストラクトを含む。タンパク質の安定化並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して様々な説明が利用可能であり、例えばＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」 ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）、特に獣医学的及び／又はヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関して、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照されたい。

【0263】

塩は、本発明のある種の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するため、且つ／又は本発明による組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させるために使用され得る。よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を低減することにより、天然状態のタンパク質を安定化することができる。イオンは、特にタンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化することもできる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。

【0264】

イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は、著しく異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けがいくつか立案されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に使用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化する溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化する溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。

【0265】

遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤及び抗酸化剤として、並びに他の標準的用途として、本発明の様々な実施形態による本発明の製剤の抗体コンストラクトに使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）において適切なケークの構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。

【0266】

ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース及びソルビトール並びに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール並びに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質を物理的及び化学的劣化過程から保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調整するのにも有用である。ポリオールの中で本発明の選択された実施形態において有用なのは、マンニトールであり、これは、凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために一般に使用される。マンニトールはケークの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として好ましいものの中に含まれる。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、それらは、一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中に含まれない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で本発明の好ましいポリオールの中に含まれない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化すること及び凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に使用することができる。

【0267】

本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面への吸着並びに気体－液体界面、固体－液体界面及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、通常、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は、慣例的に、表面吸着を防止するか、最小化するか、又は低減するために使用される。この点に関して本発明において有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するために一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は、通常、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するため、この点において、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。

【0268】

ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、多くの場合、供給されるとき、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、注意して使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最小影響濃度で用いるべきとする一般通則を例示している。

【0269】

本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、１種以上の抗酸化剤をさらに含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することにより、且つ光への暴露を回避することにより、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。抗酸化賦形剤を、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤及びキレート剤が含まれる。本発明による治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損傷することがある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは、特に分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか又はその可能性を十分に低減するように選択される。

【0270】

本発明による製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかの過程も阻害することができる。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程も触媒する。マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ^＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２及びＺｎ^＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ^＋２及びＳｒ^＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、これは、Ｍｇ^＋２、Ｍｎ^＋２及びＺｎ^＋２、Ｃｕ^＋２及びＦｅ^＋２によって不安定化されることがあり、その凝集は、Ａｌ^＋３イオンによって増大し得る。

【0271】

本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、１種以上の保存剤をさらに含む。保存剤は、同じコンテナからの２回以上の取り出しを伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主な機能は、製剤の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ－クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量配合物が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。防腐処理された配合物の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ－クレゾールにより製剤化されている。保存処理された剤形の製剤化及び開発中、いくつかの態様を考慮する必要がある。製剤中の効果的な防腐剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の防腐剤を、タンパク質の安定性を損なうことなく抗微生物効果を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。

【0272】

予想されるとおり、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。フリーズドライ生成物は、防腐剤なしで凍結乾燥され、使用時に希釈剤を含有する防腐剤で再構成することができる。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８～２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証される必要がある。

【0273】

本明細書で開示される抗体コンストラクトは、７６ｙｏｐｈｉ－リポソーム（７６ｙｏｐｈｉ－ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）としても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質の配置と同様に二層構造で配置される。抗体コンストラクトを含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書；並びに国際公開第９７／３８７３１号パンフレットに記載される、当技術分野で知られる方法によって調製される。循環時間が長くなったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製することができる。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを、所定の孔径のフィルターを通して押し出す。本発明の抗体コンストラクトのＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるとおりにリポソームにコンジュゲートされ得る。任意選択的に、化学療法剤がリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。

【0274】

医薬組成物を製剤化した後、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中に保存してもよい。そのような製剤は、即時使用が可能な形態か、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）のいずれで保存してもよい。

【0275】

本明細書で定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、以下の実施例、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）において記載されるとおりの細胞障害アッセイによって決定され得る。本明細書で使用する場合、「有効性」又は「インビボ有効性」は、例えば、標準化されたＮＣＩの反応基準を用いた、本発明の医薬組成物による療法に対する反応を指す。本発明の医薬組成物を用いる療法の成功又はインビボ有効性は、その意図された目的、すなわち組成物がその所望の効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の激減を引き起こす能力に関する組成物の有効性を指す。インビボ有効性は、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺を含むが、これらに限定されない、それぞれの疾患実体についての確立された標準的方法によって観測され得る。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法が使用され得る。さらに、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの基準に基づく反応評価［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ，Ｓｈｉｐｐ ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ，Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ Ｗ，Ｈｏｐｐｅ Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、ポジトロン放出断層走査、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学及び様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）並びに他の確立された標準的方法が使用され得る。

【0276】

本発明の医薬組成物などの薬物の開発におけるもう１つの主な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、候補薬物の薬物動態プロファイル、すなわち特定の薬物が所与の病態を治療する能力に影響する薬物動態パラメータのプロファイルが確立され得る。薬物が特定の疾患実体を治療する能力に影響する薬物の薬物動態パラメータとしては、半減期、分布容積、肝臓の初回通過代謝及び血清結合の程度が挙げられるが、これらに限定されない。所与の薬物の有効性は、上記のパラメータの各々によって影響を受ける可能性がある。特定のＦＣ様式により提供される本発明の抗体コンストラクトの想定される特徴は、それらが、例えば、薬物動態挙動に関して相違を含むことである。本発明による半減期が延長した標的化抗体コンストラクトは、好ましくは、前記抗体コンストラクトの「カノニカル」な非ＨＬＥバージョンと比較して、インビボで驚くほど増加した滞留時間を示す。

【0277】

「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的過程、例えば代謝、排泄などを通じて排出される時間を意味する。「肝臓の初回通過代謝」は、肝臓との初回接触時、すなわち肝臓を最初に通過する間に代謝される薬物の傾向を意味する。「分布容積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織及び臓器などのような、身体の様々な区画にわたる薬物の保持度並びにこれらの区画内での薬物の分布を意味する。「血清結合の程度」は、薬物がアルブミンなどの血清タンパク質と相互作用して結合し、薬物の生物活性の低減又は消失をもたらす傾向を意味する。

【0278】

薬物動態パラメータは、投与される所与量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの作用発現及び／又はＣｍａｘも含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液コンパートメント中の薬物の量を意味する。「ラグタイム」は、薬物の投与から、血液又は血漿中での薬物の検出及び測定が可能になるまでの遅延時間を意味する。「Ｔｍａｘ」は、その後に薬物の最高血中濃度に到達する時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物によって得られる最高血中濃度である。薬物が生物学的効果に必要とされる血中濃度又は組織濃度に達するまでの時間は、全てのパラメータに影響される。先に概説したチンパンジーではない霊長類における前臨床動物試験において決定され得る種間特異性を示す二重特異性抗体コンストラクトの薬物動態パラメータは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）において記載されるとおりの細胞障害アッセイによって決定され得る。

【0279】

本発明の好ましい態様では、医薬組成物は、約－２０℃で少なくとも４週間安定である。付属の実施例から明らかなように、対応する最先端の抗体コンストラクトの質に対する本発明の抗体コンストラクトの質は、異なる系を使用して試験され得る。それらの試験は、「ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ５Ｃ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ６Ｂ」に準拠するものであることが理解され、それにより、その産物の同一性、純度及び能力の変化の確実な検出をもたらす安定性指標プロファイルを提供するよう選択される。純度という用語は、相対的な用語であることが十分に受け入れられている。グリコシル化、脱アミド又は他の異種性の影響に起因して、生物工学的／生物学的産物の絶対的な純度は、通常、２つ以上の方法によって評価されるべきであり、得られる純度の値は、方法依存的である。安定性試験の目的のために、純度の試験は、分解産物の決定方法に合わせるべきである。

【0280】

本発明の抗体コンストラクトを含む医薬組成物の品質の評価のために、例えば溶液中の可溶性凝集物の含有量（サイズ排除によるＨＭＷＳ）を分析することによって分析され得る。約－２０℃での少なくとも４週間の安定性は、１．５％ＨＭＷＳ未満、好ましくは１％ＨＭＷＳ未満の含有量によって特徴付けられる。

