特許 7346641 抗Ｔ細胞ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-08

(45)【発行日】2023-09-19

(54)【発明の名称】抗Ｔ細胞ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20230911BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230911BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230911BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230911BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230911BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230911BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20230911BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61P35/00

A61P37/04

G01N33/53 D

G01N33/577 B

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2022046629

(22)【出願日】2022-03-23

(65)【公開番号】P2022151802

(43)【公開日】2022-10-07

【審査請求日】2022-03-23

(31)【優先権主張番号】63/165,191

(32)【優先日】2021-03-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/698,567

(32)【優先日】2022-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516144245

【氏名又は名称】中國醫藥大學附設醫院

【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ

(74)【代理人】

【識別番号】110002066

【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】周 徳陽

(72)【発明者】

【氏名】邱 紹智

(72)【発明者】

【氏名】黄 士維

(72)【発明者】

【氏名】潘 志明

(72)【発明者】

【氏名】陳 美智

(72)【発明者】

【氏名】林 育全

(72)【発明者】

【氏名】陳 曄

【審査官】大久保 元浩

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５１５１０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０４８３１８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Molecular Immunology，2020年，118，174-181

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ３ε（ＣＤ３ epsilon）に特異的に結合する抗Ｔ細胞ナノボディであって、
配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示されたアミノ酸配列を含み、
前記配列番号１に示されたアミノ酸配列は、相補性決定領域１（complementarity determining region 1、ＣＤＲ１）であり、前記配列番号２に示されたアミノ酸配列は、ＣＤＲ２であり、前記配列番号３に示されたアミノ酸配列は、ＣＤＲ３であることを特徴とする、
抗Ｔ細胞ナノボディ。

【請求項2】

請求項１に記載の抗Ｔ細胞ナノボディのアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、
単離された核酸。

【請求項3】

請求項１に記載の抗Ｔ細胞ナノボディ、及び医薬上許容可能な担体を含むことを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項4】

がんの治療、免疫調節及び免疫細胞の活性化のための医薬品を製造するための請求項１に記載の抗Ｔ細胞ナノボディの使用。

【請求項5】

サンプルに請求項１に記載の抗Ｔ細胞ナノボディを添加することを含むＣＤ３εの発現レベルを検出するための方法であって、
前記サンプルは、血液、尿液、痰液、唾液、又は体液であることを特徴とする、
ＣＤ３εの発現レベルを検出するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗Ｔ細胞ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

がんは、悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞の分裂・増殖の制御機能不全による疾患であり、細胞が異常に増殖し、また、異常増殖した細胞が体の他の部分に侵入可能である。世界中でがん患者がどんどん増加しており、台湾でも死因トップ１０の１つであり、かつ、長年に死因トップ１０の１位を占めている。

【0003】

従来の腫瘍治療方法は、外科手術、放射線療法、化学療法及び標的療法等が挙げられる。腫瘍免疫治療は、上記の治療法以外の腫瘍を治療する方法であり、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞又は腫瘍抗原物質を利用して生体の特異的細胞性免疫及び体液性免疫反応を誘導し、生体の抗がん能力を高め、腫瘍の成長、拡散、再発を抑制することで、腫瘍の除去又は制御という目的を達成することができる。しかしながら、現在の腫瘍治療方法は、効果が低く、副作用が強いという問題があり、他の免疫関連疾患を引き起こすことさえ可能性がある。

【0004】

ＣＤ３ε(CD3 epsilon）は、Ｔ細胞上に発見された膜貫通型タンパク質であり、腫瘍及び免疫機能の調節との関連性があるため、腫瘍の特定及び免疫機能の調節のための標的分子として用いられ、抗がん剤又は免疫調節剤として利用する可能性が検討されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記の問題を解決するために、当業者は、がんの治療、免疫調節、及び免疫細胞の活性化をより効果的にする新規な医薬品を研究開発している。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記を鑑み、本発明は、ＣＤ３ε(CD3 epsilon）に特異的に結合するＴ細胞ナノボディを提供することを目的とする。前記抗Ｔ細胞ナノボディは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及びそれらの任意の結合からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

【0007】

本発明の１つの実施例において、前記アミノ酸配列は、前記抗Ｔ細胞ナノボディの重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）のアミノ酸配列である。

【0008】

本発明の１つの実施例において、前記抗Ｔ細胞ナノボディは、フラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region、Fc region）をさらに含む。

【0009】

本発明の１つの実施例において、前記抗Ｔ細胞ナノボディを第２の抗体に結合することで、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成する。

