特許 7347767 造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法、予測診断薬及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-11

(45)【発行日】2023-09-20

(54)【発明の名称】造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法、予測診断薬及びキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20230912BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230912BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20230912BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/53 D

C07K16/18

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021574091

(86)(22)【出願日】2021-01-28

(86)【国際出願番号】 JP2021002963

(87)【国際公開番号】W WO2021153649

(87)【国際公開日】2021-08-05

【審査請求日】2022-07-27

(31)【優先権主張番号】P 2020015285

(32)【優先日】2020-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】519135633

【氏名又は名称】公立大学法人大阪

(73)【特許権者】

【識別番号】504209655

【氏名又は名称】国立大学法人佐賀大学

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100122448

【弁理士】

【氏名又は名称】福井 賢一

(72)【発明者】

【氏名】岡村 浩史

(72)【発明者】

【氏名】中前 博久

(72)【発明者】

【氏名】進藤 岳郎

(72)【発明者】

【氏名】大塚 泰史

【審査官】中村 直子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５２８２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第１６／１００７４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】SARTAIN, Sarah et al.，The alternative complement pathway activation product Ba as a marker for transplant-associated throm，Pediatric Blood & Cancer，2019年11月27日，https://doi.org/10.1002/pbc.28070

【文献】SARTAIN, Sarah E. et al.，Patients with Transplantation-Associated Thrombotic Microangiopathy Demonstrate Elevated Levels of B，Biology of Blood and Marrow Transplantation，2019年，25(3)Supplement，S150-151

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｃ０７Ｋ １６／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）造血幹細胞移植後４～１３日の被験対象に由来する生体試料中の補体活性化因子Ｂａを検出する工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無を検出する工程と、を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法。

【請求項2】

前記工程（ｉｉ）が、被験対象について得られる工程（ｉ）の結果を、対照について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、前記補体活性化因子Ｂａの量が増加していることを指標として行われる、請求項１に記載の検出方法。

【請求項3】

前記造血幹細胞移植後の合併症が、造血幹細胞移植後血栓性微小血管症である、請求項１又は２に記載の検出方法。

【請求項4】

前記造血幹細胞移植後の合併症が、非再発死亡をもたらす致死的合併症である、請求項１～３のいずれかに記載の検出方法。

【請求項5】

前記工程（ｉｉ）において、８６９ｎｇ／ｍｌをカットオフ値とし、前記工程（ｉ）の結果が前記カットオフ値以上である場合に前記造血幹細胞移植後の合併症リスク有と検出する、請求項１～４のいずれかに記載の検出方法。

【請求項6】

前記工程（ｉ）を生体特異的親和性に基づく検出法によって行う、請求項１～５のいずれかに記載の検出方法。

【請求項7】

抗Ｂａ抗体を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断薬であって、前記予測診断が造血幹細胞移植後４～１３日である、予測診断薬。

【請求項8】

請求項７に記載の予測診断薬を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断キット。

【請求項9】

抗Ｂａ抗体を含む、造血幹細胞移植後の合併症の発症リスクを低減するための処置の選定用コンパニオン診断薬であって、前記選定が、造血幹細胞移植後４～１３日である、コンパニオン診断薬。

【請求項10】

抗Ｂａ抗体の、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断薬の製造のための使用であって、前記予測診断が造血幹細胞移植後４～１３日である、使用。

【請求項11】

抗Ｂａ抗体の、合併症の発症リスクを低減するための処置の選定用コンパニオン診断薬の製造のための使用であって、前記選定が造血幹細胞移植後４～１３日である、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法に関する。より具体的には、本発明は、造血幹細胞移植後血栓性微小血管症（ＴＡ－ＴＭＡ）の発症及び造血幹細胞移植後の非再発死亡（ＮＲＭ）リスクを早期に予測できる方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

同種造血幹細胞移植は、通常の化学療法や免疫抑制療法だけでは治療することが難しい血液がんや免疫不全症等の疾患に対して、完治させることを目的として行う唯一の治療手段であり、日本では年間約３，５００例実施されている。一方で、同種造血幹細胞移植後には合併症としてＴＡ－ＴＭＡが比較的高頻度（１０～３０％）で認められ、そのうちの重症例は、診断から３か月以内の致死率の中央値が７５％と報告されるほどに重篤である。

【0003】

同種造血幹細胞移植後の合併症がこれほどまでの予後不良を来たす原因は、その病態生理に関して不明な点が多く早期診断する手段がないことにより、一旦発症すると重症化し治療困難となりやすいためであると考えられる。このため、同種造血幹細胞移植後の合併症の予測手段の確立は臨床現場におけるアンメットニーズの１つとなっている。

【0004】

ＴＡ－ＴＭＡの診断や予後予測に、補体活性化経路における終末経路の補体複合体であるｓＣ５ｂ－９が関連しているとして、ｓＣ５ｂ－９についてＴＡ－ＴＭＡの発症予測のマーカーとしての可能性が報告されている。具体的には、小児において、同種造血幹細胞移植後２８日目に測定されるｓＣ５ｂ－９について、ＴＡ－ＴＭＡの発生予測のマーカーとしての有用性が示されており（非特許文献１）、成人において、同種造血幹細胞移植後に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を発症しさらにＧＶＨＤ発症から２～６週間経過時に測定されるｓＣ５ｂ－９について、ＴＡ－ＴＭＡの発生予測のマーカーとしての有用性が示されている（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Biol Blood Marrow Transplant 24 (2018) 989？996

【文献】blood advances, Volume 2, Number 20 (2018) Pages 2619-2628

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＴＡ－ＴＭＡの発症予測マーカーとしてｓＣ５ｂ－９の有用性が報告されてきたが、この予測マーカーを有効に用いることができるタイミングは、小児で同種造血幹細胞移植後２８日経過時、成人で同種造血幹細胞移植後の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）発症後２～６週間経過時である。しかしながら、ＴＡ－ＴＭＡの予後不良性に鑑みると、その予防のための対処を移植後のできるだけ早いタイミングで開始することが、ＴＡ－ＴＭＡ発症制御において極めて重要である。そうすると、これまで報告されているようなタイミングでのＴＡ－ＴＭＡ発症予測は、依然として遅きに失するといわざるを得ない。遅くとも、造血幹細胞移植後２０日以内には、合併症のリスクを判断する必要がある。また、これまで、ＴＡ－ＴＭＡの中でもＮＲＭまで予測できたことの報告はなく、事実、上記の非特許文献１では、ｓＣ５ｂ－９によってＮＲＭの予測が出来なかったことが明示されている。しかしながら、ＴＡ－ＴＭＡの中でも最も重篤なＮＲＭまで予測できれば臨床的な意義は非常に大きい。

