▶ バソミューン セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧 ▶ ハミルトン， ダグラス エー．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-05
(45)【発行日】2023-09-13
(54)【発明の名称】コロナウイルス治療薬および処置方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/60 20170101AFI20230906BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20230906BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230906BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230906BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230906BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230906BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230906BHJP
C07K 7/00 20060101ALN20230906BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230906BHJP
【ＦＩ】
A61K47/60
A61K38/08 ZNA
A61K38/16
A61K45/00
A61P11/00
A61P31/14
A61P43/00 121
C07K7/00
C12N15/11 Z
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022574090
(86)(22)【出願日】2021-04-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 US2021025819
(87)【国際公開番号】W WO2021207099
(87)【国際公開日】2021-10-14
【審査請求日】2022-11-30
(31)【優先権主張番号】63/005,981
(32)【優先日】2020-04-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522391501
【氏名又は名称】バソミューン セラピューティクス， インコーポレイテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】522391512
【氏名又は名称】ハミルトン， ダグラス エー．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ハミルトン， ダグラス エー．
(72)【発明者】
【氏名】チク， ガニア
【審査官】高橋 樹理
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１２９６１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】CID，2006年，Vol.43, No.6，p.748-756
【文献】EJMO，2020年03月，Vol.4, No.1，p.104-105
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／６０
Ａ６１Ｋ ３８／０８
Ａ６１Ｋ ３８／１６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）【化22】
ｎは、約２５から約１００までの整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、そして
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）またはＴ８ペプチド（配列番号５）である）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物、あるいは前記化合物またはその薬学的に許容される塩と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であって、ヒト被験体におけるコロナウイルス感染症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の処置および／もしくは予防において使用するための、または前記被験体におけるＡＲＤＳの症状を好転することにおいて使用するための、組成物または医薬組成物であって、
ここで、前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
組成物または医薬組成物。
【請求項2】
Ｒが、Ｔ７ペプチド（配列番号１）である、請求項１に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項3】
ｎが、約４０から約７０までの、好ましくは、約４８から約６５までの、より好ましくは、約５５の整数である、請求項１に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項4】
Ｘが、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニレンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項5】
Ｙが、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニレンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項6】
前記式（Ｉ）の化合物が、【化23】
ｎは、約５０～６０の間のまたは約５５の整数であり、そして
Ｒは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）である）
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項7】
前記被験体が、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６およびＩＬ－８から選択される、上昇したレベルの１種または複数の炎症促進性サイトカインを有すると同定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項8】
急性呼吸窮迫症候群が、サイトカインストームを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項9】
前記組成物または医薬組成物が、前記被験体に、第２の治療剤と逐次的にまたは同時発生的に同時投与されるものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項10】
前記第２の治療剤が、抗炎症薬、コロナウイルススパイクタンパク質に対する抗体、および抗ウイルス化合物から選択される、請求項９に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項11】
前記第２の治療剤が、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、レムデシビル、ロピナビル、リトナビル、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログからなる群より選択される抗ウイルス化合物である、請求項１０に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項12】
前記第２の治療剤が、１種または複数の炎症性サイトカインを阻害する抗炎症薬である、請求項１０に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項13】
前記炎症性サイトカイン阻害剤が、エタネルセプト、サリルマブ、トシリズマブ、アダリムマブおよびカナキヌマブからなる群より選択される、請求項１２に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項14】
前記被験体が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を含む前記医薬組成物を投与される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項15】
前記組成物または医薬組成物が、吸入、局所的、全身性、経口、鼻腔内および／または非経口投与によって前記被験体に投与されるものである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項16】
前記処置が、前記被験体における肺内皮細胞の漏出を好転させることを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項17】
前記処置が、前記被験体における肺内皮細胞を安定化することを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項18】
前記被験体が、前記化合物の１回または複数の用量を投与され、各用量が、０．１～１００μｇ／ｋｇの間の前記化合物を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項19】
前記化合物が静脈内注射により投与されるものである、請求項１８に記載の使用のための組成物または医薬組成物。
【請求項20】
式【化24】
ｎは、約５０～６０の間のまたは約５５の整数であり、そして
Ｒは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）である）
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物であって、ヒト被験体におけるコロナウイルス感染症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の処置および／もしくは予防のためのまたは前記被験体におけるＡＲＤＳの症状を好転することのための医薬の製造における使用のための、組成物であって、
ここで、前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／００５，９８１号の優先権を主張する。
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／００５，９８１号の優先権を主張する。
【0002】
発明の分野
本開示は、バスキュロチド（Ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ）と比較して改善された活性を有する薬剤、ならびにその方法および使用に関する。特に、本開示は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、コロナウイルス感染症、例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳ関連肺病理等、呼吸器感染症の処置に関する。
本開示は、バスキュロチド（Ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ）と比較して改善された活性を有する薬剤、ならびにその方法および使用に関する。特に、本開示は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、コロナウイルス感染症、例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳ関連肺病理等、呼吸器感染症の処置に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
いくつかの鍵となる役割を果たす分子が、血管恒常性の維持を調節することが同定された。そのうち最もよく知られたものの１つが、Ｔｉｅ２／アンジオポエチン（Ａｎｇ）シグナル伝達軸である。この受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）およびタンパク質増殖因子（Ａｎｇ）系は、２種の主要増殖因子、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が、血管内皮に位置する同じ受容体を介してそれぞれ抗炎症性または炎症促進性応答を伝播するという点において、若干独特である。大部分の受容体チロシンキナーゼとは異なり、Ｔｉｅ２は、Ａｎｇ１の作用により、正常で健康な内皮細胞において構成的に活性な状態で維持される。この受容体は、増殖ならびに内皮細胞生存（ＭＡＰＫおよびＡＫＴ）、透過性（ＶＥ－カドヘリン）および細胞間相互作用（ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ）を調節するいくつかの細胞内経路を活性化することが見出されており、これらは全て、正常な生理機能において、内皮細胞を静止状態に維持するように協力して働く。Ｔｉｅ２受容体リン酸化を特徴とするこの経路の活性化は、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）シグナルとして機能する；これは、ＶＥＧＦ、セロトニン、ブラジキニン、ヒスタミン、ＰＡＦ、トロンビン、ＬＰＳ、敗血症血清（ｓｅｐｔｉｃ ｓｅｒｕｍ）および炭疽毒素を含む無数の炎症性因子への曝露後の血管漏出の誘導に対抗する（Ｐａｒｉｋｈ ＳＭ， Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ２０１３）。Ａｎｇ２レベルの急激な上昇は、数多くの異なる侵襲後に血管漏出、病的状態および死亡をもたらすことが繰り返し示されてきた。研究は、血管活性化の優位な根底にある状態を規定するのは、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の循環レベルの間の均衡であることを実証した。この事実から、この経路をモジュレートすることを目標とするアプローチは、治療適用を有し得る。
いくつかの鍵となる役割を果たす分子が、血管恒常性の維持を調節することが同定された。そのうち最もよく知られたものの１つが、Ｔｉｅ２／アンジオポエチン（Ａｎｇ）シグナル伝達軸である。この受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）およびタンパク質増殖因子（Ａｎｇ）系は、２種の主要増殖因子、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が、血管内皮に位置する同じ受容体を介してそれぞれ抗炎症性または炎症促進性応答を伝播するという点において、若干独特である。大部分の受容体チロシンキナーゼとは異なり、Ｔｉｅ２は、Ａｎｇ１の作用により、正常で健康な内皮細胞において構成的に活性な状態で維持される。この受容体は、増殖ならびに内皮細胞生存（ＭＡＰＫおよびＡＫＴ）、透過性（ＶＥ－カドヘリン）および細胞間相互作用（ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ）を調節するいくつかの細胞内経路を活性化することが見出されており、これらは全て、正常な生理機能において、内皮細胞を静止状態に維持するように協力して働く。Ｔｉｅ２受容体リン酸化を特徴とするこの経路の活性化は、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）シグナルとして機能する；これは、ＶＥＧＦ、セロトニン、ブラジキニン、ヒスタミン、ＰＡＦ、トロンビン、ＬＰＳ、敗血症血清（ｓｅｐｔｉｃ ｓｅｒｕｍ）および炭疽毒素を含む無数の炎症性因子への曝露後の血管漏出の誘導に対抗する（Ｐａｒｉｋｈ ＳＭ， Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ２０１３）。Ａｎｇ２レベルの急激な上昇は、数多くの異なる侵襲後に血管漏出、病的状態および死亡をもたらすことが繰り返し示されてきた。研究は、血管活性化の優位な根底にある状態を規定するのは、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２の循環レベルの間の均衡であることを実証した。この事実から、この経路をモジュレートすることを目標とするアプローチは、治療適用を有し得る。
【0004】
Ａｎｇの複雑な性質は、これまで精製および治療適用を妨げてきた。そのような訳で、この経路をモジュレートするための代替アプローチが広範に検査された。これまでに２種の主要なアプローチが記載された。第１のアプローチは、圧倒的により一般的であるが、アンタゴニスト性リガンド、Ａｎｇ２の遮断に着目した。このクラスにおける治療薬は、Ａｎｇ２に対する遮断抗体またはペプチボディとして大まかに定義することができる。Ｔｉｅ２標的化モジュレーターの第２のクラスは、Ａｎｇ１の解明された構造的特徴を取り入れている。すなわち、当該の生理活性Ａｎｇ１は、４個以上のサブユニットの多量体として天然に存在する。Ａｎｇ１サブユニットが、Ｔｉｅ２受容体に結合し、その際、隣接受容体にクラスターを形成させる；トランスリン酸化を容易にする構成で受容体を有効に並置することが仮定される。Ｔｉｅ２受容体に対するＡｎｇ１のアゴニスト性作用を模倣するために、隣接受容体に結合し、これにクラスターを形成させる、いくつかの大型の組換えタンパク質が作出された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００２；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． ２００４；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１６；米国特許第８，９５７，０２２号）。
【0005】
バスキュロチド（親バスキュロチドとも呼ばれる）は、Ａｎｇ１の作用を模倣する、合理的に設計された完全に合成の化合物である。バスキュロチドの中心核は、１０ｋＤａの狭い分散度の４腕の（ａｒｍｅｄ）ポリエチレングリコールからなる。高親和性Ｔｉｅ２結合ペプチド、特に、（－ＣＨＨＨＲＨＳＦ－、配列番号６）の共有結合性付着は、活性化マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）基およびアミノ末端システインの反応により容易となる。この構造は、Ｔｉｅ２受容体に結合し、これを活性化するための最適な構成として規定された。親バスキュロチドによるＴｉｅ２の直接的な活性化は、アトピー性疾患およびインフルエンザの前臨床モデルを含む、いくつかの別個のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験において、優勢な抗血管漏出シグナルをもたらすことが示された（Ｂｏｕｒｄｅａｕ Ａ， ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ ２０１６およびＳｕｇｉｙａｍａ ＭＧ， ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５）。
【0006】
コロナウイルス誘導性急性肺傷害またはより重症のおよび関連する診断の急性呼吸窮迫症候群（ＡＬＩ／ＡＲＤＳ）は、世界中で大衆に多大な犠牲を強いている。病原体媒介性ＡＬＩ／ＡＲＤＳの共通の保存された特色は、血管漏出の誘導である。感染に対する宿主の応答、特に、血管漏出の処置における治療アプローチは、常に変異し続けている病原体を特異的に目標とする治療薬で見られる抵抗性の急速な発生を伴うべきではない。現在、肺傷害の処置のために承認された、治療的に標的化されたアプローチは存在しない。コロナウイルス誘導性ＡＬＩ／ＡＲＤＳを処置するための、バスキュロチドおよび本明細書に開示されている化合物等のＴｉｅ２アゴニストの使用は、その有効性が病原体の遺伝的変異によって限定され得るワクチンおよび／または抗ウイルス薬の使用に優る、ある特定の概念的な相違点（ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を提供することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】米国特許第８，９５７，０２２号明細書
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｐａｒｉｋｈ ＳＭ， Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ２０１３
【文献】Ｂｏｕｒｄｅａｕ Ａ， ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ ２０１６
【文献】Ｓｕｇｉｙａｍａ ＭＧ， ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
概要
親バスキュロチドの化学分析は、結果として生じるペプチドＰＥＧコンジュゲートが、５および６員環産物の混合物を含有することを明らかにした（図１Ａ）。示されている５員のスクシンイミド環は、システイン上のチオール基によるマレイミドの直接的なアルキル化の結果として生じ、同じく示されている６員のチアジン（ｔｈｉａｚｉｎ）環は、システインリンカー上の遊離アミン基を介したこの初期産物の転位の結果として生じる。これらの知見は、ペプチドが直鎖状スルファン部分を介してＰＥＧに連結されて、活性化ＰＥＧ四量体を形成した、より単純なバスキュロチドアナログ（Ｍｐａ－Ｂｒ）の開発をもたらした。一実施形態では、Ｍｐａ－Ｂｒは、Ｎ末端におけるアミン側鎖を欠くシステインのアキラルアナログである３－メルカプトプロピオン酸を有するＴ７ペプチドの、ブロモアセトアミド（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｍｉｄｅ）を含有する活性化ＰＥＧ四量体への連結によって調製される（図１Ｂ）。結果として生じるペプチドＰＥＧコンジュゲートは、転位に対して感受性の不安定な環構造を含まない単一の産物を提供する。
親バスキュロチドの化学分析は、結果として生じるペプチドＰＥＧコンジュゲートが、５および６員環産物の混合物を含有することを明らかにした（図１Ａ）。示されている５員のスクシンイミド環は、システイン上のチオール基によるマレイミドの直接的なアルキル化の結果として生じ、同じく示されている６員のチアジン（ｔｈｉａｚｉｎ）環は、システインリンカー上の遊離アミン基を介したこの初期産物の転位の結果として生じる。これらの知見は、ペプチドが直鎖状スルファン部分を介してＰＥＧに連結されて、活性化ＰＥＧ四量体を形成した、より単純なバスキュロチドアナログ（Ｍｐａ－Ｂｒ）の開発をもたらした。一実施形態では、Ｍｐａ－Ｂｒは、Ｎ末端におけるアミン側鎖を欠くシステインのアキラルアナログである３－メルカプトプロピオン酸を有するＴ７ペプチドの、ブロモアセトアミド（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｉｍｉｄｅ）を含有する活性化ＰＥＧ四量体への連結によって調製される（図１Ｂ）。結果として生じるペプチドＰＥＧコンジュゲートは、転位に対して感受性の不安定な環構造を含まない単一の産物を提供する。
【0010】
したがって、本開示は、式（Ｉ）の化合物
（式中、
ｎは、約２５～約１００の整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドである）
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化1】
ｎは、約２５～約１００の整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドである）
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0011】
ある実施形態では、化合物は、Ｔｉｅ２リン酸化；ＭＡＰＫ、ＡＫＴおよび／またはｅＮＯＳのリン酸化を刺激する；内皮細胞遊走を刺激する；内皮細胞からのＭＭＰ２放出、および血清除去（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）誘導性アポトーシスからの内皮細胞の保護を刺激する；マトリゲルアッセイにおいてｉｎ ｖｉｖｏで血管新生応答を刺激する；被験体の創傷に局所的に適用されたときに、被験体における創傷治癒を刺激する；血管漏出を減少させる；アレルギー性疾患を処置する、ならびに／またはインフルエンザおよびその関連する肺病理を処置する。
【0012】
ある実施形態では、Ｒは、配列番号１に示されるＴ７ペプチドである。
【0013】
ある実施形態では、本明細書に開示されている化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所的投与に適する。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、全身性投与に適する。さらに別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、鼻腔内投与に、吸入にまたは灌流液の構成成分として適する。
