特許 7346640 抗免疫チェックポイントナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-08

(45)【発行日】2023-09-19

(54)【発明の名称】抗免疫チェックポイントナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230911BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230911BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230911BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230911BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230911BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230911BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230911BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230911BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C07K16/46

C07K16/28

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P37/02

G01N33/53 D

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2022046598

(22)【出願日】2022-03-23

(65)【公開番号】P2022151799

(43)【公開日】2022-10-07

【審査請求日】2022-03-23

(31)【優先権主張番号】63/165,274

(32)【優先日】2021-03-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/692,701

(32)【優先日】2022-03-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516144245

【氏名又は名称】中國醫藥大學附設醫院

【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ

(74)【代理人】

【識別番号】110002066

【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】周 徳陽

(72)【発明者】

【氏名】邱 紹智

(72)【発明者】

【氏名】黄 士維

(72)【発明者】

【氏名】潘 志明

(72)【発明者】

【氏名】陳 美智

(72)【発明者】

【氏名】林 育全

(72)【発明者】

【氏名】陳 曄

【審査官】中根 知大

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５３１０３９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する抗免疫チェックポイントナノボディであって、
配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、
抗免疫チェックポイントナノボディ。

【請求項2】

ＰＤ－Ｌ１と前記ＰＤ－Ｌ１の受容体との相互作用を遮断し、
前記受容体は、プログラム細胞死タンパク質－１（programmed cell death protein-1、ＰＤ－１）であることを特徴とする、
請求項１に記載の抗免疫チェックポイントナノボディ。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の抗免疫チェックポイントナノボディのアミノ酸配列をコードする単離された核酸であって、
配列番号４又は配列番号６に示されるヌクレオチド配列からなることを特徴とする、
単離された核酸。

【請求項4】

請求項１又は２に記載の抗免疫チェックポイントナノボディ、及び医薬上許容可能な担体を含むことを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項5】

がんを治療するための医薬品を製造するための請求項１又は２に記載の抗免疫チェックポイントナノボディの使用。

【請求項6】

サンプルに請求項１又は２に記載の抗免疫チェックポイントナノボディを添加することを含む、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出するための方法であって、
前記サンプルは、血液、尿液、痰液、唾液又は体液であることを特徴とする、
ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出するための方法。

【請求項7】

請求項１又は２に記載の抗免疫チェックポイントナノボディと、
フラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region、Fc region）と、を含む抗体共役物であって、
前記抗免疫チェックポイントナノボディは、前記フラグメント結晶化可能領域に共役されることを特徴とする、
抗体共役物。

【請求項8】

請求項１又は２に記載の抗免疫チェックポイントナノボディと、
第２の抗体と、を含む抗体共役物であって、
前記抗免疫チェックポイントナノボディは、前記第２の抗体に共役されることにより、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は、任意の二重特異性抗体を形成することを特徴とする、
抗体共役物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗免疫チェックポイントナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは、悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞の分裂・増殖の制御機能不全による疾患であり、細胞が異常に増殖し、また、異常増殖した細胞が体の他の部分に侵入可能である。世界中でがん患者がどんどん増加しており、台湾でも死因トップ１０の１つであり、かつ、長年に死因トップ１０の１位を占めている。

【0003】

従来の腫瘍治療方法は、外科手術、放射線療法、化学療法及び標的療法等が挙げられる。腫瘍免疫治療は、上記の治療法以外の腫瘍を治療する方法であり、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞又は腫瘍抗原物質を利用して生体の特異的細胞性免疫及び体液性免疫反応を誘導し、生体の抗がん能力を高め、腫瘍の成長、拡散、再発を抑制することで、腫瘍の除去又は制御という目的を達成することができる。しかしながら、現在の腫瘍治療方法は、効果が低く、副作用が強いという問題があり、他の免疫関連疾患を引き起こすことさえ可能性がある。

【0004】

プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１）は、様々な固形腫瘍の細胞の表面に大量に発見されるため、腫瘍を特定する標的分子として用いられ、抗がん剤として利用する可能性が検討されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記の問題を解決するために、当業者は、がん及び免疫関連疾患をより効果的に治療することができる新規な医薬品を研究開発している。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記を鑑み、本発明は、プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand1、ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する抗免疫チェックポイントナノボディを提供することを目的とする。前記抗免疫チェックポイントナノボディは、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、大腸菌（E.coli）菌株ＨＢ２１５１から生成及び精製される。