【0007】

そこで、本発明は、造血幹細胞移植後の合併症について、ＮＲＭも含めて広く予測でき、且つ造血幹細胞移植後２０日以内の超早期に予測できる方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、造血幹細胞移植後の合併症をより一層早期に行うため、補体活性化経路においてｓＣ５ｂ－９よりも上流の経路に関連するタンパク質を予測マーカーとして用いることに着眼した。しかしながら、このようなタンパク質として、終末経路のｓＣ５ｂ－９よりも上流で生じる補体活性化物Ｃ５ａ、終末経路よりも上流経路である共通経路を仲介する補体成分Ｃ３、古典経路の機能に関連するＣＨ５０、古典経路及びレクチン経路を仲介する補体成分Ｃ４、終末経路よりも上流経路であるＣ３の活性化を制御する補体制御因子ＣＦＩ及びＣＦＨ、並びにＣＦＨに対する自己抗体について検討したものの、これらタンパク質はＴＡ－ＴＭＡを移植後２０日以内の超早期に予測できるマーカーとしては機能しなかった。そうした中で、第二経路の補体活性化物であるＢａについては、ＴＡ－ＴＭＡを移植後２０日以内の超早期に予測できるマーカーとして機能することを見出した。それだけでなく、Ｂａが、同様の超早期に、ＮＲＭを予測できるマーカーとしても機能することも見出した。本発明は、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。

【0009】

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． （ｉ）被験対象に由来する生体試料中の補体活性化因子Ｂａを検出する工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無を検出する工程と、を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法。
項２． 前記工程（ｉｉ）が、被験対象について得られる工程（ｉ）の結果を、対照について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、前記補体活性化因子Ｂａの量が増加していることを指標として行われる、項１に記載の検出方法。
項３． 前記造血幹細胞移植後の合併症が、造血幹細胞移植後血栓性微小血管症である、項１又は２に記載の検出方法。
項４． 前記造血幹細胞移植後の合併症が、非再発死亡をもたらす致死的合併症である、項１～３のいずれかに記載の検出方法。
項５． 前記被験対象が、造血幹細胞移植後２０日以内の被験対象である、項１～４のいずれかに記載の検出方法。
項６． 前記工程（ｉ）を生体特異的親和性に基づく検出法によって行う、項１～５のいずれかに記載の検出方法。
項７． 抗Ｂａ抗体を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断薬。
項８． 項７に記載の予測診断薬を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断キット。
項９． 抗Ｂａ抗体を含む、造血幹細胞移植後の合併症の発症リスクを低減するための処置の選定用コンパニオン診断薬。
項１０． （ｉ）被験対象に由来する生体試料中の補体活性化因子Ｂａの量を測定する工程と、
（ｉｉ）対照について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、前記補体活性化因子Ｂａの量が増加している場合に、造血幹細胞移植後の合併症リスク有と示す工程と、を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの診断方法。
項１１． （Ｉ）造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者を特定するために、造血幹細胞移植を受けた患者の生体試料中の補体活性化因子Ｂａを測定する工程と、（ＩＩ）特定された造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者にエクリズマブを投与する工程と、を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者の治療方法。
項１２． 前記（Ｉ）工程及び前記（ＩＩ）工程を、造血幹細胞移植後２０日以内の患者に対して行う、項１１に記載の治療方法。
項１３． 抗Ｂａ抗体の、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断薬の製造のための使用。
項１４． 抗Ｂａ抗体の、合併症の発症リスクを低減するための処置の選定用コンパニオン診断薬の製造のための使用。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、被験対象に由来する生体試料中のＢａを造血幹細胞移植後の合併症リスク予測バイオマーカーとして用いることで、造血幹細胞移植後の合併症リスクを、移植後２０以内、例えば移植後７日目という超早期に予測することが可能となり、さらに、ＮＲＭについても超早期の予測が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】解析対象となる患者（ＴＡ－ＴＭＡ患者又は非ＴＡ－ＴＭＡ患者）の選択フローを示す。

【図2a】ＴＡ－ＴＭＡ患者（１）又は非ＴＡ－ＴＭＡ患者（０）の、移植日及び移植後７日目における血漿中に含まれる各種補体活性経路関連因子（Ｂａ，ＣＨ５０）の含有量を示す。

【図2b】ＴＡ－ＴＭＡ患者（１）又は非ＴＡ－ＴＭＡ患者（０）の、移植日及び移植後７日目における血漿中に含まれる各種補体活性経路関連因子（Ｃ３，ＣＦＨ）の含有量を示す。

【図2c】ＴＡ－ＴＭＡ患者（１）又は非ＴＡ－ＴＭＡ患者（０）の、移植日及び移植後７日目における血漿中に含まれる各種補体活性経路関連因子（ＣＦＩ，ＣＦＨ－ＩｇＧ）の含有量を示す。

【図2d】ＴＡ－ＴＭＡ患者（１）又は非ＴＡ－ＴＭＡ患者（０）の、移植日及び移植後７日目における血漿中に含まれる各種補体活性経路関連因子（Ｃ４，Ｃ５ｂ９）の含有量を示す。