【0014】
本明細書に開示されている式（Ｉ）の化合物を作製する方法であって、
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを、式（ＩＩ）のチオール化合物
と反応させて、式（ＩＩＩ）の化合物
を得るステップと、
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＶ）のＰＥＧ－四量体
と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップと
を含み、式中、変数ｎ、ＸおよびＹが、上に定義される通りであり、ＬＧが、適した脱離基であり、ＰＧが、Ｈまたは適した保護基である、方法もまた、本明細書に提供される。
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを、式（ＩＩ）のチオール化合物
【化2】
【化3】
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＶ）のＰＥＧ－四量体
【化4】
を含み、式中、変数ｎ、ＸおよびＹが、上に定義される通りであり、ＬＧが、適した脱離基であり、ＰＧが、Ｈまたは適した保護基である、方法もまた、本明細書に提供される。
【0015】
一部の実施形態では、コロナウイルスに感染したヒト被験体を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に開示されている化合物、または化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、化合物は、Ｍｐａ－Ｂｒ（図１Ｂ）である。他の実施形態では、化合物は、バスキュロチド（図１Ａ）、またはそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８９５７０２２号および同第９１８６３９０号に記載されているいずれかの化合物である。
【0016】
一部の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０４５５１２．２、ＭＮ９８５３２５．１、ＭＮ９０８９４７．３、ＹＰ＿００９７２４３９０．１、ＱＨＤ４３４１６．１）である。他の実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２７８７４１．１、ＡＹ２７４１１９．３、ＡＹ５２５６３６．１）または中東呼吸器症候群ＣｏＶ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ウイルス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１９８４３．３）である。
【0017】
一部の好ましい実施形態では、ヒト被験体は、上昇したレベルの１種または複数の炎症促進性サイトカインを有すると同定される。好ましくは、ヒト被験体は、上昇したレベルのＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６および／またはＩＬ－８を有する。
【0018】
一部の実施形態では、コロナウイルスに感染したヒト被験体における急性呼吸窮迫症候群を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に開示されている化合物、または化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。
【0019】
一部の実施形態では、コロナウイルスに感染したヒト被験体における急性呼吸窮迫症候群の症状を処置および／または予防するための方法であって、予防または治療有効量の本明細書に開示されている化合物、または化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、被験体は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン－１およびアンジオポエチン－２から選択される、上昇したレベルの１種または複数の炎症促進性サイトカインを示す。一部の実施形態では、本明細書に開示されている化合物の予防有効量は、被験体における血管漏出の予防に有効な量である。他の実施形態では、本明細書に開示されている化合物の治療有効量は、被験体における血管漏出の処置（例えば、逆転）に有効な量である。
【0020】
コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に関連する障害、症状または症候群を処置するための治療方法であって、治療有効量の本明細書に開示されている化合物または化合物を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む治療方法もまた提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている化合物または化合物を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより、被験体におけるコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２）感染症の少なくとも１種の症状または徴候を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）またはその重症度を低下させるための方法であって、少なくとも１種の症状または徴候が、肺における炎症、肺胞損傷、発熱、咳、息切れ、下痢、臓器不全、肺炎、敗血症性ショックおよび死亡からなる群より選択される、方法が提供される。一部の実施形態では、化合物（またはこれを含む医薬組成物）は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２）感染症を有するまたはそれを有するリスクがある被験体に予防的にまたは治療的に投与することができる。リスクがある被験体は、免疫無防備状態の人物、高齢者（６５歳を超える）、医療従事者、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２）感染症が確認されたまたは疑われる人物（複数可）と濃厚接触した成人または小児、および肺感染症、心臓疾患、肥満または糖尿病等の基礎医学的状態（または併存症）を有する者を含むがこれらに限定されない。
【0021】
一部の実施形態では、第２の治療剤が、被験体に、本明細書に記載されている１種または複数の化合物と同時投与される（逐次的にまたは同時発生的に）。一部の態様では、第２の治療剤は、抗炎症薬、抗感染薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体、抗ウイルス薬、抗酸化剤等の栄養補助食品、または当技術分野で公知の他のいずれかの薬物もしくは治療法である。抗炎症薬は、デキサメタゾン等のコルチコステロイド、および炎症性サイトカインの阻害剤（その非限定的な例は、エタネルセプト（ｅｔｅｒｎａｃｅｐｔ）、サリルマブ、トシリズマブ、アダリムマブおよびカナキヌマブ（ｋａｎａｋｉｎｕｍａｂ）を含む）を含む。
【0022】
Ｔｉｅ２受容体を活性化する方法であって、Ｔｉｅ２受容体が活性化されるように、Ｔｉｅ２受容体を本明細書に開示されている化合物と接触させるステップを含む方法もまた、本明細書に提供される。ある実施形態では、Ｔｉｅ２受容体の活性化は、Ｔｉｅ２受容体のヒトにおけるチロシン９９２（Ｙ９９２）およびマウスのＹ９９０等のチロシン残基のリン酸化によって、またはＭＡＰＫ、ＡＫＴもしくはｅＮＯＳのリン酸化によって証明される。
【0023】
漏出性血管の部位における血管透過性を減少させる方法であって、それを必要とする被験体における部位に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法もまた、本明細書に提供される。ある実施形態では、被験体は、脳卒中、黄斑変性症、黄斑浮腫、リンパ浮腫、血液網膜関門の崩壊、血液脳関門の崩壊、細菌誘導性血管漏出または腫瘍血管構造の正常化を有するまたはこれを有した。
【0024】
内皮細胞を保護する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法もまた、本明細書に提供される。一実施形態では、被験体は、腎臓傷害または腎臓線維症、脳卒中、血管性認知症、黄斑変性症、または糖尿病性合併症を有するまたはこれを有した。別の実施形態では、被験体は、肺傷害を有するまたはこれを有した。
【0025】
ＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法が、さらにまた本明細書に提供される。ある実施形態では、方法は、それを必要とする被験体における好酸球および／もしくは好塩基球を低下させるためのもの、アトピー性皮膚炎、喘息もしくはアレルギー性鼻炎、コロナウイルス（Ｃｏｖｉｄ １９、重症急性呼吸器症候群ウイルス（（ＳＡＲＳ ＣＯＶ））中東呼吸器症候群（（ＭＥＲＳ ＣＯＶ））、関連する肺傷害症候群、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置するためのもの、および／またはそれを必要とする被験体における好酸球および／もしくは好塩基球に関連する状態を処置するためのものである。
【0026】
一実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、好酸球および／または好塩基球起源の白血病である。別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、炎症性腸疾患である。さらに別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、寄生生物感染症である。
【0027】
別の実施形態では、ＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害する方法は、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを低下させるためのものであり、本開示の化合物を、それを必要とする患者に投与するステップを含み、サイトカインは、エオタキシン、ＩＬ－１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ－９、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－１３およびＭＣＰ－、ＩＬ－２、ＩＬ－７、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦガンマ誘導性タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、マクロファージ炎症性タンパク質１－αまたは（ｏｆ）ＩＬ－２、ＩＬ－７、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦガンマ誘導性タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、マクロファージ炎症性タンパク質１－α、ＴＮＦ－αのうち少なくとも１種である。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシンを含む。
【0028】
別の実施形態は、本発明の化合物を投与することにより、コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ １９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳ）に関連するサイトカインストームを予防または阻害するための方法であり、サイトカインストームを構成するサイトカインは、エオタキシン、ＩＬ－１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ－９、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－１３およびＭＣＰ－、ＩＬ－２、ＩＬ－７、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦガンマ誘導性タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、マクロファージ炎症性タンパク質１－αまたは（ｏｆ）ＩＬ－２、ＩＬ－７、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦガンマ誘導性タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、マクロファージ炎症性タンパク質１－α、ＴＮＦ－αのうち少なくとも１種を含む。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシンを含む。方法は、エタネルセプト、サリルマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、カナキヌマブおよび／または他の炎症性サイトカイン阻害剤等、炎症性サイトカイン阻害剤の逐次的または同時発生的のいずれかでの同時投与をさらに含む。
【0029】
インフルエンザに、またはコロナウイルスに、またはインフルエンザもしくはコロナウイルスに関連する細菌重感染に感染した被験体を処置する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法が、さらになお本明細書に提供される。
【0030】
一実施形態では、方法は、本明細書に開示されている化合物と同時発生的にまたは逐次的に、抗ウイルス剤または抗マラリア剤を投与するステップをさらに含む。ある実施形態では、抗ウイルス剤は、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンもしくはオセルタミビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、レムデシビル、ロピナビル、リトナビルまたはいずれかのヌクレオシドもしくはヌクレオチドアナログである。
【0031】
ある実施形態では、化合物は、局所的に、全身性に、鼻腔内に、吸入によってまたは灌流液として投与される。
【0032】
（ａ）本明細書に開示されている化合物と、（ｂ）抗ウイルス剤もしくは抗マラリア剤および／または１種もしくは複数の炎症性サイトカイン阻害剤の阻害剤と、（ｃ）コロナウイルスに感染した被験体を処置するためおよび／またはコロナウイルスに感染した被験体における細菌重感染を処置するためのキットの使用についての指示とを含むキットがさらに提供される。
【0033】
本開示の他の特色および利点は、次の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本出願の実施形態を指し示しているものの、単なる説明として提供されており、特許請求の範囲は、これらの実施形態によって限定されるべきではないが、全体として本明細書と整合した最も広い解釈を与えられるべきであることを理解されたい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
ヒト被験体におけるコロナウイルス感染症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置および／もしくは予防する、または前記被験体におけるＡＲＤＳの症状を好転させる方法であって、前記方法は、式（Ｉ）：
の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を前記被験体に投与するステップ、または
前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含み、式中、
ｎは、約２５～約１００の整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ２０ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ２０ ）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキル、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルコキシ、（Ｃ ６ ～Ｃ １０ ）－アリールまたは（Ｃ ５ ～Ｃ １０ ）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ２０ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ２０ ）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキル、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルコキシ、（Ｃ ６ ～Ｃ １０ ）－アリールまたは（Ｃ ５ ～Ｃ １０ ）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）またはＴ８ペプチド（配列番号５）である、
方法。
(項目２)
Ｒが、Ｔ７ペプチド（配列番号１）である、項目１に記載の方法。
(項目３)
ｎが、約４０～約７０、好ましくは、約４８～約６５、より好ましくは、約５５の整数である、項目１に記載の方法。
(項目４)
Ｘが、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）－アルケニレンである、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
Ｙが、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）－アルケニレンである、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
Ｙが、チオグリコール酸、２－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプトヘキサン酸、８－メルカプトオクタン酸、１１－メルカプトウンデカン酸、１２－メルカプトドデカン酸または１６－メルカプトヘキサデカン酸に由来する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記式（Ｉ）の化合物が、
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
ｎは、約５０～６０の間または約５５の整数であり、
Ｒは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）である、
項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスである、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記被験体が、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６およびＩＬ－８から選択される、上昇したレベルの１種または複数の炎症促進性サイトカインを有すると同定される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
急性呼吸窮迫症候群が、サイトカインストームを含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
好ましくは、抗炎症薬、コロナウイルススパイクタンパク質に対する抗体、および抗ウイルス薬から選択される、第２の治療剤の逐次的または同時発生的な同時投与をさらに含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記抗ウイルス化合物が、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、レムデシビル、ロピナビル、リトナビル、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記抗炎症薬が、１種または複数の炎症性サイトカインを阻害する、項目１１に記載の方法。
(項目１４)
前記炎症性サイトカイン阻害剤が、エタネルセプト、サリルマブ、トシリズマブ、アダリムマブおよびカナキヌマブからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
前記被験体に、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物が投与される、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記化合物または医薬組成物が、吸入、局所的、全身性、経口、鼻腔内および／または非経口投与によって前記被験体に投与される、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記被験体における肺内皮細胞の漏出を好転させるステップを含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記被験体における肺内皮細胞を安定化するステップを含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
ヒト被験体におけるコロナウイルス感染症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置および／もしくは予防する、または前記被験体におけるＡＲＤＳの症状を好転させる方法であって、前記方法は、式（Ｉ）：
【化20】
前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含み、式中、
ｎは、約２５～約１００の整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ２０ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ２０ ）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキル、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルコキシ、（Ｃ ６ ～Ｃ １０ ）－アリールまたは（Ｃ ５ ～Ｃ １０ ）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ２０ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ２０ ）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキル、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルコキシ、（Ｃ ６ ～Ｃ １０ ）－アリールまたは（Ｃ ５ ～Ｃ １０ ）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）またはＴ８ペプチド（配列番号５）である、
方法。
(項目２)
Ｒが、Ｔ７ペプチド（配列番号１）である、項目１に記載の方法。
(項目３)
ｎが、約４０～約７０、好ましくは、約４８～約６５、より好ましくは、約５５の整数である、項目１に記載の方法。
(項目４)
Ｘが、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）－アルケニレンである、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
Ｙが、独立してまたは同時に、（Ｃ １ ～Ｃ ６ ）－アルキレンまたは（Ｃ ２ ～Ｃ ６ ）－アルケニレンである、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
Ｙが、チオグリコール酸、２－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプトヘキサン酸、８－メルカプトオクタン酸、１１－メルカプトウンデカン酸、１２－メルカプトドデカン酸または１６－メルカプトヘキサデカン酸に由来する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記式（Ｉ）の化合物が、
【化21】
ｎは、約５０～６０の間または約５５の整数であり、
Ｒは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）である、
項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスである、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記被験体が、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６およびＩＬ－８から選択される、上昇したレベルの１種または複数の炎症促進性サイトカインを有すると同定される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
