特許 7344858 Ｆｃ含有ポリペプチドの安定化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-06

(45)【発行日】2023-09-14

(54)【発明の名称】Ｆｃ含有ポリペプチドの安定化

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230907BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230907BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230907BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230907BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230907BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230907BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230907BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230907BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230907BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230907BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20230907BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20230907BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

A61K39/395 M

A61P43/00 111

C07K16/00 ZNA

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/02 C

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2020160475

(22)【出願日】2020-09-25

(62)【分割の表示】P 2016531860の分割

【原出願日】2014-07-30

(65)【公開番号】P2021019598

(43)【公開日】2021-02-18

【審査請求日】2020-10-23

(31)【優先権主張番号】61/860,800

(32)【優先日】2013-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】グナセーカラン・カナン

(72)【発明者】

【氏名】ジェニファー・ラバリー

(72)【発明者】

【氏名】フレデリック・ダブリュ・ジェイコブセン

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５１１３３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００１－５２３９７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１１２８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／０７８６８８（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００－１９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２つのポリペプチドを含む二量体であって、各ポリペプチドは抗体Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域はヒンジ領域を欠き、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づきＴ３９４Ｃ置換を含み、前記２つのポリペプチドにおける前記Ｔ３９４Ｃ残基の間でジスルフィド結合が形成される、二量体。

【請求項2】

Ｆｃが、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づき、Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３又はＩ３３２における１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＣＨ２領域を含む、請求項１に記載の二量体。

【請求項3】

ＦｃのＣ末端の１つ又は複数のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の二量体。

【請求項4】

ＦｃのＣ末端の３つ、２つ又は１つのアミノ酸が欠失している、請求項３に記載の二量体。

【請求項5】

ＦｃのＣ末端の末端アミノ酸が欠失している、請求項３に記載の二量体。

【請求項6】

各ポリペプチドが抗体重鎖を含む、請求項１に記載の二量体。

【請求項7】

各ポリペプチドがＦｃ融合タンパク質を含む、請求項１に記載の二量体。

【請求項8】

ホモ二量体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の二量体。

【請求項9】

ヘテロ二量体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の二量体。

【請求項10】

請求項８のホモ二量体を含む抗体。

【請求項11】

請求項９のヘテロ二量体を含む抗体。

【請求項12】

請求項８のホモ二量体を含むＦｃ融合タンパク質。

【請求項13】

請求項９のヘテロ二量体を含むＦｃ融合タンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８６０，８００号の利益を主張するものであり、同出願を参照により本明細書に援用する。

【0002】

配列表
本出願は、電子的に提出したＡＳＣＩＩ形式の配列表を含むものであり、同配列表の全体を参照により本明細書に援用する。２０１４年７月２８日に作成された当該ＡＳＣＩＩ形式の複製の名称は、Ａ－１８５２－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、大きさは１２２，９８８バイトである。

【背景技術】

【0003】

抗体は、治療用分子の開発者にとって魅力的ないくつかの特性を持つことから、生物薬剤産業内で選択される手段になってきている。抗体は、特定の構造または細胞への標的能に加えて、その標的細胞がＦｃ受容体細胞を介した食作用及び殺傷を受けるようにする（Ｒａｇｈａｖａｎ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｍａｎ １９９６）。更に、ｐＨ依存的に新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用する抗体の能力により、血清半減期の増大がもたらされる（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ ２０００）。抗体のこの固有の特徴のため、Ｆｃ－融合分子を操作することにより血清中の治療用タンパク質またはペプチドの半減期を拡大することが可能である。

【0004】

抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤを含む、タンパク質の免疫グロブリンクラスに属する。ヒト血清中に最も豊富に存在する免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧであり、その模式構造を図１に示す（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ １９８１；Ｈｕｂｅｒ １９８４；Ｒｏｕｘ １９９９）。ＩｇＧ構造は、２つの軽鎖及び２つの重鎖の４つの鎖を有し、各軽鎖は２つのドメインを有し、各重鎖は４つのドメインを有する。抗原結合部位は、可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）ドメイン並びに定常軽鎖（ＬＣ）及び定常重鎖（ＣＨｌ）ドメインを含むＦａｂ領域（抗原結合断片）に位置する。重鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン領域は、Ｆｃ（結晶性断片）と呼ばれる。ＩｇＧ分子は、ヒンジ領域のジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）により結合された２つの重鎖と、２つの軽鎖とを有するヘテロ四量体とみなすことができる。ヒンジジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのサブクラス間で異なる（Ｐａｐａｄｅａ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋ １９８９）。ＦｃＲｎ結合部位は、抗体のＦｃ領域に位置し（Ｍａｒｔｉｎ，Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．２００１）、そのため、抗体の長期血清半減期性は、Ｆｃ断片中に保持されている。Ｆｃ領域は、単独では、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重鎖のホモ二量体と考えることができる。

【0005】

天然ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、ホモ二量体であり、二量体として発現させ、精製することができる。上述のように、抗体のＦｃ領域は、ＦｃＲｎリサイクリング機序を介して血清半減期をもたらす。したがって、Ｆｃは、治療用タンパク質、ペプチド（ペプチボディ）及びタンパク質ドメインの血清半減期を増大するための融合パートナーとして用いられる。しかしながら、一部の治療用途では、Ｆｃを形成する２つのポリペプチド鎖間の共有結合を取り除く、ヒンジ領域の除去が必要になる場合がある。例えば、内部ジスルフィド結合または遊離システイン残基を含むタンパク質とＦｃとを融合させる場合、ヒンジジスルフィドは折り畳みと干渉し、凝集をもたらし得る。しかしながら、ヒンジ領域を取り除くと、２つのポリペプチド鎖間の共有結合が除去される。これは、製造段階またはインビボのいずれにおいて、２つのＦｃ鎖間の非共有結合作用の解離をもたらし、Ｆｃ鎖と他のタンパク質／分子との会合をもたらし得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｒａｇｈａｖａｎ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｍａｎ １９９６

【文献】Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ ２０００

【文献】Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ １９８１；Ｈｕｂｅｒ １９８４；Ｒｏｕｘ １９９９

【文献】Ｐａｐａｄｅａ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋ １９８９

【文献】Ｍａｒｔｉｎ，Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．２００１

【発明の概要】

【0007】

本明細書にて開示するように、ＣＨ３ドメイン界面にジスルフィド結合を導入することにより、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を欠くＦｃ含有分子の熱安定性を改善することができる。更に、この共有結合により、Ｆｃ構造の二量体を形成する２つのポリペプチド鎖は、インビトロまたはインビボでの解離なく、そのままの形態を保持する。図３に示すように、ある特定の実施形態において、ＷＴヒンジ除去Ｆｃホモ二量体及び変異型ヒンジ除去Ｆｃヘテロ二量体における２つのＦｃ鎖間の唯一の共有結合は、導入されたジスルフィド結合だけである。

【0008】

ある特定の実施形態において、ＣＨ３ドメイン間のジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）の形成により相互作用が安定化するように、両ＣＨ３ドメイン上でＣＨ３－ＣＨ３界面を形成する１つまたは複数の残基をスルフヒドリル含有残基で置換する。好ましい実施形態において、界面のアミノ酸、例えば、ロイシン、スレオニン、セリンまたはチロシンを、システインまたはメチオニン、好ましくはシステインで置換する。ある特定の実施形態において、アミノ酸を、所望の電荷特性を有する非天然アミノ酸、例えば、ホモシステインまたはグルタチオンで置換する。

【0009】

本発明の第１の態様において、ポリペプチドは、ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインの欠失または置換及び１つまたは複数のＣＨ３界面アミノ酸のスルフヒドリル含有残基、好ましくは、システインとの置換を有する抗体Ｆｃ領域を含む。ヒンジ領域は、置換によりまたは欠失を介してシステイン残基を欠いていてよい。ある特定の実施形態において、Ｆｃは、ヒンジ領域を完全に欠いている。他の実施形態において、ヒンジ領域の一部のみ、好ましくは、システイン残基を含む部分を除去する。

