特許 7348160 ヌクレアーゼ媒介ゲノム遺伝子操作のための送達方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-11

(45)【発行日】2023-09-20

(54)【発明の名称】ヌクレアーゼ媒介ゲノム遺伝子操作のための送達方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230912BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230912BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230912BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20230912BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230912BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20230912BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230912BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230912BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

A61K48/00 ZNA

A61K35/76

A61K31/573

A61K39/395 U

A61P7/04

A61P43/00 121

C12N15/12

【請求項の数】 4

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020209010

(22)【出願日】2020-12-17

(62)【分割の表示】P 2018501179の分割

【原出願日】2016-07-13

(65)【公開番号】P2021045166

(43)【公開日】2021-03-25

【審査請求日】2020-12-17

(31)【優先権主張番号】62/191,918

(32)【優先日】2015-07-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/247,469

(32)【優先日】2015-10-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/315,438

(32)【優先日】2016-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゲイリー ケー． リー

(72)【発明者】

【氏名】ブリジット イー． レイリー

(72)【発明者】

【氏名】スーザン ジェイ． セント マーティン

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ウェクスラー

【審査官】大久保 元浩

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０８９５４１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１３－５２３７７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００３／０００３５８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／０５９１７３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１５／１６４７５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J. Virol., 2003, 77(11), pp.6394-6404

【文献】J. Virol., 1998, 72(12), pp.9835-9843

【文献】Mol. Ther., 2007, 15(7), pp.1323-1330

【文献】Nat. Med., 2003, 9(10), pp.1306-1312

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、核酸を対象の細胞内に導入するための組成物であって、前記ＡＡＶベクターは前記対象の前記細胞内に導入される前記核酸を含み、
前記組成物は、ステロイド、および抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて前記対象に投与されるものであり、前記抗ＣＤ２０抗体は、前記組成物の投与の前に前記対象に投与されるものである、組成物。

【請求項2】

前記核酸が導入遺伝子を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記対象がヒトであり、前記導入遺伝子が治療用タンパク質をコードし、さらに前記対象が前記治療用タンパク質に寛容化されている、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記対象が血友病を有し、前記導入遺伝子がＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子から選択される凝固因子をコードする、請求項３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月１３日出願の米国特許仮出願第６２／１９１，９１８号、２０１５年１０月２８日出願の米国特許仮出願第６２／２４７，４６９号、及び２０１６年３月３０日出願の米国特許仮出願第６２／３１５，４３８号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、ゲノム遺伝子操作、特に細胞のゲノムの標的化された改変の分野にある。

【背景技術】

【0003】

ゲノムＤＮＡの標的化された開裂のための種々の方法及び組成物が説明されてきた。このような標的化された開裂事象を使用して、例えば標的化された突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、米国特許第２５５，２５０号、同第９，２００，２６６号、同第９，０４５，７６３号、同第９，００５，９７３号、同第９，１５０，８４７号、同第８，９５６，８２８号、同第８，９４５，８６８号、同第８，７０３，４８９号、同第８，５８６，５２６号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６００６３２３１号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１２００１７２９０号、同第２０１１０２６５１９８号、同第２０１３０１３７１０４号、同第２０１３０１２２５９１号、同第２０１３０１７７９８３号、同第２０１３０１９６３７３号、同第２０１４０１２０６２２号、同第２０１５００５６７０５号、同第２０１５０３３５７０８号、同第２０１６００３０４７７号、及び同第２０１６００２４４７４号を参照し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0004】

これらの方法は、多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などのエラーを生じる過程による切断の修復または修復テンプレートを使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組込み）をもたらし得るような、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための遺伝子操作された開裂系の使用に関与する。遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの特異的ヌクレアーゼの使用により、特異的開裂をガイドするための遺伝子操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（Ｃａｓ及び／またはＣｆｐ１を含む）を使用して、及び／またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば「ＴｔＡｇｏ」として知られるＴ．サーモフィルス由来）を使用して、開裂を生じることができる（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５０７（７４９１）：２５８－２６１）。

【0005】

上述のヌクレアーゼ系の１つを使用する標的化された開裂は、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ媒介性処理のいずれかを使用して、特異的標的位置に核酸を挿入するために利用できる。しかし、細胞にヌクレアーゼ系及びドナーの両方を送達することは、問題になり得る。例えば、細胞内へのプラスミドの形質導入を介したドナーまたはヌクレアーゼの送達は、レシピエント細胞、特に一次細胞であり、したがって細胞株由来の細胞ほどには頑強でない細胞に対して、毒性であり得る。

【0006】

多くの場合、細胞への核酸の送達のために利用される一方法は、ウイルス核酸送達ベクターの使用を含む。特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その効率及び相対的非毒性のため、核酸を送達するために広く使用される。ＡＡＶゲノムは、ウイルス核酸をほぼ除去して、ドナー導入遺伝子または操作したヌクレアーゼをコードする核酸と置き換えられて、導入遺伝子のレシピエント細胞のＤＮＡへの組込みを容易にする。

【0007】

哺乳動物細胞のＡＡＶ形質導入は、標的細胞上の一次及び二次共受容体の両方に依存する。一次受容体が標的細胞（及びその指向性）にウイルスの初期粘着力にとって重要である一方で、二次受容体は細胞内にＡＡＶウイルスのエンドサイトーシスを介在する。例えば血清型ＡＡＶ６において、一次受容体は、α２，３Ｎ－結合シアル酸（Ｗｕ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（１８）：９０９３）及び二次受容体はＥＧＦＲとして同定されている。更に追加の二次共受容体の使用も提案されている（Ｗｅｌｌｅｒ
ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｎａｔ Ｍｅｄ １６（６）：６６２）。

【0008】

細胞及び／または組織のｉｎ ｖｉｖｏ送達（移植）は、抗体媒介性反応によって多くの場合妨げられ得る。例えば一部の腎臓移植患者は、移植組織に対する宿主の抗体の出現によって媒介される急性拒絶反応を起こしやすい。したがって医師はステロイド治療を日常的に使用して、移植後の抗体反応を抑制し（例えばＫｕ ｅｔ ａｌ（１９７３）Ｂｒ．Ｍｅｄ Ｊ４：７０２を参照）、Ｂ細胞抑制のためにリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）を使用できる（例えばＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４）Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌ
４：９９６）。ＡＡＶ媒介性送達システムによる投与の後、ヒト集団の抗ＡＡＶ抗体の非公式な有病率及びこれらの抗体のｄｅ ｎｏｖｏ出現のため、抗体媒介性反応はＡＡＶ送達の使用が直面する課題でもある（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２（２）：１１６－１２６を参照）。

【0009】

身体には、免疫系の細胞群の活性化または抑制を制御できる複雑な機序がある。例えば樹枝細胞（ＤＣ）は、免疫活性化対免疫寛容の間のバランスの中心的存在として認められている。それらは免疫系の最も強力な抗原提示細胞であり、特にナイーブＴ細胞に対する抗原を捕捉かつ提示する。未成熟なＤＣは、Ｔｏｌｌ様受容体などの特異的受容体によって有望な抗原と相互作用し、そこで抗原は微飲作用によって細胞内に集められる。それから抗原は、主要組織適合遺伝子複合体によってＴ細胞に提示される、より小さいペプチドに分解される。更に成熟ＤＣは、炎症性メディエータ（例えばＴ細胞を活性化するのに更に役立つ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－６及びＴＮＦ）を分泌する。一方でＤＣは、中枢性及び末梢性トレランスを維持するために、いくつかの抗原に身体を寛容化する役割も果たす。免疫寛容を誘発するＤＣ（ｔｏｌＤＣ）は細胞表面に少量の共刺激シグナルを有し、上述の炎症性メディエータの減少した発現を有する。しかし、これらのｔｏｌＤＣはＩＬ－１０のような大量の抗炎症性サイトカインを発現し、これらの細胞がナイーブＴ細胞と相互作用するとき、Ｔ細胞はアネルギー性／制御性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ）になるように促進される。事実、この処理は、これらの未成熟／免疫寛容誘発のＤＣによるＴ細胞の反復刺激で強化されることが示されている。異なる種類のＴｒｅｇを誘発するためにｔｏｌＤＣと協調して作用するいくつかの因子も、同定されている。例えば、ｔｏｌＤＣｓ及びＨＧＦ、ＶＩＰペプチド、ＴＳＬＰまたはビタミンＤ３に共曝露したナイーブＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの誘発を引き起こし、ＴＧＦ－βまたはＩＬ－１０への共曝露はＴｒ１ Ｔ ｒｅｇの誘発を引き起こし、副腎皮質ホルモン、ラパマイシン、レチノイン酸への共曝露はＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの誘発を引き起こすことができる。（Ｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ
６：ａｒｔ ５６９及びＯｓｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：ａｒｔ ５３５）。

【0010】

ＣＤ３４＋幹細胞または前駆細胞は、リンパ球系（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び骨髄細胞系（例えば単球、赤血球、好酸球、好塩基球及び好中球）の細胞に自己複製及び／または分化するその能力によって特徴づけられる、異質な細胞の集合である。ＣＤ３４＋幹細胞集団内に、特定の群の多分化能（関係している系統のいずれか）を多くの場合反映する複数のサブグループがあるという事実から、それらの異質な性質は生じる。例えばＣＤ３８－であるＣＤ３４＋細胞は、より原始的かつ未成熟のＣＤ３４＋前駆細胞（長期造血前駆細胞とも称される）であり、一方でＣＤ３４＋ＣＤ３８＋（短期造血前駆細胞）であるものは系統と関連付けされている（Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８０：３６７－３８７を参照）。それからこの母集団が分化経路を更に進行するとき、ＣＤ３４マーカーは失われる。ＣＤ３４＋幹細胞には、臨床細胞療法の非常に大きな可能性がある。しかし、その異質な性質も一部起因して、細胞への遺伝子操作（例えば遺伝子ノックアウト、導入遺伝子挿入など）を実施することは、困難であり得る。具体的には、これらの細胞は従来の送達ベクターによって十分には形質導入されず、最も原始的な幹細胞は改変に敏感であり、誘発されたＤＮＡ ＤＳＢに続いて限定的ＨＤＲがあり、長期の標準的培養条件下での不十分なＨＳＣ維持がある。そのうえ、他の目的の細胞（単に非限定例として、心筋細胞、中型有棘神経細胞、初代肝細胞、胚幹細胞、人工多能性幹細胞及び筋細胞）は、ゲノム編集において他よりうまく形質導入するのが少ない。
したがって、ゲノム遺伝子操作において、ウイルスベクターを使用して核酸を目的のＣＤ３４＋細胞及び他の細胞に効率的に送達するための追加の組成物及び方法への必要性が残っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】米国特許第２５５，２５０号明細書

【文献】米国特許第９，２００，２６６号明細書

【文献】米国特許第９，０４５，７６３号明細書

【文献】米国特許第９，００５，９７３号明細書

【文献】米国特許第９，１５０，８４７号明細書

【文献】米国特許第８，９５６，８２８号明細書

【非特許文献】

【0012】

【文献】Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５０７（７４９１）：２５８－２６１

【文献】Ｗｕ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（１８）：９０９３

【文献】Ｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｎａｔ Ｍｅｄ １６（６）：６６２

【文献】Ｋｕ ｅｔ ａｌ（１９７３）Ｂｒ．Ｍｅｄ Ｊ４：７０２

【文献】Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４）Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌ ４：９９６

【文献】Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２（２）：１１６－１２６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、遺伝子療法及びゲノム遺伝子操作における使用のための組成物及び方法を記載する。具体的には、記載されている方法及び組成物は、核酸を細胞（例えば造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）を含む一次細胞及びＴ細胞）内に導入することに関する。更に本発明の方法及び組成物は、目的のドナーＤＮＡを含むＡＡＶ粒子（ベクター）をこのような細胞に送達するのに有用である。
いくつかの態様において、本発明は、ゲノム遺伝子操作のために少なくとも１つのヌクレアーゼの、細胞（例えば、ＨＳＣ／ＰＣまたは他の造血系細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞））への送達を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼはペプチドとして送達され、その一方で他では、ヌクレアーゼをコードする核酸として送達される。いくつかの実施形態で、２つ以上のヌクレアーゼを使用する。いくつかの好ましい実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり、場合によってｍＲＮＡは保護されている。ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃａｓ及び／またはＣｆｐｌ）もしくはＴｔＡｇｏヌクレアーゼ系、またはこれらの組み合わせを含むことができる。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸は、エレクトロポレーションを介して送達される。

【0014】

別の態様において、核酸を分離細胞（例えば、造血幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）内に導入する方法は、本明細書に記載されており、その方法は、成長因子受容体結合の少なくとも１つの阻害剤の存在下で、ドナー分子（例えば細胞で発現する導入遺伝子）を含む、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスベクターを細胞に投与することを含む。特定の実施形態で、成長因子阻害剤は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、Ｍｅｔ／肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、リポアラビノマンナン受容体（ＬａｍＲ）、αＶβ５インテグリン受容体、細胞間接着分子１受容体（Ｉｃａｍ－１）及び／または血小板由来成長因子受容体に結合することを阻害する。導入遺伝子はエピソームであり得て、細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。本明細書に記載の方法のいずれかで、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードすることができる。更に本明細書に記載されている方法のいずれかは、少なくとも１つのヌクレアーゼを細胞内に導入することを更に含むことができ、導入遺伝子は、ヌクレアーゼによる１つ以上の遺伝子の開裂の後、細胞の１つ以上の遺伝子内に組み込まれる。追加のヌクレアーゼは、標的組み込みの有無にかかわらず、追加の遺伝子の不活化（ノックアウト）のために使用してよい。特定の実施形態で、ヌクレアーゼは、プログラムされた細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）遺伝子、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／またはＴ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）遺伝子を切断する。特定の実施形態で、細胞は組み込まれた導入遺伝子を有する少なくとも１つの遺伝子を含み、その遺伝子は不活性化（ＫＯ）されており、及び更に不活性化（ＫＯ）された少なくとも１つの第２の（異なる）遺伝子である。少なくとも１つの第２の遺伝子は、導入遺伝子の組み込みの有無にかかわらず、不活性化されることができる。

【0015】

したがって本発明は、核酸の細胞への送達の効率を増加させる方法及び組成物を含む、核酸を細胞内に導入するための方法ならびに組成物を提供する。特定の実施形態で、少なくとも５０％～６０％（またはその間の任意の値）、より好ましくは少なくとも６０～７０％（またはその間の任意の値）、更により好ましくは少なくとも７０％～８０％（またはその間の任意の値）、または更により好ましくは８０％超（８０～１００％の間の任意の値）の細胞は、その中への（例えば、細胞のゲノム内への）核酸の導入によって改変される。いくつかの実施形態において、送達はウイルスベクターの使用を包含する。好ましい実施態様で、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターの増大した送達の効率は、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）と結合する細胞上の１つ以上のウイルス受容体の能力を選択的に阻害することを介して、及びそれによってウイルスベクターによって１つ以上の交互の受容体により細胞へ運ばれる核酸の送達を増加させることを介して達成される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することはブロックされるまたは阻害され、一方で他の実施形態では、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）への結合はブロックされるまたは阻害される。他の実施形態において、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）に結合することからブロックされ得るまたは阻害され得る受容体は、Ｍｅｔ／肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、リポアラビノマンナン受容体（ＬａｍＲ）、αＶβ５インテグリン受容体、細胞間接着分子１受容体（Ｉｃａｍ－１）及び／または血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲβ及びＰＤＧＦＲαを含むＰＤＧＦＲ）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態で、受容体の阻害は、ウイルス送達の効率を２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍上昇させる。阻害剤は、ＡＡＶによる細胞の処理のために事前に（例えば４～５日、２～３日、１日、１２～２４時間、６～１１時間、１～５時間または１時間未満（またはそれらの間の任意の時間））投与されることができる。ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を細胞に送達するとき同時に、及び／またはウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を細胞に送達した後（１日またはそれより長い任意の時間）、阻害剤を投与することもできる。いくつかの実施形態で、使用する阻害剤（複数可）は、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ及び／またはＰＤＧＦＲの阻害のためのゲフィチニブ、ＢＧＪ３９８、ＳＵ１１２７４、ＣＰ－６７３４５１及び／またはＣｒｅｎｏｌａｎｉｂである。ＰＤＧＦＲ阻害剤ＣＰ－６７３４５１（ＰＤＧＦＲ１とも称される）及びＣｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＰＤＧＦＲ２とも称される）は、異なる親和性にもかかわらず、ＰＤＧＦＲα及びβを阻害する。本明細書に記載の方法のいずれかで、ウイルスベクターは、１つ以上のヌクレアーゼ及び／または１つ以上のドナーをコードする核酸（例えば治療用タンパク質をコードする配列）を運ぶことができる。

【0016】

一態様で、ウイルスベクターは、導入遺伝子がゲノム内に組み入れられないように、導入遺伝子を送達するために使用する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は誘導性プロモーターを含む。他の実施形態で、導入遺伝子は構成的プロモーターを含む。他の更なる実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターである。ウイルスベクターを１つ以上の細胞表面受容体に結合することを阻害する１つ以上の分子の送達の前、その間またはその後に、ウイルスベクターを送達できる。