【0281】

本明細書における好ましい製品品質の分析方法は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）である。ＳＥ－ＨＰＬＣは通常、サイズ排除カラム及びＵＨＰＬＣシステム、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００サイズ排除カラム（４．６×１５０ｍｍ、１．７μｍ）及びＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣシステムを使用して実施される。タンパク質試料は、例えば、０．４ｍＬ／分の流速で、例えば、ＮａＣｌ塩を含有するリン酸緩衝液（移動相は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌであった）を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。通常、約６μｇの試料がロードされる。

【0282】

ＣＭプロセスが開始される前に、通常、二重特異性抗体コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルが解凍される。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁される。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成する（例えば、１０Ｌ又は５０Ｌ以上のスケール）。

【0283】

細胞が本明細書に指定されるとおりの濃度範囲で生産バイオリアクターに播種されると、本明細書に記載されるとおり及び静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの好ましい設定値に細胞密度及び生物量を増加させるために、数日間、典型的には約７～２８日間、初期の細胞増殖期が存在する。生産バイオリアクターは、好ましいｐＨ、典型的には約６～７．４、例えばｐＨ６．８５、溶存酸素、例えば６４ｍｍ Ｈｇ、及び約３６℃で制御される。灌流培養は、細胞増殖期の数日後、典型的には２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日目、好ましくは４日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）などのフィルター、及び好適な既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（例えば、Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、本明細書に記載されるとおりのＶＶＤ灌流量、例えば０．４バイオリアクターＶＶＤの灌流量で開始される。灌流量は通常、例えば、４日目の０．４ＶＶＤから１２日目の２ＶＶＤへと徐々に増加される。段階的なＶＶＤ増加の最終日に生物量設定値に到達すると、細胞培養温度は通常、例えば、３３．５℃に下げられ、ＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、二重特異性抗体コンストラクトを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、本明細書に記載されるとおりの期間、例えば、少なくとも７、１４、２８又は４０日の追加の日数、好ましくは少なくとも２８日間、設定された灌流量、通常、段階的な増加が導く最高ＶＶＤ灌流量（すなわち、定常状態の細胞比灌流量、ＣＳＰＲ、例えば、０．０２～０．０３ｎＬ／細胞－日）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて好ましい生物量設定値を維持することによって継続される。細胞密度（ＣＤＶ、例えば、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡによって測定される）、代謝産物（例えば、ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡによって測定される）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析によって測定される）は通常、培養期間全体にわたって測定される。ＨＣＣＦは、好ましくは室温で連続的に又は例えば６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０若しくは１４４時間の増分で回収され、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進める。例えば、２６、２７、３４、４０日目のプロテイン－Ｌからの溶出物が、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング及び／又はＨＣＰ ＥＬＩＳＡを使用して、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析される。
化学修飾に関するトリプシンペプチドマッピング
二重特異性抗体コンストラクトのタンパク質試料は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０Ｋデバイスを使用して、フィルターに基づく方法で消化される。タンパク質試料は、フィルター上に添加され、遠心分離されて試料マトリックスが除去され、続いて例えば、メチオニンを含有する６Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液中で変性させられ、例えば、５００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により例えば３７℃で３０分間還元され、その後例えば、５００ｍＭのヨード酢酸（ＩＡＡ）（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との例えば、室温の暗所での２０分間のインキュベーションによりアルキル化される。未反応のＩＡＡは、ＤＴＴの添加によってクエンチされる。上記の全ての工程はフィルター上で行われた。その後、試料は、遠心分離によって消化緩衝液（例えば、メチオニンを含有する５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８）へと緩衝液交換されて、残留しているＤＴＴ及びＩＡＡが除去される。トリプシン消化は、例えば、３７℃で１時間、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上で実施される。消化混合物は、遠心分離によって回収され、続いて、例えば、ｐＨ４．７の酢酸緩衝液中の８ＭのＧｕＨＣｌを添加することによってクエンチされる。

【0284】

液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）分析は、質量分析計、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅに直接的に結合された超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｕ－３０００を使用して実施される。タンパク質消化物は、５０℃で維持されたカラム温度によるＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ ＲＲ ＨＤカラム（２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して逆相によって分離された。移動相Ａは、水中の０．０２０％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）からなり、移動相Ｂは、アセトニトリル（Ｉ）中の０．０１８％（ｖ／ｖ）ＦＡであった。およそ５μｇの消化された二重特異性抗体コンストラクトが、カラムに注入される。勾配（例えば、１４５分間の０．５～３６％Ｂ）を使用して、例えば、０．２ｍＬ／分の流速でペプチドを分離する。溶出されたペプチドはＭＳによってモニターされる。

【0285】

ペプチドの同定及び修飾の分析のために、データ依存的タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）実験が通常利用される。フルスキャンは通常、例えば、陽イオンモードにおいて２００～２０００ｍ／ｚで取得され、続いて、例えば、６回のデータ依存的ＭＳ／ＭＳスキャンを行い、ペプチドの配列を同定する。定量化は、下の式を使用して、選択イオンモニタリングの質量分析データに基づく。

【0286】

【数2】

【0287】

式中、修飾％は、修飾ペプチドのレベルであり、Ａ_修飾は、修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積であり、Ａ_無修飾は、無修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積である。
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗ＨＣＰ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びＨＣＰ較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗ＨＣＰ ＩｇＧ－ビオチン（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン（商標）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ－コンジュゲート）（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ－ＧＥ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（例えば、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）がプレートに添加される。発色は１Ｍのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。

【0288】

医薬組成物としての抗体コンストラクトのための好ましい製剤は、例えば、下記のとおりの製剤の成分を含み得る：
・製剤：
ｐＨ６．０のリン酸カリウム、Ｌ－アルギニン塩酸塩、トレハロース、ポリソルベート８０
医薬組成物の形態の本発明の抗体コンストラクトの安定性の評価に関する他の例は、付属の実施例４～１２に提供される。それらの実施例において、本発明の抗体コンストラクトの実施形態は、異なる医薬製剤において異なるストレス条件に関して試験され、その結果が当技術分野で知られる他の半減期延長（ＨＬＥ）形式の二重特異性Ｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクトと比較される。一般に、本発明による特定のＦｃ様式で提供される抗体コンストラクトは、通常、異なるＨＬＥ形式とともに提供される抗体コンストラクト及びいかなるＨＬＥ形式も有しない抗体コンストラクト（例えば、「カノニカル」な抗体コンストラクト）の両方と比較して、温度及び光ストレスなどの広範囲のストレス条件に対してより安定であることが想定される。前述の温度安定性は、低温（凍結温度を含む室温未満）及び高温（体温までの又は体温を超える温度を含む室温超）の両方に関連し得る。当業者が認めるとおり、診療において避けるのが困難なストレスに対するそのような安定性の向上により、診療において分解産物がより少なくなるため、抗体コンストラクトがより安全になる。結果として、前述の安定性の向上は、安全性の向上を意味する。

【0289】

一実施形態は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患又は免疫障害の予防、治療又は改善に使用するための本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを提供する。

【0290】

本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において、本明細書に記載される病的な医学的状態を治療、改善及び／又は予防する医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的治療及び予防的又は抑止的手段の両方を指す。治療は、疾患、疾患の症状又は疾患素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、好転させる又は影響を与えることを目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状又は疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織又は細胞に対する製剤の適用又は投与を含む。

【0291】

本明細書で使用する場合、用語「改善」は、本発明による抗体コンストラクトのそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の疾患状態のあらゆる好転を指す。そのような好転は、患者の腫瘍又は癌若しくは転移性癌の進行の緩徐化又は停止として見られる場合もある。本明細書で使用する場合、用語「予防」は、本発明による抗体コンストラクトのそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の発症又は再発の回避を意味する。

【0292】

用語「疾患」は、本明細書に記載される抗体コンストラクト又は医薬組成物を用いた治療から恩恵を被ることになる任意の病態を指す。これは、哺乳動物を対象の疾患に罹患させやすくする病的状況を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。