【0007】

本発明の１つの実施例において、前記アミノ酸配列は、前記抗免疫チェックポイントナノボディの重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）のアミノ酸配列である。

【0008】

本発明の１つの実施例において、前記抗免疫チェックポイントナノボディは、フラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region、Fc region）に共役される。

【0009】

本発明の１つの実施例において、前記抗免疫チェックポイントナノボディは、第２の抗体に共役されることにより、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成する。

【0010】

本発明の１つの実施例において、前記抗免疫チェックポイントナノボディは、前記ＰＤ－Ｌ１と前記ＰＤ－Ｌ１の受容体との相互作用及び／又は結合を遮断する。

【0011】

本発明の１つの実施例において、前記受容体は、プログラム細胞死タンパク質－１（programmed cell death protein-1、ＰＤ－１）である。

【0012】

また、本発明のもう１つの目的は、前記抗免疫チェックポイントナノボディのアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供することである。前記単離された核酸は、配列番号４又は配列番号６に示されるヌクレオチド配列からなる。

【0013】

また、本発明のもう１つの目的は、前記抗免疫チェックポイントナノボディ及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供することである。

【0014】

また、本発明のもう１つの目的は、がんを治療するための医薬品を製造するための前記抗免疫チェックポイントナノボディの使用を提供することである。

【0015】

また、本発明のもう１つの目的は、サンプルに前記抗免疫チェックポイントナノボディを投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出するための方法を提供することである。

【0016】

本発明の１つの実施例において、前記サンプルは、血液、尿液、痰液、唾液、又は体液である。

【発明の効果】

【0017】

上記をまとめると、本発明の抗免疫チェックポイントナノボディの効果は、以下の通りである。

【0018】

表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ binding assay）により、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがそれぞれ０.２７及び０.４１nM以内のＫ_D値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に有効に結合することを証明し、
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Blockade Bioassay kit）によるＰＤ－Ｌ１ナノボディのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の軸遮断（axis blockade）の測定により、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがＰＤ－Ｌ１、ＡＰＣ／ＰＤ－１エフェクター共培養系においてＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の信号伝達を遮断すること、及び、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがγδＴ細胞で誘導された腫瘍細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対する細胞毒性を向上させることを証明し、
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがＰＤ－Ｌ１に結合した後に、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）誘導性Ｔ細胞増殖を回復することを証明し、及び、
フローサイトメトリー及び免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析により、ＰＤＬ－１ナノボディが細胞サンプル中のＰＤ－Ｌ１の発現を検出するために用いられることを証明する。

【0019】

上記の効果によれば、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成することができる。特に、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の抗免疫チェックポイントナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。なお、本発明によれば、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出できる効果も達成することができる。

【0020】

以下、本発明の実施形態についてさらに説明する。下記の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、改良や変更することができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲を基準とすべきである。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析の結果を示す。ｃｌｏｎｅは、クローン株を示し、ｎｂは、ナノボディを示し、ＲＵは、応答ユニット（response unit）、即ちＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質（Sino Biological、Cat:10084-H05H）が塗布されたＣＭ５チップを示す。

【図2】ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Blockade Bioassay kit）による抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の軸遮断（axis blockade）の測定結果を示す。cloneは、クローン株を示し、ＰＤ－Ｌ１ ｎｂは、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを示す。アテゾリズマブ（Atezolizumab）は、尿路上皮がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん、小細胞肺がん及び肝細胞がんを治療するためのＩｇＧ１アイソタイプ完全ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である。

【図3】抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＴ細胞増殖の分析結果を示す。^**は、ｐ＜０.０１を示し、^***は、ｐ＜０.００１を示す。

【図4】抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するγδＴ（ＧＤＴ）細胞誘導性細胞毒性の向上効果を示す。一番左の群は、いずれの抗体を併用していない純粋なγδＴ細胞処理群を示す。^*は、ｐ＜０.０５を示し、^**は、ｐ＜０.０１を示す。