【図2e】ＴＡ－ＴＭＡ患者（１）又は非ＴＡ－ＴＭＡ患者（０）の、移植日及び移植後７日目における血漿中に含まれる各種補体活性経路関連因子（Ｃ５ａ）の含有量を示す。

【図3】ＴＡ－ＴＭＡ発症に対する移植後７日目におけるＢａ値のＲＯＣ曲線を示す。

【図4】ＴＡ－ＴＭＡ発症に対する移植後２８日目におけるｓＣ５ｂ－９のＲＯＣ曲線を示す。

【図5】図３から導出した移植後７日目におけるＢａ値のカットオフに基づく低値群（０）及び高値群（１）のＴＡ－ＴＭＡの累積発症の経時的推移を示す。

【図6】移植後７日目におけるＢａ値のカットオフに基づく低値群（ｄａｙ７＿Ｂａｌｏｗ）及び高値群（ｄａｙ７＿Ｂａ ｈｉｇｈ）に基づく腎機能の経時的推移を示す。

【図7】移植後７日目におけるＢａ値のカットオフに基づく低値群（０）及び高値群（１）に基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発症の経時的推移を示す。

【図8】移植後７日目におけるＢａ値のカットオフに基づく低値群（０）及び高値群（１）に基づく再発（Ｒｅｌａｐｓｅ）の累積発症の経時的推移を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

１．造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法
本発明の造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法は、（ｉ）被験対象に由来する生体試料中の補体活性化因子Ｂａを検出する工程と、（ｉｉ）前記工程（ｉ）の結果に基づいて造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無を検出する工程と、を含むことを特徴とする。以下、本発明の検出方法について詳述する。

【0013】

１－１．造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカー
本発明の検出方法においては、補体活性化因子Ｂａを、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーとして用いる。Ｂａは、造血幹細胞移植後の合併症を起こした被験者由来の生体試料において、当該合併症を起こさなかった造血幹細胞移植患者に比べて、含有量が有意に増加する。従って、Ｂａは、造血幹細胞移植後の患者において、造血幹細胞移植後の合併症リスクが高い者とそうでない者との区別を可能にする。

【0014】

Ｂａは、補体活性化経路のうちの第二経路において、補体Ｂ因子が補体Ｄ因子によって分解されることで生じる、Ｂ因子分解産物として公知である。Ｂａのアミノ酸配列については、例えばヒトＢａアミノ酸配列の場合、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔにおける受入番号Ｐ００７５１に、当該受入番号で登録されているＣＦＡＢ＿ＨＵＭＡＮの、Ｂ因子（２６～７６４番目のアミノ酸配列）のＮ末端側の約１／３を占める２６～２５９番目のアミノ酸配列で構成される。

【0015】

ヒトＢａアミノ酸配列について、タンパク質の具体的なアミノ酸配列を配列番号１に示す。

【0016】

本発明で用いられる造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーであるＢａは、配列番号１に示されるヒトＢａ、及びその他のその変異体であってもよい。すなわち、本発明で用いられる造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａとしては、配列番号１に示されるヒトＢａの他、ヒトＢａの変異体、ヒト以外の生物種のＢａ、ヒト以外の生物種のＢａの変異体が挙げられる。

【0017】

より具体的には、本発明で用いられる造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーであるＢａとしては、以下の（１）及び（２）のタンパク質が挙げられ、好ましくは（１）のタンパク質が挙げられる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｂａとしての補体活性を有するタンパク質

【0018】

なお、「１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法や多型により、置換、欠失、挿入、及び／又は付加される程度の数（好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、一層好ましくは２個以下、特に好ましくは１個）のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意図する。また、Ｂａが、Ｂ因子のアミノ基側の約１／３に当たるアミノ酸残基より構成されていることと、Ｂ因子が補体活性化経路の第二経路において細胞膜に結合したＣ３ｂに結合する活性及びＤ因子によって分解される特性を有するものであることとから、（２）のタンパク質は、補体活性化経路の第二経路においてヒトＢ因子と同様のＣ３ｂへの結合活性及びＤ因子によって分解される特性を有しているＢ因子の、Ｎ末端側の約１／３を占めるアミノ酸配列で構成されていればよい。

【0019】

１－２．造血幹細胞移植後の合併症
造血幹細胞移植後の合併症としては、具体的には、造血細胞移植後に発症する血栓性微小血管症（transplant-associated thrombotic microangiopathy：ＴＡ－ＴＭＡ）が挙げられる。ＴＡ－ＴＭＡは、微小血管症性溶血性貧血（microangiopathic hemolytic anemia: MAHA）、消費性血小板減少、微小循環不全による臓器機能障害を主徴とする。ＴＡ－ＴＭＡは、公知のＴＡ－ＴＭＡ診断基準（例えば、(1)ＬＤＨ正常上限値以上、(2)５０％以上の血小板減少又は血小板輸血依存、(3)進行性の貧血又は赤血球輸血依存、(4)末梢血中の１％以上の破砕赤血球出現又は組織学的な微小血管症の証明、(5)凝固異常がない、及び(6)ハプトグロビン正常下限値未満、及び(7)クームス試験陰性を全て満たす）により診断される。ＴＡ－ＴＭＡは、二次性ＴＭＡに分類されるものであり、その代表疾患としては、血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura：ＴＴＰ）、溶血性尿毒症症候群（hemolytic uremic syndrome：ＨＵＳ）が挙げられる。ＴＡ－ＴＭＡは、造血幹細胞移植後において様々な原因で血管内皮細胞が障害を受け、血小板血栓の形成が促進され、結果的に生体は循環不全による臓器機能障害に陥ることにより発症する。

【0020】

本発明で用いられる造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーは、造血幹細胞移植後の合併症の中でも、移植関連の非再発死亡（non-relapse mortality：ＮＲＭ）をもたらす重篤なものも予測することができる。このような観点から、本発明において、予測対象とする造血幹細胞移植後の合併症の好ましい例として、ＮＲＭをもたらす致死的合併症が挙げられる。

【0021】

１－３．被験対象
被験対象としては、造血幹細胞移植を受けた動物である限り、任意の動物であってよく、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類及びウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。本発明における被験対象は、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトであり、特に好ましくはヒトの成人である。成人の年齢の下限としては、１６歳以上、好ましくは３０歳以上、より好ましくは３５歳以上が挙げられ、成人年齢の上限としては、造血幹細胞移植の適応対象である限りにおいて制限はなく、例えば８０歳以下、好ましくは７５歳以下、より好ましくは７０歳以下が挙げられる。

