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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-06
(45)【発行日】2023-09-14
(54)【発明の名称】前立腺癌の骨転移遺伝子抽出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20230907BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230907BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230907BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230907BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
G01N33/53 M
G01N33/574 Z
C12N15/12
G01N33/50 P
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2018198404
(22)【出願日】2018-10-22
(65)【公開番号】P2020065453
(43)【公開日】2020-04-30
【審査請求日】2021-10-06
(73)【特許権者】
【識別番号】517332720
【氏名又は名称】株式会社プラスパブレインズ
(73)【特許権者】
【識別番号】518374284
【氏名又は名称】今井 祐記
(74)【代理人】
【識別番号】110000567
【氏名又は名称】弁理士法人サトー
(72)【発明者】
【氏名】今井 祐記
(72)【発明者】
【氏名】雑賀 隆史
(72)【発明者】
【氏名】菊川 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】沢田 雄一郎
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】Journal of Cellular Physiology，2005年，Vol.202，p.361-370
【文献】医学検査，2018年01月25日，Vol.67, No.1，p.131-141
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８２７
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
前立腺癌組織から全ＲＮＡを抽出する工程と、抽出した前記全ＲＮＡに、骨転移の原因となる遺伝子である特定遺伝子としてＧＰＲＣ５Ａが含まれるか否かを判断する工程と、
を含む前立腺癌の骨転移遺伝子抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前立腺癌の骨転移遺伝子抽出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
前立腺癌は、世界的にみて、非常に発症頻度の高い疾患である。前立腺癌は、早期診断、早期治療により高い確率で根治が見込める癌腫であるものの、治療抵抗性前立腺癌や進行性前立腺癌は、リンパ節転移や内臓転移を起こし、予後の悪化や、疼痛や骨折、麻痺などによるＱＯＬ（Quality Of Life）の低下を招くこととなる。
【0003】
局所浸潤前立腺癌や進行前立腺癌の治療戦略としてアンドロゲン除去療法は、重要な位置づけにある。一方、アンドロゲン除去療法の問題点は、治療経過とともにアンドロゲン非依存的な腫瘍増殖機構により治療抵抗性となることにある（去勢抵抗性前立腺癌）。ホルモン療法は、前立腺癌症例の９０％以上に極めて有効である反面、数年後には多くの症例でＰＳＡ（Prostate Specific Antigen）の上昇を伴って病状が悪化する去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）へ移行していく。現在のところ、ＣＲＰＣの発生機序として提唱されているは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の増幅、ＡＲ遺伝子の突然変異体、ＡＲの共役因子の活性化、リガンド非依存性のＡＲのリン酸化、そしてＡＲを介さない増殖シグナル伝達の活性化等である。現在、去勢抵抗性前立腺癌に対して、ドセタキセルやカバジタキセルを用いた化学療法、アビラテロンやエンザルタミドといった新規抗アンドロゲン薬など様々な薬剤が選択肢となりうるようになっているが、その使用方法や薬剤選択には未だコンセンサスは得られていない。また、ＡＲＶ７のようなＡＲ変異症例のエンザルタミドとアビラテロンに対する抵抗性が指摘されているように、その治療選択肢はまだ十分とは言えないのが現状である。
【0004】
そこで、ＣＲＰＣや高悪性度の前立腺癌の生物学的特徴に着目し、そのうえでＡＲを介さない増殖シグナルへのアプローチが新たな治療戦略の一つとして注目されている。ＡＲを介さない増殖シグナルの活性化に関しては、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）とその受容体（ＥＧＲ－Ｒ）が前立腺癌組織に存在し、発現量が生存率と相関するという報告がある。さらに、他の成長因子の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）やインスリン様成長因子（ＩＧＦ）なども前立腺癌の進行に関係すると報告されている。また、様々なサイトカインも前立腺癌の進行にとって重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
そこで、前立腺癌からの骨転移を早期に発見する前立腺癌の骨転移遺伝子抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、全遺伝子から前立腺癌特異的な新規の治療ターゲットの抽出を試みた。代表的な前立腺癌細胞株には、PC3、DU145、及びLNCaPがある。しかし、これらは、細胞株の由来やアンドロゲンに対する反応性、ＡＲの発現、前立腺特異抗原の発現に違いがみられる。本発明者らは、既存の前立腺癌細胞株のアンドロゲン依存性の有無という違いに着目した。臨床的にアンドロゲン非依存的な増殖を来す前立腺癌の予後が悪いことから、この違いを比較することで高悪性度の前立腺癌に特異的に発現している分子を抽出できるものと考えた。既存のビッグデータの解析から、アンドロゲン感受性の違いを踏まえ、前立腺癌特異的な癌進展を担う候補分子を抽出し、ＣＲＰＣに対する新規の治療標的や骨転移等のマーカー遺伝子としての有用性を見出し、骨転移の早期発見や重点的フォローアップの対象の絞り込みなどへの応用につなげることができる。
【0007】
前立腺癌の代表的細胞株には、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞株としてLNCaP、アンドロゲン非依存性で悪性度の高い細胞株としてPC3及びDU145が扱われる。そのため、代表的前立腺癌細胞株のマイクロアレイデータをＮＣＢＩの提供するＧＥＯ（Gene expression omnibus）より入手して（PC3:ｎ＝９、DU145:ｎ＝６、LNCaP:ｎ＝３３のアレイデータセットサプリ；図１参照）、LNCaPと比較し、PC3及びDU145におけるOrphan ＧＰＣＲ遺伝子の発現のHeatmapを作成した（図１）。特に、ＧＰＣＲ Ｃｌａｓｓ ＣのOrphan ＧＰＣＲに着目した結果、ＧＰＲＣ５Ａは、図１及び図２に示すようにPC3、DU145に共通して発現がLNCaPに対してLog2FCで５倍上昇していることがわかった。そこで、PC3、DU145、LNCaPにおけるＧＰＲＣ５Ａの発現を、validation解析したところ、LNCaPと比較して、図３に示すようにPC3、DU145で有意に発現が高いことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】本実施形態で用いる代表的前立腺癌細胞株のマイクロアレイデータを示す概略図
【図2】本実施形態で用いる代表的前立腺癌細胞株のマイクロアレイデータを示す概略図
【図3】本実施形態においてPC3、DU145、LNCaPにおけるＧＰＲＣ５Ａの発現をvalidation解析した結果を示す概略図
【図4】本実施形態において、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞増殖の抑制を示す概略図
【図5】本実施形態において、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞増殖の抑制を示す概略図
【図6】本実施形態において、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞浸潤能を示す概略図
【図7】本実施形態において、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞浸潤能を示す概略図
【図8】本実施形態において、ＧＰＲＣ５Ａによる遊走能の抑制を示す概略図
【図9】本実施形態において、マウスにおける腫瘍細胞の生着を示す図
【図10】本実施形態において、マウスにおける腫瘍外観の写真を示す図
【図11】本実施形態において、マウスにおける腫瘍重量を示す概略図