【図5】抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の結果を示す。矢印は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の位置、即ち分子量が市販の抗体と一致する位置を示す。使用される細胞株は、非小細胞肺がん細胞株Ｈ１９７５（NCI-H1975 [H-1975、H1975]、ATCC）である。ｍＡｂは、モノクローナル抗体を示し、Ｎｂは、ナノボディを示す。市販の抗体は、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（66248-1-Ig、Proteintech）である。市販抗体群の一次抗体は、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（１:２５００）であり、二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（anti-rabbit-horseradish peroxidase、anti-Rab-HRP）（１:１００００）である。実験群の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの濃度は、１ng/mlであり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１００００）である。

【図6】図６Ａ及び図６Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのフローサイトメトリーの結果を示す。図６Ａの（ａ）において、ｎｂは、ナノボディを示し、Ａｂは、抗体を示し、ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）を示す。図６Ａの（ｂ）において、ｍＡｂは、モノクローナル抗体を示し、Ｈ１９７５は、一種類の非小細胞肺がん細胞株であり、Alexa Fluor 488-Hは、４８８nmのレーザー光で励起される明るい緑色の蛍光色素である。図６Ｂの（ａ）において、Ａ５４９は、ヒト非小細胞肺がん細胞株である。図６Ｂの（ｂ）において、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ヒト乳がん細胞株である。

【図7】抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの免疫細胞化学の分析結果を示す。Ｈ１９７５は、一種類の非小細胞肺がん細胞株であり、ｃｌｏｎｅは、クローン株を示し、抗ＰＤＬ－１ナノボディの濃度は、１ng/mlであり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－フルオレセイン（fluorescein、ＦＩＴＣ）（１:５０００）であり、ｐａｎ－カドヘリン（pan-cadherin）は、一種類の細胞膜マーカーである。ｐａｎ－カドヘリン及びＰＤ－Ｌ１の共局在は、特異的ナノボディによって膜結合型（membrane bound）のＰＤ－Ｌ１を検出することを説明するために用いられる。

【発明を実施するための形態】

【0022】

定義
本明細書に記載の数値は、概算値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいは±１０％、より好ましくは±５％の範囲を示す。

【0023】

本明細書において、「抗プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１）ナノボディ（nanobody、ＮＢ）」及び「抗免疫チェックポイントナノボディ」という用語は、相互交換可能に使用される。

【0024】

本明細書において、「第２の抗体」という用語は、ナノボディに共役されることにより、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成することができる抗体を意味する。好ましくは、前記第２の抗体は、抗ＣＤ３ε、ＣＤ３、ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）、プログラム細胞死リガンド２（programmed cell death ligand 2、ＰＤ－Ｌ２）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3、Ｔｉｍ３）、表皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ヒト表皮成長因子受容体２（human epidermal growth factor receptor 2、Ｈｅｒ２）、Ｂ細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen、ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１６、Ｆｃ、上皮細胞接着分子（epithelial cell adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、メソテリン（mesothelin)、ニューヨーク食道扁平上皮細胞がん-1(New York esophageal squamous cell carcinoma-1、ＮＹ－ＥＳＯ－１）、糖タンパク質１００（glycoprotein 100、ｇｐ１００）、及びムチン１（Ｍｕｃ１）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

本明細書において、「治療（treating又はtreatment）」という用語は、疾患（disease）又は障害（disorder）の１つ又は複数の臨床徴候（clinical sign）を緩和（alleviating）、減少（reducing）、改善（ameliorating）、軽減（relieving）、又は制御（controlling）すること、及び、治療中の病態（condition）又は症状（symptom）の重症度（severity）の進展（progression）を低下（lowering）、停止（stopping）又は逆転（reversing）させることを意味する。

【0026】

本発明に係る医薬品は、通常の知識に基づいて、非経口（parenterally）投与の剤形（dosage form）に製造されてもよい。前記非経口投与の剤形は、例えば、注射剤（injection）（例えば、滅菌水溶液（sterile aqueous solution）又は分散液（dispersion）、滅菌粉末（sterile powder）、錠剤（tablet）、トローチ剤（troche）、ロゼンジ剤（lozenge）、丸薬（pill）、カプセル（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）又は顆粒（granule）、溶液、懸濁液（suspension）、乳剤（emulsion）、シロップ（syrup）、エリキシル剤（elixir）、スラリー剤（slurry）及び類似のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0027】