急性呼吸窮迫症候群が、サイトカインストームを含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
好ましくは、抗炎症薬、コロナウイルススパイクタンパク質に対する抗体、および抗ウイルス薬から選択される、第２の治療剤の逐次的または同時発生的な同時投与をさらに含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記抗ウイルス化合物が、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、レムデシビル、ロピナビル、リトナビル、ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記抗炎症薬が、１種または複数の炎症性サイトカインを阻害する、項目１１に記載の方法。
(項目１４)
前記炎症性サイトカイン阻害剤が、エタネルセプト、サリルマブ、トシリズマブ、アダリムマブおよびカナキヌマブからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
前記被験体に、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物が投与される、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記化合物または医薬組成物が、吸入、局所的、全身性、経口、鼻腔内および／または非経口投与によって前記被験体に投与される、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記被験体における肺内皮細胞の漏出を好転させるステップを含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記被験体における肺内皮細胞を安定化するステップを含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【0034】
図面の簡単な説明
実施形態は、次の図面との関連で下に記載される：
実施形態は、次の図面との関連で下に記載される：
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1-1】図１Ａは、マレイミドを含有する活性化ＰＥＧ四量体へのＮ末端におけるシステインを有するＴ７ペプチドの連結により調製された、親バスキュロチドの概略図を示す。結果として生じるペプチドＰＥＧコンジュゲートは、５および６員環産物の混合物を含有する。示されている５員のスクシンイミド環は、システイン上のチオール基によるマレイミドの直接的なアルキル化の結果として生じ、同じく示されている６員のチアジン環は、システインリンカー上の遊離アミン基を介したこの初期産物の転位の結果として生じる。図１Ｂは、一実施形態では、ブロモアセトアミドを含有する活性化ＰＥＧ四量体への、Ｎ末端におけるアミン側鎖を欠くシステインのアキラルアナログである、３－メルカプトプロピオン酸を有するＴ７ペプチドの連結によって調製された、Ｍｐａ－Ｂｒの概略図を示す。
【図1-2】同上。
【0036】
【図2-1】図２Ａは、トリプトファン蛍光分光法を使用した、溶液中の均質な組換え受容体集団、ヒトＴｉｅ２Ｆｃへの親バスキュロチド結合の検出を示す。図２Ｃは、トリプトファン蛍光分光法を使用した、溶液中の均質な組換え受容体集団、ヒトＴｉｅ２ＦｃへのＭＰＡ－Ｂｒ結合の検出を示す。ヒトＴｉｅ２Ｆｃ受容体と増加濃度のリガンドとの（Ａ、Ｃ）（○）またはリガンド単独での（□）インキュベーション後の、固有蛍光強度の増加および結果として生じる結合曲線。２９５ｎｍの波長で試料を励起した。図２Ｂは、ヒトＴｉｅ２Ｆｃへの親バスキュロチドの特異的飽和結合曲線を示す。図２Ｄは、ヒトＴｉｅ２ＦｃへのＭｐａ－Ｂｒの特異的飽和結合曲線を示す。一部位特異的結合の非線形回帰のため、親バスキュロチド単独またはＭＰＡＢｒ単独の固有蛍光強度を、総結合から減算した。ヒトＴｉｅ２Ｆｃへの親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒの正規化された特異的結合の結果として生じるＫｄ値は、それぞれ１０２．９ｎＭおよび２．６２３ｎＭである。図２Ｅは、ヒトＩｇＧＦｃと親バスキュロチドの結合曲線を示す。図２Ｆは、ヒトＩｇＧＦｃとＭＰＡ－Ｂｒの結合曲線を示す。ヒトＩｇＧＦｃおよび親バスキュロチドまたはヒトＩｇＧＦｃおよびＭＰＡ－Ｂｒにより、結合の飽和は観察されない。図２Ｇは、様々な種の組換えＴｉｅ２ＦＣに対する、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒの結合定数を描写する表を示す。トリプトファンスキャニング蛍光分光法を使用して、指し示される種の組換えＴｉｅ２Ｆｃ受容体に対する、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒの結合定数を決定した。
【図2-2】同上。
【0037】
【図3】図３Ａは、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒが、Ｔｉｅ２受容体を活性化することを示す。漸増用量の親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒで処置されたＨＵＶＥＣ細胞におけるリン酸化Ｔｉｅ－２。正規化された平均±ＳＥＭとして表現されたデータ、処置なし（ＮＴ）と比べた、一元配置ＡＮＯＶＡ事後ホルム・シダック（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ）多重比較、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。視覚的に分かり易くするために、破線（ｈａｔｃｈｅｄ ｌｉｎｅ）が、ＭＰＡ－Ｂｒ処置から親バスキュロチド処置を分ける。図３Ｂは、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒが、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化することを示す。親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒで処置されたＨＵＶＥＣ細胞におけるＭＡＰＫ（Ｅｒｋ２）のリン酸化。正規化された平均±ＳＥＭとして表現されたデータ、処置なし（ＮＴ）と比べた、一元配置ＡＮＯＶＡ事後ホルム・シダック多重比較、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0038】
【図4-1】図４Ａは、指し示される濃度の親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒで処置されたＨＭＶＥＣｔｅｒｔ細胞（テロメラーゼにより不死化されている）におけるリン酸化Ｔｉｅ－２を示す（平均±ＳＥＭとして表現されたデータ、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、処置群 対 内皮基本培地（ＥＢＭ）処置群）。図４Ｂは、指し示される濃度の親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒで処置された初代マウス肺微小血管内皮細胞におけるリン酸化Ｔｉｅ－２を示す（平均±ＳＥＭとして表現されたデータ、一元配置ＡＮＯＶＡ事後ホルム・シダック、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＃ｐ＝０．０６、処置群 対 処置なし（ＮＴ））。
【図4-2】同上。
【0039】
【図5】図５Ａは、ラット糸球体に由来する初代培養内皮細胞を示し、図５Ｂは、イヌ大動脈に由来する初代培養内皮細胞を示し、図５Ｃは、カニクイザル糸球体に由来する初代培養内皮細胞を示す。細胞は、指し示される濃度のＭＰＡ－Ｂｒ（ｍＢｒ）で１５分間刺激した。リン酸化Ｔｉｅ２をＥＬＩＳＡにより定量化し、示されているデータは、総Ｔｉｅ２タンパク質レベルに対して正規化された場合の、Ｔｉｅ２の相対的活性化（ｐＴｉｅ２）を表す。ヒト組換えアンジオポエチン１（Ａｎｇ１）が陽性対照として含まれた。平均±ＳＥＭとして表現されたデータ、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、処置群 対 処置なし（ＮＴ）。ラットについてｎ＝３、イヌについてｎ＝４およびカニクイザルについてｎ＝３。
【0040】
【図6-1】図６Ａ～６Ｉは、親ＶＴおよびＭＰＡ－Ｂｒが、Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザ接種後にマウスを保護することを示す。マウスに、０日目に６４ＨＡＵ Ｘ３１を鼻腔内で感染させた。指し示される用量の親ＶＴまたはＭＰＡ－Ｂｒを、感染４８時間後から開始して、試験の持続時間にわたり、２４時間毎に腹腔内（Ｉ．Ｐ．）で与えた。生存率を１２日目まで毎日モニターした（図６Ａ）。感染から５日後（図６Ｂ）および６日後（図６Ｃ）に測定された初期体重に対する割合。感染後５日目（図６Ｄ）および６日目（図６Ｅ）の動脈血酸素飽和度。感染５日後（図６Ｆ）または６日後（図６Ｇ）に測定された体温。感染から５日目（図６Ｈ）および６日目（図６Ｉ）に測定された活動性スコア。マンテル・コックスログランク（Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ Ｌｏｇ Ｒａｎｋ）解析によって生存統計を行った、＊＊＊ｐ＜０．００１。他の統計的尺度は全て、次の通りであった：フィッシャーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを介して、インフルエンザ（Ｆｌｕ）とＰＢＳに対して、＃ｐ＜０．０５、ダネット事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを介して、インフルエンザとＰＢＳに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ，０．０００１。
【図6-2】同上。
【図6-3】同上。
【0041】
【図7-1】図７Ａ、Ｂは、スプラーグドーリーラットに、時間ゼロに尾静脈注射により指し示される用量の親ＶＴまたはＭＰＡ－Ｂｒを与えたことを示す。指し示される時点で血漿を収集して、ＥＬＩＳＡによる試験薬剤の循環レベルの定量化を容易にした。グラフは、経時的な全身性循環からの循環ＭＰＡ－Ｂｒ（図７Ａ）および親ＶＴ（図７Ｂ）の損失を描写する。表は、１２０ｕｇ／ｋｇ用量に関する計算されたクリアランス、分布体積および終末半減期値について詳しく述べる。試験の１つのアーム（ａｒｍ）は、連続３日間にわたり２４時間毎に１回の用量（複数用量ＭＤ １２０ｕｇ／ｋｇ）として送達されるＭＰＡ－Ｂｒを提供した。
【図7-2】同上。
【0042】
【図8】図８は、背側が剪毛された雄ＦＶＢマウスに、皮膚ヒスタミン負荷の１時間前に、指し示される量の親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒ（ＩＰによる）を与えたことを示す。尾静脈経由で送達されるエバンスブルー（ＥＢ）色素は、ヒスタミン曝露の直後に投与した。ヒスタミン負荷から３０分後に、標準化された皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｋｉｎ）生検材料を、心臓灌流されたマウスから取り出した。６２０ｎｍにおける吸光度を使用して、全処置群について、ＥＢ色素血管外遊出（ｅｘｔｒａｖａｓｓａｔｉｏｎ）の量を計算した。ＥＢの平均量±ＳＥＭとして表現されたデータ、ＰＢＳビヒクル対照と比べた一元配置ＡＮＯＶＡ事後ダネット多重比較、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0043】
【図9-1】図９Ａ～Ｄは、インピーダンス測定によって決定された、トロンビンおよびＴＮＦ－α誘導性ＨＵＶＥＣ細胞不安定化のＭＰＡ－Ｂｒ（ＡＶ－００１）阻害を説明する。図９Ａ、Ｃは、正規化ＣＩの時間分解変化を示す。図９Ｂ、Ｄは、ビヒクル対照処置に対して正規化された総ＡＵＣを示す。条件毎にＮ＝３。＊および＊＊について、それぞれＰ＜０．０１およびＰ＜０．００１。
【図9-2】同上。
【0044】
【図10-1】図１０Ａ～Ｇは、インピーダンス測定によって決定された、ＣＯＶＩＤ－１９患者血清誘導性ＨＵＶＥＣ細胞完全性の不安定化のＭＰＡ－Ｂｒ（ＡＶ－００１）阻害を説明する。図１０Ａ～Ｃは、ＨＤ１またはＣＯＶＩＤ－１９血清（ＩｇＧ８、ＩｇＭ５、ＩｇＭ６）±ＡＶ－００１による負荷後のＣＩの時間分解変化を示す。図１０Ｄ～Ｇは、ビヒクル対照処置に対して正規化された総ＡＵＣを示す。条件毎にＮ＝３。＊、＊＊および＊＊＊について、それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０００１。
【図10-2】同上。
【0045】
【発明を実施するための形態】
【0046】
詳細な説明
定義
用語「（Ｃ１～Ｃｐ）－アルキル」は、本明細書で使用される場合、１～「ｐ」個の炭素原子を含有する、直鎖および／または分枝鎖、飽和アルキルラジカルを意味し、（ｐがいくつであるかに応じて）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、２，２－ジメチルブチル、ｎ－ペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、ｎ－ヘキシルおよびその他を含み、式中、変数ｐは、アルキルラジカルにおける最大の炭素原子数を表す整数である。
定義
用語「（Ｃ１～Ｃｐ）－アルキル」は、本明細書で使用される場合、１～「ｐ」個の炭素原子を含有する、直鎖および／または分枝鎖、飽和アルキルラジカルを意味し、（ｐがいくつであるかに応じて）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、２，２－ジメチルブチル、ｎ－ペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、ｎ－ヘキシルおよびその他を含み、式中、変数ｐは、アルキルラジカルにおける最大の炭素原子数を表す整数である。
【0047】
用語「（Ｃ２～Ｃｐ）－アルケニル」は、本明細書で使用される場合、２～「ｐ」個の炭素原子を含有する、直鎖および／または分枝鎖、不飽和アルキル部分を意味し、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を含み、（ｐがいくつであるかに応じて）エテニル、１－プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、ｔ－ブテニル、１－ペンテニル、２－メチル－１－ペンテニル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニルおよびその他を含み、式中、変数ｐは、アルケニルラジカルにおける最大の炭素原子数を表す整数である。
【0048】
用語「（Ｃ１～Ｃｐ）－アルコキシ」は、そこに酸素原子が取り付けられた、上に定義される通りのアルキル基を意味する。本明細書で使用される場合、この用語は、そこに酸素原子が取り付けられた、１～「ｐ」個の炭素原子を含有する、直鎖および／または分枝鎖、飽和アルキルラジカルを意味し、（ｐがいくつであるかに応じて）メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔ－ブトキシ、２，２－ジメチルブトキシ、ｎ－ペントキシ、２－メチルペントキシ、３－メチルペントキシ、４－メチルペントキシ、ｎ－ヘキソキシ（ｈｅｘｏｘｙ）およびその他を含み、式中、変数ｐは、アルコキシラジカルにおける最大の炭素原子数を表す整数である。
【0049】
用語「アリール」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１個の芳香環、例えば、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチル）を含有する、環式の基を指す。本開示のある実施形態では、アリール基は、フェニル、ナフチル、インダニル、アントラセニル（ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）、１，２－ジヒドロナフチル、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルおよびその他等、６、９または１０個の原子を含有する。
【0050】
用語「ヘテロアリール」は、本明細書で使用される場合、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子ならびに少なくとも１個の芳香環を有する、芳香環式または多環式の環系を指す。ヘテロアリール基の例は、とりわけ、フリル、チエニル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、ピロリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、カルバゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、キノキサリニル、ベンゾチアゾリル、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）およびキナゾリニルを限定することなく含む。
【0051】
用語「ハロ」は、本明細書で使用される場合、ハロゲン原子を指し、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）およびヨウ素（Ｉ）を含む。
【0052】
上述の基のいずれかに付けられる接尾辞「エン（ｅｎｅ）」は、この基が、二価である、すなわち、２個の他の基の間に挿入されることを意味する。
【0053】
レトロインベルソペプチドは、本明細書で使用される場合、ｄ－アミノ酸が逆方向の配列（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）で置換されたペプチドを指す。側鎖トポロジーは、元の分子（一次構造）を模倣し、よって、結合を提供するであろう。
【0054】
本開示の化合物
一実施形態では、本発明者らは、バスキュロチド（ＶＴ）よりも改善された活性を有する新規薬剤の１クラスを提供し、このような新規薬剤の１つを、実施例において「Ｍｐａ－Ｂｒ」と呼ぶ。
一実施形態では、本発明者らは、バスキュロチド（ＶＴ）よりも改善された活性を有する新規薬剤の１クラスを提供し、このような新規薬剤の１つを、実施例において「Ｍｐａ－Ｂｒ」と呼ぶ。
【0055】
したがって、本開示は、式（Ｉ）の化合物、
（式中、
ｎは、約２５～約１００の整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソペプチドである）
および／またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化5】
ｎは、約２５～約１００の整数であり、
各Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
各Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニレンであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
Ｒは、Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソペプチドである）
および／またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0056】
一実施形態では、Ｒは、Ｔ７ペプチドであり、このＴ７ペプチドは、アミノ酸配列：Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）を含む。別の実施形態では、Ｒは、ＧＡ３ペプチドであり、このＧＡ３ペプチドは、アミノ酸配列：Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ（配列番号２）を含む。別の実施形態では、Ｒは、Ｔ４ペプチドであり、このＴ４ペプチドは、アミノ酸配列：Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｓｅｒ（配列番号３）を含む。さらに別の実施形態では、Ｒは、Ｔ６ペプチドであり、このＴ６ペプチドは、アミノ酸配列：Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ（配列番号４）を含む。さらに別の実施形態では、Ｒは、Ｔ８ペプチドであり、このＴ８ペプチドは、アミノ酸配列：Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ（配列番号５）を含む。
【0057】
Ｔ４、Ｔ６、Ｔ７およびＴ８は、Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００４） ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：２６２－２６７に記載されているＴｉｅ２結合ペプチドＴ４、Ｔ６、Ｔ７およびＴ８である。ＧＡ３もまた、Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３１５：１００４－１０１０に記載されているＴｉｅ２結合ペプチドである。
【0058】
一実施形態では、ｎは、約４０～約７０、または約４８～約６５、または約５５の整数である。
【0059】
別の実施形態では、Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ１０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ１０）－アルケニレンである。別の実施形態では、Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニレンである。別の実施形態では、Ｘは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ３）－アルキレンである。別の実施形態では、Ｘは、メチレン（－ＣＨ２－）である。別の実施形態では、必要に応じた置換基は、ハロまたは（Ｃ１～Ｃ３）－アルキルまたはＣＨ３のうち１種または複数である。
【0060】
別の実施形態では、Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ１０）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ１０）－アルケニレンである。別の実施形態では、Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキレンまたは（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニレンである。別の実施形態では、Ｙは、独立してまたは同時に、（Ｃ１～Ｃ３）－アルキレンである。別の実施形態では、Ｙは、エチレン（－ＣＨ２ＣＨ２－）である。別の実施形態では、Ｙは、チオグリコール酸、２－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプトヘキサン酸、８－メルカプトオクタン酸（Ｍｅｒｃａｐｔｏｏｃｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）、１１－メルカプトウンデカン酸、１２－メルカプトドデカン酸または１６－メルカプトヘキサデカン酸に由来する。
【0061】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
（式中、
ｎは、約５０～６０の間または約５５の整数であり、
Ｒは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）である）
またはその薬学的に許容される塩である。
【化6】
ｎは、約５０～６０の間または約５５の整数であり、
Ｒは、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ（配列番号１）である）
またはその薬学的に許容される塩である。
【0062】
別の実施形態では、薬学的に許容される塩は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩またはＨＣｌ塩形態等、酸付加塩である。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、酢酸塩または塩酸塩である、塩である。
【0063】
他の実施形態では、本開示はまた、式（Ｉ）の化合物の四量体に加えて、二量体および三量体を含む。一実施形態では、本開示は、次式
（式中、