【0017】

一態様では、１つ以上の導入遺伝子を分離細胞のゲノム内に組み込む方法は、本明細書に開示されており、その方法は、ヌクレアーゼが導入遺伝子の標的組み込みを媒介するように、導入遺伝子及び少なくとも１つのヌクレアーゼを細胞内に連続的にまたは同時に導入することを含む。その方法は、成長因子受容体結合の少なくとも１つの阻害剤またはＢ細胞阻害剤の存在下で、ドナー分子を含む少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスベクターを細胞に投与することを含み、及び少なくとも１つのヌクレアーゼを細胞内に導入することを更に含み、ヌクレアーゼによる開裂（例えば、標的ヌクレアーゼによるＰＤ１、ＣＴＬＡ－４及び／またはＴＲＡＣの開裂）の後、導入遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体）はゲノム内に組み込まれる。したがって特定の態様において、１つ以上の導入遺伝子を分離細胞のゲノム内に組み込む方法は、本明細書に開示されており、その方法は、細胞内へ（ａ）１つ以上の導入遺伝子を含むドナーベクター（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／または操作されたＴＣＲをコードする）、及び（ｂ）少なくとも１つのヌクレアーゼを導入することを含み、少なくとも１つのヌクレアーゼは、１つ以上の導入遺伝子が細胞のゲノム内に組み込まれるように、細胞のゲノムを切断し、更に（ｉ）少なくとも１つのヌクレアーゼの前にドナーベクターが細胞内に導入される場合、少なくとも１つのヌクレアーゼは、ドナーベクターが導入された後、４８時間以内に細胞内に導入されて、（ｉｉ）ドナーベクターの前に少なくとも１つのヌクレアーゼが導入される場合、ドナーベクターは、少なくとも１つのヌクレアーゼが導入された後、４時間以内に細胞に導入される。特定の実施形態で、前記方法は、（ａ）１つ以上の導入遺伝子を含むドナーベクターを細胞内に導入すること、（ｂ）４８時間未満（例えば、数秒～４８時間またはそれらの間の任意の時間）細胞を培養すること、及び（ｃ）少なくとも１つのヌクレアーゼを細胞内に導入すること、を含むことができ、１つ以上の導入遺伝子が細胞のゲノム内に組み込まれるように、少なくとも１つのヌクレアーゼは細胞のゲノムを切断する。あるいは前記方法は、（ａ）少なくとも１つのヌクレアーゼを細胞内に導入すること、（ｂ）２４時間未満（例えば、数秒～２４時間またはそれらの間の任意の時間）細胞を培養すること、及び（ｃ）１つ以上の導入遺伝子を含むドナーベクターを細胞内に導入すること、を含むことができ、１つ以上の導入遺伝子が細胞のゲノム内に組み込まれるように、少なくとも１つのヌクレアーゼは細胞のゲノムを切断する。方法の工程は、追加の導入遺伝子を同じ及び／または異なる座内へ取り込むために繰り返すことができる。特定の実施形態で、細胞は、２４時間未満（例えば、数秒～２４時間またはそれらの間の任意の時間）培養される（工程（ｂ））。他の更なる実施形態において、例えばヌクレアーゼ（複数可）がドナーベクターの導入前に導入されるとき、細胞は４時間未満培養される。これらの方法のいずれかは、ヌクレアーゼ及び／またはドナーベクターを細胞に導入する工程の前に、それと同時に及び／またはその後に、ウイルスベクター（例えば、ヌクレアーゼ（複数可）及び／またはドナーベクターを運ぶ）と細胞受容体との結合を阻害する分子を投与する工程を更に含むことができる。

【0018】

任意の細胞は、例えば、造血幹細胞（例えばＣＤ３４＋細胞）またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞（Ｔｒｅｇ細胞を含む））またはＢ細胞またはＮＫ細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球（ＴＩＬ）である。ドナーベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ２／６などのＡＡＶ６またはＡＡＶ６キメラベクター）として導入され得る。ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）は更に、例えばｍＲＮＡの形で、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して導入され得る。特定の実施形態で、ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子、アルブミン遺伝子など）を標的とする。導入遺伝子は、タンパク質、例えば疾患（例えばリソソーム蓄積症、異常ヘモグロビン症、血友病など）を有する対象で欠如または欠損している治療用タンパク質をコードし得る。特定の実施形態で、それを必要とする対象に１つ以上のタンパク質を提供する方法が開示されており、前記方法は、本明細書に記載のいずれかの方法に従って１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の導入遺伝子を分離細胞内に導入すること、及び１つ以上のタンパク質が対象に提供されるように細胞を対象内に導入することを含む。

【0019】

他の態様では、本発明は、標的細胞へのドナー核酸の送達を含む。ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）及び／または任意のウイルス受容体阻害剤をコードする核酸の前に、その後に、またはそれと一緒に送達することができる。特定の実施形態で、ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）及び／または任意のウイルス受容体阻害剤と同時に送達される。他の実施形態で、ヌクレアーゼ（複数可）より前の任意の時間、例えばその直前、１～６０分前（またはそれらの間の任意の時間）、１～２４時間前（またはそれらの間の任意の時間）、１～４８時間前（またはそれらの間の任意の時間）または４８時間超前を含む、ヌクレアーゼ（複数可）よりも前に、ドナーを送達する。特定の実施形態では、ヌクレアーゼの後に、好ましくは４時間以内にドナーを送達する。特定の実施形態で、核酸を細胞内に導入する方法が本明細書に開示されており、前記方法は、核酸を含むドナー分子を細胞内に投与すること、ヌクレアーゼを細胞に投与すること、を含み、ヌクレアーゼは、ドナー分子の１～４８時間後またはその前の４時間以内に投与され、更にドナー分子は、ヌクレアーゼによる開裂後、細胞のゲノム内に組み込まれる。他の実施形態において、１つ以上の導入遺伝子を細胞のゲノム内に導入する方法が本明細書に開示されており、前記方法は、少なくとも１つのヌクレアーゼを細胞内に導入することを含み、少なくとも１つのヌクレアーゼは、１つ以上の導入遺伝子が細胞のゲノム内に組み込まれるように、細胞のゲノムを切断し、更に（ｉ）少なくとも１つのヌクレアーゼの前にドナーベクターが細胞内に導入される場合、少なくとも１つのヌクレアーゼは、ドナーベクターが導入された後、４８時間以内に細胞内に導入されて、（ｉｉ）ドナーベクターの前に少なくとも１つのヌクレアーゼが導入される場合、ドナーベクターは、少なくとも１つのヌクレアーゼが導入された後、４時間以内に細胞に導入される。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば内因性遺伝子座中に組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）を含む。導入遺伝子は、ヌクレアーゼ（複数可）による開裂部位にまたはその近傍（例えば、１～５０塩基対内）に組み込まれることが好ましい。いくつかの実施形態で、ドナーは、標的化された開裂部位との相同性領域が隣接する、完全長遺伝子またはその断片を含む。いくつかの実施形態で、ドナーは相同領域を欠き、相同性非依存的機序（すなわちＮＨＥＪ）を介して標的遺伝子座中に組み込まれる。他の実施形態では、ドナーは、細胞で使用するため（すなわち、遺伝子補正のため）の相同領域が隣接する、核酸のより小さな断片を含む。いくつかの実施形態では、ドナーは、機能的または構造的成分、例えばｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなどをコードする遺伝子を含む。他の実施形態では、ドナーは、目的の遺伝子に結合及び／またはその発現を調節する制御エレメントをコードする遺伝子を含む。

【0020】

他の態様で、ウイルス及び／または非ウイルス遺伝子導入方法によってドナーを送達する。好ましい実施態様で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介してドナーを細胞に送達する。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びこれらの組み合わせを含む、任意のＡＡＶベクターを使用することができるが、これらに限定されない。場合によっては、ＡＡＶは、カプシド血清型と比較して異種血清型であるＬＴＲ（例えば、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、またはＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶ２ ＩＴＲ）を含む。ヌクレアーゼを送達するために使用するものと同じ遺伝子導入系を使用して送達することもでき（同じベクター上を含める）、または、ヌクレアーゼのために使用する異なる送達系を使用して、ドナーを送達することができる。特定の実施形態で、ドナーは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を使用して送達され、ヌクレアーゼ（複数可）はｍＲＮＡ形態で送達される。細胞は、本明細書に記載されるようにウイルスベクター（例えば、ヌクレアーゼ（複数可）及び／またはドナーを運ぶ）の送達の前に、それと同時に及び／またはその後に、細胞表面受容体へのウイルスベクターの結合を阻害する、１つ以上の分子で処理されることもできる。

【0021】

ドナー分子の目的の配列は、プロモーターの有無にかかわらず、機能性ポリペプチドをコードする１つ以上の配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含むことができる。ある場合には、ドナーは、特異的細胞型だけで発現するプロモーター（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞またはＮＫ細胞特異的プロモーター）を含む。特定の実施形態では、核酸配列は、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、上述のいずれかの機能的断片、及び上述の組み合わせをコードする配列を含む。例としてはリソソーム蓄積症または血友病を含む、疾患または障害を有する対象に欠如している及び／または異常に発現している１つ以上のタンパク質を、核酸配列はコードすることもできる。核酸配列は、癌療法に有用な１つ以上のタンパク質（例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ））もコードすることができる。配列をコードする機能性ポリペプチドがプロモーターを持たない実施形態では、組み込まれた配列の発現は、次いで目的の領域の内因性プロモーターまたは他の制御エレメントによって引き起こされる転写によって確実にされる。他の実施形態では、「タンデム」カセットは、このように選択された部位中に組み込まれており、カセットの第１成分は、上述のようにプロモーターを持たない配列を含み、その後転写終止配列、及び自律的発現カセットをコードする第２の配列が続く。２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳなどをコードする配列を含むがこれらに限定されない、追加の配列（コード配列または非コード配列）は、相同アーム間のドナー分子中に含まれ得る。

【0022】

別の態様では、相同性非依存的機序を介して細胞のゲノム中にドナー核酸を組み込む方法が、本明細書に記載される。前記方法は、細胞のゲノムに二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じること、及びヌクレアーゼを使用してドナー分子を開裂させることを含み、その結果、ドナー核酸はＤＳＢの部位に組み込まれる。特定の実施形態では、ドナー核酸は、非相同性依存的方法（例えば、ＮＨＥＪ）によって組み込まれる。上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏ開裂の際、ドナー配列は、ＤＳＢの位置で細胞のゲノム中に標的化した様式で組み込まれ得る。ドナー配列は、ＤＳＢを生成するために使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上と、同じ標的部位のうちの１つ以上を含み得る。したがってドナー配列は、組み込みが望まれる内因性遺伝子を開裂させるために使用するのと同じヌクレアーゼのうちの１つ以上によって開裂され得る。特定の実施形態では、ドナー配列は、ＤＳＢを誘導するために使用するヌクレアーゼとは異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。標的細胞のゲノム中のＤＳＢは、任意の機序によって生じ得る。特定の実施形態では、ＤＳＢは、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、目的の領域内の配列に結合するように遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む融合タンパク質によって生じる。他の実施形態では、ＤＳＢは、ヌクレアーゼドメインに融合し１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（天然起源または非天然起源）（ＴＡＬＥＮ）によって生じる。他の更なる実施形態では、ＤＳＢは、遺伝子操作された単一ガイドＲＮＡまたはその機能的等価物がゲノム中の標的化された部位にヌクレアーゼをガイドするために必要に応じて使用される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃａｓ及び／またはＣｆｐ１）またはＴｔＡｇｏヌクレアーゼ系を使用して生じる。

【0023】

他の態様では、ヌクレアーゼ（複数可）は、セーフハーバー遺伝子、例えば哺乳動物細胞のＣＣＲ５遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知）遺伝子、Ｒｏｓａ遺伝子、及びアルブミン遺伝子に結合する及び／またはそれらを開裂する。更に哺乳動物系の選択を補助するために、ＨＰＲＴ遺伝子座を使用することができる。

【0024】

いくつかの態様において、ヌクレアーゼ（複数可）は、チェックポイント阻害剤遺伝子（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、阻害性リガンドのＢ７ファミリーにおける受容体）に結合する及び／もしくはそれらを開裂する、またはＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲを介したシグナル伝達に伴う受容体もしくはリガンド遺伝子、及びキラー阻害性受容体（ＫＩＲ及びＣ型レクチン受容体）を開裂する。Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２（４）：２５２を参照のこと。

【0025】

他の態様では、ヌクレアーゼ（複数可）は、拒絶に関与する因子をコードする遺伝子、例えばＨＬＡ複合体（クラスＩ：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、クラスＩＩ：ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ、ＨＬＡ－ＤＲＢ）またはＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子に結合する及び／もしくはそれらを開裂する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）は、ＨＬＡ複合体（例えばＴＡＰ、タパシン、カルレティキュリン、カルネキシン、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７またはＥｒｐ５７）のためのペプチド負荷処理及び抗原プロセシングに関与する生成物をコードする遺伝子を標的とする。

【0026】

一態様では、ドナーは、目的の遺伝子に結合する及び／またはその発現を調整する、目的の調節タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＴＦ、ＴＡＬＥ ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ）である。一実施形態では、調節タンパク質はＤＮＡ配列に結合し、他の調節因子の結合を防止する。別の実施形態では、調節タンパク質の結合は、標的ＤＮＡの発現を調節（すなわち、誘導または抑圧）し得る。

【0027】

他の態様では、ドナーは、Ｔ細胞をリダイレクトできるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、タンパク質は操作された抗原受容体である。更なる実施形態では、遺伝子操作された受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、いくつかの実施形態のＴＣＲは、増強した親和性の操作されたＴＣＲまたは天然起源のＴＣＲである。他の態様では、遺伝子操作されたタンパク質は、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。

【0028】

他の態様では、例えば遺伝子改変を導入するためにヌクレアーゼを使用して、本明細書に記載されるように遺伝子改変した細胞（例えば、トランスジェニック）を、本明細書に開示する。細胞の１つ以上の遺伝子は、例えば標的化された組込みを介して、１つ以上の遺伝子及び／または１つ以上の遺伝子の部分的もしくは完全な不活性化（ＫＯ）へ改変され得て、それは、１つ以上の遺伝子及びＫＯの標的化された組込み（標的遺伝子の不活化の有無にかかわらず）を含有する遺伝子改変（１つ以上の遺伝子の標的化された組込みの有無にかかわらず（例えば、１つの遺伝子の標的化された組込み及び不活性化（ＫＯ）ならびに第２の異なる遺伝子のＫＯ））を含む。特定の実施形態で、細胞は本明細書に記載の方法によって生成される。特定の実施形態では、細胞は、セーフハーバー遺伝子座（例えばＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１、ＡＬＢ、Ｒｏｓａ２６及び／またはＨＰＲＴ）内に組み込まれた導入遺伝子を含む。細胞への遺伝子改変（例えば、核酸の組込み）は、例えばヌクレアーゼのＤＮＡ結合分子が結合する遺伝子の標的部位の１２以上の（例えば１２～３５またはその間の任意の値）の連続するヌクレオチドを含む、部位内、そこでまたはその近くであり得る。組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、内在性プロモーターからの導入遺伝子を発現することができる、または導入遺伝子は、調整及び制御因子（例えば導入遺伝子の発現を引き起こす外因性プロモーター（例えばセーフハーバー遺伝子座内に組み込まれるとき））を含むことができる。特定の実施形態で、導入遺伝子を含む細胞は、ゲノム内に組み込まれる任意のウイルスベクター配列を含まない。細胞は、任意の真核細胞、例えばＣＤ３４＋幹細胞（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）もしくは他の動員剤の投与を介して骨髄から末梢血に患者で動員された、または骨髄もしくは臍帯から直接搾取した患者由来の幹細胞）であり得る。細胞を採取し、精製し、培養し、ならびに任意の適切な方法によってヌクレアーゼ及び／またはドナーを細胞中に導入することができる。

【0029】

本明細書に記載されているように遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物などの組成物も提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＤ３４＋ＨＳＣ／ＰＣまたはＨＳＣ／ＰＣ細胞集団を含む。他の実施形態では、組成物は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはＴＩＬ）を含む。他の更なる実施形態では、Ｔ細胞組成物は、ＣＤ４＋細胞のみ、またはＣＤ８＋細胞のみを含む。

【0030】

別の態様では、本明細書に記載されるように遺伝子改変した細胞を使用する方法が提供される。特定の実施形態では、遺伝子改変した血液細胞前駆体（「ＨＳＣ／ＰＣ」）は、骨髄移植において投与され、ＨＳＣ／ＰＣはｉｎ ｖｉｖｏで分化及び成熟する。いくつかの実施形態において、ＨＳＣ／ＰＣは、Ｇ－ＣＳＦに誘導された動員の後に単離され、他の実施形態では、これらの細胞はヒト骨髄または臍帯から単離される。いくつかの態様では、ＨＳＣ／ＰＣは、特定の遺伝子または調節配列をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼによる処理によって編集される。他の態様では、ＨＳＣ／ＰＣは、野生型遺伝子もしくは他の目的の遺伝子が挿入及び発現され、及び／または内因性の異常な遺伝子が補正されるように、遺伝子操作されたヌクレアーゼとドナー核酸とで改変される。いくつかの実施形態では、改変されたＨＳＣ／ＰＣは、穏やかな骨髄破壊的前処理の後に患者に投与される。他の態様では、移植後に造血細胞の１００％が改変されたＨＳＣ／ＰＣに由来するように、ＨＳＣ／ＰＣは完全な骨髄破壊後に投与される。

【0031】

本発明の方法と組成物は、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）の標的組織の細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ送達効率を増大させるため、対象（例えば、動物）の追加的な治療も含み得る。いくつかの実施形態では、治療は、ＡＡＶ送達の前、その間及び／またはその後に提供される。いくつかの実施形態では、治療は、体液性抗体反応を阻害するために、対象へのステロイドの提供を含む。好適なステロイドの非限定例は、メチルプレドニゾロン（例えばＭｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｓｏｌｕ Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））及びプレドニゾロンを含む。他の実施態様において、治療は、リツキシマブ（例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））などのＢ細胞阻害剤を含む、体液性反応の阻害剤の使用を含む。他の更なる実施形態において、治療方法は、少なくともステロイド及びＢ細胞阻害剤で動物を治療するなどの送達効率を上昇させるために、群を組み合わせる。これらの治療群は、ＡＡＶによる動物の治療の前、その間またはその後に使用することができる。

【0032】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法及び組成物は、導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の濃度が、抗治療用タンパク質抗体の一時的増大の後、治療的に関連したレベルで残るように、治療的タンパク質への哺乳動物の忍容性を誘導するために用いることができる。したがって、対象の治療用タンパク質への忍容性を誘導する方法が本明細書に開示されており、前記方法は、本明細書に記載されるような方法を使用して（例えば、細胞が治療用タンパク質を生成するように）、動物が治療用タンパク質に寛容化されるように、所望により追加の組成物（例えば、ステロイド及び／またはＢ細胞阻害剤）で対象を治療することと共に、対象の細胞を遺伝子改変することを含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質のレシピエント細胞への挿入は、免疫抑制性ステロイドまたはＢ細胞阻害剤による治療と同時に行われ、他の場合では、免疫調節剤は使用されない。場合によっては、免疫調節剤は、抗治療用タンパク質抗体が生成される場合のみ投与される。更なる場合において、免疫調節剤はしばらくして中止する。したがって核酸を対象（例えば血友病などの疾患に罹患した対象）の細胞に導入する方法が提供されており、前記方法は、ドナー分子（例えば、治療用タンパク質（例えば凝固因子、所望によりＶＩＩＩ因子及び／またはＩＸ因子）をコードする導入遺伝子）及び少なくとも１つのステロイド及び／または少なくとも１つのＢ細胞阻害剤を含む、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を対象に投与することを含む。特定の実施形態で、対象は哺乳動物であり、導入遺伝子は治療用タンパク質をコードし、哺乳動物は治療用タンパク質に寛容化される。