本発明に係る医薬品は、非経口経路（parenteral routes）で投与してもよい。前記非経口経路は、腹腔内注射（intraperitoneal injection）、皮下注射（subcutaneous injection）、表皮内注射（intraepidermal injection）、皮内注射（intradermal injection）、筋肉内注射（intramuscular injection）、静脈内注射（intravenous injection）及び病巣内注射（intralesional injection）からなる群から選ばれる。

【0028】

本発明に係る医薬品は、医薬上許容可能な担体を含んでもよい。前記医薬上許容可能な担体は、例えば、溶剤（solvent）、乳化剤（emulsifier）、懸濁化剤（suspending agent）、分解剤（decomposer）、結合剤（binding agent）、賦形剤（excipient）、安定剤（stabilizing agent）、キレート剤（chelating agent）、希釈剤（diluent）、ゲル化剤（gelling agent）、防腐剤（preservative）、滑剤（lubricant）、吸収遅延剤（absorption delaying agent）、リポソーム（liposome）及び類似のものからなる群から選ばれる１つ又は複数の試薬を含んでもよい。前記試薬の選用及び数量は、当業者の専門知識及び技術的範囲に属する。

【0029】

本発明に係る前記医薬上許容可能な担体は、溶剤を含んでもよい。前記溶剤は、水、生理食塩水（normal saline）、リン酸塩緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）、糖含有溶液、アルコール含有水溶液（aqueous solution containing alcohol）、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0030】

本明細書において、「核酸」、「核酸配列」又は「核酸フラグメント」等の用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド配列又はリボヌクレオチド配列を意味し、かつ、既知の天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）又は人工の化学的模倣物を含む。本明細書において、「核酸」という用語は、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」と相互交換可能に使用される。

【実施例】

【0031】

実施例１．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの製造
本実施例において、抗プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１）ナノボディ（nanobody、ＮＢ）の製造プロセスは、以下の通りである。

【0032】

重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）の生成プロセスは、以下の通りである。

【0033】

ＶＨＨ遺伝子は、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ａｍｐ耐性）又はｐＳＢ－ｉｎｉｔ（ＣｍＲ耐性）に構築され、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化及び配列決定によって同定される。１μLの同定されたプラスミド（約５０ng）をＢＬ２１（ＤＥ３）に添加し、３７℃で一晩作用させる。耐性含有ＬＢ培地に単一コロニーを接種し、３７℃、２２０r/minで一晩培養する。

【0034】

一晩培養したものを１:１００の比例で新鮮な耐性含有ＬＢ培地（１０Ｌ～２０Ｌ）に接種し、３７℃、２２０r/minで培養する。ＯＤ₆₀₀が０.８に達すと、室温まで冷却する。最終濃度が０.１mMであるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside、ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃、２２０r/minで一晩誘導する。遠心分離（２０mM Tris ｐＨ８.０、１５０mM NaCl）によって細胞を破壊した後、細胞及び上清が得られる。

【0035】

フロースルー（flow-through）によって上清をＮｉ－ＮＴＡビーズ（１mL）に結合させる。適切な濃度勾配を有するイミダゾール（imidazole）（１０mM、２０mM、５０mM、１００mM、２５０mM、及び５００mM）を含有する緩衝液によって洗浄してＮｉ－ＮＴＡビーズを溶出する。溶出部分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。タンパク質の純度と収量（イオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィー）に基づいて後の精製方法を決める。要件を満たすタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーで単離精製し、緩衝液をＰＢＳ緩衝液に置換する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の成分を分析し、要件を満たす成分を合併濃縮し、０.２２μmのフィルターで濾過して容器に詰める。その後、タンパク質を－２０℃以下で保存する。

【0036】

ナノボディは、大腸菌（E.coli）から生成及び精製される。ナノボディを生成するための大腸菌の生成方法として、文献Microb Cell Fact. 2019 Mar 11、18(1):47を参照することができる。要するに、大腸菌株ＨＢ２１５１を利用する。アンピシリン（ampicillin）耐性をコードするプラスミドｐＥＴ（Creative Biolab）は、細胞質タンパク質の生成に用いられる。