【図12】本実施形態において、腫瘍細胞の増殖の写真を示す図
【図13】本実施形態において、腫瘍細胞の蛍光免疫染色を示す図
【図14】本実施形態において、腫瘍細胞におけるKi67陽性細胞の割合を示す概略図
【図15】骨転移症例の前立腺癌組織におけるＧＰＲＣ５Ａ発現の上昇を示す概略図
【図16】本実施形態において、マウスにおける腫瘍細胞の生着の写真を示す図
【図17】本実施形態において、腫瘍細胞の生着を示す概略図
【図18】本実施形態において、マウスにおける骨破壊像の写真を示す図
【図19】本実施形態において、骨密度を示す概略図
【図20】本実施形態において、骨髄腔における骨破壊像の写真を示す図
【図21】ＲＮＡシークエンスにより変動が認められた遺伝子をVolcanoプロットした概略図
【図22】変動が認められた遺伝子群のＤＡＶＩＤによるＧＯ解析を示す概略図
【図23】ＧＳＥＡによる解析結果を示す概略図
【図24】ＧＯ解析で上位にenrichされたgene setについて、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトとの相関を示す概略図
【図25】定量的RT-PCR解析を示す概略図
【図26】各細胞周期におけるＣＣＮ、ＣＤＫの発現時期とＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる発現変動との関係を示す概略図
【図27】各細胞周期におけるＣＣＮ、ＣＤＫの発現時期とＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる発現変動との関係を示す概略図
【図28】本実施形態において、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、ＣＲＥＢのリン酸化が亢進することを示す概略図
【図29】本実施形態において、ＧＰＲＣ５ＡがＣＲＥＢのリン酸化に抑制的に作用することを示す概略図
【図30】本実施形態において、ＧＰＲＣ５ＡがＣＲＥＢのリン酸化に抑制的に作用することを示す概略図
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、前立腺癌の骨転移判定方法の一実施形態を説明する。
（ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる前立腺癌細胞の細胞増殖、細胞遊走の抑制）
ＧＰＲＣ５Ａが前立腺癌の進展に及ぼす影響を確かめるために、図２及び図３に示すようにPC3-Luc及びDU145において、CRISPR/Cas9によるゲノム編集でＧＰＲＣ５Ａをノックアウト（ＫＯ）した。その結果、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、図４及び図５に示すように細胞増殖の抑制が認められた。このことから、ＧＰＲＣ５Ａは、高悪性度前立腺癌においては増殖を正に制御していることが分かった。一方、細胞浸潤能は、図６及び図７に示すように有意な変化が認められず、ＧＰＲＣ５ＡノックアウトによりFibronectinに対する接着能は上昇した。また、図８に示すように、ＧＰＲＣ５Ａ遊走能の抑制が認められた。このことから、ＧＰＲＣ５Ａは、細胞遊走を正に制御していることが分かる。
（ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる前立腺癌細胞の細胞増殖、細胞遊走の抑制）
ＧＰＲＣ５Ａが前立腺癌の進展に及ぼす影響を確かめるために、図２及び図３に示すようにPC3-Luc及びDU145において、CRISPR/Cas9によるゲノム編集でＧＰＲＣ５Ａをノックアウト（ＫＯ）した。その結果、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、図４及び図５に示すように細胞増殖の抑制が認められた。このことから、ＧＰＲＣ５Ａは、高悪性度前立腺癌においては増殖を正に制御していることが分かった。一方、細胞浸潤能は、図６及び図７に示すように有意な変化が認められず、ＧＰＲＣ５ＡノックアウトによりFibronectinに対する接着能は上昇した。また、図８に示すように、ＧＰＲＣ５Ａ遊走能の抑制が認められた。このことから、ＧＰＲＣ５Ａは、細胞遊走を正に制御していることが分かる。
【0010】
In vitroにおいてＧＰＲＣ５Ａが高悪性度前立腺癌細胞の細胞増殖を制御していることを受け、次にin vivoにおける腫瘍増殖を確認した。WTPC3-Luc細胞とＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Lucをマトリゲルに溶解し、ヌードマウスの皮下に移植した。In vivo bioluminescence imagingにて腫瘍細胞の生着及び増大を確認したところ、図９に示すようにいずれの群においても腫瘍細胞の生着を認めるものの、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより増大が抑制された。輝度の定量においても、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、有意にその抑制が認められた。腫瘍外観については、図１０に示すようにＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc群は、顕著に腫瘍増大が抑制されていた。腫瘍重量による定量においても、図１１に示すように主要増殖は有意に抑制されていた。組織学的解析では、Control群では、PC3-Luc細胞が均質に増殖している。これに対して、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト群では、図１２に示すように器質化したマトリゲルが大部分を占め、腫瘍細胞の増殖はわずかであった。そこで、ＧＰＲＣ５ＡノックアウトによるPC3-Luc細胞の増殖マーカーの変化を評価するため、図１３に示すようにLuciferaseとKi67の蛍光免疫染色を行った。その結果、腫瘍細胞におけるKi67陽性細胞の割合は、図１４に示すようにＧＰＲＣ５Ａノックアウト群において抑制されていた。これらの結果から、ＧＰＲＣ５Ａは、in vivoにおいて、高悪性度前立腺癌細胞増殖を正に制御していることがわかる。
【0011】
（ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる前立腺癌骨転移の成立の抑制）
高悪性度前立腺癌やＣＲＰＣは、高頻度に骨転移を来し、予後の悪化を来す。このことから、臨床サンプルを用いた遺伝子発現データベース（Oncomine: https://www.oncomine.org）及びＧＥＯから、ＣＲＰＣかつ骨転移を認める前立腺癌患者の原発巣でのマイクロアレイデータを解析した（Tamura et al （15）. GSE6811, 骨転移あり:ｎ＝３、骨転移なし:ｎ＝１０）。これによると、骨転移症例の前立腺癌組織では、図１５に示すようにＧＰＲＣ５Ａの発現が上昇していることがわかった。このことから、ＧＰＲＣ５Ａは、骨転移の成立にも関与している可能性が示唆された。
高悪性度前立腺癌やＣＲＰＣは、高頻度に骨転移を来し、予後の悪化を来す。このことから、臨床サンプルを用いた遺伝子発現データベース（Oncomine: https://www.oncomine.org）及びＧＥＯから、ＣＲＰＣかつ骨転移を認める前立腺癌患者の原発巣でのマイクロアレイデータを解析した（Tamura et al （15）. GSE6811, 骨転移あり:ｎ＝３、骨転移なし:ｎ＝１０）。これによると、骨転移症例の前立腺癌組織では、図１５に示すようにＧＰＲＣ５Ａの発現が上昇していることがわかった。このことから、ＧＰＲＣ５Ａは、骨転移の成立にも関与している可能性が示唆された。
【0012】
そこで、ＧＰＲＣ５Ａが前立腺癌骨転移の成立に及ぼす影響を確かめるために、ＧＰＲＣ５ＡをノックアウトしたPC3-Luc細胞を、図１６に示すようにヌードマウスの脛骨にXenograftし、in vivo bioluminescence imagingにて腫瘍細胞の生着及び増大を確認した。その結果、ＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc群は、図１６及び図１７に示すように顕著に骨転移の成立が抑制された。その程度の強さは、皮下と比べて圧倒的な差がある。マイクロＣＴによる骨形態計測では、Control群では骨転移巣の増大による顕著な骨破壊像が認められた。これに対し、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト群の場合、図１８に示すように骨形態はintact群と同様なまでにその形態を保っていた。骨密度で骨破壊の程度を定量したところ、図１９に示すようにControl群ではintact群に比し、骨密度が有意に減少し、骨破壊を反映している。これに対し、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト群では、骨密度はintact群と同レベルに保たれており、腫瘍細胞の生着及び増大が強く抑制されていることが示された。ＨＥ染色による組織学的評価を行なったところ、Control群では骨髄腔に溶骨性の骨破壊像が認められた。また、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト群では、図２０に示すように腫瘍細胞の生着や骨破壊像は確認されず、骨形態はintact群と同レベルに保たれていた。さらに、ＴＲＡＰ染色を行なったところ、Control群では腫瘍細胞に接して破骨細胞増加が認められた。これに対し、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト群では、図２０に示すように破骨細胞の局在や密度は、intact群と同レベルに保たれていた。皮下へのXenograftにおいてはＧＰＲＣ５Ａノックアウト群において、増殖は抑制されたのに対し、腫瘍の生着そのものは認められていた。これらのことから、ＧＰＲＣ５Ａは、増殖の抑制のみならず、骨転移の成立そのものを抑制していると考えられる。