【0010】

本発明の１つの実施例において、前記抗Ｔ細胞ナノボディは、ＣＤ３ε陽性細胞を活性化及び／又は凝集させる。

【0011】

また、本発明のもう１つの目的は、前記抗Ｔ細胞ナノボディのアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供することである。前記単離された核酸は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及びそれらの任意の結合からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。

【0012】

また、本発明のもう１つの目的は、前記抗Ｔ細胞ナノボディ及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供することである。

【0013】

また、本発明のもう１つの目的は、がんの治療、免疫調節及び免疫細胞の活性化のための医薬品を製造するための前記抗Ｔ細胞ナノボディの使用を提供することである。

【0014】

また、本発明のもう１つの目的は、サンプルに前記抗Ｔ細胞ナノボディを投与することを含む、ＣＤ３εの発現レベルを検出するための方法を提供することである。

【0015】

本発明の１つの実施例において、前記サンプルは、血液、尿液、痰液、唾液、体液、腫瘍、臓器、組織又は細胞である。

【発明の効果】

【0016】

上記をまとめると、本発明の抗Ｔ細胞ナノボディの効果は、以下の通りである。

【0017】

Ｔ細胞（即ち、末梢血単核細胞）の増殖及び活性化アッセイ（T cell(i.e. peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ) proliferation and activation assay）により、抗ＣＤ３εナノボディがＴ細胞のクラスター増殖及び活性化を促進させ、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を向上させ、γδＴ（ＧＤＴ）細胞におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を向上させることを証明し、
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＣＤ３εナノボディがヒトＴ細胞の細胞溶解物中のＣＤ３εタンパク質を特定できることを証明し、
免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）及びフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）により、抗ＣＤ３εナノボディがフローサイトメトリーによって細胞サンプルにおけるＣＤ３εの発現を検出できることを証明し、
表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ binding assay）により、抗ＣＤ３εナノボディが０.５０５６nM以内のＫ_D値でＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に有効に結合することを証明し、及び、
免疫細胞化学の分析により、抗ＣＤ３εナノボディが細胞サンプルにおけるＣＤ３εの発現を検出するために用いられることを証明する。

【0018】

上記効果によれば、がんの治療、免疫調節及び免疫細胞の活性化の効果を達成することができる。特に、本発明の抗Ｔ細胞ナノボディは、免疫功能の調節及び免疫細胞の活性化という役割を果たす。かつ、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の抗Ｔ細胞ナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。なお、本発明によれば、ＣＤ３εの発現レベルを検出できる効果も達成することができる。

【0019】

以下、本発明の実施形態についてさらに説明する。下記の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、改良や変更することができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲を基準とすべきである。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、抗ＣＤ３εナノボディのＴ細胞（即ち、末梢血単核細胞）の増殖及び活性化の分析（T cell(i.e. peripheral blood mononuclear cell、PBMC) proliferation and activation assay）の結果を示す。

【図2】図２Ａ～図２Ｃは、抗ＣＤ３εナノボディによるＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖効果の評価結果を示す。ＣＤ３ｅ ｎｂは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、Vehicleは、ベクターを示す。

【図3】図３Ａ～図３Ｄは、抗ＣＤ３εナノボディによるgamma delta T（ＧＤＴ）細胞におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖効果の評価結果を示す。ＣＤ３ｅ ｎｂは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、^*は、ｐ＜０.０５を示し、^**は、ｐ＜０.０１を示し、^***は、ｐ＜０.００１を示す。

【図4】抗ＣＤ３εナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の結果を示す。上段の数字は、Ｔ細胞のタンパク質溶解物（protein lysate）の量（μg）を示す。（ａ）において、抗ＣＤ３抗体である従来の抗体#ab135372を使用し、一次抗体の濃度は、１０μg/ml（１:１０００）であり、二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）（１:１０００）である。（ｂ）において、抗ＣＤ３εナノボディ（即ち、重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）ナノボディ）を使用し、一次抗体の濃度は、１μg/ml（１:１０００）であり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１０００）である。

【図5】抗ＣＤ３εナノボディの免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）の結果を示す。ＣＤ３ｅ ｎｂは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、ＳＰ７は、従来の抗ＣＤ３抗体である。