【0037】

ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１多重特異性ナノボディのプラスミドで新たに形質転換された大腸菌ＨＢ２１５１を５０μg/mLのアンピシリンを含有する培地５mLに接種し、３７℃で一晩培養する。その後、１mLの前記培養物を１００mLの培地に接種し、３７℃で成長させる。一晩培養した後、１００mLの培養物ごとにEnPresso Booster錠剤２枚及び追加のグルコース放出酵素（０.６ U/L）を添加すると共に、１mMのＩＰＴＧを添加し、組換えナノボディのタンパク質を２４時間誘導発現させる。

【0038】

そして、培養物を回収して氷上で５分間冷却した後に、６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。上清を除去した後に、大容量Ｍｙｃ－ｔａｇ結合樹脂を用いて、細胞ペレットを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（immobilized metal affinity chromatography、ＩＭＡＣ）によって精製する。メーカー（Clontech Laboratories）の操作手順に従って、自然条件下でグラビティフロー式クロマトグラフィー（gravity-flow-based chromatography）を行う。

【0039】

２００mgの細菌細胞ペレットごとに１mLのｘＴｒａｃｔｏｒ細胞溶解緩衝液（Clontech Laboratories）を添加し、ＥＤＴＡを含有しないプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒoche Diagnostics）、及び２５Ｕのエンドヌクレアーゼ（Thermo Scientific Pierce）を追加することで、細胞溶解を有効に行うことができる。氷上で１５分間作用させ、１０,０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して細胞破片を除去した後、上清を１mLの樹脂を充填したグラビティフローカラムに添加し、室温で３０分間作用させる。

【0040】

３００mMのイミダゾールを含有する溶出緩衝液を添加することによってナノボディを溶出する前に、カラムを２０及び４０ｍＭのイミダゾールで２回洗浄する。分子量カットオフが３．５～５kDaであるセルロースエステル膜（cellulose ester membrane）（Spectrum^(R) Laboratories）を用いて、ＰＢＳに対して透析を行うことにより、イミダゾールを除去して緩衝液を置換する。

【0041】

抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの各クローン株の相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）のアライメント（alignment）及びアミノ酸配列は、表１に示されている。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１のアミノ酸配列は、配列番号１である。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１４のアミノ酸配列は、配列番号２である。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃６７のアミノ酸配列は、配列番号３である。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４である。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５である。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃６７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６である。

【0042】

【表1】

【0043】

実施例２．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ binding assay）の結果
本実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、SPR binding assay）の操作手順は、以下の通りである。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（Biacore-GE Healthcare、Piscataway、ＮＪ）により、ＣＭ５又はＮＴＡチップをＳＰＲ分析する。

【0044】

つまり、１０mMの緩衝溶液（ｐＨが４.０、５.５又は６.０）中に、２０μg/mLの濃度範囲でタンパク質（ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質）サンプルを希釈することにより、最大の表面が得られ、チップに固定させるために保留される。表面製造プロセスに従ってリガンド（ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ１多重特異性ナノボディ、２５、１２.５、６.２５、３.１２５、１.５６２５及び０.７８１２５nM）を選択してチップに塗布する。

【0045】

そして、再生条件検討実験（regeneration scouting）及び表面性能試験（surface performance test）を行った後、再生方法を選択して実験を実行する。そして、結合分析（ＢＩＮＤＩＮＧＡＮＡＬＹＳＩＳ）及び直接結合（ＤＩＲＥＣＴ ＢＩＮＤＩＮＧ）を選択してタンパク質の結合を解析する。動力学的分析（ＫＩＮＥＴＩＣ ＡＮＡＬＹＳＩＳ）及び物質移動（ＭＡＳＳ ＴＲＡＮＳＦＥＲ）を選択し、実験と結合した動力学的分析を行う。その後、データの分析及び動力学的定数の確定を行う。

【0046】

図１Ａ～図１Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析の結果を示している。ｃｌｏｎｅは、クローン株を示し、ｎｂは、ナノボディを示し、ＲＵは、応答ユニット（response unit）を示す。図１Ａ～図１Ｂから分かるように、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディは、それぞれ０.２７及び０.４１nM以内のＫ_D値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に有効に結合することができる
実施例３．ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Blockade Bioassay kit）による抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の軸遮断（axis blockade）の測定
本実施例において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Blockade Bioassay kit）による抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の軸遮断（axis blockade）の測定の操作手順は、以下の通りである。１×１０⁴のＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９６ウェルプレートに接種し、一晩静置する。翌日、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を含有するウェルに１×１０⁴のＰＤ－１エフェクター細胞を添加する。