【0013】
（ＧＰＲＣ５Ａによる前立腺癌細胞における細胞周期関連遺伝子の発現の調節）
これまでの結果から、ＧＰＲＣ５Ａは、前立腺癌の腫瘍細胞の増殖制御及び骨転移制御因子の一つであることが見出された。
この詳細な分子メカニズムを解明するため、Wild Type PC3LucとＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3LucのＲＮＡシークエンスを行った。ＲＮＡシークエンスにより変動が認められた遺伝子をVolcanoプロットしたところ、図２１に示すようにＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより５１１の遺伝子群は有意にupregulateされており、４４３の遺伝子群は有意にdownregulateされていた。変動が認められた遺伝子群のＤＡＶＩＤによるＧＯ解析では、図２２に示すようにupregulateされている遺伝子群は、細胞周期関連遺伝子や、細胞分裂関連遺伝子として上位に分類された。これに対し、Downregulateされていた遺伝子群は、細胞増殖との強い関連は見出されなかった（サプリ）。また、多様な解析を行うためＧＳＥＡによる解析も行った。その結果、図２３に示すようにＮＥＳ＞１．５で１６のgene setがenrichされ、そのうち、８のgene setが細胞周期に関連するものであった。さらに、ＧＳＥＡのＧＯ解析で上位にenrichされたgene setについて、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトとの相関を検証したところ、図２４に示すようにこれらはＧＰＲＣ５Ａノックアウトと高い相関が認められた。このことから、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞増殖能の低下は、細胞周期及び細胞分裂の変化によるものと考えられる。ＧＰＲＣ５Ａは、細胞周期関連遺伝子の発現に抑制的に関与していることが考えられる。そのため、ＣＣＮやＣＤＫといった細胞周期関連遺伝子の発現を調べた。定量的RT-PCRによる解析ではＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、ＣＣＮＡやＣＣＮＢ群、及びＣＣＮＡやＢと共役的に働くＣＤＫ１の発現が上昇していた。一方、図２５に示すようにＣＣＮＤ１の発現は抑制されていた。
これまでの結果から、ＧＰＲＣ５Ａは、前立腺癌の腫瘍細胞の増殖制御及び骨転移制御因子の一つであることが見出された。
この詳細な分子メカニズムを解明するため、Wild Type PC3LucとＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3LucのＲＮＡシークエンスを行った。ＲＮＡシークエンスにより変動が認められた遺伝子をVolcanoプロットしたところ、図２１に示すようにＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより５１１の遺伝子群は有意にupregulateされており、４４３の遺伝子群は有意にdownregulateされていた。変動が認められた遺伝子群のＤＡＶＩＤによるＧＯ解析では、図２２に示すようにupregulateされている遺伝子群は、細胞周期関連遺伝子や、細胞分裂関連遺伝子として上位に分類された。これに対し、Downregulateされていた遺伝子群は、細胞増殖との強い関連は見出されなかった（サプリ）。また、多様な解析を行うためＧＳＥＡによる解析も行った。その結果、図２３に示すようにＮＥＳ＞１．５で１６のgene setがenrichされ、そのうち、８のgene setが細胞周期に関連するものであった。さらに、ＧＳＥＡのＧＯ解析で上位にenrichされたgene setについて、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトとの相関を検証したところ、図２４に示すようにこれらはＧＰＲＣ５Ａノックアウトと高い相関が認められた。このことから、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞増殖能の低下は、細胞周期及び細胞分裂の変化によるものと考えられる。ＧＰＲＣ５Ａは、細胞周期関連遺伝子の発現に抑制的に関与していることが考えられる。そのため、ＣＣＮやＣＤＫといった細胞周期関連遺伝子の発現を調べた。定量的RT-PCRによる解析ではＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、ＣＣＮＡやＣＣＮＢ群、及びＣＣＮＡやＢと共役的に働くＣＤＫ１の発現が上昇していた。一方、図２５に示すようにＣＣＮＤ１の発現は抑制されていた。
【0014】
各細胞周期におけるＣＣＮ、ＣＤＫの発現時期とＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる発現変動とをまとめると、図２６及び図２７に示すようにＧ２／Ｍ期に発現する細胞周期関連遺伝子の上昇、及びＧ１期に発現する細胞周期関連遺伝子の抑制が認められた。そこで、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトが細胞周期に実際に影響しているかをフローサイトメトリーにて確認した。これによると、Control群に対し、Ｇ２／Ｍ期の割合は増加し、Ｇ１期の割合は低下していた。これはＧ２／Ｍ期からＧ１期への移行が障害されている状態であると考えられる。以上から、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによる細胞増殖の抑制は、細胞周期関連遺伝子の発現サイクルの協調不全によりもたらされたものであると考えられる。
【0015】
（ＧＰＲＣ５ＡによるＣＲＥＢのリン酸化の抑制、細胞増殖及び骨転移の成立の制御）
ＧＰＣＲには、代表的にＧｓα、Ｇｉαなどのクラスがある。これら、Ｇｓα、Ｇｉαのシグナル伝達は、ｃＡＭＰ依存的なシグナルがＣＲＥＢのリン酸化で調節されている。そこで、ＧＰＲＣ５ＡがＣＣＮやＣＤＫなどの細胞周期関連遺伝子の遺伝子発現をどのように調節しているかを確認するため、ＣＲＥＢのリン酸化を確認した。これによると、図２８に示すようにＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、ＣＲＥＢのリン酸化は亢進していることが分かった。このことから、PC3においてはＣＲＥＢのリン酸化により、細胞増殖は抑制されることが示唆された。そこで、PC3-Luc細胞においてForskolinでＣＲＥＢのリン酸化を惹起し、PC3の細胞増殖を評価した。その結果、図２９及び図３０に示すようにForskolin 30μM添加後、ＣＲＥＢのリン酸化の亢進をＷＢにより確認するとともに、ＢｒｄＵにより細胞増殖能を確認した。これによると、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト時と同様に、増殖能の抑制が認められた。以上のことから、高悪性度前立腺癌細胞において、ＧＰＲＣ５Ａは、ＣＲＥＢのリン酸化に抑制的に作用しており、細胞周期調節や骨転移に関わる遺伝子の転写調節を行い、細胞増殖や骨転移の成立に関与していると考えられる。
ＧＰＣＲには、代表的にＧｓα、Ｇｉαなどのクラスがある。これら、Ｇｓα、Ｇｉαのシグナル伝達は、ｃＡＭＰ依存的なシグナルがＣＲＥＢのリン酸化で調節されている。そこで、ＧＰＲＣ５ＡがＣＣＮやＣＤＫなどの細胞周期関連遺伝子の遺伝子発現をどのように調節しているかを確認するため、ＣＲＥＢのリン酸化を確認した。これによると、図２８に示すようにＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、ＣＲＥＢのリン酸化は亢進していることが分かった。このことから、PC3においてはＣＲＥＢのリン酸化により、細胞増殖は抑制されることが示唆された。そこで、PC3-Luc細胞においてForskolinでＣＲＥＢのリン酸化を惹起し、PC3の細胞増殖を評価した。その結果、図２９及び図３０に示すようにForskolin 30μM添加後、ＣＲＥＢのリン酸化の亢進をＷＢにより確認するとともに、ＢｒｄＵにより細胞増殖能を確認した。これによると、ＧＰＲＣ５Ａノックアウト時と同様に、増殖能の抑制が認められた。以上のことから、高悪性度前立腺癌細胞において、ＧＰＲＣ５Ａは、ＣＲＥＢのリン酸化に抑制的に作用しており、細胞周期調節や骨転移に関わる遺伝子の転写調節を行い、細胞増殖や骨転移の成立に関与していると考えられる。
【0016】
（考察）