【0022】

また、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーであるＢａが、移植後２０日以内の早期のタイミングで当該合併症の予測が可能であるため、被験対象の好ましい例は、造血幹細胞移植日を０日として、移植後２０日以内の被験対象である。また、精度よく当該合併症の予測を行う観点から、被験対象のより好ましい例として、移植後１～１９日、好ましくは２～１７日、より好ましくは３～１５日、さらに好ましくは４～１３日、一層好ましくは５～１１日、特に好ましくは６～９日経過時の被験対象が挙げられる。

【0023】

１－４．被験対象に由来する生体試料中のＢａを検出する工程
工程（i）では、被験対象に由来する生体試料中のＢａを検出する。工程（ｉ）における検出対象試料は生体試料であり、検出対象物質は前記造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカー（即ち、Ｂａ）である。

【0024】

生体試料としては、被験対象に由来するものであればよく、具体的には、被験対象から採取された、血液試料、組織試料及び細胞試料等が挙げられる。

【0025】

低侵襲性の観点からは、生体試料として好ましくは血液試料が挙げられる。血液試料としては、例えば全血、血清、血漿等が挙げられる。診断精度の観点から、好ましくは血漿が挙げられる。各種血液試料の採取及び調製は公知の手法に従って行うことができる。例えば、血漿であれば、抗凝固剤（ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ヘパリン等）入りの容器に採取された血液（全血）を入れ、遠心分離して細胞成分（赤血球、白血球、血小板）を除去して調製することができる。血液試料は、必要に応じて、適切な濃度に希釈して使用される。

【0026】

診断精度の観点からは、生体試料として好ましくは組織試料及び細胞試料が挙げられる。組織試料及び細胞試料としては、例えば、生検、外科病理診断、または細胞診により得られる試料が挙げられる。具体的には、組織試料及び細胞試料としては、新鮮組織及び細胞、凍結組織及び細胞、並びに病理組織学的に処理された（例えば、ホルマリン固定又はパラフィン包埋処理された）組織及び細胞等であってよい。これらの試料は、切片として使用されてもよいし、組織又は細胞から調製したタンパク質可溶画分として使用されてもよい。

【0027】

Ｂａの検出は、被験対象に由来する生体試料中のＢａの存在の有無を検出することにより行うことができる。好ましくは、Ｂａの検出は、生体試料中のＢａの量を測定することにより行う。

【0028】

Ｂａの検出方法としては、公知のタンパク質検出方法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、生体特異的親和性に基づく検出法及び質量分析による検出法が挙げられる。

【0029】

生体特異的親和性に基づく検出法においては、被験対象から採取された生体試料中に存在するＢａを抗原として特異的に認識し得る（但し、Ｂ因子は認識しない）抗Ｂａ抗体を用いる。このような抗Ｂａ抗体は、公知である。抗Ｂａ抗体としては、Ｂａを抗原として特異的に認識し、Ｂ因子を認識しない限りにおいて、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。

【0030】

また、生体試料中のＢａを検出するために使用される抗Ｂａ抗体は、検出可能である限り特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ等のいずれのアイソタイプであってもよい。本発明において好ましい抗体のアイソタイプとしては、ＩｇＧが例示される。また、抗Ｂａ抗体は、Ｂａを特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであればよく、具体的には、（ａｂ'）₂、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ）等の抗体の結合性断片であってもよい。抗Ｂａ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。

【0031】

生体特異的親和性に基づく検出法を用いたＢａの具体的な検出方法としては、抗Ｂａ抗体と生体試料とを接触させて、抗Ｂａ抗体と造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａとの特異的結合を直接的又は間接的に検出する方法が挙げられる。このような検出方法としては、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、蛍光イムノアッセイ法等のイムノアッセイが例示される。これらのイムノアッセイによりＢａを検出する場合には、Ｂａに結合する別の抗体に酵素標識、発色標識、放射標識又は発光標識などの標識を結合し、この標識を検出又は測定することにより行うことができる。当該別の抗体としては、少なくともＢａとの結合能を有していればよく、更にＢ因子への結合能を有していても有していなくてもよい。また、当該別の抗体としては、少なくともＢａとの結合能を有している限りにおいて、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。

【0032】

前記イムノアッセイを実施する際の条件については、生体試料中のＢａと抗Ｂａ抗体との特異的結合を検出し得る限り特に限定されず、従来公知の条件に基づいて設定される。

【0033】

例えば、ＥＬＩＳＡ法によりＢａを検出する場合、抗Ｂａ抗体が固定されたマルチウェルプレートの各ウェルに被験対象から採取した生体試料を添加し、ウェル中の抗Ｂａ抗体と生体試料中のＢａとを反応させる。そして、Ｂａに結合する標識化抗体を各ウェルに添加して反応させた後、酵素基質を添加して得られる反応生成物を検出及び／又は定量することによって、生体試料中の前記バイオマーカーの検出及び／又は定量を行うことができる。ここで、標識化抗体としては、生体試料を採取する被験対象の動物に基づいて適宜選択され得るが、被験対象がヒトである場合には、ヒトＢａと特異的に結合する非ヒト標識化抗体（例えば、ウサギ由来抗ヒトＢａ抗体）等が挙げられる。

【0034】

また、標識化抗体の標識に使用される酵素についても、通常使用されるものから適宜選択して用いることができ、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、β－Ｄ－グルクロニダーゼ等が挙げられる。また、酵素基質としては、酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択され得るが、例えば、酵素がペルオキシダーゼの場合であれば、３，３'，５，５'－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用することができる。

【0035】

酵素と基質との反応により生じた反応生成物の検出及び／又は定量は、反応生成物の吸光度を測定することによって行うことができ、例えば３，３'，５，５'－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を酵素基質として用いた場合には、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することによって実施され得る。

【0036】

ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）であれば、抗Ｂａ抗体を放射性同位元素で標識し、生体試料中のＢａと反応させ免疫複合体を形成させ、放射性同位元素から放出される放射能に基づいて検出することができる。