【0010】

第１の態様の特定の実施形態において、ＣＨ３界面アミノ酸のＹ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｔ３９４またはＹ４０７を、スルフヒドリル含有残基、好ましくはシステインで置換する。好ましい実施形態において、Ｆｃは、Ｌ３５１Ｃ置換を含む。Ｌ３５１Ｃ置換を有する２つのＦｃ含有ポリペプチドが適切な条件下で相互に作用する場合、２つの鎖中のＬ３５１Ｃ残基間でジスルフィド結合が形成される。同様に、Ｔ３９４Ｃ置換を有する２つのＦｃ含有ポリペプチドが適切な条件下で相互に作用する場合、２つの鎖中のＴ３９４Ｃ残基間でジスルフィド結合が形成される。更に、Ｙ４０７Ｃ置換を有する２つのＦｃ含有ポリペプチドが適切な条件下で相互に作用する場合、２つの鎖中のＹ４０７Ｃ残基間でジスルフィド結合が形成される。Ｙ３４９Ｃ置換を有するＦｃ含有ポリペプチドがＳ３５４Ｃ置換を有するＦｃ含有ポリペプチドと適切な条件下で相互に作用する場合、一方の鎖中のＹ３４９Ｃ残基と、もう一方の鎖中のＳ３５４Ｃ残基の間にジスルフィド結合が形成される。

【0011】

第１の態様のポリペプチドのＦｃ領域は、ＣＨ２及び／またはＣＨ３領域に、１つまたは複数の更なるアミノ酸置換を含み得る。好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、野生型ＣＨ２を有する類似のタンパク質と比べて、Ｆｃ含有タンパク質のエフェクター機能を変更する、１つまたは複数のアミノ酸置換をＣＨ２領域に含む。他の実施形態において、Ｆｃ領域は、対応するアミノ酸置換をＣＨ３領域に有するＦｃ含有ポリペプチドとのＦｃ含有ポリペプチドのホモ二量体化能を変更する及び／またはヘテロ二量体化能を増加させる、１つまたは複数のアミノ酸置換をＣＨ３領域に含む。

【0012】

第１の態様のある特定の実施形態において、ＦｃのＣ末端の１つまたは複数のアミノ酸を欠失させるかまたは置換する。好ましい実施形態において、Ｃ末端リジンを欠失させるか、別のアミノ酸に置換する。他の実施形態において、２つまたは３つの末端アミノ酸を欠失させるか、別のアミノ酸に置換する。

【0013】

第１の態様のある特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体重鎖である。他の実施形態において、ポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ分子のＮ末端及び／またはＣ末端にリンカーを含み得る。

【0014】

本発明の第２の態様において、核酸が第１の態様のポリペプチドをコードする。

【0015】

第３の態様において、発現ベクターが異種プロモーター及び／またはエンハンサーなどの制御配列に機能的に連結した第２の態様の核酸を含む。

【0016】

第４の態様において、宿主細胞が第３の態様の発現ベクターを含む。好ましい実施形態において、宿主細胞は、酵母菌または哺乳動物の細胞株などの真核細胞である。好ましい哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。

【0017】

本発明の第５の態様は、第１の態様のポリペプチドを作製するための方法である。当該方法は、第４の態様の宿主細胞を、制御領域が宿主細胞内で活性となる条件下で培養すること、及びその培養物からポリペプチドを単離することを含む。

【0018】

第６の態様において、医薬組成物が第１の態様のポリペプチドを含む。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ドメインを示したＩｇＧ１抗体の模式図である。ＩｇＧ１抗体は、２つの重鎖（長さがより長い）及び２つの軽鎖（長さがより短い）を有するＹ字形の四量体である。２つの重鎖は、ヒンジ領域でジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）により互いに結合している。Ｆａｂ：抗原結合断片、Ｆｃ：結晶性断片、ＶＬ：可変軽鎖ドメイン、ＶＨ：可変重鎖ドメイン、ＣＬ：定常（配列変動なし）軽鎖ドメイン、ＣＨｌ：定常重鎖ドメイン１、ＣＨ２：定常重鎖ドメイン２、ＣＨ３：定常重鎖ドメイン３。

【図2】ヒンジ領域を欠き（「ヒンジ除去」）、ＣＨ３ドメイン界面に導入したジスルフィド結合を有するＦｃ二量体の模式図である。（ａ）野生型Ｆｃホモ二量体の場合と、（ｂ）ＣＨ３ドメイン界面に変異（例えば、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓまたは電荷対変異）も導入した、変異型Ｆｃヘテロ二量体の場合。

【図3】ＣＨ３ドメイン界面に導入したＬ３５１Ｃジスルフィド結合を有するヒンジ除去Ｆｃ電荷対変異型ヘテロ二量体融合構築物に関するＳＤＳＰＡＧＥを示す。大きい単一バンドにより、Ｆｃ鎖の正（「＋」）と負（「－」）の間の共有結合が確認される。

【図4】ヒンジ領域を欠くヘテロ二量体（電荷対変異）Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態の要約を示す。Ａ．ヒンジを欠き、かつ治療用ペプチドとＦｃの間にリンカーを有さないＦｃ融合体。Ｂ．Ａと同様であるが、治療用ペプチド内に変異を有するＦｃ融合体。Ｃ．Ｂと同様であるが、グリコシル化していないリンカーがＦｃと治療用ペプチドとを連結しているＦｃ融合体。Ｄ．Ｃと同様であるが、異なるリンカーを有するＦｃ融合体。Ｅ．Ａと同様であるが、一方のＦｃ鎖がＹ３４９Ｃ置換を含み、他方がＳ３５４Ｃ置換を含むＦｃ融合体。Ｆ．Ｂと同様であるが、一方のＦｃ鎖がＹ３４９Ｃ置換を含み、他方がＳ３５４Ｃ置換を含むＦｃ融合体。

【発明を実施するための形態】

【0020】

抗体Ｆｃスカフォールド、特に、ヒンジ領域を欠くか、ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域の一部を欠くか、またはヒンジ領域が１つ若しくは複数のシステイン残基の置換を含む、Ｆｃスカフォールドの安定性を改善するための方法が本明細書にて記載される。当該方法は、１つまたは複数の操作したジスルフィド結合をＣＨ３ドメイン界面に導入することを含む。

【0021】

図１に示すように、ＩｇＧ１抗体は、２つの重鎖（長さがより長い）及び２つの軽鎖（長さがより短い）を有するＹ字形の四量体である。２つの重鎖は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）により互いに結合している。ＩｇＧ分子は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）により結合された２つの重鎖と、２つの軽鎖とからなるヘテロ四量体とみなすことができる。ヒンジジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのサブクラス間で異なる。

【0022】

天然抗体において、２つの重鎖間の共有結合が、ヒンジ領域においてジスルフィド結合（溶媒にさらされる）によりもたらされる。したがって、ヒンジ領域を欠くＦｃ二量体または抗体には、２つの重鎖間に共有結合がない。ヒンジジスルフィドは、軽鎖と重鎖の間（ＣＬ－ＣＨ１）のジスルフィド結合とともに、４つのすべての鎖を共有結合的に連結させる。未変性抗体の分子量は約１５０ＫＤａであり、非還元ＳＤＳＰＡＧＥにて単一バンドとして出る。野生型ＩｇＧ１／Ｆｃには、ＣＨ３ドメイン界面にジスルフィド結合はない。

【0023】

例示的なヒトＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列は、
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号９）である。

【0024】

上記配列中、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号１０）がヒンジ領域に該当する。

【0025】

ＣＨ３－ＣＨ３界面を形成するアミノ酸については、２００９年１月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／００００７１に加え、２００８年１月７日に出願された共同所有の仮特許出願第６１／０１９，５６９号及び２００９年１２月５日に出願された同第６１／１２０，３０５号に記載されている（これらすべての出願全体を参照により援用する）。

【0026】

Ｆｃ領域に対応する座標を有する総数４８の抗体結晶構造を、構造に基づく検索アルゴリズム（Ｙｅ ａｎｄ Ｇｏｄｚｉｋ ２００４）を用いて、蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ）から特定した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｋｏｅｔｚｌｅ ｅｔ ａｌ．１９７７）。特定されたＦｃ結晶構造を調べると、最高解像度で特定された構造が、Ｚ３４Ｃ（ＰＤＢコード：１Ｌ６Ｘ）と呼ばれるタンパク質Ａ由来のＢドメインの最小型に結合したリツキシマブのＦｃ断片に対応することが明らかになった。寄託されているＦｃ単量体座標及び結晶対称性を用いて、１Ｌ６Ｘの生物学的Ｆｃホモ二量体構造を生成した。（ｉ）距離限界基準によって求めた接触及び（ｉｉ）溶媒露出表面積分析の２つの方法を用いて、ＣＨ３－ＣＨ３ドメイン相互作用に関与する残基を特定した。