【0047】

その後、異なる濃度を有する抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ（クローン株＃１又はクローン株＃６７）又はアテゾリズマブ（Atezolizumab）（尿路上皮がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん、小細胞肺がん及び肝細胞がんを治療するためのＩｇＧ１アイソタイプ完全ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体）を添加する。６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^TM試薬を添加し、ＧｌｏＭａｘ^(R) Ｄｉｓｃｏｖｅｒシステムによって発光を測定し、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアを利用してデータを４ＰＬ曲線にフィッティングする。

【0048】

図２には、本実施例の結果を示している。ｃｌｏｎｅは、クローン株を示し、アテゾリズマブ（Atezolizumab）は、尿路上皮がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳がん、小細胞肺がん及び肝細胞がんを治療するためのＩｇＧ１アイソタイプ完全ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である。図２から分かるように、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１及び＃６７は、ＰＤ－Ｌ１、ＡＰＣ／ＰＤ－１エフェクター共培養系においてＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の信号伝達を遮断する。

【0049】

実施例４．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＴ細胞増殖分析（T cell proliferation assay）の結果
本実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＴ細胞（即ち、末梢血単核細胞）増殖分析（T cell(i.e.、peripheral blood mononuclear cell、PBMC)proliferation assay）の操作手順は、以下の通りである。

【0050】

１×１０⁶のＰＢＭＣ細胞を１２ウェルプレートに接種する。組換えヒトＰＤ－Ｌ１（１０μg/ml、Sino Biological、Cat. 10084-H05H）は、存在しても存在しなくてもよい。そして、１μg/mlの抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ（クローン株＃１又はクローン株＃６７）を添加する。７日後、総細胞数を記録し、ＦＩＴＣ共役ＣＤ３モノクローナル抗体（Cat#11-0037-42）によって染色する。そして、フローサイトメトリーによって分析する。ＣＤ３陽性細胞の数は、ＣＤ３細胞パーセンテージ（％）×総細胞数である。ＣＤ３モノクローナル抗体単独群を１００％とする。

【0051】

図３には、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＴ細胞増殖分析の結果を示している。^**は、ｐ＜０.０１を示し、^***は、ｐ＜０.００１を示す。図３から分かるように、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１及び＃６７は、γδＴ細胞で誘導された腫瘍細胞（MDA-MB-231）に対する細胞毒性を向上させる。

【0052】

実施例５．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するgamma delta T（ＧＤＴ）誘導性細胞毒性の向上効果の評価
本実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から購入）に対するγδＴ（ＧＤＴ）誘導性細胞毒性の向上の実験操作手順は、以下の通りである。エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）として、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells、ＰＢＭＣｓ）、ナチュラルキラー細胞、又はγδＴ細胞を使用する。

【0053】

標的細胞（腫瘍細胞株）及びエフェクター細胞を特定の効果／標的（Ｅ:Ｔ）比率（１:１から５０:１まで）で、３７℃で２４～７２時間共培養する。生／死細胞の活性分析について、共培養の前に、全ての腫瘍細胞を緑色蛍光カルセイン－ＡＭ（green-fluorescent calcein-AM）によって染色し、そして、共培養した後に、死細胞を赤色蛍光エチジウムホモ二量体－１（red-fluorescent ethidium homodimer-1）によって染色する。メーカーの取扱説明書（Thermo Fisher Scientific）によると、死腫瘍細胞は、緑色蛍光＋／赤色蛍光＋細胞である。細胞死滅率は、総細胞群のパーセンテージとして表示される。

【0054】

一次γδＴ細胞の増殖の操作手順は、以下の通りである。ゾレドロン酸（zoledronic acid）（５μM）と１０００IU/mlのＩＬ－２とを含有し、かつ１０％の多血小板血漿（platelet-rich plasma、ＰＲＰ）を追加してなるＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Lonza、Basel、Switzerland）に、ヒトＰＢＭＣｓ（１×１０⁷）を２周培養する。細胞数を記録し、蛍光共役ＣＤ３、Ｖγ９、Ｖδ２及びＮＫＧ２Ｄ抗体を使用し、フローサイトメトリーによって純度と効力を測定する。