【図6】抗ＣＤ３εナノボディのフローサイトメトリーの分析結果を示す。（ａ）において、ＦＳＣ－Ａは、前方散乱領域（forward scatter area）を示し、ＳＳＣ－Ａは、側方散乱領域（side scatter area）を示し、ｆｃｓは、フローサイトメトリー標準（flow cytometry standard）を示す。（ｂ）において、Alexa Fluor 488-Aは、４８８ｎｍのレーザー光で励起される明るい緑色の蛍光染料である。

【図7】ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に対する抗ＣＤ３εナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析（SPR binding assay）の結果を示す。分析濃度は、６２.５nM、３１.２５nM、１５.６２５nM、７.８１２５nM、３.９０６２５nM、１.９５３nMであり、結合時間（association time）は、１２０秒であり、解離時間（dissociation time）は、６００秒である。Ｋｄ:５.０５６×１０^-10＝０.５０５６nMである。ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体組換えタンパク質（ACROBiosystems、Cat:CDD-H52W1）が塗布されたＮＴＡチップを使用する。

【図8】抗ＣＤ３εナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析結果を示す。抗ＣＤ３εナノボディの濃度は、１ng/mlであり、ＳＰ７は、従来の抗ＣＤ３抗体（１:５００、ＭＡ１－９０５８２、Invitrogen）であり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－フルオレセイン（fluorescein、ＦＩＴＣ）（１:５０００）である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

定義
本明細書に記載の数値は、概算値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいは±１０％、より好ましくは±５％を示す。

【0022】

本明細書において、「第２の抗体」という用語は、ナノボディに共役されることにより、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成できる抗体を意味する。

【0023】

好ましくは、前記第２の抗体は、プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死リガンド２（programmed cell death ligand 2、ＰＤ－Ｌ２）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3、Ｔｉｍ３）、表皮成長因子受容体（EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR、ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ヒト表皮成長因子受容体２（human epidermal growth factor receptor 2、Ｈｅｒ２）、Ｂ細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen、ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）、上皮細胞接着分子（epithelial cell adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、メソテリン（mesothelin）、ニューヨーク食道扁平上皮細胞がん－１（New York esophageal squamous cell carcinoma-1、ＮＹ－ＥＳＯ－１）、糖タンパク質１００（glycoprotein 100、ｇｐ１００）、及びムチン１（Ｍｕｃ１）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本明細書において、「ＣＤ３ｅ」及び「ＣＤ３ε」という用語は、相互交換可能に使用される。

【0025】

本明細書において、「ＣＤ３ｅナノボディ」、「ＣＤ３ｅ ｎｂ」、「ＣＤ３ｅ Ｎｂ」、「ＣＤ３ｅ nanobody」、「抗ＣＤ３εナノボディ」及び「抗Ｔ細胞ナノボディ」という用語は、相互交換可能に使用される。

【0026】

本明細書において、「治療（treating又はtreatment）」という用語は、疾患（disease）又は障害（disorder）の１つ又は複数の臨床徴候（clinical sign）を緩和（alleviating）、減少（reducing）、改善（ameliorating）、軽減（relieving）、又は制御（controlling）すること、及び、治療中の病態（condition）又は症状（symptom）の重症度（severity）の進展（progression）を低下（lowering）、停止（stopping）又は逆転（reversing）させることを意味する。

【0027】

本発明に係る医薬品は、通常の知識に基づいて、非経口（parenterally）投与の剤形（dosage form）に製造されてもよい。前記非経口投与の剤形は、例えば、注射剤（injection）（例えば、滅菌水溶液（sterile aqueous solution）又は分散液（dispersion））、滅菌粉末（sterile powder）、錠剤（tablet）、トローチ剤（troche）、ロゼンジ剤（lozenge）、丸薬（pill）、カプセル（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）又は顆粒（granule）、溶液、懸濁液（suspension）、乳剤（emulsion）、シロップ（syrup）、エリキシル剤（elixir）、スラリー剤（slurry）及び類似のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

本発明に係る医薬品は、非経口経路（parenteral routes）で投与してもよい。前記非経口経路は、腹腔内注射（intraperitoneal injection）、皮下注射（subcutaneous injection）、表皮内注射（intraepidermal injection）、皮内注射（intradermal injection）、筋肉内注射（intramuscular injection）、静脈内注射（intravenous injection）及び病巣内注射（intralesional injection）からなる群から選ばれる。