【0027】

界面残基は、接触に基づく方法に従って、その側鎖重原子が第２の鎖中の任意の残基の重原子から特定の限界よりも近くに位置する残基として定義される。４．５Ａの距離限界が好ましいが、界面残基を特定するために、より長い距離限界（例えば、５．５Ａ）を用いることも可能である（Ｂａｈａｒ ａｎｄ Ｊｅｒｎｉｇａｎ １９９７）。

【0028】

第２の方法は、第２の鎖の存在下及び非存在下で、ＣＨ３ドメイン残基の溶媒露出表面積（ＡＳＡ）を算出することを伴う（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ １９７１）。ＡＳＡにて２つの計算値の間に差異（１Ａ^２超）を示す残基を界面残基として特定する。どちらの方法も、類似セットの界面残基を特定した。更に、これらは公開研究と一致した（Ｍｉｌｌｅｒ １９９０）。

【0029】

表１は、４．５Ａの距離限界を用いる接触基準方法に基づいて特定した２４の界面残基の一覧である。これらの残基の構造保存を更に調べた。この目的のために、ＰＤＢにより特定された４８のＦｃ構造を重ね合わせ、側鎖重原子の平均二乗偏差を算出することにより分析した。残基の表記は、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに基づく。これはまた、蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ）の番号付けとも対応している。

【0030】

【表1】

【0031】

野生型Ｆｃの結晶構造を得て、操作ジスルフィド結合のための、システイン残基の導入が見込まれる位置を分析した。具体的には、Ｔ３９４及びＬ３５１の位置が選ばれた。野生型Ｆｃ鎖のＴ３９４位置をＣＨ３ドメイン界面で並列させる。両方のＦｃ鎖上のＴ３９４をシステインに変異させると、ジスルフィド結合の形成が可能となるであろう。同様に、野生型Ｆｃ鎖のＬ３５１位置をＣＨ３ドメイン界面で並列させる。両方のＦｃ鎖上のＬ３５１をシステインに変異させると、ジスルフィド結合の形成が同じく可能となるであろう。両方のＦｃ鎖上のＴ３９４とＬ３５１の両方をシステインに変異させると、２つのジスルフィド結合の形成が可能となるであろう。

【0032】

ジスルフィド結合は両鎖中の同じ残基が関与するので、Ｔ３９４とＬ３５１の両部位は、野生型Ｆｃホモ二量体だけでなく、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓまたは電子対変異を有するＦｃ鎖などの操作したＦｃヘテロ二量体にも適用することができる。

【0033】

Ｙ３４９及びＳ３５４の位置を野生型Ｆｃ ＣＨ３界面で並列させる。Ｆｃヘテロ二量体において、一方のＣＨ３領域がＹ３４９Ｃ置換を含み、もう一方のＣＨ３領域がＳ３５４Ｃ置換を含み得る。（Ｙ３４９Ｃ／Ｓ３５４Ｃ）システインクランプ変異を含む電荷対ヘテロ二量体の安定性は、システインクランプを含まないヘテロ二量体よりも優れていることがわかった。特に、システインクランプのない電子対ヘテロ二量体の単量体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で別々のバンドで観察されたが、システインクランプ変異のある電子対ヘテロ二量体は、単一バンドで観察された。（Ｌ３５１Ｃ／Ｌ３５１Ｃ）システインクランプ変異を含む電子対ヘテロ二量体についても同様であった。

【0034】

Ｙ３４９Ｃ置換を含む第１のＣＨ３含有分子及びＳ３５４Ｃ置換を含む第２のＣＨ３含有分子を含むヘテロ二量体は、当該位置に野生型アミノ酸残基を含むヘテロ二量体と比べて、より大きな安定性と、より高いヘテロ二量体のパーセンテージを示した。更に、Ｌ３５１Ｃ置換をそれぞれ含む第１及び第２のＣＨ３含有分子を含むヘテロ二量体は、Ｌ３５１を含むヘテロ二量体と比べて、より大きな安定性及びより高い生成レベルを示した。

【0035】

ＣＨ３領域内の界面残基は、種々の抗体のサブクラス間、クラス間、更には異なる種間で、高度に保存されている傾向がある。したがって、当該システイン操作は、本実施形態ではヒトＩｇＧ１内に施しているが、他のＦｃ含有分子への適用も可能である。例示的なＦｃ配列を以下に記載する。以下の配列内のヒトＩｇＧ１のＹ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｔ３９４またはＹ４０７に対応する残基を、スルフヒドリル含有残基、好ましくはシステインで置換することができる。他のヒトＩｇＧサブクラスにて対応する残基は、[ ]で括って示す。

【化1】

【0036】

ある特定の実施形態において、ＣＨ３領域を含むポリペプチドは、ＩｇＧ分子であり、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインを更に含む。例示的なヒトＩｇＧ配列は、ＩｇＧｌ（例えば、配列番号１）、ＩｇＧ２（例えば、配列番号２）、ＩｇＧ３（例えば、配列番号３）及びＩｇＧ４（例えば、配列番号４）の定常領域を含む。

【0037】

Ｆｃ領域はまた、ＩｇＡ（例えば、配列番号５）、ＩｇＤ（例えば、配列番号６）、ＩｇＥ（例えば、配列番号７）及びＩｇＭ（例えば、配列番号８）重鎖の定常領域内にも構成され得るか、当該定常領域に由来してもよい。

【0038】

本発明の好ましい実施形態は、抗体、二重特異性抗体、単一特異性一価抗体、二重特異性マキシボディ（マキシボディはｓｃＦｖ－Ｆｃを指す）、モノボディ、ペプチボディ、二重特異性ペプチボディ、一価ペプチボディ（ヘテロ二量体Ｆｃ分子の１つのアームに融合したペプチド）及び受容体－Ｆｃ融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。

【0039】

いくつかの実施形態において、本戦略は、抗体ドメインの相互作用を変更する他の戦略、例えば、ドメインがそれ自体と相互作用する能力を減少させるか、または当該能力に有利に働く、ＣＨ３ドメイン変更とともに用いることができる。

【0040】

置換が適切に調整されれば、電荷は、界面における残基間のジスルフィド結合の形成に有利であり、これによりヘテロ二量体形成が安定化する。

【0041】

ある特定の態様において、本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を作製するための方法を提供する。ヘテロ二量体は、第１のＣＨ３含有ポリペプチド及び第２のＣＨ３含有ポリペプチドを含み得、これらが会合して、ヘテロ二量体形成を促進し安定化するように操作された界面を形成する。第１のＣＨ３含有ポリペプチド及び第２のＣＨ３含有ポリペプチドは、界面内に、１つまたは複数のスルフヒドリル含有アミノ酸を含み、第１のＣＨ３含有ヘテロ二量体上のアミノ酸のスルフヒドリル基と、第２のＣＨ３含有ヘテロ二量体上のアミノ酸のスルフヒドリル基との間にジスルフィド結合が形成可能なように配置される。

【0042】

ある特定の実施形態において、ＣＨ３含有ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃ領域、好ましくは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に由来するものを含む。「野生型」ヒトＩｇＧ Ｆｃとは、ヒト集団内に自然発生するアミノ酸配列を意味する。当然のことながら、Ｆｃ配列が個体間でわずかに異なり得るように、１つまたは複数の改変を野生型配列に施してもよく、これも本発明の範囲内であり得る。例えば、Ｆｃ領域は、グリコシル化部位における変異、非天然アミノ酸の包含または「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」若しくは「電荷対」変異などの本発明に関連しない更なる改変を含み得る。

【0043】

ＩｇＧ１ Ｆｃに施すことができる更なる変異には、Ｆｃ含有ポリペプチド間のヘテロ二量体形成を促進するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、２つの異なるＦｃ含有ポリペプチド鎖が細胞内で同時に発現したときにヘテロ二量体形成を促進する、「ｋｎｏｂ（突起）」及び「ｈｏｌｅ（空隙）」を生じるようにＦｃ領域を操作する（Ｕ．Ｓ．７，６９５，９６３）。他の実施形態において、２つの異なるＦｃ含有ポリペプチドが細胞内で同時に発現したときに、ヘテロ二量体形成を促進しつつ、ホモ二量体形成を妨げるように、静電的ステアリングを用いてＦｃ領域を改変する（ＷＯ０９／０８９，００４、その全体を参照により本明細書に援用する）。好ましいヘテロ二量体Ｆｃには、Ｆｃの１つの鎖がＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ置換を含み、Ｆｃのもう１つの鎖がＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ置換を含むものが挙げられる。他の実施形態において、Ｆｃの１つの鎖は、Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ及びＥ３５７Ｋ置換を含み、Ｆｃのもう１つの鎖は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｄ及びＫ３７０Ｄ置換を含む。