【0033】

本明細書に記載され方法及び組成物のいずれかで、使用する治療用導入遺伝子は、凝固因子をコードする。好ましい実施形態で、導入遺伝子は、ＦＶＩＩＩタンパク質またはＦ．ＩＸタンパク質をコードする。特に好ましい実施形態で、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする導入遺伝子は、Ｂドメインを欠いている（Ｂドメイン欠失またはＢＤＤ）ＦＶＩＩＩをコードする。

【0034】

他の実施態様において、本明細書に記載されているように遺伝子改変したＴ細胞を使用する方法が提供される。場合によっては自家Ｔ細胞（患者に由来）を使用し、他の実施形態では異質遺伝子型（ドナーに由来）が使用される。場合によっては、Ｔ細胞は、アフェレーシスによってドナーまたは患者から分離されて、それからｅｘ ｖｉｖｏ処理して、所望の遺伝子改変を得る。そうして、患者への注入のために多くの細胞を得るために、改変Ｔ細胞を増殖させる。いくつかの実施形態では、単離されたＴ細胞は最初に増殖して、それから所望の遺伝子改変を得るために改変される。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、特定の遺伝子または調節配列をノックアウトするように設計されたヌクレアーゼによる処理によって編集される。他の態様では、Ｔ細胞は、野生型遺伝子もしくは他の目的の遺伝子が挿入及び発現され、及び／または内因性の異常な遺伝子が補正されるように、遺伝子操作されたヌクレアーゼとドナー核酸とで改変される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは周知の方法（例えば、Ｅｌｌｅｂａｅｋ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １０：１６９のみを参照のこと）により切除した腫瘍組織から分離され、更なる実施形態で、患者は、腫瘍組織の切除の後だが、改変ＴＩＬの注入前に、免疫療法を受けることができる。他の更なる実施形態で、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。更に細胞は、細胞周期のＧ２期で停止され得る。

【0035】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の特異的疾患を治療するまたは予防するための、方法及び組成物を含む。いくつかの実施形態で、前記方法及び組成物は、癌（例えば濾胞性リンパ腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、神経膠芽腫、慢性リンパ性白血病またはＣＬＬ及び急性リンパ性白血病またはＡＬＬ、卵巣癌、前立腺、結腸、腎細胞及び細胞腫）を治療するために使用する（例えばＫｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３，ｅ１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．７を参照のこと）。他の実施態様において、前記方法及び組成物は、例えばＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ（Ｓａｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｇｕｔ
０：１－１２を参照）、エボラ、ＣＭＶ、ＥＢＶ及びアデノウイルスなどの感染症を治療するために用いる。他の更なる態様において、本発明の方法及び組成物は、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、ループス及び強皮症）の治療を含む。

【0036】

別の態様においては、対象の癌を治療する方法が提供されており、前記方法は記載した方法のいずれかによって核酸を単離された細胞に導入することを含み、そこでドナー分子は、細胞がＣＡＲを発現するようにＣＡＲをコードして、ＣＡＲを発現する細胞を対象に投与する配列を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲコード配列は、ヌクレアーゼによる遺伝子開裂の後、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４及び／またはＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれる。特定の実施形態において、ＣＡＲコード配列は、開裂後、ヌクレアーゼによる遺伝子の開裂後に第１の遺伝子（例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４及び／またはＴＲＡＣ遺伝子）に組み込まれ、第２の（異なる）遺伝子（例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４及び／またはＴＲＡＣ遺伝子）は、第２のヌクレアーゼによって不活性化される。

【0037】

いくつかの実施形態において、遺伝子導入ＨＳＣ／ＰＣ細胞もしくはＴ細胞、及び／または動物は、ヒト遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。場合によっては、遺伝子導入動物は、外因性導入遺伝子に対応する内因性遺伝子座のノックアウトを含み、それによって、ヒトタンパク質が単離で試験され得るｉｎ ｖｉｖｏシステムの開発を可能にする。そのような遺伝子導入モデルは、小分子もしくは大きい生体分子、または目的のヒトタンパク質と相互作用し得るもしくはそれを改変し得る他の実体を同定するために、スクリーニング目的で使用され得る。いくつかの態様において、導入遺伝子は、本明細書に記載の方法のいずれかによって得られた幹細胞（例えば、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞または前駆細胞など）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋（Ｔｒｅｇを含む）またはＴＩＬ）または動物胚中の選択された遺伝子座（例えば、セーフハーバー）内に組み込まれ、次いで胚は、生きた動物が出生するように移植される。それから動物は性的成熟期になるまで育成され、子孫を生じさせて、子孫の少なくとも一部は、編集された内因性遺伝子配列または組み込まれた導入遺伝子を含む。

【0038】

本発明のＡＡＶ及び核酸を含むキットも提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子、または適切な発現ベクター中に含有されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、適切な幹細胞性改変因子、本発明の方法を実施するための指示書などを含み得る。これらのキットは、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーなどの目的のドナー分子も含み得る。

【0039】

これら及び他の態様は、全体としての開示を踏まえて、当業者に容易に明らかである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸を分離細胞内に導入する方法であって、前記方法が、
成長因子受容体結合の少なくとも１つの阻害剤の存在下で、ドナー分子を含む、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
（項目２）
前記成長因子阻害剤が、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、Ｍｅｔ／肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、リポアラビノマンナン受容体（ＬａｍＲ）、αＶβ５インテグリン受容体、細胞間接着分子１受容体（Ｉｃａｍ－１）及び／または血小板由来成長因子受容体に結合することを阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ドナー分子が前記細胞で発現する導入遺伝子を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記導入遺伝子が前記細胞の前記ゲノム内に組み込まれる、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記導入遺伝子がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、項目４に記載の方法。
（項目６）
少なくとも１つのヌクレアーゼを前記細胞内に導入することを更に含み、前記導入遺伝子が、前記ヌクレアーゼによる１つ以上の遺伝子の開裂の後、前記細胞の１つ以上の遺伝子内に組み込まれ、前記方法が前記細胞の１つ以上の追加の遺伝子を不活性化する第２のヌクレアーゼを導入することを更に含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記ヌクレアーゼが、プログラムされた細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）遺伝子、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び／またはＴ細胞受容体α（ＴＲＡＣ）遺伝子を切断する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記細胞が、造血幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
対象の癌を治療する方法であって、
前記方法が、項目１～８のいずれか一項に記載の方法に従って核酸を細胞内に導入することであって、そこで前記細胞がＣＡＲを発現するように、ドナー分子が前記ＣＡＲをコードする配列を含む、前記導入することと、
前記対象に前記細胞を投与することと、を含む、前記方法。
（項目１０）
核酸を対象の細胞内に導入する方法であって、前記方法が、
ドナー分子及び少なくとも１つのステロイド及び／または少なくとも１つのＢ細胞阻害剤を含む、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を対象に投与することを含む、前記方法。
（項目１１）
前記ドナー分子が導入遺伝子をコードする配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記対象が哺乳動物であり、前記導入遺伝子が治療用タンパク質をコードし、更に前記哺乳動物が治療用タンパク質に寛容化される、項目１０または項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記対象が血友病を有し、前記ドナー分子がＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子などの凝固因子をコードする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
核酸を細胞内に導入する方法であって、前記方法が、
核酸を含むドナー分子を細胞内に投与することと、
ヌクレアーゼを前記細胞に投与すること、を含み、前記ヌクレアーゼが、ドナー分子の１～４８時間後またはその前の４時間以内に投与され、更に前記ドナー分子が、前記ヌクレアーゼによる開裂後、前記細胞の前記ゲノム内に組み込まれる、前記方法。
（項目１５）
１つ以上の導入遺伝子を細胞のゲノム内に導入する方法であって、前記方法が、
少なくとも１つのヌクレアーゼを前記細胞内に導入することを含み、前記少なくとも１つのヌクレアーゼは、前記１つ以上の導入遺伝子が前記細胞の前記ゲノム内に組み込まれるように、前記細胞の前記ゲノムを切断し、更に（ｉ）前記少なくとも１つのヌクレアーゼの前に前記ドナーベクターが前記細胞内に導入される場合、前記少なくとも１つのヌクレアーゼは、前記ドナーベクターが導入された後、４８時間以内に前記細胞内に導入されて、（ｉｉ）前記ドナーベクターの前に前記少なくとも１つのヌクレアーゼが導入される場合、前記ドナーベクターは、前記少なくとも１つのヌクレアーゼが導入された後、４時間以内に前記細胞に導入される、前記方法。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】Ｔ細胞導入遺伝子ドナーベクターのデザインを示す。ドナーは、切断部位に隣接するゲノム配列に相同の右（Ｒ）及び左（Ｌ）相同性アームを含む。ドナーは、目的の導入遺伝子に結合するプロモーター配列も含む。導入遺伝子は、操作された抗原受容体（例えばＣＡＲ、ＴＣＲまたはＡＣＴＲ）をコードする。ポリＡシグナル伝達配列は、導入遺伝子の効率的な発現を得るために、ドナーにもある。Ｔ細胞を形質導入するために使用する方法も示される。

【図2】培養基に存在する血清が、ドナーのＣＤ３＋Ｔ細胞への標的化された組込みに有する、効果を示すグラフである。ＲＦＬＰドナーを含むＡＡＶ２／６の増加した投与量で検出した、組込まれたＲＦＬＰの割合によってドナーの組込みは測定される。ＣＣＲ５特異的ＺＦＮは、ｍＲＮＡ電気穿孔法を介して送達された。

【図3】ＡＡＶ２／６形質導入した細胞のヌクレアーゼ活性を示すグラフである。示した阻害剤（ウイルス受容体へのＡＡＶの結合を阻害する）の存在下で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、一対のヒトアルブミン特異的ＺＦＮを含むＡＡＶ２／６の３ｅ４ ｖｇ／細胞のＭＯＩ（感染多重度）により形質導入された。形質導入の３日後、ゲノムＤＮＡは細胞から分離されて、ＺＦＮ切断部位周辺の小さな挿入及び欠失の形で（ｉｎｄｅｌ％）ヌクレアーゼ活性について分析した。阻害剤は示された濃度で使用されて、ＰＤＧＦＲの阻害剤が観察した活性の量を増加させることをデータは示す。

【図4】リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸによるｍＲＮＡ形質導入を介して送達された、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を示すグラフである。データは、図３に示される結果と異なることを示し、ＡＡＶ２／６送達が使用した際、ＰＤＧＦＲ阻害剤の濃度を上昇させることは検出したｉｎｄｅｌの数に影響を及ぼさない。したがって、ＰＤＧＦＲ阻害剤の存在下で観察されるｉｎｄｅｌ頻度の増加は、ＤＮＡ切断修復経路に直接作用する阻害剤が原因ではない。

【図5】アルブミン特異的ＺＦＮならびにＰＤＧＦＲ及びＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせを含む、ＡＡＶによるＨｅｐ３Ｂ細胞の処理後のヌクレアーゼ活性を示すグラフであり、各条件は２回ずつ行われた。両方の阻害剤型の存在下でｉｎｄｅｌ形成の増加がないことを、結果は示す。

【図6】阻害剤をＨｅｐＧ２細胞で使用したときのヌクレアーゼ活性を示すグラフである。異なる阻害剤の濃度が以下のデータに示されており、ＺＦＮ含有ＡＡＶ２／６（３ｅ４ｖｇ／細胞のＭＯＩ）のこの用量で、ＰＤＧＦＲ阻害剤は増加した検出可能なヌクレアーゼ活性をもたらすことを実証する。

【図7】血清及び示したウイルス受容体阻害剤の存在下または不存在下で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞のヌクレアーゼ活性を示すグラフである。各データセットは血清の有無の結果を示し、すべての阻害剤は、ＺＦＮ含有ＡＡＶ２／６を用いて試験した。各セットの左のグラフは血清のない状態で測定したデータに対応しており、各セットの右のグラフは血清有りで行われた実験の結果である。Ｈｅｐ３Ｂで、約４０倍血清がある場合に、全体のＡＡＶ２／６形質導入が下がることをデータは示す。しかし、ＰＤＧＦＲ阻害剤の存在下で、ＡＡＶ形質導入は、検出可能な２０％のｉｎｄｅｌがあって頑強である。

【図8】血清の存在下または不存在下でＰＤＧＦＲ阻害剤がある場合、ｉｎｄｅｌ検出の倍増を示すグラフである。２つの条件においてＺＦＮのみと比較して、検出したｉｎｄｅｌ形成の倍増変化としてデータをプロットした。実験を血清で実施したとき、血清中ＺＦＮのみと比較してＰＤＧＦＲ阻害剤がある場合、検出されるｉｎｄｅｌは７０倍増加したことをこのデータは示す。

【図9】初代肝細胞のＡＡＶ取り込みでのＰＤＧＦＲ阻害剤２（クレノラニブ）の効果を示すグラフである。阻害剤がない場合と比較して、ＰＤＧＦＲ阻害剤９μＭが、検出されたｉｎｄｅｌの大きい増加を引き起こしたことを、データは証明する。

【図10A】図１０Ａ及び図１０Ｂは、非ヒト霊長類試験における投与概略を示す。試験物投与後のリツキサン（登録商標）及びソルメドロール（登録商標）投与を、図１０Ａは示す。試験物投与前のリツキサン（登録商標）及びソルメドロール（登録商標）投与を、図１０Ｂは示す。

【図10B】図１０Ａ及び図１０Ｂは、非ヒト霊長類試験における投与概略を示す。試験物投与後のリツキサン（登録商標）及びソルメドロール（登録商標）投与を、図１０Ａは示す。試験物投与前のリツキサン（登録商標）及びソルメドロール（登録商標）投与を、図１０Ｂは示す。

【図11A】図１１Ａ～図１１Ｄは、ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）を運ぶＡＡＶドナーによるＮＨＰの処理後、全ＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ用量によるピークヒトＦ．ＩＸレベルを表すグラフである。図１１Ａ及び図１１Ｂは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ａは、グループ３（実施例を参照、１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ４（９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：４、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ５（６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：２、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ７（中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：２、２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）の用量曲線を示す。図１１Ｂは、ＺＦＮ：ＺＦＮ：ｈＦ９ドナーの１：１：８比におけるＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー用量レベルによる、ピーク循環ｈＦ．ＩＸレベルについてまとめている。図１１Ｃは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ｄは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図11B】図１１Ａ～図１１Ｄは、ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）を運ぶＡＡＶドナーによるＮＨＰの処理後、全ＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ用量によるピークヒトＦ．ＩＸレベルを表すグラフである。図１１Ａ及び図１１Ｂは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ａは、グループ３（実施例を参照、１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ４（９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：４、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ５（６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：２、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ７（中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：２、２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）の用量曲線を示す。図１１Ｂは、ＺＦＮ：ＺＦＮ：ｈＦ９ドナーの１：１：８比におけるＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー用量レベルによる、ピーク循環ｈＦ．ＩＸレベルについてまとめている。図１１Ｃは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ｄは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図11C】図１１Ａ～図１１Ｄは、ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）を運ぶＡＡＶドナーによるＮＨＰの処理後、全ＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ用量によるピークヒトＦ．ＩＸレベルを表すグラフである。図１１Ａ及び図１１Ｂは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ａは、グループ３（実施例を参照、１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ４（９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：４、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ５（６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：２、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ７（中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：２、２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）の用量曲線を示す。図１１Ｂは、ＺＦＮ：ＺＦＮ：ｈＦ９ドナーの１：１：８比におけるＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー用量レベルによる、ピーク循環ｈＦ．ＩＸレベルについてまとめている。図１１Ｃは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ｄは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図11D】図１１Ａ～図１１Ｄは、ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）を運ぶＡＡＶドナーによるＮＨＰの処理後、全ＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ用量によるピークヒトＦ．ＩＸレベルを表すグラフである。図１１Ａ及び図１１Ｂは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ａは、グループ３（実施例を参照、１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ４（９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：４、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ５（６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：２、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、グループ７（中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：２、２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）の用量曲線を示す。図１１Ｂは、ＺＦＮ：ＺＦＮ：ｈＦ９ドナーの１：１：８比におけるＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー用量レベルによる、ピーク循環ｈＦ．ＩＸレベルについてまとめている。図１１Ｃは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、用量曲線を示す。図１１Ｄは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図12A】図１２Ａ～図１２Ｃは、１：１：８用量比グループにおけるＮＨＰの処理後、遺伝子改変のレベル（Ｉｎｄｅｌ％）を示すグラフである。図１２Ａは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、２８日目のＩｎｄｅｌ％を示す。グループ３（１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）。図１２Ｂは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、６１日目のＩｎｄｅｌ％を示す。図１２Ｃは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図12B】図１２Ａ～図１２Ｃは、１：１：８用量比グループにおけるＮＨＰの処理後、遺伝子改変のレベル（Ｉｎｄｅｌ％）を示すグラフである。図１２Ａは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、２８日目のＩｎｄｅｌ％を示す。グループ３（１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）。図１２Ｂは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、６１日目のＩｎｄｅｌ％を示す。図１２Ｃは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図12C】図１２Ａ～図１２Ｃは、１：１：８用量比グループにおけるＮＨＰの処理後、遺伝子改変のレベル（Ｉｎｄｅｌ％）を示すグラフである。図１２Ａは、試験物投与後のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、２８日目のＩｎｄｅｌ％を示す。グループ３（１．５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、高用量ＺＦＮ＋ｈＦ９）、グループ６（５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、１：１：８、中用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー）、及びグループ８（低用量ＺＦＮ＋ｈＦ９ドナー、１：１：８、１．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）。図１２Ｂは、試験物投与前のリツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）によるＮＨＰ試験における、６１日目のＩｎｄｅｌ％を示す。図１２Ｃは、リツキサン（登録商標）／ソルメドロール（登録商標）投与後（灰色）及びその前（黒）両方の収集データを示す。

【図13A】図１３Ａ～図１３Ｄは、ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）Ｂドメイン欠失（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）タンパク質を運ぶＡＡＶドナーを使用したＮＨＰ試験における、ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの概要を表すグラフである。図１３Ａは、グループ２動物（ＡＡＶ２／６、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｂは、グループ３動物（ＡＡＶ２／６、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｃは、グループ４動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｄは、グループ５動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。ヒトＶＩＩＩ因子の１Ｕ／ｍＬは生理的正常値と考えられ、したがって正常な生理的循環ヒトＶＩＩＩ因子の１００％に等しい。