【0037】

蛍光イムノアッセイであれば、抗Ｂａ抗体をプレート等に固相化し、そこに生体試料を加えて反応させた後、被験対象の生体試料中に存在するＢａに結合する標識化抗体を更に反応させて、蛍光発色を検出することにより行うことができる。被験対象由来のＢａに特異的に結合する標識化抗体としては、前記ＥＬＩＳＡ法において記載される通りであり、蛍光色素により標識化されたものを用いる。蛍光色素としては、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５等が例示される。

【0038】

免疫沈降法であれば、抗Ｂａ抗体と生体試料とを反応させて免疫複合体を形成させ、プロテインＡ、プロテインＧ等の活性吸着剤を用いて、不溶化物として沈降させることによって検出することができる。更に、免疫沈降法とウェスタンブロット法を組合せて検出することもできる。より具体的には、ＦＬＡＧ等のタグが連結された抗Ｂａ抗体と生体試料とを反応させ、試料中にＢａが存在すれば免疫複合体が形成されるため、前述の活性吸着剤によって沈降させる。そして、得られた沈降物をウェスタンブロット法に供する。即ち、沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離展開し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等に転写した後、タグに対する抗体と転写膜上で抗原抗体反応を行うことにより生体試料中にＢａが存在していた場合にはバンドとして検出することができる。

【0039】

質量分析による検出法においては、公知の質量分析装置を特に限定されることなく用いることができる。例えば、試料を機器に導入するための方式としては、高速液体クロマトグラフィー等の分離装置への接続、ステンレスプレートへの試料の滴下、プローブを試料に浸漬させる方法等が挙げられる。導入された試料をイオン化させる方式としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法などが挙げられる。イオンの質量を測定する機器の種類としては、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）型などが単独又は組み合わせて用いられる。当業者は、これら多様な選択肢の中から最適な組み合わせを任意に選択して質量分析を行うことができる。

【0040】

質量分析による検出法を用いたＢａの具体的な検出方法においては、質量分析を用いた公知のタンパク質測定法を用いることができる。例えば、測定対象となるＢａをトリプシン消化等によって断片化してペプチド試料を調製し、Ｂａに特異的な配列を有するプロダクトイオンを検出することで、Ｂａの存在を検出することができる。当該Ｂａに特異的な配列を有するプロダクトイオンは、使用する質量分析計の測定範囲（m/z）内で設定する。また、当該Ｂａに特異的な配列を有する安定同位体標識内部標準ペプチドを用い、内部標準ペプチド由来のピークの強度に対する当該Ｂａに特異的な配列を有するプロダクトイオン由来ピークの相対的な強度を導出することで、Ｂａの定量を行うことができる。

【0041】

１－５．造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無を検出する工程
工程（ｉｉ）では、前記工程（ｉ）の結果に基づいて造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無を検出する。

【0042】

造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無は、Ｂａが、造血幹細胞移植後の合併症を起こした被験者由来の生体試料において、当該合併症を起こさなかった造血幹細胞移植患者に比べて含有量が有意に増加する特性に基づいて判断する。好ましくは、造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無の判断は、被験対象について得られる工程（ｉ）の結果を、対照について得られる工程（ｉ）の結果（以下において、基準Ｂａ量とも記載する。）と対比して、Ｂａ量が増加していることを指標として行うことができる。

【0043】

ここで、工程（ｉｉ）において用いられる上記対照としては、被験対象と同種の動物で、造血幹細胞移植後の動物で、且つ、移植後の合併症を発症しない動物が挙げられ、好ましくは、被験対象と同種の動物で、造血幹細胞移植後の動物で、合併症を発症しない動物で、且つ、移植後の経過期間も被験対象と同じ動物が挙げられる。

【0044】

基準Ｂａ量の例としては、対照集団におけるＢａ測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲（標準偏差を減じた値及び標準偏差を加えた値の両方を含む）、当該平均値の下限値から上限値までの範囲（下限値及び上限値の両方を含む）等、が挙げられる。このような基準Ｂａ量を用いる場合、被験者におけるＢａ測定値が基準Ｂａ量の上限値を超える場合に、被験者が造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断（合併症リスク「有」を検出）することができる。

【0045】

基準Ｂａ量の他の例としては、造血幹細胞移植後の合併症の有無が既知の対象集団において、造血幹細胞移植後の合併症を起こした対象がカットオフ値未満に所定の割合で含まれるように決定されたカットオフ値が挙げられる。このようなカットオフ値の決定においては、判別のカイ二乗値が最良となるような値を求めることができる。このような基準Ｂａ量を用いる場合、被験者におけるＢａ測定値が基準Ｂａ量を超える場合に、被験者が造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断（合併症リスク「有」を検出）することができる。

【0046】

基準Ｂａ量の更なる他の例としては、造血幹細胞移植後の合併症の有無が既知の対象集団における受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線に基づいて設定されるカットオフ値が挙げられる。この場合、感度及び特異度がいずれも１である点（座標（０，１））に最も近い距離にあるＲＯＣ曲線上の点、又は、座標（１，１）から原点座標（０，０）を結ぶ直線から最も遠い距離にあるＲＯＣ曲線上の点に基づいてカットオフ値を定めることができる。このような基準Ｂａ量を用いる場合、被験者におけるＢａ測定値が基準Ｂａ量を超える場合に、被験者が造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断（合併症リスク「有」を検出）することができる。

【0047】

造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断された被験者については、更に、合併症の発症リスクを低減するための処置として、ＴＡ－ＴＭＡの発症リスクとなる薬剤の調整、感染症対策、予防的エクリズマブ投与等を検討し、処置することができる。

【0048】

また、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、移植の適応の原因となった疾患が再発した場合と再発しなかった場合とで、生体試料中の含有量に有意差を示さない。このため、本発明によれば、合併症と再発と区別して予測することができる。更に、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、ＴＡ－ＴＭＡの中でも特に重篤なＮＲＭも予測することができる。しかも、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、これらの予測を、２０日以内の超早期に行うことができる。従って、造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断された被験者に対して取りうるべき処置を、超早期に適切に選択し開始することができるため、適切な処置を行う期間を長く確保することができる。そのため、造血幹細胞移植後の合併症リスクの低減、ひいては合併症による致命率の低減を、より効果的に図ることが期待できる。