【0044】

重鎖は、当該重鎖を含む抗体の１つまたは複数のＦｃ受容体への結合に影響を与える１つまたは複数の変異を更に含み得る。抗体のＦｃ部分の機能の１つは、抗体が標的と結合したときに、免疫系と連絡を取ることである。これは、「エフェクター機能」とみなされている。連絡により、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貧食（ＡＤＣＰ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）がもたらされる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞表面上のＦｃ受容体へのＦｃの結合を通じて媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃと補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとの結合を通じて媒介される。

【0045】

ＩｇＧサブクラスは、エフェクター機能を媒介する能力が異なる。例えば、ＩｇＧ１は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介することにおいて、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもはるかに優れている。抗体のエフェクター機能は、１つまたは複数の変異をＦｃに導入することにより、増加させることも減少させることもできる。本発明の実施形態は、エフェクター機能が増加するように操作されたＦｃを有するＦｃ含有タンパク質、例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質を包含する（Ｕ．Ｓ．７，３１７，０９１及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：６８５－６９１，２００９；両文献の全体を参照により本明細書に援用する）。エフェクター機能を増加させた例示的なＩｇＧ１ Ｆｃ分子には、以下の置換を有するものが挙げられる（すべてＥＵ番号付けスキームに基づく）。
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ
Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ３３４Ｖ
Ｌ２３５Ｓ＋Ｓ２３９Ｄ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｑ３１１Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２３９Ｄ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｆ２４３Ｖ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｅ２９４Ｌ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｅ２３３Ｌ＋Ｑ３１１Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｌ２３４Ｉ＋Ｑ３１１Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ｋ３３４Ｖ
Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ａ３３０Ｆ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｑ３１１Ｍ＋Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｑ３１１Ｍ＋Ａ３３０Ｆ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ａ３３０Ｆ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２３９Ｄ＋Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２３９Ｄ＋Ｓ２９８Ｔ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｋ２９０Ｙ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｆ２４３Ｖ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｅ２９４Ｌ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｋ２９０Ｙ＋Ｙ２９６Ｗ

【0046】

本発明の更なる実施形態は、エフェクター機能が減少するように操作されたＦｃを有するＦｃ含有タンパク質、例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質を包含する。エフェクター機能を減少させた例示的なＦｃ分子には、以下の置換を有するものが挙げられる（Ｅｕ番号付けスキームに基づく）。
Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｑ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ２）
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ（ＩｇＧ４）
Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）
Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＩｇＧ１）

【0047】

ＩｇＧ Ｆｃ含有タンパク質のエフェクター機能を増加させるための別の方法は、Ｆｃのフコシル化を減少させることによるものである。Ｆｃに結合した二分岐複合型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合またはＣＤＣエフェクター機能を変えることなく、ＡＤＣＣエフェクター機能が大幅に向上した。Ｆｃ含有分子、例えば抗体のフコシル化を減少させるまたは無効にするための方法は複数知られている。これらの方法には、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異型ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０を含めた特定の哺乳動物細胞株、ＦＵＴ８遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡを含む細胞株、並びにβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジ体α－マンノシダーゼＩＩを同時に発現する細胞株内での組み換え発現が挙げられる。あるいは、Ｆｃ含有分子を植物細胞、酵母菌または原核細胞、例えば大腸菌などの非哺乳動物細胞内で発現させてもよい。したがって、本発明の特定の実施形態において、組成物は、フコシル化を減少させたＦｃまたはフコシル化を完全に欠くＦｃを含む。

【0048】

ヒトＩｇＧ１がＮ２９７（ＥＵ番号付けスキーム）にグリコシル化部位を有し、グリコシル化がＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与することが知られている。脱グリコシル化抗体を作製するために、グループが、Ｎ２９７に変異を加えた。これらの変異は、Ｎ２９７を、生理化学的性質の点でアスパラギンに類似するアミノ酸、例えばグルタミン（Ｎ２９７Ｑ）または極性基なしでアスパラギンの働きを再現するアラニン（Ｎ２９７Ａ）で置換することに主眼を置いている。

【0049】

本明細書にて使用する場合、「脱グリコシル化抗体」または「脱グリコシル化Ｆｃ」は、Ｆｃの２９７位置にある残基のグリコシル化の状態を指す。抗体または他の分子は、１つまたは複数の他の位置にグリコシル化を含んでもよいが、この場合でも同様に脱グリコシル化抗体または脱グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質とみなされ得る。

【0050】

２０１３年３月１４日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６１／７８４，６６９号は、エフェクター機能のないＩｇＧ１ Ｆｃについて記載している（この出願全体を参照により本明細書に援用する）。ヒトＩｇＧ１のアミノ酸Ｎ２９７のグリシンへの変異、すなわちＮ２９７Ｇにより、当該残基の他のアミノ酸置換よりもはるかに優れた精製効率及び生物物理学的性質がもたらされる。したがって、好ましい実施形態において、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。

【0051】

脱グリコシル化ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子は、グリコシル化ＩｇＧ１ Ｆｃ含有分子よりも安定性が低いことが示された。脱グリコシル化分子の安定性を増加させるように、Ｆｃ領域を更に操作してもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸をシステインに置換して、二量体状態のジスルフィド結合を形成する。ＣＨ２領域の残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３またはＩ３３２をシステインで置換することができる。好ましい実施形態において、残基の特定の対が、当該対が優先的に互いにジスルフィド結合をし、これによりジスルフィド結合の不規則性が制限または防止されるような置換である。好ましい対には、Ａ２８７ＣとＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣとＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣとＶ３０２Ｃ及びＶ３２３ＣとＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

残基Ｖ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３またはＩ３３２のうち１つまたは複数がシステインで置換された、Ｆｃ含有分子が本明細書にて提供される。好ましいＦｃ含有分子には、Ａ２８７ＣとＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣとＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣとＶ３０２ＣまたはＶ３２３ＣとＩ３３２Ｃの置換を含むものが挙げられる。

【0053】

目的のポリペプチドをＩｇＧ Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に融合させて、Ｆｃ融合タンパク質を作製してもよい。ある特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃと目的のポリペプチドとの間にリンカーを含む。多くの様々なリンカーポリペプチドが当該技術分野において知られており、Ｆｃ融合タンパク質にて用いることができる。好ましい実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃと目的のペプチドまたはポリペプチドとの間にＧＧＧＧＳ（配列番号４５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号４６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号４７）からなる、１つまたは複数のペプチド複製を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域と目的のペプチドまたはポリペプチド領域の間のポリペプチド領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号４５）、ＧＧＮＧＴ（配列番号４６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号４７）の単一複製を含む。リンカーＧＧＮＧＴ（配列番号４６）またはＹＧＮＧＴ（配列番号４７）は、適切な細胞内で発現した場合、グリコシル化され、当該グリコシル化により、溶液中及び／またはインビボ投与時におけるタンパク質の安定化が促される。したがって、ある特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域と目的のタンパク質領域の間にグリコシル化されたリンカーを含む。

【0054】

２０１２年１月２６日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６１／５９１，１６１号及び２０１３年１月２８日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２３４５６（両出願の全体を参照により本明細書に援用する）がＧＤＦ１５ Ｆｃ融合タンパク質について記載している。本発明のある特定の実施形態において、ポリペプチドは、ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインの欠失または置換及び１つまたは複数のＣＨ３界面アミノ酸のスルフヒドリル含有残基、好ましくは、システインとの置換を有する抗体Ｆｃ領域を含み、当該ポリペプチドはＧＤＦ１５ Ｆｃ融合体ではない。より詳細には、ポリペプチドは、ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインの欠失または置換及び１つまたは複数のＣＨ３界面アミノ酸のスルフヒドリル含有残基、好ましくは、システインとの置換を有する抗体Ｆｃ領域を含み、当該ポリペプチドは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２３４５６に記載されている、以下を含むＧＤＦ１５融合タンパク質などのＧＤＦ１５
Ｆｃ融合タンパク質ではない。

【化2】

【0055】

抗体及びＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
抗体重鎖及びＦｃ融合タンパク質をコードする核酸が本発明に包含される。本発明の態様は、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド変異体（例えば、縮重によるもの）を含む。