Ｗは、独立してもしくは同時に、ヒドロキシ置換された（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキルもしくはヒドロキシ置換された（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニルであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールもしくは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種もしくは複数に必要に応じて置換されているか、または
Ｗは、Ｘ－Ｓ－Ｙ－Ｃ（Ｏ）－Ｒ、
（式中、ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは、上に定義される通りである）である）
を有する二量体、三量体および四量体化合物を含む。
【化7】
Ｗは、独立してもしくは同時に、ヒドロキシ置換された（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキルもしくはヒドロキシ置換された（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニルであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールもしくは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種もしくは複数に必要に応じて置換されているか、または
Ｗは、Ｘ－Ｓ－Ｙ－Ｃ（Ｏ）－Ｒ、
（式中、ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは、上に定義される通りである）である）
を有する二量体、三量体および四量体化合物を含む。
【0064】
一実施形態では、Ｗは、ヒドロキシ置換された（Ｃ１～Ｃ１０）－アルキルまたはヒドロキシ置換された（Ｃ２～Ｃ１０）－アルケニルである。別の実施形態では、Ｗは、ヒドロキシ置換された（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルまたはヒドロキシ置換された（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルである。別の実施形態では、Ｗは、－ＣＨ２－ＯＨである。
【0065】
一実施形態では、二量体は、次の構造
（式中、Ｗは、独立してまたは同時に、ヒドロキシ置換された（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキルまたはヒドロキシ置換された（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニルであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは、上に定義される通りである）
を有する。
【化8】
ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは、上に定義される通りである）
を有する。
【0066】
別の実施形態では、三量体は、次の構造
（式中、Ｗは、独立してまたは同時に、ヒドロキシ置換された（Ｃ１～Ｃ２０）－アルキルまたはヒドロキシ置換された（Ｃ２～Ｃ２０）－アルケニルであり、これらはそれぞれ、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル、（Ｃ１～Ｃ６）－アルコキシ、（Ｃ６～Ｃ１０）－アリールまたは（Ｃ５～Ｃ１０）－ヘテロアリールのうち１種または複数に必要に応じて置換されており、
ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは、上に定義される通りである）
を有する。
【化9】
ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは、上に定義される通りである）
を有する。
【0067】
別の実施形態では、四量体が、式（Ｉ）の化合物である。
【0068】
ある実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、Ｔｉｅ２アゴニスト活性を示す。このＴｉｅ２アゴニスト活性は、当技術分野で十分に確立されているＴｉｅ２活性化の指標を使用して検出することができる。例えば、本明細書に開示されている化合物は、Ｔｉｅ２リン酸化（例えば、ヒトＴｉｅ２のアミノ酸残基Ｙ９９２等のチロシン残基におけるリン酸化）を刺激することができる。
【0069】
したがって、ある実施形態では、化合物は、Ｔｉｅ２リン酸化を刺激する。
【0070】
さらに、本明細書に開示されている化合物は、ＭＡＰＫ、ＡＫＴ（例えば、ヒトＡＫＴのアミノ酸残基Ｓ４７３におけるリン酸化）および／またはｅＮＯＳ（例えば、ｅＮＯＳのアミノ酸残基Ｓ１１７７におけるリン酸化）のリン酸化等、Ｔｉｅ２の下流シグナル伝達経路における分子のリン酸化を刺激することができる。特定のタンパク質のリン酸化を刺激する化合物の能力は、化合物で処置された細胞ライセートのイムノブロットアッセイ等、当技術分野で周知の標準技法を使用して決定することができる。
【0071】
したがって、ある実施形態では、化合物は、ＭＡＰＫ、ＡＫＴおよびｅＮＯＳのリン酸化を刺激する。
【0072】
別の実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、内皮細胞に対する実証可能な効果を有する。例えば、本明細書に開示されている化合物は、内皮細胞遊走の刺激、内皮細胞からのＭＭＰ２放出および血清除去誘導性アポトーシスからの内皮細胞の保護の刺激からなる群より選択される、内皮細胞に対する少なくとも１種の効果を有することができる。必要に応じて、本明細書に開示されている化合物は、内皮細胞に対するこれらの効果のうち少なくとも２種を有する、または内皮細胞に対するこれらの効果のうち全３種を有する。内皮細胞に対するこれらの効果のうちいずれかを有する化合物の能力は、細胞遊走を評価するためのボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーアッセイ、ＭＭＰ２放出を評価するためのザイモグラフィアッセイ、または血清除去誘導性アポトーシスを評価するための細胞死ＥＬＩＳＡアッセイ等、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
【0073】
したがって、ある実施形態では、化合物は、内皮細胞遊走を刺激する；内皮細胞からのＭＭＰ２放出および／または血清除去誘導性アポトーシスからの内皮細胞の保護を刺激する。
【0074】
一実施形態では、本明細書に開示されている化合物におけるＰＥＧ分子の数は、必要に応じて、約２１，５００ダルトン未満の分子量、約８，０００ダルトン～約２１，５００ダルトンの分子量範囲、約１２，５００ダルトン、約１５，５００ダルトンまたは約１４，０００ダルトンの分子量をもたらす数である。
【0075】
本明細書に開示されている化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物もまた、本明細書に提供される。
【0076】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびにその他を含む。必要に応じて、担体は、局所的投与に、または静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄もしくは上皮投与に適する（例えば、注射または注入による）。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するための材料中にコーティングされ得る。
【0077】
薬学的に許容される担体は、所望の投与経路に適するように選択することができる。例えば、一実施形態では、薬学的に許容される担体は、局所的投与に適する。局所的投与に適した担体の非限定的な例は、ＩｎｔｒａＳｉｔｅ Ｇｅｌ（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗから市販）である。別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、全身性投与に適する。全身性（例えば、静脈内）投与に適した担体の非限定的な例は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【0078】
さらに別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、鼻腔内投与に適する。さらに別の実施形態では、薬学的に許容される担体は、吸入に適する。さらなる実施形態では、薬学的に許容される担体は、灌流液の構成成分として適する。
【0079】
医薬組成物は、１種または複数の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」は、元の化合物の所望の生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性学的効果も付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６：１－１９を参照）。斯かる塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸およびその他等の無毒性無機酸に、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸、およびその他（酢酸等）等の無毒性有機酸に由来する塩を含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびその他等のアルカリ土類金属に、ならびにＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインおよびその他等の無毒性有機アミンに由来する塩を含む。
【0080】
医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含むこともできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムおよびその他等の水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールおよびその他等の油溶性抗酸化剤；ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸およびその他等の金属キレート剤を含む。
【0081】
医薬組成物において用いることができる、適した水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびその他等）およびこれらの適した混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散物の場合は要求される粒径の維持によって、および界面活性物質の使用によって維持することができる。
【0082】
これらの組成物は、例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤および／または分散剤を含有することもできる。微生物の存在の予防は、滅菌手順、ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびその他の包含の両方によって確実にすることができる。組成物中に糖、塩化ナトリウムおよびその他等の等張剤を含むことが望ましい場合もある。加えて、注射可能な薬学的形態の延長された吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等、吸収を遅延させる作用物質の包含によってもたらされ得る。
【0083】
治療組成物は典型的に、無菌であり、製造および貯蔵条件下で安定していなければならない。無菌の注射可能な溶液は、要求に応じて、上に列挙されている成分のうち１種または組合せと共に、妥当な溶媒中に要求される量で活性化合物を組み込み、続いて、滅菌精密濾過することにより調製することができる。組成物は、高い薬物濃度に適した、溶液、マイクロエマルション、リポソームまたは他の規則正しい構造物として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールおよびその他）およびこれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散物の場合は要求される粒径の維持によって、および界面活性物質の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【0084】
担体材料と組み合わせて単一の剤形を産生することができる活性成分の量は、処置されている被験体および特定の投与のモードに応じて変動するであろう。担体材料と組み合わせて単一の剤形を産生することができる活性成分の量は、一般に、治療効果を産生する組成物の量となるであろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、約０．０１パーセント～約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約０．１パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセント～約３０パーセントの活性成分の範囲に及ぶであろう。
【0085】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単一のボーラスを投与することができる、いくつかの分割用量を経時的に投与することができる、または用量は、治療状況の緊急事態によって指し示される通りに比例的に低下もしくは増加させることができる。非経口組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で製剤化することができる。投薬単位形態は、本明細書で使用される場合、処置されるべき被験体のための単位投薬量として適した物理的に別々の単位を指す；各単位は、要求される薬学的担体に関連した所望の治療効果を産生するように計算された所定の量の活性化合物を含有する。投薬単位形態のための仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のための斯かる活性化合物の配合の技術分野に固有の限界によって指示され、これらに直接的に依存する。
【0086】
本明細書に開示されている化合物の全身性投与のため、投薬量は、典型的に、約０．００００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は、０．１～１００μｇ／ｋｇ（宿主体重）の範囲に及ぶ。例えば、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重または１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。局所的投与のため、例示的な投薬量濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌである。
【0087】
医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性がない、特定の患者、組成物および投与のモードのための所望の治療応答の達成に有効である活性成分の量を得るように変動され得る。選択された投薬量レベルは、用いられる特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態因子に依存するであろう。当業者であれば、被験体のサイズ、被験体の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路等の因子に基づき斯かる量を決定することができるであろう。
【0088】
作製方法
本明細書に開示されている式（Ｉ）の化合物を作製する方法であって、
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを、式（ＩＩ）のチオール化合物
と反応させて、式（ＩＩＩ）の化合物
またはその塩を得るステップと、
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＶ）のＰＥＧ－四量体
と反応させて、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を得るステップと
を含み、変数ｎ、ＸおよびＹが、上に定義される通りであり、ＬＧが、適した脱離基であり、ＰＧが、Ｈまたは適した保護基である、方法もまた、本明細書に提供される。
本明細書に開示されている式（Ｉ）の化合物を作製する方法であって、
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはそれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを、式（ＩＩ）のチオール化合物
【化10】
【化11】
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＶ）のＰＥＧ－四量体
【化12】
を含み、変数ｎ、ＸおよびＹが、上に定義される通りであり、ＬＧが、適した脱離基であり、ＰＧが、Ｈまたは適した保護基である、方法もまた、本明細書に提供される。
【0089】
一実施形態では、適した脱離基は、ハロ、トシレートまたはメシレートである。さらなる実施形態では、脱離基は、ブロモである。
【0090】
一実施形態では、適した保護基は、トリチルである。
【0091】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩または塩酸塩等、酸付加塩である。
【0092】
一部の実施形態では、ペプチド（Ｒ）は先ず、ポリスチレン樹脂に結合される。別の実施形態では、次に、ポリスチレン樹脂に結合されたペプチドは、式（ＩＩ）のチオール化合物と反応させられる。さらなる実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、ポリスチレン樹脂に結合され、これは、式（ＩＶ）の化合物と反応させられる前に切断される。
【0093】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＶ）の化合物の間の反応は、約５～約８の間または約６～約８の間または約６～約７の間、または６．５のｐＨで遂行される。
【0094】
他の実施形態では、式（ＩＩＩ）のチオール化合物は、上に記載されており、不飽和部分をさらに含有する、四量体ＰＥＧ分子とのマイケル付加反応における求核剤として使用される。例えば、式（ＩＩＩ）の化合物は、
（式中、
Ｔは、アクリレート部分またはビニルスルホン部分等、不飽和部分である）
等の四量体ＰＥＧ分子と反応させられる。
【化13】
Ｔは、アクリレート部分またはビニルスルホン部分等、不飽和部分である）
等の四量体ＰＥＧ分子と反応させられる。
【0095】
別の実施形態では、アクリレート部分は、
である。
【化14】
【0096】
別の実施形態では、ビニルスルホン部分は、
である。
【化15】
【0097】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物におけるチオール部分は、マイケル付加反応における求核剤として作用して、
または
（式中、ＲおよびＹは、上に定義される通りである）
等、本開示の追加的な化合物を形成する。
【化16】
【化17】
等、本開示の追加的な化合物を形成する。
【0098】
方法および使用
血管新生のＴｉｅ２活性化および刺激
血管新生のＴｉｅ２活性化および刺激
【0099】
別の態様は、本明細書に開示されている化合物を使用する方法および本明細書に開示されている化合物の使用に関係する。本明細書に検討される通り、本明細書に開示されている化合物を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、Ｔｉｅ２受容体を活性化することができる。よって、ある実施形態では、Ｔｉｅ２受容体を活性化する方法であって、Ｔｉｅ２受容体が活性化されるように、Ｔｉｅ２受容体を本明細書に開示されている化合物と接触させるステップを含む方法が提供される。Ｔｉｅ２受容体を活性化するための、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。Ｔｉｅ２受容体を活性化するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用がさらに提供される。Ｔｉｅ２受容体の活性化における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらになお提供される。
【0100】
Ｔｉｅ２受容体の活性化は、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを含むがこれらに限定されない、当技術分野で十分に確立されているＴｉｅ２活性化の多数の可能な指標のいずれかによって証明することができる。一実施形態では、例えば、Ｔｉｅ２受容体の活性化は、Ｔｉｅ２受容体のチロシン残基、例えば、ヒトＴｉｅ２のチロシン９９２（Ｙ９９２）のリン酸化によって証明される。別の実施形態では、例えば、Ｔｉｅ２受容体の活性化は、ＭＡＰＫ、ＡＫＴまたはｅＮＯＳのリン酸化によって証明される。
【0101】
本明細書に開示されている化合物は、血管新生活性を有することが示されたバスキュロチドよりも、増加した応答規模およびより広い用量範囲を有することが示されたため（例えば、図３Ａ、Ｂ、４Ａ、Ｂ、５Ａ～Ｃおよび８Ａを参照）、被験体における血管新生を刺激する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法もまた提供される。それを必要とする被験体における血管新生を刺激するための、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする被験体における血管新生を刺激するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用がさらに提供される。それを必要とする被験体における血管新生の刺激における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらになお提供される。
【0102】
ある実施形態では、化合物によって刺激された血管新生は、次の特性のうち少なくとも１種によって特徴付けされる：
ａ）血管周囲支持細胞の動員；
ｂ）漏出性である筈の血管が漏出し難いこと；
ｃ）十分に規定された枝分かれ；および
ｄ）内皮細胞アポトーシスの阻害。
ａ）血管周囲支持細胞の動員；
ｂ）漏出性である筈の血管が漏出し難いこと；
ｃ）十分に規定された枝分かれ；および
ｄ）内皮細胞アポトーシスの阻害。
【0103】
血管周囲支持細胞の動員は、平滑筋細胞のマーカーの検出によって、例えば、平滑筋アクチン１（Ｓｍａ１）、ＮＧ２またはデスミンに対する抗体による免疫染色によって実証することができる。血管が漏出し難いことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを含む、当技術分野で確立されている血管透過性アッセイを使用して評価することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ血管透過性アッセイの非限定的な例は、エバンスブルーまたはＦＩＴＣアルブミンのいずれかを使用したマイルズ（Ｍｉｌｅｓ）アッセイである。本明細書で使用される場合、血管の透過性の程度が、その成長がＶＥＧＦ処置またはセロトニンもしくはヒスタミン等の他の血管炎症性メディエーターによる処置によって刺激された血管の透過性の程度に満たない場合、血管は、「非漏出性」と考慮されるべきである。十分に規定された枝分かれは、例えば、新たに形成された血管のイメージング、ならびに特定の画像視野における血管の数および結節の数の定量化によって実証することができる。十分に規定された枝分かれは、例えば、血管の数の結節の数に対する比が１．０：０．５、必要に応じて１．０：０．７またはさらには１．０：１．０である血管新生等、有意なかつ組織化された血管分枝によって指し示される。さらに、新生血管の流動力学は、マイクロドプラ超音波を使用して評価することができる。
【0104】
血管新生を刺激するための方法において、部位は、本明細書に開示されている化合物単独と接触され得る、またはその代わりに、部位は、１種または複数の追加的な血管新生剤と接触され得る。よって、別の実施形態では、血管新生方法は、被験体における部位を、第２の血管新生剤と接触させるステップをさらに含む。本明細書に開示されている化合物と組み合わせて使用され得る追加的な血管新生剤の非限定的な例は、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポエチン、ｂＦＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）を含む。したがって、一実施形態では、第２の血管新生剤は、ＶＥＧＦである。別の実施形態では、第２の血管新生剤は、ＰＤＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポエチン、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ２阻害剤および胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）からなる群より選択される。