前立腺癌の主な進展・増殖機構は、ＡＲを介した増殖シグナルの活性であるものの、ＡＲを介さない増殖シグナルの活性経路も存在する。ＡＲを介さないシグナル活性経路は、前立腺癌の進行、ＣＲＰＣへの変化において、種々の成長因子やサイトカイン、ｍｉＲＮＡやエピジェネティクス制御が関与することが報告されている。そして、ＡＲを介さないシグナル活性経路は、新たな治療標的となる可能性が追及されている。そのシグナル活性において、ＧＰＣＲ、とりわけOrphan ＧＰＣＲが治療標的として大きなポテンシャルを秘めている。本発明者らは、前立腺癌の代表的細胞株の性質の違いと治療標的として大いなる可能性を秘めているＧＰＣＲ Orphan groupとに着目したビッグデータ解析により、新たに前立腺癌特異的な癌進展及び骨転移制御機構を担う候補分子であるＧＰＲＣ５Ａを抽出することができた。
前立腺癌の主な進展・増殖機構は、ＡＲを介した増殖シグナルの活性であるものの、ＡＲを介さない増殖シグナルの活性経路も存在する。ＡＲを介さないシグナル活性経路は、前立腺癌の進行、ＣＲＰＣへの変化において、種々の成長因子やサイトカイン、ｍｉＲＮＡやエピジェネティクス制御が関与することが報告されている。そして、ＡＲを介さないシグナル活性経路は、新たな治療標的となる可能性が追及されている。そのシグナル活性において、ＧＰＣＲ、とりわけOrphan ＧＰＣＲが治療標的として大きなポテンシャルを秘めている。本発明者らは、前立腺癌の代表的細胞株の性質の違いと治療標的として大いなる可能性を秘めているＧＰＣＲ Orphan groupとに着目したビッグデータ解析により、新たに前立腺癌特異的な癌進展及び骨転移制御機構を担う候補分子であるＧＰＲＣ５Ａを抽出することができた。
【0017】
ＧＰＲＣ５Ａは、ＧＰＣＲ family C class IVに分類される。ＧＰＣＲ family C class IVは、レチノイン酸刺激により誘導され、胚発達、分化、腫瘍形成、上皮の恒常性の維持に働いていると考えられている。ＧＰＲＣ５Ａは、肺組織の恒常性の維持に働いており、肺上皮細胞に多く分布している。肺癌においては、ＥＧＦＲシグナルのnegative modulatorとして肺癌に抑制的に働いていると報告されている。一方、膵臓癌や大腸癌や乳癌、骨髄異形成症候群等において、発現が上昇しているという報告もあり、癌腫や組織型により発現は異なっている。前立腺癌においては発現が上昇しているという報告はあるものの、分子機構を詳細に解析した報告はない。今回、本発明者らは、前立腺癌の進展と、ＧＰＲＣ５Ａとの関連を検証した。
【0018】
ＧＰＣＲの代表的なシグナルカスケードには、ｃＡＭＰ依存性経路（アデニリルシクラーゼ経路）があり、細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たす。その機構は、膜受容体に結合したＧタンパク質によってアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が活性化される。そして、このＡＣにより、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、ピロリン酸及び3',5'-サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へ変換される。ｃＡＭＰは、環状ヌクレオチド依存性イオンチャネル及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のような他のタンパク質と相互作用するか、又は直接的に調節することによってセカンドメッセンジャーとして作用する。ｃＡＭＰにより、ＰＫＡは活性化され、ＰＫＡ触媒サブユニットが核に移行し、転写因子ＣＲＥＢをリン酸化する。リン酸化されたＣＲＥＢは、小アクチベーターCBP/P300と結合し、転写調節因子ＣＲＥによって標的遺伝子の発現を促す。ＣＲＥＢの標的遺伝子としては、転写因子、代謝調節遺伝子、細胞周期制御遺伝子、分泌制御遺伝子などが報告されている。ｃＡＭＰ依存性経路の機能不全は、腫瘍の発生及び進行、抗癌剤耐性に寄与することが報告されている。
【0019】
本実施形態では、ＧＰＲＣ５ＡがＣＲＥＢのリン酸化を介した経路において、細胞周期関連遺伝子の発現を調節し、細胞増殖を制御していることを示している。ＧＰＲＣ５Ａノックアウトによって、ＣＲＥＢのリン酸化が亢進したことから、ＧＰＲＣ５Ａは阻害性Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇｉα）であると考えられる。ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、一部のＣＣＮやＣＤＫといった細胞周期関連遺伝子の上昇を来していたにも関わらず、細胞増殖は抑制された。正常な細胞周期は、ＣＣＮやＣＤＫが規則的に発現上昇及び低下することで維持されており、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトにより、細胞周期関連遺伝子の発現の規則性が損なわれ、増殖能の低下を来したものと考えられる。ＣＲＥＢのリン酸化を促進する物質としてForskolinが知られている。そのため、前立腺癌細胞株においてForskolin添加によりＣＲＥＢのリン酸化を惹起したところ、ＧＰＲＣ５Ａノックアウトと同様にその増殖が抑制された。このことから、ｃＡＭＰ依存性経路は、前立腺癌細胞の増殖に抑制的に関与していることが示唆された。
【0020】
前立腺癌細胞において、ＧＰＲＣ５Ａは、ＣＲＥＢのリン酸化を抑制し、細胞周期関連遺伝子の発現を制御し、他の癌腫と同様に細胞増殖や細胞遊走、細胞接着などの腫瘍進展に関わっていると考えられる。また、詳細な分子機構は不明であるものの、ＧＰＲＣ５Ａは骨転移の成立にも関与していることも明らかである。腫瘍抑制因子であるｐ５３は、ＧＰＲＣ５Ａの発現を抑制するという報告がある。ｐ５３は、骨芽細胞の分化、及び骨芽細胞依存性の破骨細胞の分化を制御することが知られており、これらの分子機構が骨転移の成立にも関与していると想定される。しかし、問題点として、ヒト前立腺癌における骨転移は、造骨性骨転移であることが多い。これに対し、本実施形態で用いている前立腺癌細胞株は、溶骨性の骨転移巣を形成する点で相違がある。また、別の問題点として、ヒト前立腺癌の主要な骨転移成立経路は、血行性転移が想定される。これに対し、本実施形態では脛骨骨髄腔に、直接、腫瘍細胞を播種する点で非生理的であることが挙げられる。これらの問題点は、今後、造骨性骨転移を成立させうる細胞株を使用すること、血行性転移モデルによる骨転移の評価が必要であると考えられる。
【0021】
ＧＰＲＣ５Ａは、骨をはじめとした転移症例の前立腺癌原発組織において高発現し、予後との相関も認められることから、新規の予後予測マーカーとして期待できる分子であると考えられる。また、前立腺癌に対するアンドロゲン除去療法中の去勢抵抗性前立腺癌への進展は、前立腺癌の治療において最も重要な課題の一つである。ＧＰＲＣ５ＡとＣＲＰＣへの発展が相関している可能性もある。
【0022】
（実施例）
・遺伝子発現マイクロアレイ解析
前立腺癌におけるＧＰＣＲ Orphan receptorの発現を調べるために、既存のビックデータから遺伝子発現解析を行った。未処理の前立腺癌細胞株PC3、DU145及びLNCaPのマイクロアレイ生データは、ＧＥＯ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）よりダウンロードした。生データは、The Comprehensive R Archive Networkが提供する解析ソフトであるＲ（https://cran.r-project.org/）を使用し、ＲＭＡ（Irizarry et al. , 2003）を用いて正規化し、遺伝子発現を比較した。 臨床前立腺癌サンプルマイクロアレイの生データは、Oncomine（https://www.oncomine.org/）により非転移症例サンプルと有骨転移、かつＣＲＰＣ症例サンプルのマイクロアレイ解析を行った報告を検索し、解析した（Tamuraら、2007）。これらの臨床サンプルデータは、ＧＥＲ２Ｒ分析ツールによって、非転移症例と、有骨転移かつＣＲＰＣ症例におけるＧＰＲＣ５Ａの発現とを比較した。
・遺伝子発現マイクロアレイ解析
前立腺癌におけるＧＰＣＲ Orphan receptorの発現を調べるために、既存のビックデータから遺伝子発現解析を行った。未処理の前立腺癌細胞株PC3、DU145及びLNCaPのマイクロアレイ生データは、ＧＥＯ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）よりダウンロードした。生データは、The Comprehensive R Archive Networkが提供する解析ソフトであるＲ（https://cran.r-project.org/）を使用し、ＲＭＡ（Irizarry et al. , 2003）を用いて正規化し、遺伝子発現を比較した。 臨床前立腺癌サンプルマイクロアレイの生データは、Oncomine（https://www.oncomine.org/）により非転移症例サンプルと有骨転移、かつＣＲＰＣ症例サンプルのマイクロアレイ解析を行った報告を検索し、解析した（Tamuraら、2007）。これらの臨床サンプルデータは、ＧＥＲ２Ｒ分析ツールによって、非転移症例と、有骨転移かつＣＲＰＣ症例におけるＧＰＲＣ５Ａの発現とを比較した。
【0023】
・細胞培養