【0056】

核酸単離のためのプローブ若しくはプライマーまたはデータベース検索のためのクエリー配列として使用される、本明細書に記載のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、当該アミノ酸配列からの「戻し翻訳」により得ることができる。よく知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、抗体重鎖及びＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離及び増幅することができる。組み合わせＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドを５’及び３’プライマーに用いる。これらのオリゴヌクレオチドには、増幅した組み合わせＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入しやすくするために、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を更に含めることができる。ＰＣＲ技術については、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９８９），ｐｐ．１８９－１９６；及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ．ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）に記載されている。

【0057】

本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ並びに対応する相補配列が含まれる。「単離核酸」は、天然源から単離された核酸である場合、その核酸を単離した生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的にまたは化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子またはオリゴヌクレオチドなどの場合、こうした方法から得られる核酸は単離核酸であると解釈される。単離核酸分子は、分離された断片の形態またはより大きな核酸構築物の成分である核酸分子を指す。好ましい一実施形態において、核酸は、内因性汚染物質を実質的に含まない。核酸分子は、その成分であるヌクレオチド配列を標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているものなど）により特定、操作及び回収を行うことができる量または濃度で、かつ実質的に純粋な形態に、少なくとも１回は単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来しているのが好ましい。こうした配列は、好ましくは、真核細胞遺伝子に通常存在する内部非翻訳配列、すなわちイントロンで中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、オープンリーディングフレームの５’または３’側に存在してよく、この場合、これらの配列はコード領域の操作または発現を妨げない。

【0058】

本発明に係る変異体は、通常、重鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により作製され、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発または当該技術分野においてよく知られている技術を用いて、変異体をコードするＤＮＡを作製し、その後本明細書にて概略するように細胞培養にて組み換えＤＮＡを発現させる。しかしながら、確立されている技術を用いて、インビトロ合成により重鎖及びＦｃ融合タンパク質を作製してもよい。変異体は、通常、天然類似体と質的に同じ生物学的活性を示すが、以下に更に詳しく概説するように、特徴を改変した変異体を選択することもできる。

【0059】

当業者であれば理解するように、遺伝子コードの縮重により、極めて多数の核酸であって、これらのすべてが本発明の重鎖及びＦｃ融合タンパク質をコードする核酸を作製できる。したがって、特定のアミノ酸配列が特定されれば、当業者は、コードタンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で、１つまたは複数のコドン配列を単に変更することにより、任意の数の異なる核酸を作製することができる。

【0060】

本発明はまた、少なくとも１つの上記のポリヌクレオチドを含む、プラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態の発現系及び構築物を提供する。更に、本発明は、こうした発現系または構築物を含む宿主細胞を提供する。

【0061】

通常、宿主細胞のいずれかに用いられる発現ベクターは、プラスミド維持のための配列並びに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含む。こうした配列は、ある特定の実施形態では「フランキング配列」と総称され、通常、プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカー要素のヌクレオチド配列のうち１つまたは複数を含む。これらの配列のそれぞれについて以下に考察する。

【0062】

任意で、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、重鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードする配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含んでよく、このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ（配列番号５８）など）、またはＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）若しくはｍｙｃなどの別の「ｔａｇ」をコードしており、これらに対する市販の抗体がある。このタグは、通常、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、宿主細胞からのタンパク質のアフィニティー精製または検出のための手段として機能し得る。アフィニティー精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。任意で、その後、ある特定の切断用ペプチダーゼを用いるなどの各種手段により、精製した重鎖またはＦｃ融合タンパク質からタグを取り除くことができる。

【0063】

フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同種及び／または同系統由来）、異種（すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源からのフランキング配列の組み合わせ）でも、合成でも、天然でもよい。したがって、フランキング配列の供給源は、当該フランキング配列が、宿主細胞機構内で機能でき、かつ当該機構により活性化され得るのであれば、いずれの原核生物若しくは真核生物、いずれの脊椎動物若しくは無脊椎動物またはいずれの植物であってもよい。

【0064】

本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当該技術分野においてよく知られたいくつかの方法のいずれかにより得ることができる。通常、マッピングにより及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化により本明細書にて有用なフランキング配列を事前に特定しておき、当該配列を、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。場合により、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が知られていることもある。この場合、核酸合成またはクローニングについて本明細書に記載した方法を用いて、そのフランキング配列を合成してもよい。

【0065】

既知のフランキング配列が全配列であっても、その一部であっても、フランキング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により並びに／または同種若しくは別種由来のオリゴヌクレオチド及び／若しくはフランキング配列断片などの好適なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。フランキング配列がわからない場合は、例えば、コード配列または更には他の遺伝子を含み得るより大きなＤＮＡ片から、フランキング配列を含むＤＮＡ断片を単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化により適切なＤＮＡ断片を生成し、次いで、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に知られた他の方法を用いることにより単離することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に明らかであろう。

【0066】

複製起点は、通常、市販されている原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞中におけるベクターの増幅を助けるものである。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲーションしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性菌に好適であり、種々のウイルス性起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞でのクローニングベクターに有用である。通常、哺乳動物の発現ベクターには複製起点成分を必要としない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含むという理由でのみ用いられることが多い）。

【0067】

転写終結配列は、通常、ポリペプチドコード領域末端の３’側に位置し、転写を終結させる働きがある。一般に、原核細胞の転写終結配列は、Ｇ－Ｃに富んだ断片であり、後にポリ－Ｔ配列が続く。当該配列はライブラリーから簡単にクローニングでき、またベクターの一部として市販さえもされているが、本明細書に記載の方法のような核酸合成方法を用いて容易に合成することもできる。

【0068】

選択マーカー遺伝子は、選択培地中で増殖する宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞であればアンピシリン、テトラサイクリン若しくはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地若しくは規定培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。具体的な選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核生物及び真核生物のいずれの宿主細胞の選択にも用いることもできる。

【0069】

他の選択遺伝子を用いて、発現させる遺伝子を増幅させてもよい。増幅とは、増殖または細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組み換え細胞の継代の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターのないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体は、ベクター内に存在する選択遺伝子により形質転換体のみが生存するように一意的に適合させた選択圧下に置く。選択圧を加えるには、培地中の選択剤の濃度を連続的に高め、これにより、選択遺伝子と、抗体重鎖またはＦｃ融合タンパク質などの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅がもたらされる条件下で形質転換細胞を培養する。その結果、増幅したＤＮＡから、重鎖またはＦｃ融合タンパク質などの増大した量のポリペプチドが合成される。

【0070】

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）を特徴とする。この要素は、通常、プロモーターの３’側及び発現させるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。ある特定の実施形態において、１つまたは複数のコード領域を内部のリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に機能的に連結させてよく、これにより、単一ＲＮＡ転写物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能になる。

【0071】

真核生物宿主細胞の発現系においてグリコシル化が望まれるような、いくつかの場合、種々のプレまたはプロ配列を操作して、グリコシル化または収量を改善することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更してもよいし、グリコシル化に作用し得るプロ配列を加えてもよい。最終のタンパク質産物は、完全に除去され得なかった、発現に伴う１つまたは複数の付加アミノ酸を（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）－１位に有し得る。例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合したペプチダーゼ切断部位に認められる１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位を用いて、酵素で成熟ポリペプチド内の当該領域を切断すれば、わずかに短縮した型の所望のポリペプチドが生じ得る。

【0072】

本発明の発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、かつ重鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードする分子に機能的に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’側）（通常、約１００～１０００ｂｐ以内）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、誘導的プロモーターと構成的プロモーターの２つのクラスの１つに分類される。誘導的プロモーターは、栄養素の有無または温度変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、プロモーターの制御下でＤＮＡのより高いレベルの転写を開始する。一方、構成的プロモーターは、機能的に連結された遺伝子を一様に翻訳する。すなわち、遺伝子発現に対する制御はほとんどまたは全くない。候補となる種々の宿主細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。

【0073】

酵母宿主との使用に好適なプロモーターもまた当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと一緒に有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞との使用に好適なプロモーターは、よく知られており、限定するものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターなどが挙げられる。

【0074】

対象となり得る更なるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）、ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）、メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター及び制御配列Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）、並びにβ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられるが、これらに限定されない。また、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に用いられている動物転写制御領域として、膵腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）、膵β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ系細胞及びマスト細胞で活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１ ：２６８－２７６）、肝臓で活発なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）、肝臓で活発なα１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）、骨髄細胞で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）、脳内の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）、骨格筋で活性なミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）、並びに視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）も対象となる。