【0105】
血管新生を刺激する本明細書に開示されている化合物の能力を考慮すると、本明細書に開示されている化合物は、血管新生の促進が望ましい種々の臨床状況において使用することができる。斯かる徴候の非限定的な例は、再生組織の血管新生、虚血性肢疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｌｉｍｂ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳虚血、動脈硬化症を含む血管炎症の状態、虚血壊死、発毛の刺激、および勃起機能不全を含む。
【0106】
漏出性血管の部位における血管透過性を減少させる方法であって、それを必要とする被験体における部位に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法もまた、本明細書に提供される。それを必要とする被験体における漏出性血管の部位における血管透過性を減少させるための、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする被験体における漏出性血管の部位における血管透過性を減少させるための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用がさらに提供される。それを必要とする被験体における漏出性血管の部位における血管透過性の減少における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらになお提供される。
【0107】
ある実施形態では、被験体は、脳卒中、黄斑変性症、黄斑浮腫、リンパ浮腫、血液網膜関門の崩壊、血液脳関門の崩壊、細菌誘導性血管漏出、ウイルス誘導性血管漏出を有するもしくはこれを有した、または腫瘍血管構造の正常化を必要とする。
【0108】
バスキュロチドは、例えば、内皮細胞のアポトーシスを阻害することにより、内皮細胞において保護的効果を有することが以前に示された。腎血管構造における内皮細胞を保護するＴｉｅ２アゴニストの能力は、実験モデルにおける腎線維症を好転させることが報告された（Ｋｉｍ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １７：２４７４－２４８３）。本明細書において、ＭＰＡ－Ｂｒは、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣにおいてならびに初代ラット、イヌおよびカニクイザル内皮細胞においてＴｉｅ２リン酸化を誘導することが示された。さらに最近、ＶＴは、Ｔｈａｍｍ Ｋ ｅｔ ａｌ ２０１６によって、移植後の急性腎臓傷害を好転させることが示された（マウスにおいて）。これは、ＶＴを受けているマウスにおける移植関連の腎臓線維症の低下と解釈された。Ｒｕｂｉｇ Ｅ ｅｔ ａｌ， ２０１６は、ＶＴが、虚血再灌流後の急性腎臓傷害の程度を低下させたことを示した。傷害の低下は、生存増加、傷害された腎臓内の血流改善および血管漏出低下を特徴とした。
【0109】
したがって、内皮細胞を保護する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。それを必要とする被験体における内皮細胞を保護するための、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする被験体における内皮細胞を保護するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用がさらに提供される。それを必要とする被験体における内皮細胞を保護するための、本明細書に開示されている化合物がさらになお提供される。
【0110】
斯かる方法または使用は、種々の臨床状況において使用することができ、その非限定的な例は、肺傷害、腎臓傷害、腎臓線維症、脳卒中、血管性認知症、黄斑変性症および糖尿病性合併症（例えば、腎臓、眼、皮膚および／または肢における）を含む。
【0111】
好酸球および／または好塩基球に関連する状態
ＭＰＡ－Ｂｒは、ＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害することが以前に示されたバスキュロチドよりも改善された標的結合および薬物動態を有する化合物である。
ＭＰＡ－Ｂｒは、ＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害することが以前に示されたバスキュロチドよりも改善された標的結合および薬物動態を有する化合物である。
【0112】
したがって、ＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。本開示はまた、それを必要とする動物または細胞におけるＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害するための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。それを必要とする動物または細胞におけるＣＦＵ－Ｇ細胞の増大を阻害するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする動物または細胞におけるＣＦＵ－Ｇ細胞の増大の阻害における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。
【0113】
用語「ＣＦＵ－Ｇ」は、本明細書で使用される場合、好酸球、好塩基球および好中球等の顆粒球を産生する血液形成細胞の一型である、コロニー形成単位－顆粒球細胞を指す。「増大の阻害」は、本明細書で使用される場合、無処置対照と比較した、顆粒球コロニー形成細胞の数の、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれよりも多い減少を指す。
【0114】
ＭＰＡ－Ｂｒは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球または好中球のより一般的な免疫抑制なしで、循環する好酸球および好塩基球において、アトピー性疾患の低下をもたらすことが以前に示されたバスキュロチドよりも改善された結合および薬物動態を有する化合物である。したがって、本開示はまた、それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球を低下させる方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球を低下させるための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球を低下させるための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球の低下における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。
【0115】
語句「好酸球および／または好塩基球を低下させる」は、本明細書で使用される場合、対照と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない好酸球および／または好塩基球が循環している、循環する好酸球および／または好塩基球の数の低下を指す。さらに、好塩基球の低下は、マスト細胞の低下をもたらし、よって、好塩基球の低下は、マスト細胞の低下を含む。
【0116】
好酸球および好塩基球は、アレルギー性応答に関係付けられる。さらに、ＭＰＡ－Ｂｒは、皮膚ヒスタミン曝露後の血管漏出を減弱することが本明細書において示された。
【0117】
用語「処置または処置すること」は、本明細書で使用される場合、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、１種または複数の症状または状態の軽減または好転、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡散を予防すること、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の好転または緩和、および寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）を含むことができるがこれらに限定されない。
【0118】
別の実施形態では、本開示はまた、それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球に関連する状態を処置する方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球に関連する状態を処置するための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球に関連する状態を処置するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする動物または細胞における好酸球および／または好塩基球に関連する状態の処置における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。一実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、骨髄異形成症候群である。別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好酸球性白血病、急性好酸球性白血病、好酸球増加症を伴う慢性骨髄単球性白血病、および急性好塩基球性白血病等、好酸球および／または好塩基球起源の白血病である。別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、炎症性腸疾患である。さらに別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、寄生生物感染症である。さらに別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する状態は、特発性好酸球増多症候群（ＨＥＳ）である。
【0119】
本開示はまた、それを必要とする動物または細胞における炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを低下させる方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、それを必要とする動物または細胞における炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを低下させるための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。それを必要とする動物または細胞における炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを低下させるための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする動物または細胞における炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルの低下における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルは、血清炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルである。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシン、ＩＬ－１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ－９、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－１３およびＭＣＰ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦガンマ誘導性タンパク質１０、単球走化性タンパク質－１、マクロファージ炎症性タンパク質１－αおよびエオタキシンのうち少なくとも１種を含む。さらに別の実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシンを含む。斯かる方法および使用は、ＣＯＶＩＤ １９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳ感染症ならびに関連ＡＲＤＳ等、コロナウイルス感染症を含む、増加した炎症性サイトカインおよび／またはケモカインに関連する疾患および状態の処置における治療適用を有する。
【0120】
ある実施形態では、方法および使用は、本明細書に開示されている化合物と組み合わせた免疫調節物質またはコルチコステロイドの投与または使用をさらに含む。
【0121】
インフルエンザおよびコロナウイルス感染症
ＭＰＡ－Ｂｒは、バスキュロチドと同様に、インフルエンザのマウスモデルにおける罹患率および死亡率を改善することが示されたが、より低い投薬量で有効である。
ＭＰＡ－Ｂｒは、バスキュロチドと同様に、インフルエンザのマウスモデルにおける罹患率および死亡率を改善することが示されたが、より低い投薬量で有効である。
【0122】
したがって、インフルエンザまたはコロナウイルス、例えば、ＣＯＶＩＤ１９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳに感染した被験体を処置する方法であって、それを必要とする被験体に本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。インフルエンザまたはコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳ ＣＯＶＩＤ １９に感染した被験体を処置するための、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。インフルエンザに感染した被験体を処置するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用がさらに提供される。インフルエンザまたはコロナウイルス、例えば、ＣＯＶＩＤ １９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳおよびコロナウイルス関連ＡＲＤＳに感染した被験体の処置における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらになお提供される。
【0123】
本開示はまた、ＣＯＶＩＤ １９、ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳならびにその関連ＡＲＤＳ等のインフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における肺内皮漏出を減少させる方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、ＣＯＶＤ １９およびその関連ＡＲＤＳおよびその関連ＡＲＤＳ等のインフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における内皮漏出を減少させるための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。インフルエンザに感染した動物または細胞における内皮漏出を減少させるための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。ＣＯＶＩＤ １９およびその関連ＡＲＤＳ等のインフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における内皮漏出の減少における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。
【0124】
本明細書で使用される場合、コロナウイルスは、プラスセンスＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。本発明によって包含されるコロナウイルスの例は、ＣＯＶＩＤ １９、ＳＡＲＳ、Ｃ型肝炎およびＭＥＲＳを含むがこれらに限定されない。
【0125】
本明細書で使用される場合、用語「肺内皮漏出」は、肺微小血管内皮の関門完全性の損失または増加した透過性を指す。用語「肺内皮漏出を減少させる」は、本明細書に記載されている方法および使用によって処置されていない対照と比較して、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、７５または１００％の肺内皮漏出の減少を指す。一実施形態では、肺内皮漏出は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、またはデキストラン等のフルオレセインをタグ付けされた化合物の蛍光によって測定される。用語「肺内皮漏出を減少させる」はまた、本明細書に記載されている方法および使用によって処置されていない対照と比較して、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、７５または１００％の肺微小血管内皮の透過性の増加を指す。
【0126】
インフルエンザおよびコロナウイルスによる低用量感染は、その後の細菌への曝露の際に、肺内皮を漏出増加させ易くし、これは、プライミングとして公知の現象であり、バスキュロチドが、このプライミング誘導性漏出を抑止することができることが以前に示された。Ｔｉｅ２受容体の改善された結合を有し、インフルエンザおよびコロナウイルスのマウスモデルにおいて要求される投薬量を低下させる、ＭＰＡ－Ｂｒは、同じまたはより低い投薬量で同様のまたは改善された活性をもたらすことが予想される。
【0127】
したがって、本開示はまた、それを必要とする動物または細胞におけるインフルエンザおよびコロナウイルスに関連する細菌重感染を処置する方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、それを必要とする動物または細胞におけるインフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を処置するための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。それを必要とする動物または細胞におけるインフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を処置するための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。それを必要とする動物または細胞におけるインフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染の処置における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。
【0128】
本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における生存を増加させるおよび／または死亡率を減少させる方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における生存を増加させるおよび／または死亡率を減少させるための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における生存を増加させるおよび／または死亡率を減少させるための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における生存の増加および／または死亡率の減少における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。
【0129】
本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における肺内皮漏出を減少させる方法であって、本明細書に開示されている化合物を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における肺内皮漏出を減少させるための、本明細書に開示されている化合物の使用を提供する。インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における肺内皮漏出を減少させるための医薬の調製における、本明細書に開示されている化合物の使用もまた提供される。インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞における肺内皮漏出の減少における使用のための、本明細書に開示されている化合物がさらに提供される。
【0130】
本明細書で使用される場合、用語「細菌重感染」は、低用量インフルエンザ感染またはコロナウイルス感染を含む原発性インフルエンザ感染に続発して、または典型的には、その後に生じる細菌感染を指す。細菌重感染は、インフルエンザまたはコロナウイルス感染と同時にまたはその後に起こる肺炎として定義することもできる。一実施形態では、細菌重感染の原因となる細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）等、グラム陽性細菌である。理論によって制約されないが、インフルエンザおよびコロナウイルス感染は、肺内皮をプライミングし、続発性細菌感染が起きた場合に、漏出に対するその感受性をより高くすると考えられる。結果として、細菌重感染は、他の点では日常的なインフルエンザおよびコロナウイルスによる感染の後に、重症肺傷害を引き起こし得る。
【0131】
本明細書で使用される場合、表現「インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染」は、一実施形態では、インフルエンザまたはコロナウイルス感染と同時期にまたはそれと同時に起こる細菌重感染を指す。別の実施形態では、表現「インフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染」は、インフルエンザまたはコロナウイルス感染に続いてまたはその後に起こる細菌重感染を指す。
【0132】
抗ウイルス剤による現在の処置は、感染の開始初期と処置との間で時間が経過するのでそれほど有効ではなく、このことは、患者が、必ずしも症状が生じた直後に処置を受けるとは限らないため問題になる。抗ウイルス処置の減退する有効性とは対照的に、バスキュロチドは、遅延された様式で与えた場合であっても有効であることが以前に実証されており、ＭＰＡ－Ｂｒもまた、投与が感染後４８時間遅延された場合に有効性を示した。
【0133】
したがって、ある実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、感染の約２４時間後または少なくとも２４時間後に使用または投与される。別の実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、感染の約４８時間後または少なくとも４８時間後に使用または投与される。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、感染の約７２時間後または少なくとも７２時間後に使用または投与される。
【0134】
バスキュロチドによる処置はまた、インフルエンザによる原発性ウイルス肺炎および急性肺傷害のマウスモデルにおいて、抗ウイルス処置の有効性を低下させず、生存を増加させることが以前に示された。ＭＰＡ－Ｂｒが、同じまたはより低い投薬量で、同様のまたは改善された活性を有することが予想される。したがって、本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞を処置する方法であって、それを必要とする動物または細胞に（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞を処置するための、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用を提供する。インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞を処置するための医薬の調製における、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用もまた提供される。インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞の処置における使用のための、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤がさらに提供される。
【0135】
本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における生存を増加させるおよび／または死亡率を減少させる方法であって、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における生存を増加させるおよび／または死亡率を減少させるための、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用を提供する。インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における生存を増加させるおよび／または死亡率を減少させるための医薬の調製における、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用もまた提供される。インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における生存の増加および／または死亡率の減少における使用のための、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤がさらに提供される。
【0136】
本開示はまた、インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における肺内皮漏出を減少させる方法であって、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を投与するステップを含む方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザに感染した動物または細胞における肺内皮漏出を減少させるための、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用を提供する。インフルエンザに感染した動物または細胞における肺内皮漏出を減少させるための医薬の調製における、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用もまた提供される。インフルエンザまたはコロナウイルスに感染した動物または細胞における肺内皮漏出の減少における使用のための、（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤がさらに提供される。
【0137】
用語「抗ウイルス剤」は、本明細書で使用される場合、インフルエンザウイルスによる感染症等のウイルス感染症の処置に使用される薬物を指す。一実施形態では、抗ウイルス剤は、繁殖するウイルスの能力を抑制する薬剤である。抗ウイルス剤の例は、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、レムデシビル、リバビリンおよびオセルタミビル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）としても公知）、リトナビル、ロピナビル（ｌｏｐｉｎｏｖｉｒ）および別の抗ウイルスヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログを含むがこれらに限定されない。
【0138】
用語「処置または処置すること」は、本明細書で使用される場合、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、１種または複数の症状または状態の軽減または好転、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患の拡散を予防すること、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の好転または緩和、および寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）を含むことができるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「処置または処置すること」は、インフルエンザまたはコロナウイルスによるウイルス感染症に続発する細菌重感染を予防することまたは遅滞させることも含む。インフルエンザおよびコロナウイルス処置の有益な結果の例は、生存を増加させること、死亡率を減少させること、肺内皮漏出を減少させること、体重減少を減少させること、および／または低体温症を予防すること、および動脈血酸素化（ａｒｔｅｒｉａｌ ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）を改善することを含む。
【0139】
用語「生存を増加させる」は、本明細書で使用される場合、インフルエンザもしくはコロナウイルスによる感染および／またはこれらのウイルスに関連する細菌重感染後に動物が生存する時間の長さを増加させることを意味する。一実施形態では、用語「生存を増加させる」は、本明細書に記載されている方法および使用で処置されていない動物と比較して、これらのウイルスによる感染後に動物が生存する時間の長さの少なくとも５、１０、２５、５０、７５、１００、２００％増加を指す。
【0140】
用語「死亡率を減少させる」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されている方法および使用で処置されていない動物と比較したときに、インフルエンザもしくはコロナウイルスおよび／またはインフルエンザもしくはコロナウイルスに関連する細菌重感染を有する動物または細胞の死亡率を減少させることを意味する。一実施形態では、死亡率は、本明細書に記載されている方法および使用で処置されていない動物と比較したときに、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％減少する。
【0141】
用語「投与すること」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの動物または細胞への本明細書に記載されている薬剤の投与を含む。
【0142】
用語「被験体」または「動物」は、本明細書で使用される場合、ヒトを含む動物界の全メンバーを含む。
【0143】
用語「細胞」は、単一の細胞と共に複数の細胞または細胞の集団を含む。細胞に投与することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（またはｅｘ ｖｉｖｏ）と共にｉｎ ｖｉｖｏで投与することを含む。
【0144】
本明細書に開示されている化合物は、局所的、全身性、経口、鼻腔内または吸入を含むいずれか適した方法によって投与することができる。
【0145】
抗ウイルス剤もまた、局所的、全身性、経口、鼻腔内または吸入を限定することなく含む、いずれか適した様式で投与することができる。
【0146】
本明細書に開示されている化合物および抗ウイルス剤は、同時発生的に（同時期に）投与することができる。別の実施形態では、本明細書に開示されている化合物および抗ウイルス剤は、逐次的に投与することができる。本明細書に開示されている化合物は、抗ウイルス剤の前に投与することができる、または抗ウイルス剤は、本明細書に開示されている化合物の前に投与することができる。ある実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、抗ウイルス剤の約２４時間後または少なくとも２４時間後に使用または投与される。別の実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、抗ウイルス剤の約４８時間後または少なくとも４８時間後に使用または投与される。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、抗ウイルス剤の約７２時間後または少なくとも７２時間後に使用または投与される。
【0147】
本明細書に記載されている薬剤の「有効量」の投与は、所望の結果の達成に必要な投薬量および期間で有効な量として定義される。本明細書に開示されている化合物の有効量は、動物の疾患状態、年齢、性別および体重等の因子に従って変動し得る。抗ウイルス剤の有効量も、動物の疾患状態、年齢、性別および体重等の因子に従って変動し得る。
【0148】
投薬レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することができる、または用量は、治療状況の緊急事態によって指し示される通りに比例的に低下させることができる。投与のモード（例えば、注射もしくは局所的適用によるｉｎ ｖｉｖｏ、または培養におけるｅｘ ｖｉｖｏ）も、投薬レジメンに影響を与えるであろう。
【0149】
本明細書に記載されている方法および使用は、単独での、または本明細書に開示されている化合物を含む医薬組成物の一部としての、本明細書に開示されている化合物の投与または使用を含む。
【0150】
一実施形態では、本明細書における方法および使用における使用のための、本明細書に開示されている化合物を含む医薬組成物は、本明細書に開示されている抗ウイルス剤をさらに含む。必要に応じて、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0151】
斯かる医薬組成物は、病巣内、静脈内、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）、直腸、非経口、局所性（ｌｏｃａｌ）、吸入（ｉｎｈａｌａｎｔ）、鼻腔内または皮下、皮内、筋肉内、髄腔内、経腹膜、経口および脳内使用のためのものであり得る。組成物は、液体、固体または半固体形態、例えば、丸剤、錠剤、クリーム剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、軟ゼラチンカプセル剤、ゲル剤、膜、錠剤（ｔｕｂｅｌｅｔ）、液剤または懸濁剤であり得る。組成物は、灌流液の形態であってもよい。
【0152】
医薬組成物は、患者に投与され得る、また、有効量の活性物質が、薬学的に許容されるビヒクルとの混合物中で組み合わされるように、薬学的に許容される組成物の調製のために、それ自体が公知の方法によって調製することができる。適したビヒクルは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡ ２００３ － ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）およびＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９） ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ １９９９に記載されている。
【0153】
これに基づき、本明細書に記載されている方法および／または使用における使用のための医薬組成物は、排他的ではないものの、１種または複数の薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤と併せて、そして適したｐＨを有し生理学的流体と等浸透圧性（ｉｓｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ）である緩衝溶液中に含有される活性化合物または物質を含む。医薬組成物はその上、コルチコステロイドおよび免疫モジュレーター等の他の薬剤を含有することができる。
【0154】
（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を含む組成物もまた提供される。必要に応じて、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0155】
（ａ）本明細書に開示されている化合物および（ｂ）本明細書に記載されている抗ウイルス剤を含むキットがさらに提供される。一実施形態では、キットは、容器をさらに含む。別の実施形態では、キットは、それを必要とする動物もしくは細胞におけるインフルエンザもしくはコロナウイルスを処置するため、ならびに／またはインフルエンザもしくはコロナウイルス感染症を有する動物における生存を増加させるおよび／もしくは死亡率を減少させるためのキットの使用についての指示を含有する。他の実施形態では、キットは、それを必要とする動物または細胞におけるインフルエンザまたはコロナウイルスに関連する細菌重感染を処置するためのキットの使用についての指示を含有する。さらなる実施形態では、キットは、インフルエンザまたはコロナウイルスを有する動物における肺内皮漏出を減少させるためのキットの使用についての指示を提供する。
【0156】
キットの本明細書に開示されている化合物および抗ウイルス剤は、必要に応じて、同時発生的なまたは逐次的な使用のためのものである。本明細書に開示されている化合物は、抗ウイルス剤／第２の血管新生剤の前の使用のためのものであり得る、または抗ウイルス剤／第２の血管新生剤は、本明細書に開示されている化合物の前の使用のためのものであり得る。
【0157】
生体材料
本明細書に開示されている化合物を生体材料中に組み込んで、次いでこれを被験体における部位に植え込んで、これにより、当該部位に化合物の効果を提供することもできる。マトリックスまたは足場を提供する生体材料は、使用に適する。化合物を、単独で、またはＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポエチン、ｂＦＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）等の１種もしくは複数の追加的な薬剤と組み合わせて組み込むことができる。適した生体材料の非限定的な例は、マトリゲル、皮膚代用物および架橋グリコサミノグリカンハイドロゲルを含む（例えば、Ｒｉｌｅｙ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５９３５－５９４３に記載されている通り）。したがって、別の態様は、本明細書に開示されている化合物が単独で、または１種もしくは複数の追加的な薬剤と組み合わせて組み込まれた生体材料組成物に関係する。生体材料を含む包装された材料も包含される。包装された材料は、生体材料の使用のために標識されてよい。
本明細書に開示されている化合物を生体材料中に組み込んで、次いでこれを被験体における部位に植え込んで、これにより、当該部位に化合物の効果を提供することもできる。マトリックスまたは足場を提供する生体材料は、使用に適する。化合物を、単独で、またはＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポエチン、ｂＦＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）等の１種もしくは複数の追加的な薬剤と組み合わせて組み込むことができる。適した生体材料の非限定的な例は、マトリゲル、皮膚代用物および架橋グリコサミノグリカンハイドロゲルを含む（例えば、Ｒｉｌｅｙ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５９３５－５９４３に記載されている通り）。したがって、別の態様は、本明細書に開示されている化合物が単独で、または１種もしくは複数の追加的な薬剤と組み合わせて組み込まれた生体材料組成物に関係する。生体材料を含む包装された材料も包含される。包装された材料は、生体材料の使用のために標識されてよい。
【0158】
上の開示は、本出願について全般的に記載する。次の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。この実施例は、単に説明目的で記載されており、本出願の範囲の限定が意図されるものではない。状況が、都合がよいと示唆するまたはそのようにすることができるときに、形態の変化および均等物の置換が考慮される。本明細書において特異的な用語が用いられてきたが、斯かる用語は、記述的な意味で意図され、限定を目的としない。
【実施例】
【0159】
次の非限定的な実施例は、本開示を説明するものである。
【0160】
（実施例１）
結果
結果
【0161】
トリプトファン蛍光分光法を使用した、均質な種特異的組換え受容体集団への親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒ結合の検出
【0162】
アミノ酸トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンは、２８０ｎｍの波長で、特にトリプトファンは２９５ｎｍで励起された場合に、固有の蛍光特性を呈する。この発光スペクトルは、タンパク質の構造上のコンフォメーションおよびその溶媒に高度に依存する。構造上のコンフォメーションに関して、リガンドのその受容体への結合が原因で起こるスペクトルの変化が、用量依存性結合を特徴付けするための固有のマーカーとして使用された。この目的で、種特異的Ｔｉｅ２Ｆｃタンパク質の固有の蛍光特性、および親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒの存在下での発光スペクトルの変化を利用して、結合動態を特徴付けた。
【0163】
組換えヒトＴｉｅ２Ｆｃ受容体およびリガンド親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒのインキュベーションにより、固有蛍光強度の用量依存性増加が観察された（図２Ａ、Ｃ）。どちらの場合も、蛍光強度は、飽和性であることが見出された。受容体およびリガンド複合体によって生成された蛍光強度から、リガンド単独によって生成された蛍光強度を減算することによって、特異的シグナルを導き出した。一部位特異的結合の非線形回帰を使用して、ヒトＴｉｅ２Ｆｃへの親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒの正規化された特異的結合の結果として生じるＫｄは、１０２．９ｎＭおよび２．６２３ｎＭである（図２Ｂ、Ｄ）。組換えマウスＴｉｅ２Ｆｃに対する親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒについて、および組換えラットおよびカニクイザルＴｉｅ２Ｆｃを用いてＭＰＡ－Ｂｒ単独について同一の試験を行った（生データ図示せず）。決定された解離定数（Ｋｄ）は、図２Ｇで詳しく述べる。
【0164】
組換えＴｉｅ２受容体が、ヒトＩｇＧ Ｆｃとの融合タンパク質であることを考慮して、親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒに結合する組換えヒトＩｇＧ Ｆｃの能力を決定した。重要なことに、蛍光強度の用量依存性増加は、いずれのリガンドに対しても観察されなかった（図２Ｅ、Ｆ）。
【0165】
親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、ＨＵＶＥＣにおけるＴｉｅ２およびＭＡＰＫリン酸化を誘導する
【0166】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において親バスキュロチドおよびＭＰＡ－ＢｒのＴｉｅ２活性化潜在力を評価した。変動する用量の両方のリガンドで処置されたＨＵＶＥＣは、Ｔｉｅ２および下流シグナル伝達分子ＭＡＰＫの活性化の増加を呈した（図３Ａ、Ｂ）。一般に、ＭＰＡ－Ｂｒは、親バスキュロチドよりも、より低い濃度で開始する増加した応答規模およびより広い用量範囲を呈した；親バスキュロチドの１０００ｎｇ／ｍｌにおける単一の有意な応答のみと比較して、１０～１００ｎｇの用量でＴｉｅ２を有意に活性化する。親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒ処置は両者共に、Ｔｉｅ２受容体に対して特徴的な釣鐘状の用量応答を呈した。この型の用量応答は、Ｔｉｅ２リガンドについて以前に注記されており、この受容体チロシンキナーゼの活性化に関連する共通の特色であると思われる（Ｂｒｋｏｖｉｃ Ａ， ｅｔ ａｌ ２００７、Ｓｔｕｒｎ ＤＨ， ｅｔ ａｌ ２００５、Ｍｕｒｄｏｃｈ Ｃ， ｅｔ ａｌ ２００７、Ｇｒｕｂｅｒ ＢＬ， ｅｔ ａｌ １９９５およびＭａｌｉｂａ Ｒ， ｅｔ ａｌ ２００８）。親バスキュロチドまたはＭＰＡ－ＢｒのいずれかによるＨＵＶＥＣの刺激は、ＭＡＰＫの下流活性化をもたらした。Ｔｉｅ２およびＭＡＰＫ活性化試験のための陽性対照としてヒト組換えＡｎｇ１を使用した。
【0167】
親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、ＨＭＶＥＣｔｅｒｔにおけるＴｉｅ２リン酸化を誘導する
【0168】
ＨＵＶＥＣに関して上で詳しく述べられている試験と同様のＴｉｅ２活性化試験を、テロメラーゼにより不死化されているヒト微小血管内皮細胞（真皮起源）（ＨＭＶＥＣｔｅｒｔ）において完了した。異なる血管床または相対的内径の血管由来の内皮細胞が、異なって挙動することは十分に受け入れられ、そのため、ＨＭＶＥＣｔｅｒｔを利用した試験は、異なる起源のヒト内皮細胞における比較を容易にした。指し示される濃度の親バスキュロチドまたはＭＰＡ－ＢｒによるＨＭＶＥＣｔｅｒｔの刺激は、Ｔｉｅ２受容体の用量依存性活性化をもたらした（図３Ａ）。この場合もやはり、用量応答は釣鐘状であり、ＭＰＡ－Ｂｒは、０．２ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ濃度で統計的に有意なアゴニスト活性を呈した。親バスキュロチド刺激後の活性化は、５倍高い濃度で明らかになり、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの範囲に及んだ。Ｔｉｅ２活性化の相対的規模は、親バスキュロチド（ほぼ２．６倍）またはヒト組換えＡｎｇ１（８００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかと比較した場合に、ＭＰＡ－Ｂｒ（ほぼ３．３倍）に対してより大きかった。ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣｔｅｒｔの両方における、親バスキュロチドと比較した場合のＭＰＡ－Ｂｒのアゴニスト効力増加は、ヒトＴｉｅ２受容体に対して呈される改善された結合特性の関数であり得る（図２Ｇを参照）。
【0169】
親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、ＭＬＭＶＥＣにおけるＴｉｅ２リン酸化を誘導する。
【0170】
本明細書に詳しく述べられているいくつかの前臨床有効性試験は、試験種としてマウスを利用する。したがって、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－ＢｒのＴｉｅ２アゴニスト効力を特異的に評価するために、初代マウス肺微小血管内皮細胞（ＭＬＭＶＥＣ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系を使用した。親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、濃度特異的、釣鐘状の用量応答を呈した。Ｔｉｅ２のＭＰＡ－Ｂｒ媒介性活性化は、１０ｎｇ／ｍｌ～５０００ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ濃度において明らかであったが、親バスキュロチドは、１００ｎｇ／ｍｌ～５０００ｎｇ／ｍｌの範囲に及んだ濃度でＴｉｅ２の活性化を促進した。Ｔｉｅ２の統計的に有意な活性化が、ＭＰＡ－Ｂｒでは、親バスキュロチドの場合の１０分の１の濃度で起こったものの、Ｔｉｅ２受容体の誘導の相対的規模は、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒで異ならなかった。
【0171】
親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、初代ラット、イヌおよびカニクイザル内皮細胞におけるＴｉｅ２リン酸化を誘導する
【0172】
ラット糸球体内皮細胞、イヌ大動脈内皮細胞およびカニクイザル糸球体内皮細胞の初代細胞培養物を、変動する濃度のＭＰＡ－Ｂｒで刺激した。全ての場合において、これらの細胞培養アッセイは、Ｔｉｅ２活性化のＭＰＡ－Ｂｒ依存性増加を呈した。用量応答は、ヒトおよびマウス内皮細胞試験で注記される特徴的な釣鐘状に似ており、Ｔｉｅ２受容体リン酸化の統計的に有意な増加は、０．２ｎｇ／ｍｌと５０ｎｇ／ｍｌとの間を中心とした。全ての場合において、ヒト組換えＡｎｇ１は、ベースラインＴｉｅ２リン酸化の有意な増加をもたらした（処置なし（ＮＴ）と比較して）。
【0173】
親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザへの曝露後に罹患率および死亡率を改善する
【0174】