【0049】

２．造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断薬及び予測診断キット
本発明は、抗Ｂａ抗体を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断薬を提供する。本発明の予測診断薬は、上記項目１で述べた造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法を行うために用いることができる。

【0050】

本発明の予測診断薬に用いられる抗Ｂａ抗体については、上記項目１－４で述べた通りである。

【0051】

本発明の予測診断薬において、抗Ｂａ抗体は、不溶化担体上に固定化された状態で提供されてよい。不溶化担体の素材としては、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａの検出を妨げない限り特に限定されず、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、ポリビニルクロライド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、紙、シリコン、ガラス、金属、アガロース等を例示することができる。また、これらの材料を２種以上組合せて用いてもよい。不溶化担体の形状としては、基板状、粒子状、その他任意の形状が挙げられ、不溶化担体の具体例としては、マイクロプレート、トレイ、粒子、繊維、棒、盤、容器、セル、試験管等が挙げられる。

【0052】

不溶化担体上への抗Ｂａ抗体の固定化は、従来公知の方法に従って行うことができる。

【0053】

また、本発明の予測診断薬は、抗Ｂａ抗体の他に、緩衝液、安定化剤、防腐剤等を含んで製剤化されていてもよい。

【0054】

本発明の予測診断薬は、抗Ｂａ抗体の検出を行うために必要とされ得る他のアイテムと組み合わされてキット化されていてもよい。つまり、本発明は、当該予測診断薬を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの予測診断キットも提供する。

【0055】

他のアイテムとしては、抗Ｂａ抗体の検出を行うために必要とされ得るものであれば特に限定されず、例えば、標識化抗体、標識物質の検出剤、溶解剤、洗浄剤、反応停止液、コントロール試料、及び／又は予測診断プロトコル等が挙げられる。予測診断プロトコルには、上述の造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法を実施するための操作及び手順等の情報が含まれる。

【0056】

３．造血幹細胞移植後の合併症リスクの診断方法
上記項目１－５で述べたとおり、造血幹細胞移植後の合併症リスクの有無の判断は、被験対象について得られるＢａ量が、対照について得られる基準Ｂａ量と対比して増加していることを指標として行うことができる。つまり、本発明は、（ｉ）被験対象に由来する生体試料中の補体活性化因子Ｂａの量を測定する工程と、（ｉｉ）対照について得られる工程（ｉ）の結果と対比して、前記補体活性化因子Ｂａの量が増加している場合に、造血幹細胞移植後の合併症リスク有と示す工程と、を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクの診断方法も提供する。

【0057】

本発明の診断方法における工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の詳細は、上記項目１で述べた造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法の工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）と同様である。

【0058】

３．合併症の発症リスクを低減するための処置の選定用コンパニオン診断薬
上記項目１－１で述べたとおり、生体試料中のＢａは、造血幹細胞移植後の患者において、造血幹細胞移植後の合併症リスクが高い者とそうでない者との区別を可能にし、上記項目１－５で述べた通り、造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断された被験者については、更に、合併症の発症リスクを低減するための処置として、ＴＡ－ＴＭＡの発症リスクとなる薬剤の調整、感染症対策、予防的エクリズマブ投与等を検討し、処置することができる。つまり、本発明は、抗Ｂａ抗体を含む、合併症の発症リスクを低減するための処置の選定用コンパニオン診断薬も提供する。本発明のコンパニオン診断薬は、上記項目１で述べた造血幹細胞移植後の合併症リスクの検出方法に用いることができ。

【0059】

本発明のコンパニオン診断薬に用いられる抗Ｂａ抗体については、上記項目１－４で述べた通りであり、抗Ｂａ抗体の具体的な形態の例については上記項目２と同様であり、抗Ｂａ抗体が、抗Ｂａ抗体の検出を行うために必要とされ得る他のアイテムと組み合わされてキット化されてよい点も上記項目２と同様である。

【0060】

４．造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者の治療方法
上記項目１－５で述べたとおり、生体試料中のＢａを造血幹細胞移植後の合併症リスク予測バイオマーカーとして用いることで、造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクを診断することができ、造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断（合併症リスク「有」を検出）された被験者については、更に、合併症の発症リスクを低減するための処置として、予防的にエクリズマブ投与等を検討し、処置することができる。エクリズマブは、抗Ｃ５キメラ抗体製剤であり、補体Ｃ５に特異的に結合することにより、炎症促進因子であるＣ５ａ及び終末補体複合体Ｃ５ｂ－９の産生を抑制する。つまり、本発明は、（Ｉ）造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者を特定するために、造血幹細胞移植を受けた患者の生体試料中のＢａを測定する工程と、（ＩＩ）特定された造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者にエクリズマブを投与する工程と、を含む、造血幹細胞移植後の合併症リスクを有する患者の治療方法も提供する。

【0061】

さらに、上記項目１－３及び１－５で述べたとおり、造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、予測を２０日以内の超早期に行うことができるため、造血幹細胞移植後の合併症を発症するリスクが高いと予測診断された被験者に対して取りうるべき処置を、超早期に適切に選択し開始することができる。つまり、本発明の治療方法においては、前記（Ｉ）工程及び前記（ＩＩ）工程を、造血幹細胞移植後２０日以内（好ましくは移植後１～１９日、より好ましくは２～１７日、さらに好ましくは３～１５日、一層好ましくは４～１３日、より一層好ましくは５～１１日、特に好ましくは６～９日）の患者に対して行うことができる。