【0075】

高等真核生物による転写を高めるために、エンハンサー配列をベクターに挿入することができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用要素であり、通常約１０～３００ｂｐの長さであり、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、配向及び位置に比較的依存せず、転写ユニットの５’と３’の両側で確認されている。哺乳動物の遺伝子から入手できる複数のエンハンサー配列（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン及びインスリン）が知られている。しかしながら、通常、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において知られている、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが真核生物プロモーターの活性化を増大させる例示的な要素である。エンハンサーは、コード配列の５’側または３’側のいずれかでベクター内に配置され得るが、通常はプロモーターの５’側の位置に置かれる。抗体またはＦｃ融合タンパク質の細胞外分泌を促進するために、適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、タンパク質を産生させる宿主細胞の種類に依存し、天然シグナル配列を異種シグナル配列に置き換えてもよい。哺乳動物宿主細胞で機能するシグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されているインターロイキン－２受容体のシグナル配列、欧州特許第０３６７５６６号に記載に記載されているインターロイキン－４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド、欧州特許第０４６０８４６号に記載されているＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。

【0076】

ベクターは、当該ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれたときに発現を促進する、１つまたは複数の要素を含み得る。例としては、ＥＡＳＥ要素（Ａｌｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１９：１４３３－３８）及びマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造組織化を媒介し、「位置」効果から統合ベクターを保護し得る。したがって、ＭＡＲは、ベクターを用いて安定的な形質導入体を作製するときには特に有用である。いくつかの天然及び合成ＭＡＲ含有核酸が、当該技術分野において、例えば、米国特許第６，２３９，３２８号、同第７，３２６，５６７号、同第６，１７７，６１２号、同第６，３８８，０６６号、同第６，２４５，９７４号、同第７，２５９，０１０号、同第６，０３７，５２５号、同第７，４２２，８７４号、同第７，１２９，０６２号にて知られている。

【0077】

本発明の発現ベクターは、市販されているベクターのような出発ベクターから構築してもよい。こうしたベクターは、所望のフランキング配列をすべて含む場合もあれば、含まない場合もある。本明細書に記載のフランキング配列のうち１つまたは複数がまだベクターに存在していない場合、そのフランキング配列を個別に得て、ベクターにライゲーションしてもよい。フランキング配列のそれぞれを得るのに用いられる方法は、当業者によく知られている。

【0078】

ベクターを構築し、重鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、増幅及び／またはポリペプチド発現のために、完成したベクターを好適な宿主細胞に挿入することができる。選択した宿主細胞への発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランによるトランスフェクションまたは他の既知の技術などのよく知られた方法により行うことができる。選択する方法は、用いる宿主細胞の種類に応じてある程度決まる。これらの方法及び他の好適な方法は、当事者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、上掲）に記載されている。

【0079】

宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、重鎖またはＦｃ融合タンパク質を合成する。この重鎖またはＦｃ融合タンパク質は、その後、培地から回収してもよいし（宿主細胞が培地中に分泌する場合）、産生している宿主細胞から直接回収してもよい（分泌しない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要であるポリペプチド改変（グリコシル化またはリン酸化など）及び生物活性分子への折り畳まれやすさなどの様々な要因に左右される。宿主細胞は、真核生物であっても原核生物であってもよい。

【0080】

発現用の宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、限定するものではないが、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できる不死化細胞株が挙げられ、当該技術分野において知られている発現系にて使用されているいずれの細胞株も本発明の組み換えポリペプチドを作製するために用いることができる。一般に、所望の重鎖またはＦｃ融合体をコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。用いることができる宿主細胞には、原核生物、酵母菌または高等真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または桿菌が挙げられる。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞株ＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び無血清培地中で成長する関連細胞株などの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株及びＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１により記載されているようなアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、一次外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。必要に応じて、種々のシグナルトランスダクションまたはレポーターアッセイでポリペプチドを用いることが望ましい場合、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３またはＳ４９などの哺乳動物細胞株を、ポリペプチドの発現に用いることができる。

【0081】

あるいは、酵母菌などの下等真核生物または細菌などの原核生物でポリペプチドを産生することができる。好適な酵母菌には、サッカロマイセス・セレヴィシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス株、カンジダまたは異種ポリペプチドを発現することができる任意の酵母菌株が挙げられる。好適な細菌株には、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌または異種ポリペプチドを発現することができる任意の細菌株が挙げられる。ポリペプチドが酵母菌または細菌にて生成される場合、機能性ポリペプチドを得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって、産生されるポリペプチドを修飾することが望ましい場合がある。こうした共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を用いて行うことができる。

【0082】

ポリペプチドはまた、本発明の単離核酸を、１つまたは複数の昆虫発現ベクター中の好適な制御配列に機能的に連結し、昆虫発現系を用いることによっても産生することができる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）からキット形態で市販されており、そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）及びＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に記載されているように、当該技術分野においてよく知られている。無細胞翻訳系を採用して、本明細書に開示の核酸構築物に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを産生することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングベクター及び発現ベクターについては、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）によって記載されている。本発明の単離核酸、好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列に機能的に連結された単離核酸を含む宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」である。

【0083】

医薬組成物
本発明のポリペプチドは、安全性の向上及び凝集の低減という特徴により、医薬組成物への配合に特に有用である。当該組成物は、生理学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤などの１つまたは複数の追加成分を含む。任意で、当該組成物は、例えば以下に示すように、１つまたは複数の生理学的に活性な剤を更に含む。種々の特定の実施形態において、当該組成物は、本発明の１つまたは複数の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質に加えて、１、２、３、４、５または６つの生理学的に活性な剤を含む。

【0084】

一実施形態において、医薬組成物は、本発明の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質を、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡ、グルタチオンなどのキレート化剤、安定剤及び賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数の物質とともに含む。中性緩衝食塩水または同種血清アルブミンを混合した食塩水が適切な希釈剤の例である。また、適切な業界基準に従って、ベンジルアルコールなどの保存剤を加えてもよい。組成物は、適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として用いる凍結乾燥物として製剤化することができる。好適な成分は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性である。製剤に用いることができる成分の更なる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．（１９８０） ａｎｄ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに示されている。

【0085】

本発明の１つまたは複数の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質並びにラベルまたは本明細書に考察する状態のいずれかの治療にて使用するための他の説明書を含む、医師が使用するためのキットが提供される。一実施形態において、キットは、１つまたは複数の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質の無菌製剤を含み、これは、上で開示した組成物の形態であってもよいし、１つまたは複数のバイアルであってもよい。

【0086】

投与量及び投与回数は、投与経路、用いられる特定の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質、処置を施す疾患の性質及び重症度、症状が急性であるか慢性であるか、並びに対象の体格及び全身状態などの要素によって変化し得る。適切な用量は、関連技術分野において知られた手順、例えば、用量漸増を伴い得る臨床試験によって決定することができる。

【0087】

本発明の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質は、例えば、ある期間にわたって一定の間隔で、例えば、１回または２回以上、投与することができる。特定の実施形態において、抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質は、１ヶ月以上、例えば、１ヶ月、２ヶ月若しくは３ヶ月に少なくとも１回または無期限投与する。慢性症状を治療するには、長期治療が通常最も効果的である。一方、急性症状を治療するには、短期間投与、例えば１～６週間の投与で十分であり得る。一般に、選択した１つまたは複数の指標に関するベースラインを越えて医学的に関連した改善の程度を患者が呈するまで、抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質を投与する。

【0088】

関連分野において理解されているように、本発明の抗体及び／またはＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物は、適応症に適した方法で対象に投与される。医薬組成物は、任意の好適な技術によって投与することができ、限定するものではないが、非経口的、局所的または吸入による投与が挙げられる。医薬組成物を注入する場合は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注入または連続注入により投与することができる。局所投与、例えば疾患部位または損傷部位での局所投与は、経皮的送達及びインプラントからの持続放出性が企図される。吸入による送達には、例えば、経鼻または経口吸入、ネブライザの使用、エアロゾル形態での抗体及び／若しくはＦｃ融合タンパク質の吸入などが挙げられる。他の代替法には、丸剤、シロップ剤またはトローチ剤などの経口製剤が挙げられる。