インフルエンザ（Ｈ３Ｎ２、６４ＨＡＵ／マウス）に感染したＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、体重減少を生じ（図６Ｂ、Ｃ）、感染５～７日後の間に致死的効果に屈し始めた。１００ｎｇ／マウス／日で投与された親バスキュロチドの有効性を以前に検査したところ（Ｓｕｇｉｙａｍａ ＭＧ ｅｔ ａｌ， ２０１５）、Ｘ３１インフルエンザによるＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの感染後の生存の増強において無効であることが見出された。親バスキュロチド（５００ｎｇ、腹腔内に毎日－－最適であると以前に規定されている）またはＭＰＡ－Ｂｒ（３１．２５ｎｇまたは２００ｎｇ、腹腔内に毎日）の投与は、感染したマウスの全生存を有意に改善した（ｐ＜０．００１）（図６Ａ）。加えて、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、肺酸素化（ＳｐＯ２）、熱調節および活動性スコアを有意に改善した（図６Ｄ～Ｉ）。ＭＰＡ－Ｂｒが、親バスキュロチドに対して優越性を呈したいくつかの尺度が存在した。これらの例は、消耗からの保護（６日目、ＭＰＡ－Ｂｒ ２００ｎｇ／日、図６Ｃ）および動脈血酸素化（６日目、ＭＰＡ－Ｂｒ ２００ｎｇ／日、図６Ｅ）を特に含む。３１．２５ｎｇ／マウス／日で送達されたＭＰＡ－Ｂｒは、１６分の１の用量の低下を表す。全ての試験エンドポイントにおいて、３１．２５ｎｇ／マウス／日で送達されたＭＰＡ－Ｂｒは、親バスキュロチドに等しいまたはより優れた成績を収めた。これは、親バスキュロチドと比較した用量の２．５分の１への低下を表す、ＭＰＡ－Ｂｒ ２００ｎｇ／マウス／日にも当てはまった。
【0175】
雄スプラーグドーリーラットにおける親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒの薬物動態解析
【0176】
指し示される量（ｕｇ／ｋｇ）の親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒを、雄スプラーグドーリーラットへのボーラス注射により静脈内投与した。一連の時限の採血を行い、血漿調製物を、親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒを定量化するように特異的に設計された所有権のある酵素結合免疫吸着アッセイに適用した。経時的な試験薬剤の定量化は、分布体積、クリアランスおよび終末半減期を含む薬物動態（ＰＫ）尺度の計算を容易にした（図７Ａ、Ｂ）。１２０ｕｇ／ｋｇ用量は、これらの試験における検出の最大の感度をもたらし、したがって、提示されるＰＫ尺度は、この特定の用量レベルに関係する。親バスキュロチド（図７Ｂ）およびＭＰＡ－Ｂｒ（図７Ａ）は、同様の分布体積およびクリアランス速度を呈したが、ＭＰＡ－Ｂｒは、親バスキュロチドよりも著しく長く循環した（ｔ１／２ ６８分 対 ３４分）。２４時間毎に１回を連続３日間の１２０ｕｇ／ｋｇにおける複数用量（ＭＤ）静脈内設定でＭＰＡ－Ｂｒ ＰＫを評価した。この特定の投薬アプローチは、単一の１２０ｕｇ／ｋｇ ＩＶ用量と異ならず、毎日投与されたときに薬物の蓄積がないことを示唆する。
【0177】
親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒは、皮膚ヒスタミン曝露後の血管漏出を減弱する
【0178】
以前の試験は、ヒスタミンへの曝露後の血管漏出誘導の対抗におけるＴｉｅ２の必須の（ｏｂｌｉｇａｔｅ）役割を強調した。特に、Ｔｉｅ２の天然のアンタゴニストであるアンジオポエチン２が遺伝的に欠損したマウスは、ヒスタミン負荷後に血管漏出応答を開始することが全くできない（Ｂｅｎｅｓｔ ＡＶ ｅｔ ａｌ， Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ， ２０１３）。そのため、親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒ等の、Ｔｉｅ２の特異的アゴニストの投与は、ヒスタミン誘導性血管漏出を阻害すると仮定された。皮膚ヒスタミン負荷の１時間前に予防的用量の親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒを与えた雄ＦＶＢマウスは、エバンスブルー色素トレーサーの血管外遊出によって評価されたときに、ビヒクル処置マウスよりも有意に少ない血管漏出を呈した（図８Ａ）。重要なことに、５００ｎｇ／マウスの最適用量で送達された親バスキュロチド処置は、ヒスタミン誘導性血管漏出の低下において、等しい用量のまたは４分の１の（１２５ｎｇ／マウス）ＭＰＡ－Ｂｒよりも劣った成績を収めた。
【0179】
方法および材料：
バスキュロチドアナログＭｐａ－Ｂｒをもたらす、３－メルカプトプロピオン酸（Ｍｐａ）リンカーを介した四量体Ｔｉｅ２結合ペプチド（Ｔ７）の調製
バスキュロチドアナログＭｐａ－Ｂｒをもたらす、３－メルカプトプロピオン酸（Ｍｐａ）リンカーを介した四量体Ｔｉｅ２結合ペプチド（Ｔ７）の調製
【0180】
概観：Ｍｐａ－Ｂｒのために実行される製造プロセスは、いくつかのステップを要求した。第１のステージにおいて、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成技法を使用して、Ｔ７ペプチドおよび３－メルカプトプロピオン酸（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｍｐａ）生産ペプチド（ｅｌａｂｏｒａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）を調製した。これは、Ｎ末端に３－メルカプトプロピオニルリンカーを有するＴ７ペプチドを含むＭｐａ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－ＯＨをもたらした（配列番号７）。これに続いて、切断および脱保護、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製および最終産物の凍結乾燥によるフリーズドライによって、ＴＦＡ塩としてＭｐａ－Ｔ７ペプチドを単離した。第２のステージにおいて、（ブロモアセトアミド）４－ＰＥＧ１０ＫとＭｐａ－ペプチドのコンジュゲーションを遂行し、続いて、ＰＥＧコンジュゲートの２つのレベルの精製を行った。第１の精製ステップは、Ｍｐａ－ＢｒコンジュゲートＴＦＡ塩を生じるＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む。この産物は、凍結乾燥により、このステージで単離することができる、またはＴＦＡ対イオンが、ＴＦＡ塩中間体の単離なしで、イオン交換クロマトグラフィーにより、酢酸塩形態へと直接的に交換される。この初期産物をフリーズドライして、自由に流動する固体としてＭｐａ－Ｂｒ酢酸塩を単離した。
【0181】
Ｍｐａ Ｔ７－ペプチド製造
ステップ１：樹脂上でのアセンブリ
ステップ１：樹脂上でのアセンブリ
【0182】
ＣＳ Ｂｉｏペプチド合成機を使用して、４０ｇ樹脂インプットによりＷａｎｇポリスチレン樹脂（初期官能化１．２ｍｍｏｌ／ｇ）上でＴ７ペプチド配列をアセンブルした。４時間にわたりＤＭＦにおいて８当量のアミノ酸および４当量のＤＩＣを使用して、Ｗａｎｇ樹脂にＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨをローディングした。Ｆｍｏｃローディング検査は、４５．４ｍｍｏｌスケール合成に対応する０．８ｍｍｏｌ／ｇローディングが達成されたことを指し示した。全アミノ酸は、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ化学（３当量、１３６．２ｍｍｏｌ）を使用して単一カップリングされた。０．５Ｍ Ａｃ２Ｏ／ＤＭＦをキャッピングのために使用し、２０％ピペリジン／ＤＭＦをＦｍｏｃ脱保護のために使用した。Ｔ７ペプチド配列の完了後に、試行切断を実行し、ＲＰ－ＨＰＬＣ解析は、７７．５％粗純度で配列がアセンブルに成功したことを指し示した。
【0183】
４時間にわたるＤＭＦにおける３当量のＤＩＣ／Ｏｘｙｍａの存在下で３当量のＴｒｔ－Ｍｐａ－ＯＨを使用して、樹脂結合Ｔ７ペプチドへのＭｐａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）のカップリングを実行した。樹脂を洗浄し（ＤＭＦ、ＭｅＯＨおよびＭＴＢＥ）、真空デシケーター内で一晩乾燥させた後に、８９．１％の合成収率に対応する、１２４．５ｇの最終樹脂を得た（８４．５ｇ重量増加）。試行切断解析は、７８．５％の粗純度でＭｐａ－Ｔ７ペプチドが形成されたことを指し示した。ＥＳＩ－ＭＳ解析は、Ｍｐａペプチドが形成されたことを確認した（観察されたＭＳ＝１０４４．４）。
【0184】
ステップ２：切断および脱保護
【0185】
樹脂結合Ｍｐａ－Ｔ７ペプチドを、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＥＤＴ（９２．５：２．５：２．５：２．５）を含む切断溶液で３時間処理した。ペプチドを貧溶媒（ａｎｔｉ－ｓｏｌｖｅｎｔ）（ｉＰｒ２Ｏ）で沈殿させ、ペプチドを濾過によって単離して、粗生成物を生じた。樹脂結合Ｍｐａ－Ｔ７ペプチドを切断して、全体で３８％回収および９１．８％収率に対応する、３１．５ｇ粗ペプチドを生じた。粗生成物のＲＰ－ＨＰＬＣ解析は、粗純度が７０．５％であることを指し示した。
【0186】
ステップ３：精製
【0187】
粗Ｍｐａ－Ｔ７ペプチド（２４ｇ）を緩衝液Ａ（１５ｍＭ ＴＥＡＰ）に希釈し、５～１０％緩衝液Ｂ（２０％ＭｅＣＮ／水）の勾配および８８ｍＬ／分の流量による、Ｌｕｎａ Ｃ１８（３）ＰＲＥＰ ２５０×５０ｍｍ ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラムにおけるＲＰ－ＨＰＬＣを使用して精製した。ＴＥＡＰ精製由来の産物プールを組み合わせ、０．５％ＴＦＡ／水を用いて５部において１部を希釈した。ペプチド溶液の半分を精製カラムへと戻してローディングし、産物をカラム上で初期洗浄し、０．５％ＴＦＡを含有する水／ＭｅＣＮ（１０％）で溶出させ、その後、緩衝液Ｂを、ＭｅＣＮにおける０．１％ＴＦＡに置き換え、２０～６０％Ｂの勾配を適用することにより産物を溶出させた。残っているペプチド溶液を用いてこのステップを反復し、産物プールを組み合わせ、凍結乾燥して、樹脂ローディングステップからの全体で４３．７％収率に対応する、ＴＦＡ塩としての１１．４ｇのＭｐａ－Ｔ７ペプチドを生じた。最終解析は、６．７ｇ正味ペプチド（２５．８％収率）に対応する、６１％のペプチド含有量および９６．２％のＲＰ－ＨＰＬＣ純度を指し示した。
【0188】
Ｍｐａ－Ｂｒコンジュゲート製造
ステップ１：コンジュゲーション
ステップ１：コンジュゲーション
【0189】
０．１３Ｍ ＮａＣｌを含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基性）緩衝液ｐＨ８（１２０ｍｌ）にＭｐａ－Ｔ７ペプチドＴＦＡ塩（２ｍｍｏｌ）および（ブロモアセトアミド）４－ＰＥＧ１０Ｋ（ＪｅｎＫｅｍ、ＵＳＡ）（０．４８ｍｍｏｌ）を溶解することにより、コンジュゲーション反応を行った。反応溶液のｐＨがｐＨ６．５であると確認し、反応混合物を３０℃で２２時間撹拌した。反応進行をＲＰ－ＨＰＬＣによってモニターし、４腕置換四量体ブロモアセトアミドから完全にコンジュゲートされた産物へのおよそ５８％変換まで進めた。反応完了時に、粗混合物は、大まかに、それぞれほぼ３０％の３腕およびほぼ７％の２腕中間体を含有した。少量の単一腕産物を得た。
【0190】
ステップ２：Ｍｐａ－Ｂｒ ＴＦＡ塩の精製
【0191】
反応混合物を緩衝液Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）で１：１希釈し、１０～７５％緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ：水（６０：４０）＋０．１％ＴＦＡ）の勾配および４２ｍＬ／分の流量によりＬｕｎａ Ｃ１８（３）ＰＲＥＰ ２５０×３０ｍｍカラムを用いて、１０ｍＬ画分を収集する精製を実行した。このステージにおいて凍結乾燥によって単離された産物は、約４５％の収率およびＲＰ－ＨＰＬＣによる純度＞９９％で、Ｍｐａ－Ｂｒ ＴＦＡ塩をもたらした。
【0192】
ステップ３：Ｍｐａ－Ｂｒ対イオン交換
【0193】
ＴＦＡ対イオンを有するＭｐａ－Ｂｒコンジュゲートは、蝋様／粘着性のコンシステンシーを有するアモルファス材料を生じる。この物理的特徴に取り組むために、ステップ２に記載されている通りに得られたＲＰ－ＨＰＬＣ精製Ｍｐａ－Ｂｒ ＴＦＡ塩画分から直接的に塩交換を行った。凍結乾燥前に、画分を組み合わせ（ほぼ５００ｍＬ）、水で１：１希釈した。溶液をＲＰ－ＨＰＬＣカラムにローディングし、４２ｍＬ／分の流量によるＬｕｎａ Ｃ１８（３）ＰＲＥＰ ２５０×３０ｍｍカラムを使用した酢酸塩交換プロセスにより採取し、以下を含むいくつかのステップの後に１０ｍＬ画分を収集した；初期カラム平衡化（１％ＡｃＯＨを含有する０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ）、試料のローディングと、それに続く、交換プロセス（１％ＡｃＯＨを含有する０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ）、酢酸アンモニウム除去ステップ（１％ＡｃＯＨ（緩衝液Ａ）およびＭｅＣＮ（緩衝液Ｂ）、１０％Ｂ）および溶出プロセス（１％ＡｃＯＨ（緩衝液Ａ）およびＭｅＣＮ（緩衝液Ｂ）、１０～５０％Ｂ）。産物をプールし、凍結乾燥して、自由に流動する結晶性固体としてＭｐａ－Ｂｒ酢酸塩をもたらした。解析は、４２．１％の全体的収率で、完全に置換されたペプチドコンジュゲートＭｐａ－Ｂｒに対応する、ＲＰ－ＨＰＬＣにより１００％純度を指し示した。イオンクロマトグラフィーによる残存する臭素（Ｂｒ）に関するコンジュゲートの解析は、＜０．１％Ｂｒを確認し、４腕ブロモアセトアミド－ＰＥＧ四量体の完全置換を指し示した。Ｍｐａ－Ｂｒ酢酸塩の追加的な解析をＳＣＸクロマトグラフィーによっても実行し、Ｍｐａ－Ｂｒ酢酸塩の純度は、９０．０％であることが見出された。
【0194】
トリプトファン蛍光分光法：
【0195】
リガンドおよび受容体相互作用。２×濃度の各リガンド（親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒ）を２５μＬで調製し、２５μＬの２×濃度のＴｉｅ２Ｆｃ受容体と混合して、最終体積５０μＬに１×濃度のリガンドおよび受容体を生成した。リガンドの濃度は、受容体の結合飽和に達するほど十分に高くなるべきである。１０ｎｍの設定読み取り間隔および読み取りに先立つ５秒間の自動混合とともに、２９５ｎｍの励起波長、３６０ｎｍの開始発光波長スキャン、および４５０ｎｍの終了発光波長スキャンに設定されたＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２プレートリーダーによって周囲温度で試料を読み取った。データは、ＳｏｆｔＭａｘを使用してコンパイルし、Ｐｒｉｓｍを使用して解析した。
【0196】
受容体およびリガンド。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから組換え受容体を購入した（組換えヒトＴｉｅ－２Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、組換えマウスＴｉｅ－２Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、組換えラットＴｉｅ２－ＦＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および組換えカニクイザルＴｉｅ２－ＦＣ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）。リガンドは、Ｂａｃｈｅｍによって製造された（親バスキュロチドおよびＭＰＡ－Ｂｒ）。陰性ＩｇＧ－ＦＣ対照は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから供給された。受容体およびリガンドの両方を、ＤＰＢＳ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－ＨｙＣｌｏｎｅ）に再懸濁した。
【0197】
Ｔｉｅ２リン酸化－－ＨＵＶＥＣ：
【0198】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、製造業者の推奨に従って、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および３７℃の加湿チャンバー内で、１００ｍｍ組織培養プレートにて、「ＥＧＭ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕｏｔｓ」（Ｌｏｎｚａ）を補充した完全内皮基本培地（ＥＢＭ）（Ｌｏｎｚａ）に播種した。９０％コンフルエンスに達した細胞を、完全ＥＢＭ培地における指定濃度の親バスキュロチド、ＭＰＡ－Ｂｒまたはアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１５分間刺激した。１５分間の刺激の後に、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳにおいて２回洗浄した。ＩＣ１２溶解緩衝液（１％ＮＰ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウム）における使用のために、細胞ライセートを調製した。製造業者の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の通りに、ＢＣＡタンパク質濃度キットを使用して、各ライセートのタンパク質濃度を測定した。製造業者のプロトコールに従って、試料を、リン酸化Ｔｉｅ２および総Ｔｉｅ２レベルを測定するＥＬＩＳＡに供した。それぞれリン酸化Ｔｉｅ２および総Ｔｉｅ２読み取りのために、各試料由来の２０μｇまたは５μｇのタンパク質を、２連でローディングした。リン酸化Ｔｉｅ２：総Ｔｉｅ２比を試料毎に決定した。次に、各実験において、全処置群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを、処置なし群（ＮＴ、完全ＥＢＭのみ）のものに対して正規化した。
【0199】
ＭＡＰＫリン酸化－－ＨＵＶＥＣ：
【0200】
上述の通りにＨＵＶＥＣを培養した。（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、６Ｍ尿素、５ｍＭ ＮａＦ、１００ｕＭ ＰＭＳＦ、２５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、ｐＨ７．２～７．４、１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ミニＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤）においてライセートを調製した。製造業者の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の通りに、ＢＣＡタンパク質濃度キットを使用して、各ライセートのタンパク質濃度を測定した。製造業者のプロトコール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、試料を、リン酸化ＭＡＰＫおよび総ＭＡＰＫレベルを測定するＥＬＩＳＡに供した。それぞれリン酸化ＭＡＰＫおよび総ＭＡＰＫ読み取りのために、各試料由来の２０μｇまたは１０μｇのタンパク質を、２連でローディングした。リン酸化ＭＡＰＫ：総ＭＡＰＫ比を試料毎に決定した。次に、各実験において、全処置群のＭＡＰＫリン酸化のレベルを、処置なし群（ＮＴ、ＥＢＭのみ）のものに対して正規化した。
【0201】
Ｔｉｅ２リン酸化－－ＨＭＶＥＣｔｅｒｔ：
【0202】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素／触媒サブユニット（ｔｅｒｔ）により不死化されたヒト微小血管内皮細胞（真皮起源）（Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｇｕｏ （２００４））を、１００ｍｍ組織培養プレートにて、完全内皮基本培地－２（ＥＢＭ－２）（Ｌｏｎｚａ）に播種し、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および３７℃の加湿チャンバー内で培養した。増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１ｕｇ／ｍｌヒドロコルチゾンおよび１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを補充したＥＢＭ－２からなった。９０％コンフルエンスに達した細胞を、完全ＥＢＭ－２培地における指定濃度の親バスキュロチド、ＭＰＡ－Ｂｒまたはアンジオポエチン－１で１５分間刺激した。１５分間の刺激の後に、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳにおいて２回洗浄した。ＩＣ１２溶解緩衝液（１％ＮＰ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウム）における使用のために、細胞ライセートを調製した。ＢＣＡタンパク質濃度キットを使用して、各ライセートのタンパク質濃度を測定した。試料を、ｐＹＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２濃度を測定するＥＬＩＳＡに供した。各試料由来の２０μｇのタンパク質を、各ウェルにローディングし、各試料を２連で実行した。ｐＴｉｅ２の総Ｔｉｅ２に対する相対的な比を試料毎に決定した。各実験において、各処置群におけるＴｉｅ－２リン酸化のレベルを、ＥＢＭ処置群のものに対して正規化した。
【0203】
Ｔｉｅ２リン酸化－－初代マウス肺微小血管内皮細胞
【0204】
初代マウス肺内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、１００ｍｍ組織培養プレートにて、「ＥＧＭ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕｏｔｓ」（Ｌｏｎｚａ）を補充した完全内皮基本培地（ＥＢＭ）（Ｌｏｎｚａ）に播種した。９０％コンフルエンスに達した細胞を、完全ＥＢＭ培地における指定濃度の親バスキュロチド、ＭＰＡ－Ｂｒまたはアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で１５分間刺激した。１５分間の刺激の後に、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳにおいて２回洗浄した。ＩＣ１２溶解緩衝液（１％ＮＰ－４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウム）における使用のために、細胞ライセートを調製した。製造業者の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の通りに、ＢＣＡタンパク質濃度キットを使用して、各ライセートのタンパク質濃度を測定した。製造業者のプロトコール（マウスＴｉｅ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、試料を、リン酸化Ｔｉｅ２および総Ｔｉｅ２レベルを測定するＥＬＩＳＡに供した。それぞれリン酸化Ｔｉｅ２および総Ｔｉｅ２読み取りのために、各試料由来の５０μｇまたは５μｇのタンパク質を、３連でローディングした。リン酸化Ｔｉｅ２：総Ｔｉｅ２比を試料毎に決定した。次に、各実験において、全処置群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを、処置なし群（ＮＴ、完全ＥＢＭのみ）のものに対して正規化した。
【0205】
Ｔｉｅ２リン酸化－－初代ラット糸球体内皮細胞：
【0206】
ラット初代糸球体内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および３７℃の加湿チャンバー内で、完全ラット内皮細胞培地／ｗキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）において増殖させ、８０～９０％コンフルエンシーに達したら１：３に分割した。ラット腎臓糸球体内皮細胞におけるＭＰＡ－ＢｒによるＴｉｅ２の活性化を検査するために、９５～１００％コンフルエント細胞を、血清含有培地において指し示される濃度の試験薬剤で１５分間刺激した。陽性対照としてヒトＡｎｇ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ヒトホスホ－Ｔｉｅ－２ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）において推奨される溶解緩衝液ＩＣ１２（上に詳述）を使用して、細胞ライセートを収集し、ラットＴｉｅ２に対して検証された捕捉抗体の置き換えを伴うＥＬＩＳＡ（ヒトホスホ－Ｔｉｅ２および総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、チロシン－リン酸化Ｔｉｅ２および総Ｔｉｅ２を測定した。マウス抗Ｔｉｅ２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））およびウサギＴＥＫポリクローナル抗体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を、それぞれｐＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として使用した。次に、各実験において、全処置群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを、処置なし群（ＮＴ、完全ラット内皮細胞培地）のものに対して正規化した。