【0029】

本発明に係る医薬品は、医薬上許容可能な担体を含んでもよい。前記医薬上許容可能な担体は、例えば、溶剤（solvent）、乳化剤（emulsifier）、懸濁化剤（suspending agent）、分解剤（decomposer）、結合剤（binding agent）、賦形剤（excipient）、安定剤（stabilizing agent）、キレート剤（chelating agent）、希釈剤（diluent）、ゲル化剤（gelling agent）、防腐剤（preservative）、滑剤（lubricant）、吸収遅延剤（absorption delaying agent）、リポソーム（liposome）及び類似のものからなる群から選ばれる１つ又は複数の試薬を含んでもよい。前記試薬の選用及び数量は、当業者の専門知識及び技術的範囲に属する。

【0030】

本発明に係る前記医薬上許容可能な担体は、溶剤を含んでもよい。前記溶剤は、水、生理食塩水（normal saline）、リン酸塩緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）、糖含有溶液、アルコール含有水溶液（aqueous solution containing alcohol）、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0031】

本明細書において、「核酸」、「核酸配列」又は「核酸フラグメント」等の用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド配列又はリボヌクレオチド配列を意味し、かつ、既知の天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）又は人工の化学的模倣物を含む。本明細書において、「核酸」という用語は、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」と相互交換可能に使用される。

【実施例】

【0032】

実施例１．抗ＣＤ３εナノボディの製造
本実施例において、抗ＣＤ３ε（ＣＤ３ epsilon）ナノボディ（nanobody、ＮＢ）、及び重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）の製造プロセスは、以下の通りである。

【0033】

重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）の生成プロセスは、以下の通りである。ＶＨＨ遺伝子は、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ａｍｐ耐性）又はｐＳＢ－ｉｎｉｔ（ＣｍＲ耐性）に構築され、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化及び配列決定によって同定される。１μLの同定されたプラスミド（約５０ng）をＢＬ２１（ＤＥ３）に添加し、３７℃で一晩作用させる。

【0034】

耐性含有ＬＢ培地に単一コロニーを接種し、３７℃、２２０r/minで一晩培養する。一晩培養したものを１:１００の比例で新鮮な耐性含有ＬＢ培地（１０Ｌ～２０Ｌ）に接種し、３７℃、２２０r/minで培養する。ＯＤ₆₀₀が０.８に達すと、室温まで冷却する。最終濃度が０.１mMであるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside、ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃、２２０r/minで一晩誘導する。

【0035】

遠心分離（２０mM Tris ｐＨ８.０、１５０mM NaCl）によって細胞を破壊した後、細胞及び上清が得られる。フロースルー（flow-through）によって上清をＮｉ－ＮＴＡビーズ（1mL）に結合させる。適切な濃度勾配を有するイミダゾール（imidazole）（１０mM、２０mM、５０mM、１００mM、２５０mM、及び５００mM）を含有する緩衝液によって洗浄してＮｉ－ＮＴＡビーズを溶出する。溶出部分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。

【0036】

タンパク質の純度と収量（イオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィー）に基づいて後の精製方法を決める。要件を満たすタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーで単離精製し、緩衝液をＰＢＳ緩衝液に置換する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の成分を分析し、要件を満たす成分を合併濃縮し、０.２２μmのフィルターで濾過して容器に詰める。その後、タンパク質を－２０℃以下で保存する。

【0037】

ナノボディは、大腸菌（E.coli）から生成及び精製される。ナノボディを生成するための大腸菌の生成方法として、文献Microb Cell Fact. 2019 Mar 11、18(1):47を参照することができる。要するに、大腸菌株ＨＢ２１５１を利用する。アンピシリン（ampicillin）耐性をコードするプラスミドｐＥＴ（Creative Biolab）は、細胞質タンパク質の生成に用いられる。ｐＥＴ－ＨＬＡ－Ｇ又はＰＤ－Ｌ１多重特異性ナノボディのプラスミドで新たに形質転換された大腸菌ＨＢ２１５１を５０μg/mLのアンピシリンを含有する培地５mLに接種し、３７℃で一晩培養する。

【0038】

その後、１mLの前記培養物を１００mLの培地に接種し、３７℃で成長させる。一晩培養した後、１００mLの培養物ごとにEnPresso Booster錠剤２枚及び追加のグルコース放出酵素（０.６ U/L）を添加すると共に、１mMのＩＰＴＧを添加し、組換えナノボディのタンパク質を２４時間誘導発現させる。そして、培養物を回収して氷上で５分間冷却した後に、６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。上清を除去した後に、大容量Ｍｙｃ－ｔａｇ結合樹脂を用いて、細胞ペレットを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（immobilized metal affinity chromatography、ＩＭＡＣ）によって精製する。