【0293】

「新生物」は、組織の異常な増殖であり、必ずしもそうとは限らないが、通常、腫瘤を形成する。また、腫瘤を形成する場合、それは、一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物又は腫瘍は、良性、潜在性悪性（前癌性）又は悪性であり得る。悪性新生物は、一般に癌と呼ばれる。それらは、通常、周囲の組織に侵入してそれを破壊し、転移を形成し得、すなわち、それらは、身体の他の部分、組織又は臓器に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、原発腫瘍のもの以外の他の組織又は臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的において、それらは、用語「腫瘍」又は「癌」にも包含される。

【0294】

用語「ウイルス性疾患」は、対象のウイルス感染の結果である疾患を表す。
本明細書で使用する場合、用語「免疫障害」は、この用語の一般的な定義に沿って自己免疫疾患、過敏症、免疫不全などの免疫障害を表す。

【0295】

一実施形態では、本発明は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患又は免疫障害の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを投与する工程を含む方法を提供する。

【0296】

用語「必要とする対象」又は「治療を必要とする」対象は、すでにその障害を有する対象及びその障害が予防されることになる対象を含む。必要とする対象又は「患者」は、予防的治療又は治療的治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。

【0297】

本発明の抗体コンストラクトは、一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で製剤化される。

【0298】

したがって、製剤及び組成物は、本発明に従って任意の好適な投与経路による送達に合わせて設計され得る。本発明に関連して、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、８３ｙｏｐｈｉｌｉｓａ、耳介／耳、膣、粘膜）；
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）
を含むが、これらに限定されない。

【0299】

本発明の医薬組成物及び抗体コンストラクトは、例えば、ボーラス注射などの注射による、又は持続注入などの注入による、非経口投与、例えば、皮下又は静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。

【0300】

特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療薬の流入を調整するための、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現され得る。本発明の抗体コンストラクトを含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与され得る。そのようなポンプシステムは、一般に当技術分野で知られており、通常、注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合でも、カートリッジ交換前の投与段階及びカートリッジ交換後の投与段階はなお、ともにこのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内と見なされるであろう。

【0301】

本発明の抗体コンストラクトの連続投与又は中断のない投与は、流体をレザバーから送り出すための流体送出機構及び送出機構を駆動するための駆動機構を含む、流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定又は装着することでポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間～数日間装着することができる。レザバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのレザバーの容積は、０．１～５０ｍｌであり得る。

【0302】

連続投与は、皮膚に装着され時折交換されるパッチによって経皮的でもあり得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば、第１の使用済みパッチの直接隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は生じない。

【0303】

医薬組成物が凍結乾燥されている場合、まず凍結乾燥材料を投与前に適切な液体で再構成する。凍結乾燥材料を、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成し得る。

【0304】

本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトをチンパンジーではない霊長類、例えばマカクに用量を増加させながら投与することによる用量漸増試験によって決定できる好適な用量で対象に投与することができる。上述のとおり、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトは、チンパンジーではない霊長類の前臨床試験において同一の形態で使用でき、且つヒトにおける薬物として使用できるという利点がある。投与計画は、主治医が臨床的要因によって決定することになる。医学分野でよく知られるとおり、ある１人の患者に対する投与量は、その患者の体格、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態並びに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。

【0305】

用語「有効用量」又は「有効投与量」は、所望の効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効用量」は、疾患にすでに罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量又は用量は、治療される病態（適応症）、送達される抗体コンストラクト、治療の内容及び目的、疾患の重症度、前治療、患者の病歴及び治療薬に対する反応性、投与経路、体格（体重、体表面積又は臓器サイズ）及び／又は患者の状態（年齢及び全身健康状態）並びに患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。適当な用量は、１回の投与又は複数回にわたる投与で患者に投与できるように、また最適な治療効果を得るために主治医の判断に従って調整することができる。

【0306】

典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ～最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ～最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

【0307】

治療有効量の本発明の抗体コンストラクトは、好ましくは、疾患症状の重症度を低下させるか、疾患症状がない期間の頻度若しくは期間を増加させるか、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害を防止する。標的細胞の抗原発現腫瘍の治療に関して、治療有効量の本発明の抗体コンストラクト、例えば抗標的細胞抗原／抗ＣＤ３抗体コンストラクトは、好ましくは、細胞増殖又は腫瘍増殖を未治療の患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、有効性を予測する動物モデルにおいて評価され得る。

【0308】

医薬組成物は、１回の治療で投与することも、又は必要に応じて抗癌療法などの追加治療、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と併用して投与することもできる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の抗体コンストラクトを含む組成物と同時に投与され得るか、又は前記抗体コンストラクトの投与前若しくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与され得る。

【0309】

本明細書で使用する場合、用語「有効且つ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずに又は本質的に生じさせずに、病的細胞の激減、腫瘍の除去、腫瘍の縮退又は疾患の安定化をもたらすのに十分である、本発明の抗体コンストラクトの許容用量を指す。そのような有効且つ非毒性用量は、例えば、当技術分野で記載されている用量漸増試験によって決定され得、その用量は、重篤な有害副事象を誘発する用量未満であるべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。

【0310】

本明細書で使用する場合、用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全身的な薬物忍容性の欠如及び／又は投与後の局所的な忍容性の欠如を指す場合がある。毒性は、その薬物によって引き起こされる催奇性作用又は発癌性作用も含み得る。

【0311】

本明細書で使用する場合、用語「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、投与直後に（局所耐性）及びより長期の薬物適用期間中に重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、例えば、治療中及び経過観察期間中に定期的に評価することができる。測定値は、臨床評価、例えば臓器の所見及び臨床検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ－ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準に従って正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の所見は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査並びに他の体液、例えば血清、血漿、リンパ液又は脊髄液、髄液などの検査を含む。したがって、安全性は、例えば、身体検査、画像化技術（すなわち超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いた他の計測（すなわち心電図）、バイタルサインにより、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法において、チンパンジーではない霊長類における有害事象は、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法により試験され得る。

【0312】

上記の用語は、例えば、１９９７年７月１６日のＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇでも参照されている。

【0313】

最後に、本発明は、本発明の抗体コンストラクト、本発明の方法に従って作製された抗体コンストラクト、本発明の医薬組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター及び／又は本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。

【0314】

本発明に関連して、用語「キット」は、２つ以上の構成要素がコンテナ、容器又は他にまとめて梱包されており、構成要素の１つが本発明の抗体コンストラクト、医薬組成物、ベクター又は宿主細胞に相当するものを意味する。したがって、キットは、単品として販売することができる特定の目的を達成するのに十分な製品及び／又は用具の一式であると説明することができる。

【0315】

キットは、投与に適した投与量（上記を参照されたい）の本発明の抗体コンストラクト又は医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ及び材質（好ましくは防水性、例えばプラスチック又はガラス）の１つ以上の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットは、（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態の）使用のための指示書、本発明の抗体コンストラクトを投与するための手段、例えばシリンジ、ポンプ、インフューザーなど、本発明の抗体コンストラクトを再構成するための手段及び／又は本発明の抗体コンストラクトを希釈するための手段をさらに含み得る。

【0316】

本発明は、単回用量投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥／凍結乾燥された抗体コンストラクトを含む第１の容器及び水性製剤を含む第２の容器も含み得る。本発明のある種の実施形態では、単一チャンバー及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び溶解シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。

【0317】

本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことが認められる。したがって、例えば、「試薬」に対する参照は、１つ以上のこのような種々の試薬を含み、「方法」に対する参照は、本明細書に記載される方法のために改変され得るか又は本明細書に記載される方法と置換され得る、当業者に知られる均等な工程及び方法に対する参照を含む。

【0318】

別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されるものとする。

【0319】

用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。

【0320】

本明細書で使用する場合、用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内及びより好ましくは５％以内を意味する。ただし、この用語は、具体的な数字も含み、例えば、約２０は、２０を含む。

【0321】

用語「～未満」又は「～より大きい」は、具体的な数字を含む。例えば、２０未満は、未満又はそれに等しいことを意味する。同様に、～を超える又は～より大きいは、それぞれ～を超える若しくはそれに等しい、又は～より大きい若しくはそれに等しいことを意味する。