【図13B】図１３Ａ～図１３Ｄは、ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）Ｂドメイン欠失（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）タンパク質を運ぶＡＡＶドナーを使用したＮＨＰ試験における、ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの概要を表すグラフである。図１３Ａは、グループ２動物（ＡＡＶ２／６、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｂは、グループ３動物（ＡＡＶ２／６、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｃは、グループ４動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｄは、グループ５動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。ヒトＶＩＩＩ因子の１Ｕ／ｍＬは生理的正常値と考えられ、したがって正常な生理的循環ヒトＶＩＩＩ因子の１００％に等しい。

【図13C】図１３Ａ～図１３Ｄは、ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）Ｂドメイン欠失（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）タンパク質を運ぶＡＡＶドナーを使用したＮＨＰ試験における、ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの概要を表すグラフである。図１３Ａは、グループ２動物（ＡＡＶ２／６、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｂは、グループ３動物（ＡＡＶ２／６、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｃは、グループ４動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｄは、グループ５動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。ヒトＶＩＩＩ因子の１Ｕ／ｍＬは生理的正常値と考えられ、したがって正常な生理的循環ヒトＶＩＩＩ因子の１００％に等しい。

【図13D】図１３Ａ～図１３Ｄは、ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）Ｂドメイン欠失（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）タンパク質を運ぶＡＡＶドナーを使用したＮＨＰ試験における、ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの概要を表すグラフである。図１３Ａは、グループ２動物（ＡＡＶ２／６、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｂは、グループ３動物（ＡＡＶ２／６、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｃは、グループ４動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。図１３Ｄは、グループ５動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）の結果を示す。ヒトＶＩＩＩ因子の１Ｕ／ｍＬは生理的正常値と考えられ、したがって正常な生理的循環ヒトＶＩＩＩ因子の１００％に等しい。

【図14】１０３日目のすべての免疫抑制の除去を含む、ヒトＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）試験における投与スキームを示す。リツキサン及びソルメドロール投与の概要。リツキサン（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）投与は試験物投与前であり、メチルプレドニゾロン（ソルメドロール）（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）投与は１０３日目まで毎日あった。

【図15】非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の処理後、試験にわたるピークヒトＦＶＩＩＩ抗原濃度を示すグラフである。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇの用量レベル（ｎ＝３）で、ヒトの正常ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの１１１．０％、４９３．９％及び８４０．０％のピーク値（ｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡで測定される全体の平均４８１．６％）は得られた。６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３）を表す高用量で、ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの４５０．０％、６２５．６％及び８８６．７％［全体の平均６５４．１％］のピーク値は得られた。

【図16A】図１６Ａ～図１６Ｃは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／６－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの低用量（２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ２）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。すべての３つのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物２１０１、２１０２及び２１０３）の結果を示す。

【図16B】図１６Ａ～図１６Ｃは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／６－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの低用量（２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ２）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。すべての３つのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物２１０１、２１０２及び２１０３）の結果を示す。

【図16C】図１６Ａ～図１６Ｃは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／６－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの低用量（２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ２）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。すべての３つのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物２１０１、２１０２及び２１０３）の結果を示す。

【図17A】図１７Ａ～図１７Ｃは、投与後１８０日の期間にわたるＡＡＶ２／６－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ３）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。すべての３つのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物３１０１、３１０２及び３１０３）の結果を示す。

【図17B】図１７Ａ～図１７Ｃは、投与後１８０日の期間にわたるＡＡＶ２／６－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ３）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。すべての３つのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物３１０１、３１０２及び３１０３）の結果を示す。

【図17C】図１７Ａ～図１７Ｃは、投与後１８０日の期間にわたるＡＡＶ２／６－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ３）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。すべての３つのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物３１０１、３１０２及び３１０３）の結果を示す。

【図18A】図１８Ａ～図１８Ｄは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ４）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１８Ａ～１８Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１８Ｄは、動物４１０３についてのグラフの低値の「ブローアップ」である（１８Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１８ＤがＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物４１０１、４１０２及び４１０３）の結果を示す。

【図18B】図１８Ａ～図１８Ｄは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ４）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１８Ａ～１８Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１８Ｄは、動物４１０３についてのグラフの低値の「ブローアップ」である（１８Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１８ＤがＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物４１０１、４１０２及び４１０３）の結果を示す。

【図18C】図１８Ａ～図１８Ｄは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ４）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１８Ａ～１８Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１８Ｄは、動物４１０３についてのグラフの低値の「ブローアップ」である（１８Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１８ＤがＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物４１０１、４１０２及び４１０３）の結果を示す。

【図18D】図１８Ａ～図１８Ｄは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ４）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１８Ａ～１８Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１８Ｄは、動物４１０３についてのグラフの低値の「ブローアップ」である（１８Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１８ＤがＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物４１０１、４１０２及び４１０３）の結果を示す。

【図19A】図１９Ａ～図１９Ｅは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ５）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１９Ａ～１９Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１９Ｄ及び図１９Ｅは、グラフの低値の「ブローアップ」である（１９Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１９Ｄ及び１９Ｅの軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物５１０１、５１０２及び５１０３）の結果を示す。

【図19B】図１９Ａ～図１９Ｅは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ５）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１９Ａ～１９Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１９Ｄ及び図１９Ｅは、グラフの低値の「ブローアップ」である（１９Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１９Ｄ及び１９Ｅの軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物５１０１、５１０２及び５１０３）の結果を示す。

【図19C】図１９Ａ～図１９Ｅは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ５）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１９Ａ～１９Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１９Ｄ及び図１９Ｅは、グラフの低値の「ブローアップ」である（１９Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１９Ｄ及び１９Ｅの軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物５１０１、５１０２及び５１０３）の結果を示す。

【図19D】図１９Ａ～図１９Ｅは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ５）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１９Ａ～１９Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１９Ｄ及び図１９Ｅは、グラフの低値の「ブローアップ」である（１９Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１９Ｄ及び１９Ｅの軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物５１０１、５１０２及び５１０３）の結果を示す。

【図19E】図１９Ａ～図１９Ｅは、投与後１６８日の期間にわたるＡＡＶ２／８－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡの高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、グループ５）を投与した、個々のカニクイザル（ｎ＝３）からの結果を示すグラフである。１９Ａ～１９Ｃのグラフで、ＥＬＩＳＡにより測定された血漿のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの濃度は、黒で示される。そのうえ血漿の抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する濃度（ベセスダ単位と示す）は、灰色で示される。図１９Ｄ及び図１９Ｅは、グラフの低値の「ブローアップ」である（１９Ａ～Ｃのｙ軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～５Ｕ／ｍＬからはじまり、１９Ｄ及び１９Ｅの軸がＦＶＩＩＩ抗原の０～１Ｕ／ｍＬからはじまることに注意）。水平点線はベセズダ単位カットオフポイントを表し、その下の値は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体において陽性とはみなされない。ソルメドロールは、垂直点線で示される１０３日目で止めた。各グラフは、１匹のサル（動物５１０１、５１０２及び５１０３）の結果を示す。

【図20A】図２０Ａ～図２０Ｄは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍシングルならびダブルノックアウト（ＫＯ）、ならびに標的化された組込み（ＴＩ）のＦＡＣｓ分析を示す。ＴＲＡＣ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の８８％がＴＲＡＣ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７１％がＴＲＡＣ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ａは示す。Ｂ２Ｍ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の９３％がＢ２Ｍ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７２％がＢ２Ｍ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ｂは示す。ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの両方が同じ細胞（ダブルＫＯ／改変遺伝子細胞）で標的とされる細胞の分析を、図２０Ｃ及び図２０Ｄは示す。

【図20B】図２０Ａ～図２０Ｄは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍシングルならびダブルノックアウト（ＫＯ）、ならびに標的化された組込み（ＴＩ）のＦＡＣｓ分析を示す。ＴＲＡＣ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の８８％がＴＲＡＣ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７１％がＴＲＡＣ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ａは示す。Ｂ２Ｍ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の９３％がＢ２Ｍ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７２％がＢ２Ｍ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ｂは示す。ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの両方が同じ細胞（ダブルＫＯ／改変遺伝子細胞）で標的とされる細胞の分析を、図２０Ｃ及び図２０Ｄは示す。

【図20C】図２０Ａ～図２０Ｄは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍシングルならびダブルノックアウト（ＫＯ）、ならびに標的化された組込み（ＴＩ）のＦＡＣｓ分析を示す。ＴＲＡＣ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の８８％がＴＲＡＣ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７１％がＴＲＡＣ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ａは示す。Ｂ２Ｍ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の９３％がＢ２Ｍ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７２％がＢ２Ｍ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ｂは示す。ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの両方が同じ細胞（ダブルＫＯ／改変遺伝子細胞）で標的とされる細胞の分析を、図２０Ｃ及び図２０Ｄは示す。

【図20D】図２０Ａ～図２０Ｄは、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍシングルならびダブルノックアウト（ＫＯ）、ならびに標的化された組込み（ＴＩ）のＦＡＣｓ分析を示す。ＴＲＡＣ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の８８％がＴＲＡＣ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７１％がＴＲＡＣ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ａは示す。Ｂ２Ｍ－ヌクレアーゼ／ＡＡＶ ＧＦＰドナー処理細胞の９３％がＢ２Ｍ遺伝子を不活性化し（左パネル）、細胞の７２％がＢ２Ｍ遺伝子内に組み込まれたＡＡＶ送達ＧＦＰドナーを有する（右パネル）ことを、図２０Ｂは示す。ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍの両方が同じ細胞（ダブルＫＯ／改変遺伝子細胞）で標的とされる細胞の分析を、図２０Ｃ及び図２０Ｄは示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

遺伝子治療及びゲノム遺伝子操作に使用するための細胞の形質導入の組成物及び方法を、本明細書に開示する。特に、標的化された開裂、続いて非相同末端結合による、外因性配列または遺伝子変化のヌクレアーゼ媒介性（すなわちＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃａｓ及び／またはＣｆｐ１）系）標的化された組込みを、細胞に効率的に得る。ＨＳＣ／ＰＣ及び初代Ｔ細胞の形質導入及び遺伝子操作に特に有用であるが、前記方法及び組成物は他の細胞型にも使用することができる。

【0042】

ＺＦＮ及びドナーテンプレートＤＮＡの送達は、細胞表面受容体へのウイルスベクターの結合を阻害するウイルスベクター及び／または分子を使用して、本明細書に詳述されるように最適化された。本明細書で記載される方法及び組成物は、ＣＤ３４＋細胞などの任意の造血幹細胞または前駆体細胞を含む、細胞型で使用可能である。ＣＤ３４＋細胞は、原始（ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋、またはＣＤ９０－）、初期（ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋）及び委任（ＣＤ３４＋ＣＤ１３３－）ＣＤ３４＋サブセットならびにＴ細胞を含み得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋細胞、またはＴＩＬを含むことができる。本出願に含まれる方法及び組成物は、ＡＡＶを介して一次細胞に核酸を送達するためのｉｎ ｖｉｖｏ使用にも関することができる。本明細書に記載の方法により、改変細胞で処置した動物の長期の多系列移植がもたらされる。

【0043】

概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製及び使用の実施は、特に指示がない限り、当該技術分野の範囲内である分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及びＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。

【0044】

定義
「核酸」「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同じ意味で使用され、直鎖状もしくは環状配座の、一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈してはならない。前記用語は、天然ヌクレオチドの周知の類似体、ならびに塩基、糖及び／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）に修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する、すなわちＡの類似体はＴと塩基対合する。

【0045】

「ポリペプチド」「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は同じ意味で使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。前記用語は、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然起源アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。

【0046】

「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的な非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。このような相互作用は一般に、１０^－６Ｍ^－１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」とは結合の強度を指し、結合親和性の増大はより低いＫ_ｄと相関性がある。

【0047】

「結合タンパク質」は、別の分子と結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）及び／または異なるタンパク質（複数可）の１つ以上の分子に結合できる。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有し得る。例えばジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合及びタンパク質結合活性を有する。

【0048】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）はタンパク質である、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。

【0049】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ繰り返しドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらの繰り返しドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「繰り返し単位」（「繰り返し」とも呼ぶ）は通常３３～３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ繰り返し配列と少なくともいくつかの配列相同性を示す。

【0050】

ジンクフィンガー及びＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の遺伝子操作（１つ以上のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作され」得る。したがって遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定例は、デザイン及び選択である。デザインしたＤＮＡ結合タンパク質は、そのデザイン／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。デザインの合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥのデザイン及び結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照、更に国際特許第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号及び同第ＷＯ０３／０１６４９６号も参照のこと。

【0051】

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験過程から主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際特許第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照のこと。

【0052】

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与していると考えられる原核アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌サーマスサーモフィラスに由来する（例えばＳｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ，ｉｂｉｄ，Ｇ．Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２を参照）。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による開裂におけるガイドＤＮＡを含む、必要とされるすべての構成成分である。

【0053】

「組換え」とは、限定されないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換えによるドナー捕捉を含む、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指す。本開示の目的において、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば相同組換え修復機序を介した細胞の二本鎖切断の修復の間に行われる、このような交換の特殊形態を指す。この工程はヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）のテンプレート修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移動を引き起こすので、「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に周知である。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、このような移動は、切断された標的とドナーの間に形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／または標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、及び／または関連する工程に関与し得る。このような特殊ＨＲは多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。

【0054】

本開示の方法では、本明細書に記載される１つ以上の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。ドナー配列は物理的に組み込まれることができ、またはドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介した切断の修復のテンプレートとして使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列のすべてまたは一部の導入を生じる。したがって細胞クロマチン中の第１配列は変更され得て、特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって「置き換える」または「置換」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものによる置換（すなわち、情報的意味での配列の置換）を表すと理解され得て、１つのポリヌクレオチドの別のものによる物理または化学置換を必ずしも必要としない。

【0055】

本明細書に記載の方法のいずれかで、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質またはＴＡＬＥＮの追加の対は、細胞内の更なる標的部位の更なる二本鎖開裂に使用され得る。

【0056】

本明細書に記載される方法のいずれかは、任意のサイズのドナーの挿入、及び／または目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１つ以上の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。

【0057】

更に本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１つ以上の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、及び１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。更に外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を生成し得る。

【0058】

細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換え及び／または置換及び／または変更のための方法の特定の実施形態では、染色体の配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。このような相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。

【0059】

本明細書に記載される方法のいずれかで、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得て、それによって目的の領域に非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって特定の実施形態で、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０～９９％の間（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列の間の相同性は、例えば１つのヌクレオチドのみが１００を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列の間で異なる場合、９９％よりも高い。特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０～１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、ドナー配列は第１配列に非相同であり、非相同組換え機序によってゲノム中に挿入される。

【0060】

「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂及び二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。

【0061】

「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と共に、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。「第１及び第２の開裂ハーフドメイン」「＋及び－の開裂ハーフドメイン」及び「右及び左の開裂ハーフドメイン」という用語は同じ意味で用いられ、二量体化する開裂ハーフドメインの対を指す。

【0062】

「遺伝子操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン）と絶対ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。例えば、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号、及び同第２０１１／０２０１０５５号も参照し、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0063】

「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得て、直鎖状、環状または分枝状であり得て、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２ヌクレオチド長と１００，０００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長と１００，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約１００ヌクレオチド長と５，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の値）、更により好ましくは約１００と２，０００塩基対との間（またはそれらの間の任意の値）のものであり得る。

【0064】

「相同非同一配列」は、第２配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列と同一ではない第１配列を指す。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列と相同かつ非同一である。特定の実施形態において、２つの配列の間の相同性の程度は、正常な細胞機序を利用して、その間の相同組換えを可能にするために十分なものである。２つの相同非同一配列は任意の長さであり得て、その非相同性の程度は、単一のヌクレオチドほどに小さくても（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の補正のため）、１０キロベースまたはそれを超えるほどに大きくてもよい（例えば、染色体の所定の異所での遺伝子の挿入のため）。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０と１０，０００のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。

【0065】

核酸及びアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当技術分野において周知である。一般的にこのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定及び／またはそれによってコードされるアミノ酸配列の決定、ならびに第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とこのような配列の比較を含む。この様式でゲノム配列を決定及び比較することもできる。一般に、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、標準的な技術を使用してそれらの同一性％を決定することにより比較することができる。一般的に配列間の同一性％は、少なくとも７０～７５％、好ましくは８０～８２％、より好ましくは８５～９０％、更により好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。

【0066】

あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間に安定的二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化及び消化した断片のサイズ決定により決定することができる。当該技術分野において周知の方法を使用して決定されるとおり、配列が、定義される長さの分子にわたり少なくとも約７０％～７５％、好ましくは８０％～８２％、より好ましくは８５％～９０％、更により好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を提示する場合、２つの核酸または２つのポリペプチド配列は互いに実質的に相同である。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知のものである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対するより低い忍容性と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子は、当業者に周知のものであり、温度、ｐＨ、イオン強度、ならびに例えばホルムアミド及びジメチルスルホキシドなどの有機溶媒の濃度が挙げられるがこれらに限定されない。当業者に周知のとおり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度及びより低い溶媒濃度により増加する。

【0067】

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４のそれぞれ２つを含む、八量体を伴うおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）はヌクレオソームコア間に延在する。ヒストンＨ１の分子が一般的に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的において「クロマチン」という用語は、原核生物及び真核生物の両方のすべての種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチン及びエピソームクロマチンの両方が含まれる。

【0068】

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは多くの場合、細胞のゲノムを含むすべての染色体のコレクションである、その核型によって特徴づけられる。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。

【0069】

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミド及びある特定のウイルスゲノムが含まれる。

【0070】

「到達可能領域」は、核酸に存在する標的部位が、前記標的部位を認識する外因性分子に結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造へパッケージ化されない領域であると考えられている。到達可能領域の独特な構造は、多くの場合、化学的及び酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性により検出することができる。

【0071】

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。

【0072】

「外因性」分子は細胞中に通常は存在しない分子であるが、１つ以上の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」とは、細胞の特定の発生段階または環境条件に関して決定される。したがって例えば筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能型、または正常機能する内因性分子の機能不全型を含み得る。

【0073】

外因性分子はとりわけ、例えばコンビナトリアルケミストリー処理によって生成されるような小分子、または巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上述分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上述分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得て、直鎖状、分枝状または環状であり得て、任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース及びヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。