【0089】

定義
本明細書中に別途の記載がない限り、本発明に関して用いられる科学技術用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に解される意味を有するものとする。更に、文脈により別途の要求がない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。概して、本明細書にて記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用する専門用語及びこれらの技術は、当該技術分野においてよく知られ、一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、概して、特に指定のない限り、当該技術分野においてよく知られた従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用し論じる種々の一般的かつ具体的な参考文献に記載されている通りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。これらの文献は、参照により本明細書に援用する。酵素反応及び精製技術は、製造業者の説明書に従って、当該技術分野において一般に実施される通りにまたは本明細書の記載通りに実施される。本明細書にて記載する分析化学、有機合成化学及び医薬製薬化学に関連して使用する用語並びにこれらの実験手順及び技術は、当該技術分野においてよく知られ、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤化及び送達並びに患者の処置には標準的な技術を用いることができる。

【0090】

特に指定のない限り、次の用語は次の意味を有するように理解されるものとする。「単離分子」という用語（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体である場合）は、その起源または派生供給源により、（１）天然状態で当該分子に付随する自然会合成分と会合していない分子、（２）同種由来の他の分子を実質的に含まない分子、（３）異種由来の細胞によって発現される分子、または（４）天然には生じない分子である。したがって、化学的に合成した分子または天然起源の細胞とは異なる細胞系内で発現した分子は、その自然会合成分から「単離」されている。分子はまた、当該技術分野においてよく知られた精製技術を用いた分離により、自然会合成分を実質的に含まないものにすることができる。分子の純度または均質性は、当該技術分野においてよく知られた多数の手段により分析することができる。例えば、当該技術分野においてよく知られた技術を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲル染色を用いてポリペプチドを可視化して、ポリペプチド試料の純度を分析してよい。ある特定の目的では、ＨＰＬＣまたは当該技術分野においてよく知られている精製のための他の手段を用いることで、より高い分解能を得ることができる。

【0091】

ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、標準的な１文字または３文字の略記を用いて示す。特に指示のない限り、ポリペプチド配列は、アミノ末端を左側に、カルボキシ末端を右側に有し、一本鎖核酸配列及び二本鎖核酸配列の上鎖は、５’を左側に、３’末端を右側に有する。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列はまた、参照配列とどのように異なるかを説明することにより記載することができる。

【0092】

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はそれぞれ、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然及び人工タンパク質、タンパク質断片並びにタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質、変異体及び融合タンパク質）、並びに翻訳後修飾または別の共有結合的若しくは非共有結合的修飾タンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または多量体であってよい。

【0093】

「ポリペプチド断片」という用語は、本明細書にて使用する場合、対応する完全長タンパク質と比較して、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。断片は、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００の長さのアミノ酸であり得る。断片は、例えば、最大で１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１または１０の長さのアミノ酸であり得る。断片は、その末端のいずれかまたは両方に、１つまたは複数の付加アミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質に由来するアミノ酸配列または人工アミノ酸配列を更に含み得る。

【0094】

本発明のポリペプチドには、何らかの理由により、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性の低減、（２）酸化に対する感受性の低減、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性の変更、（４）結合親和性の変更、及び（４）他の物理化学的性質または機能性の付与または変更のために、任意の方法にて修飾されたポリペプチドが含まれる。類似体には、ポリペプチドの突然変異タンパク質が含まれる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を天然配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン以外のポリペプチド部分）に施すことができる。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変えないものである（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるヘリックスの中断につながるものまたは親配列を特徴付ける若しくはその機能性に必要である他の種類の二次構造の破壊につながるものであってはならない）。当該技術分野にて認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、各文献を参照により本明細書に援用する。

【0095】

ポリペプチドの「変異体」は、アミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列に、別のポリペプチド配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基が挿入、欠失及び／または置換されているアミノ酸配列である。本発明の変異体には、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン変異体を含むものが含まれる。ある特定の実施形態において、変異体は、Ｆｃ分子に存在すると１つまたは複数のＦｃγＲに対するポリペプチドの親和性を向上させる１つまたは複数の突然変異を含む。こうした変異体は、向上した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を示す。こうしたものをもたらす変異体の例は、米国特許第７，３１７，０９１号に記載されている。

【0096】

他の変異体には、ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドのホモ二量体化能を減少させつつ、ヘテロ二量体化能を増加させるものが挙げられる。こうしたＦｃ変異体の例は、米国特許第５，７３１，１６８号及び同第７，１８３，０７６号に記載されている。更なる例は、共同所有の、２００８年１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０１９，５６９号及び２００８年１２月５日出願された同第６１／１２０，３０５号に記載されている（両出願の全体を参照により本明細書に援用する）。

【0097】

ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学的部分、例えば、ポリエチレングリコール、細胞傷害剤、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などへの結合、リン酸化及びグリコシル化を介して化学的に修飾されたポリペプチド（例えば、抗体）である。特に指定のない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖と２つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片及び突然変異タンパク質を含み、それらの例は本明細書に記載される。

【0098】

ＣＨ３ドメイン含有ポリペプチドは、例えば、天然免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンでは、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成され、各対が１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う、約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥという抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖及び重鎖中では、可変領域と定常領域が約１２またはそれ以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた約１０以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域を含んでいる。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を広く参照されたい（本出願において、その全体を参照により援用する）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗原結合部位を形成し、これにより未変性免疫グロブリンは２つの結合部位を有する。

【0099】

天然免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により連結された、同じ一般構造の比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。軽鎖と重鎖はどちらも、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４のドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２，１９９１におけるＫａｂａｔらの定義に従う。未変性抗体には、完全長の重鎖及び軽鎖を有する、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化または完全ヒトが含まれる。

【0100】

抗体は、１つまたは複数の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、その結合部位は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、通常、２つの同一結合部位を有するが、「二重特異性」または「二価」抗体は２つの異なる結合部位を有する。

【0101】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変領域及び定常領域を有するすべての抗体を包含する。一実施形態において、可変ドメイン及び定常ドメインのすべてが、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、様々な方法で作製することができ、その例を以下に示すが、ヒト重鎖及び／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子的に改変したマウスを目的抗原で免疫付与することが挙げられる。ヒト重鎖をコードする１つまたは複数の遺伝子を改変し、Ｓｅｒ３６２変異を含むようにすることができる。当該マウスを抗原で免疫にすると、マウスはＳｅｒ３６４変異を有するヒト抗体を産生する。

【0102】

ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されたとき、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する可能性が小さくなるように、かつ／または比較的軽度の免疫応答が誘導されるように、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失及び／または付加により、非ヒト種に由来する抗体配列とは異なる配列を有する。一実施形態において、ヒト化抗体を産生するために、非ヒト種抗体の重鎖及び／または軽鎖のフレームワーク及び定常ドメイン中の特定のアミノ酸を変異させる。別の実施形態において、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合させる。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号及び同第５，８７７，２９３号に見出すことができる。

【0103】

「キメラ抗体」という用語は、ある抗体に由来する１つまたは複数の領域と、他の抗体に由来する１つまたは複数の領域とを含む抗体を指す。キメラ抗体の一例では、重鎖及び／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、由来するものであり、かつ、鎖の残りの部分が、別の種由来の抗体または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、由来するものである。所望の生物学的活性を示す、こうした抗体の断片もまた含まれる。

【0104】

抗体の断片または類似体は、当業者であれば、本明細書の教示に従い、当該技術分野においてよく知られた技術を用いることにより容易に作製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に見出される。ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列データを公共または私有の配列データベースと比較することにより、構造ドメイン及び機能ドメインを特定することができる。

【0105】

コンピュータ比較法を用いて、既知の構造及び／または機能を持つ他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予想されるタンパク質コンフォメーションドメインを特定することができる。

【0106】

既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を特定するための方法が知られている。例えば、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照されたい。

【0107】

「ＣＤＲグラフト化抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲと、同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークとを含む抗体である。

【0108】

「多重特異性抗体」は、１つまたは複数の抗原上のエピトープを２つ以上認識する抗体である。このタイプの抗体のサブクラスは、「二重特異性抗体」である。

【0109】

２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ １０．３版の一部（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））をデフォルトのパラメーターで用いて、配列を比較することにより決定される。

【0110】

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書全体を通じて区別なく用いられ、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸及び非天然ヌクレオチド類似体）を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体及びこれらのハイブリッドが挙げられる。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよい。一実施形態において、本発明の核酸分子は、抗体またはＦｃ融合体及びその誘導体、突然変異タンパク質または変異体をコードする連続オープンリーディングフレームを含む。

【0111】

２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップ導入なしで、かついずれの配列の５’末端にも３’末端にも不対のヌクレオチドなく、一方のポリヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドが他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと相対するように、２つの配列を逆平行方向にアライメントできる場合、互いに「相補体」である。ポリヌクレオチドは、中程度のストリンジェントな条件下で、２つのポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズできるのであれば、もう１つのポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、もう１つのポリヌクレオチドの相補体でなくても、もう１つのポリヌクレオチドに相補的であり得る。