【0322】

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などのバリエーションは、述べられる整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」若しくは「包含する」又は本明細書で使用する場合にはときに用語「有する」とも置き換えることができる。

【0323】

本明細書で使用する場合、「～からなる」は、請求項の要素で特定されていない任意の要素、工程又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「～から本質的になる」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。

【0324】

本明細書では、各場合において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかを他の２つの用語のいずれかに置き換え得る。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬及び物質などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するように意図されてはおらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。

【0325】

本明細書の本文全体において引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾又は一致しない限り、本明細書は、いかなるこのような資料よりも優先される。
非限定的に本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、
前記第１の結合ドメインが前記第２の結合ドメインとは異なる標的に結合する二重特異性抗体製品の生産のための連続的な上流製造プロセスであって、前記プロセスが：
（ｉ）灌流バイオリアクター中に少なくとも１つの哺乳動物細胞培養物を含む液体細胞培養培地を供給する工程であって、前記哺乳動物細胞培養物が、前記二重特異性抗体製品を発現することができ、且つ前記細胞が、前記灌流バイオリアクター中における播種時に少なくとも０．４×１０ ^６ 細胞／ｍＬの濃度を有する工程、
（ｉｉ）バイオリアクターから前記細胞を除去することなく、灌流量（Ｄ）を適用して好ましくは連続的な様式で前記液体細胞培養培地を交換することによって、前記哺乳動物細胞培養物を増殖させる工程であって、前記灌流量が最初のうちは、少なくとも０．４の１日当たりの容器容量（ｖｖｄ）に相当し、続いて連続的に、徐々に又は漸増的に、少なくとも１ｖｖｄに増加され、その時、生物量設定値に達し、前記生物量設定値が、少なくとも３５×１０ ^６ 細胞／ｍＬの生細胞密度（ＶＣＤ）に等しい工程、
（ｉｉｉ）好ましくはバイオリアクターから前記細胞を除去することなく、前記灌流量（Ｄ）を適用して連続的又は漸増的に前記液体細胞培養培地を交換することによって灌流培養を維持し、その時、前記生物量設定値に達する工程であって、工程（ｉｉｉ）における前記灌流量が、少なくとも１ｖｖｄに相当する工程、及び
（ｉｖ）任意選択的に前記バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、前記生物量設定値を維持する工程であって、
前記バイオリアクター中の前記二重特異性抗体製品濃度が、工程（ｉｉ）～（ｉｖ）の全体にわたって前記液体細胞培養培地から前記二重特異性抗体製品を連続的に収集することによって３．５ｇ／Ｌ未満に保たれる工程
を含む、連続的な上流製造プロセス。
［態様２］
工程（ｉ）において、前記細胞が、前記バイオリアクター中における播種時に少なくとも１×１０ ^６ 細胞／ｍＬの濃度を有する、態様１に記載のプロセス。
［態様３］
工程（ｉｉ）において、前記生物量設定値が、少なくとも６５×１０ ^６ 細胞／ｍＬのＶＣＤに等しい、態様１に記載のプロセス。
［態様４］
工程（ｉｉ）において、前記生物量設定値が、少なくとも７１×１０ ^６ 細胞／ｍＬのＶＣＤに等しい、態様１に記載のプロセス。
［態様５］
工程（ｉｉ）において、前記細胞培養の前記増殖が、少なくとも４日間、好ましくは少なくとも７日間、好ましくは１２日間起こる、態様１に記載のプロセス。
［態様６］
工程（ｉｉ）において、前記灌流量（Ｄ）が、０．４～７ｖｖｄの範囲である、態様１に記載のプロセス。
［態様７］
工程（ｉｉｉ）において、前記灌流量（Ｄ）が、１～７ｖｖｄの範囲である、態様１に記載のプロセス。
［態様８］
工程（ｉｉｉ）において、前記灌流量（Ｄ）が、２～６．４ｖｖｄの範囲であり、好ましくは２ｖｖｄ、最も好ましくは２．０１ｖｖｄに等しい、態様１に記載のプロセス。
［態様９］
工程（ｉｉｉ）において、前記灌流量（Ｄ）が、０．０１～０．１５ｎＬ／細胞－日（１日当たりの細胞当たりのｎＬ）の範囲、好ましくは０．０１５～０．０３５ｎＬ／細胞－日の範囲又は０．０５１～０．１ｎＬ／細胞－日の範囲の細胞比灌流量（ＣＳＰＲ）である、態様１に記載のプロセス。
［態様１０］
工程（ｖ）において、前記二重特異性抗体製品濃度が、１．２ｇ／Ｌ未満、好ましくは０．５ｇ／Ｌ未満、最も好ましくは０．１２ｇ／Ｌ未満に保たれる、態様１に記載のプロセス。
［態様１１］
工程（ｉｖ）における収集前の前記バイオリアクターにおける前記二重特異性抗体製品の滞留時間が、最大２日、好ましくは最大１日、最も好ましくは最大０．５日である、態様１に記載のプロセス。
［態様１２］
単離された前記二重特異性抗体のパーセンタイル単量体含量が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、９０％、９３％若しくは９５％である、態様１に記載のプロセス。
［態様１３］
前記二重特異性抗体製品が、二重特異性全長抗体又は非全長二重特異性抗体コンストラクトである、態様１に記載のプロセス。
［態様１４］
前記二重特異性抗体製品が、第１及び／又は第２の結合ドメインが標的及び／又はエフェクター細胞に結合する二重特異性全長抗体である、態様１３に記載のプロセス。
［態様１５］
前記二重特異性抗体コンストラクトが、半減期延長部分、好ましくはＩｇＧ抗体に由来するＦｃに基づく半減期延長部分、最も好ましくはｓｃＦｃ半減期延長部分を含む、態様１３に記載のプロセス。
［態様１６］
前記二重特異性抗体コンストラクトが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））である、態様１３に記載のプロセス。
［態様１７］
前記二重特異性抗体製品の前記第１の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ、ＣＤＨ１９、ＦＬＴ３、ＤＬＬ３、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ及びＰＳＭＡからなる群から選択される少なくとも１つの標的細胞の表面抗原に結合する、態様１に記載のプロセス。
［態様１８］
前記二重特異性抗体製品の前記第２の結合ドメインが、ＣＤ３に結合する、態様１に記載のプロセス。
［態様１９］
前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｂ）配列番号２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｃ）配列番号４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号４４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号４７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｄ）配列番号５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｅ）配列番号６５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｆ）配列番号８３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号８６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号８７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号８８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｇ）配列番号９４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号９６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号９９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｈ）配列番号１０５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１０６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１０７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１０９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｉ）配列番号１１５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１１７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１１８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｊ）配列番号１２６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１２８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１２９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｋ）配列番号１３７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１３９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１４０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、
（ｌ）配列番号１５２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５３に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１５４に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１５５に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５６に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３、並びに
（ｍ）配列番号１６７に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１６８に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１６９に示されるとおりのＣＤＲ－Ｈ３、配列番号１７０に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７１に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１７２に示されるとおりのＣＤＲ－Ｌ３
からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域並びにＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含む、態様１に記載のプロセス。
［態様２０］
収集された前記二重特異性抗体製品が、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）に含まれる、態様１に記載のプロセス。
［態様２１］
前記ＨＣＣＦが、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は工程（ｉｉｉ）のみから得られる、態様１に記載のプロセス。
［態様２２］
前記ＨＣＣＦが、好ましくは室温で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０及び／又は１４４時間刻みで、又は連続的に回収され、さらなる処理、例えば、前記二重特異性抗体製品を捕捉するために下流工程に渡される、態様１に記載のプロセス。
［態様２３］
前記下流工程が、捕捉クロマトグラフィー、ウイルス不活性化及び／又はポリッシング工程を含む、態様２１に記載のプロセス。
［態様２４］
前記灌流培養が、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８日間、最も好ましくは少なくとも３５日間、規定の細胞比灌流量で供給し、前記バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、前記生物量設定値を維持することによって連続的に行われている、態様１に記載のプロセス。
［態様２５］
少なくとも生物量制御デバイス、ＤＯ制御デバイス及びレベル制御デバイス、並びに灌流流量調節デバイスを有する注入口、並びに細胞保持デバイス及びＨＣＣＦ流量調節デバイスを有する放出口を備える灌流バイオリアクターを含む、態様１に記載の連続的な上流製造プロセスを実施するための装置。
［態様２６］
態様１に記載の連続的な上流製造プロセスによって生産される二重特異性抗体製品。