PC3-Luc細胞株（JCRB細胞バンクより提供）は、７％ウシ胎仔血清及び抗生物質（カタログ番号15240062, Thermo Fisher Scientific）を添加したHam's F-12K培地（カタログ番号080-08565, Wako, Japan）中で培養した。DU145及びLNCaP細胞株は１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したRPMI-1640培地（カタログ番号187-02705, Wako, Japan）中で培養した。いずれの細胞も３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
PC3-Luc細胞株（JCRB細胞バンクより提供）は、７％ウシ胎仔血清及び抗生物質（カタログ番号15240062, Thermo Fisher Scientific）を添加したHam's F-12K培地（カタログ番号080-08565, Wako, Japan）中で培養した。DU145及びLNCaP細胞株は１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したRPMI-1640培地（カタログ番号187-02705, Wako, Japan）中で培養した。いずれの細胞も３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【0024】
・CRISPR / Cas9によるＧＰＲＣ５Ａのノックアウト
ＧＰＲＣ５Ａは、Guide-itTM CRISPR/Cas9 Systems（カタログ番号632601 Clontech Laboratories、Inc., California,USA）を用いてノックアウトした。 ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列及びシークエンス確認用のプライマーは、オンラインプログラムＣＨＯＰＣＨＯＰ（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/dev/）を用いて設計した。ｇＲＮＡを組み込んだベクターは、ScreenFect A（カタログ番号299-73203 Wako, Japan）によりマニュアルに従いPC3-Luc細胞及びDU145細胞にトランスフェクトし、BD FACSAria（Becton、Dickinson and Company）を用いてZsGreenをトランスフェクトのレポーターとして単一細胞に選別して培養した。
ＧＰＲＣ５Ａは、Guide-itTM CRISPR/Cas9 Systems（カタログ番号632601 Clontech Laboratories、Inc., California,USA）を用いてノックアウトした。 ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列及びシークエンス確認用のプライマーは、オンラインプログラムＣＨＯＰＣＨＯＰ（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/dev/）を用いて設計した。ｇＲＮＡを組み込んだベクターは、ScreenFect A（カタログ番号299-73203 Wako, Japan）によりマニュアルに従いPC3-Luc細胞及びDU145細胞にトランスフェクトし、BD FACSAria（Becton、Dickinson and Company）を用いてZsGreenをトランスフェクトのレポーターとして単一細胞に選別して培養した。
【0025】
・ＧＰＲＣ５Ａの過剰発現
pME18S II-Myc-CT -GPRC5Aの構築のために、PC3-Luc の相補的DNAから、5'-AAAAGCTGCGGAATTCCCTTGGCACTAGGGTCCAGA -3 '及び、5'- CGAGGTCGACAGATCTGCTGCCCTCTTTCTTTACTTC-3 'をプライマーとしＰＣＲを行い、ＧＰＲＣ５Ａプロモーター断片を作出した。In-Fusion HDクローニングキット（cat.no.639642, Takara Bio, USA）により、ＧＰＲＣ５Ａプロモーター断片をpME18S II-Myc-CTプラスミドに組み込んだ。このようにして作成したpME18S II-Myc-CT-GPRC5Aを、Lipofectamine 3000 Reagent（カタログ番号L3000015, Thermo Fisher Scientific）を用いてPC3-Lucにトランスフェクトし、ＧＰＲＣ５Ａを強制発現した。
pME18S II-Myc-CT -GPRC5Aの構築のために、PC3-Luc の相補的DNAから、5'-AAAAGCTGCGGAATTCCCTTGGCACTAGGGTCCAGA -3 '及び、5'- CGAGGTCGACAGATCTGCTGCCCTCTTTCTTTACTTC-3 'をプライマーとしＰＣＲを行い、ＧＰＲＣ５Ａプロモーター断片を作出した。In-Fusion HDクローニングキット（cat.no.639642, Takara Bio, USA）により、ＧＰＲＣ５Ａプロモーター断片をpME18S II-Myc-CTプラスミドに組み込んだ。このようにして作成したpME18S II-Myc-CT-GPRC5Aを、Lipofectamine 3000 Reagent（カタログ番号L3000015, Thermo Fisher Scientific）を用いてPC3-Lucにトランスフェクトし、ＧＰＲＣ５Ａを強制発現した。
【0026】
・リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ISOGEN（カタログ番号 319-90211 Nippongene, Japan）及びRNeasyスピンカラムキット（カタログ番号74106 Qiagen, USA）で処理し、続いてDNaseI（カタログ番号 79254 Qiagen, USA）で処理した。続いてPrimeScript RT Master Mix（カタログ番号 RR036A Takara Bio Inc., Japan）を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡより相補的ＤＮＡを合成した。Thermal Cycler Dice（Takara Bio Inc.）によりSYBR Premix Ex Taq II（カタログ番号 RR820S Takara Bio Inc., Japan）をプロトコールに従い使用し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。遺伝子発現レベルをＳＤＭ法によって定量し、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰＯの発現レベルで正規化した。
全ＲＮＡを、ISOGEN（カタログ番号 319-90211 Nippongene, Japan）及びRNeasyスピンカラムキット（カタログ番号74106 Qiagen, USA）で処理し、続いてDNaseI（カタログ番号 79254 Qiagen, USA）で処理した。続いてPrimeScript RT Master Mix（カタログ番号 RR036A Takara Bio Inc., Japan）を用いて５００ｎｇの全ＲＮＡより相補的ＤＮＡを合成した。Thermal Cycler Dice（Takara Bio Inc.）によりSYBR Premix Ex Taq II（カタログ番号 RR820S Takara Bio Inc., Japan）をプロトコールに従い使用し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。遺伝子発現レベルをＳＤＭ法によって定量し、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰＯの発現レベルで正規化した。
【0027】
・ＴＡクローニング
CRISPR/Cas9によるゲノム編集におけるｇＲＮＡの変異の確認は、ＴＡクローニングで行った。ＧＰＲＣ５ＡのｇＲＮＡ標的配列を挟むように、5'- CTTCCTCTTTGGGATCCTCTTT-3 '、及び5'- AGAAGAGGACGTAGGTGAGCAG-3'として設計した（上述のＣＨＯＰ－ＣＨＯＰにより設計）。上記のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、標的部位を含む約２６６ｂｐの断片をクローニングした。このＰＣＲ産物は、ＴＡ－Enhancerクローニングキット（カタログ番号316-08271、Nippongene, Japan）のプロトコールに従いにＴＡクローニング用のプラスミドにライゲーションした。続いて、そのプラスミドをE. col i DH5α Competent Cell（カタログ番号 9057 Takara Bio Inc., Japan）に形質転換した後、ＳＯＣ培地にて培養後、コロニーをFastGeneTM プラスミドミニキット（カタログ番号 FG-90502 NIPPON Genitics, Japan）にてプロトコールに従いミニプレップを行い、シークエンスを解析した。