【実施例】

【0062】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0063】

<<患者及び方法>>
<試験デザインと対象患者選択>
本試験は後方視的観察により行った。患者の選択は、図１に示す順序で行った。具体的には、２０１２年１２月～２０１６年１２月の間に大阪市立大学で同種造血幹細胞移植を施術された患者（但し、同意を得られなかった患者及び検体利用ができない患者を除外した）の症例のうち、ＴＡ－ＴＭＡ診断困難例（uncertain TA-TMA）を除外した。uncertain TA-TMAは、ＴＡ－ＴＭＡが疑われるものの、ＴＡ－ＴＭＡ診断に必要なハプトグロビン、クームス試験、破砕赤血球などの検査項目がなされていない症例と、血小板減少又は溶血を来す他の要因（血液原疾患や薬剤等）が認められる症例とを含む。このようにして対象となるＴＡ－ＴＭＡ発症患者を選択した後、各症例に対して傾向スコアを算出し、同数の非ＴＡ－ＴＭＡ患者をマッチングした。最終的にＴＡ－ＴＭＡ発症患者とマッチングされた非ＴＡ－ＴＭＡ患者を解析対象とした。

【0064】

ＴＡ－ＴＭＡ患者及び非ＴＡ－ＴＭＡ患者から採取した移植前及び移植後２０日以内（具体的には７日目）の凍結血漿検体を用いて９項目の補体活性経路関連因子を測定し、比較検討した。なお、補体活性経路関連因子のうち、非特許文献１において移植後２８日目でのＴＡ－ＴＭＡ発生予測マーカーとしての有用性が報告されたｓＣ５ｂ－９については、移植後２８日目の凍結血漿検体についても測定を行った。本試験で測定した補体活性経路関連因子を表１に示す。

【0065】

【表1】

【0066】

<定義>
ＴＡ－ＴＭＡの診断基準はChoらが提唱した診断基準に沿って、次の７項目を同時に満たすこととした。(1)ＬＤＨ正常上限値以上、(2)５０％以上の血小板減少又は血小板輸血依存、(3)進行性の貧血又は赤血球輸血依存、(4)末梢血中の１％以上の破砕赤血球出現又は組織学的な微小血管症の証明、(5)凝固異常がない、及び(6)ハプトグロビン正常下限値未満、及び(7)クームス試験陰性。

【0067】

既報告に従い、８Ｇｙより多いＴＢＩ量、７．２ｍｇ／ｋｇ以上の静注ブスルファン量、１４０ｍｇ／ｍ²以上のメルファラン量のいずれかを含む前処置は骨髄破壊的前処置とし、それ以外を非骨髄破壊的前処置と定義した。ＨＬＡ一致度はＨＬＡ－Ａ座、ＨＬＡ－Ｂ座、ＨＬＡ－Ｃ座、ＨＬＡ－ＤＲ座のＤＮＡタイピングによって定義された。

【0068】

<補体活性経路関連因子測定法>
血漿検体は、採血をＥＤＴＡ－２Ｎａ入りの採血管に採取した後ただちに3000回転/20分間遠心を行うことで調製した。調製した血漿検体は、大阪市立大学の臨床検査部門で、検査測定時まで同じ型の超低温冷凍庫にて－８０℃で管理・凍結保存を行った。

【0069】

補体活性経路関連因子９項目（ＣＨ５０、Ｃ３、Ｃ４、ＣＦＩ、ＣＦＨ、抗ＣＦＨ抗体Ｃ５ａ、ｓＣ５ｂ－９、Ｂａ）の定量を行った。ＣＨ５０の定量にはワンポイントＣＨ５０「生研」（デンカ生研株式会社）を用い；Ｃ３及びＣ４の定量には、それぞれ、N-アッセイTIA C3-SHニットーボー及びN-アッセイTIA C4-SH ニットーボー（いずれもニットーボーメディカル株式会社）を用い；ＣＦＩ、ＣＦＨ、及び抗ＣＦＨ抗体の定量には、それぞれ、CFI (Human) ELISA Kit、CFH (Human) ELISA Kit、及びCFH IgG ELISA Kit (いずれもAbnova社)を用い；Ｂａ、ｓＣ５ｂ－９、及びＣ５ａの定量には、それぞれ、MicroVue Ba EIA Kit、MicroVue sC5b-9 Plus EIA Kit、及びMicroVue C5a EIA Kit (Quidel 社)を用いた。具体的には、MicroVue Ba EIA Kitを用いたＢａの定量においては、基板にコートされた、Ｂａに特異的な（且つＢ因子を認識しない）モノクローナル抗体に、血漿検体を接触させ、当該モノクローナル抗体に結合した血漿検体中のＢａに、Ｂａとの結合性を有するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識のポリクローナル抗体を結合させ、当該標識を測定する。

【0070】

<傾向スコアマッチング法>
ＴＡ－ＴＭＡ発症の有無を従属変数とし、ＴＡ－ＴＭＡの既知の移植前リスク因子である、患者年齢、性別、移植前疾患状態、ドナー（血縁／非血縁）、ＨＬＡ一致度（一致／不一致）、グラフト種別（骨髄／末梢血／臍帯血）、前処置強度（骨髄破壊的／非骨髄破壊的）、ＧＶＨＤ予防法（シクロスポリン投与／タクロリムス投与）、患者サイトメガロウイルス抗体（有／無）を独立変数としたロジスティック回帰モデルにより、各患者の傾向スコアを算出した。ＴＡ－ＴＭＡ患者のＴＡ－ＴＭＡ発症日と同時期までＴＡ－ＴＭＡを発症せず非再発生存しており、かつＴＡ－ＴＭＡ患者の傾向スコアに最も近い傾向スコアを持つ患者が１：１で対照患者としてマッチングされた。対照患者は復元抽出可とし、マッチングのキャリパーは傾向スコアの標準偏差の０．２５範囲内とした。欠損値は多重補完法によって補完した。

【0071】

<統計学的解析手法>
２群間における補体蛋白値の経時的推移の比較、Ｃｒｅ値の経時的推移の比較には、Ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ法を用い、多重検定の補正にはｓｉｄａｋ法を用いた。両群間で有意差が得られた場合には、さらにＰｏｓｔ ｈｏｃ解析により有意差のある時点を得た。ＲＯＣ曲線からＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘによる最適Ｃｕｔｏｆｆ値を求め、ＴＡ－ＴＭＡ及びＮＲＭ累積発症の比較にはＧｒａｙ法を用いた。ＴＡ－ＴＭＡ発症と非ＴＡ－ＴＭＡ死亡は互いに競合イベントとした。