【0326】

本発明及びその利点のより適切な理解が以下の実施例から得られることになるが、本実施例は、例示目的で提供されるにすぎない。本実施例は、決して本発明の範囲を限定するように意図されていない。

【実施例】

【0327】

実施例１：ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの生産のためのフェドバッチと連続製造様式の比較
ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌ又は５００Ｌのスケール）。

【0328】

細胞が１．５×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、２、５、７、９、１１及び１３日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．８５、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で維持され、ほぼ７日目に３３．５℃まで温度を変化させた。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の１５日後、遠心分離及び濾過により収集及び清澄化が実施されて、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得て、これは、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められ、溶出物は、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡを用いて製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。
ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスが開始される前に、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルが解凍された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（１０Ｌ又は５０Ｌのスケール）。

【0329】

細胞が０．７×１０^６細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの７０ｐＦ／ｃｍ（６０～８０×１０^６細胞／ｍＬ）の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのに１２日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．８５、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期の４日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、１日当たり０．４バイオリアクター容量（ＶＶＤ）の灌流量で開始された。灌流量は、４日目の０．４ＶＶＤから１２日目の２ＶＶＤへと徐々に増加された。１２日目に生物量設定値に到達すると、細胞培養温度は３３．５℃に下げられ、ＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、さらに２８日間、２ＶＶＤ灌流量（０．０２～０．０３ｎＬ／細胞－日の定常状態の細胞比灌流量、ＣＳＰＲ）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。ＨＣＣＦは、室温にて２４時間の増分で回収され、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進めた。２６、２７、３４、４０日目のプロテイン－Ｌからの溶出物が、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング及びＨＣＰ ＥＬＩＳＡを使用して、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。

【0330】

ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＣＭの細胞培養の性能（図２、表４）、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物のレベル（表４）は、ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＦＢプロセスと比較して改善された。ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの上流ＣＭプロセスにより、より高い容量生産性、より少ない化学的及び物理的な製品の劣化、並びにプロセスに関連する不純物の減少が実証された。表４に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。
製品品質の分析方法
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）
弱カチオン交換（ＣＥＸ）分離は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ－１０カラム（４．０×２５０ｍｍ、１０μｍ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００シリーズを使用して実施された。タンパク質試料は、製剤緩衝液を使用して２２．５μｇ／ｍＬに希釈され、続いてローディングの前に２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホニック（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．８）で調整され、ＮａＣｌの増加性の勾配を用いて３０℃の設定温度で分離された。移動相Ａは、ｐＨ５．８の２０ｍＭのＭＥＳであり、移動相Ｂは、ｐＨ５．８の２０ｍＭのＭＥＳ及び１．０ＭのＮａＣｌであった。直線勾配は、０．５ｍＬ／分の流速にて５５分で７％Ｂから５４％Ｂへと実施された。およそ１．５μｇの試料が注入され、シグナルは、ＦＬ検出（２８０ｎｍでの励起、３４５ｎｍでの発光）でモニターされた。
化学修飾に関するトリプシンペプチドマッピング
ＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのタンパク質試料は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０Ｋデバイスを使用して、フィルターに基づく方法で消化された。タンパク質試料は、フィルター上に添加され、遠心分離されて試料マトリックスが除去され、続いてメチオニンを含有する６Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液中で変性させられ、５００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により３７℃で３０分間還元され、その後５００ｍＭのヨード酢酸（ＩＡＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との室温の暗所での２０分間のインキュベーションによりアルキル化された。未反応のＩＡＡは、ＤＴＴの添加によってクエンチされた。上記の全ての工程はフィルター上で行われた。その後、試料は、遠心分離によって消化緩衝液（メチオニンを含有する５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８）へと緩衝液交換されて、残留しているＤＴＴ及びＩＡＡが除去された。トリプシン消化は、３７℃で１時間、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上で実施された。消化混合物は、遠心分離によって回収され、続いて、ｐＨ４．７の酢酸緩衝液中の８ＭのＧｕＨＣｌを添加することによってクエンチされた。

【0331】

液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）分析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に直接的に結合されたＴｈｅｒｍｏ Ｕ－３０００超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムを使用して実施された。

【0332】

タンパク質消化物は、５０℃で維持されたカラム温度によるＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ ＲＲ ＨＤカラム（２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ）を使用して逆相によって分離された。移動相Ａは、水中の０．０２０％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）からなり、移動相Ｂは、アセトニトリル（Ｉ）中の０．０１８％（ｖ／ｖ）ＦＡであった。およそ５μｇの消化されたＣＤ１９ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトが、カラムに注入された。勾配（１４５分間の０．５～３６％Ｂ）を使用して、０．２ｍＬ／分の流速でペプチドを分離した。溶出されたペプチドはＭＳによってモニターされた。

【0333】

ペプチドの同定及び修飾の分析のために、データ依存的タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）実験が利用された。フルスキャンは、陽イオンモードにおいて２００～２０００ｍ／ｚで取得され、続いて、６回のデータ依存的ＭＳ／ＭＳスキャンを行い、ペプチドの配列を同定した。定量化は、下の式を使用して、選択イオンモニタリングの質量分析データに基づいた。

【0334】

【数3】

【0335】

式中、修飾％は、修飾ペプチドのレベルであり、Ａ_修飾は、修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積であり、Ａ_無修飾は、無修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積である。
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗ＨＣＰ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びＨＣＰ較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗ＨＣＰ ＩｇＧ－ビオチン（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン（商標）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ－コンジュゲート）（Ａｍｅｒｓｈａｍ－ＧＥ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）がプレートに添加される。発色は１Ｍのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。

【0336】

【表4】

【0337】

【表5】

【0338】

実施例２：ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの生産のためのフェドバッチと連続製造様式の比較
ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0339】

細胞が１．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、及び８日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃一定で維持された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の１２日後、細胞培養上清が固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製され、溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。
ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスは、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0340】

細胞が５～１０×１０^６細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの８０ｐＦ／ｃｍ（６０～８０×１０^６細胞／ｍＬ）の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのにおよそ６日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期のおよそ１日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、０．５ＶＶＤの灌流量で開始された。灌流量は、１日目の０．５ＶＶＤから４日目の２ＶＶＤへと徐々に増加された。およそ６日目に生物量設定値に到達すると、ＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、さらに２９日間、２ＶＶＤ灌流量（０．０２～０．０３ｎＬ／細胞－日の定常状態のＣＳＰＲ）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。５、１０、１５、２０、２５、３０及び３５日目からの浸透液試料が、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製され、溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。表５に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。

【0341】

ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＣＭプロセスの細胞培養の性能（図３、表５）及び製品品質の特質（表５）は、同じＣＨＯ細胞株を使用するＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＦＢプロセスと比較して改善された。特に、ＣＭプロセス浸透液における濃度が低いほど、ＦＢプロセスと比較して、高分子量（ＨＭＷ）種のレベルが低く且つ製品単量体が多いという相関があった（図４）。ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの上流ＣＭプロセスにより、物理的な製品の劣化が少ない、より高い容量生産性が実証された。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
ＳＥ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００サイズ排除カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）及びＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、０．４ｍＬ／分の流速で、ＮａＣｌ塩を含有するリン酸緩衝液（移動相は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌであった）を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。およそ６μｇの試料がロードされた。

【0342】

【表6】

【0343】

実施例３：ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体の生産のためのフェドバッチと連続製造様式の比較
ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体のフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体（全長）を発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0344】