CRISPR/Cas9によるゲノム編集におけるｇＲＮＡの変異の確認は、ＴＡクローニングで行った。ＧＰＲＣ５ＡのｇＲＮＡ標的配列を挟むように、5'- CTTCCTCTTTGGGATCCTCTTT-3 '、及び5'- AGAAGAGGACGTAGGTGAGCAG-3'として設計した（上述のＣＨＯＰ－ＣＨＯＰにより設計）。上記のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、標的部位を含む約２６６ｂｐの断片をクローニングした。このＰＣＲ産物は、ＴＡ－Enhancerクローニングキット（カタログ番号316-08271、Nippongene, Japan）のプロトコールに従いにＴＡクローニング用のプラスミドにライゲーションした。続いて、そのプラスミドをE. col i DH5α Competent Cell（カタログ番号 9057 Takara Bio Inc., Japan）に形質転換した後、ＳＯＣ培地にて培養後、コロニーをFastGeneTM プラスミドミニキット（カタログ番号 FG-90502 NIPPON Genitics, Japan）にてプロトコールに従いミニプレップを行い、シークエンスを解析した。
【0028】
・ウェスタンブロッティング
50ｍＭのトリス-ＨＣｌ（pH8.0）、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．５ｗ／ｖ％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％のドデシル硫酸ナトリウム、０．０ｗ／ｖ％の硫酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号 188-02453 Wako, Japan）に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号 11697498001 Roche, Germany）を添加し、細胞ペレットを溶解した。全細胞抽出物をSDS-PAGEによって分離し、iBlot（登録商標） Gel Transfer Device（カタログ番号 IB1001 invitrogen）、及びiBlot（登録商標） Gel Transfer Stacks,Mini（カタログ番号IB4010-02 invitrogen）をプロトコールに従い使用しＰＶＤＦ膜に移した。次に、一次抗体反応として抗ＧＰＲＣ５Ａ抗体（カタログ番号12968 Cell Signaling Technology Japan, Japan）、抗ＣＲＥＢ抗体（カタログ番号 D76D11 CST Japan, Japan）、phospho－ＣＲＥＢ抗体（カタログ番号 87G3 CST Japan, Japan）、及び抗β－アクチン抗体（カタログ番号 2F3 Wako, Japan）を使用した。抗ＧＰＲＣ５Ａ抗体及び抗ＡＣＴＢ抗体反応は、メンブレンを、Tween-20（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中の５％スキムミルクを用いて、室温で１時間ブロックした後、一次抗体を５％スキムミルクバッファーに１：１０００の割合で溶解し、４℃オーバーナイトで反応させた。抗ＣＲＥＢ抗体及び抗phospho－ＣＲＥＢ抗体反応は、ブロッキング及び抗体反応に５％ＢＳＡを使用した。一次抗体反応後、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ結合二次抗体（１：８０００, カタログ番号 P0161, P0448 Dako）を、室温で１時間反応させた。ＢＳＴで洗浄した後、Chemi-Lumi One Ultra（カタログ番号 11644-40 Nacalai Tesque, Japan）、及びImageQuant LAS 4000（GE Healthcare、USA）を用いてシグナルを検出した。
50ｍＭのトリス-ＨＣｌ（pH8.0）、１５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．５ｗ／ｖ％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％のドデシル硫酸ナトリウム、０．０ｗ／ｖ％の硫酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号 188-02453 Wako, Japan）に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号 11697498001 Roche, Germany）を添加し、細胞ペレットを溶解した。全細胞抽出物をSDS-PAGEによって分離し、iBlot（登録商標） Gel Transfer Device（カタログ番号 IB1001 invitrogen）、及びiBlot（登録商標） Gel Transfer Stacks,Mini（カタログ番号IB4010-02 invitrogen）をプロトコールに従い使用しＰＶＤＦ膜に移した。次に、一次抗体反応として抗ＧＰＲＣ５Ａ抗体（カタログ番号12968 Cell Signaling Technology Japan, Japan）、抗ＣＲＥＢ抗体（カタログ番号 D76D11 CST Japan, Japan）、phospho－ＣＲＥＢ抗体（カタログ番号 87G3 CST Japan, Japan）、及び抗β－アクチン抗体（カタログ番号 2F3 Wako, Japan）を使用した。抗ＧＰＲＣ５Ａ抗体及び抗ＡＣＴＢ抗体反応は、メンブレンを、Tween-20（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中の５％スキムミルクを用いて、室温で１時間ブロックした後、一次抗体を５％スキムミルクバッファーに１：１０００の割合で溶解し、４℃オーバーナイトで反応させた。抗ＣＲＥＢ抗体及び抗phospho－ＣＲＥＢ抗体反応は、ブロッキング及び抗体反応に５％ＢＳＡを使用した。一次抗体反応後、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ結合二次抗体（１：８０００, カタログ番号 P0161, P0448 Dako）を、室温で１時間反応させた。ＢＳＴで洗浄した後、Chemi-Lumi One Ultra（カタログ番号 11644-40 Nacalai Tesque, Japan）、及びImageQuant LAS 4000（GE Healthcare、USA）を用いてシグナルを検出した。
【0029】
・細胞増殖アッセイ
これは、９６ウェルプレートに、細胞を１．０×１０４個／well播種し、経時的にＭＴＴ細胞数測定キット（カタログ番号 23506-80 Nacalai Tesque, Japan）をプロトコールに従って使用し、５７０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みアッセイ（カタログ番号 11647229001 Roche, Germany）を、プロトコールに従い使用した。３７０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
これは、９６ウェルプレートに、細胞を１．０×１０４個／well播種し、経時的にＭＴＴ細胞数測定キット（カタログ番号 23506-80 Nacalai Tesque, Japan）をプロトコールに従って使用し、５７０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みアッセイ（カタログ番号 11647229001 Roche, Germany）を、プロトコールに従い使用した。３７０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【0030】
・細胞遊走アッセイ
これは、親株PC3-Luc細胞及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を、１００％コンフルエンスの密度で、６ウェルプレートに播種した。１％ＦＢＳ含有培地（Ham's F-12K培地、カタログ番号080-08565、和光）で２４時間飢餓状態として増殖を抑制し、２００μlのピペットチップを用いて各ウェルをスクラッチした。その後、細胞を無血清培地（Ham's F-12K培地、カタログ番号080-08565 Wako, Japan）に変更して２４時間培養し、同一部位の単位面積当たりの遊走細胞数を計測した。
これは、親株PC3-Luc細胞及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を、１００％コンフルエンスの密度で、６ウェルプレートに播種した。１％ＦＢＳ含有培地（Ham's F-12K培地、カタログ番号080-08565、和光）で２４時間飢餓状態として増殖を抑制し、２００μlのピペットチップを用いて各ウェルをスクラッチした。その後、細胞を無血清培地（Ham's F-12K培地、カタログ番号080-08565 Wako, Japan）に変更して２４時間培養し、同一部位の単位面積当たりの遊走細胞数を計測した。
【0031】
・細胞接着アッセイ
これは、CytoSelectTM 48- Well Cell Adhesion Assay（カタログ番号CBA-070、; Cell Biolabs Inc., USA）を用いて行った。プロトコールに従い、２４時間血清飢餓状態にした親株PC3-Luc細胞及びGPRC5AノックアウトPC3-Luc細胞は、０．５×１０６／ｍｌの濃度となるように無血清培地（Ham's F-12K培地、カタログ番号080-08565 Wako, Japan）に溶解し、接着プレートに播種した。９０分間インキュベートし後、接着細胞を固定して染色した。 次いで、染色細胞に抽出溶液を添加し、溶解した。この溶液の一部を９６ウェルプレートのウェルに移し、マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍの波長を測定した。