【0072】

<<結果>>
<解析対象の患者背景>
マッチングにより抽出されたＴＡ－ＴＭＡ患者（ｎ＝１５）及び対照患者（ｎ＝１５）を解析対象とした。これらＴＡ－ＴＭＡ患者及び対照患者について、それぞれの移植前リスク因子における各群の人数（但し、年齢については、中央値及び範囲（括弧内）を示し、移植前疾患状態及びグラフト種別については、人数と共に割合（括弧内；単位％）を示す）及び群間比較によるｐ値（群間に差がない）を、下記表に示す。なお、このＴＡ－ＴＭＡ患者において、ＴＡ－ＴＭＡの発症日の中央値は、移植日を０日として、移植後２５日目（四分位範囲：２２．５－４４）であった。

【0073】

【表2】

【0074】

＜ＴＡ－ＴＭＡ群と非ＴＡ－ＴＭＡ群における補体活性経路関連因子の差>
ＴＡ－ＴＭＡ群（１）と非ＴＡ－ＴＭＡ群（０）の間における比較例１～８及び実施例１の補体活性経路関連因子の測定結果を、図２ａ～図２ｅに示す。９つの補体活性経路関連因子のうち、Ｂａ以外（比較例１～８）では、移植後２０日以内（具体的には移植後７日目）に両群間で有意差を示さなかった。なお、図示していないが、非特許文献１において移植後２８日目でのＴＡ－ＴＭＡ発生予測マーカーとしての有用性が報告されたｓＣ５ｂ－９については、移植後２８日（比較例９）にＴＡ－ＴＭＡ群（１）で異常高値を示した。一方で、Ｂａ（実施例１）では、移植後２０日以内（具体的には移植後７日目）にＴＡ－ＴＭＡ群（１）で有意に異常高値を示した（平均値±標準誤差が、ＴＡ－ＴＭＡ群（１）で１１２９±１０９ｎｇ／ｍｌ、非ＴＡ－ＴＭＡ群（０）で５８４±３８ｎｇ／ｍｌ）。

【0075】

<移植後７日目のＢａ値による造血幹細胞移植後の合併症予測能－１＞
ＴＡ－ＴＭＡ発症群についての移植後７日目のＢａ値（実施例１）のＲＯＣ曲線を図３に示す。ＴＡ－ＴＭＡ発症群についての移植後７日目のＢａ値のＡＵＣは０．８８（９５％信頼区間：０．７２－１．０）であり、ＲＯＣ曲線から求めた最適カットオフ値は８６９ｎｇ／ｍｌであった。

【0076】

なお、ＴＡ－ＴＭＡ発症群についての移植後２８日目のｓＣ５ｂ－９値（比較例９）のＲＯＣ曲線を図４に示す。ＴＡ－ＴＭＡ発症群についての移植後２８日目のｓＣ５ｂ－９値のＡＵＣは０．６９（９５％信頼区間：０．４９－０．８９）であり、ＲＯＣ曲線から求めた最適カットオフ値は１９７．２ｎｇ／ｍｌであった。

【0077】

図３と図４との対比に示される通り、本発明の造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、非特許文献１で移植後２８日目におけるＴＡ－ＴＭＡ予測マーカーとしての有用性が報告されたｓＣ５ｂ－９と比べて、ＴＡ－ＴＭＡの予測時期が格段に早くなるだけでなく、その精度においても格段に優れている。

【0078】

<移植後７日目のＢａ値による造血幹細胞移植後の合併症予測能－２＞
図３から導出した移植後７日目におけるＢａ値（実施例１）のカットオフを用い、Ｂａ値がカットオフ未満の低値群（０）及びカットオフ以上の高値群（１）についてＴＡ－ＴＭＡ累積発症率（縦軸）と移植後経過月（横軸）との関係を図５に示す。図５における両群を群間比較すると、移植後７日目のＢａ高値群（１）は、移植後７日目のＢａ低値群（０）に比べて有意に高いＴＡ－ＴＭＡ累積発症率を示した（１年累積発症率：１００％ ｖｓ １７％；ＨＲ：１８．９［９５％信頼区間：５．５－６４．６］；ｐ＜０．００１）。

【0079】

また、同様にして腎機能を示すクレアチニンＣｒｅ（縦軸）と移植後経過日（横軸）との関係を図６に示す。図６に示すように、移植後７日目のＢａ高値群（ｄａｙ７＿Ｂａ ｈｉｇｈ）は、移植後７日目のＢａ低値群（ｄａｙ７＿Ｂａ ｌｏｗ）に比べて有意に高いクレアチニン値を示した。

【0080】

<移植後７日目のＢａ値による造血幹細胞移植後の合併症予測能－３＞
図３から導出した移植後７日目におけるＢａ値（実施例１）のカットオフを用い、Ｂａ値がカットオフ未満の低値群（０）及びカットオフ以上の高値群（１）について非再発死亡（ＮＲＭ）累積発症率（縦軸）と移植後経過月（横軸）との関係を図７に示す。図７における両群を群間比較すると、移植後７日目のＢａ高値群（１）は、移植後７日目のＢａ低値群（０）に比べて有意に高いＮＲＭ累積発症率を示した（ｐ＝０．００８）。

【0081】

なお、図３から導出した移植後７日目におけるＢａ値（実施例１）のカットオフを用い、Ｂａ値がカットオフ未満の低値群（０）及びカットオフ以上の高値群（１）について、再発（Ｒｅｌａｐｓｅ）累積発症率（縦軸）と移植後経過月（横軸）との関係を図８に示す。図において両群を群間比較しても、両群に有意差は無かった。

【0082】

図７と図８との対比に示される通り、本発明の造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、再発と区別してＮＲＭを予測することができる。一方、非特許文献１では、ｓＣ５ｂ－９について移植後２８日目におけるＴＡ－ＴＭＡ予測マーカーとしての有用性が示される一方で、ＮＲＭの予測はできないことが示されている。本発明の造血幹細胞移植後の合併症リスク予測マーカーＢａは、最も重篤なケースであるＮＲＭまで超早期に予測できるため、臨床的な意義が非常に大きい。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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