細胞が１．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、及び８日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃一定で維持された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の１２日後、遠心分離及び濾過により収集及び清澄化が実施されて、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得て、これは、プロテイン－Ａ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められた後、ＮａＣｌ勾配溶出による強カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程が行われた。ＣＥＸ溶出物は、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＲＣＥ－ＳＤＳ）、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡを用いて製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。
ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体の連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスは、ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体を発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。 細胞が５×１０^６細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの８０ｐＦ／ｃｍ（６０～８０×１０^６細胞／ｍＬ）の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのに６日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期の１日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、０．５ＶＶＤの灌流量で開始された。灌流量は、１日目の０．５ＶＶＤから６日目の２ＶＶＤへと徐々に増加された。６日目に生物量設定値に到達すると、ＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体を含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、さらに２８日間、２ＶＶＤ灌流量（０．０２～０．０３ｎＬ／細胞－日の定常状態のＣＳＰＲ）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。ＨＣＣＦは、８～１０日目及び２９～３１日目に回収され、プロテイン－Ａ捕捉クロマトグラフィーへと処理が進められた後、ＮａＣｌ勾配溶出による強カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程が行われた。ＣＥＸ溶出物は、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＲＣＥ－ＳＤＳ）、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡを用いて製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。表６に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。

【0345】

ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体のＣＭプロセスの細胞培養の性能（図５、表６）、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物（表６）は、ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体のＦＢプロセスと比較して改善された。ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体の上流ＣＭプロセスにより、より高い容量生産性、より少ない化学的及び物理的な製品の劣化、並びにプロセスに関連する不純物の減少が実証された。
製品品質の分析方法
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）
強カチオン交換（ＣＥＸ）分離は、ＹＭＣ－ ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆ；１００×４．６ｍｍｌ．Ｄ；５μｍカラム及びＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００シリーズを使用して実施された。タンパク質試料は、ローディングの前に移動相Ａを使用して３．０ｍｇ／ｍＬに希釈され、ＮａＣｌの増加性の勾配を用いて２５℃の設定温度で分離された。移動相Ａは、ｐＨ６．９の２０ｍＭのリン酸ナトリウムであり、移動相Ｂは、ｐＨ６．９の２０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．５ＭのＮａＣｌであった。直線勾配は、０．６ｍＬ／分の流速にて１０分で２％Ｂから２５％Ｂへと実施された。およそ９０μｇの試料が注入され、シグナルは、２８０ｎｍでのＵＶ検出によりモニターされた。
還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＲＣＥ－ＳＤＳ）
還元ＣＥ－ＳＤＳは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ８００ ＰＬＵＳ ＣＥシステム上で実施された。タンパク質試料は、水で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈され、続いてＢｅｃｋｍａｎ ＳＤＳ試料緩衝液中において７０℃で１０分間－βメルカプトエタノール（β－ＭＥ）で還元された（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）。還元され、変性されたタンパク質試料は、非被覆溶融シリカキャピラリー（５０μｍ ＩＤ×３０．０ｃｍ有効長）に動電学的に注入され（２０秒間の５ｋＶ）、ＳＤＳゲル緩衝液を使用して分離され（１５ｋＶで３０分間の分離）、検出結果は、フォトダイオードアレイ検出器による２２０ｎｍのＵＶを使用して得られた。
トリプシンペプチドマッピング
ＴＮＦ－アルファｘＴＬ１Ａ二重特異性抗体のタンパク質試料は、水で３ｍｇ／ｍＬの作業量に希釈され、続いてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する４ＭのＧｕＨＣｌ緩衝液中で変性され、５００ｍＭのＤＴＴにより３７℃で３０分間還元された後、５００ｍＭのＩＡＡとの室温の暗所での２０分間のインキュベーションによりアルキル化される。未反応のＩＡＡは、ＤＴＴの添加によってクエンチされた。試料は脱塩され、重力流によるＮＡＰ－５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）により消化緩衝液（メチオニンを含有する５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８）へと緩衝液交換された。トリプシン消化は、１：１０の比で実施され、３７℃で３５分間インキュベートされた。消化は、１０％のギ酸を用いてクエンチされた。

【0346】

液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）分析は、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計と直接的に結合された温度制御を有するバイナリーポンプ、カラム加熱区画、自動注入装置及び自動回収装置を備えるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙシリーズを使用して実施された。

【0347】

タンパク質消化物は、５０℃で維持されたカラム温度によるＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ ＲＲ ＨＤカラム（２．１×１５０ｍｍ、１．８ｕｍ）を使用して逆相によって分離された。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸からなり、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。勾配（７９分間の１％～３６％Ｂ）を使用して、０．２５ｍＬ／分の流速でペプチドを分離した。溶出されたペプチドはＭＳによってモニターされた。

【0348】

ペプチドの同定及び修飾の分析のために、データ依存的タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）実験が利用された。フルスキャンは、陽イオンモードにおいて２００～２０００ｍ／ｚで取得され、続いて、８回のデータ依存的ＭＳ／ＭＳスキャンを行い、ペプチドの配列を同定した。定量化は、下の式を使用して、選択イオンモニタリングの質量分析データに基づいた。

【0349】

【数4】

【0350】

式中、修飾％は、修飾ペプチドのレベルであり、Ａ_修飾は、修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積であり、Ａ_無修飾は、無修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積である。
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗ＨＣＰ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びＨＣＰ較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗ＨＣＰ ＩｇＧ－ビオチン（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン（商標）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ－コンジュゲート）（Ａｍｅｒｓｈａｍ－ＧＥ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）がプレートに添加される。発色は１Ｍのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。

【0351】

【表7】

【0352】

【表8】

【0353】

実施例４：ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの生産のためのフェドバッチと連続製造様式の比較
ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞（クローンＡ）を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0354】

細胞が１．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、８及び１０日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃一定で維持された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の１２日後、細胞培養上清が固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製され、溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。
ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスは、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0355】

細胞は、１×１０^６細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種され、後の４段階の灌流培養は、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの生物量設定値（表７）を増加させながら試験した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、３日目に、ポリエーテルスルホン ７５０ｋＤａフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、１ＶＶＤの灌流量で開始された。灌流量は、灌流培養の期間に１ＶＶＤで一定に維持されたが、生物量設定値は、４つの異なるＣＳＰＲを達成するように徐々に増加された（表７）。４日目にＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、１ＶＶＤ灌流量で供給し、且つそれに応じて余分な細胞を抜いて４つの生物量設定値を維持することによって２５日目まで継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。１日の浸透液試料が固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製され、溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。

【0356】

ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＣＭプロセスの製品濃度は、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＦＢプロセスより低かった（図６）。ＣＭにおける増大したＶＣＤは、１日単量体量において測定されるとおり製品濃度を及び容量生産性を増大させた（表８）。しかしながら、製品濃度の低下は、より高い単量体レベル及びより低いＨＭＷと相関した（図７及び８）。この相関は、いくつかのＢｉＴＥ製品において見出される（図９）。さらに、高い細胞比灌流速度及び対応する低い製品濃度は、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの凝集の減少と相関した。増大したＶＣＤによりパーセント単量体及び１日単量体量の両方を最大化するために、より高い６．４ＶＶＤの灌流量及び６４．８×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＤが使用され得る（表７）。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
ＳＥ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００サイズ排除カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）及びＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、０．４ｍＬ／分の流速で、ＮａＣｌ塩を含有するリン酸緩衝液（移動相は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌであった）を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。およそ６μｇの試料がロードされた。

【0357】

【表9】

【0358】

【表10】

【0359】

実施例５：ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの生産のためのフェドバッチと連続製造様式のさらなる比較
ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（クローンＢ）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（３Ｌのスケール）。

【0360】

細胞が０．８×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、及び８日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、４８ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で維持された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の最後に、収集及び清澄化が実施されて、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得て、これは、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められ、溶出物はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。
ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスは、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（クローンＢ）を発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（３Ｌのスケール）。

【0361】

細胞が０．７×１０^６細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの７０ｐＦ／ｃｍ（７０～９０×１０^６細胞／ｍＬ）の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのに１２日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．８５、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期の４日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、１日当たり０．５バイオリアクター容量（ＶＶＤ）の灌流量で開始された。灌流量は、４日目の０．５ＶＶＤから８日目の１．８ＶＶＤへと徐々に増加された。生物量設定値に到達すると、細胞培養温度は３３．０℃に下げられ、１２日目にＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、さらに３０日間、２ＶＶＤ灌流量（０．０２～０．０３ｎＬ／細胞－日の定常状態の細胞比灌流量、ＣＳＰＲ）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。ＨＣＣＦは、室温にて２４時間の増分で回収され、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進めた。プロテイン－Ｌからの溶出物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。表９に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。