【0039】

メーカー（Clontech Laboratories）の操作手順に従って、自然条件下でグラビティフロー式クロマトグラフィー（gravity-flow-based chromatography）を行う。２００mgの細菌細胞ペレットごとに１mLのxTractor細胞溶解緩衝液（Clontech Laboratories）を添加し、ＥＤＴＡを含有しないプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics）、及び２５Ｕのエンドヌクレアーゼ（Thermo Scientific Pierce）を追加することで、細胞溶解を有効に行うことができる。

【0040】

氷上で１５分間作用させ、１０,０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して細胞破片を除去した後、上清を１mLの樹脂を充填したグラビティフローカラムに添加し、室温で３０分間作用させる。３００mMのイミダゾールを含有する溶出緩衝液を添加することによってナノボディを溶出する前に、カラムを２０及び４０mMのイミダゾールで２回洗浄する。分子量カットオフが３.５～５kDaであるセルロースエステル膜（cellulose ester membrane）（Spectrum^(R) Laboratories）を用いて、ＰＢＳに対して透析を行うことにより、イミダゾールを除去して緩衝液を置換する。

【0041】

ＣＤ３ε ＶＨＨは、ＨｕＳｄＬ^(R)ヒトシングルドメイン抗体ライブラリー（human single domain antibody library）（Creative Biolabs）から生成する。要するに、ＣＤ３ε抗原による結合、洗浄、溶出して４回パンニング（panning）を行う。その後、クローン株１００個を選択し、ファージ酵素結合免疫吸着測定法（enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）によって陽性モノクローナルファージを選択する。陽性クローン株をサンガー法（Sanger method）によって配列決定し、ナノボディの配列が得られる。

【0042】

ＤＮＡシーケンシングを行ったクローン株は、表１に示されている。

【0043】

【表1】

【0044】

クローン株＃２ファージミド（phagemid）をサンガー法（Sanger method）によって配列決定し、全てのＤＮＡ配列をコンピューターシミュレーションによって対応するコードアミノ酸に翻訳する。その後、クローン株＃２のＤＮＡ及び対応するＣＤＲアミノ酸がナノボディファージミドクローン株のアミノ酸配列と全て同じであるため、クローン株＃２を選択する。抗ＣＤ３εナノボディのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、及び配列番号３である。ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４、配列番号５、及び配列番号６である。

【0045】

そして、クローン株＃２に対して、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、competitive ＥＬＩＳＡ）を行う。その操作手順は、以下の通りである。大腸菌にてクローン株＃２ファージミドを増幅させ、上清を収集する。ＣＤ３ε組換えタンパク質（０.２μg）をコーティングして洗浄した後、各ウェルに２５０μｌのクローン株＃２ファージ含有ＴＢ培地、模擬ＴＢ培地、及びＰＢＳ対照群を添加する。

【0046】

翌日、上清を除去し、ＰＢＳＴで洗浄した後に、抗Ｍ１３ファージ西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）共役二次抗体と２時間作用させる。洗浄した後、ＴＭＢ基質（ＨＲＰの活性を検出するため）（５０μl）を添加し、ＥＬＩＳＡリーダーにより、４５０nmチャネルを使用してシグナルを測定する。結果を表２に示す。

【0047】

【表2】

【0048】

実施例２．抗ＣＤ３εナノボディによるＴ細胞の増殖及び活性化の分析結果
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディのＴ細胞（即ち、末梢血単核細胞）の増殖及び活性化の分析（T cell(i.e. peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ) proliferation and activation assay）の操作手順は、以下の通りである。１×１０⁶のＰＢＭＣ細胞を１２ウェルプレートに接種する。抗ＣＤ３εナノボディ（１μg/ml）又は臨床用ＣＤ３εモノクローナル抗体ＯＫＴ３（１０mg/ml、Invitrogen、Cat:MA1-10175）は、存在しても存在しなくてもよい。

【0049】

そして、５０IU/mlのＩＬ－２及び２μg/mlのＩＬ－１５（Sino Biological、Cat No:10360-H07E）を添加する。５日又は７日後、総細胞数を記録し、ＦＩＴＣ共役ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３、11-0037-42、eBioscience）によって染色する。そして、フローサイトメトリーによって分析する。写真は、４０倍の顕微鏡で撮影した画像である。ＣＤ３陽性細胞の数は、ＣＤ３細胞パーセンテージ（％）×総細胞数である。