【0074】

外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は当業者に周知であり、それは、脂質媒介性移入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、生体高分子ナノ粒子送達（Ｎｉｔｔａ ａｎｄ Ｎｕｍａｔａ（２０１３）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １４：１６２９参照）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入及びウイルスベクター媒介性移入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は内因性分子と同じ型の分子でもあり得るが、細胞から由来するのとは異なる種に由来し得る。例えばヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。

【0075】

それに反して「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアもしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。更なる内因性分子には、タンパク質、例えば転写因子及び酵素が含まれ得る。

【0076】

本明細書で使用する場合「外因性核酸の産物」という用語には、ポリヌクレオチド産物及びポリペプチド産物の両方、例えば転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）及び翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。

【0077】

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に結合された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得る、または異なる化学型の分子であり得る。第１型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）及び融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これらに限定されない。第２型の融合分子の例には、三重鎖形成性核酸とポリペプチドの間の融合物、及び小溝結合剤と核酸の間の融合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0078】

細胞での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得て、前記ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランス・スプライシング、ポリペプチド開裂及びポリペプチドライゲーションも、細胞でのタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの送達の方法は、本開示の他の場所で示される。

【0079】

「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにそのような調節配列がコード配列及び／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域が含まれる。したがって遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えばリボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製開始点、マトリックス結合部位、及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

【0080】

「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化及び編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリストイル化及びグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。

【0081】

遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の活性での変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム突然変異）は、発現を調節するために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較して、遺伝子発現の任意の低下を指す。したがって遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。

【0082】

「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望ましい、細胞クロマチンの任意の領域、例えば遺伝子、または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂及び／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えばミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域内（例えばリーダー配列、トレーラー配列またはイントロン）、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。

【0083】

「真核」細胞として、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0084】

「分泌組織」は、通常上皮に由来するいくつかの種類の管腔内に、個別細胞からの産物を分泌する動物の組織である。胃腸管に局在化する分泌組織の例は、腸、膵臓及び胆嚢を覆う細胞を含む。他の分泌組織は、肝臓、目と関連する組織及び粘膜（例えば唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体及び内分泌系の他の器官）を含む。そのうえ分泌組織は、分泌することができる組織型の個別細胞を含む。

【0085】

「機能的連結」及び「機能的連結した」（または「機能的に連結した」）という用語は、２つ以上の成分（例えば配列エレメント）の並置に関連して同じ意味で使用され、前記成分は、両方の成分が正常に機能し、他の成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例として転写調節配列（例えばプロモーター）は、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に機能的に連結される。転写調節配列は一般に、コード配列とシスで機能的に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えばエンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合でも、コード配列に機能的に連結した転写調節配列である。

【0086】

融合ポリペプチドに関して、「機能的に連結した」という用語は、各成分が他の成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えばＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位及び／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、機能的連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン及び開裂ドメインは、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位及び／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位（例えば、１～５００の塩基対、または標的部位の両側の間の任意の値）でＤＮＡを開裂できる場合に、機能的連結状態にある。

【0087】

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得て、及び／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を測定するための方法は、当該技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を測定するための方法は周知である。例えばポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって測定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。上述のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的及び生化学的の両方の相補性によって決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６、米国特許第５，５８５，２４５号及びＰＣＴ出願第ＷＯ９８／４４３５０号を参照のこと。

【0088】

「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を導入させることが可能である。一般的に「ベクター構築物」「発現ベクター」及び「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を導入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがってこの用語は、クローニング及び発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。

【0089】

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくはルーチンアッセイで必須ではないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）ならびに増強された細胞成長及び／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えばＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニターするために、所望の遺伝子配列に機能的に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。

【0090】

「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対する任意の悪影響なしに挿入され得る、ゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が隣接する遺伝子からのいずれのリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座が、最も有益である。哺乳動物細胞のセーフハーバー遺伝子座の非限定例は、ＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第８，１１０，３７９号）、ＣＣＲ５遺伝子（米国特許公開第２００８０１５９９９６号）、Ｒｏｓａ遺伝子座（国際特許第ＷＯ２０１０／０６５１２３号）及び／またはアルブミン遺伝子座（米国特許公開第２０１３０１７７９６０号及び同第２０１３０１７７９８３号）である。植物細胞のセーフハーバーは、ＺＰ１５遺伝子座である（米国特許公開第２０１００１９９３８９号）。

【0091】

「対象」及び「患者」という用語は同じ意味で用いられ、哺乳動物、例えばヒト患者及び非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス及び他の動物を指す。したがって「対象」または「患者」という用語は本明細書で使用する場合、本発明の幹細胞が投与され得る任意の哺乳動物の患者または対象を意味する。本発明の対象は、例えば神経毒素を含む、１つ以上の化学的毒素に曝露されたものを含む。

【0092】

「幹細胞性」とは、幹細胞様の様式で作用する任意の細胞の相対能力、すなわち全能性、多能性または少能性の程度、及び任意の特定の幹細胞が有し得る拡張したまたは不確定の自己複製に関連する。

【0093】

ヌクレアーゼ
導入遺伝子が標的化された様式でゲノム中に組み込まれるように、導入遺伝子と細胞のゲノムの開裂のためのヌクレアーゼを運ぶドナー分子のｉｎ ｖｉｖｏ開裂に有用な組成物、特にヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｔｔａｇｏ及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）が本明細書に記載される。特定の実施形態では、ヌクレアーゼのうちの１つ以上は天然起源である。他の実施形態では、ヌクレアーゼのうちの１つ以上は非天然起源であり、すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン及び／または開裂ドメインに遺伝子操作されている。例えば天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、同系結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメイン及び開裂ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；異種開裂ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔａｇｏ系などの系を含む。

【0094】

Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、ドナー分子に結合するため及び／または細胞のゲノム中の目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５～４０の塩基対の開裂部位を認識し、４つのファミリー、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓｔボックスファミリー及びＨＮＨファミリーへ一般に分類される。代表的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅIＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ
－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩを含む。それらの認識配列は周知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照のこと。

【0095】

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、遺伝子操作された（非天然起源の）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを使用する。ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅIＶ、Ｉ－Ｃｓ
ｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩ）は周知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照のこと。更にホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように遺伝子操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ
ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
７：４９－６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得て（すなわち、ヌクレアーゼが同系開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。

【0096】

他の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物で使用する１つ以上のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは遺伝子操作された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば米国特許第８，５８６，５２６号を参照し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。キサントモナス属の植物病原菌は、重要農植物に多くの疾患を引き起こすことが周知である。キサントモナスの病原性は、２５つ超の異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する、保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかで、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８～６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインを含有する。最もよく特性決定したＴＡＬエフェクターの１つは、キサントモナスカンペストリス病原型ベスカトリア由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７～１３６及び国際特許第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬエフェクターは縦列繰り返しの集中ドメインを含有し、各繰り返しは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である、およそ３４アミノ酸を含有する。更にこれらは、核局在化配列及び酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６～２７２を参照のこと）。更に植物病原細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
ｂｉｏｖａｒ１株ＧＭＩ１０００及びｂｉｏｖａｒ４株ＲＳ１０００のｂｒｇ１１及びｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９～４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列で９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の繰り返しドメインで１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかし両方の遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば米国特許公開第８，５８６，５２６号を参照し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0097】

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらの縦列繰り返し中に見出される配列に依存する。繰り返される配列はおよそ１０２ｂｐを含み、繰り返しは通常互いに９１～１００％相同である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ、同書）。前記繰り返しの多型は１２位及び１３位に通常位置し、１２位及び１３位での超可変二残基の同一性と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの同一性の間には、一対一の相関が存在するようにみえる（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１及びＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９～１５１２を参照のこと）。１２位及び１３位におけるＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ならびにＩＮＧがＴに結合するように、実験的にこれらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは決定されている。これらのＤＮＡ結合の繰り返しは、新たな配列と相互作用でき、植物細胞での非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組み合わせ及び繰り返し数を有するタンパク質内へ組み込まれる（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ、同書）。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイで活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を生じる（プラスミドベース標的）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ（（２０１０年）＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照のこと。

【0098】

特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ ｖｉｖｏ開裂及び／または標的化された開裂に使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するように遺伝子操作されているという点で、非天然起源である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照し、すべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0099】

遺伝子操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。遺伝子操作方法には、合理的デザイン及び種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的デザインには、例えばトリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば共有の米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0100】

ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む、例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号及び同第６，２４２，５６８号、ならびに国際特許第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号及び第ＷＯ０１／８８１９７号に開示されている。更にジンクフィンガー結合ドメインにおける結合特異性の増強は、例えば共有の国際特許第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

【0101】

更にこれら及び他の文献に開示されるように、ジンクフィンガードメイン及び／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。代表的なリンカー配列については、米国特許第８，７７２，４５３号、同第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号及び同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

【0102】

標的部位の選択、融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）のデザイン及び構築のためのＺＦＰならびに方法は当業者に周知であり、米国特許第６，１４０，８１５号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際特許第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、及び同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳細に記載されている。

【0103】

更にこれら及び他の文献に開示されるように、ジンクフィンガードメイン及び／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６以上のアミノ酸長の代表的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

【0104】

特定の実施形態で、ＤＮＡ結合領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号及び米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照のこと。前記系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、及びタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５－１５７５、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４８２－４９６、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００５．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含有する。

【0105】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴決定された系の１つであり、４つの連続した工程で標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡの繰り返し領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識に更に必要とされている、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック型塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つの工程（ｉ）「適応」と呼ばれる過程における、更なる攻撃を防止するためのＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現及びプロセシング、その後の（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉、からなる。したがって細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連して、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。

【0106】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系を使用する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属で同定したＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ系は、ヒト細胞での強力なＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されるが、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９は、ガイドＲＮＡ及び基質特異性に含有される多くの態様で異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，（２０１５）Ｇｅｎｏｍ Ｂｉｏ １６：２５１を参照のこと）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質の間の重大な差は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがってｃｒＲＮＡだけを必要とするということである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡｓは４２～４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチド繰り返し及び２３～２５ヌクレオチドスペーサー）であり、単一のステムループを含有して、それは二次構造を保持する配列変化を許容する。更にＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９に必要とされる約１００ヌクレオチドを操作されたｓｇＲＮＡより著しく短く、及びＦｎＣｐｆ１のＰＡＭ要件は置換した鎖の５’－ＴＴＮ－３’及び５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１の両方が標的ＤＮＡの二本鎖切断を生じさせるが、Ｃａｓ９はそのＲｕｖＣ及びＨＮＨ様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内にブラント末端切断を生じさせ、一方Ｃｐｆ１はＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側に互い違いの切断を作成する。Ｃｐｆ１が大切なシード領域から離れる方向に互い違いの切断を作成するので、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、したがって所望のＨＤＲ再結合事象が起きるまで、Ｃｐｆ１が同じ部位を切断し続け得ることを確実にする。したがって本明細書に記載される方法及び組成物では、「Ｃａｓ」という用語はＣａｓ９及びＣｆｐ１タンパク質の両方を含むものと理解される。したがって本明細書で使用する場合「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼ及び／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指す。

【0107】

特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチド及びその断片の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異、共有結合的修飾、及びその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異、融合物、共有結合的修飾が含まれるが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、及びＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得ることができる、もしくは化学的に合成され得る、またはこれらの２つの手順の組み合わせによって得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得て、核酸は内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の場合、細胞はＣａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。

【0108】

いくつかの実施形態で、ＤＮＡ結合ドメインはＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ，同書、Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，同書を参照のこと）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは小さな（１９～３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、低分子ＲＮＡと標的の間のワトソン・クリック型塩基対合を介して、標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に開裂する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４：９７２～９７３）。それに対し、原核生物Ａｇｏタンパク質は小さな一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来（多くの場合ウイルス）ＤＮＡを検出かつ除去するように機能する可能性が高い（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １９，４０５、Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５１，５９４、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが挙げられる。

【0109】

最もよく特性決定した原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの（ＴｔＡｇｏ、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ、同書）である。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を伴う１５ｎｔまたは１３～２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、第３のＤＮＡ分子内のワトソン・クリック型相補ＤＮＡ配列に結合するために、タンパク質－ＤＮＡ複合体を導くように機能する。これらのガイドＤＮＡの配列情報により標的ＤＮＡの同定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体が標的ＤＮＡを開裂する。そのような機構は、その標的ＤＮＡと結合する一方でＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（Ｇ．Ｓｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＲｓＡｇｏ）由来のＡｇｏは同様の性質を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ、同書）。

【0110】

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡをＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ、同書）。ＴｔＡｇｏ開裂の特異性はガイドＤＮＡによって導かれるので、したがって外因性の研究者指定のガイドＤＮＡと形成されるＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体により、相補的な研究者指定の標的ＤＮＡへのＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ開裂が導かれる。このように、ＤＮＡに標的化された二本鎖切断を生じさせることができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソロガスなＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系）の使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された開裂が可能になる。そのような開裂は、一本鎖または二本鎖でもあり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡの開裂において、哺乳動物細胞での発現についてコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンを使用することが好ましい。更にＴｔＡｇｏタンパク質を細胞透過性ペプチドと融合する場合、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合がある。更に３７℃での活性が改善されるように突然変異誘発によって変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ－ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ開裂を使用して、ＤＮＡ切断を活用するための当該技術分野の標準技術を使用した遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子補正、標的化された遺伝子欠失を含む、転帰のひと揃いを得ることができる。

【0111】

したがってヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれる任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するという点で、ＤＮＡ結合ドメインを含む。本明細書に記載のＤＮＡ結合ドメインは一般的に、１２～３５ヌクレオチド（またはその間の任意の値）を含む標的部位に結合する。ＤＮＡ結合ドメインに結合される標的部位内のヌクレオチドは、隣接または非隣接であり得る（例えばＤＮＡ結合ドメインは、標的部位を形成するすべての塩基対未満と結合することができる）。

【0112】

Ｂ．開裂ドメイン
任意の好適な開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに機能的に連結されて、ヌクレアーゼを形成し得る。例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ（その遺伝子操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図した核酸標的を認識でき、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡが切断されるようにする、機能的物質）を生成する。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（３）：１１５６－１１６０を参照のこと。更に最近になるとＺＦＮは、種々の生命体のゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、及び国際特許公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照のこと。同様にＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼドメインに融合されて、ＴＡＬＥＮを生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。

【0113】

上述のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種（例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメイン及び開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン及び異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン）であり得る。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照のこと。ＤＮＡを開裂する更なる酵素は周知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、リョクトウヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上は、開裂ドメイン及び開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。

【0114】

同様に開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量化を必要とする、上述の任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。更に２つの融合タンパク質における標的部位は、好ましくは互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体化によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、開裂ハーフドメインを置く。したがって特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５～８ヌクレオチドまたは１５～１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２～５０ヌクレオチド対以上）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。

【0115】

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在しており、（認識部位で）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位でＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメイン及び開裂ドメインを有する。例えばＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド及び他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所で、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照のこと。したがって一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。

【0116】

その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ
ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって本開示の目的のため、開示された融合タンパク質で使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがってジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂及び／または標的化された置換において、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒として活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子も使用され得る。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂及び標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。

【0117】

開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体化する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。

【0118】

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、米国特許第７，８８８，１２１号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。更なる制限酵素も、分離可能な結合及び開裂ドメインを含み、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－４２０を参照のこと。

【0119】

特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば米国特許第８，７７２，４５３号、同第８，６２３，６１８号、同第８，４０９，８６１号、同第８，０３４，５９８号、同第７，９１４，７９６号及び同第７，８８８，１２１号に記載される（そのすべての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）ように、ホモ二量体を最小化または防止する１つ以上の遺伝子操作された開裂ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位及び５３８位のアミノ酸残基は、すべて、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。

【0120】

絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な遺伝子操作された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０位及び５３８位のアミノ酸残基での変異を含み、第２の開裂ハーフドメインがアミノ酸残基４８６及び４９９での変異を含む、対が含まれる。

【0121】

したがって一実施形態では、４９０位での変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）に置き換えられ、５３８位での変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）に置き換えられ、４８６位での変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）に置き換えられ、４９９位での変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）に置き換えられる。特に本明細書に記載の遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、一方の開裂ハーフドメインで４９０位（Ｅ→Ｋ）及び５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生し、ならびに別の開裂ハーフドメインで４８６位（Ｑ→Ｅ）及び４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される遺伝子操作された開裂ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書に記載の遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、絶対ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号及び同第８，０３４，５９８号を参照し、その開示が、参照によりすべての目的でその全体を組み込む。特定の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位及び４９６位での突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える突然変異、及び４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメイン及び「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位及び５３７位での突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、及び５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメイン及び「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、４９０位及び５３７位での突然変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える突然変異、及び５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える突然変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメイン及び「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照のこと。他の実施形態では、遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」及び／または「シャーキー」突然変異を含む（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６－１０７を参照のこと）。

【0122】

本明細書に記載の遺伝子操作された開裂ハーフドメインは、例えば米国特許第８，７７２，４５３号、同第８，６２３，６１８号、同第８，４０９，８６１号、同第８，０３４，５９８号、同第７，９１４，７９６号、及び同第７，８８８，１２１号に記載されるように、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位指定突然変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。

【0123】

あるいはヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ ｖｉｖｏアセンブルされ得る（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのような開裂酵素の成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得る、または例えば自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の成分が分離される、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

【0124】

ヌクレアーゼは、例えば米国特許第８，５６３，３１４号に記載の酵母ベースの染色体系での使用前に、活性についてスクリーニングされ得る。

【0125】

ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えばラフィノース及び／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。

【0126】

Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が置かれたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する２つのＲＮＡ非コード成分、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイを含む。ゲノム遺伝子操作を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びプレｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介して、または別々のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、遺伝子操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されてキメラｃｒ－ＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ぶ）を生じる、キメラＲＮＡが構築される（Ｊｉｎｅｋ同書及びＣｏｎｇ、同書を参照）。

【0127】

標的部位
上で詳細に記載したように、ＤＮＡドメインは、選択された任意の配列に結合するように遺伝子操作され得る。遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有し得る。遺伝子操作方法には、合理的デザイン及び種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的デザインには、例えばトリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば共有の米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的デザインも実施され得る。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。

【0128】

ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な代表的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号及び同第６，２４２，５６８号、ならびに国際特許第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号及び英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。更にジンクフィンガー結合ドメインにおける結合特異性の増強は、例えば共有の国際特許第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

【0129】

標的部位の選択、融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のためのヌクレアーゼ及び方法は、当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号及び同第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。