これは、CytoSelectTM 48- Well Cell Adhesion Assay（カタログ番号CBA-070、; Cell Biolabs Inc., USA）を用いて行った。プロトコールに従い、２４時間血清飢餓状態にした親株PC3-Luc細胞及びGPRC5AノックアウトPC3-Luc細胞は、０．５×１０６／ｍｌの濃度となるように無血清培地（Ham's F-12K培地、カタログ番号080-08565 Wako, Japan）に溶解し、接着プレートに播種した。９０分間インキュベートし後、接着細胞を固定して染色した。 次いで、染色細胞に抽出溶液を添加し、溶解した。この溶液の一部を９６ウェルプレートのウェルに移し、マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍの波長を測定した。
【0032】
・細胞浸潤アッセイ
これは、CytoSelectTM 24-Well Cell Invasion Assay（カタログ番号CBA-110 Cell Biolabs Inc., USA）を用いて行った。プロトコールに従い、親株PC3-Luc細胞及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を、ＰＢＳで洗浄し、無血清培地中に０．５×１０６／ｍｌで懸濁した。次いで、細胞懸濁液を各インサートの内側に置き、底部ウェルを、７％ＦＢＳを含む培地で満たした。３７℃、５％ＣＯ２で２２時間インキュベートした後、インサートの内部の細胞を機械的に除去し、浸潤した細胞を固定し、キットのCell Stain Solutionで染色して乾燥させた。次いで、細胞抽出溶液を添加し、染色された浸潤細胞を溶解し、一部を９６ウェルプレートのウェルに移し、マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍの波長を測定した。
これは、CytoSelectTM 24-Well Cell Invasion Assay（カタログ番号CBA-110 Cell Biolabs Inc., USA）を用いて行った。プロトコールに従い、親株PC3-Luc細胞及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を、ＰＢＳで洗浄し、無血清培地中に０．５×１０６／ｍｌで懸濁した。次いで、細胞懸濁液を各インサートの内側に置き、底部ウェルを、７％ＦＢＳを含む培地で満たした。３７℃、５％ＣＯ２で２２時間インキュベートした後、インサートの内部の細胞を機械的に除去し、浸潤した細胞を固定し、キットのCell Stain Solutionで染色して乾燥させた。次いで、細胞抽出溶液を添加し、染色された浸潤細胞を溶解し、一部を９６ウェルプレートのウェルに移し、マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍの波長を測定した。
【0033】
・細胞アポトーシスアッセイ
親株PC3-Luc細胞及びDU145細胞、並びにＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞及びDU145細胞におけるアポトーシスを、In Situ Cell Death Detection Kit（カタログ番号11684817910 Roche, Germany）を用いて、プロトコールに従い調べた。 ＤＡＰＩを用いて核を染色し、蛍光顕微鏡（Keyence、Japan）を用いてアポトーシスの染色シグナルを評価した。
親株PC3-Luc細胞及びDU145細胞、並びにＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞及びDU145細胞におけるアポトーシスを、In Situ Cell Death Detection Kit（カタログ番号11684817910 Roche, Germany）を用いて、プロトコールに従い調べた。 ＤＡＰＩを用いて核を染色し、蛍光顕微鏡（Keyence、Japan）を用いてアポトーシスの染色シグナルを評価した。
【0034】
・細胞周期アッセイ
親株PC3-Luc細胞、DU145細胞、及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞の細胞周期を調べるため、６ウェルプレートに各細胞を１×１０５個播種し、４８時間後にBD CycletestTM Plus DNA Kit（カタログ番号 340242 BD Biosciences, USA）をプロトコールに従い使用し、サンプルを精製し、ＦＣＭにて細胞周期を評価した。
親株PC3-Luc細胞、DU145細胞、及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞の細胞周期を調べるため、６ウェルプレートに各細胞を１×１０５個播種し、４８時間後にBD CycletestTM Plus DNA Kit（カタログ番号 340242 BD Biosciences, USA）をプロトコールに従い使用し、サンプルを精製し、ＦＣＭにて細胞周期を評価した。
【0035】
・ヒト前立腺癌細胞異種移植
皮下移植は、まず１００μｌのMatrigel Basement Membrane HC（カタログ番号 354248 Corning, USA）に１×１０６個の親株PC3-Luc及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を氷上で溶解した。次に、イソフルランによる麻酔下で、５週齢の雄ヌードマウス（日本クレア）の背部に、２６Ｇシリンジを用いて、細胞液を注射した。キャリパーを用いて、腫瘍体積を１週間ごとに測定した。５週間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液（カタログ番号163-20145、Wako）で固定し、組織学的検査に用いた。
皮下移植は、まず１００μｌのMatrigel Basement Membrane HC（カタログ番号 354248 Corning, USA）に１×１０６個の親株PC3-Luc及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を氷上で溶解した。次に、イソフルランによる麻酔下で、５週齢の雄ヌードマウス（日本クレア）の背部に、２６Ｇシリンジを用いて、細胞液を注射した。キャリパーを用いて、腫瘍体積を１週間ごとに測定した。５週間後、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液（カタログ番号163-20145、Wako）で固定し、組織学的検査に用いた。
【0036】
脛骨骨髄内移植は、まず１０μｌの滅菌ＰＢＳに１×１０４個の親株PC3-Luc及びＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞を溶解した。次に、イソフルランによる麻酔下で、５週齢の雄ヌードマウス（日本クレア）の左後肢の膝関節部に皮切を加え、膝関節を露出させ、膝蓋腱やや外側から脛骨骨髄腔に向けて、２６Ｇ針を穿刺し脛骨に穴をあけた。続いて、２７Ｇ針付きシリンジを用いて、骨髄内に細胞液を注射した後、穿刺腔を骨蝋（カタログ番号 0050010 東京エム・アイ商会 Japan）で塞ぎ、皮膚を5-0ナイロン糸（カタログ番号 NN3283 日腸工業）で閉創した。移植後３週目より１週間ごとにin vivo imagingにて腫瘍細胞の生着、増殖を評価した。移植後６週間で安楽死させ、脛骨を採取、骨形態計測、骨密度計測及び組織学的解析を行った。
【0037】
・In vivo imaging
Ｄ－ルシフェリン（カタログ番号123-03943 Wako, Japan）を滅菌ＰＢＳに溶解（４０ｍｇ／ｍｌ）した。２７Ｇ針の注射器を使用してルシフェリン溶液１００μｌをマウスの腹腔内に注入した。注射５分後にイソフルランによる麻酔下でAEQUORIA-2D/8600（Hamamatsu Photonics K. K.）プラットフォームにマウスを置き撮影した。撮影は、毎回同じ条件下で行い、得られた発光像をGrayscaleに変換後、ImageJで同一面積でのintegrated densityとして輝度を定量及び解析した。
Ｄ－ルシフェリン（カタログ番号123-03943 Wako, Japan）を滅菌ＰＢＳに溶解（４０ｍｇ／ｍｌ）した。２７Ｇ針の注射器を使用してルシフェリン溶液１００μｌをマウスの腹腔内に注入した。注射５分後にイソフルランによる麻酔下でAEQUORIA-2D/8600（Hamamatsu Photonics K. K.）プラットフォームにマウスを置き撮影した。撮影は、毎回同じ条件下で行い、得られた発光像をGrayscaleに変換後、ImageJで同一面積でのintegrated densityとして輝度を定量及び解析した。
【0038】
・骨密度測定及びμＣＴ
脛骨骨髄内移植より６週後の脛骨を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１日間固定し、７０％エタノールに浸した。骨ミネラルアナライザー（DCS-600EX アロカ, Japan）を用いて二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）により脛骨の骨密度（ＢＭＤ）を測定した。続いて、Scanco MedicalμCT35システム（SCANCO Medical, Switzerland）を用いて、脛骨のマイクロコンピュータ断層撮影スキャンを実施した。