【0055】

一次ナチュラルキラー細胞の増殖の操作手順は、以下の通りである。メーカーの取扱説明書（STEMCELL Technologies Vancouver Canada）に従って、ネガティブセレクションキットを用いてＰＢＭＣｓからヒトナチュラルキラー細胞を単離する。ＣＤ３５５、ＣＤ２抗体（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ）、及び５００IU/mlのＩＬ－２（PeproTech、Rocky Hill、ＵＳＡ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Lonza、Basel、Switzerland）に、ナチュラルキラー細胞を３週間培養し、かつ１０％の多血小板血漿（ＰＲＰ）を追加する。細胞数を記録し、フローサイトメトリーによって純度を測定する。ナチュラルキラー細胞として、蛍光共役ＣＤ５６及びＣＤ１６抗体を使用する。

【0056】

１×１０⁵のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩静置する。翌日、MDA-MB-231細胞を含有するウェルに３×１０⁵の一次γδＴ細胞を添加する。そして、１μg/mlの抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ（クローン株＃１又はクローン株＃６７）又は１０μg/mlのアテゾリズマブを添加する。４８時間後、生／死細胞が媒介する細胞毒性分析により、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する一次γδＴ細胞の特異的溶解をフローサイトメトリーによって確定する。

【0057】

図４には、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するγδＴ（ＧＤＴ）誘導性細胞毒性の向上の結果を示している。一番左の群は、いずれの抗体を併用していない純粋なγδＴ細胞処理群を示す。^*は、ｐ＜０.０５を示し、^**は、ｐ＜０.０１を示す。本実施例の結果から分かるように、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディは、γδＴ細胞で誘導された腫瘍細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対する細胞毒性を向上させることができる。

【0058】

実施例６．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の結果
本実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の操作手順は、以下の通りである。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰＲＯ－ＰＲＥＰタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ、台北、台湾）から細胞を取り、４℃で１５分間激しく振とうした後、遠心分離をする。上清を回収し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＢＣＡ試薬（Bio-Rad Hercules、CA、ＵＳＡ）を使用してタンパク質の濃度を測定する。３０μgの各サンプルのライセートをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングする。ＴＢＳＴブロッキング剤に５％のＢＳＡを添加し、メンブレン及び一次抗体（ＴＢＳＴに溶解された）を４℃下で一晩作用させる。

【0059】

そして、４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ（Upstate、Billerica、ＭＡ、ＵＳＡ）で２時間作用させる。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、転写物とSuperSignal West Pico ECL試薬（Pierce Biotechnology、Rockford、ＩＬ、ＵＳＡ）とを一緒に１分間作用させ、そして、Kodak-X-Omatフィルムへの曝露によって化学発光を検出する。

【0060】

図５には、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのウエスタンブロッティングの分析結果を示している。矢印は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の位置、即ち分子量が市販の抗体と一致する位置を示す。使用される細胞株は、非小細胞肺がん細胞株Ｈ１９７５（NCI-H1975 [H-1975、H1975]、ＡＴＣＣ）である。ｍＡｂは、モノクローナル抗体を示し、Ｎｂは、ナノボディを示す。市販の抗体は、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（66248-1-Ig、Proteintech）である。市販抗体群の一次抗体は、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（１:２５００）であり、二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（anti-rabbit-horseradish peroxidase、anti-Rab-HRP）（１:１００００）である。実験群の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの濃度は、１ng/mlであり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１００００）である。本実施例の結果から分かるように、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディクローン株＃１及び＃６７は、ＰＤ－Ｌ１に結合した後に、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）誘導性Ｔ細胞の増殖を回復する。

【0061】

実施例７．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の結果
本実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の操作手順は、以下の通りである。抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ（１ng/ml）について、Fastlinkフルオレセインマーカーキット（Abnova）を用いてＦＩＴＣフルオレセインによって前染色を行う。プロセスは、操作手順書に従って行う。ＦＩＴＣ共役ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（１:５００、BD Pharmingen、クローン株MIH1、Cat.:558065）又はＦＩＴＣ共役抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ（１ng/ml）によってＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ａ５４９又はＨ１９７５細胞を染色する。前記染色は、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで４５分間行う。ＰＢＳで洗浄した後、ＦＬ１チャネルを使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析する。