【0130】

更に、これら及び他の文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５以上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して連結され得る。６以上のアミノ酸長の代表的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号も参照のこと。

【0131】

好適な標的遺伝子の非限定例としては、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（γ）グロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、ＶＩＩＩ因子遺伝子、ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ Ｂ遺伝子、ＨＬＡ Ｃ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原プロセシング輸送体（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、Ｒａｇ－１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子及び／またはＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ（複数可）は、チェックポイント阻害剤遺伝子（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、阻害性リガンドのＢ７ファミリーにおける受容体）に結合する及び／またはそれらを開裂する、またはＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲを介したシグナル伝達に伴う受容体もしくはリガンド遺伝子及びキラー阻害性受容体（ＫＩＲ及びＣ型レクチン受容体）を開裂する。Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２（４）：２５２を参照のこと。米国特許第８，９５６，８２８号及び同第８，９４５，８６８号、ならびに米国特許公開第２０１４０１２０６２２号及び同第２０１５００５６７０５号も参照のこと。

【0132】

他の態様では、ヌクレアーゼ（複数可）は、拒絶に関与する因子をコードする遺伝子、例えばＨＬＡ複合体（クラスＩ：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、Ｂ２Ｍ、クラスＩＩ：ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ、ＨＬＡ－ＤＲＢ）もしくはＴＣＲのサブユニットをコードする遺伝子に結合する及び／またはそれらを開裂する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）は、ＨＬＡ複合体（例えばＴＡＰ、タパシン、カルレティキュリン、カルネキシン、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７またはＥｒｐ５７）のためのペプチド負荷処理及び抗原プロセシングに関与する生成物をコードする遺伝子を標的とする。例えば、米国特許第８，９５６，８２８号及び同第８，９４５，８６８号を参照のこと。

【0133】

特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヒト細胞のＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミン及びＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞のＲｏｓａ２６などの「セーフハーバー」遺伝子座（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第８，５８６，５２６号、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６００６３２３１号、同第２００８０１５９９９６号、同第２０１０００２１８２６４号、同第２０１２００１７２９０号、同第２０１１０２６５１９８号、同第２０１３０１３７１０４号、同第２０１３０１２２５９１号、同第２０１３０１７７９８３号及び同第２０１３０１７７９６０号を参照）、ならびに植物のＺｐ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照）を標的とする。

【0134】

ドナー
本開示は、ＨＳＣ／ＰＣのゲノムへの外因性配列のヌクレアーゼ媒介性の標的化された組込みに関する。上述したとおり、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも言う）の挿入は、例えば変異遺伝子を補正するため、または野生型遺伝子の発現を増加させるため、または導入遺伝子の発現のためである。ドナー配列は通常、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、２つの相同性領域に隣接する非相同配列を含有し、目的の位置での効率的なＨＤＲを可能とする。更にドナー配列は、細胞クロマチン内の目的の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば通常は目的の領域に存在しない標的化された配列を挿入するために、前記配列をドナー核酸分子中に存在させることができ、目的の領域中の配列に相同性領域を隣接させることができる。

【0135】

選択された位置内へ挿入するための、任意のポリヌクレオチドの標的化された挿入の方法が、本明細書に記載されている。挿入のためのポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」とも呼ばれ得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、一本鎖及び／または二本鎖であってもよく、直鎖状または環状の形態で細胞内に導入することができる。例えば、米国特許公開第２０１０００４７８０５号及び同第２０１１０２０７２２１号を参照のこと。ドナー配列（複数可）はＤＮＡ ＭＣ形態でも導入されることができ、それは細胞内へ環状または直鎖状の形態で導入されてもよい。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に周知の方法によりドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に添加する、及び／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照のこと。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加の方法としては、末端アミノ基（複数可）の追加、及び例えばホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ－メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。二本鎖形態で導入する場合、ドナーは、１つ以上のヌクレアーゼ標的部位、例えば細胞のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ標的部位を含み得る。例えば、米国特許公開第２０１３０３２６６４５号を参照のこと。

【0136】

ポリヌクレオチドは、例えば複製開始点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加的な配列を有するベクター分子の一部として、細胞内に導入することができる。更にドナーポリヌクレオチドを、裸の核酸として、リポソーム、ナノ粒子またはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として、導入することができる、または、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。

【0137】

特定の実施形態では、二本鎖のドナーは、１ｋｂ超の長さの配列（例えば、導入遺伝子とも呼ばれるコード配列）、例えば２と２００ｋｂの間、２と１０ｋｂの間（またはこれらの間の任意の値）を含む。二本鎖ドナーも、例えば少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位を含む。特定の実施形態では、ドナーは、例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの対において、少なくとも２つの標的部位を含む。一般的にヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の開裂において、導入遺伝子配列の外側、例えば導入遺伝子配列に対して５’及び／または３’にある。ヌクレアーゼの開裂部位（複数可）は、任意のヌクレアーゼ（複数可）においてである。特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されているヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、内因性の標的を開裂するために使用されるのと同じヌクレアーゼ（複数可）においてであり、その内因性の標的に、開裂されたドナーが相同性非依存的な方法を介して組み込まれる。

【0138】

ドナーは一般的に、組込み部位の内因性プロモーター、すなわちドナーが挿入されている内因性遺伝子（例えばグロビン、ＡＡＶＳ１など）の発現を引き起こすプロモーターによって、発現が引き起こされるように挿入される。しかしドナーが、プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば構成的プロモーターまたは誘導可能なもしくは組織特異的なプロモーターを含み得ることは明らかである。

【0139】

ドナー分子は、内因性遺伝子のすべてもしくはいくつかが発現する、またはそのどれも発現しないように、内因性遺伝子内に挿入されてもよい。他の実施形態では、導入遺伝子（例えばペプチドがコードする配列の有無に関係なく）は、任意の内因性遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座に組み込まれている。例えば、米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号及び同第２０１０００２１８２６４号を参照のこと。

【0140】

更に発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。そのうえスプライスアクセプター配列を含めることができる。例示的なスプライスアクセプター部位配列は当業者に周知であり、あくまで例としては、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号１）（ヒトＨＢＢ遺伝子由来）及びＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号２）（ヒト免疫グロブリン－ガンマ遺伝子由来）が挙げられる。

【0141】

本明細書に記載のドナー配列に運ばれる導入遺伝子は、プラスミド、細胞または他の供給源から、ＰＣＲなど当技術分野で既知の標準技術を使用して単離され得る。使用するドナーとしては、環状スーパーコイル型、環状リラックス型、線型などを含めて様々な種類の形態を挙げることができる。あるいは、それらを、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学的に合成してもよい。更にドナーをメチル化してもよいし、メチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌または酵母の人工染色体であってもよい（ＢＡＣまたはＹＡＣ）。

【0142】

本明細書に記載の二本鎖のドナーポリヌクレオチドは、１つ以上の非天然の塩基及び／または骨格を含んでいてもよい。具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、メチル化シトシンを伴うドナー分子の挿入を実施して、目的の領域での転写的に静止した状態を達成することができる。

【0143】

外因性の（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の目的の配列（外因性配列）を含んでいてもよい。例示的な外因性配列としては、任意のポリペプチドをコードする配列（例えば、ｃＤＮＡまたはその断片）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、開裂酵素認識部位、及び様々な種類の発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、発色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖の増強及び／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えばＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。

【0144】

好適な実施形態では、外因性配列（導入遺伝子）は、細胞での発現が望ましい任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そのようなポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面のまたは核の）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子及び前出のいずれかの機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。コード配列は、例えばｃＤＮＡであってもよい。外因性配列は、目的の内因性遺伝子配列と連結するための導入遺伝子の断片でもよい。例えば、目的の遺伝子の３’末端の配列を含む導入遺伝子の断片を利用して、挿入または置き換えを介して、内因性遺伝子配列の３’末端の変異をコードする配列を補正することができる。同様に断片は、そのような内因性配列を補正または改変するための内因性配列の挿入／置き換えのための、内因性遺伝子の５’末端と同様の配列を含んでいてもよい。更に断片は、内因性遺伝子配列とｉｎ ｓｉｔｕ連結して融合タンパク質を産生するための目的の機能的ドメイン（触媒、分泌など）をコードしてよい。

【0145】

例えば外因性配列は、遺伝性疾患に罹っている対象に欠失している、または機能しないポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよく、そのような遺伝性疾患としては、軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ Ｎｏ．１０２７００）、副腎白質萎縮症、アイカルディ症候群、α１アンチトリプシン欠損症、α地中海貧血症、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈性右心室異形成、毛細血管拡張性小脳失調症、バルト症候群、β地中海貧血症、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ネコ泣き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉形成異常症、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、血色素症、βグロビンの第６コドンのヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガーギーデオン症候群、白血球粘着不全（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ Ｎｏ．１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球病（鎌状赤血球貧血症）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・ザックス病、血小板減少橈骨欠損症（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ Ｎｏ．３０８２４０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0146】

標的化された組込みによって治療され得る更なる例示の疾患としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積病（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病及びテイ・ザックス病）、ムコ多糖沈着症（例えば、ハンター病、フルラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病、ＨｂＣ、α地中海貧血、β地中海貧血）ならびに血友病が挙げられる。

【0147】

特定の実施形態では、外因性配列は、標的化された組込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述）と、追加的な機能をコードする連結された配列とを含むことができる。マーカー遺伝子の非限定例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）などが挙げられる。

【0148】

挿入することのできる追加的な遺伝子配列としては、例えば変異配列を置き換える野生型遺伝子が挙げられ得る。例えば野生型のＩＸ因子の遺伝子配列を、内因性の遺伝子コピーが変異している幹細胞のゲノム内へ挿入してもよい。野生型コピーは、内因性遺伝子座へ挿入してもよく、または代替的にセーフハーバー遺伝子座へ標的化してもよい。

【0149】

いくつかの実施形態では、ドナー配列は、Ｔ細胞の機能を導くのに役立つ受容体をコードする。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞表面に発現した特異的な分子標的に免疫細胞を標的化するようにデザインされた分子である。その最も基本的な形状で、それらは、細胞内部のシグナル伝達経路に細胞外側で発現する特異的ドメインを連結する細胞に導入される受容体であり、その結果、特異的ドメインがその標的と相互作用する場合、細胞は活性化される。多くの場合、特異的ドメイン（例えばｓｃＦｖまたは数種の受容体）がＴＣＲのシグナル伝達ドメインに融合する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の変異体から、ＣＡＲは作成される。これらの構造体はそれからＴ細胞内に導入されて、標的抗原を発現する細胞の存在下で、Ｔ細胞を活性化させて、非ＭＨＣ依存的に活性化Ｔ細胞による標的細胞への攻撃をもたらす（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：２９４－３１１を参照のこと）。あるいは、ＣＡＲ発現カセットがＴ細胞に特有のプロモーター（例えばＦＯＸＰ３プロモーター、Ｍａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３５９３－３６０２を参照）の制御下にあるように、ＣＡＲ発現カセットは後の移植のためのＨＳＣ／ＰＣ内に導入されることができる。

【0150】

現在、様々な腫瘍抗原を標的とする腫瘍特異的ＣＡＲは、様々な異なる癌の治療のためのクリニックで試験されている。標的とされるこれらの癌及びその抗原の例は、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽細胞腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、神経膠芽腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ性白血病またはＣＬＬ、及び急性リンパ性白血病またはＡＬＬを（両方ともＣＤ１９）を含む。

【0151】

ウイルス特異的ＣＡＲも、ＨＩＶなどのウイルスを保有している細胞を攻撃するために開発された。例えば臨床試験は、ＨＩＶの治療についてＧｐ１００に特異的なＣＡＲを使用して開始された（Ｃｈｉｃａｙｂａｍ、同書）。他のウイルス特異的ＣＡＲは、エボラウイルスを保有する細胞をノックアウトするために開発することができる、またはＣＡＲ含有Ｔ細胞を、これらのウイルスに特定的なＣＡＲを含む操作されたＴ細胞を使用して、ＣＭＶ、アデノウイルス及び／またはＥＢＶを標的とするために移植後に使用することができる。

【0152】

ＣＡＲは、自己免疫疾患の治療用も開発されている。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＩＬ－２受容体α鎖及び転写因子ＦｏｘＰ３を恒常的に発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである。例えばエフェクターＴ細胞増殖及び炎症誘発性サイトカインの生成を阻害し、ならびに自然免疫系の成分を妨げることによって、Ｔｒｅｇは大腸炎を抑制すると考えられている。特異性抗原に対するＴｒｅｇの欠乏が原因で、Ｔ細胞が自己免疫と関連した抗原に対してＣＡＲを発現するために改変されている、操作された抗原特異的Ｔｒｅｇの養子移入の可能性を、研究者は探っている（例えば大腸炎についてＣＥＡ、Ｂｌａｔ ｅｔ
ａｌ（２０１４）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２（５）：１０１８を参照）。

【0153】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴ細胞の選択的活性化の必須部分であり、通常、ヘテロ二量体を形成するために共集合する２つの鎖、α及びβから作成される。ＴＣＲ鎖をコードするゲノム遺伝子座は、ＴＣＲα遺伝子がＶ及びＪセグメントを含む一方、β鎖遺伝子座がＶ及びＪセグメントに加えてＤセグメントを含むという点において、遺伝子座をコードする抗体に似ている。そのうえＴＣＲ複合体は、Ｔ細胞にＣＤ３抗原複合体の一部を構成する。Ｔ細胞活性化中に、ＴＣＲは、抗原提示細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に表示された抗原と相互作用する。ＴＣＲによる抗原－ＭＨＣ複合体の認識はＴ細胞刺激をもたらし、これは続いて、メモリー及びエフェクターリンパ球でのヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）の両方の分化をもたらす。したがって操作されたＴＣＲの使用は、Ｔ細胞活性（米国特許第８，９５６，８２８号を参照）の方向を変えることをもたし得て、ドナー配列はＴＣＲをコードする操作された配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲサブユニット（すなわちＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）をコードする遺伝子を切断するためにデザインされた操作されたヌクレアーゼを使用することにより、内因性ＴＣＲも破壊される。例えば、米国特許第８，９５６，８２８号及び同第８，９４５，８６８号を参照のこと。

【0154】

抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）技術は、Ｔ細胞を配向するために様々な異なる抗体と組み合わせるＡＣＴＲ分子を含むＴ細胞の単一種の使用である。ＡＣＴＲは、ＣＤ３シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ８膜貫通及びヒンジドメイン、ならびにＣＤ１６Ｆｃ受容体ドメインからなる、膜貫通タンパク質である。抗体がＡＣＴＲを発現するＴ細胞と結合するように、このタンパク質はＴ細胞で発現されて、抗体とｉｎ
ｖｉｖｏ結合されて、抗体－ＡＣＴＲ複合体は、抗体が結合する特異性抗原を発現する特異的細胞または組織にＴＣＲを標的化するのに役立つ。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＲで改変されるＴ細胞は患者に由来する。他の実施態様で、Ｔ細胞は、特異的内在性Ｔ細胞受容体（例えばＴＣＲ、ＭＨＣ）が不活性した「万能」Ｔ細胞である。場合によっては、受容体は、ＡＣＴＲ－抗体複合体の不存在下で宿主抗原と反応しないＴ細胞バンクを作成する、操作されたヌクレアーゼによって不活性化される。

【0155】

本明細書の教示に従い、そのような発現カセットの構築は、分子生物学の当該技術分野で周知の方法を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照）。発現カセットを使用して遺伝子導入動物を生成する前に、選択された制御エレメントに関連があるストレス誘導物質に対する発現カセットを安定な細胞株（例えば、一次細胞、形質転換細胞または不死化細胞株）内へ導入することによって、発現カセットの応答性を試験することができる。

【0156】

更に発現に必要でなくとも、外因性配列は更に、転写調節配列または翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／またはポリアデニル化シグナルであり得る。更に目的の遺伝子の制御エレメントをレポーター遺伝子へ機能的に連結して、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作成することができる。

【0157】

非コード核酸配列の標的挿入も達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列も、標的挿入のために使用され得る。

【0158】

追加の実施形態で、ドナー核酸は、追加のヌクレアーゼのデザインのために、特異的な標的部位である非コード配列を含んでもよい。その後に、元のドナー分子が開裂されて、別の目的のドナー分子を挿入されることによって改変されるように、追加のヌクレアーゼを細胞に発現させてもよい。このように、ドナー分子の反復的な組込みを生成して、目的の特定の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で、形質スタッキングを可能とし得る。

【0159】

ドナー（複数可）は、ヌクレアーゼ（複数可）を細胞中に導入する前に、それと同時に、またはその後に送達することができる。特定の実施形態では、ドナー（複数可）をヌクレアーゼ（複数可）と同時に送達する。他の実施形態で、ドナーをヌクレアーゼ（複数可）の前に、例えばこれらに限定されないが、ヌクレアーゼ（複数可）の１～６０分（またはその間の任意の時間）前、ヌクレアーゼ（複数可）の１～２４時間（またはその間の任意の時間）前、またはヌクレアーゼ（複数可）の２４時間超前を含む、ドナーの数秒前～数時間～数日前に送達する。特定の実施形態では、ヌクレアーゼの後に、好ましくは４時間以内にドナーを送達する。

【0160】

ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）と同じ送達系を使用して送達することができる。同時に送達する場合、ドナー及びヌクレアーゼは、同じベクター、例えばＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）上にあってよい。特定の実施形態で、ドナーはＡＡＶベクターを使用して送達され、ヌクレアーゼ（複数可）はｍＲＮＡ形態で送達される。

【0161】

細胞
したがって、遺伝子改変した細胞、例えば細胞で機能的なタンパク質を発現する導入遺伝子を含有する導入遺伝子を含む一次ＨＳＣ／ＰＣまたはＴ細胞が本明細書で提供される。本明細書に記載の方法によって産生される細胞も提供される。導入遺伝子を、１つ以上のヌクレアーゼを使用して、標的化された様式で細胞のゲノム中に組み込む。特定の実施形態で、導入遺伝子をセーフハーバー遺伝子中に組み込む。

【0162】

ランダムな組込みとは異なり、標的化された組込みでは、指定の遺伝子または遺伝子座中への導入遺伝子の組込みが確実になる。導入遺伝子は、標的遺伝子中のどこにでも組み込むことができる。特定の実施形態で、導入遺伝子をヌクレアーゼ開裂部位またはその近く、例えば開裂部位の上流または下流の１～３００（またはその間の任意の値）塩基対内、より好ましくは開裂部位のいずれか側の１～１００塩基対（またはその間の任意の値）内、更により好ましくは開裂部位のいずれか側の１～５０塩基対（またはその間の任意の値）内に組み込む。特定の実施形態では、導入遺伝子を含む組み込まれた配列は、任意のベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）を含まない。