【0112】

「ベクター」は、連結した別の核酸を、細胞内に導入するために用いることができる核酸である。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、その内部に更なる核酸セグメントをライゲーションできる、直鎖または環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）であり、更なるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に導入することができる。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を誘導できる種類のベクターである。

【0113】

ヌクレオチド配列は、制御配列が当該ヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に作用するのであれば、制御配列に「機能的に連結されて」いる。「制御配列」は、当該制御配列が機能的に連結している核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に作用する核酸である。制御配列は、例えば、制御対象の核酸に対して直接的にまたは１つ若しくは複数の他の分子（例えば、制御配列及び／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その効果を発揮することができる。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列の更なる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ及びＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５－０６に記載されている。

【0114】

「宿主細胞」は、核酸、例えば、本発明の核酸を発現するために用いることができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌であってもよいし、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母菌若しくはは他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ若しくはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞若しくは昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。例示的な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸＢ－１１（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－２０参照）、無血清培地中で増殖するＣＨＯ細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１参照）、ＣＳ－９細胞、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ細胞の誘導体及びＡＭ－１／Ｄ細胞（米国特許第６，２１０，９２４号に記載のもの）を含めたＣＨＯ株の誘導体が挙げられる。他のＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１８６１）及びＵＶ２０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１８６２）が挙げられる。他の宿主細胞の例には、サル腎臓細胞株ＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１参照）、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、一次外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。通常、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクションが可能な培養細胞であり、次いでその核酸が宿主細胞にて発現され得る。

【0115】

「組み換え宿主細胞」という表現は、発現させようとする核酸で形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を指すために用いることができる。宿主細胞はまた、核酸を含むが、制御配列が当該核酸との機能的連結をなすように宿主細胞に導入されない限り、当該核酸を所望のレベルで発現しない細胞であってもよい。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、当該細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。後続世代では、例えば、突然変異または環境的影響に起因して、ある特定の修飾が生じる場合があることから、こうした子孫は事実上親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書で使用する当該用語の範囲内に変わらず含まれる。

【実施例】

【0116】

以下の実施例は、実施した実験及び得られた結果を含め、例示のみを目的に提供するものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。

【0117】

実施例１
システインクランプ構築物の作製
ＣＨＯ－Ｋ１細胞株に適した無血清懸濁液中にて、電荷対（ｄｅｌＨｉｎｇｅ）システインクランプＦｃ配列を有するペプチド融合体を安定的に発現させた。Ｆｃ融合分子をピューロマイシン耐性を有する安定発現ベクターにクローニングし、一方、Ｆｃ鎖はハイグロマイシン含有発現ベクターにクローニングした（Ｓｅｌｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．）。リポフェクタミンＬＴＸを１：１の割合で用いてプラスミドをトランスフェクトし、トランスフェクションから２日後にピューロマイシン１０μｇ／ｍＬ及びハイグロマイシン６００μｇ／ｍＬを含む成長培地で細胞を選択した。選択中、培地を週２回交換した。細胞が約９０％の生存率に達したとき、流加連続生産にスケールアップした。産生培地中に細胞を１ｅ６／ｍＬで播種し、３日、６日及び８日目に流加した。細胞により産生させた馴化培地（ＣＭ）を１０日目に回収し、清澄した。エンドポイント生存率は、概して９０％を上回った。

【0118】

Ｆｃ融合体清澄馴化培地を、２段階クロマトグラフィー法を用いて精製した。約５ＬのＣＭを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて事前に平衡化したＧＥ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムに直接加えた。結合タンパク質を３回の洗浄ステップにかけた（１回目は３カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳ、次に１ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．４、最後に３ＣＶの５００ｍＭ Ｌ－アルギニン、ｐＨ７．５）。この洗浄ステップにより、結合していないまたはわずかにしか結合していない培地成分及び宿主細胞不純物が除去される。次いで、再度、カラムを５ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化し、ＵＶ吸光度をベースラインに戻した。所望のタンパク質をｐＨ３．６の１００ｍＭ 酢酸で溶出し、大量に回収した。このタンパク質プールを１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）を用いて５．０～５．５のｐＨ範囲内になるように素早く滴定した。

【0119】

次に、ｐＨ調整タンパク質プールを、ｐＨ６．０の２０ｍＭ ＭＥＳを用いて事前に平衡化したＧＥ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムに装填した。その後、結合タンパク質を５ＣＶの平衡緩衝液で洗浄し、最後に、２０ＣＶ、０～５０％の直線勾配、２０ｍＭ ＭＥＳ中０～４００ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）により溶出した。溶出中に画分を回収して分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）により分析し、均質産物のプールに適切な画分を特定した。ＳＰ ＨＰクロマトグラフィーにより、遊離Ｆｃ、クリップされた化学種及びＦｃ－ＧＤＦ１５多量体などの産物関連不純物が除去される。

【0120】

次いで、ＳＰ ＨＰプールを透析により製剤緩衝液へと緩衝液交換を行った。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０の１０キロダルトン分子量カットオフの遠心分離装置を用いて、約１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最後に、滅菌濾過し、得られた精製Ｆｃ融合分子を含む溶液を５℃で保存する。質量スペクトル分析、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィーを用いて、最終産物の識別及び純度について分析した。

【0121】

実施例２
システインクランプ構築物の分析
ジスルフィド結合形成
上記の通り、ヒンジ領域を欠き、かつＬ３５１Ｃ変異を有するＦｃ融合タンパク質を発現させ、精製した。

【0122】

試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。異なる分子量を有する構築物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で異なる移動度を有する。これにより結合鎖の特定が容易になる。図３において、最後のレーンは、ジスルフィド結合が切断される還元条件に対応し、その他のレーンは、精製プロセスによる各種画分の非還元条件に対応する。非還元条件下では、ジスルフィドがそのまま保たれている。非還元条件下ではより高いバンドが観察され、ＣＨ３ドメインにて２つのＦｃ鎖の間にジスルフィド結合を介した共有結合の導入が確かに形成されたことが示されている。また、図３の最後のレーンから、還元条件下では、操作したジスルフィドが予想された通りに切断され、２つのバンドがもたらされたことが示されている。

【0123】

薬物動態分析
ヒンジ領域を欠く６つのＦｃ融合タンパク質構築物（Ａ～Ｆ）を比較した。
Ａ．ヒンジを欠き、かつ治療用ペプチドとＦｃの間にリンカーを有さないＦｃ融合体。
Ｂ．Ａと同様であるが、治療用ペプチド内に変異を有するＦｃ融合体。
Ｃ．Ｂと同様であるが、グリコシル化していないリンカーがＦｃと治療用ペプチドとを連結しているＦｃ融合体。
Ｄ．Ｃと同様であるが、異なるリンカーを有するＦｃ融合体。
Ｅ．Ａと同様であるが、一方のＦｃ鎖がＹ３４９Ｃ置換を含み、他方がＳ３５４Ｃ置換を含むＦｃ融合体。
Ｆ．Ｂと同様であるが、一方のＦｃ鎖がＹ３４９Ｃ置換を含み、他方がＳ３５４Ｃ置換を含むＦｃ融合体。

【0124】

オスの食餌誘発性肥満ＣＤ－１マウス（１試験物あたりｎ＝３）に試験物を１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈を介して静脈投与した。投与後１、４、８、２４、７２、１６８、２４０及び３３６時間の時点で、連続血液試料（各時点５０μＬ）を各動物から採取した。捕捉と検出のための抗試験物抗体を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、血清試料中の試験物濃度を定量化した。アッセイの定量下限値は３１３μｇ／Ｌであった。濃度－時間プロファイルをプロットし、Ｗａｔｓｏｎを用いてＰＫパラメーターを算出するためにノンコンパートメント分析を実施した。

【0125】

図４に示すように、６つの試験変異体のうち、システインクランプ変異体であるＥ及びＦは、全身クリアランスが最も小さく、それに対応して曝露が最も高かった（濃度－時間曲線下面積ＡＵＣとして表示）。Ｅはシステインクランプのない型のＡよりもＡＵＣが３倍を超えて大きく、一方、ＦはＢと比較して１．６倍のＡＵＣ改善を示した。したがって、ジスルフィド結合をＣＨ３界面に導入することにより、ヒンジ領域を欠くＦｃ融合タンパク質の薬物動態が有意に改善した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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