【0050】

図１Ａ及び図１Ｂには、抗ＣＤ３εナノボディのＴ細胞（即ち、末梢血単核細胞）の増殖及び活性化の分析結果を示している。図１Ａ及び図１Ｂから分かるように、本発明の抗ＣＤ３εナノボディは、Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進させることができる。

【0051】

実施例３．抗ＣＤ３εナノボディによるＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖の向上効果の評価
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディによるＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖の向上効果の評価の操作手順は、以下の通りである。１×１０⁶のＰＢＭＣ細胞を１２ウェルプレートに接種する。抗ＣＤ３εナノボディ（１０、１００、１０００、５０００ng/ml）は、存在しても存在しなくてもよい。

【0052】

そして、５０IU/mlのＩＬ－２（Gibco、PHC0021）及び２μg/mlのＩＬ－１５（Sino Biological、Cat No:10360-H07E）を添加する。３日又は７日後、総細胞数を記録し、ＦＩＴＣ共役ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３、11-0037-42、eBioscience）によって染色する。そして、
フローサイトメトリーによって分析する。写真は、４０倍の顕微鏡で撮影した画像である。ＣＤ３陽性細胞の数は、ＣＤ３細胞パーセンテージ（％）×総細胞数である。

【0053】

図２Ａ～図２Ｃには、抗ＣＤ３εナノボディによるＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖の向上効果の評価結果を示している。ＣＤ３ｅ ｎｂは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、Vehicleは、ベクターを示す。図２Ａ～図２Ｃから分かるように、抗ＣＤ３εナノボディは、クラスター形成（cluster formation）の方式でＰＢＭＣｓにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を顕著に刺激する。

【0054】

実施例４．抗ＣＤ３εナノボディによるγδＴ（ＧＤＴ）細胞におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖の向上効果の評価
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディによるγδＴ（ＧＤＴ）細胞におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖の向上効果の評価の操作手順は、以下の通りである。１×１０⁶の一次γδＴ（ＧＤＴ）細胞を１２ウェルプレートに接種する。ＣＤ３εナノボディ（１０、１００、１０００、５０００ng/ml）は、存在しても存在しなくてもよい。

【0055】

そして、５０IU/mlのＩＬ－２（Gibco、PHC0021）及び２μg/mlのＩＬ－１５（Sino Biological、Cat No:10360-H07E）を添加する。３日又は７日後、総細胞数を記録し、ＦＩＴＣ共役ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３、11-0037-42、eBioscience）によって染色する。そして、フローサイトメトリーによって分析する。写真は、４０倍の顕微鏡で撮影した画像である。ＣＤ３陽性ＧＤＴ細胞の数は、ＣＤ３ ＧＤＴ細胞パーセンテージ（％）×総細胞数である。

【0056】

図３Ａ～図３Ｄには、抗ＣＤ３εナノボディによるgamma delta T（ＧＤＴ）細胞におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖の向上効果の評価結果を示している。ＣＤ３ｅ ｎｂは、抗ＣＤ３εナノボディを示す。本実施例の結果から分かるように、抗ＣＤ３εナノボディは、用量依存的にγδＴ細胞の増殖を有効に向上させることができる。

【0057】

実施例５．抗ＣＤ３εナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の結果
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の操作手順は、以下の通りである。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰＲＯ－ＰＲＥＰタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ、台北、台湾）から細胞を取り、４℃で１５分間激しく振とうした後、遠心分離をする。上清を回収し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＢＣＡ試薬（Bio-Rad Hercules、CA、ＵＳＡ）を使用してタンパク質の濃度を測定する。

【0058】

３０μgの各サンプルのライセートをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングする。ＴＢＳＴブロッキング剤に５％のＢＳＡを添加し、メンブレン及び一次抗体（ＴＢＳＴに溶解された）を４℃下で一晩作用させる。

【0059】

そして、４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ（Upstate、Billerica、ＭＡ、ＵＳＡ）で２時間作用させる。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、転写物とSuperSignal West Pico ECL試薬（Pierce Biotechnology、Rockford、ＩＬ、ＵＳＡ）とを一緒に１分間作用させ、そして、Kodak-X-Omatフィルムへの曝露によって化学発光を検出する。

【0060】

図４には、抗ＣＤ３εナノボディのウエスタンブロッティングの結果を示している。上段の数字は、Ｔ細胞のタンパク質溶解物（protein lysate）の量（μg）を示す。