脛骨骨髄内移植より６週後の脛骨を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１日間固定し、７０％エタノールに浸した。骨ミネラルアナライザー（DCS-600EX アロカ, Japan）を用いて二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）により脛骨の骨密度（ＢＭＤ）を測定した。続いて、Scanco MedicalμCT35システム（SCANCO Medical, Switzerland）を用いて、脛骨のマイクロコンピュータ断層撮影スキャンを実施した。
【0039】
・組織学的評価
腫瘍細胞皮下移植片及び腫瘍細胞脛骨骨髄内移植後の脛骨は、サンプリング後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１日間固定し、７０％エタノールに浸した。皮下移植サンプルはパラフィンに包埋し、脛骨サンプルはモールス溶液で脱灰した後パラフィンに包埋した。パラフィン切片は、ミクロトーム（RM2255、Leica Biosystems）で１０μｍ厚に薄切りにされ組織学的評価に使用した。脛骨骨髄内移植サンプルのＨＥ染色は、各サンプルをキシレン及びアルコールによる脱パラフィン処理後に滅菌水で洗浄し、ヘマトキシリン－エオジン染色を行った。ＴＲＡＰ染色は、各サンプルを同様に脱パラフィン処理後に滅菌水で洗浄し、TRAP/ALP Stain kit（カタログ番号 294-67001 Wako, Japan）をプロトコールに従い使用し染色した。皮下移植サンプルの蛍光免疫染色は、パラフィン切片をキシレン及びアルコールにより脱パラフィン処理を行った後、滅菌水で洗浄し、ＰＨ６．０のクエン酸緩衝液を加え、マイクロウェーブ処理を９００ｗで１０分間施した後、５００ｗで１５分間施した。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで１：５０に希釈したヤギ血清（カタログ番号 143-06561 Wako, Japan）を用いて室温で３０分間ブロッキングを行った。anti-Luciferase抗体（カタログ番号 PM016 MBL）及びanti-Ki67抗体（カタログ番号 14-5698-82 invitrogen）は、それぞれ抗体希釈液（カタログ番号 S2022 Dako, Japan）で１：２００に希釈し４℃オーバーナイトで反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体反応（ＤＡＰＩ）を加えてマウントし観察した。
腫瘍細胞皮下移植片及び腫瘍細胞脛骨骨髄内移植後の脛骨は、サンプリング後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１日間固定し、７０％エタノールに浸した。皮下移植サンプルはパラフィンに包埋し、脛骨サンプルはモールス溶液で脱灰した後パラフィンに包埋した。パラフィン切片は、ミクロトーム（RM2255、Leica Biosystems）で１０μｍ厚に薄切りにされ組織学的評価に使用した。脛骨骨髄内移植サンプルのＨＥ染色は、各サンプルをキシレン及びアルコールによる脱パラフィン処理後に滅菌水で洗浄し、ヘマトキシリン－エオジン染色を行った。ＴＲＡＰ染色は、各サンプルを同様に脱パラフィン処理後に滅菌水で洗浄し、TRAP/ALP Stain kit（カタログ番号 294-67001 Wako, Japan）をプロトコールに従い使用し染色した。皮下移植サンプルの蛍光免疫染色は、パラフィン切片をキシレン及びアルコールにより脱パラフィン処理を行った後、滅菌水で洗浄し、ＰＨ６．０のクエン酸緩衝液を加え、マイクロウェーブ処理を９００ｗで１０分間施した後、５００ｗで１５分間施した。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで１：５０に希釈したヤギ血清（カタログ番号 143-06561 Wako, Japan）を用いて室温で３０分間ブロッキングを行った。anti-Luciferase抗体（カタログ番号 PM016 MBL）及びanti-Ki67抗体（カタログ番号 14-5698-82 invitrogen）は、それぞれ抗体希釈液（カタログ番号 S2022 Dako, Japan）で１：２００に希釈し４℃オーバーナイトで反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体反応（ＤＡＰＩ）を加えてマウントし観察した。
【0040】
・ＲＮＡシークエンス
親株PC3-Luc及び２種類のＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞は、上記と同様の方法で全ＲＮＡを採取した。Bioanalyzer, RNA6000 pico kitでＲＮＡの品質チェックを行い、ＲＩＮ値が８以上のサンプルを解析に使用した。各サンプル２００ｎｇを使用して、illumina社TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep kit のマニュアルに準じてライブラリーを作成した。Bioanalyzer, DNA 1000 kitでライブラリーの品質チェクを行い、品質が問題ない事を確認した。Kapa Library Quantification KitでｑＰＣＲベースのライブラリーの定量を行い、マニュアル通りにライブラリーを希釈した後、ｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲでの定量結果に基づき、各ライブラリーを均等に混ぜ合わせた後、ライブラリー濃度１９ｐＭでMiSeq Reagent kit V3 150 cycle kitを用いて７５ｂｐペアエンドで解析を実施し、fastqファイルを取得した。Tophatでfastqファイルをヒトゲノムデータｈｇ３８へのマッピングを行い、発現解析ツールcufflinksで各サンプルの正規化、２群間（PC3 vs GPRC5A KO1及びKO２）の発現差解析を行った。
親株PC3-Luc及び２種類のＧＰＲＣ５ＡノックアウトPC3-Luc細胞は、上記と同様の方法で全ＲＮＡを採取した。Bioanalyzer, RNA6000 pico kitでＲＮＡの品質チェックを行い、ＲＩＮ値が８以上のサンプルを解析に使用した。各サンプル２００ｎｇを使用して、illumina社TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep kit のマニュアルに準じてライブラリーを作成した。Bioanalyzer, DNA 1000 kitでライブラリーの品質チェクを行い、品質が問題ない事を確認した。Kapa Library Quantification KitでｑＰＣＲベースのライブラリーの定量を行い、マニュアル通りにライブラリーを希釈した後、ｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲでの定量結果に基づき、各ライブラリーを均等に混ぜ合わせた後、ライブラリー濃度１９ｐＭでMiSeq Reagent kit V3 150 cycle kitを用いて７５ｂｐペアエンドで解析を実施し、fastqファイルを取得した。Tophatでfastqファイルをヒトゲノムデータｈｇ３８へのマッピングを行い、発現解析ツールcufflinksで各サンプルの正規化、２群間（PC3 vs GPRC5A KO1及びKO２）の発現差解析を行った。
【0041】
・Statistical analysis
全てのグラフは平均値±ＳＥＭを表わしている。平均値間の有意な差は、Microsoft Excel、ＥＺＲバージョン1.35（Kanda, 2013）、又はGraphPad Prism7を用いて、両側検定、スチューデントｔ検定（２つの群を分析した場合）、又はone way ANOVAを行った後、Student Newman-Keuls検定（３群以上について）を行った。 ２つのデータセットの正規性は、Kolmogorov-Smirnov検定、及びShapiro-Wilk検定を有意水準０．０５で評価した。グループで正規性が確認された場合、両側スチューデントt検定を行い、確認されなかったとき、マンホイットニーＵ検定をそれぞれ適用した。
全てのグラフは平均値±ＳＥＭを表わしている。平均値間の有意な差は、Microsoft Excel、ＥＺＲバージョン1.35（Kanda, 2013）、又はGraphPad Prism7を用いて、両側検定、スチューデントｔ検定（２つの群を分析した場合）、又はone way ANOVAを行った後、Student Newman-Keuls検定（３群以上について）を行った。 ２つのデータセットの正規性は、Kolmogorov-Smirnov検定、及びShapiro-Wilk検定を有意水準０．０５で評価した。グループで正規性が確認された場合、両側スチューデントt検定を行い、確認されなかったとき、マンホイットニーＵ検定をそれぞれ適用した。
【0042】
以上説明した本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々の実施形態に適用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