【0362】

ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＣＭの細胞培養の性能（図１０、表９）及び製品品質の特質レベル（図１１、表９）は、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトのＦＢプロセスと比較して改善された。ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの上流ＣＭプロセスにより、より高い容量生産性、より少ない化学的及び物理的な製品の劣化が実証された。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
ＳＥ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００サイズ排除カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）及びＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、０．４ｍＬ／分の流速で、ＮａＣｌ塩を含有するリン酸緩衝液（移動相は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌであった）を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。およそ６μｇの試料がロードされた。

【0363】

【表11】

【0364】

実施例６：ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの生産のための従来の１５日フェドバッチと複合型の１０日フェドバッチ様式の比較
ＣＭプロセスから製品濃度の低下及び製品の品質の向上の恩恵を受けながら、培養時間を最小化するために、複合型フェドバッチプロセスが試験された。これに関して、プロセスは、播種から７日目までフェドバッチであり、続いて収集のための交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システムを使用して短期間の灌流培養を行った。ＣＭプロセスと同様の方法における製品の除去は、製品濃度を低下させ、且つ製品品質を向上させた。
ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの従来の１５日フェドバッチプロセス（従来のＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（クローンＢ）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（３Ｌのスケール）。

【0365】

細胞が０．８×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、及び８日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、４８ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で維持された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。様々な生産の期間（１０日又は１５日）で、遠心分離に基づく収集及び清澄化が実施されて、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得て、これは、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められ、溶出物はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及びカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。
ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの複合型の１０日フェドバッチプロセス（複合型のＦＢ）
複合型のＦＢプロセスは、従来のＦＢと同じスケールアップ及び生産条件及びサンプリングを使用した。３日間の１ＶＶＤの精密濾過の複合型ＦＢプロセス（複合型－３Ｄ－１ＶＶＤ）の間、３及び６日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。７日目に、培養は、ポリエーテルスルホン ７５０ｋＤａフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、１日当たり１容器容量（１ＶＶＤ）で３日間専売の既知組成フィード培地により灌流された。ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ抗体製品は、フィルターを通して浸透され、７～１０日目の間にＨＣＣＦとして回収された。ＨＣＣＦは、プロテイン－Ｌ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められ、溶出物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及びカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）を使用して、製品品質の特質について分析された。表１０に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。

【0366】

ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの複合型－３Ｄ－１ＶＶＤプロセスの細胞培養の性能（図１２、表１０）及び製品品質の特質レベル（表１０）は、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの従来の１５日ＦＢプロセスと比較して改善された。複合型－３Ｄ－１ＶＶＤの１０日ＦＢは、従来の１５日ＦＢプロセスと同様の容量生産性を実証したが、前者は、より短い期間、より高い１日容量生産性及び向上した製品品質を有した（表１０）。特に、製品凝集が少なく、化学的及び物理的な製品の劣化が少ない、より低いＨＣＣＦ濃度は、ＣＤ３３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ抗体コンストラクトの複合型－３Ｄ－１ＶＶＤの１０日ＦＢプロセスにより実証された。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
ＳＥ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００サイズ排除カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）及びＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、０．４ｍＬ／分の流速で、ＮａＣｌ塩を含有するリン酸緩衝液（移動相は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌであった）を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。およそ６μｇの試料がロードされた。
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）
弱カチオン交換（ＣＥＸ）分離は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐａｋ Ｈｉ Ｒｅｓ ＣＭ ４．６×１００ｍｍカラム及びＷａｔｅｒｓ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）システムを使用して実施された。タンパク質試料は、ローディングの前に製剤緩衝液 １０ｍＭリン酸カリウム、８％スクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、１％（ｗ／ｖ）Ｃａｐｔｉｓｏｌ（ｐＨ６．１±０．０４）で予め条件を整えられた。試料は、２６℃の設定温度、０．ｍＬ／分の流速にて、３種の移動相（Ａ、Ｂ、及びＣ）の様々な勾配下で分離された。移動相ＡはｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウムであり、移動相ＢはｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２５０ｍＭの塩化ナトリウムであり、移動相ＣはｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５００ｍＭの塩化ナトリウムであった。およそ８．０μｇの試料が注入され、シグナルは、ＦＬＤ検出（２８０ｎｍでの励起、３４５ｎｍでの発光）でモニターされた。

【0367】

【表12】

【0368】

【表13】

【0369】

実施例７：ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥの生産のためのフェドバッチと連続製造様式の比較
ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0370】

細胞が１．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、及び８日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で維持され、ほぼ６日目に３４℃まで温度を変化させた。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の１２日後、遠心分離及び濾過により収集及び清澄化が実施されて、収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を得て、これは、プロテイン－Ａ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められ、溶出物は、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム、還元宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ（ｑＰＣＲ）を使用して、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。
ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥの連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスは、ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（１０Ｌ又は５０Ｌのスケール）。

【0371】

細胞が０．７×１０^６細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの７０ｐＦ／ｃｍ（４０～６０×１０^６細胞／ｍＬ）の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのに１２日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期の４日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、１日当たり０．４バイオリアクター容量（ＶＶＤ）の灌流量で開始された。灌流量は、４日目の０．４ＶＶＤから１２日目の２ＶＶＤへと徐々に増加された。１２日目に生物量設定値に到達すると、細胞培養温度は３４℃に下げられ、ＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、さらに２８日間、２ＶＶＤ灌流量（０．０３～０．０５ｎＬ／細胞－日の定常状態の細胞比灌流量、ＣＳＰＲ）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。ＨＣＣＦは、室温にて２４時間の増分で回収され、プロテイン－Ａ捕捉クロマトグラフィーへと処理を進めた。１９及び４０日目（定常状態から７及び２８日目）のプロテイン－Ａからの溶出物が、分析的カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ペプチドマッピング、還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム、還元宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ（ｑＰＣＲ）を使用して、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。

【0372】

ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのＣＭの細胞培養の性能（図１３、表１１）、製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物のレベル（表１１）は、ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのＦＢプロセスと比較して改善された。ＢＣＭＡｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥの上流ＣＭプロセスにより、より高い容量生産性、より少ない化学的及び物理的な製品の劣化、並びにプロセスに関連する不純物の減少が実証された。表１１に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。
製品品質の分析方法
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）
弱カチオン交換（ＣＥＸ）分離は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ－１０カラム（４．０×２５０ｍｍ、１０μｍ）及びＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００シリーズを使用して実施された。タンパク質試料は、移動相Ａにより５００μｇ／ｍＬに希釈され、ＮａＣｌの増加性の勾配を用いて３０℃の設定温度で分離された。移動相Ａは、ｐＨ６．０の５０ｍＭのリン酸ナトリウムであり、移動相Ｂは、ｐＨ６．０の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌであった。直線勾配は、０．５ｍＬ／分の流速にて５０分で１０％Ｂから４０％Ｂへと実施された。およそ５０μｇの試料が注入され、シグナルは、可変波長検出器によって２２０ｎｍでＵＶ検出によりモニターされた。
化学修飾に関するトリプシン／エラスターゼペプチドマッピング
タンパク質試料は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０Ｋデバイスを使用して、フィルターに基づく方法で消化された。タンパク質試料は、フィルター上に添加され、遠心分離されて試料マトリックスが除去され、続いてメチオニンを含有する６Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液中で変性させられ、３７．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により３７℃で３０分間還元され、その後８７．５ｍＭのヨード酢酸（ＩＡＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との室温の暗所での２０分間のインキュベーションによりアルキル化された。未反応のＩＡＡは、ＤＴＴの添加によってクエンチされた。上記の全ての工程はフィルター上で行われた。その後、試料は、遠心分離によって消化緩衝液（メチオニンを含有する５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８）へと緩衝液交換されて、残留しているＤＴＴ及びＩＡＡが除去された。トリプシン消化は、３７℃で１時間、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上で実施された。小さいトリプシン消化物は、遠心分離によって回収され、大きいトリプシン消化物は、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上において３７℃で３０分間実施されるエラスターゼ消化にかけられた。消化混合物は、遠心分離によって回収され、続いて、ｐＨ４．７の２５０ｍＭの酢酸緩衝液中の８ＭのＧｕＨＣｌを添加することによってクエンチされた。