【0061】

（ａ）において、抗ＣＤ３抗体である従来の抗体#ab135372を使用し、一次抗体の濃度は、１０μg/ml（１:１０００）であり、二次抗体は、抗ウサギＨＲＰ（１:１０００）である。

【0062】

（ｂ）において、抗ＣＤ３εナノボディ（即ち、重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）ナノボディ）を使用し、一次抗体の濃度は、１μg/ml（１:１０００）であり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１０００）である。本実施例の結果から分かるように、ウエスタンブロッティングにより、抗ＣＤ３εナノボディは、ヒトＴ細胞の細胞溶解物中のＣＤ３εタンパク質を特定することができる。

【0063】

実施例６．抗ＣＤ３εナノボディの免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）の結果
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディの免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）の操作手順は、以下の通りである。

【0064】

ヒトＰＢＭＣサンプルを１０％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋する。切片（厚さ＝３μm）をヘマトキシリン及びエオジンによって染色する。免疫組織化学分野において、９９℃のマイクロ波によって抗原賦活化（antigen retrieval）を行う。切片をＨ₂Ｏ₂で洗浄して１５分間作用させることにより、内因性ペルオキシダーゼを遮断する。そして、５％のＢＳＡに３０分間浸漬し、切片及び一次抗体を４℃で一晩作用させる。

【0065】

そして、切片を希釈したビオチン共役二次抗体で、室温で２時間又は４℃で一晩作用させる。最後に、切片と重合物とを一緒に室温で１０分間作用させ、ジアミノベンジジン（diaminobenzidine、ＤＡＢ）（西洋ワサビペルオキシダーゼの最も感度が高く、最も使用される発色反応物）によって染色し、さらに、ヘマトキシリン及びエオジンによって染色し、中性ゴムで固定する。染色の定量化は、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本）によって４０倍及び４００倍の倍率でそれぞれ行う。

【0066】

図５には、抗ＣＤ３εナノボディの免疫組織化学的染色の結果を示している。ＣＤ３ｅ ｎｂは、抗ＣＤ３εナノボディを示し、ＳＰ７は、従来の抗ＣＤ３抗体である。本実施例の結果から分かるように、抗ＣＤ３εナノボディは、免疫組織化学的染色によってＣＤ３εの発現を検出するために用いられる。

【0067】

実施例７．抗ＣＤ３εナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の結果
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の操作手順は、以下の通りである。ヒトＰＢＭＣを氷上でＦＩＴＣ共役ＣＤ３εナノボディ（１μg/ml）及びＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）（１０μg/ml）によって４５分間染色する。洗浄した後、ＦＬ１チャネルを使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析する。

【0068】

図６には、抗ＣＤ３εナノボディのフローサイトメトリーの分析結果を示している。（ａ）において、ＦＳＣ－Ａは、前方散乱領域（forward scatter area）を示し、ＳＳＣ－Ａは、側方散乱領域（side scatter area）を示し、ｆｃｓは、フローサイトメトリー標準（flow cytometry standard）を示す。（ｂ）において、Alexa Fluor 488-Aは、４８８nmのレーザー光で励起される明るい緑色の蛍光染料である。図６から分かるように、抗ＣＤ３εナノボディは、フローサイトメトリーによって細胞サンプルにおけるＣＤ３εの発現を検出することができる。

【0069】

実施例８．ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に対する抗ＣＤ３εナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲbinding assay）の結果
本実施例において、ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に対する抗ＣＤ３εナノボディ表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲbinding assay）の操作手順は、以下の通りである。

【0070】

ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（Biacore-GE Healthcare、Piscataway、ＮＪ）により、ＣＭ５又はＮＴＡチップをＳＰＲ分析する。つまり、１０mMの緩衝溶液（ｐＨが４.０、５.５又は６.０）中に、２０μg/mLの濃度範囲でタンパク質（ＣＤ３ε／ＣＤ３δ組換えタンパク質）サンプルを希釈することにより、最大の表面が得られ、チップに固定させるために保留される。

【0071】

表面製造プロセスに従ってリガンド（ＣＤ３ε又はＣＤ３ε多重特異性ナノボディ、２５、１２.５、６.２５、３.１２５、１.５６２５及び０.７８１２５nM）選択してチップに塗布する。そして、再生条件検討実験（regeneration scouting）及び表面性能試験（surface performance test）を行った後、再生方法を選択して実験を実行する。