【0163】

これらに限定されないが細胞及び細胞株を含む任意の細胞型を、本明細書に記載されるように遺伝子改変することができる。本明細書に記載の細胞の他の非限定例としては、Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋（Ｔｒｅｇを含む）など）、樹状細胞、Ｂ細胞、自己由来（例えば患者由来）もしくは異種の万能性幹細胞、全能性幹細胞または多能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、治療することが望まれる疾患の患者に由来するＣＤ３４＋細胞である。

【0164】

本明細書に記載の細胞は、疾患を、例えばｅｘ ｖｉｖｏ療法によって治療及び／または予防することにおいて有用である。ヌクレアーゼ修飾細胞を増殖させて、次いで標準的な技術を使用して患者に再導入することができる。例えば、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ３７０（１０）：９０１を参照のこと。幹細胞の場合、対象に注入後、これらの前駆体の、機能的な導入遺伝子を発現する細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ分化も生じる。本明細書に記載の細胞を含む医薬組成物も提供される。更に細胞は、患者に投与する前に凍結保存することができる。

【0165】

送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質及び／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の好適な手段によって、任意の細胞型へｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ送達し得る。

【0166】

好適な細胞としては、真核（例えば、動物）及び原核細胞及び／または細胞株が挙げられる。このような細胞、またはこのような細胞から生成される細胞株の非限定例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）及びｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞が挙げられる。特定の実施形態で、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な細胞としては、例として胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞及び間葉幹細胞などの幹細胞も挙げられる。

【0167】

本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号及び同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらのすべての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0168】

本明細書に記載されているようなヌクレアーゼ及び／またはドナー構築物を更に、１つ以上のＺＦＮ（複数可）、ＴＡＬＥＮ（複数可）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターなどを含む、任意のベクター系を使用してもよい。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号及び同第７，１６３，８２４号も参照し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、これらのベクターのいずれかが、治療に求められる１つ以上の配列を含み得ることは明らかである。したがって１つ以上のヌクレアーゼ及びドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼ及び／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに運ばせてもよい（ＤＮＡ ＭＣ（複数可））。複数のベクターを使用する際に、各ベクターは、１つもしくは複数のヌクレアーゼ及び／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。

【0169】

従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織のヌクレアーゼ及びドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ ＭＣ、裸の核酸、及びリポソーム、ナノ粒子またはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成する核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質及びこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達の概要については、例えば、Ｒｅｂａｒ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ １３（７）：８２９－８３９、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１２）：１４４４－１４５４、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）などの一般的な遺伝子送達の文献を参照されたい。

【0170】

核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。

【0171】

更なる例示の核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，によって提供されるものが挙げられる（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際特許第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号の脂質が挙げられる。

【0172】

免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号及び第４，９４６，７８７号を参照のこと）。

【0173】

追加の送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照のこと）。

【0174】

遺伝子操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、及び／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に発展した過程を利用する。ウイルスベクターは患者に直接投与（ｉｎ ｖｉｖｏ）することができる、または細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ処置するために使用することができ、改変された細胞は患者に投与される（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、及び単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ関連ウイルスの遺伝子導入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。そのうえ高い形質導入効率は、多くの異なる細胞型及び標的組織で観察されている。

【0175】

レトロウイルスの指向性は、標的細胞の潜在的な標的集団を増殖させる、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、一般的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングには十分であり、それらは次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く用いられるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、国際出願ＰＣＴ／米国第９４／０５７００号を参照のこと）。

【0176】

一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質導入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価及び高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。またアデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば核酸及びペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際特許第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含む、多数の刊行物に記載されている。

【0177】

少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子導入に利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。

【0178】

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３－１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用した最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５－４８０（１９９５））。ＭＦＧ－Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０－２０（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２（１９９７））。

【0179】

組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型及び非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐの逆位末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子導入及び安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０、ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス核酸のＬＴＲ配列のウイルス起源がカプシド配列のウイルス起源と異種である場合、キメラＡＡＶを使用する。例として、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲと、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシドを有するキメラウイルス（すなわち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８及びＡＡＶ２／９）が挙げられる。

【0180】

複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生されることができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ及び／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、遺伝子操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓及び筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ ｖｉｖｏ形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例は、筋肉注入による抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療を含有した（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。臨床試験で遺伝子導入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５－１０ （１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３－１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５－１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７－６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７－５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－１０８９（１９９８）が挙げられる。

【0181】

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、ＡＡＶ及びアデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする産生細胞株によって生成される。前記ベクターは通常、パッケージング及びその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用される場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは通常、宿主ゲノム内へのパッケージング及び組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするものがＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、及びヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えばＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、バキュロウイルス発現系を使用して作成される。

【0182】

多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７－９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現している特定のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス－標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば繊維状ファージを遺伝子操作して、ほとんどの任意の選ばれた細胞受容体について特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上の記載は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを遺伝子操作して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有することができる。

【0183】

遺伝子治療ベクターは、後述のとおり、個々の患者への投与によって、一般的には全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ ｖｉｖｏ送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えばリンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ ｖｉｖｏ送達し、続いて通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。

【0184】

ヌクレアーゼ及び／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を、細胞のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによるものであり、そのような経路としては、注射、注入、局所適用及びエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は利用可能であり、当業者に周知であり、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。

【0185】

本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えばヌクレアーゼをコードする及び／または二本鎖ドナー）の導入に好適なベクターは、非組込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２－１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３－９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７－２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照のこと。

【0186】

薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって後述のように、利用可能な医薬組成物の多種多様な好適な形態な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。

【0187】

ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えばヌクレアーゼ及びドナーを同じＤＮＡ ＭＣによって運ぶことができる。あるいは、ドナーポリヌクレオチドをＭＣによって運ぶことができ、一方、１つ以上のヌクレアーゼを標準的なプラスミドまたはＡＡＶベクターによって運ぶことができる。更に異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉注射、尾部静脈注射、他の静脈注射、腹腔内投与及び／または筋肉内注射）によって投与することができる。前記ベクターを、同時にまたは任意の順番で送達することができる。

【0188】

したがって本開示は、治療タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に適応し易い疾患及び状態のｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ治療を含み、例えばＶＩＩＩ因子（Ｆ８）などの凝固因子のヌクレアーゼ媒介性組込みを介した血友病の治療などを含む。組成物は、血清または標的器官もしくは標的細胞で所望の濃度の治療ポリペプチドを得るのに効果的な量で、ヒト患者へ投与される。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段による。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方の方法が意図される。門脈への静脈注射は、好ましい投与方法である。他のｉｎ ｖｉｖｏ投与の様式としては、例えば、肝動脈によるものを含む肝臓葉もしくは胆管への直接注射及び肝臓遠位への静脈注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射ならびに／または胆樹による逆行性注射が挙げられる。ｅｘ ｖｉｖｏ投与の様式としては、切除した肝細胞または肝臓の他の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入し、続いて形質導入された切除肝細胞をヒト患者の門脈脈管、肝実質または胆樹へ戻して注入することが挙げられる。例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：３３５－３４１を参照のこと。

【0189】

投与する有効量のヌクレアーゼ（複数可）及びドナーは、患者間で異なり、目的の治療ポリペプチドによって変化する。したがって有効量は、組成物を投与する臨床医によって最適に決定され、適切な投与量は当業者によって容易に決定され得る。十分な時間で組込み及び発現させた後（例えば通常は４～１５日間）、治療ポリペプチドの血清または他の組織のレベルの分析、及び投与前の初期レベルとの比較によって、投与される量が少なすぎるのか、適正な範囲内か、または多すぎるのかを決定する。初期投与及びそれに引き続いての投与に適した状況も変化し得るが、初期投与と、必要であればそれに引き続いての投与とを行うのが典型的である。引き続いての投与は、種々の間隔で投与されてもよく、毎日から毎年まで数年に１回までの範囲に及ぶ。当業者は、適切な免疫抑制技法が、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：１３９１－１４０１を参照のこと。

【0190】

ｅｘ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、懸濁液または乳化液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びこれらの組み合わせが挙げられる。更に組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。

【0191】

以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む、本開示の例示的実施形態に関する。これが、あくまで例示目的であること、ならびに他のヌクレアーゼが使用され得ること、例えば遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメイン、及び／または天然起源のもしくは遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインと異種開裂ドメインの融合物、及び／またはメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質との融合物と共にＴｔａｇｏ系、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ることは、理解されるであろう。

【実施例】

【0192】

実施例１：ジンクフィンガーヌクレアーゼの組み立て
Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７７８－７８５に記載のとおり、ＺＦＮをヒトＰＤ１遺伝子に対して組み立て、ＥＬＩＳＡ及びＣＥＬ１アッセイによって活性を試験した。ＴＣＲ（例えばＴＲＡＣ）、Ｂ２Ｍ、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ１特異的ヌクレアーゼについては、米国特許第８，９５６，８２８号、同第８，９４５，８６８号、同第８，５６３，３１４号、ならびに米国特許公開第２０１４０１２０６２２号及び同第２０１５００５６７０５号を参照し、参照により本明細書に組み込まれる。

【0193】

実施例２：ＡＡＶ形質導入及び遺伝子改変ＴＩ
Ａ．ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞
ＩＬ２（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下で、プロモーター（例えばＥＦ１ａまたはＰＧＫ）促進性かつ操作された抗原受容体導入遺伝子（例えば図１に示すＣＡＲ、ＴＣＲまたはＡＣＴＲ）及びｍＲＮＡがコードするＰＤ１特定的ＺＦＮまたはＴＲＡＣ特異的ＺＦＮを含有するＡＡＶ６ベクターを、初代ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入した。次いで感染の５日後（ｄｐｉ）に細胞を収集し、操作された抗原受容体の発現について分析した。ＰＤ１チェックポイント阻害剤またはＴＣＲα鎖ＴＲＡＣに特異的なＺＦＮと組み合わせた遺伝子操作された抗原受容体導入遺伝子を含むＡＡＶ６ベクターの使用が、導入遺伝子のＰＤ１またはＴＲＡＣ座への組込みをもたらすことを、結果は示す。

【0194】

Ｂ．ＣＤ３＋Ｔ細胞
ＣＣＲ５－ＲＦＬＰドナーを運搬するＡＡＶ２／６ベクターをＣＤ３＋Ｔ細胞に形質導入するために、標準条件下で、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＡＡＶ２／６－ＲＦＬＰドナーベクターに４時間曝露した（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４１８０７号を参照）。標準状態は、培地の血清の使用を含む。上述のとおり、ｍＲＮＡがコードするＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（ＤｅＫｅｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｇｅｎ．Ｒｅｓ．２０：１１３３－１１４２）は、６０μｇ／ｍＬでエレクトロポレーションを介して細胞に導入された。形質導入効率における血清の効果を試験するために、４時間の形質導入中、比較実験は培地の血清なしで実施した。形質導入及びエレクトロポレーションの後、細胞は、血清含有条件下で５日間増殖されて、その後採取した。ゲノムＤＮＡは、標準的な手順によってＩｌｌｕｍｉｎａディープシーケンシングにより分離されて、ＲＦＬＰ含有ドナー（「ＲＦＬＰ％」）の標的化された組込みの効率を測定した。

【0195】

結果を図２に示し、ＡＡＶ２／６ドナーの低濃度で、ドナーの標的化された組込みが血清の存在下で抑制されて、血清の不存在下では観察されないことを実証する。

【0196】

実施例３：ＡＡＶ形質導入及び遺伝子改変
１つ以上の内因性遺伝子が本明細書に記載の組成物及び方法を使用して改変された（例えば、ＴＩの有無にかかわらず不活性化された）細胞でも、ＡＡＶドナー発現を試験した。特にＴＲＡＣ及び／またはＢ２Ｍ遺伝子は、初代Ｔ細胞（ＣＤ３＋）で基本的には上述のとおり改変された。簡潔には、ヌクレアーゼ標的化ＴＲＡＣ及び／またはＢ２Ｍは、ＧＦＰをコードする導入遺伝子（ＴＲＡＣ１ヌクレアーゼ単独で２５０ｕｇ／ｍＬ及び１ｅ５ｖｇ／細胞のＡＡＶ ＭＯＩ、Ｂ２Ｍヌクレアーゼ単独で１２０ｕｇ／ｍＬ及び１ｅ５ｖｇ／細胞のＡＡＶ ＭＯＩ、Ｂ２Ｍを１２０ｕｇ／ｍＬ、ならびにＴＲＡＣ１及びＢ２Ｍヌクレアーゼについて６０ｕｇ／ｍＬ及び１ｅ５ｖｇ／細胞のＡＡＶ ＭＯＩ）を含むＡＡＶドナーと一緒に細胞に投与された。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化されて、血清代替物及びＩＬ－２を有する培地で培養した。活性化後２日目、１Ｅ５ｖｇ／細胞のＡＡＶ６ ＧＦＰドナーベクター（ＴＲＡＣまたはＢ２Ｍ ＺＦＮ切断部位のいずれかに特異的な相同アームを含む）によって、活性化された細胞は形質導入された。翌日、６０～２５０ｕｇ／ｍＬの範囲のｍＲＮＡ濃度でのエレクトロポレーションによるＴＲＡＣまたはＢ２Ｍいずれかを標的化するＺＦＮについて、コードするｍＲＮＡと共に細胞をトランスフェクトした。それからＴ細胞を標準Ｔ細胞培地で希釈し、一晩３０℃にてインキュベートした。培養液をその後に、更に７～１１日間、標準Ｔ細胞増殖条件下で増殖させた。

【0197】

図２０に示すように、大部分の細胞（すべての場合で７０％超）は、ＴＲＡＣまたはＢ２Ｍ座へのＡＡＶドナーの標的化された組込み（ＴＩ）を示した。更に、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ両方の標的化ヌクレアーゼを受ける細胞の同程度の割合は、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ両方の不活化（ＫＯ）、ならびにＡＡＶ ＧＦＰドナーの標的化された組込み（ＴＲＡＣ相同アームを有するドナーを使用する場合、ＴＲＡＣ内への）を示した。

【0198】

実施例４：Ｅｘ ｖｉｖｏ法
前述したように（Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１，１２３３１５１）、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（例えば患者由来のＣＤ３４＋細胞、及びまたは改変したＣＤ４＋、ＣＤ３＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を含み、本明細書に記載されるように１つ以上のＣＡＲを発現する、遺伝子改変した細胞は、上述したように（Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．同所）対象に投与されて、改変細胞で治療した対象に長期の多系列移植をもたらす。

【0199】

実施例５：ＰＤＧＦｒ阻害剤を使用するＡＡＶ形質導入
ＡＡＶ形質導入への共受容体の相対的な関与を試験するために、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に対する阻害剤を、ヒトアルブミン座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用する、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝細胞癌細胞株）細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＡＶ２／６形質導入実験の前に使用した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ＡＡＶ２／６による形質導入の前日に、完全増殖培地３００μＬ中の４８ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり１×１０５細胞密度で蒔かれた。形質導入の朝に、細胞を無血清培地で３回洗浄し、３時間の無血清培地でインキュベートした。成長因子受容体阻害剤をウェルに加えて、１時間インキュベートした。それからアルブミン座に標的化したＺＦＮを送達するためにＡＡＶ２／６粒子を、ウェルに加えた。３時間後に、血清をウェルに加えて、１０％の最終濃度にした。細胞を、形質導入後４日目に採取した。ゲノムＤＮＡは抽出されて、アルブミン座でディープシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって分析された。使用する成長因子受容体阻害剤を下の表１に示し、それらは図３で示される濃度実験で使用されて、各阻害剤はその標的によって標示される。例えばゲフィチニブ（ＥＧＦＲの阻害剤）は、「ＥＧＦＲｉ」と標示される。

【0200】

図３に示すように対照と比較して、ＥＧＦＲｉのみが穏やかな阻害（ＡＡＶ６共受容体としてのその役割のため予想どおり）を示し、ＨＧＦＲｉ及びＦＧＦＲｉはＡＡＶ形質導入の穏やか刺激を示した。対照的に、使用した両方のＰＤＧＦＲ阻害剤（ＣＰ－６７３４５１及びクレノラニブ）は、ｉｎｄｅｌ形成最高８倍の著しい用量依存的な刺激を示した（濃度９μＭで）。

【表1】

【0201】

阻害剤がそれら単独でＤＳＢ修復の誤作動を何とか不注意に刺激しなかった（したがってＡＡＶ形質導入に影響を及ぼさない）ことを確実にするために、ＡＡＶによる、及びｍＲＮＡ送達によるＺＦＮの送達を比較した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ＡＡＶ２／６による形質導入またはｍＲＮＡによる形質導入の前日に、完全増殖培地３００μＬ中の４８ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり１×１０^５細胞密度で蒔かれた。形質導入及びトランスフェクションの朝に、細胞を無血清培地で３回洗浄し、３時間の無血清培地でインキュベートした。成長因子受容体阻害剤をウェルに加えて、１時間インキュベートした。ＡＡＶ２／６形質導入において、それからアルブミン座に標的化したＺＦＮを送達するためにＡＡＶ２／６粒子を、ウェルに加えた。ｍＲＮＡトランスフェクションにおいて、ＺＦＮ当たり５ｎｇのｍＲＮＡは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びＲＮＡｉＭａｘリポフェクタミン試薬によって細胞に送達された。３時間後に、血清をウェルに加えて、１０％の最終濃度にした。細胞を、形質導入後４日目に採取した。ゲノムＤＮＡは抽出されて、アルブミン座でディープシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって分析された。

【0202】

図４に示すように、ＺＦＮがＲＮＡとして送達されるとき、阻害剤効果がＡＡＶの形質導入にあることを示し、阻害剤の増加投与量で処理した細胞で検出されるヌクレアーゼ活性（ｉｎｄｅｌ％）に著しい差は見られなかった。