【0062】

図６Ａ及び図６Ｂには、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのフローサイトメトリーの分析結果を示している。図６Ａの（ａ）において、ｎｂは、ナノボディを示し、Ａｂは、抗体を示し、ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）を示す。図６Ａの（ｂ）において、ｍＡｂは、モノクローナル抗体を示し、Ｈ１９７５は、非小細胞肺がん細胞株であり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－Ｈは、４８８nmのレーザー光で励起される明るい緑色の蛍光色素である。図６Ｂの（ａ）において、Ａ５４９は、ヒト非小細胞肺がん細胞株である。図６Ｂの（ｂ）において、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ヒト乳がん細胞株である。本実施例の結果から分かるように、フローサイトメトリーの分析により、抗ＰＤＬ－１ナノボディクローン株＃１（ルシフェリンで標識された）は、細胞サンプル中のＰＤ－Ｌ１の発現を検出するために用いられる。

【0063】

実施例８．抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析結果
本実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析の操作手順は、以下の通りである。腫瘍細胞（１×１０⁵）を６ウェルプレートのスライドガラスに接種し、一晩培養する。特定の処理を行った後、細胞を１％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）に固定し、ＰＢＳで洗浄し、０.５％のＢＳＡを含有するＰＢＳに０.１％ Triton X-100を使用して３０分間透過化させ、２％のＢＳＡでブロッキングし、特異的抗体（２％のＢＳＡ／０.０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に混合された）と作用させる。

【0064】

洗浄した後、細胞とフルオレセイン共役二次抗体とを一緒に作用させる。ＰＢＳＴで洗浄し、退色剤及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、ＤＡＰＩ）を含有する水溶性の封入剤で封入する。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８ Ｘ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）によって画像を分析する。

【0065】

図７には、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの免疫細胞化学の分析結果を示している。Ｈ１９７５は、一種類の非小細胞肺がん細胞株であり、ｃｌｏｎｅは、クローン株を示し、抗ＰＤＬ－１ナノボディの濃度は、１ng/mlであり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－フルオレセイン（fluorescein、ＦＩＴＣ）（１:５０００）であり、ｐａｎ－カドヘリン（ｐａｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）は、一種類の細胞膜マーカーである。ｐａｎ－カドヘリン及びＰＤ－Ｌ１の共局在は、特異的ナノボディによって膜結合型（membrane bound）のＰＤ－Ｌ１を検出することを説明するために用いられる。本実施例の結果から分かるように、抗ＰＤＬ－１ナノボディクローン株＃１は、細胞サンプル中のＰＤ－Ｌ１の発現を検出するために用いられる。

【0066】

上記をまとめると、本発明の抗免疫チェックポイントナノボディ（即ち、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）の効果は、以下の通りである。

【0067】

表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ binding assay）により、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがそれぞれ０.２７及び０.４１nM以内のＫ_D値でＰＤ－Ｌ１タンパク質に有効に結合することを証明し、
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Blockade Bioassay kit）によるＰＤ－Ｌ１ナノボディのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の軸遮断（axis blockade)の測定により、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがＰＤ－Ｌ１、ＡＰＣ／ＰＤ－１エフェクター共培養系においてＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の信号伝達を遮断すること、及び、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがγδＴ細胞で誘導された腫瘍細胞（MDA-MB-231）に対する細胞毒性を向上させることを証明し、
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディがＰＤ－Ｌ１に結合した後に、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）誘導性Ｔ細胞増殖を回復することを証明し、及び、
フローサイトメトリー及び免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析により、ＰＤＬ－１ナノボディが細胞サンプル中のＰＤ－Ｌ１の発現の検出するために用いられることを証明する。

【0068】

上記効果によれば、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成することができる。特に、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の抗免疫チェックポイントナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。なお、本発明によれば、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを検出できる効果も達成することができる。

【0069】

上記の内容は、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない改良や変更は、いずれも添付の特許請求の範囲に含まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【配列表】

0007346640000001.app