【0072】

そして、結合分析（BINDINGANALYSIS）及び直接結合（DIRECT BINDING）を選択してタンパク質の結合を解析する。動力学的分析（KINETIC ANALYSIS）及び物質移動（ＭＡＳＳ ＴＲＡＮＳＦＥＲ）を選択し、実験と結合した動力学的分析を行う。その後、データの分析及び動力学的定数の確定を行う。

【0073】

図７には、ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に対する抗ＣＤ３εナノボディの表面プラズモン共鳴結合分析（SPR binding assay）の結果を示している。分析濃度は、６２.５nM、３１.２５nM、１５.６２５nM、７.８１２５nM、３.９０６２５nM、１.９５３nMであり、結合時間（association time）は、１２０秒であり、解離時間（dissociation time）は、６００秒であり、Ｋｄは、５.０５６×１０^-10＝０.５０５６ｎＭである。ＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体重組タンパク質（ACROBiosystems、Cat:CDD-H52W1）が塗布されたＮＴＡチップを使用する。図７から分かるように、抗ＣＤ３εナノボディは、０．５０５６以内のＫ_Ｄ値でＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に有効に結合することができる。

【0074】

実施例９．抗ＣＤ３εナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析結果
本実施例において、抗ＣＤ３εナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析の操作手順は、以下の通りである。

【0075】

細胞（１×１０⁵）を６ウェルプレートのスライドガラスに接種し、一晩培養する。特定の処理を行った後、細胞を１％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）に固定し、ＰＢＳで洗浄し、０.５％のＢＳＡを含有するＰＢＳに０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して３０分間透過化させ、２％のＢＳＡでブロッキングし、特異的抗体（２％のＢＳＡ／０.０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に混合された）と作用させる。洗浄した後、細胞とフルオレセイン共役二次抗体とを一緒に作用させる。ＰＢＳＴで洗浄し、退色剤及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（4’,6-diamidino-2-phenylindole、ＤＡＰＩ）を含有する水溶性の封入剤で封入する。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８ Ｘ共焦点顕微鏡（Leica）によって画像を分析する。

【0076】

図８には、ＣＤ３εナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析結果を示している。抗ＣＤ３εナノボディの濃度は、１ng/mlであり、ＳＰ７は、従来の抗ＣＤ３抗体（１:５００、MA1-90582、Invitrogen）であり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－フルオレセイン（fluorescein、ＦＩＴＣ）（１:５０００）である。本実施例の結果から分かるように、免疫組織化学の分析により、抗ＣＤ３εナノボディは、細胞サンプルにおけるＣＤ３εの発現を検出するために用いられる。

【0077】

上記をまとめると、本発明の抗Ｔ細胞ナノボディ（即ち、抗ＣＤ３ε抗体）の効果は、以下の通りである。

【0078】

Ｔ細胞（即ち、末梢血単核細胞）の増殖及び活性化アッセイ（T cell(i.e. peripheral blood mononuclear cell、PBMC) proliferation and activation assay）により、抗ＣＤ３εナノボディがＴ細胞のクラスター増殖及び活性化を促進させ、ＰＢＭＣにおけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を向上させ、γδＴ（ＧＤＴ）細胞におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖を向上させることを証明し、
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＣＤ３εナノボディがヒトＴ細胞の細胞溶解物中のＣＤ３εタンパク質を特定できることを証明し、
免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）及びフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）により、抗ＣＤ３εナノボディがフローサイトメトリーによって細胞サンプルにおけるＣＤ３εの発現を検出できることを証明し、
表面プラズモン共鳴結合分析（surface plasmon resonance binding assay、ＳＰＲ binding assay）により、抗ＣＤ３εナノボディが０.５０５６nM以内のＫ_D値でＣＤ３ε／ＣＤ３δヘテロ二量体に有効に結合することを証明し、及び、
免疫細胞化学の分析により、抗ＣＤ３εナノボディが細胞サンプルにおけるＣＤ３εの発現を検出するために用いられることを証明する。

【0079】

上記効果によれば、がんの治療、免疫調節及び免疫細胞の活性化も効果を達成することができる。特に、本発明の抗Ｔ細胞ナノボディは、免疫功能の調節及び免疫細胞の活性化という役割を果たす。かつ、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の抗Ｔ細胞ナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。なお、本発明によれば、ＣＤ３εの発現レベルを検出できる効果も達成することができる。

【0080】

上記の内容は、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない改良や変更は、いずれも添付の特許請求の範囲に含まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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