【0203】

ＡＡＶ２／６形質導入のＰＤＧＦＲｉ刺激の機序を調べるために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、同時にＰＤＧＦＲｉ及びＥＧＦＲｉで処理した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ＡＡＶ２／６による形質導入の前日に、完全増殖培地３００μＬ中の４８ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり１×１０５細胞密度で蒔かれた。形質導入の朝に、細胞を無血清培地で３回洗浄し、３時間の無血清培地でインキュベートした。成長因子受容体阻害剤をウェルに加えて、１時間インキュベートした。それからアルブミン座に標的化したＺＦＮを送達するためにＡＡＶ２／６粒子を、ウェルに加えた。３時間後に、血清をウェルに加えて、１０％の最終濃度にした。細胞を、形質導入後４日目に採取した。ゲノムＤＮＡは抽出されて、アルブミン座でディープシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって分析された。

【0204】

図５に示すように、ＡＡＶ形質導入全体の穏やかな減少（ｉｎｄｅｌ％として示される）は、ＥＧＦＲｉが存在するとき、ＥＧＦＲが増加したＡＡＶ２／６形質導入の間、少なくとも一部使用されていることを示唆する。他の受容体による関与の可能性が高い。

【0205】

Ｈｅｐ３Ｂが大量の表面ＥＧＦＲを発現するとされている一方で、ＨｅｐＧ２などの他の細胞株は高水準でＥＧＦＲを発現しない。本明細書に記載の方法及び組成物がＥＧＦＲ発現レベルとは独立して機能することを証明するために、ＨｅｐＧ２細胞のＰＤＧＦＲｉの存在下で、ＡＡＶ２／６形質導入を試験した。ＨｅｐＧ２／Ｃ３ａ細胞は、ＡＡＶ２／６による形質導入の前日に、完全増殖培地３００μＬ中の４８ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり１×１０５細胞密度で蒔かれた。形質導入の朝に、細胞を無血清培地で３回洗浄し、３時間の無血清培地でインキュベートした。成長因子受容体阻害剤をウェルに加えて、１時間インキュベートした。それからアルブミン座に標的化したＺＦＮを送達するためにＡＡＶ２／６粒子を、ウェルに加えた。３時間後に、血清をウェルに加えて、１０％の最終濃度にした。細胞を、形質導入後４日目に採取した。ゲノムＤＮＡは抽出されて、アルブミン座でディープシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって分析された。

【0206】

図６に示すように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞でのように、ＡＡＶ２／６形質導入率は、ＨｅｐＧ２細胞の対照と比較してＰＤＧＦＲｉと組み合わせて最高７倍だった。ＰＤＧＦＲ阻害が、ＥＧＦＲ発現状態に依存しない様々な細胞型で使用可能な技術であることを、これは示す。

【0207】

これまでのすべての実験は血清の不存在下で実施して、血清中に存在するＥＧＦＲの干渉を防いだが、血清がある場合もＰＤＧＦＲ阻害がＡＶ２／６形質導入を刺激するか、更に試験した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ＡＡＶ２／６による形質導入の前日に、完全増殖培地３００μＬ中の４８ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり１×１０５細胞密度で蒔かれた。血清なしウェルにおける形質導入の朝に、細胞を無血清培地で３回洗浄し、３時間の無血清培地でインキュベートした。成長因子受容体阻害剤をウェルに加えて、１時間インキュベートした。それからアルブミン座に標的化したＺＦＮを送達するためにＡＡＶ２／６粒子を、ウェルに加えて３時間インキュベートした。血清をウェルに加えて、１０％の最終濃度にした。完全血清ウェルにおいて、細胞は完全増殖培地で洗浄されて、ＡＡＶ２／６粒子をウェルに加えた。細胞を、形質導入後４日目に採取した。ゲノムＤＮＡは抽出されて、アルブミン座でディープシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって分析された。

【0208】

図７に示すように、ＨｅｐＧ２細胞で、約４０倍血清がある場合に、全体のＡＡＶ２／６形質導入が下がることを見いだした。しかし、ＰＤＧＲｉが加えられるとき、ＡＡＶ２／６形質導入は血清の存在下でさえ非常に強力だった（最大２０％ｉｎｄｅｌ）。未処置のＡＡＶ２／６形質導入にわたる倍率変化として換算すると（図８を参照）、ＰＤＧＲｉは、血清の不存在下で用量依存的方法の４倍（最大５０％ｉｎｄｅｌ）、血清の存在下で最高７０倍（最大２０％ｉｎｄｅｌ）、ＡＡＶ形質導入を増加させた。ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を使用する核酸の送達を強化するために、ＰＤＧＦＲ阻害が血清タンパク質の存在下で、ｉｎ ｖｉｖｏ使用できることを、これは示す。

【0209】

ＰＤＧＦＲ阻害剤のヒト患者由来の初代肝細胞への効果を、次に試験した。ヒト肝細胞について、４８ウェル細胞培養皿を、コラーゲンでプレコーティングして購入した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。解凍／平板培地を、１８ｍＬのＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ培地（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎｌＶＴ）及び４００μＬのＴｏｒｐｅｄｏ抗生物質混合物（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を混ぜ合わせて調整した。プレートが調整されると、雌付着可能ヒト肝細胞（Ｌｏｔ＃ ＡＫＢ）を、液体窒素蒸気相から３７℃の水浴内に直接移動させて、穏やかに撹拌しながら解凍した。細胞を、５ｍＬの予熱した解凍／平板培地を含有する５０ｍｌの円錐管に直接移動した。すべての細胞を回収するために、バイアルを１ｍＬの解凍／平板培地で洗浄し、それを細胞に加えた。細胞の再懸濁液の後、少量（２０μＬ）を除去して、細胞の計数を実施し、トリパンブルー液（１：５、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号＃２５－９００－Ｃ１）を使用して細胞生存度を測定した。それから細胞を５分間の７５×ｇで遠心分離し、上清を除去して、細胞を１ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を、コーティングした４８ウェルプレートの３ｅ５細胞／ウェルに播種した。それから細胞を、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。

【0210】

細胞が蒔かれた１日後に、細胞をＨＣＭ維持培地（Ｌｏｎｚａ、ＨＢＭ及びＨＣＭ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ）に切り替えた。翌日、細胞に新しいＨＣＭ培地を供給した。成長因子受容体阻害剤をウェルに加えて、１時間インキュベートした。ＡＡＶ２／６粒子は、ＨＣＭ培地（１ウェル当たり３００μＬの）を有する好適なＭＯＩで混合して、細胞に加えた。２４時間後、培地を新しいＨＣＭ培地と交換して、初代肝細胞培養の最高の健康状態を確実にした。細胞を、形質導入後４日目に採取した。ゲノムＤＮＡは抽出されて、アルブミン座でディープシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）によって分析された。

【0211】

図９に示すように、ＤＭＳＯ処理済み対照と比較して、増加したＡＡＶ２／６形質導入は、低用量（３μＭ）ではなく、高用量のＰＤＧＦＲｉ（９μＭ）処理で観察された。一次細胞での、したがってｉｎ ｖｉｖｏの本明細書に記載の方法の有効性が、５倍増加することを示す。重要なことに、これらの細胞は血清なしで増殖した。

【0212】

実施例６：非ヒト霊長類へのＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ送達
ヌクレアーゼ活性で測定されるように、ＡＡＶ送達の効率でステロイドと抗Ｂ細胞を組み合わせる状況の影響を調べるために、以下の試験を実施した。これらの試験で、ＡＡＶはＡＡＶ２ ＩＴＲを含むがＡＡＶ６キャプシドを有することを、専門用語２／６が意味する場合、ＡＡＶ２／６は使用される優勢な血清型であった（別に示していなければ）。試験は、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓアルブミン座を切断するようにデザインされたジンクフィンガーヌクレアーゼを利用した（ＳＢＳ＃３７８０４「左ＺＦＮ」／ＳＢＳ＃４３０８３「右ＺＦＮ」、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１５／１２７４３９号を参照）。使用するドナーは、導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性の標的化された組込みを介してヒトＦ．ＩＸまたはヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子を導入するようにデザインされた。ドナー構造物は、国際特許第ＷＯ２０１５１２７４３９号（ヒトＦ．ＩＸ）及び同第ＷＯ２０１５０８９０７７号（ヒトＦＶＩＩＩ）に記載されている。

【0213】

カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、ステンレスの網目状床及び自動水まき弁を備えるステンレス鋼ケージに収容した。試験は、Ｆｉｎａｌ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｃｏｄｅ
ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｔｉｔｌｅ ９）のすべての適用できる部分に対応した。

【0214】

対照物（製剤緩衝液、ＰＢＳ、３５ｍＭのＮａＣｌ、１％のショ糖、０．０５％のプルロニック １８８、ｐＨ７．１）及び試験物を、試験１日目に解凍して分配し、そこで試験物及び対象物は、１ｍＬ／分で末梢静脈に静脈内注射を介して投与された。リツキシマブ投与において、動物は、静脈内投与によって１ｍＬ／ｋｇ量の濃度１０ｍｇ／ｍＬで、１０ｍｇ／ｋｇ／投与量の用量を受けた。メチルプレドニゾロン（Ｓｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標））において、薬剤は、筋肉内に投与されて、投与量０．５ｍＬ／ｋｇの濃度２０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｋｇ／投与量の用量で投与された。

【0215】

投与スキームは図１０に示され、組み合わせがＳｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）及びＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の投与を遅延させたことを図１０Ａは示す。ＡＡＶ６試験物は１日目に動物に投与されて、Ｓｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）は５日目に開始して１６日目まで毎日与えられ、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は７日目と１４日目に与えられた。第２のスキームを図１０Ｂに示し、そこでＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）は８日目及び試験物の前日に与えられ、Ｓｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）は試験物と同じ日に与えられ、その後毎日与えられた。

【0216】

投与グループを下の表２及び表３に示す。表２は図１０Ａに示されるスキームで使用したグループを示し、表３は図１０Ｂのスキームで使用するグループを示す。表２及び表３に示される試験物は、表の項目で特徴づけられる。

【表2】

【表3】

【0217】

ヒトＦＩＸ及び抗ＦＩＸ抗体の検出のため及び尿検査のために、標準血液学、凝固、臨床化学パラメーターを評価するために、試料をとった。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及びプロトロンビン時間を測定することによって、凝固を分析した。更に、ゲノムＤＮＡのＡＡＶ６ベクターゲノムコピー数を分析して、ヌクレアーゼ活性を測定するために、生検をとった。

【0218】

遅延した（試験後物、図１０Ａ）処理状況についての結果を、図１１に示す。すべての投与グループは、最も高い全ＡＡＶ２／６投与グループで見られる最高レベルで、ｈＦＩＸ濃度の増加を示した（図１１Ａ）。１：１：８投与グループ（ＡＡＶ－ＺＦＮ１：ＡＡＶ－ＺＦＮ２：ＡＡＶ－ドナー）で、最高ｈＦＩＸ濃度は、最も高い全ＡＡＶ２／６投与で再び見られた（図１１Ｂ）。前処理状況（図１０Ｂ）において、ＦＩＸは、両方の投与グループで検出可能だった（図１１Ｃ）。両方の治療レジメンからのデータをまとめたとき（図１１Ｄ）、増加した全ＡＡＶ２／６の投与としての検出可能なｈＦ．ＩＸの増加が観察された。

【0219】

動物は更に、遺伝子改変のレベル（切断部位での挿入または欠失を含む遺伝子％「ｉｎｄｅｌ」）についても分析した。２８日目で検出される遺伝子改変のレベル（図１２）は、免疫調節剤の試験物後投与（図１０Ａ）で、全ＡＡＶ２／６投与が増加した際、遺伝子改変が増加したことを示した。リツキシマブが試験物前に投与されて、それからステロイドが試験物と同時に投与されて、その後毎日投与されたとき、全ＡＡＶ２／６投与が増加した際、遺伝子改変は増加した（図１２Ａ）。両方の状況からの遺伝子改変のレベルをまとめると（図１２Ｂ）、一般的な傾向は、増加したＡＡＶ２／６投与は増加した遺伝子改変に関連するということだった（図１２Ｃ）。重要なことに試験物による処理前のステロイド処理の使用は、投与前ステロイド処理のない処理と比較して、低用量の試験物の使用が、遺伝子改変の所与のレベルを達成すると共に、タンパク質発現の治療レベルも更に達成するのを可能にした。

【0220】

類似の実験も、Ｆ．ＩＸドナーの代わりにＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ導入遺伝子を使用してＮＨＰで実施した。この実験で、ＡＡＶ６及びＡＡＶ８血清型を評価した。以下の表４に、投与グループの成分を示す。グループ２～４（「ｃＤＮＡ１」）とグループ５（「ｃＤＮＡ２」）のＦ８導入遺伝子発現カセットの間の差は、グループ５ドナーがわずかに異なるプロモーターモジュールを有している（複合型肝臓プロモーター、ＭｃIｎｔｏｓｈ ｅ
ｔ ａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２１（１７）：３３３５を参照）が、残りのＦ８－ＢＤＤ導入遺伝子発現カセット（コード領域を含む）は同一であった。この実験では、ＺＦＮは、ゲノム内への標的化された組込みを生じさせるために使用されなかった。

【表4】

この実験において、図１０Ｂで概説する投与レジメンを使用し（リツキシマブが試験物前に投与され、ステロイドは試験物と同時に、その後毎日投与される）、実験は１４日間実施された。

【0221】

データを１３～図１９に示し、各グループはそれぞれサルであり、データポイントが付与されている。ＡＡＶ６血清型バックグラウンドの試験物の高用量（図１３Ａを図１３Ｂと比較）が、通常のヒトプラズマで見られるレベルのほぼ１０倍で、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの発現をしたことを、データは示す。ＡＡＶ２／８血清型の試験物のデータは、ＦＶＩＩＩ活性の増加を示したが、ＡＡＶ２／６で観察したものと同程度ではなかった。

【0222】

上述の最初の１４日間の後に、実験は、ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの単回投与後、１６８日目まで続けられた。ステロイドの共投与は、１０３日目に止められた（図１４）。サルの血漿のｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤレベルの測定は、以下のとおりにカスタムＥＬＩＳＡを使用して測定した。９６ウェルハーフエリアＨＢ（高結合）ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、０．２Ｍの炭酸重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）中のマウスモノクローナル抗ｈＦＶＩＩＩ抗体（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＴ）で４℃にて一晩、コーティングした。翌日、プレートを、１×ＴＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を使用して４回洗浄した。それから９６ウェルプレートを、３％のＢＳＡ／ＴＢＳブロッキング緩衝液を使用して室温にて２時間ブロックして、続いて１×ＴＢＳＴで４回洗浄した。血漿をプレートに加えて、室温にて２時間揺り動かしながらインキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで４回洗浄した。検出抗体（ビオチン化モノクローナルマウス抗ＦＶＩＩＩ抗体）（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＴ）を加えて、室温にて１時間インキュベートして、続いて１×ＴＢＳＴで４回洗浄した。ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）を加えて、室温にて１時間インキュベートして、続いて１×ＴＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を加えて、１０分間成長させて、反応を停止液で停止して、吸光度をプレートリーダーを使用して４５０ｎＭで読み取った。バックグラウンド吸光度表示は無視できる（一般的に０）。阻害抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在は、ベセスダアッセイ（例えば、Ｋａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｔｈｒｏｍｂ Ｄｉａｔｈ Ｈａｅｍｏｒｒｈ ３４：８６９－７２）を使用して測定した。図１５は、実験にわたって血漿で検出されるＡＡＶ２／６を介して送達されるＦＶＩＩＩ－ＢＤＤのピーク濃度を示す。

【0223】

強力なｈＦＶＩＩＩ抗原濃度（Ａｇ）の検出後、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで投与された、ＡＡＶ２／６のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡドナーを含む低用量動物（ｎ＝３）について、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤレベルはベセスダ単位（ＢＵ）の付随する増加によって減少した。ＢＵはだんだんと減少し、ｈＦＶＩＩＩ Ａｇは増加した（図１６）。免疫抑制療法の停止後、ヒトＦＶＩＩＩ抗原の濃度が低下したことを、前記結果は証明した。

【0224】

６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで投与された、ＡＡＶ２／６のＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡドナーを含む高用量動物（ｎ＝３）について、類似のパターンを観察した（図１７を参照）。しかし、Ｓｏｌｕ－ｍｅｄｒｏｌ除去後の一動物３１０１について、ＦＶＩＩＩ抗原（通常のｈＦＶＩＩＩレベルの２００％を表す）の検出可能及び持続的濃度にもかかわらず、抗ＦＶＩＩＩ抗体は検出されず、それはヒトＦＶＩＩＩ抗原への動物の忍容性を示す可能性がある。

【0225】

実験を高用量のＡＡＶ２／８ベクターの送達によって行ったとき、血漿で検出可能なＦＶＩＩＩ抗原の量が、ＡＡＶ２／６ベクターを使用して見られるものより少ないことを除いて、類似の結果が観察された（図１８）。同様に、異なるＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ ｃＤＮＡプロモーターモジュールがＡＡＶ２／８ベクターで試験したとき（上述のグループ５）、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ血漿レベルは、グループ４で見られるものと類似していた（図１９）。しかし上述のように、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ発現の検出可能な量を維持した２つの個体（５１０１及び５１０２）、及びＳｏｌｕ－ｍｅｄｒｏｌの除去後、実験の初日に見られた強力な反応レベル後の抗原への寛容化を再び思わせる著しい抗体反応のないグループ４の個体（４１０３、図１８Ｄ）がいた。

【0226】

図１９Ｄに示すように、メチルプレドニゾロンの除去後に、動物番号５１０１はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤに寛容化されたように見え、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤレベルは、約０．１Ｕ／ｍＬ（正常なｈＦＶＩＩＩレベルの１０％を表す）で８週間安定している。図１９Ｅに示すように、メチルプレドニゾロンの除去後に、動物番号５１０２はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤに寛容化されたように見え、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤレベルは、約０．６Ｕ／ｍＬ（正常なｈＦＶＩＩＩレベルの６０％を表す）で８週間安定している。ヒト血漿のｈＦＶＩＩＩの正常レベルは約１Ｕ／ｍＬまたは２００ｎｇ／ｍＬであり、正常（＞０．００１Ｕ／ｍＬ）の平均１％～５％の発現が治療有効性を有することは注目に値する（Ｌｌｕｎｇ ＲＣ（１９９９）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８２（２）：５２５－５３０）。

【0227】

本明細書にて言及されているすべての特許、特許出願及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0228】

開示は、理解を明確にする目的で、例証及び実施例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の趣旨または範囲を逸脱することなく様々な変形及び改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって前述の記載及び実施例は、限定的として解釈されるべきものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【配列表】

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