【0373】

液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）分析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計に直接的に結合されたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ超高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用して実施された。

【0374】

タンパク質消化物は、５０℃で維持されたカラム温度によるＷａｔｅｒ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）を使用して逆相によって分離された。移動相Ａは、水中の０．１０％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）からなり、移動相Ｂは、アセトニトリル（ＡＣＮ）中の０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡであった。およそ６．２５μｇの消化されたタンパク質が、カラムに注入された。勾配（７８分間の１～３６％Ｂ）を使用して、０．２５ｍＬ／分の流速でペプチドを分離した。溶出されたペプチドはＭＳによってモニターされた。

【0375】

ペプチドの同定及び修飾の分析のために、データ依存的タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）実験が利用された。フルスキャンは、陽イオンモードにおいて２００～２０００ｍ／ｚで取得され、続いて、５回のデータ依存的ＭＳ／ＭＳスキャンを行い、ペプチドの配列を同定した。定量化は、下の式を使用して、選択イオンモニタリングの質量分析データに基づいた。

【0376】

【数5】

【0377】

式中、修飾％は、修飾ペプチドのレベルであり、Ａ_修飾は、修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積であり、Ａ_無修飾は、無修飾ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム面積である。
還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（還元ＣＥ－ＳＤＳ）
還元ＣＥ－ＳＤＳは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ８００ ＰＬＵＳ ＣＥシステム上で実施された。タンパク質試料は、水で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈され、続いてＢｅｃｋｍａｎ ＳＤＳ試料緩衝液中において７０℃で１０分間β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）で還元された（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）。還元され、変性されたタンパク質試料は、非被覆溶融シリカキャピラリー（５０μｍ ＩＤ×３０．０ｃｍ有効長）に動電学的に注入され（２０秒間の５ｋＶ）、ＳＤＳゲル緩衝液を使用して分離され（１５ｋＶで４０分間の分離）、検出は、フォトダイオードアレイ検出器による２２０ｎｍのＵＶを使用して得られた。
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗ＨＣＰ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びＨＣＰ較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗ＨＣＰ ＩｇＧ－ビオチン（Ａｍｇｅｎ、内製の抗体）がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン（商標）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ－コンジュゲート）（Ａｍｅｒｓｈａｍ－ＧＥ；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）がプレートに添加される。発色は１Ｍのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。
ＤＮＡの方法（ｑＰＣＲ）
試料は、プロテイナーゼＫによる消化によって調製された後、ＤＮＡ抽出及びイソプロピルアルコール沈殿が行われた。ＣＨＯ細胞特異的な反復ＤＮＡ配列（ＲｅｐＡと称される）を増幅するためにプライマーが設計され、それらの間をアニールするために特異的なプローブが設計された。プローブは、その５’末端で蛍光レポーター色素ＦＡＭ（６－カルボキシフルオセイン）により標識され、その３’末端でクエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）により標識される。アニールされたプローブが未変化であるとき、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素の近接によってクエンチされる。各ＰＣＲサイクルの伸長期の間、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼがアニールされたプローブを切断し、プローブからレポーター色素を放出し、蛍光の増加をもたらす。この蛍光の増加は、反応中に存在する増幅された標的ＤＮＡの量に正比例し、リアルタイムＰＣＲ機器によってＰＣＲ反応全体にわたって連続的にモニターされる。増幅の対数期内で、産物配列の量はＤＮＡの開始量に比例する。ＣＨＯ細胞から単離されたゲノムＤＮＡの既知の量の検量線を使用して、原物の試料におけるゲノムＤＮＡの濃度に対して蛍光のレベルを相関させる。

【0378】

【表14】

【0379】

【表15】

【0380】

実施例８：ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥの生産のためのフェドバッチと連続製造様式の比較
ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのフェドバッチプロセス（ＦＢ）
ＦＢプロセスは、ＤＬＬｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0381】

細胞が１．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクターに播種されると、３、６、及び８日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。培養は、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃一定で維持された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。生産の１２日後、細胞培養上清がプロテイン－Ａクロマトグラフィーにより精製され、溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。
ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥの連続製造プロセス（ＣＭ）
ＣＭプロセスは、ＤＬＬｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥを発現するＣＨＯ細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度（ＶＣＤ）で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した（２Ｌのスケール）。

【0382】

細胞が１．５×１０ ^６ 細胞／ｍＬで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定されるとおりの７０ｐＦ／ｃｍ（４０～６０×１０^６細胞／ｍＬ）の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのにおよそ１０日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、ｐＨ６．９、６４ｍｍ Ｈｇの溶存酸素及び３６℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期のおよそ３日目に、ポリエーテルスルホン０．２－μｍフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）濾過システム（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を使用して、０．５ＶＶＤの灌流量で開始された。灌流量は、３日目の０．５ＶＶＤから１０日目の２ＶＶＤへと徐々に増加された。およそ１０日目に生物量設定値に到達すると、ＨＣＣＦの回収が開始され（すなわち、ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）－ＨＬＥを含有する無細胞浸透液）、灌流培養は、さらに１３日間、２ＶＶＤ灌流量（０．０３～０．０５ｎＬ／細胞－日の定常状態のＣＳＰＲ）で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度（ＣＤＶ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、代謝産物（ＮｏｖａＦｌｅｘ、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び浸透液力価（ＨＰＬＣ分析）は、培養期間全体にわたって測定された。１０日目から２３日目までの浸透液試料が、プロテイン－Ａクロマトグラフィーにより精製され、溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して製品品質の特質について分析された。

【0383】

ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのＣＭプロセスの細胞培養の性能（図１４、表１２）及び製品品質の特質（表１２）は、同じＣＨＯ細胞株を使用するＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥのＦＢプロセスと比較して改善された。表１２に示される標準化された値は、ＦＢにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した；ＦＢに関して、これは１に対応し；ＣＭに関しては、記載される比率に対応するある数である。ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥの上流ＣＭプロセスにより、物理的な製品の劣化又は凝集が少ない、より高い容量生産性が実証された。ＤＬＬ３ｘＣＤ３ ＢＩＴＥ（登録商標）－ＨＬＥ ＣＭ及び他のＢｉＴＥ（登録商標）のＣＭプロセスに関して、ＡＴＦ濾過収集プロセスそれ自体が、バイオリアクター中で保持された細胞培養液と比較して、より低い濃度及びより少ないＨＭＷ種の両方を有する浸透液ＨＣＣＦを生成するのに有益である（図１５）。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
ＳＥ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００サイズ排除カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）及びＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、０．４ｍＬ／分の流速で、ＮａＣｌ塩を含有するリン酸緩衝液（移動相は、ｐＨ６．８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌであった）を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、２２０ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターされた。およそ１０μｇの試料がロードされた。
還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（還元ＣＥ－ＳＤＳ）
還元ＣＥ－ＳＤＳは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ８００ ＰＬＵＳ ＣＥシステム上で実施された。タンパク質試料は、製剤緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬまで希釈され、続いてＢｅｃｋｍａｎ ＳＤＳ試料緩衝液中において７０℃で１０分間β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）で還元され（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）、最終濃度を０．４８ｍｇ／ｍＬとした。還元され、変性されたタンパク質試料は、非被覆溶融シリカキャピラリー（５０μｍ ＩＤ×２０．０ｃｍ有効長）に動電学的に注入され（３０秒間の１０ｋＶ）、ＳＤＳゲル緩衝液を使用して分離され（１５ｋＶで４０分間の分離）、検出は、フォトダイオードアレイ検出器による２２０ｎｍのＵＶを使用して得られた。

【0384】

【表16】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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