【0207】
Ｔｉｅ２リン酸化－－初代イヌ大動脈内皮細胞：
【0208】
イヌ初代大動脈内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および３７℃の加湿チャンバー内で、完全イヌ内皮細胞培地／ｗキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）において増殖させ、８０～９０％コンフルエンシーに達したら１：３に分割した。初代カニクイザル糸球体内皮細胞において行われたＴｉｅ２活性化試験は、ラット初代糸球体内皮細胞試験について上で詳しく述べたアプローチに従って行った。
【0209】
Ｔｉｅ２リン酸化－－初代カニクイザル糸球体内皮細胞：
【0210】
初代カニクイザル糸球体内皮細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、ＨＭＶＥＣｔｅｒｔについて上に提示した詳細に従って培養した。初代カニクイザル糸球体内皮細胞において行われたＴｉｅ２活性化試験は、ラット初代糸球体内皮細胞試験について上で詳しく述べたアプローチに従って行った。
【0211】
皮膚ヒスタミン負荷：
【0212】
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから１０週齢雄ＦＶＢマウスを購入した。マウスを、標準明：暗サイクルの動物施設に収容し、食物および水に自由にアクセスできるようにした。０日目に、マウスをイソフルランで麻酔し、背側部全体を電動シェーバーで剪毛した。残存する毛を、脱毛クリームの塗布により除去した。残存するクリームを滅菌ガーゼおよび水で除去した。４日目に、マウスは、２００ｕｌ腹腔内注射としてビヒクル対照（滅菌ＰＢＳ）、親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒのいずれかを受けた。ＰＢＳ／親バスキュロチド／ＭＰＡ－Ｂｒの送達１時間後に、マウスを、イソフルラン麻酔下に置き、その時点で、１００ｕｌの１％エバンスブルー色素（滅菌ＰＢＳ中に含有される）を尾静脈経由で静脈内送達した。エバンスブルー色素投与の直後に、まだ麻酔下にあるうちに、単一のＰＢＳ注射（背側、皮内、５０ｕｌ）および３個の等しく間隔をあけたヒスタミン注射（背側、皮内、５０ｕｌ中に含有された１．２５ｕｇ）を適用した。皮内注射が完了したら、マウスを麻酔から覚まし、２５分間にわたりその収容ケージ内に戻した。
【0213】
心臓灌流（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒａｎｓｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）。ヒスタミンへの曝露の２５分後に、マウスを、妥当な体積の２．５％アバチン（ａｖｅｒｔｉｎ）（腹腔内注射を介して１００ｕｌ／１０ｇ体重）で麻酔下に置いた。麻酔の深く定常な状態（ｄｅｅｐ ｐｌａｎｅ）が得られたら、マウスを仰臥位で置いて固定し、胸部を外科的に切開し、心臓を露出させ、２３ゲージ針で終端するカテーテルを左心室に挿入した。カテーテルが確実に適所に置かれたら、右心房においてカットを入れて、１００ｍｍＨｇにてカテーテル経由で２５ｍｌの冷ＰＢＳを送達して、血管内エバンスブルー色素を全て流し出した。マウスが有効に灌流されたら、背側皮膚を外科的に除去した。標準化された皮膚穿孔器を使用して、マウス毎に４個の１２ｍｍ皮膚生検材料を収集した（１個のＰＢＳ、３個のヒスタミン）。全ての場合において、ＰＢＳを受けた生検材料を、当該の個々のマウスのベースライン対照とした。
【0214】
エバンスブルー色素血管外遊出の定量化。皮膚生検材料を標識されたチューブ内に置き、これを摂氏６０度のオーブン内に１６時間置いて、全ての水分を除去した。乾燥皮膚生検材料を秤量し、１．５ｍｌのホルムアミドを含有するチューブ内に置き、次いでこれを摂氏６０度のウォーターバス内に７２時間置いた。７２時間後に、チューブを５００ＲＣＦで遠心分離し、１００ｕｌ試料を、６２０ｎｍおよび４０５ｎｍでの測定のために平底９６ウェルマイクロタイタープレートに取り出した。エバンスブルー色素血管外遊出の量（皮膚１ｇあたりｕｇ）を計算することができるように、高いおよび低い実験データ点を包含するエバンスブルー色素標準曲線を構築した。
【0215】
インフルエンザ試験：
【0216】
実験設計。１４週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。マウスを、標準明：暗サイクルの動物施設に収容し、食物および水に自由にアクセスできるようにした。全実験について、マウスを５％イソフルランで鎮静させ、最終体積８０ｕＬへとＰＢＳで希釈されたインフルエンザウイルス（下のウイルスセクションを参照）に鼻腔内感染させた。感染後に、マウスを、体重を一致させた対照および処置群に分けた；各実験処置アームは、１群当たり１０匹のマウスを使用し、マウスを、７日目までに１００％死亡率を引き起こした６４ ＨＡＵのインフルエンザウイルスに感染させた。次の群が含まれた：インフルエンザウイルス単独を受けたマウス（インフルエンザ）、親バスキュロチド（腹腔内注射による０．１ｍＬ ＰＢＳにおける５００ｎｇ）またはＭＰＡ－Ｂｒ（腹腔内注射による０．１ｍＬ ＰＢＳにおける２００ｎｇまたは３１．２５ｎｇ）も受けた感染マウス。親バスキュロチドまたはＭＰＡ－Ｂｒによる処置は、感染４８時間後に開始し、試験の持続時間にわたり２４時間毎に１回与えた。対照マウス（インフルエンザ）は、感染４８時間後に開始して試験の持続時間にわたり、０．１ｍＬ ＰＢＳの毎日の腹腔内注射を受けた。
【0217】
ウイルス。インフルエンザＡウイルスＨＫｘ３１（Ｈ３Ｎ２）は元々、Ｔａｎｉａ Ｗａｔｔｓ博士から得て、Ｓｚｒｅｔｔｅｒ， Ｋ． Ｊ．， Ｂａｌｉｓｈ， Ａ． Ｌ． ＆ Ｋａｔｚ， Ｊ． Ｍ．， ２００６に従って増やした。培養上清由来のウイルス力価は、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）細胞において標準プラーク形成アッセイを行うことにより、またはヒツジ赤血球の凝集（ヘマグルチニン単位、ＨＡＵ）を測定することにより決定した。
【0218】
パルスオキシメトリ測定。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ用の小型の襟クリップのいずれかを使用して、覚醒した（麻酔されていない）マウスにおいて、Ｍｏｕｓｅ Ｏｘ Ｐｌｕｓデバイスおよびソフトウェア（Ｓｔａｒｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏａｋｍｏｎｔ、ＰＡ）を使用して、動脈血酸素飽和度を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのため、感染数日前に、化学的脱毛クリームを使用して、首の付け根の周囲の毛を除去した。ＳＯ２測定のため、最大ＳＯ２測定値を記録する前に、マウスを、数分間そのホームケージに置いて襟クリップに慣れさせた。
【0219】
活動性スコアリングガイドライン
【0220】
マウスを毎日２回観察し、毎日１回秤量し、１～５の活動性スコアを割り当てた。５のスコアを受けるために、マウスは、正常で、活発かつ好奇心旺盛な挙動を示す必要がある。マウスは、動き回り、ケージの側面で直立する。４のスコアのため、マウスは、それほど活発ではない。マウスは、それほど頻繁には立ち上がらず、ケージの隅に留まることを好む。３のスコアのため、マウスは、より活発ではなく、移動時にしばしば停止して座る。マウスは、営巣する隅（ｎｅｓｔ ｃｏｒｎｅｒ）に留まる。２のスコアのため、マウスは、触れたときだけ、短い距離しか移動しない。マウスは、好ましくは、営巣する隅に潜む。最後に、１のスコアのため、マウスは瀕死である。５～３の活動性スコアは、許容されるとみなされる。２の活動性スコアを有するマウスは、入念にモニターされ、活動性が、２のスコアよりも下に減少した場合、マウスは屠殺された。その上、３０％を超える体重減少を経験するマウスは、ほかに許容される活動性スコアがあっても関係なく、安楽死された。
【0221】
マイケル付加のための包括的反応方法
【0222】
活性化ＰＥＧ四量体（ビニルスルホンまたはアクリレート等）（１１７～１１８ｍｇ、１当量）およびＭｐａ－ペプチド（１００ｍｇ、１．５当量）を、遮光した５０ｍｌ丸底フラスコに添加し、最終ペプチド濃度５ｍｇ／ｍｌとするためにＰＢＳ（ｐＨ６．５＊、２０ｍｌ）を添加した。反応物をＲＴで撹拌し、ｐＨメーターを使用してｐＨを確認し、様々な時間間隔でＨＰＬＣによって反応の進行をモニターした。反応混合物をｐＨ３．５へと酸性化した後に、次のステップを使用する精製を行った：
【0223】
ステップ１ フラッシュＬＣ：
カラム：逆相Ｃ１８、Ｆｕｊｉ、２００Å、４０ｇカラム３０μｍ（特注充填）。
勾配プロファイル：６３分で１０～１００％Ｂ
溶離液：溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ
溶離液Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中０．１％ＴＦＡ
検出：ＵＶ（λ＝２１０ｎｍ／２５４ｎｍ）
カラム温度：ＲＴ
流量：４０ｍＬ／分
カラム：逆相Ｃ１８、Ｆｕｊｉ、２００Å、４０ｇカラム３０μｍ（特注充填）。
勾配プロファイル：６３分で１０～１００％Ｂ
溶離液：溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ
溶離液Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中０．１％ＴＦＡ
検出：ＵＶ（λ＝２１０ｎｍ／２５４ｎｍ）
カラム温度：ＲＴ
流量：４０ｍＬ／分
【0224】
ステップ２ 調製用ＨＰＬＣ：
カラム：逆相Ｃ１８、Ｄａｉｓｏ Ｂｉｏ Ｃ１８、２００Å、１０μｍ ２５ｍｍ×２５０ｍｍ（特注充填）。
勾配プロファイル：７７分で４５～１００％Ｂ
溶離液：溶離液Ａ＝水中３％アセトニトリルにおける０．１％ＨＦＢＡ
溶離液Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中０．１％ＨＦＢＡ
検出：ＵＶ（λ＝２１０ｎｍ）
カラム温度：ＲＴ
流量：３０ｍＬ／分
カラム：逆相Ｃ１８、Ｄａｉｓｏ Ｂｉｏ Ｃ１８、２００Å、１０μｍ ２５ｍｍ×２５０ｍｍ（特注充填）。
勾配プロファイル：７７分で４５～１００％Ｂ
溶離液：溶離液Ａ＝水中３％アセトニトリルにおける０．１％ＨＦＢＡ
溶離液Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中０．１％ＨＦＢＡ
検出：ＵＶ（λ＝２１０ｎｍ）
カラム温度：ＲＴ
流量：３０ｍＬ／分
【0225】
ステップ３ 調製用ＨＰＬＣ：
カラム：逆相Ｃ１８、Ｄａｉｓｏ Ｂｉｏ Ｃ１８、２００Å、１０μｍ ２５ｍｍ×２５ｍｍ（特注充填）。
勾配プロファイル：８４分で４０～１００％Ｂ
溶離液：溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ
溶離液Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中０．１％ＴＦＡ
カラム：逆相Ｃ１８、Ｄａｉｓｏ Ｂｉｏ Ｃ１８、２００Å、１０μｍ ２５ｍｍ×２５ｍｍ（特注充填）。
勾配プロファイル：８４分で４０～１００％Ｂ
溶離液：溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ
溶離液Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中０．１％ＴＦＡ
【0226】
ビニルスルホン－ＰＥＧコンジュゲートの収量は、４８ｍｇであり、アクリレート－ＰＥＧコンジュゲートの収量は、１５．２ｍｇであり、両者共にＴＦＡ塩としての収量である。
【0227】
（実施例２）
【0228】
ＣＯＶＩＤ－１９疾患重症度および死亡率は、多臓器不全に寄与する、ウイルス肺感染によって誘発される急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）をもたらすサイトカインストームに関連付けられる。肺内皮および上皮細胞の炎症促進性サイトカイン媒介性傷害は、肺胞浮腫、炎症性細胞の浸潤および低酸素に加えて、血管透過性の促進により血液／空気関門の完全性を損なう（Ｚｈａｎｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ．． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０２０；１５（７））。細胞－細胞接合部調節不全およびその後の透過性の原因となるサイトカインは、ＶＥＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１８およびＴＮＦａを含む（Ａｎｎａ Ｆｌａｖｉａ Ｒｉｂｅｉｒｏ ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｍｉｇｇｉｏｌａｒｏ Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ Ｃａｓｅ Ｒｅｐ． ２０２０； ３１；Ｇｉｏｖａｎｎｉ Ｚａｒｒｉｌｌｉ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２０２１， ２２）。
【0229】
ＣＯＶＩＤ－１９疾患におけるＭＰＡ－Ｂｒ（別名ＡＶ－００１）治療法の潜在的な利益を調査するために、本発明者らは、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２によって感染した入院患者由来の血清とのインキュベーション後にヒト内皮細胞層において誘発された透過性を相殺する薬物の潜在力を評価した。ＭＰＡ－Ｂｒありおよびなしでの患者血清とのインキュベーション後の細胞層インピーダンスを測定することにより、透過性を評価した。インピーダンスの変化は、サイズ、体積、形状、または拡散する、増殖するもしくは生存する能力を含む、細胞完全性の変化を誘導するいずれかの応答を反映する。
【0230】
材料および試薬
【0231】
全てのヒト血清試料は、ＢＩＯＩＶＴ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａから購入した。健常なドナー血清（ロット＃ＨＭＮ４０９２０４、別名ＨＤ１）は、２０１９年１１月より前に収集された。ＣＯＶＩＤ－１９血清試料は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２が陽性と検査されており、ＩｇＧ陽性（ロット＃ＨＭＮ３７３５５１－ＳＲ１、別名ＩｇＧ８）またはＩｇＭ陽性（ロット＃ＨＭＮ３７３７８２１－ＳＲ１、別名ＩｇＭ５およびＨＭＮ３７３７４５－ＳＲ１、別名ＩｇＭ６）のいずれかであった。トロンビン（＃ＳＩＢＷ３０４６ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびヒトＴＮＦ－ａ（＃Ｂ２４９５７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を陽性対照として使用した。ＭＰＡ－Ｂｒ薬物製品（ＣＯＡ＃ＶＡＳＯ（ＡＶ－００１）－２０１９－２４０９１９）は、薬物物質ロット＃１００００１９６１５（Ｂａｃｈｅｍ）を使用して調製した。細胞層インピーダンスは、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＣＡ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して測定した。
【0232】
方法
【0233】
ＨＵＶＥＣ（カタログ＃Ｃ２５１９ＡＳ、ロット＃００００５６０５７３；継代２；Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）を、１ウェル当たり２０，０００個の細胞／１００ｍｌで９６ウェルＥ－プレートにて、補充されたＥＢＭ－２増殖培地（カタログ＃ＣＣ－３１６２、Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）にプレーティングした。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ）上にプレートをローディングし、コンフルエンスとなるまで４８時間増殖させた。細胞増殖および単層形成を、継続的インピーダンス読み取りによってリアルタイムでモニターした。細胞が、インピーダンスプラトーによって決定される通りに単層を形成したら、血清を欠乏させた。３時間の血清なしのインキュベーションおよびインピーダンス安定化の後に、細胞に、健常なドナー（ＨＤ１）またはＣＯＶＩＤ－１９患者（ＩｇＧ８、ＩｇＭ５またはＩｇＭ６）由来の血清（１／１０希釈）±ＭＰＡ－Ｂｒを負荷した。ビヒクル対照±ＭＰＡ－Ｂｒと並行して、トロンビン（０．２５ｎｇ／ｍＬ）±ＭＰＡ－ＢｒおよびＴＮＦα（０，５ｎｇ／ｍＬ）±ＭＰＡ－Ｂｒを陽性対照として使用した。Ｅ－プレートをインキュベーターに戻し、インピーダンスの変化を１８時間モニターした。条件毎に３連のウェルで実施した。
【0234】
インピーダンスデータを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡソフトウェアによって細胞指数（ＣＩ）に変換し、細胞処置前のＣＩに対して正規化した。
【0235】
データは、正規化された細胞指数および対照に対する％（ＡＵＣ）として提示した。
【0236】
サイトカイン定量化
【0237】
ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒト炎症パネル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ＃７４０８０８、ロット＃Ｂ３０４３３６）およびヒト血管新生パネル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ＃７４０６９８、ロット＃Ｂ３１７５６０）を使用して、健常なドナーＣＯＶＩＤ－１９血清試料において血清サイトカインを定量化した。製造業者のプロトコールに従ってレベル２＋バイオセイフティー下でアッセイを行い、Ｖ字底プレートにおいて染色を行い、取得のためのＦＡＣＳチューブに移した。ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘソフトウェアｖ８．０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によりデータを解析した。
【0238】
統計解析
【0239】
全ての反復にわたるデータを平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）としてプロットし、事後フィッシャーＬＳＤ多重比較検定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）により全ての統計解析を行った。ｐ－値≦０．０５を統計的に有意であると考慮した。
【0240】
結果
【0241】
トロンビン陽性対照およびＴＮＦα（ＣＯＶＩＤ－１９患者血清において測定される主要な炎症促進性サイトカインの１種）へのＨＵＶＥＣの曝露は、無処置対照と比べた正規化ＣＩによって測定される通り、インピーダンス損失を有意に減少させた。ＴＮＦ－ａおよびトロンビン負荷後のそれぞれ５ｎｇ／ｍＬおよび０．５～５ｎｇ／ｍＬのＭＰＡ－Ｂｒによる処置は、無処置ＨＵＶＥＣと比較して、経時的に正規化ＣＩの有意な増加をもたらした（図９Ａ～Ｃ）。ビヒクル対照処置に対して正規化された総ＡＵＣの評価は、ＴＮＦ－ａおよびトロンビン負荷細胞のためのそれぞれ５ｎｇ／ｍＬおよび０．５～５ｎｇ／ｍＬ ＭＰＡ－Ｂｒによる処置が、ビヒクル対照細胞（負荷されておらず、かつ処置されていない）のＣＩと同等な、正規化ＣＩの統計的に有意な増加をもたらしたことを明らかにした（図９Ｂ～Ｄ）。
【0242】
ＣＯＶＩＤ－１９患者ＩｇＧ８およびＩｇＭ６由来の血清とのインキュベーション後に、健常なドナー（ＤＨ）由来の血清とのインキュベーションと比較して、有意により低いＣＩが記録されており、患者の血清中に含有される炎症促進性サイトカインが、内皮細胞層の完全性を損なうことを確認する。
【0243】
ＭＰＡ－Ｂｒによる処置後に、観察されたＣＩ損失の回復は、ＨＤ１ ＣＩと同等であった（図１０Ａ～Ｂ）。ビヒクル対照処置に対して正規化された総ＡＵＣの評価は、０．５～５ｎｇ／ｍＬ ＡＶ－００１用量の両方による処置が、ＣＩの統計的に有意な増加をもたらしたことを明らかにした（図１０Ｄ～Ｅ）。ＣＯＶＩＤ－１９患者試料ＩｇＭは、患者試料ＩｇＧ８およびＩｇＭ６と比較して、より低いＣＩ損失を有した（図１０Ａ～Ｃ）が、ＡＵＣが、ビヒクル対照に対して正規化された場合、０．５～５ｎｇ／ｍＬ ＭＰＡ－Ｂｒによる処置後に、正規化ＣＩの統計的に有意な増加が観察された（図１０Ｄ～Ｆ）。特に、ＩＬ１ｂ、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン－１およびアンジオポエチン－２に関して、ＨＤ１において測定されたレベルの比として提示された場合の、ＨＤ１およびＣＯＶＩＤ－１９血清試料において定量化されたサイトカインレベル（下の表１）は、全３種のＣＯＶＩＤ－１９血清が、ＨＤ１と比較して、より高いレベルの炎症促進性サイトカインを含有したことを指し示す。重要なことに、患者ＩｇＧ８およびＩｇＭ６と比較した、患者ＩｇＭ５のサイトカインプロファイルの差は、高レベルのＩＬ１ｂ、ＴＮＦ－ａ、ＭＣＰ－１およびＩＬ－６が、より大きい細胞損傷の誘導において有意な役割を果たし得ることを指し示す。
表１
表１：上述の材料および方法に指し示される通りに、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒト炎症および血管新生パネルを使用して、ＣＯＶＩＤ－１９患者（ＩｇＧ８、ＩｇＭ５およびＩｇＭ６）および健康なドナー（ＨＤ１）における血清分析物を定量化した。データは、ＣＯＶＩＤ患者における分析物濃度の、ＨＤ１における濃度に対する比として提示されている。
表１
【表1-1】
【表1-2】
【0244】
患者試料ＨＤ１に関して、高用量（５ｎｇ／ｍＬ）のＭＰＡ－Ｂｒによる処置は、ビヒクル対照処置に対して正規化された総ＡＵＣによって評価された場合に、正規化細胞インピーダンス（ＣＩ）の統計的に有意な増加をもたらしたが、より低い用量（０．５ｎｇ／ｍＬ）ではそのようにはならなかった（図１０Ｄ～Ｇ）。
【0245】
補体タンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９患者試料ＨＤ１由来の血清によるＣＩ改善についての説明をもたらす、細胞完全性に影響する潜在力を有するため、これらの実験において使用された患者血清は、非活性化されなかった。
【0246】
ＨＤ１またはＣＯＶＩＤ－１９患者（ＩｇＧ８、ＩｇＭ５およびＩｇＭ６）由来の血清とのインキュベーション後の細胞インピーダンス（透過性）に対するＭＰＡ－Ｂｒの効果はまた、血清＋ＡＶ－００１と共にインキュベートされた細胞および血清＋ビヒクル対照と共にインキュベートされた細胞との間の細胞指数の差を計算することにより評価した。ＨＤと比較したＣＯＶＩＤ－１９血清と共にインキュベートされた全細胞についての有意差を得た（図１１）。
【0247】
全体的に見て、データは、ＭＰＡ－Ｂｒが、ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の血清中に含有される炎症促進性サイトカインによって誘発される内皮細胞不安定化を阻害する潜在力を有することを指し示す。
【0248】
本開示を、実施例であると現在考慮されているものを参照しつつ記載してきたが、本開示が、開示されている実施例に限定されないことを理解されたい。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な修正および均等な配置を網羅することが意図される。
【0249】
あらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、その全体が参照により組み込まれていると特にかつ個々に指し示されているのと同じ程度まで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0250】
参考文献
【化18】
【化19】
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【配列表】